DE102010019590A1

DE102010019590A1 - Datenabhängiges Erfassungssystem für die Massenspektrometrie und Verfahren für dessen Anwendung

Info

Publication number: DE102010019590A1
Application number: DE102010019590A
Authority: DE
Inventors: David M. Santa Clara Horn; Javier E. Santa Clara Satulovsky
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 2009-05-06
Filing date: 2010-05-05
Publication date: 2010-12-09
Anticipated expiration: 2030-05-06
Also published as: DE102010019590B4; GB2471155A; GB2471155B; US20100286927A1; GB201007321D0

Abstract

Es werden Verfahren, Systeme und computerlesbare Medien für die datenabhängige Erfassung bereitgestellt. Es wird ein Computersystem für die datenabhängige Erfassung unter Verwendung von Daten, welche die aus einem Massenspektrum einer Probe (202) ermittelten Isotopen-Cluster repräsentieren, zur Berechnung eines Reinheitswertes (205) für jeden infrage kommenden Isotopen-Cluster im Massenspektrum verwendet, wobei jeder infrage kommende Isotopen-Cluster innerhalb eines zur Gewinnung der Daten verwendeten Trennfenster ermittelt wird. Dann wird für jeden infrage kommenden Isotopen-Cluster auf der Grundlage des Reinheitswertes eine Auswahlbewertung berechnet (206). Dann werden die Auswahlbewertungen nach einer Rangfolge geordnet (208) und ein oder mehrere der höchsten Auswahlbewertungen ausgewählt (210), um diejenigen Isotopen-Cluster, die den ausgewählten Auswahlbewertungen entsprechen, für die Weiterverarbeitung ausfindig zu machen.

Description

QUERVERWEISE
Diese Patentanmeldung beansprucht die Rechte aus der provisorischen US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 61/176 047, eingereicht am 6. Mai 2009, die hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die ”Bottom-up”-Proteomik stellt ein verbreitetes Verfahren zur Charakterisierung von Proteinen in biologischen Proben dar. Bei diesem Ansatz wird die Probe proteolytisch zersetzt, und die entstehenden Peptide werden unter Verwendung der IC/MS/MS (Flüssigkeitschromatografie/Tandem-Massenspektrometrie) analysiert. Die Peptide in der Probe werden im Allgemeinen unter Verwendung der direkt mit dem IC-System verbundenen Elektrospray-Ionisation ionisiert. Im Verlauf der LC/MS/MS-Experimente werden ausgewählte Ionenvorstufen nach ihrem Masse/Ladungs-Verhältnis (m/z) gefiltert und unter Verwendung von Tandem-Massenspektrometrieverfahren wie beispielsweise stoßinduzierte Dissoziation (Collision Induced Dissociation, CID) oder Elektronenübertragungs-Dissoziation (Electron Transfer Dissociation, ETD) fragmentiert, um im Massenspektrometer ein charakteristisches MS/MS-Spektrum zu erzeugen. Um ein bestimmtes Vorgängerion zuverlässig mit einer nachgeschalteten Software ermitteln zu können, muss das betreffende Vorgängerion nach der ersten MS-Stufe, aber noch vor der zweiten MS-Stufe des MS/MS-Prozesses herausgefiltert werden, da zusammen mit ihm gleichzeitig bis zu einigen Tausend andere Vorgängermoleküle eluiert werden. Zu diesem Zweck wird vom Benutzer ein eng begrenztes m/z-Trennfenster für das Massenspektrometer gewählt, um alle einzelnen Vorgängerionen-Peaks vor der Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) herauszufiltern. Nach der Erfassung der Daten werden die MS/MS-Spektren mit vorausberechneten MS/MS-Spektren oder Spektraldatenbanken verglichen, um die Identität der Peptide in der Probe nachzuweisen.
Für die Auswahl eines Vorgängerions gibt es zwei gebräuchliche Kriterien: die Intensität und die Ladung. Diese beiden Kriterien dienen dazu, für die Vorgängerionen aus einem vorliegenden Massenspektrum eine Rangfolge festzulegen, um diejenigen auszuwählen, die mit größter Wahrscheinlichkeit auswertbare MS/MS-Spektren liefern. Wenn die Ionenvorstufen in einem Tandem-Massenspektrometer herausgefiltert werden, wird hierzu ein vom Benutzer wählbares eng begrenztes Massentrennfenster verwendet. Ein breiteres Massenfenster bewirkt eine höhere Empfindlichkeit für ein bestimmtes Vorgängerion, noch wahrscheinlicher aber eine Ionenverunreinigung, während ein schmaleres Massenfenster die Wahrscheinlichkeit für ein überaus stark angereichertes Vorgängerion bei gleichzeitig verringerter Empfindlichkeit erhöht. Wenn zur Messung komplexer Proben Trennfenster von 1 Thomson oder mehr verwendet werden, muss für jedes Vorgängerion mit einer beträchtlichen Ionenverunreinigung gerechnet werden.
Mit zunehmender Komplexität der Proben nimmt in gleichem Maße auch die Wahrscheinlichkeit zu, dass zwei oder mehr Vorgängerionen mit gleicher Häufigkeit durch weniger als ein Trennfenster abgetrennt werden, wo die Vorgängerionen in einem Massenspektrum als Peak-Cluster erscheinen. Wenn das einem der Cluster entsprechende Vorgängerion für die MS/MS ausgewählt wird, besteht eine nicht zu vernachlässigende Wahrscheinlichkeit, dass das resultierende MS/MS-Spektrum nicht ausgewertet werden kann, da jeder der verschiedenen Isotopen-Cluster Produktionen erzeugt, die ein gemischtes MS/MS-Spektrum bilden.
Die Gewinnung von MS/MS-Spektren an der Spitze von chromatografischen Peaks ist zur Maximierung des Signal-Rausch-Verhältnisses von MS/MS-Spektren vorgeschlagen worden, siehe Senko et al., US-Patentschrift 7 297 941 . Die Grenzen eines solchen Ansatzes liegen darin, dass durch das gezielte Auswählen eines Vorgängerions am Flutions-Peak noch kein reines MS/MS-Spektrum garantiert ist, sofern davon ausgegangen wird, dass in dem Quadrupol-Trennfenster immer noch andere gleichzeitig eluierte Peptide vergleichbarer Masse enthalten sein können.
Somit besteht ein Bedarf an einer Verbesserung der Auswahlregeln für Vorgängerionen, um in bestimmten Fällen bei einem bestimmten Trennfenster für die Massenfilterung eine mögliche Verunreinigung des Vorgängerions vor der MS/MS-Messung auf ein Mindestmaß zu verringern, um bei der Analyse einer komplexen Peptidprobe mit einem Tandem-Massenspektrometer leichter auszuwertende MS/MS-Spektren zu erhalten.
ÜBERBLICK ÜBER DIE ERFINDUNG
Bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen eine Änderung der Auswahlregeln für Vorgängerionen, die für ein bestimmtes Trennfenster zur Massenfilterung die Möglichkeit der Verunreinigung des Vorgängerions vor einer MS/MS-Messung verringern. Infolgedessen kann mit besser auswertbaren MS/MS-Spektren gerechnet werden, wenn eine komplexe Probe mit einem Tandem-Massenspektrometer analysiert wird.
Es wird ein Verfahren zum Analysieren der Daten aus einem Massenspektrometer für eine datenabhängige Erfassung bereitgestellt. Bestimmte Ausführungsformen dieses Verfahrens beinhalten folgende Schritte: Gewinnen eines Massenspektrums einer Probe, wobei das Massenspektrum infrage kommende Isotopen-Cluster beinhaltet; für jeden infrage kommenden Isotopen-Cluster: Verwenden eines Trennungsfensters mit einer vorgegebenen Breite entlang einer m/z-Achse des Massenspektrums, Verwenden eines für die datenabhängige Erfassung eingerichteten Computersystems, um einen Teil des Massenspektrums abzutrennen; für jeden infrage kommenden Isotopen-Cluster: Berechnen eines Reinheitswertes für den betreffenden, innerhalb des Trennungsfensters gelegenen, Isotopen-Cluster unter Verwendung des datenabhängigen Computersystems; Berechnen einer Auswahlbewertung für jeden Isotopen-Cluster auf der Grundlage jedes einzelnen Reinheitswertes und Auswählen eines oder mehrerer Isotopen-Cluster mit den höchsten Auswahlbewertungen entsprechend ihrer Rangfolge zum Zweck ihrer weiteren Analyse.
