JP4768189B2 - 非標的化複雑試料分析の方法 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、生物学、とりわけゲノム学への特別な適用を有する非標的化複雑試料分析の方法に関するものである。
【0002】
発明の背景
機能的ゲノム学は遺伝子機能の特性決定に照準を合わせたバイオテクノロジーの新生分野である。全ての生物はただ一つの遺伝子型を持っている。しかしながら、異なる発達および環境条件の下でこの遺伝子型が発現されると、殆ど無限の数の可能性ある表現型が生成する。機能的ゲノム学を規定するのは、表現型に対する遺伝子発現の相関である。或る遺伝子を正確に研究するためには、その実体(即ち配列)を知るだけでなく、発達および環境上の変化に応答した、そして単離された際の、そしてゲノム中の他の遺伝子に関連したその発現パターンを観察および特性決定できることが必要とされる。或る遺伝子の発現から生み出される影響を正確に研究するためには、この活動から生ずる表現型を客観的且つ定量的に特性決定できることが必要とされる。これが、本明細書に記載の非標的化代謝プロファイリング技術発明によって、機能的ゲノム集団が行い得る事である。
【0003】
種全体の遺伝子配列が、今や分かっている。遺伝子チップテクノロジーは、発達および環境上の変化に対してゲノム内部の各々そしてあらゆる遺伝子の発現の変化を同時に監視および定量することを可能にした。遺伝子チップテクノロジーは、実際には可能性のある全ての標的をたまたま含んでいる標的化分析であるとは言え、本質的には非標的化遺伝子発現分析である。これは強力な包括的能力であるが、ゲノムが有限且つ単一の実体であるという事実によって可能となった。類似の表現型能力は、或る生物の全ての代謝産物および蛋白が分かるようにし、それをチップ上に乗せることであろう。これは、複数の表現型が存在するということだけでなく、事実上無限の数の代謝産物および蛋白が考えられるという事実のため、不可能である。ゲノム分析の現在の状態を補完するためには、表現型分析は「実際に」非標的化されていなくてはならない。本明細書に記載の非標的化代謝プロファイリング技術は、非標的化表現型分析の要件を満足する唯一の足掛かりである。さらに、この技術はどれか1つの種に限定されるのではなく、全ての植物および動物種に等しく有効である。
【0004】
個々の表現型の複雑な分子の構成を解読するのは手ごわい仕事である。事実上無限の数の考え得る表現型を相互に比較し遺伝子発現と相関させ得るようなやり方で、この表現型情報を正確且つ再現性あるように作製できるということが、機能的ゲノム学が直面するジレンマの核心である。分子レベルでは、与えられた生態系の表現型はプロテオーム(proteome)とメタボローム(metabolome)に分けられる。遺伝子発現は蛋白合成を引き起こすため、プロテオームが最初のそして最も直接的な遺伝子発現とのつながりである。しかしながら、代謝経路の複雑な相互作用のため、与えられた蛋白の発現レベルにおける変化が、それが関与するかも知れない細胞プロセス全体に及ぼす影響を予想することは困難である。これに対してメタボロームは、与えられた或る時点において或る生物に起こっている全代謝(proteomic)活動の総計である。故にメタボロームは、与えられた任意の時点での、与えられた任意の生態系の細胞プロセスに及ぼす遺伝子発現の総体的または最終的影響の直接的尺度である。この理由により、メタボロームは、遺伝子の機能および操作の影響を実際に理解する上での、二つの表現型のうちより強力なものであると判明する。本明細書に記載の非標的化代謝プロファイリング技術は、利用できる唯一の包括的代謝プロファイリング技術である。
【0005】
単離、同定および定量は、全ての分析法についての三つの基本的要件である。非標的化メタボローム分析のための第一の仕事は、メタボローム内の全代謝産物についてこれらの要件を同時に満たすことである。第二の、そして恐らくより困難な仕事は、これが遺伝子チップテクノロジーと並行して使用できるよう、充分なスループットおよび長期安定性を伴ってこれらの要件を満たし得ることである。このようなテクノロジーは、特定遺伝子の機能の解明に要する時間を大幅に減少させるであろう。加えて、係る分析のデータベースは、膨大な数の表現型および遺伝子型を客観的且つ定量的に比較することを可能にする。現時点で機能的ゲノム学研究者が利用できるような係る生成物またはテクノロジーは無い。本明細書に記載の非標的化代謝プロファイリング技術は、多数の種において広範に試験された。全ての場合において、本技術は、異なる種の様々な遺伝子型および発達段階の間に存在することが知られている代謝上の変化を立証した。
