DE19709172A1 - Verfahren der vergleichenden Analyse mit Ionenfallenmassenspektrometern - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Analysenverfahren, deren Genauigkeit und Präzision dadurch erhöht wird, daß die Signale analytisch interessierender Ionen (Analysenionen) auf die von Referenz­ ionen bezogen oder daß die Verfahrensbedingungen durch Referenzverfahren überprüft wer­ den. Diese "vergleichenden" Analysen sollen in Ionenfallenmassenspektrometern vorgenommen werden.

Die Erfindung besteht darin, die zu vergleichenden Ionensorten oder Verfahren in getrennten, sich zeitlich schnell abwechselnden Einzelspektren unter jeweilig optimalen Raumladungsbe­ dingungen aufzunehmen, wobei die Regelung der Raumladung in der Ionenfalle für die Ein­ zelspektren der jeweiligen Ionensorte oder des jeweiligen Verfahrens getrennt vorgenommen wird. Die Steuergröße für die Regelung kann beispielsweise aus den jeweils letzten unter glei­ chen Bedingungen aufgenommenen Einzelspektren hergeleitet werden. Dabei kann eine Isolie­ rung, aber auch eine Fragmentierung der interessierenden Ionensorten vorgenommen werden. Durch diese Schachtelung von Einzelspektren kann einerseits eine zeitsparende Steuerung der Raumladung, andererseits ein großer dynamischer Bereich für die Messungen genutzt werden. Zur Verbesserung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses - und damit der Präzision der Messung- können jeweils mehrere geschachtelt aufeinanderfolgende Einzelspektren gleicher Ionensor­ ten getrennt zu Summenspektren addiert werden, wobei nur die Summenspektren quantitativ ausgewertet werden.

Stand der Technik

Vergleichende Analysen bieten sich immer dann an, wenn die Prozesse der Probenvorberei­ tung, der Probenzuführung oder der Messung nicht völlig konstant zu halten sind. Der Ver­ gleich einer Analysenmessung mit den möglichst zeitgleich gewonnenen Ergebnissen einer Re­ ferenzmessung kann lediglich der Kontrolle des Meßverfahrens dienen; es kann aber auch der Bezug eines Signals der Analysensubstanz auf die Signale einer zur Probe zugebenen "inter­ nen" Referenzsubstanz Verluste einer Probenaufbereitung ausgleichen. Es gibt viele Ausfor­ mungen solcher Vergleichsanalysen, das Verfahren der quantitativen, massenspektrometrischen Analyse mit einer isotopenmarkierten internen Referenzsubstanz, deren Ionen im gleichen Spektrum mitgemessen werden, ist nur eines davon.

Ionenfallen nach Paul bestehen aus einer hochfrequenzversorgten Ringelektrode und zwei Endkappenelektroden; im Inneren können Ionen gespeichert werden. Die Ionenfallen können als Massenspektrometer verwendet werden, indem die gespeicherten Ionen massenselektiv ausgeworfen und durch Sekundärelektronenvervielfacher gemessen werden. Es sind mehrere verschiedene Methoden für den Ionenauswurf bekannt geworden, auf die hier nicht näher ein­ gegangen werden soll.

In Hochleistungs-Ionenfallenmassenspektrometern, wie sie hier für vergleichende Analysen eingesetzt werden sollen, dürfen sich nur relativ wenige Ionen befinden, wenn gut aufgelöste Spektren mit richtiger Massenzuordnung erhalten werden sollen. Befinden sich zu viele Ionen in der Ionenfalle, so stört die Raumladung der Ionen den Ionenauswurf und damit die Spek­ trenaufnahme. So wurde für ein weitverbreitetes, kommerzielles Massenspektrometer dieser Art von nur 300 Nutzionen berichtet, die für die Messung eines Einzelspektrums zur Verfü­ gung stehen. In Ionenfallen der antragstellenden Firma stehen für ein Einzelspektrum etwa 2000 Ionen zur Verfügung. Selbst damit ist aber der dynamische Bereich für vergleichende Analysen innerhalb eines Spektrums außerordentlich beschränkt.

Die Raumladungsgrenze kann aus der Drift oder der Breitenzunahme der Ionensignale be­ stimmt werden. Eine übliche Definition bezieht sich auf eine Drift von 0,1 atomaren Massen­ einheiten, das heißt, als Raumladungsgrenze wird diejenige Ionenmenge in der Ionenfalle defi­ niert, die eine Zeitverzögerung des Auswerfens der Ionen um eine solche Zeitdifferenz bewirkt, die umgerechnet einer Massendrift von 0,1 atomaren Masseneinheiten gegenüber Normalbe­ dingungen entspricht.

Der Einsatz der Raumladungswirkung ist relativ scharf. Eine Zunahme der Füllmenge an der Raumladungsgrenze von nur 10% bewirkt bereits eine weitere Drift um etwa 0,1 atomare Masseneinheiten, bleibt man dagegen um etwa 20% unter der Raumladungsgrenze, so ist die Massendrift nicht mehr meßbar.