Bei mindestens einer Ausführungsform beinhaltet das Verfahren das Festlegen einer Rangfolge für die Isotopen-Cluster entsprechend den vorher für die Isotopen-Cluster berechneten Auswahlbewertungen.
Bei mindestens einer Ausführungsform werden die Reinheitswerte auf der Grundlage einer Funktion berechnet, die mit I_prec monoton steigt und mit I_other monoton fällt, wobei I_prec gleich dem Wert des Ionenstroms des infrage kommenden Isotopen-Cluster und I_other gleich der Summe aller anderen Ionenströme innerhalb des jeweiligen Trennfensters ist.
Bei mindestens einer Ausführungsform werden die Reinheitswerte gemäß:
berechnet, wobei p₁ ≥ 0, 1 ≥ p₂ ≥ 0, I_prec gleich dem Wert des Ionenstroms des infrage kommenden Isotopen-Cluster und I_other gleich der Summe aller anderen Ionenströme innerhalb des Trennfensters ist; und wobei das Bereitstellen einer Auswahlbewertung das Multiplizieren der Intensität des infrage kommenden Isotopen-Cluster mit einem der folgenden Werte aufweist: mit dem berechneten Reinheitswert oder einer monotonen Funktion des berechneten Reinheitswertes, um die Auswahlbewertung bereitzustellen.
Bei mindestens einer Ausführungsform wird die Vorauswahl mindestens eines der Werte p₁ und p₂ durch eine Person vorgenommen.
Bei mindestens einer Ausführungsform werden die beiden Werte p₁ und p₂ durch eine Person vorausgewählt.
Bei mindestens einer Ausführungsform werden die Reinheitswerte gemäß: Purity = Iprec – p1·Iother wenn Iprec – p1·Iother > p2; und Reinheit = 0 wenn Iprec – p1·Iother ≤ p2 berechnet, wobei p₁ ≥ 0, 1 ≥ p₂ ≥ 0, I_prec gleich dem Wert des Ionenstroms des infrage kommenden Isotopen-Cluster und I_other gleich der Summe aller anderen Ionenströme innerhalb des Trennfensters ist; und wobei das Bereitstellen einer Auswahlbewertung das Bereitstellen der berechneten Reinheitswerte des infrage kommenden Isotopen-Cluster als Auswahlbewertung für den infrage kommenden Isotopencluster aufweist.
Bei mindestens einer Ausführungsform wird die Auswahlbewertung auf der Grundlage einer monotonen Funktion der Reinheit berechnet.
Bei mindestens einer Ausführungsform wird die Auswahlbewertung als Produkt der Intensität des infrage kommenden Isotopen-Cluster und der monotonen Funktion der Reinheit berechnet.
Bei mindestens einer Ausführungsform weist die datenabhängige Erfassung das Analysieren des einen oder der mehreren ausgewählten Isotopen-Cluster mittels Tandem-Massenspektrometrie auf.
Bei mindestens einer Ausführungsform weist die Probe ein Protein auf, wobei durch Tandem-Massenspektrometrie MS/MS-Spektren erfasst werden, die mit rechnerisch vorhergesagten MS/MS-Spektren von Peptiden oder mit Spektraldatenbanken verglichen werden, um die Identität der Peptide in der Proteinprobe nachzuweisen.
Bei mindestens einer Ausführungsform beinhaltet das Verfahren das Gewichten der m/z-Werte von Ionen, die näher in der Mitte des Trennfensters liegen, mit höheren Gewichtungswerten im Vergleich zu den niedrigeren Gewichtungswerten, die den m/z-Werten der Ionen zugewiesen werden, welche auf der m/z-Achse näher an den Rändern des Trennfensters liegen.
Bei mindestens einer Ausführungsform wird die Probe vor der Gewinnung eines Massenspektrums einer Probe einem flüssigkeitschromatografischen Prozess unterzogen.
Bei mindestens einer Ausführungsform wird das Verfahren mit Rohdaten in Echtzeit durchgeführt.
Ferner wird auch ein System zur datenabhängigen Erfassung bereitgestellt. Dieses System kann Folgendes beinhalten: ein Computersystem mit mindestens einem Prozessor; eine mit dem Prozessor verbundene Benutzeroberfläche, die so eingerichtet ist, dass sie Eingaben von einer Person empfängt; ein computerlesbares Medium, das mit dem Prozessor verbunden werden kann, wobei das computerlesbare Medium einen Speicher aufweist, der einen Satz von Anweisungen zur Steuerung der Verarbeitung eines Massenspektrums einer Probe speichert, darunter die Berechnung eines Reinheitswertes für jeden aus der Vielzahl von infrage kommenden Isotopen-Clustern, die durch Peaks im Massenspektrum dargestellt werden; die Berechnung einer Auswahlbewertung für jeden der infrage kommenden Isotopen-Cluster aus jedem einzelnen Reinheitswert, sodass mindestens eine der Auswahlbewertungen mit dem höchsten Rang ausgewählt werden kann, um die dadurch repräsentierten infrage kommenden Isotopen-Cluster zur weiteren Verarbeitung auszuwählen.
Bei mindestens einer Ausführungsform legt das System für die Auswahlbewertungen eine Rangfolge fest.
Bei mindestens einer Ausführungsform beinhaltet das System eine Steuereinheit des datenabhängigen Erfassungssystems, das die datenabhängige Erfassung durch das System steuert, wobei: der Satz von Anweisungen bei Ausführung durch die Systemsteuereinheit das System veranlasst, ein Massenspektrum der Probe zu gewinnen, wobei das Massenspektrum die infrage kommenden Isotopen-Cluster beinhaltet, und für jeden infrage kommenden Isotopen-Cluster unter Verwendung eines Trennfensters mit einer vorgegebenen Breite entlang einer m/z-Achse des Massenspektrums mindestens einen Teil des Massenspektrums abzutrennen und den Reinheitswert für jeden betreffenden, infrage kommenden Isotopen-Cluster innerhalb jedes einzelnen Trennfensters zu berechnen.
Bei mindestens einer Ausführungsform wählt das System automatisch eine oder mehrere der höchsten Auswahlbewertungen zur weiteren Analyse der dadurch dargestellten, infrage kommenden Isotopen-Cluster aus.
Bei mindestens einer Ausführungsform beinhaltet das System ein Massenspektrometer, wobei die Steuereinheit mindestens einen Teil der Funktionen des Massenspektrometers steuert.
Bei mindestens einer Ausführungsform beinhaltet das System eine Flüssigkeitschromatografiesäule, um die Probe zur Analyse durch das Massenspektrometer bereitzustellen.
Bei mindestens einer Ausführungsform weist die datenabhängige Erfassung nach der Auswahl einer oder mehrerer der höchsten Auswahlbewertungen zur weiteren Analyse die Trennung des einen oder der mehreren durch die Auswahlbewertungen dargestellten und ausgewählten infrage kommenden Isotopencluster mittels Tandem-Massenspektrometrie auf.
Es wird ein computerlesbares Medium bereitgestellt, das bei bestimmten Ausführungsformen Anweisungen bereitstellt, die bei Ausführung in einem Prozessor diesen zur Durchführung eines Verfahrens veranlassen, das die folgenden Schritte aufweist: Gewinnen von Daten, die für Isotopen-Cluster repräsentativ sind, welche aus einem Massenspektrum einer Probe ermittelt wurden; für jeden infrage kommenden Isotopen-Cluster: Berechnen eines Reinheitswertes für den innerhalb eines betreffenden, zur Gewinnung der Daten verwendeten Trennfensters liegenden infrage kommenden Ionen-Cluster; für jeden infrage kommenden Isotopen-Cluster: Berechnen einer Auswahlbewertung auf der Grundlage des betreffenden Reinheitswertes; iteratives Berechnen eines Reinheitswertes und Berechnen einer Auswahlbewertung für jeden der ermittelten Isotopen-Cluster; und Auswählen eines oder mehrerer der Isotopen-Cluster mit den höchsten Auswahlbewertungen, die sich aus der Rangfolge ergeben, zur deren weiterer Analyse.
Bei mindestens einer Ausführungsform veranlassen die im Prozessor ausgeführten Anweisungen den Prozessor, für die Auswahlbewertungen eine Rangfolge festzulegen.
Bei mindestens einer Ausführungsform veranlassen die im Prozessor ausgeführten Anweisungen den Prozessor, die folgenden Schritte auszuführen: Gewinnen des Massenspektrums der Probe; iteratives Verwenden des Trennfensters mit einer vorgegebenen Breite entlang einer m/z-Achse des Massenspektrums, um an den Stellen der infrage kommenden Isotopen-Cluster Teile des Massenspektrums abzutrennen; und Ermitteln und Gewinnen der Daten, welche für die Isotopen-Cluster repräsentativ sind.