【0006】
重要な技術概念。
本明細書に記載の非標的化代謝プロファイリング技術は、複雑な生体試料中の構成成分の全てを、迅速且つ同時に分離、定量および同定することができる。これは、目的とする代謝産物を先験的に選択することなく達成でき、故に先入観が排除される。これらのデータはデータベースへとエクスポートされ、そのデータベースは、研究者が、或る試料を別の試料と直接比較すること(即ち、突然変異体と野生型、開花と茎の伸長、乾燥ストレスと正常の成長条件など)、または代謝産物濃度によりデータベース全体を体系化すること(即ち、与えられた代謝産物を最大または最小に発現するのはどの遺伝子型であるか)を可能にする。この技術は、ヒトの疾病の研究にも同じく適用可能である。この情報を利用するためには、研究者は、興味を持っている代謝産物の実験式または正確な分子量をタイプすればよく、そうすればソフトウェアがしかるべくデータを体系化してくれるであろう。
【0007】
生体試料中の物質の組成の分析を行う能力は、保健、環境監視、および製品開発プロセスの多くの局面にとって重要である。典型的には、複雑な混合物中の特定物質の量は様々な手段によって測定される。例えば、複雑な混合物中の被検体を測定するためには、目的とする被検体をこの混合物中の他の全ての分子から分離し、その後個別に測定および同定せねばならない。
【0008】
複雑な混合物中の被検体を相互に分離するためには、研究者は各被検体のユニークな化学的および/または物理的特性を利用してその被検体を相互に分離する。これらのユニークな性質はこの被検体の同定にも使用される。複雑な混合物の分析に関する過去の公表されている報告では全て、その方法では、未知試料中の構成成分の存在および/または実体が決定される前に、可能性ある各被検体の、既知の分析用標準が必要とされている。分析用標準および未知試料は、この方法により同一方法で処理され、得られたこれらの標準の性質が記録される(例えば、クロマトグラフィーの保持時間)。この情報を使用して、未知成分を含む試料が分析でき、もし未知試料中の或る成分が既知の分析用標準の1つと同じ性質を示したならば、その成分は、その分析用標準と同じものであると推定される。これが標的化分析技術である。標的化分析技術は一方向性である。研究者は既知の標準から方法の特性へと進むことができるが、方法の特性から既知の標準へと進むことはできない。研究者は、過去に分析した標準のうち1つのものの存在および/または量を確認またはそれに異議を唱えることができるに過ぎない。研究者は未知の被検体の方法特性からその化学的実体へと進むことはできない。この型の分析の主たる欠点は、分析前に同定されなかった分子は測定できないということである。その結果、有用である可能性のある多くの情報が研究者から失われてしまう。真に非標的性であるためには、既知であるか未知であるかに関わりなく、研究者がその混合物の全成分をその方法によって等しく評価できなければならない。これは、明らかにすべき被検体の物理的および/または化学的性質が、分析法に関係するのではなくその被検体自身の組成(即ち、その原子組成、および故に正確な質量)に固有である場合にのみ可能である。
【0009】
非標的化代謝プロファイリング技術の重要な利点
1. 多学問分野。与えられた1つの試料について事実上ただ1組の分析をしさえすればよく、この分析で得られたデータは、科学者が照準を定めている研究分野に関わりなく全ての科学者が利用可能である。
2. 包括的。非標的化アプローチは全ての代謝産物の変化を評価し、故に遺伝子機能/機能不全のより迅速且つ正確な決定につながる。
3. 未知の代謝産物の発見。非標的化アプローチは、現在知られておらず標的化分析シナリオでは監視されない重要な代謝調節物質を同定する可能性を有する。
4. 高スループット。この系は完全に自動化でき、分析時間は短く、一日あたり1つの機器で100の試料を分析できる。
5. 定量的。この系は再現性があり、有効ダイナミックレンジ>104を有する。集団全体にわたる代謝産物発現の相対的変化を研究することができる。
【0010】
技術のビジネス影響力