Die optimale Füllmenge muß sich stets um einen Sicherheitsabstand unterhalb der Füllmenge an der Raumladungsgrenze befinden. Es hängt von der Güte der Raumladungsregelung ab, wie groß dieser Sicherheitsabstand gewählt werden muß. Eine sehr gute Regelung erlaubt es, bei einer optimalen Füllung zu arbeiten, die sich lediglich 20% unterhalb der Raumladungsgrenze befindet; eine weniger gute Regelung kann dazu zwingen, bei der halben oder sogar bei einem Drittel der Raumladungsgrenze zu arbeiten. Die Güte der Regelung ist also von starkem Ein­ fluß auf die Meßdynamik im Spektrum.

Ionenfallenmassenspektrometer haben andererseits Eigenschaften, die ihren Einsatz für viele Arten von Analysen interessant macht. So können ausgewählte Ionensorten in der Ionenfalle isoliert und fragmentiert werden. Die Spektren dieser Fragmentionen werden Tochterionen­ spektren der betreffenden Elternionen genannt. Auch Enkelionenspektren können gemessen werden. Durch die Zugabe von Reaktantgasen können Ionen-Molekül-Reaktionen studiert werden, beispielsweise die Abhängigkeit deren Reaktionsgeschwindigkeiten von den Konzen­ trationen der Reaktionspartner.

Die Anpassung der Ionenfalle an wechselnde Konzentrationen der zugeführten Substanzen, oder beispielsweise auch an wechselnde Ionisierungs-, Reaktions- oder Zerfallsbedingungen, kann bei der Ionenfalle aus oben genannten Gründen nicht über die Dynamik der Messung ei­ nes Massenspektrums unter Normalbedingungen vorgenommen werden, wie es bei magneti­ schen Sektorfeld- oder Quadrupolfilter-Massenspektrometern möglich ist. Diese haben eine Meßdynamik von sechs bis neun Zehnerpotenzen für die Messung der Ionenströme eines Spektrums.

In der Ionenfalle muß daher die Meßdynamik über die Bedingungen bei der Regelung zur op­ timalen Füllung der Ionenfalle hergestellt werden. Ist beispielsweise die Konzentration einer Substanz in der Probe groß, so ist bei konstanter Ionisierungsstarke die Füllzeit für die Ionen­ falle bis zum Erreichen der optimalen Befüllung nur kurz. Ist die Konzentration dagegen sehr klein, so braucht es eine lange Zeit um die Ionenfalle optimal zu füllen. Das gilt in ähnlicher Weise auch für die Füllung der Ionenfalle mit Reaktionsprodukten oder Tochterionen.

Die Füllzeiten können in der Praxis zwischen 10 Mikrosekunden und 1000 Millisekunden, also über 5 Zehnerpotenzen hinweg, variiert werden. Wird dieses Verfahren auf die quantitative Analyse angewandt, so berechnet sich die Konzentration dann aus einem Wert, der sich - bei konstanter Erzeugung der Ionen - als Signalhöhe im Spektrum geteilt durch die Füllzeit be­ rechnet. Dieser Wert ist dem Ionenstrom dieser Ionensorte, der während der Ionisierung gene­ riert wird, proportional. Somit wird bei der Anwendung dieses berechneten Wertes für den Ionenstrom die Bestimmung der Konzentration vergleichbar mit der durch andere Arten von Massenspektrometern. Die Meßdynamik der Ionenfallenmassenspektrometer erhöht sich damit von drei auf acht Zehnerpotenzen; allerdings nur, wenn sich keine störenden Ionen im Über­ schuß in der Ionenfalle befinden.

Die Regelung zur Füllung der Ionenfalle muß auf einer Messung der Ionenanzahl in der Ionen­ falle beruhen, aus dem sich dann ein Steuerwert für die Füllung berechnen läßt. Da sich die Ionen in der Ionenfalle bisher nicht genügend einfach zerstörungsfrei messen lassen, haben sich zwei verschiedenartige Verfahren herausgebildet:

• (1) Das Verfahren des "Prescan", bei dem ein kurzer Füllprozeß mit konstanter Füllzeit der eigentlichen Spektrennahme vorgeschaltet wird. Die dabei gebildeten Ionen werden aus der Falle ausgetrieben und gemessen. Aus diesem Meßwert wird die optimale Füllzeit bestimmt (US 5 107 109). - Eine Verbesserung besteht darin, die Füllzeit des Prescan nicht konstant zu halten, sondern die Füllzeit des Prescan aus vorangegangenen Messun­ gen auf optimale Meßbedingungen hin zu steuern (US 5 448 061). - Diese beiden Ver­ fahren brauchen zusätzliche Meßzeit für den Prescan, die der eigentlichen Spektrennahme verlorengeht
• (2) Ein besseres Verfahren verwendet eine Füllsteuerung, die auf die bekannte Füllrate eines oder sogar mehrerer vorhergehender Spektren zurückgreift (DE 43 26 549). Aus diesen Füllraten vorhergehender Spektren wird auf einen Erwartungswert für die aktuelle Füllrate extrapoliert. Die Extrapolation kann je nach den Bedingungen linear, quadratisch, kubisch, exponentiell oder nach einer anderen bekannten Funktion erfolgen. Aus dem prognosti­ zierten Erwartungswert wird die aktuelle Füllzeit für die optimale Füllmenge berechnet Die Füllrate ist dabei als Füllmenge geteilt durch die bekannte Füllzeit definiert, die Füll­ menge wird als integrierter Ionenstrom über ein Spektrum bestimmt. Da dabei auf die vorhergehend gemessenen Spektren zurückgegriffen wird, wird keine zusätzliche Zeit für einen Prescan verbraucht. Besonders bei starken Änderungen in der Konzentration der zugeführten Substanzen, wie sie beispielsweise in der Kopplung mit chromatographischen Trennverfahren vorliegen, ist diese Art der Raumladungsregelung der Prescan-Methode weit überlegen.

Das Verfahren der sogenannten "internen Referenz" ist in allen Ausformungen der quantitati­ ven Analyse wohlbekannt. Es besteht darin, einer genau bekannten Menge des Analysenguts (möglichst vor jeglicher Probenaufbereitung) eine genau bekannte Menge einer Referenzsub­ stanz zuzusetzen, und bei der letztendlichen Auswertung der Analysenresultate die unbekannte Menge oder Konzentration der Analytsubstanz auf die bekannte Menge oder Konzentration der Referenzsubstanz zu beziehen. Sind sich die beiden Substanzen einander so ähnlich, daß sie für alle Schritte der Aufbereitung und Analyse gleiches Verhalten zeigen, so werden alle Ver­ luste oder Veränderungen oder Empfindlichkeitsunterschiede relativiert und durch den Bezug aufeinander ausgemerzt.

Es wird hier im Folgenden das Verfahren der internen Referenz beispielhaft für eine verglei­ chende Analyse behandelt, obwohl es viele verschiedene Arten dieser vergleichenden Analysen mit verschiedenen Zielsetzungen gibt.

In der Massenspektrometrie bietet es sich an, isotopisch veränderte Referenzsubstanzen zu benutzen, die chemisch genau den Analytsubstanzen entsprechen. Beispielsweise kann man Benzol (Molekulargewicht 78 atomare Masseneinheiten) hervorragend analysieren, indem man voll deuteriertes Benzol (Molekulargewicht 86 atomare Masseneinheiten) als Referenz zusetzt Verluste durch Verdampfung, verschiedenartige Ionisierungswahrscheinlichkeiten für Substan­ zen und viele andere Effekte der Verfälschung von Analysenresultaten entfallen damit weitest­ gehend.

Aber auch chemisch den Analytsubstanzen sehr ähnliche Referenzsubstanzen anderer Art las­ sen sich als Referenzsubstanzen benutzen, beispielsweise Isomere, wenn sie ein verschiedenar­ tiges Massenspektrum ergeben.

Für die Analyse von Gemischen muß man die Gemische in der Regel zunächst durch ein Sepa­ rationsverfahren auftrennen. Es bieten sich hier die wohlbekannten chromatographischen oder elektrophoretischen Verfahren an. Man wählt dann für das Verfahren der internen Referenz in der Regel koeluierende Referenzsubstanzen, um für die quantitative Bestimmung möglichst gleiche Verhältnisse zu haben. Isotopenmarkiete Substanzen haben gewöhnlich (fast) gleiche Retentionszeiten.

Auf diese Weise können durch koeluierende Substanzen viele Schwierigkeiten der quantitati­ ven Analyse ausgeräumt werden: So kann beispielsweise ein Sekundärelektronenvervielfacher, der als Ionendetektor benutzt wird, durch vorausgehende Überladungen mit Ionen aus demsel­ ben Chromatogramm ermüdet sein. Dadurch wird die Empfindlichkeit zeitabhängig, sie steigt durch Erholungseffekte nachfolgend wieder langsam an. Diese sich zeitlich verändernde Emp­ findlichkeit kann jedoch durch koeluierende Analyt- und Referenzsubstanzen wieder relativiert und damit berücksichtigt werden.

Bei einem Ionenpeak, der aus 100 Ionen besteht, muß sich auch bei konstantem Angebot an Substanz eine Schwankung der Ergebnisse wiederholter Spektrennahmen zeigen, die aufgrund der Ionenstatistik durch eine relative Standardabweichung von 10% gekennzeichnet ist. Selbst bei 1000 Ionen ergibt sich eine Schwankung mit einer relativen, einfachen Standardabweichung von 3%. Erst bei 10000 Ionen reduziert sich die einfache Standardabweichung auf 1%.