Bei mindestens einer Ausführungsform werden die Reinheitswerte gemäß:
berechnet, wobei p₁ ≥ 0, 1 ≥ p₂ ≥ 0, I_prec gleich dem Wert des Ionenstroms des infrage kommenden Isotopen-Cluster und I_other gleich der Summe der Ionenströme aller anderen Ionenströme innerhalb des Trennfensters ist, und wobei das Bereitstellen einer Auswahlbewertung das Multiplizieren des berechneten Reinheitswertes des infrage kommenden Isotopen-Cluster mit einem Intensitätswert des infrage kommenden Isotopen-Cluster aufweist, um die Auswahlbewertung bereitzustellen.
Diese und weitere Merkmale der Erfindung werden dem Fachmann nach der Lektüre der folgenden ausführlichen Beschreibung der Verfahren, Systeme und computerlesbaren Medien klar.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht schematisch ein Beispiel eines datenabhängigen Erfassungssystems 10 gemäß bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
2 ist ein Ablaufdiagramm, das die Arbeitsschritte eines Verfahrens gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur besseren Trennung von Vorgängerionen für deren nachfolgende Analyse veranschaulicht.
3 veranschaulicht ein auf einer Benutzeroberfläche dargestelltes Merkmal gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, das von einem Benutzer ausgewählt werden kann, wobei das Merkmal durch einen Benutzer interaktiv verändert werden kann, um eine gewünschte Breite eines eng begrenzten Massentrennfensters einzustellen.
Die 4A bis 4I veranschaulichen die Entwicklung der Einhüllenden von zwei Isotopenclustern im zeitlichen Verlauf von t₁ bis t₈.
Die 5A und 5B veranschaulichen Fenster, die überlappende Bereiche eines Spektrums abtrennen, wobei der m/z-Bereich in 5B geringfügig niedrigere (und dennoch überlappende) m/z-Werte als in 5A beinhaltet.
6 zeigt ein typisches Computersystem gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
7 ist ein Ablaufdiagramm, das die Arbeitsschritte bei einer online realisierten Ausführungsform des Verfahrens zeigt.
8 ist ein Ablaufdiagramm, das die Arbeitsschritte bei einer offline realisierten Ausführungsform des Verfahrens zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Vor der Beschreibung der Systeme, Verfahren und computerlesbaren Medien sollte klar sein, dass diese Erfindung nicht auf die einzelnen beschriebenen Ausführungsformen beschränkt ist und insofern natürlich Änderungen unterliegen kann. Ferner sollte klar sein, dass die hier gebrauchten Begriffe nur zur Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dienen und nicht als Einschränkung zu verstehen sind, da der Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung nur durch die angehängten Ansprüche begrenzt wird.
Wenn ein Wertebereich angegeben wird, sollte klar sein, dass damit ausdrücklich auch jeder Zwischenwert in Zehnteleinheiten des unteren Grenzwertes zwischen dem oberen und dem unteren Grenzwert dieses Bereichs gemeint ist, sofern aus dem Zusammenhang nicht ausdrücklich anderes hervorgeht. Jeder kleinere Bereich zwischen einem beliebigen angegebenen Wert oder Zwischenwert in einem angegebenen Bereich und jeder beliebige andere angegebene oder Zwischenwert im angegebenen Bereich wird von der Erfindung umfasst. Der obere und der untere Grenzwert dieser kleineren Bereiche kann unabhängig in den Bereich einbezogen oder von diesem ausgeschlossen werden, und jeder Bereich, bei dem einer, kein oder beide Grenzwerte in die kleineren Bereiche einbezogen sind, wird in Abhängigkeit von jedem ausdrücklich ausgeschlossenen Grenzwert des angegebenen Bereichs auch von der Erfindung umfasst. Wenn der angegebene Bereich einen oder beide Grenzwerte einschließt, sind auch Bereiche in der Erfindung enthalten, die einen oder beide eingeschlossenen Grenzwerte ausschließen.
Sofern nicht anderweitig definiert, haben alle hierin gebrauchten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie einem Fachmann verständlich sind, an den sich diese Erfindung richtet. Obwohl zum Ausführen oder Testen der vorliegenden Erfindung beliebige Verfahren und Materialien verwendet werden können, die den hier beschriebenen ähnlich oder gleichwertig sind, werden im Folgenden die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Alle hierin erwähnten Veröffentlichungen sind durch Bezugnahme hierin aufgenommen, um die Verfahren und/oder Materialien darzulegen und zu beschreiben, in Verbindung mit denen die Veröffentlichungen zitiert werden.
Es muss darauf hingewiesen werden, dass die hierin und in den angehängten Ansprüchen gebrauchten Einzahlformen ”ein”, ”eine” und ”der, die, das” auch die Mehrzahlbedeutung beinhalten, sofern aus dem Zusammenhang nicht ausdrücklich anderes hervorgeht. Somit beinhaltet zum Beispiel die Bezeichnung ”eine Berechnung” eine Vielzahl solcher Berechnungen und die Bezeichnung ”das Spektrum” ein oder mehrere Spektren und deren Entsprechungen, wie sie dem Fachmann bekannt sind, usw.
Die hier erörterten Veröffentlichungen dienen ausschließlich zu deren Darlegung vor dem Einreichungsdatum der vorliegenden Erfindung. in der vorliegenden Erfindung ist nichts als Anerkenntnis zu verstehen, dass die vorliegende Erfindung nicht zur Vordatierung einer solchen Veröffentlichung aufgrund einer vorhergehenden Erfindung berechtigt sei. Ferner können die angegebenen Veröffentlichungsdaten von den tatsächlichen Veröffentlichungsdaten abweichen, die möglicherweise unabhängig bestätigt werden müssen.
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschreiben Verfahren zur Ermittlung von Vorgängerionen, die durch die MS/MS-Analyse besser ausgewertet werden können. insbesondere betreffen die Ausführungsformen die Festlegung einer zumindest teilweise auf der Grundlage eines hier definierten ”Reinheitswertes” ermittelten Rangfolge, nach der die Vorgängerionen für die Untersuchung durch die Tandem-Massenspektrometrie ausgewählt werden.
Bei einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann die Wahrscheinlichkeit sinken, dass ein oder mehrere Vorgängerionen in ein und demselben Trennfenster eines Tandem-Massenspektrometers ausgewählt werden, was zu einem nicht auswertbaren Spektrum führen kann.
In bestimmten Fällen kann ein fortlaufender Reinheitswert zugewiesen werden, um den Verunreinigungsgrad eines Vorgängerions durch ein oder mehrere andere Vorgängerionen innerhalb seines Trennfensters anzugeben. Im Gegensatz zur Verwendung eines abgestuften Reinheitswertes kann bei bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung durch Verwendung eines durchgängigen Wertes die Retentionszeit ermittelt werden, bei welcher der Überlappungsbereich der Vorgängerionen auf ein Mindestmaß verringert wird, und es können auswertbare Spektren von Vorgängerionen gewonnen werden, die bei Verwendung eines abgestuften Reinheitswertes ignoriert worden wären (z. B. Entscheidung zwischen überlappenden und nicht überlappenden Isotopengruppen).
1 veranschaulicht schematisch ein Beispiel eines datenabhängigen Erfassungssystems 10 gemäß der vorliegenden Erfindung. Das System 10 beinhaltet eine Steuereinheit 14, die mindestens einen Prozessor 602 mit einem Speicher 16 enthält, bei dem es sich um beliebige oder eine Kombination verschiedener physischer Komponenten handeln kann, die im Folgenden anhand von Beispielen beschrieben werden und als computerlesbares Medium dienen, welches dem einen oder den mehreren Prozessoren 602 Anweisungen erteilt, damit diese die hier beschriebenen Verfahren durchführen.
Das System 10 beinhaltet ferner eine Benutzeroberfläche 110, die bidirektional mit dem Prozessor 602 verbunden ist, damit ein Benutzer Eingaben zum Beispiel in Form von Daten, Text usw. für das System vornehmen oder entsprechende Ausgaben vom System empfangen kann, die auf einem Bildschirm der Benutzeroberfläche 110 angezeigt und/oder auf Papier usw. gedruckt sind.