与えられた生物の代謝プロフィールの、探索可能なデータベースが作製できるということは、種の遺伝子操作の影響が如何にして研究できるかということにおける変革を表す。現在、実際の遺伝子コードについての我々の知識は、このコードを作り上げている遺伝子の機能についての知識よりもはるかに大きい。ゲノムをマッピングした後では、次に大きな仕事は、これらの遺伝子産物の機能と目的を決定すること、そして、数多くの目的にかなうこれらの遺伝子およびその発現の操作が如何にして達成できるかということである。遺伝子操作の影響を研究する時間、エネルギー、および費用は大きい。多数の目的のために探索でき、特定の遺伝子型の代謝産物プロフィールの直接的尺度を含んでいるデータベースは、特定の遺伝子産物の機能の決定に要する時間を劇的に減少させる可能性を有する。このようなデータベースは、蛋白発現に影響を及ぼすかも知れないが下流のフィードバック機構により細胞全体または生体レベルでは機能に正味の影響を及ぼさない遺伝子を探索する時間と資源を大量に投資するリスクを軽減するであろう。「Metabolic Profiling: a Rosetta Stone for genomics?」と題された1999年のCURRENT OPINION IN PLANT BIOLOGYに発表された論文で、Trethewey、KrotzkyおよびWillmitzerは、コンピューター技術の急激な発達が、非標的化実験化学遂行の「可能性」を開いたと指摘した。無限の自由をもって仕事をするということは可能でないと認識しつつ、実験後データ処理の力がこの非標的化アプローチを可能にするであろうという意見が提示された。この論文に記載の非標的化アプローチは、代謝産物データの非標的化収集ではなく、代謝産物データの取得後分析を扱っているに過ぎない。
【0011】
このように、複雑な混合物の非標的化分析の実行可能性は、自明でもなければ単純でもない。複雑な混合物の非標的化分析を取り巻く三つの主たる問題は、混合物中の全成分を分離および同定できること;この分析から生じる大量のデータを、研究に利用できるフォーマットに体系化できること;そして、このデータを、自動化様式で、且つ程良い時間で取得できることである。
【0012】
発明の要約
求められるのは、非標的化複雑試料分析の方法である。
本発明によれば、以下の工程を含む、複雑な試料の非標的化された分析方法が提供される。第一の工程は、既知分子の同定データを含むデータベースを提供することを含む(このデータベースは、種、代謝プロセス、細胞内位置などにより体系付けられた、自然界でかつて同定された全分子の元素組成を含む)。第二の工程は、複数の未同定分子を含む複雑な試料をフーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析機に導入して、その複雑な試料中の分子に関するデータを取得することを含む。第三の工程は、試料中の分子の比較を経て同定に到達するため、この複雑な試料中の分子に関する集められたデータを既知分子の同定データと比較することを含む。データベース中に現れない分子(即ち未知分子)は、それらの実験式を決定することにより自動的に同定される。したがって、この方法は、既に同定されている特定の分子に関連する、複雑な混合物内部の新たな分子を迅速に同定すると共に、既に定義されている分子のクラスまたは範疇と関連性を持たない、複雑な混合物中の分子を同定することを可能にする。その結果、複雑な混合物の分析は極めて単純化される。
【0013】
記載のように本発明は、フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析機(FTMS)の高分解能を使用して、異なる実験式を有する混合物内部の成分を全て分離する。これは石油蒸留製品については示されているが、付加イオンが問題となり得る「軟」イオン化方式でイオン化される水性生体試料では示されていない。実験式の決定を可能にするFTMSの正確な質量解析能は広範に確立されている。さらに、FTMSは高分解/正確質量2D MS/MSを実施することができ、これは、同一実験式を有する成分の実体を確認するのに使用できる構造情報を提供し、そして共通の構造成分に基づく代謝産物の体系化を可能にする。この能力は孤立した研究グループによって示されたが、市販の機器では利用できない。これらの能力を自動化試料注入系ならびに自動化データ統合およびデータベース系と統合することにより、複雑な混合物内部の全成分を迅速且つ同時に分析することができる。次いでこのデータを、探索できそして試料または被検体により体系化され得るデータベース中にエクスポートする。Trethewey、KrotzkyおよびWillmitzerの提唱したアプローチとは異なり、本方法は実験後のデータ処理の進み具合に依存しないことに留意されたい。本明細書に記載の非標的化代謝プロファイリング技術は、単純且つ圧縮されたデータ群を作製する。記載したデータベースを体系化および解釈することのできるコンピューター技術は容易に利用可能である。新たな進歩は必要ない。さらに、この技術はTrethewey、KrotzkyおよびWillmitzerのアプローチに内在していた有限の限界を持たない。