Je nach geforderter Präzision (Wiederholgenauigkeit) für das Analysenverfahren müssen also mindestens 100, 1000 oder gar 10000 Ionen gemessen werden. Es ist damit ersichtlich, daß sich eine höhere Präzision gar nicht durch die Ionen eines einzigen Spektrums erzielen läßt, sondern daß mehrere Spektren herangezogen werden müssen. Es werden bei Ionenfallen aus diesem Grunde sehr häufig mehrere aufeinanderfolgende "Einzelspektren" zu einem "Summen­ spektrum" addiert, bevor überhaupt eine Auswertung des Spektrums erfolgt.

Die mangelnde Meßdynamik, die selbst in Summenspektren noch herrscht, wirkt sich beson­ ders dramatisch auf die Präzision einer Messung des Verhältnisses von Konzentrationen aus. Sollen Referenz- und Analysensubstanz in einem einzigen, überlagerten Spektrum gemessen werden, mit Ionen, die sich gemeinsam in der Ionenfalle befinden, so müssen genau gleiche Konzentrationen vorliegen, wenn optimale Präzision erreicht werden soll. Bereits durch den Vergleich (Fehlerfortpflanzung bei Quotientenbildung) wird die Präzision um einen Faktor √2 ≈ 1,4 schlechter. Ist die Konzentration einer der beiden Substanzen auch nur um einen Faktor 10 geringer, so vermindert sich die Präzision der Analyse nochmals um einen Faktor √10) ≈ 3.

In der Praxis kennt man aber die Konzentration der Analytsubstanz in einer unbekannten Pro­ ben nicht. Es ist also die gleichzeitige Messung von Analyt- und Referenzsubstanz in einer Io­ nenfalle wegen der dramatischen Verluste an Präzision praktisch nicht möglich.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren für die vergleichende Messung in einer Ionen­ falle zu finden, die auch dann mit zufriedenstellender Präzision arbeitet, wenn die Ionen der miteinander zu vergleichenden Signale im Ionisierungs-, Einspeicherungs, Isolierungs- oder Fragmentierungsprozeß mit sehr verschiedenen Erzeugungsraten hergestellt werden, wie es beispielsweise bei quantitativen Analysen mit Analysen- und Referenzsubstanzen unterschiedli­ cher Konzentration der Fall ist

Beschreibung der Erfindung

Die Ionen der miteinander zu vergleichenden Signale sollen im Folgenden mit "Analysenionen" und "Referenzionen" bezeichnet werden, auch wenn es sich dabei um gleichartige Ionen han­ delt, wie sie beispielsweise beim Studium von Ionen-Molekül-Reaktionen unter Verwendung von Referenzprozessen vorliegen.

Es ist eine Grundidee der Erfindung, die Analysen- und Referenzionen nicht in einem Spek­ trum, sondern in getrennten Spektren mit jeweils optimaler Füllung abwechselnd zu messen, und dabei die Regelung der Füllung der Ionenfalle auf die letzten Spektren der gleichen Ionen­ art zu beziehen. Es laufen also zwei Regelungsstränge parallel, einer für die "Analysenspek­ tren" mit den Analysenionen und einer für die "Referenzspektren". Es wird für die Regelung kein zeitraubender Prescan ausgeführt, es wird aber auch aus naheliegenden Gründen nicht das zeitlich direkt vorangehende Spektrum für die Regelung herangezogen.

Werden, wie bei quantitativer Analyse mit koeluierender interner Referenz, beide Substanzen in einer Probe gemeinsam der Ionisierung zugeführt, so füllen sie auch gemeinsam die Ionenfal­ le und führen zu einem gemeinsamen Massenspektrum. Es ist daher eine weitere Grundidee der Erfindung, die Ionen der beiden Substanzen in der Ionenfalle zu isolieren und dann in getrenn­ ten Spektren mit jeweils optimal geregelter Füllung zu messen. Die Isolierung kann in bekann­ ter Weise bereits während der Ionisierung durch Resonanzauswurf unerwünschter Ionen durch die Anwendung von anregenden Frequenzgemischen mit Lücken vorgenommen werden. Es können aber auch, wie ebenfalls bekannt, Isolierungsverfahren nach einer gesteuerten Überfül­ lung der Ionenfalle angewandt werden, da die Isolierungsverfahren auch mit mehr als hundert­ facher Überfüllung der Ionenfalle noch arbeiten können. Es bleibt somit auch bei nachträglicher Isolierung die erwünschte Meßdynamik im Spektrum erhalten. In beiden Fällen besteht das "Spektrum" allerdings nur aus den isolierten Ionen.

Auch im Falle der Isolierung von Analyt- und Referenzionen muß die Füllung optimal gesteu­ ert werden. Es ist nun eine weitere Idee der Erfindung, den Prozeß der Isolierung mit in die Füllrate und ihre Bestimmung aus früheren Spektren einzuschließen. Die Integration des Io­ nenstroms über ein Spektrum dieser Art ergibt ja schon die Füllmenge, die durch Ionisierung, Einspeicherung und Isolierung erzeugt wurde. In DE 43 26 549 bezieht sich die Füllrate nur auf die primäre Ionenerzeugung und Einspeicherung, hier wird nun der Begriff der Füllrate auf den Isolierungsprozeß erweitert.