Wahlweise kann das System 10 bei dem gezeigten Beispiel mit einem MS/MS-Tandem-Massenspektrometer 12 verbunden, alternativ jedoch auch in ein MS/MS-Massenspektrometersystem integriert sein. Wahlweise ist mit dem Massenspektrometer 12 eine Flüssigkeitschromatografiesäule 18 verbunden. Die oben beschriebenen Ausführungsformen sind so eingerichtet, dass die massenspektrometrischen Daten in Echtzeit verarbeitet werden. Bei einer anderen Ausführungsform braucht das System 10 nicht in ein System integriert zu sein, das ein Massenspektrometer 12 oder eine Flüssigkeitschromatografiesäule 18 beinhaltet, wobei in diesem Fall der eine oder die mehreren Prozessoren nicht als Steuereinheit für das Massenspektrometer dienen müssen. Bei diesen alternativen Ausführungsformen werden die von einem Massenspektrometer 12 ausgegebenen massenspektrometrischen Daten zum Beispiel in einer Datenbank oder einem anderen Computerspeicher offline gespeichert und in das System 10 eingegeben, um von diesem in derselben Weise wie bei der Echtzeitverarbeitung in Verbindung mit einem Massenspektrometer verarbeitet zu werden, um die Reinheitswerte und die Auswahlbewertungen zu berechnen, für die Auswahlbewertungen eine Rangfolge festzulegen und die Isotopen-Cluster für die weitere Verarbeitung auszuwählen.
Bei einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird die Wahrscheinlichkeit der Auswahl von Vorgängerionen, zum Beispiel aus einem Quadrupol (oder Hexapol, Oktapol usw.) des Massenspektrometers, die gleichzeitig mit einem oder mehreren anderen Ionen eluiert werden, zur weiteren Verarbeitung durch die MS/MS-Spektroskopie verringert. Deshalb wird für die Vorgängerionen gemäß der vorliegenden Erfindung eine Rangfolge festgelegt, sodass die Ionen mit der höchsten Rangordnung zur Weiterverarbeitung durch die MS/MS-Spektroskopie ausgewählt und die zu einem einzelnen Vorgängerion gehörenden Komponenten erfolgreicher abgetrennt werden. Obwohl bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in erster Linie für die Proteomik eingesetzt werden können, wo für die Bildung eines Vorgängerions Peptide infrage kommen, können die vorliegenden Systeme und Verfahren ebenso gut auf die Auswahl von Vorgängerionen von kleinen Molekülen in einem Tandem-Massenspektrometer eingesetzt werden, zum Beispiel bei der Analyse von Stoffwechselprodukten (Metabolomik) sowie bei der Ermittlung unversehrter Proteine bei der Proteomik-Strukturanalyse (Top-down-Ansatz) angewendet werden.
Bei einer im Ablaufdiagramm von 2 beschriebenen Ausführungsform wird ein Verfahren zur verbesserten Auswahl von Vorgängerionen zu deren weiterer Analyse durch nachfolgende Verarbeitung ausgewählter Ionen unter Verwendung der MS/MS-Spektrometrie bereitgestellt.
Bei der Proteomik-Analyse nach dem Bottom-up-Ansatz wird die Probe proteolytisch zersetzt, und die entstehenden Peptide werden unter Verwendung der IC/MS/MS (Flüssigkeitschromatografie/Tandem-Massenspektrometrie) analysiert. Mit denselben im Folgenden beschriebenen Verfahren zur Festlegung der Rangfolge von weiter zu analysierenden Vorgängerionen können jedoch auch andere Proben verarbeitet werden. Beim Bottom-up-Ansatz werden die Peptide in der Probe im Allgemeinen unter Verwendung der direkt mit dem IC-System verbundenen Elektrospray-Ionisation ionisiert. Im Verlauf der LC/MS/MS-Experimente werden ausgewählte Vorgängerionen nach ihrem Masse/Ladungs-Verhältnis (m/z) gefiltert und mittels tandem-massenspektrometrischer Verfahren wie beispielsweise (aber nicht darauf beschränkt) stoßinduzierte Dissoziation (Collision Induced Dissociation, CID) oder Elektronenübertragungs-Dissoziation (Electron Transfer Dissociation, ETD) fragmentiert, um im Massenspektrometer ein charakteristische MS/MS-Spektrum zu erzeugen. Um ein bestimmtes Vorgängerion zuverlässig mit einer nachgeschalteten Software bestimmen zu können, muss das infrage kommende Vorgängerion vor dem MS/MS-Prozess herausgefiltert werden, da zusammen mit diesem gleichzeitig bis zu einigen Tausend andere Vorgängerionen eluiert werden.
In Schritt 202 wird ein Massenspektrum zum Beispiel aus dem Quadrupol des Massenspektrometers (oder alternativ bei einer Ausführungsform mittels Online-Verarbeitung aus einem Computerspeicher) gewonnen, das analysiert wird, um die Rangfolge von Vorgängerionen festzulegen. Zu diesem Zweck wird in Schritt 204 zum Abtrennen eines Teils des Massenspektrums ein eng begrenztes m/z-Trennfenster verwendet. Beim Offline-Prozess gibt ein Benutzer ebenso wie bei der Online-Erfassung ein gewünschtes Trennfenster ein, zum Beispiel unter Verwendung des Fensterauswahlmerkmals 32 in 3. Beim Filtern der Vorgängerionen im Quadrupol eines Tandem-Massenspektrometers 12 wird ein vom Benutzer auszuwählendes Massentrennfenster 40 verwendet (siehe z. B. 4). 3 veranschaulicht ein auf einer Benutzeroberfläche 110 dargestelltes Merkmal 32, das von einem Benutzer ausgewählt werden kann, um eine gewünschte Breite des eng begrenzten Massentrennfensters einzustellen. Zum Beispiel werden dem Benutzer durch Auswählen des Merkmals 32 wie beispielsweise durch einen Mausklick, durch einen Tastenanschlag oder Ähnliches Auswahlmöglichkeiten zum Beispiel in Form eines Aufklapp-Menüs, eines Aufklapp-Fensters oder Ähnlichem angeboten. Das System kann eine Standard-Fensterbreite beinhalten, die der Benutzer verwenden kann, wenn er keine Fensterbreite auswählen möchte. Es können auch andere auswählbare Breiten angeboten werden (z. B., Voreinstellung 1, Voreinstellung 2, ..., Voreinstellung N; die voreingestellte Werte aufweisen, zum Beispiel 1,3 m/z breit, 4 m/z breit, ..., usw.), die alle vom Benutzer ausgewählt werden können, um die Breite des Fensters auf den jeweiligen Vorgabewert einzustellen. Außerdem kann auch eine benutzerdefinierte Auswahl bereitgestellt werden, die der Benutzer anklicken und in die er seine gewünschte Fensterbreite eingeben kann.
Ein breiteres Massenfenster bewirkt eine höhere Empfindlichkeit für ein bestimmtes Vorgängerion, noch wahrscheinlicher aber eine Ionenverunreinigung, während ein schmaleres Massenfenster die Wahrscheinlichkeit für ein überaus stark angereichertes ausgewähltes Vorgängerion bei gleichzeitig verringerter Empfindlichkeit erhöht. Wenn zur Messung komplexer Proben Trennfenster von 1 m/z oder mehr verwendet werden, muss für jedes Vorgängerion mit einer beträchtlichen Ionen-Verunreinigung gerechnet werden..
Mit zunehmender Komplexität der Proben nimmt in gleichem Maße auch die Wahrscheinlichkeit zu, dass zwei oder mehr Vorgängerionen mit gleicher Häufigkeit durch weniger als ein Trennungsfenster 40 abgetrennt werden. In der Praxis wird das Trennfenster 40 im Verlauf der Berechnung der Reinheitswerte für verschiedene Vorgängerionen über das Massenspektrum 20 hinweg verschoben. Wenn ein oder zwei innerhalb eines einzelnen Trennfensters auftretende Isotopen-Cluster von Vorgängerionen für die MS/MS-Analyse ausgewählt werden, besteht eine nicht zu vernachlässigende Wahrscheinlichkeit, dass das resultierende MS/MS-Spektrum nicht ausgewertet werden kann, da Bestandteile von zwei verschiedenen Isotopen-Clustern zu Fragmentionen zerfallen und ein gemischtes MS/MS-Spektrum ergeben.