【0014】
本発明のこれらのそしてその他の特徴は、付随の描画および図面についてなされる以下の記述からより明らかとなるであろう。この描画および図面は例示のみの目的であり、いかなるやり方によっても本発明の範囲を示された特定の態様(群)に限定する意図はない。
【0015】
好ましい態様の詳細な説明
非標的化複雑試料分析態様の好ましい方法をここに図1を参考にして記載する。本発明の目的は、多数の複雑試料、例えば生体抽出物を分析する手段を提供すること、および、分析が完了した後にその情報を、試料間の相違を決定するために、非標的化様式で解析できることである。
【0016】
本発明においては、オートサンプラー14の利用を通じ、クロマトグラフィーカラムを更に利用して又は利用せずに、複雑試料をFTMS 12内に直接注入する。
【0017】
混合物の構成成分は多くの考え得る「軟」イオン化源(エレクトロスプレー、APCI、FAB、SIMS、MALDI等)の1つによってイオン化され、次いでさらなる質量選択的前分離(四重極、六重極など)を行いつつまたは行わずにイオンサイクロトロン共鳴(ICR)セル中に移される。次にこのイオンは分離され、同時にMS/MSを行いつつまたは行わずにICRセル中で測定される。集められたデータ(質量スペクトル)は、既知の濃度の既知分子による検定を行いつつまたは行わずに統合され(各イオンの質量、相対強度、絶対強度が測定される)そして処理される。アイソトープの脱離と実験式の計算をしたまたはしていないこれらのデータを次に、将来の比較および機能分析のためにデータを体系化し保存するデータベース16に移す。データベースに保存されたならば、個々の試料は相互に比較ができ、選択された試料間で異なる濃度を示す分子を表示することができる。データベース全体を特定分子について探索することができる。データベース中の試料を最高濃度から最低濃度へと、またはその逆に列挙することができる。この分析で検出された分子は既知分子のデータベースと比較でき、当該分子は自動的に同定される。既知分子と合致しない分子に関しては、最も可能性のある実験式が表示され得る。
【0018】
このアプローチは研究者に多くの利点を提供する。各々の試料から得られる情報量の劇的な増大がある(報告されている最も包括的な標的化分析法と比較して>10x)。混合物の既知および未知の成分両者についての情報が集められる。データ収集の効率が増大する(データ収集は、報告されている標的化分析技術よりおよそ10x速い)。未知試料の公平な比較のための根拠を提供する。代謝プロセスの小さな部分集合だけに及ぼす影響ではなく全細胞代謝に及ぼす遺伝子修飾の影響が決定できる(即ち、異なる代謝プロセス間の関係が研究できる)。全代謝産物を分析することにより、途絶している代謝プロセス内の実際の工程が決定できる。蛋白発現には影響するが細胞代謝には正味の影響を及ぼさない遺伝子修飾が同定できる。これらの分析の全ては1回の迅速な分析で同時に完了し、一方、同じデータを得るためにははるかに高い費用をかけて時間のかかる多数の分析を実施せねばならない。
【0019】
複雑混合物の分析用のFTMSの使用については多くの例が存在するが、非標的化分析とその後のデータベース形成の概念を導入したものはない。記載した方法は、これまでFTMSで用いられなかった能力を認識し利用している。FTMSは複雑な生体試料中にある異なる実験式を有する全ての代謝産物を分離する理論的分解能を持っている。FTMSは、複雑な生体試料中の全代謝産物に実験式を割り当てる、理論的に正確な質量能を持っている。FTMSは複雑な生体試料中の全代謝産物に2次元MS/MSを実施する能力を持っている。その被検体が分離でき次いでそれらの実験式およびMS/MSフラグメントデータに基づき、そしてまたはそれらを既知の被検体のデータベースと比較することにより同定できるならば、複雑な生体試料中にどんな代謝産物が存在するのかが先験的に分かっている必要はない。複雑試料を互いに比較して、どの被検体が試料間で異なる強度を持つのかを決定できる。データベースは被検体により、または共通のMS/MSフラグメントにより体系化できる。このアプローチは、生物の遺伝子操作、環境の変化、または発達の変化の結果としての遺伝子機能を解明するのに必要な時間と資源を著しく減少させる。記載した方法発明の多くの適用のうちの1つは、機能的ゲノム学研究での遺伝子機能の決定を包含する。
【0020】