Es ist nun eine weitere Idee der Erfindung, nach einer Fragmentierung der isolierten Elternio­ nen deren Tochter- oder Enkelionenspektren für die quantitative Analyse heranzuziehen, und hier auch die Fragmentierung in die Füllrate einzuschließen. Für die Regelung braucht auch hier nur jeweils auf die früheren Tochter- oder Enkelionenspektren gleicher Art zurückgegrif­ fen werden. - Hier bietet sich der besondere Vorteil, daß diese Verfahren auch dann noch ar­ beiten, wenn die Elternionen durch andere Ionen gleichen Masse-zu-Ladungsverältnisses, aber unbekannter Konzentration, überlagert sind, solange sich nur die Tochterionenspektren unter­ scheiden.

Es wird hier der besondere Vorteil der Regelung durch Rückgriff auf früher aufgenommene Spektren deutlich. Bei der Prescan-Methode, die ja auch Isolierung und Fragmentierung der Ionen für den Prescan einschließen muß, wird die zusätzlich benötigte Zeit exzessiv groß.

Für die vergleichende Reaktionsanalytik, bei der auf Standardparameter für eine Referenzreak­ tion zurückbezogen wird, braucht eine solche Isolierung der Ionen nicht unbedingt zu erfolgen.

Bei einem Vergleich von mehr als zwei Ionensorten oder mehr als zwei Reaktionsbedingungen können auch drei oder mehr Spektren abwechselnd gemessen werden, wobei dann drei oder mehr Steuerungsstränge parallel laufen müssen.

Da die Messungen der für die Regelung notwendigen Integrationswerte bei der Schachtelung der Einzelspektren bereits zwei oder mehr Einzelspektrenaufnahmezeiten zurückliegen, ist es wichtig, eine vorausschauende Regelung zu implementieren, wie in DE 43 26 549 vorgeschla­ gen. Der Wert für die voraussichtliche Füllrate, der die Füllzeit bestimmt, wird dabei nicht als konstant vom letzten Spektrum übernommen, sondern es findet eine vorausschauende Extrapo­ lation aus zwei, drei oder sogar vier letztaufgenommen Spektren der gleichen Ionensorte statt, beispielsweise durch eine lineare, quadratische oder kubische Extrapolation. Es kann für den Beginn von chromatographischen Peaks (im Fußbereich der Glockenkurve des Peaks) auch mit sehr gutem Erfolg eine exponentielle Extrapolation aus nur zwei Spektren vorgenommen wer­ den, die einfach auf dem "Wachtumsfaktor" des dort exponentiell ansteigenden Ionenstromsi­ gnals beruht.

Durch diese Schachtelung von Spektren mit getrennter Füllungsregelung für die einzelnen Io­ nensorten wird nun die Dynamik der Messung ganz erheblich erhöht. Beispielsweise können die Konzentrationen von Analysenionen und Referenzionen einer quantitativen Messung in beiden Richtungen um bis zu einem Faktor 100 und mehr auseinanderliegen, ohne daß die Präzision der Analyse beeinträchtigt wird. Es ist also eine quantitative Analyse mit gleichblei­ bender Präzision über mehr als vier Zehnerpotenzen in der Variation der Analytkonzentration möglich.

Da ein Einzelspektrum, wie oben dargelegt, häufig nicht den Präzisionsansprüchen an die Ana­ lyse entspricht, müssen meist mehrere Spektren aufaddiert werden. Dabei müssen die Rohspek­ tren vor irgendeiner weiteren Auswertung addiert werden, weil nur dadurch das Signal-zu- Rausch-Verhältnis entsprechend steigt. Meist werden etwa 3 bis 20 Einzelspektren zu einem "Summenspektrum" durch Addition aller korrespondierenden Einzelmeßwerte längs der Spek­ trenaufnahme zusammengefaßt. Diese Addition muß nun zweckmäßigerweise auch für die ein­ zelnen Ionensorten getrennt vorgenommen werden.

Für eine optimale Steuerung nach dieser Erfindung ist es dabei nicht zweckmäßig, die Einzel­ spektren für ein Summenspektrum hintereinander aufzunehmen, da sonst die optimale Rege­ lungskette zu lange unterbrochen wird. Es müssen vielmehr ausdrücklich die Einzelspektren alternierend aufgenommen werden, um die Füllsteuerung optimal vornehmen zu können. Es findet dabei eine Addition der Einzelspektren zu zwei (oder mehr) Summenspektren zeitparal­ lel statt.