Weitere Einzelheiten zur Verwendung einer Flüssigchromatografiesäule und eines Massenspektrometers zur Gewinnung eines Massenspektrums sind zum Beispiel in der US-Patentschrift Nr. 7 297 941 zu finden, die hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
In Schritt 204 werden das gesamte Massenspektrum unter Verwendung eines Trennfensters 40 einer bestimmten Breite um jeden Isotopen-Cluster im Spektrum herum abgetastet und für jeden Isotopen-Cluster ein Reinheitswert berechnet. Diese Reinheitswerte dienen dann zur Berechnung von Auswahlbewertungen für die Auswahl der weiterzuverarbeitenden Isotopen-Cluster. Bei einem ”Vorgängerion” handelt es sich um einen oder mehrere Isotopen-Peaks eines Isotopen-Cluster, der auf der Grundlage einer Auswahlbewertung gemäß der vorliegenden Erfindung ausgewählt und weiterverarbeitet wird (z. B. mittels Tandem-MS (MS/MS)). Jeder Isotopen-Cluster in einem MS-Spektrum stellt ein mutmaßliches Vorgängerion dar. Nach der Berechnung der Reinheitswerte gemäß der vorliegenden Erfindung wird für die mutmaßlichen Vorgängerionen eine Rangfolge festgelegt. Dann werden durch die ”n” höchsten Auswahlbewertungen (wobei ”n” gleich einer vom Benutzer zuvor ausgewählten positiven ganzen Zahl ist) die ersten ”n” Vorgängerionen in der Rangfolge festgelegt, um deren ”n” nächste MS/MS-Spektren weiterzuverarbeiten. In manchen Fällen kann ein Vorgängerion aus einem Einzelpeak eines Isotopen-Cluster bestehen. Im Folgenden werden Einzelheiten zur Berechnung eines Reinheitswertes dargelegt. Auf der Grundlage des berechneten Reinheitswertes wird in Schritt 206 für jeden infrage kommenden Isotopen-Cluster eine Auswahlbewertung erstellt. Danach werden die infrage kommenden Vorgängerionen/Isotopen-Cluster in Schritt 208 nach ihrer Auswahlbewertung geordnet und somit ihre mit den erstellten Auswahlbewertungen einhergehende Rangfolge festgelegt, wobei die höchste Auswahlbewertung an der Spitze der Rangfolge steht.
In Schritt 210 wird mindestens ein Isotopen-Cluster zur weiteren Verarbeitung mittels der MS/MS-Spektroskopie ausgewählt. Die Auswahl erfolgt jeweils an der Spitze der Rangfolge derart, dass nur die höchsten Auswahlbewertungen berücksichtigt werden. Nach ihrer Erfassung können die MS/MS-Spektren mit vorausberechneten MS/MS-Spektren von Peptiden oder Spektraldatenbanken verglichen werden, um die Identität der Peptide (oder anderer Bestandteile, wenn es sich nicht um die oben beschriebenen Proteomik-Beispiele handelt) in der Probe zu ermitteln.
Im Folgenden wird ausführlicher beschrieben, wie das Verfahren gemäß verschiedenen Ausführungsformen online und offline angewendet werden kann. 7 veranschaulicht, wie Ausführungsformen des Verfahrens online in Echtzeit während eines Probendurchlaufs ablaufen, die Spektren der Vorgängerionen analysiert und die MS/MS-Spektren für die Isotopen-Cluster von Vorgängerionen mit den höchsten Bewertungen erfasst werden. Bei diesen in 7 veranschaulichten Ausführungsformen können die ausgewählten Isotopen-Cluster fragmentiert und vor Beendigung des Probendurchlaufs weiter analysiert werden. Bei einer in 8 gezeigten alternativen ”offline” ablaufenden Ausführungsform werden die Spektren der Vorgängerionen offline erfasst und analysiert. Bei dieser Analyse werden die Vorgängerionen mit den höchsten Bewertungen gespeichert, beispielsweise in Form einer Liste der Vorgängerionen, die zur Ermittlung dieser Vorgängerionen bei einer weiteren Messung, z. B. in demselben oder in einem anderen Messinstrument, herangezogen werden kann. Bei diesen in 8 veranschaulichten Ausführungsformen wird eine erste Probe gemessen, für die MS-Messwerte gewonnen werden, dann wird die Messung durchgeführt, die Vorgängerionen mit den höchsten Bewertungen werden anhand der Auswahlbewertungen der zu jedem Vorgängerion gehörenden Isotopen-Cluster ausgewählt und die MS/MS-Spektren der ausgewählten Vorgängerionen nach Beendigung des ersten Probendurchlaufs erfasst. Bei diesen Ausführungsformen können die MS/MS-Spektren zum Beispiel aus einem zweiten Teil der ersten Probe oder einer anderen Probe gewonnen werden.
Die 4A bis 4I veranschaulichen die Entwicklung der Einhüllenden von zwei Isotopen-Clustern 1 und 2 im zeitlichen Verlauf von t₁ bis t₈. Somit sind in den 4A bis 4H jeweils die Spektren für ein bestimmtes m/z-Fenster 40 zu den Zeitpunkten t₁ bis t₈ dargestellt. Bei jeder der 4A bis 4H sind auf der y-Achse die Häufigkeitswerte (z. B. die Intensität) und auf der x-Achse die m/z-Werte zum angegebenen Zeitpunkt aufgetragen. Es sind aufeinanderfolgende Erfassungszeitpunkte angegeben. 4I zeigt ein Chromatogramm der beiden Verbindungen 1 und 2 als Funktion der Intensität (Häufigkeit) auf der y-Achse von der Zeit (x-Achse).
Das Sternchen in 4C zeigt den monoisotopischen Peak des Cluster 1 (zum Zeitpunkt t₃) und das Sternchen in 4F den monoisotopischen Peak des Cluster 2 (zum Zeitpunkt t₆) an. Da die ”Verunreinigung” der Cluster 1 und 2 zu den Zeitpunkten t₄ (4D) und t₅ (4E) dargestellt ist, muss damit gerechnet werden, dass die Berechnung der Reinheitswerte für die Cluster 1 und 2 keine ausreichend hohen Werte ergeben, die eine Auswahl von Cluster 1 oder Cluster 2 zur weiteren Verarbeitung erlauben.
Ausgehend von einem infrage kommenden Isotopen-Cluster in einem MS-Spektrum 20 und einem Trennfenster 40 kann ein Reinheitswert für diesen Isotopen-Cluster innerhalb dieses Fensters wie folgt berechnet werden:
wobei
p₁ ≥ 0,
1 ≥ p₂ ≥ 0,
I_prec gleich dem Wert des Ionenstroms des infrage kommenden Isotopen-Cluster ist, und
I_other gleich der Summe aller anderen Ionenströme innerhalb des Trennfensters 40 ist.
Bei der Berechnung des Ionenstroms I_prec werden nur die Ionenströme der Signale innerhalb des Fensters für den infrage kommenden Isotopen-Cluster summiert. Somit wird der Ionenstrom für alle Peaks eines bestimmten Isotopen-Cluster innerhalb des Fensters berechnet. Desgleichen erfolgt die Berechnung von I_other durch Summieren aller Ionenströme außer I_prec im Trennfenster 40.
Die Parameter p₁ und p₂ stellen ein Maß für die Richtigkeit des Reinheitswertes/-kriteriums dar. Der Parameter p₁ gewichtet den Beitrag der Verunreinigungen, während der Parameter p₂ einen Grenzwert darstellt, bis zu dem Reinheitswerte zulässig sind. Wenn beispielsweise p₁ = 0 ist, werden alle Peaks in einem Spektrum als rein angesehen. Wenn jedoch p₁ = 1 und p₂ = 0 ist, weist ein Isotopen-Cluster einen nicht zu vernachlässigenden Reinheitswert auf, wenn I_prec > I_other ist, jedoch weist er einen Reinheitswert von 0 auf, wenn I_prec ≤ I_other ist. Die 5A und 5B veranschaulichen Fenster 40, die überlappende Bereiche eines Spektrums 20 abtrennen, wobei der m/z-Bereich in 5B geringfügig niedrigere (und dennoch überlappende) m/z-Werte als in 5A beinhaltet. Zu beachten ist jedoch, dass die Breite des Fensters 40 in beiden Fällen identisch ist.