複雑な試料中の特定の分子または分子群を分析するための、多数の標的化LC-MS法およびその他のスクリーニング法が開発されている。本発明が新規であり且つ自明でない主たる理由は、これが解析用分析のために基本的に異なる戦略を使用していること、そして高度に特殊化された機器および方法によってのみ可能であることである。少なくとも10年間の間に数多くの独立したFTMSの理論的研究能力が知られてきたが、FTMSは標的化法でのみ、そして特殊化された研究目的のためにのみ用いられてきた。過去10年間、本発明の範囲内で使用されたFTMSの適用を記載したグループは無かった。本発明は、幾つかの理論的FTMS能力を、複雑な混合物の分析および解釈に商業的用途を有する、包括的な、非標的化代謝プロファイリング法と結び付けることを含んでいる。
【0021】
本発明に係る方法は以下の工程を含む:
既知の代謝産物データベースの作製。
既知の全生物学的代謝産物の実体(一般名および実験式)および関連する生物学的情報(種、関係している代謝プロセス、細胞および細胞内位置など)を、商業的データベースプログラム中に入力する(即ち、マイクロソフトEXCEL、第I表)。これらの代謝産物の正確な一アイソトープ質量は、[M+H]+および[M-H]-の正確な質量によって自動的に決定される(M+HおよびM-Hは、プロトン(H+)が、その代謝産物に加わって正に荷電したイオンが作られた場合、またはその代謝産物から除去されて負に荷電した代謝産物が作られた場合の、当該代謝産物の質量を指す)。複雑試料のFTMS分析から集められたデータは、次いでこのデータベースと比較して、複雑試料中の成分の多くを直ちに同定することができる。
【0022】
分析用試料の調製。
定量分析化学で典型的に使用される幾つかの抽出/浄化法を用いて、代謝産物をそれらの生物学的起源から抽出する。方法は通常その試料の起源(即ち、葉組織、根組織、血液、尿、脳など)に応じて修飾する。例えば、植物の葉の試料0.1gを、50/50 MeOH/0.1%蟻酸1.0ml、および3個の小ガラスビーズを入れた試験管に入れ、1分間攪拌して試料をホモジナイズすることにより抽出する。次にこの試験管を5分間遠心分離する。次いで上清100ulを試験管から96ウェル平板に移す。この96ウェル平板を自動サンプラー上に置く。上清20ulをFTMS中に注入する。
【0023】
典型的な操作条件
溶媒。
移動相として、および全ての負のイオン化分析用の希釈のために50/50 MeOH/0.1%水酸化アンモニウム、そして全ての正のイオン分析のために50/50 MeOH/0.1%蟻酸。
【0024】
機器の編成。
エレクトロスプレー(ESI)および大気圧化学イオン化(APCI)源を有する7.0テスラ能動遮蔽超電導磁石を具備したBruker Daltonics APEX IIIフーリエ変換質量分析機(FTMS)。ESI、APCI、およびイオン移動条件は、セリン、テトラ-アラニン、レセルピン、HP Mix、および副腎皮質刺激ホルモンフラグメント4-10の標準ミックスを用いて感受性および解析について最適化した。機器条件は、質量範囲100-1000amuにわたりイオン強度と広帯域蓄積について最適化した。1メガワードのデータファイルを取得し、sinmデータ変換をフーリエ変換および強度計算の前に実施した。
【0025】
検定。
全ての試料は、上に述べた標準の混合物を用いておよそ100-1000amuの質量範囲にわたり質量の正確性を内部検定した。
【0026】
試料分析
試料は自動サンプラーを経て、または幾つかの場合には注射筒ポンプを用いてFTMSに導入する。試料溶液がFTMSの源に到達すると(源とは、FTMSが試料溶液中の分子をイオン化する場所である)、分子は、使用された特定のイオン化源の原理に従いイオン化される。この源は、イオン化の型に応じて、質量分析機の外部にあることも内部にあることもある(例えば、ESIおよびAPCIでは、イオンは質量分析機の外部で生成し、しかる後質量分析機に移送され、一方電子衝撃イオン化では、分子は質量分析機の内部でイオン化される)。生成し質量分析機に移送された(必要ならば)イオンは、次に分離され、それらの質量対電荷比に基づき質量分析機で検出される。
【0027】
被検体の検出
複雑混合物内部の全ての被検体は同時に分析される(図2-5を参照されたい)。被検体の実体についての事前の知識無しで全ての被検体について構造特異的な情報(正確なMS/MSフラグメント質量を伴うまたは伴わない正確な質量)が得られ、次いでこのデータを、包括的データベースに協調的な方法でフォーマットする。
【0028】
複雑試料のデータベース作製
データベース作製の典型的プロセスは以下の工程を含んでいる:
1. FTMSの出力結果(検定された質量スペクトル)をフィルターにかけ、全ての13Cアイソトープおよび1つの電荷を持つ生物学的代謝産物に対応しない質量欠損を有するピークを除去する;