Weitere Vorteile der Erfindung

Diese Methode hat weitere Vorteile. So können beispielsweise Tochterionenspektren des Analyten mit Enkelionenspektren der Referenz (oder umgekehrt) verglichen werden. Es kön­ nen für die beiden Substanzen verschiedene Fragmentierungsbedingungen, optimal jeweils für die Substanz, eingestellt werden.

Inbesondere aber lassen sich störende Überlagerungen von Signalen vermeiden: beispielsweise können Tochterionenspektren von Analyt und Referenz miteinander verglichen werden, die gleich aussehen. Beispiel: Wird als Referenz eine Substanz verwendet, die eine mit dem Isotop 37 u des Chlors markierte ¹²C³⁷Cl₃-Gruppe enthält, so ist das Molekülion dieser Referenz sehr gut gegenüber dem Molekülion des Analyten mit Normalchlor zu isolieren. Geht aber bei der Tochterionenbildung diese Gruppe verloren, so haben die Tochterionen von Analyt und Refe­ renz die gleichen Massen. In den beiden getrennt aufgenommenen Spektren sind sie aber gut getrennt zu messen.

Beschreibung der Abbildung

Fig. 1 zeigt das einfache und schnelle Berechnungsschema für die lineare, quadratische und kubische Extrapolation der Füllraten f₀ aus den gemessenen Füllraten f₁ bis f₄ der vorausgehen­ den Spektren, wenn diese - wie gewöhnlich - gleiche Aufnahmenzeitabstände haben.

Beschreibung günstiger Ausführungsformen

Eine erste Ausführungsform der vergleichenden Analyse bezieht sich auf die Messung der Re­ aktionskinetik von Ionen-Molekül-Reaktionen. Dabei werden im Prinzip in einer Ionenfalle Ionen einer Sorte eingespeichert und durch Stöße mit den Molekülen eines Reaktantgases zur Reaktion gebracht. Verbrauch der Originalionen und Zunahme der Produktionen werden als Funktion der Reaktionszeit (der Wartezeit bis zur Aufnahme der Spektren) und der Reaktant­ gaskonzentration gemessen. Aus den Messungen werden Reaktionszeitkonstanten und Reakti­ onstypus bestimmt.

Dabei können die Originalionen in einer Ionenquelle außerhalb der Ionenfalle erzeugt und in bekannter Weise in die Ionenfalle eingebracht werden. Das Reaktantgas kann sich durch konti­ nuierliche Einleitung fortwährend in der Ionenfalle befinden. Für die Bestimmung der Zeitkon­ stanten werden Analysenspektren mit jeweils verlängerter Wartezeit bis zur Spektrenaufnahme aufgenommen.

Die Vergleichsanalyse hat in diesem Fall den Sinn, die gesamten Verfahrensbedingungen ein­ schließlich der Konstanz der Konzentration des zugeführten Reaktantgases überprüfen zu kön­ nen. Es wird dazu ein Referenzverfahren mit einer Standardwartezeit definiert, und es werden Analysen- und Referenzspektren jeweils nach dieser Erfindung geschachtelt mit jeweils eigen­ ständiger Regelung der Füllung aufgenommen.

Für die Messung der Abhängigkeit von der Konzentration des Reaktantgases kann man in ähn­ licher Weise Referenzverfahren definieren, mit denen sich beispielsweise die Konzentration des Referenzgases überprüfen und notfalls sogar regeln läßt.

Werden die Originalionen für die Ionen-Molekül-Reaktionen durch einen Elektronenstrahl in­ nerhalb der Ionenfalle gebildet, so kann es notwendig sein, die Ausgangsionen für die Reaktion zunächst zu isolieren, um Nebenreaktionen gleichzeitig gebildeter, aber unerwünschter Ionen auszuschalten. Die Isolierung kann beispielsweise in an sich bekannter Weise durch ein Fre­ quenzgemisch mit Frequenzlücken erzeugt werden, das an die beiden Endkappen der Ionenfalle angelegt wird und so ein dipolares Feld mit gemischten Anregungsfrequenzen in der Ionenfalle erzeugt. Die Anregungsfrequenzen bringen die unerwünschten Ionen zu Schwingungen zwi­ schen den Endkappen, deren Amplituden sich vergrößern und die Ionen schließlich aus der Ionenfalle entfernen. Die Frequenzlücke bestimmt somit die erwünschten Ionen, die in der Io­ nenfalle verbleiben, weil ihre Fundamentalfrequenzen nicht angeregt werden.

Da die Regelung der Füllung sich auf die gemessenen Ionen der letzten Spektren gleicher Art bezieht, bezieht die Regelung der optimalen Füllmenge die Isolierung mit ein.