Bei Anwendung von Gleichung (1) auf diese beiden verschiedenen Beispiele, bei denen der Isotopen-Cluster 3 den infrage kommenden Isotopen-Cluster darstellt, wird der Ionenstrom I_prec für das Fenster in 5A durch Summieren der Intensitäten von 3₁ , 3₂ und 3₃ berechnet. Der Ionenstrom Iother für das Fenster in 5A wird durch Summieren der Intensitäten von 4₂ und 4₃ berechnet. Wenn für p₁ der Wert 1 und für p₂ der Wert 0 gewählt wurde, ergab die Berechnung des Reinheitswertes für den Isotopen-Cluster 3 innerhalb des Fensters 40 einen Wert von ungefähr 0,5, da in diesem Fall I_prec – p₁·I_other > p₂ gilt. Der Ionenstrom I_prec für das Fenster in 5B wird durch Summieren der Intensitäten von 3₁ und 3₂ berechnet. Der Ionenstrom Iother für das Fenster in 5B wird durch Summieren der Intensitäten von 4₁ , 4₂ und 4₃ berechnet. Wenn für p_i der Wert 1 und für p₂ der Wert 0 gewählt wurde, ergab die Berechnung des Reinheitswertes für den Isotopen-Cluster 3 innerhalb des Fensters 40 in 5B einen Wert 0, da in diesem Fall I_prec – p₁·I_other ≤ p₂ gilt.
Die Werte von p₁ und p₂ können unter Verwendung der Merkmale 34 bzw. 36 (siehe 3) in derselben Weise wie bei der Voreinstellung der Fensterbreite in Form von benutzerdefinierten Werten vorausgewählt oder voreingestellt werden. Für p1 und p2 können beispielsweise beliebige Werte innerhalb der oben angegebenen Bereiche eingestellt werden. Alternativ kann das System auch Standardwerte von p₁ und p₂ verwenden, wenn sie vor Beginn der Berechnung der Reinheitswerte nicht vom Benutzer voreingestellt werden. Der Nenner in Gleichung (1) normalisiert die Reinheitswerte auf Werte zwischen 0 und 1.
Die Werte p1 und p2 können von einem Benutzer gewählt werden. Zunehmende Werte von p1 und p2 unterstreichen die Richtigkeit der Auswahl nach Reinheitswerten. Wenn der Benutzer ”reinere” MS/MS-Spektren wünscht, werden somit für p1 und p2 höhere Werte gewählt als in Fällen, bei denen nicht so zwingende Reinheitswerte/Auswahlbewertungen gewählt werden. Werden jedoch relativ höhere Werte für p1 und p2 gewählt, muss ein Kompromiss in Bezug darauf eingegangen werden, dass mutmaßliche Vorgängerionen mit einer geringeren, aber für die Ermittlung durch MS/MS ausreichenden Reinheit möglicherweise nicht ausgewählt werden, wodurch aus einer Originalprobe insgesamt weniger Peptide ermittelt werden als bei Verwendung niedrigerer Werte für p1 und p2. In manchen Fällen können jedoch MS/MS-Daten von höchster Qualität erwünscht sein, wodurch die Verwendung von hohen Werten für p1 und p2 gerechtfertigt wären. Zum Beispiel ist sowohl zur genauen Lokalisierung von posttranslationalen Peptidmodifikationen als auch bei der De-Novo-Sequenzierung eine sehr sichere Bestimmung von Peptidsequenzen mittels MS/MS erwünscht.
Um für die Berechnung der Rangfolge für die Auswahl für die MS/MS-Analyse nicht nur die Intensität zu verwenden, wird die Intensität mit dem Reinheitswert multipliziert, um eine Auswahlbewertung wie folgt zu erhalten: Auswahlbewertung = Iprec·Reinheit (3)
Somit wird in diesem Fall die Auswahlbewertung als Produkt des Reinheitswertes des infrage kommenden Isotopen-Cluster und der Intensitätssumme der Peak des infrage kommenden Isotopen-Cluster innerhalb des Trennfensters 40 zum Zeitpunkt der Messung dargestellt. Somit wird jedem Vorgängerion/jedem Isotopen-Cluster im gesamten Massenspektrum, der möglicherweise zur weiteren Verarbeitung ausgewählt werden kann, eine Auswahlbewertung zugewiesen. Somit wird jeder Isotopen-Cluster in einem Massenspektrum berücksichtigt, und die Orte im Massenspektrum der Vorgängerionen/Isotopen-Cluster geben die für die Berechnungen verwendeten Orte des Trennfensters 40 an.
Die folgende Tabelle zeigt Ergebnisse von Experimenten, die mit einer Probe von 1 μg eines E. coli-Lysats nach Zersetzung mit Trypsin in einem Agilent QTOF 6520 unter Verwendung des HPLC-Chips und chromatografischer Gradienten unterschiedlicher Länge durchgeführt wurden. Die Proteinbestimmungsanalysen wurden mittels eines Spectrum Mill (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, Kalifornien, USA) unter Verwendung der Standardsuchparameter für das Agilent Q-TOF durchgeführt, wobei allen Proteinen automatisch Auswahlbewertungen > 13 und den übrigen Peptiden Auswahlbewertungen > 8 zugeordnet wurden. Im Durchschnitt stieg während der 40-minütigen Messung und der gleichzeitigen Berechnung der ”Reinheitswerte” die Anzahl der ermittelten Proteine um ungefähr 12% und die Anzahl der ermittelten Peptide um 11%.

Wenn das Experiment auf 60 Minuten ausgedehnt wurde (hierfür werden keine Daten gezeigt), wurde bei Verwendung der Datenerfassungssoftware ohne die Berechnung der Reinheitswerte und den Auswahlprozess gemäß der vorliegenden Erfindung kein nennenswerter Anstieg der Anzahl der Proteine beobachtet. Bei Verwendung des Datenerfassungssystems einschließlich der Berechnung der Reinheitswerte gemäß der vorliegenden Erfindung, d. h. bei Auswahl der infrage kommenden Isotopen-Cluster auf der Grundlage der Auswahlbewertungen gleich einem oder größer als ein vorgegebener Schwellenwert für die Auswahlbewertungen (d. h. ein Schwellenwert von 13 für Proteine und ein Schwellenwert von 8 für die übrigen Peptide), nahm die Anzahl der Proteine um 20% und die Anzahl der Peptide um 30% zu, wenn das Experiment von 40 auf 80 Minuten ausgedehnt wurde. Ferner wurden mit einem 6520 Q-TOF-Massenspektrometer bisher noch nie zuvor so viele Proteine in einer solchen injizierten Probenmenge beobachtet wie die bei der 80-minütigen Messung ermittelten 498 Proteine. Dieser Informationszuwachs ist auf die Auswahl von ”reineren” Vorgängerionen zurückzuführen, deren reinere MS/MS-Spektren durch die Suchsoftware in der Proteomik-Datenbank leichter ausfindig gemacht werden konnten. TABELLE

Experiment	Dauer des _Experiments	Anzahl ermittelter Spektren	Anzahl der Proteine	Anzahl verschiedener Peptide
Reinheit (Nr. 0)	40 min.	1891	427	1553
Reinheit (Nr. 1)	40 min.	1930	446	1607
Reinheit (Nr. 2)	40 min.	1841	415	1545
Reinheit (Nr. 3)	60 min.	2325	474	1934
Reinheit (Nr. 4)	80 min.	2542	498	2072
Standard (Nr. 1)	40 min.	1663	384	1423
Standard (Nr. 2)	40 min.	1656	381	1414

Bei späteren Studien wurden 2,4 μg eines Hefezellenlysats nach Zersetzung mit Trypsin injiziert und 670 Proteine, 3915 Spektren und 2880 verschiedene Peptide ermittelt. Unabhängig von der injizierten Probenmenge wurden hierbei wesentlich mehr Peptide mit einem Agilent Q-TOF-System bestimmt als je zuvor.
Bei genauerer Betrachtung zeigt die obige Tabelle, dass die Analysenleistung bei Verwendung der Reinheitswerte zum Erstellen der Auswahlbewertungen zur Auswahl von Vorgängerionen für die weitere Analyse durch die Tandem-Massenspektrometrie zunimmt, da bei Verwendung der Auswahl auf der Grundlage der Reinheitswerte wesentlich mehr Spektren und damit wesentlich mehr Proteine und Peptide bestimmt werden.
Oben wurde bereits darauf hingewiesen, dass die obige Beschreibung zwar vor allem auf die Verwendung in der Proteomik ausgerichtet ist, jedoch findet die vorliegende Erfindung ebenso Anwendung bei der Auswahl von Vorgängerionen kleiner Moleküle in einem Tandem-Massenspektrometer, was routinemäßig in der Metabolomikanalyse genutzt wird, sowie bei der Ermittlung unversehrter Proteine in der Proteomik-Strukturanalyse.