Es ist aber nicht notwendig, die Isolierung während der Ionenerzeugung und -einspeicherung vorzunehmen. Es kann die Ionenfalle während der Ionenerzeugung bis weit über die optimale Füllmenge hinaus mit Ionen gefüllt und erst dann die Isolierung angewandt werden. Da die Isolierung auch dann gut arbeitet, wenn eine mehr als hundertfache Überladung vorliegt, kann in diesem Fall die zeitweilige Überladung der erfindungsgemaßen Regelung der Füllzeit wil­ lentlich so gesteuert werden, daß erst nach der Isolierung der erwünschten Ionensorte die op­ timale Füllmenge der Ionenfalle vorliegt. Die "Füllrate" schließt also in diesem Fall den Prozeß der anfänglichen Überladung und der anschließenden Isolierung mit ein. Da sich die Regelung der Füllmenge nach der Erfindung auf die integralen Ionenmengen der vorausgehenden Spek­ tren gleicher Erzeugungsart beziehen, muß nicht einmal bekannt sein, wie hoch die Überladung im speziellen Fall eigentlich ist.

Eine zweite Ausführungsform des Verfahrens nach dieser Erfindung bezieht sich auf die quanti­ tative Analyse mit interner Referenz. Dabei wird der Analysenprobe, in der die Analysensub­ stanz ("Analyt") befindet, eine Referenzsubstanz bekannter Menge zugegeben. Die Referenz­ substanz soll dem Analyt möglichst ähnlich sein, beispielsweise kann als Referenz eine iso­ topenmarkierte Verbindung genommen werden, die chemisch mit dem Analyten identisch ist Bei nachfolgenden Probenaufbereitungsschritten, wie beispielsweise einer Anreicherung des Analyten in der Probe durch Extraktion, verhalten sich dann Analyt und Referenz völlig gleich.

In vergleichenden Analysen mit interner Referenz, die in magnetischen Sektorfeldgeräten oder auch in Quadrupolfilter-Massenspektrometern durch geführt werden, werden nun die Signale der Analytionen und der Referenzionen im selben Massenspektrum gemessen und dann aufein­ ander bezogen, da die Meßdynamik im Spektrum genügend groß ist. Das ist in Ionenfallen­ massenspektrometern wegen der geringeren Meßdynamik nicht möglich.

Nach der vorliegenden Erfindung werden daher die Analytionen und die Referenzionen in ge­ trennten Einzelspektren gemessen, wobei die Füllrate getrennt geregelt wird. Diese Einzelspek­ tren können aber, da ja beide Ionensorten gemeinsam mit der Probe ionisiert werden, nur durch Isolierung der entsprechenden Ionensorten getrennt gemessen werden.

Wenn die Möglichkeit besteht, daß die Analyt- oder Referenzionen auch noch durch andere Ionen der gleichen Masse (besser: des gleichen Masse-zu-Ladungsverhältnisses) überlagert werden, so können die beiden Ionensorten auch noch zu Tochterionen fragmentiert werden, bevor die Spektren gemessen werden. Solange die überlagernden Ionen nicht zu intensiv sind und andere Tochterionen erzeugen, können die beiden Tochterionensorten getrennt in reiner Form gemessen und entsprechend aufeinander bezogen werden.

In dieser Weise kann man häufig die Konzentration von Analytsubstanzen messen, ohne daß überhaupt eine Gemischseparation durch chromatographische oder elektrophoretische Trenn­ verfahren durchgeführt werden muß.

Von besonderer Wichtigkeit sind beispielsweise Messungen des Metabolismus von pharmako­ logisch genutzten Substanzen. Für die Zulassung eines neuen Medikaments ist es notwendig, den Metabolismus solcher Substanzen mit allen Abbaustufen aufzuklären, die Aufenthaltszeiten aller Zwischenprodukte im menschlichen Körper zu bestimmen, und die Streubreiten aller Werte in verschiedenen Menschen genauestens zu messen. Dazu sind Zehntausende von Ana­ lysen vonnöten. - Für diese Messungen werden Analysenverfahren gesucht, die in kürzester Zeit genügend sicher auszuführen sind.

Da die meisten Metaboliten schwerflüchtig, aber gut in Wasser und anderen Lösemitteln löslich sind, hat sich für diese Messungen insbesondere die Flüssigkeitschromatographie in Verbin­ dung mit einer Ionisierung durch Elektrospray durchgesetzt. Um die Analysenzeit abzukürzen, wird die Flüssigkeitschromatographie so weit wie möglich durch die Wahl der Bedingungen abgekürzt. Dabei findet keine vollstandige Trennung aller Gemischkomponenten mehr statt Durch die Aufnahme von Tochterionenspektren erreicht man aber genügend substanzspezifi­ sche Analysen. Die erforderliche Präzision liegt je nach Toxizität der Metaboliten zwischen 1% und 10% einfacher Standardabweichung; interne Referenzverfahren sind notwendig, um die Richtigkeit zu gewährleisten.

Soll dieses Verfahren in Ionenfallen ausgeführt werden, so ist in der Regel eine Addition meh­ rerer Spektren notwendig. Das Analysenverfahren sieht dabei wie folgt aus: In die Eingabesta­ tion eines Kurzsäulen-Flüssigkeitchromatographen wird die aufbereitete Probe, der vor Aufbe­ reitung eine isotopenmarkierte Referenz mittlerer Konzentration zugegeben wurde, in Abstän­ den von etwa drei Minuten eingespritzt. Über den Peak des Metaboliten hinweg, der etwa 10 Sekunden Breite hat, werden erfindungsgemäß zeitgeschachtelte Tochterionenspektren von Metabolit und Referenz aufgenommen, wobei zwei Regelungsstränge die jeweils optimale Füllmenge erzeugen. Jeweils fünf Tochterionenspektren jeder Substanz werden addiert. Da insgesamt die Aufnahme eines einzelnen Tochterionenspektrums 200 Millisekunden dauert, können fünf solcher Einzelspektren pro Sekunde aufgenommen werden. Da der chromatogra­ phische Peak etwa 10 Sekunden Breite hat, werden insgesamt fünf Summenspektren des Me­ taboliten und fünf Summenspektren der Referenz aufgenommen. Von diesen lassen sich mittle­ ren drei Summenspektren hervorragend auswerten; die Einzelspektren für das erste Summen­ spektrum dienen dazu, die Regelung gut einzuschwingen zu lassen. Mit dieser Aufnahmetech­ nik läßt sich das Analysenproblem lösen, und die geforderte Präzision läßt sich erreichen, auch wenn das Einzelspektrum die Präzision keineswegs erreicht.

Die Regelung greift in diesem Fall am besten auf eine kubische Extrapolation zurück, da sich das Signal im chromatographischen Peak sehr rasch ändert. Das Schema einer kubischen Ex­ trapolation ist in Fig. 1 dargestellt. Aus den vier Füllraten f₁ (jüngstes Tochterionenspektrum) bis f₄ werden die Differenzen a₁ bis a₃ gebildet, daraus die Differenzen b₁ und b₂, daraus die Differenz c₁. Die kubische Extrapolation für den Erwartungswert f_kub, ergibt sich sehr einfach zu f_kub = f₁ + a₁ + b₁ + c₁. diese sehr einfache Berechnung setzt voraus, daß die zeitlichen Ab­ stände der Spektrennahmen gleich sind. - Die lineare Extrapolation ergibt sich übrigens zu f_lin = f₁ + a₁; die quadratische Extrapolation zu f_qu = f₁ + a₁ + b₁.

Für den Fachmann ist es leicht, für andere Arten von Vergleichsanalysen nach den hier gegebe­ nen Beschreibungen die speziell auf diese Analysen zugeschnittenen Verfahren zu entwickeln.

Claims (9)

1. Verfahren für die Messung der Signale von Ionen verschiedener Herkunft oder Erzeu­ gungsbedingungen in raumladungsgeregelten Ionenfallenmassenspektrometern zum Zwecke einer vergleichenden Analyse, dadurch gekennzeichnet, daß die zu vergleichenden Ionensignale in abwechselnd getrennt aufgenommenen Einzelspektren gemessen werden und daß zur Regelung der Raumladung jeweils ein Erwartungswert für eine Füllrate be­ nutzt wird, der aus vorhergehenden Spektren gleicher Art gewonnen wurde.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Erwartungswert für die Füllrate aus den Füllraten mindestens eines vorhergehenden Einzelspektrums gleicher Io­ nenherkunft oder Ionenerzeugungsbedingungen bestimmt wird, wobei die Füllmenge durch eine Integration der Ionensignale eines Spektrums gewonnen und für die Berech­ nung der Füllrate durch die bekannte Füllzeit dieses Spektrums geteilt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Berechnung der optimalen Füllzeit ein Erwartungswert einer Füllrate aus den Füllraten mehreren vorhergehenden Ein­ zelspektren der Ionensignale gleicher Herkunft oder Erzeugungsbedingungen durch Ex­ trapolation berechnet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine lineare, quadratische oder kubische Extrapolation aus zwei, drei oder vier Spektrenaufnahmen vorgenommen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine exponentielle Extrapolati­ on aus zwei Spektrenaufnahmen vorgenommen wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der vergleichenden Analyse um eine quantitative Analyse mit probenintern zuge­ gebener Referenzsubstanz handelt, und daß die Ionen der Analysensubstanz und der Refe­ renzsubstanz nach bekannten Verfahren jeweils für sich in der Ionenfalle isoliert werden, wobei die Bestimmung der Füllrate die Ionisierung, Einspeicherung und Isolierung ein­ schließt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß von Analysensubstanz und Re­ ferenzsubstanz durch Fragmentierung der isolierten Ionen jeweils Tochterionenspektren aufgenommen werden, wobei die Bestimmung der Füllrate auch die Fragmentierung mit einschließt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der massenspektrometrischen Analyse eine chromatographische oder elektrophoretische Sepa­ ration vorgeschaltet ist.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß meh­ rere Einzelspektren einer jeden Ionensorte getrennt zu je einem Summenspektrum addiert werden, und daß erst die Summenspektren quantitativ ausgewertet werden.