Der Nenner in Gleichung (1) dient zur Normalisierung der Reinheitswerte auf Werte zwischen 0 und 1 und kann wahlweise angewendet werden. Bei einer anderen Ausführungsform kann die Reinheit wie folgt definiert werden: Purity = Iprec – p1·Iother wenn Iprec – p1·Iother > p2; und (3) Reinheit = 0 wenn Iprec – p1·Iother ≤ p2 (4)wobei
p₁ ≥ 0,
1 ≥ p₂ ≥ 0,
I_prec gleich dem Wert des Ionenstroms des infrage kommenden Isotopen-Cluster ist, und
I_other gleich der Summe aller anderen Ionenströme innerhalb des Trennfensters ist.
Im Gegensatz zu der durch Gleichung (1) definierten I_prec und I_other) kann den Ionen mit verschiedenen m/z-Werten innerhalb des Fensters dieselbe oder eine andere Gewichtung zukommen. Zum Beispiel kann es erwünscht sein, Ionen in der Mitte des Fensters 40 eine höhere Gewichtung zuzuweisen als den Ionen am Rand des Fensters 40. Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Trennfenster 40 eines Vorgängerions verändert, um seinen Reinheitswert möglichst stark zu erhöhen. Zum Beispiel kann die Mitte des Trennfensters 40 so verschoben werden, dass Störeinflüsse (z. B. eine ”Verunreinigung”) durch Isotopen-Cluster auf den Ziel-Cluster (”infrage kommender Isotopen-Cluster”) verringert werden.
Als weitere Alternative für das Sortieren der Peaks (Isotopen-Cluster) nach ihrer mit dem Reinheitswert multiplizierten Intensität führt auch eine monotone Funktion ihrer Reinheitswerte zu Verbesserungen, z. B.: I_prec·F(Reinheit), wobei F(x) eine monotone Funktion von x ist. Als Beispiele einer monotonen Funktion des Reinheitswertes dienen unter anderem, aber nicht ausschließlich: die Quadratwurzel des Reinheitswertes oder das Quadrat des Reinheitswertes.
6 zeigt ein typisches Computersystem gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Das Computersystem 600 beinhaltet eine beliebige Anzahl von (auch als Zentraleinheiten, CPUs bezeichneten) Prozessoren 602, die mit Speichereinheiten verbunden sind, darunter auch ein Arbeitsspeicher 606 (üblicherweise ein Speicher mit wahlfreiem Zugriff, RAM) und ein Hauptspeicher 604 (üblicherweise ein Nur-Lese-Speicher, ROM). In der Technik ist bekannt, dass der Hauptspeicher 604 zur unidirektionalen Übertragung von Daten und Anweisungen an die CPU und der Arbeitsspeicher 606 üblicherweise zum bidirektionalen Übertragen von Daten und Anweisungen dient. Beide Speichereinheiten können beliebige geeignete computerlesbare Speichermedien beinhalten, wie sie oben beschrieben wurden. Mit der CPU 602 ist bidirektional auch eine Massenspeichereinheit 608 verbunden, die zusätzlichen Speicherplatz bereitstellt und eines der oben beschriebenen computerlesbaren Medien beinhalten kann. Hierbei wird darauf hingewiesen, dass die hier gebrauchten Begriffe ”computerlesbare Medien” ”computerlesbares Speichermedium”, ”computerlesbares Medium” und ”computerlesbare Speichermedien” selbstverständlich keine Trägerwellen oder andere Energieformen beinhalten. Die Massenspeichereinheit 608 kann zum Speichern von Programmen, Daten und Ähnlichem verwendet werden und besteht üblicherweise aus einem externen Speichermedium wie beispielsweise einer Festplatte, die langsamer als der Arbeitsspeicher ist. Es ist klar, dass die in der Massenspeichereinheit 608 gespeicherten Daten in bestimmten Fällen standardmäßig in einem virtuellen Speicher als Teil des Arbeitsspeichers 606 gespeichert werden können. Auch eine bestimmte Massenspeichereinheit wie ein CD-ROM oder ein DVD-ROM 614 kann Daten unidirektional an die CPU übertragen.
Die CPU 602 ist auch mit einer Schnittstelle 610 verbunden, die eine Benutzeroberfläche 110 beinhaltet und eine oder mehrere Eingabe-/Ausgabeeinheiten wie zum Beispiel Videobildschirme, Rollkugeln, Mäuse, Tastaturen, Mikrofone, berührungsempfindliche Bildschirme, Kartenlesegeräte, Magnetband- oder Papierbandlesegeräte, Tabletts, Stifte, Sprach- oder Handschrifterkennungsgeräte oder andere bekannte Eingabeeinheiten wie beispielsweise natürlich auch andere Computer beinhalten kann. Die CPU 602 kann bei Bedarf unter Verwendung eines Netzwerkanschlusses 612 mit einem Computer- oder Datenübertragungsnetz verbunden werden. Über einen solchen Netzwerkanschluss kann die CPU während der Ausführung der oben beschriebenen Schritte des Verfahrens Daten vom Netzwerk empfangen oder an das Netzwerk senden. Die oben beschriebenen Einheiten und Materialien sind dem mit Computerhardware und -software befassten Fachmann geläufig.
Die oben beschriebenen Hardwareelemente können als Reaktion auf Anweisungen mehrerer Softwaremodule in Aktion treten, um die Arbeitsschritte dieser Erfindung auszuführen. Zum Beispiel können Anweisungen zur Berechnung von Reinheitswerten und Auswahlbewertungen sowie zum Betreiben der Steuereinheit 14 zur Steuerung des Massenspektrometers 12, Anweisungen zur Steuerung der Benutzeroberfläche 110 und zum Anzeigen von Ergebnissen auf dieser sowie andere Anweisungen in der Massenspeichereinheit 608 oder 614 gespeichert und in Verbindung mit dem Arbeitsspeicher 606 in der CPU 602 ausgeführt werden.
Das oben beschriebene Verfahren und die Programmierung können in einem Massenspektrometersystem angewendet werden, das ganz allgemein eine Ionenquelle zum Ionisieren einer Probe, einen Massenanalysator zum Trennen der Ionen und einen Detektor zum Detektieren der Ionen enthält. In bestimmten Fällen kann als Massenspektrometer ein so genanntes ”Tandem”-Massenspektrometer eingesetzt werden, das Vorgängerionen abtrennen, die Vorgängerionen fragmentieren und die fragmentierten Vorgängerionen analysieren kann. Solche Systeme sind in der Technik bestens bekannt (siehe z. B. die US-Patentschriften 7 534 996 , 7 531 793 , 7 507 953 , 7 145 133 , 7 229 834 und 6 924 478 ) und können in einer Vielfalt von Anordnungen ausgeführt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen kann die Tandem-Massenspektrometrie unter Verwendung einzelner räumlich voneinander getrennter Massenanalysatoren oder in bestimmten Fällen unter Verwendung eines einzigen Massenspektrometers durchgeführt werden, bei dem die verschiedenen Trennschritte zeitlich voneinander getrennt sind. Bei der ”räumlich getrennten” Tandem-MS sind die Gerätekomponenten (QqQ oder QTOF) physisch voneinander getrennt, während bei der ”zeitlich getrennten” Tandem-MS eine Ionenfalle verwendet wird.
Ein beispielhaftes Massenspektrometersystem kann eine Ionenquelle mit einer Ionisationseinheit, einen Massenanalysator und einen Detektor enthalten. In der Technik ist es üblich, dass die Ionenquelle und der Massenanalysator durch eine oder mehrere dazwischen liegende Vakuumkammern voneinander getrennt sind, in welche die Ionen von der Ionenquelle z. B. mittels einer Übertragungskapillare oder Ähnliches überführt werden. Ferner ist es in der Technik üblich, dass die dazwischen liegenden Vakuumkammern auch eine Begrenzungsblende zum Anreichern der in dem aus der Übertragungskapillare austretenden Ionenstrahl enthaltenen Analytionen (in Bezug auf die Lösemittelionen und das Puffergas) enthalten können, bevor sie in die Ionenoptik (z. B. eine Ionenstrahlführung oder Ähnliches) gelangen, welche die Ionen zu einem im Hochvakuum befindlichen Massenanalysator lenkt.
Die Ionenquelle kann nach einem beliebigen Ionisationsverfahren arbeiten, darunter, aber nicht darauf beschränkt, zum Beispiel die Elektrospray-Ionisation (ESI), die chemische Atmosphärendruck-Ionisation (APCI), die Elektronenstoß-Ionisation (EI), die Atmosphärendruck-Fotoionisation (APPI), die matrixgestützte Laserdesorptions Ionization (MALDI) oder die induktiv gekoppelte Plasmaionisations (ICP), oder eine Kombination dieser Verfahren (um eine so genannte ”Multimode”-Ionisationsquelle zu schaffen). Bei einer Ausführungsform können die Vorgängerionen mittels EI, ESI oder MALDI erzeugt und ein ausgewähltes Vorgängerion durch Stoßprozesse oder unter Verwendung von Photonen fragmentiert werden, um daraus Ionen zu erzeugen, die anschließend analysiert werden.
Desgleichen kann jeder aus einer Vielfalt verschiedener Massenanalysatoren ein Teil des oben beschriebenen Systems sein, darunter ein Laufzeit-Massenanalysator (TOF), ein Fouriertransformations-Massenanalysator auf der Grundlage der Ionenzyklotronresonanz (FTICR), eine Ionenfalle, Quadrupol- oder doppelfokussierende Sektorfeld-Massenanalysatoren oder beliebige Mischformen davon. Bei einer Ausführungsform kann als Massenanalysator ein Sektorfeld-, ein Transmissions-Quadrupol- oder ein Laufzeit-Massenanalysator verwendet werden.
Bei bestimmten Ausführungsformen kann das System außerdem eine analytische Trenneinheit zum Trennen der Komponenten vor dem Einbringen in das System und vor dem Ionisieren durch die Ionenquelle des Systems enthalten. Zu diesem Zweck kann die Ionenquelle funktionell mit einer Einheit zum Erzeugen eines Probenstroms verbunden sein, in der die Komponenten der Probe bereits voneinander getrennt wurden. Bei bestimmten Ausführungsformen handelt es sich hierbei um eine Chromatografieeinheit, welche die Komponenten z. B. mittels Gaschromatografie (GC) oder Flüssigkeitschromatografie (LC) trennt. Beispielhafte Systeme können eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografieeinheit (HPLC), eine Ultrahochdruck-Flüssigkeitschromatografieeinheit (UHLPC), eine Kapillarelektrophoreseeinheit (CE) oder eine Kapillarelektrophorese-Chromatografieeinheit (CEC) beinhalten.
Obwohl die vorliegende Erfindung unter Bezug auf deren spezielle Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte klar sein, dass der Fachmann daran verschiedene Änderungen vornehmen und gleichwertige Bestandteile austauschen kann, ohne vom Geist und Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen. Außerdem können zahlreiche Änderungen vorgenommen werden, um eine Anpassung an bestimmte Situationen, Materialien, Stoffzusammensetzungen, Verfahren oder Verfahrensschritte an das Ziel, den Geist und den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung zu erreichen. Alle derartigen Änderungen sind von vornherein im Geltungsbereich der hier anhängenden Ansprüche enthalten.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- US 7297941 [0005, 0059]
- US 7534996 [0084]
- US 7531793 [0084]
- US 7507953 [0084]
- US 7145133 [0084]
- US 7229834 [0084]
- US 6924478 [0084]

Claims

Verfahren zum Analysieren der Daten eines Massenspektrometers zur datenabhängigen Erfassung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: Gewinnen eines Massenspektrums einer Probe, wobei das Massenspektrum infrage kommende Isotopen-Cluster beinhaltet; Verwenden eines Trennfensters mit einer vorgegebenen Breite entlang einer m/z-Achse des Massenspektrums und Verwenden eines zur datenabhängigen Erfassung eingerichteten Computers zum Abtrennen eines Teils des Massenspektrums für jeden infrage kommenden Isotopen-Cluster; Berechnen eines Reinheitswertes für jeden einzelnen innerhalb des Trennfensters befindlichen infrage kommenden Isotopen-Cluster unter Verwendung des für die datenabhängige Erfassung eingerichteten Computers; Berechnen einer Auswahlbewertung für jeden infrage kommenden Isotopen-Cluster auf der Grundlage jedes einzelnen Reinheitswertes; und Auswählen eines oder mehrerer infrage kommender Isotopen-Cluster mit den höchsten Auswahlbewertungen zur weiteren Analyse.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner das Festlegen einer Rangfolge der Isotopen-Cluster entsprechend den Auswahlbewertungen aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reinheitswerte auf der Grundlage einer mit I_prec monoton steigenden und einer mit I_other monoton fallenden Funktion berechnet werden, wobei I_prec gleich dem Wert des Ionenstroms des infrage kommenden Isotopen-Cluster und I_other gleich der Summe aller anderen Ionenströme innerhalb des betreffenden Trennfensters ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reinheitswerte gemäß:
berechnet werden, wobei p₁ ≥ 0, 1 ≥ p₂ ≥ 0, I_prec gleich dem Wert des Ionenstroms des infrage kommenden Isotopen-Cluster und I_other gleich der Summe aller anderen Ionenströme innerhalb des Trennfensters ist; und wobei das Bereitstellen einer Auswahlbewertung das Multiplizieren der Intensität des infrage kommenden Isotopen-Cluster mit einem der folgenden Werte aufweist: mit dem berechneten Reinheitswert oder einer monotonen Funktion des berechneten Reinheitswertes, um die Auswahlbewertung bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 4, das ferner die Vorauswahl mindestens eines der Werte p₁ und p₂ durch eine Person aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die beiden Werte p₁ und p₂ von einer Person vorausgewählt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reinheitswerte gemäß: Purity = Iprec – p1·Iother; wenn Iprec – p1·Iother > p2; und Reinheit = 0 wenn Iprec – p1·Iother ≤ p2; berechnet werden, wobei p₁ ≥ 0, 1 ≥ p₂ ≥ 0, I_prec gleich dem Wert des Ionenstroms des infrage kommenden Isotopen-Cluster und I_other gleich der Summe aller Ionenströme innerhalb des Trennfensters ist; und wobei das Bereitstellen einer Auswahlbewertung das Bereitstellen der berechneten Reinheitswerte des infrage kommenden Isotopen-Cluster als Auswahlbewertung für den infrage kommenden Isotopen-Cluster aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner das Gewichten der m/z-Werte von Ionen, die näher in der Mitte des Trennfensters liegen, mit höheren Gewichtungswerten im Vergleich zu den niedrigeren Gewichtungswerten aufweist, die den m/z-Werten der Ionen zugewiesen werden, welche auf der m/z-Achse näher an den Rändern des Trennfensters liegen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Probe ein Protein aufweist und die MS/MS-Spektren nach der Erfassung mittels Tandem-Spektrometrie mit rechnerisch vorhergesagten MS/MS-Spektren oder Spektraldatenbanken verglichen werden, um das Vorkommen von Peptiden in der Proteinprobe nachzuweisen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Gewinnen eines Massenspektrums einer Probe und das Untersuchen des einen oder der mehreren infrage kommenden Isotopen-Cluster mit den höchsten Auswahlbewertungen mittels Tandem-Massenspektrometrie in dem Massenspektrometer in einem einzigen Durchgang erfolgen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Gewinnen eines Massenspektrums einer Probe und das Untersuchen des einen oder der mehreren infrage kommenden Isotopen-Cluster mit den höchsten Auswahlbewertungen mittels Tandem-Massenspektrometrie in verschiedenen Durchgängen erfolgen.
Massenspektrometersystem zur datenabhängigen Erfassung, wobei das System aufweist: ein Computersystem mit mindestens einem Prozessor; eine mit dem Prozessor in Verbindung stehende Benutzeroberfläche, die zum Empfangen einer Eingabe von einer Person eingerichtet ist; ein computerlesbares Medium, das mit dem Prozessor verbunden werden kann, wobei das computerlesbare Medium einen Speicher aufweist, der einen Satz von Anweisungen zur Steuerung der Verarbeitung eines Massenspektrums einer Probe speichert, darunter zur Berechnung eines Reinheitswertes für jeden aus der Vielzahl von infrage kommenden Isotopen-Cluster, die durch Peaks im Massenspektrum dargestellt werden; zur Berechnung einer Auswahlbewertung für jeden der infrage kommenden Isotopen-Cluster aus jedem einzelnen Reinheitswert, sodass mindestens eine der Auswahlbewertungen mit dem höchsten Rang ausgewählt werden kann, um die dadurch repräsentierten infrage kommenden Isotopen-Cluster zur weiteren Verarbeitung auszuwählen.
Massenspektrometersystem nach Anspruch 13, wobei das System die Auswahlbewertungen nach einer Rangfolge ordnet.
Computerlesbares Medium, das Anweisungen bereitstellt, die bei Ausführung durch einen Prozessor den Prozessor zur Ausführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 veranlassen.