【0029】
2. 次に、このフィルターにかけたピークリスト中のピークの各々を、研究者が提供する元素制約に従い、機器製造者のソフトウェアパッケージの一部である質量分析プログラムを用いて分析する。このプログラムは、或る選択された誤差範囲内で、与えられた質量において可能な考え得る元素組成を全て報告する。
【0030】
3. フィルターにかけられたピークリスト中、上の制約を満たすピーク由来のデータ(ファイル名、試料ID、質量、相対強度、絶対強度、実験式(群))のみが最終処理されたデータファイルにエクスポートされる(第II表)。それぞれの試料の分析がこのような最終処理されたデータファイルを産む。
【0031】
4. 次に、データファイルを合しそして比較することで複数のデータベースが作製できる。このような三つのデータベースは、
【0032】
a) 二つの試料を直接比較して相違のデータベースを作製する(第VI表);
b) 複数のファイルを合して、一連の試料を通じた変化を追跡できるデータベースを作製する(第III表);
c) 試料群全体を1個の対照試料と直接比較し、次いでこの群の全試料の組み合わせを1つのデータベースに入れ、この群対共通対照内部での比較を可能にする(図8)。
【0033】
本発明の有用性を以下の実施例に例示する:
I.生物の異なる発達段階を比較する能力 ( 図 6-12 、第 IV 表 )。
この実施例では、イチゴのイチゴ色素経路を観察した。図6は完全な代謝経路を示す。図7-12は、本発明者等が観察したこの経路中の様々な代謝産物を示す。著しく相違する化学組成の分子を観察できたことに注目されたい(アミノ酸、酸、flavenoid、グルコシド)。ここで本発明者等は、発達段階(緑-白-変化-赤)の機能として単一の遺伝子型(赤いイチゴ)内での変化を観察し、それを異なる遺伝子型(白色突然変異体)と比較することができた。本明細書に記載の非標的化代謝プロファイリング技術のみがこの広いスペクトルを有する。さらに、第IV表で指摘したように、メタボロームにおけるこれらの変化は、遺伝子発現における変化と直接相関する。
【0034】
II .異なる遺伝子型を比較する能力 ( 図 13-15 、第 V 表 )
この実施例では、グルコシノレートの含有量および濃度に変化を有することが分かっている3種の異なるアラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)突然変異体(TU1、TU3、TU5)を野生型(WT)と比較した。この例において本明細書に記載の非標的化代謝プロファイリング技術は、前の結果を確認でき、そしてかつて観察されたことがなかったグルコシノレートの変化を同定することができた。
【0035】
III .重要経路に含まれる未知代謝産物を検出および同定する能力 ( 図 16 および 17 、第 IX 表 )
この実施例では、対照の(赤)タバコの花を白色突然変異体と比較した。グルコシド(図16)が、色の原因となる代謝産物であると予想された。しかしながら、非標的化代謝プロファイリング法で分析したところ、予想した代謝産物は観察されなかった。未知の代謝産物(図17)が検出され、タバコの花の色の原因となる代謝産物であると同定された(第IX表)。
【0036】
IV .生物に及ぼす異なる環境条件の影響を比較する能力 ( 第 VI 表 )
この実施例では、通常の生育条件(充分な燐酸塩)下で生育させた人参の根由来の滲出物を、異常な生育条件(不充分な燐酸塩)下で生育させた人参の根由来の滲出物と比較した。非標的化代謝プロファイリングを用いて本発明者等は、低燐酸塩の条件下で共生している真菌の生育を促進するために分泌される重要な植物ホルモンを同定することができた。
【0037】
V .正確な MS/MS データに基づく代謝産物をグループ分けおよび分類する能力 ( 第 VII 表および第 VIII 表 )
この実施例では、上記の低燐酸塩条件において増加することが観察された代謝産物について、正確なMS/MSフラグメント化データを集めた。類似の基礎構造を有する分子のクラスを一群とすることができる(この場合、C10H9N6O2フラグメントを伴う全代謝産物)。この能力は、異なる複雑混合物を探索および特性決定する能力を大幅に増強する。
【0038】
VI .生物の代謝産物を包括的に監視する能力 ( 第 X 表、図 18)
イチゴの発達段階についての研究において本発明者等は、観察された代謝産物の数、および異なる発達段階間で濃度を変化させることが観察された代謝産物の数を確認した。事実上全ての進行中の代謝プロセスを個別にまたは相互の関連において監視および評価ができるようにするということが、この方法の包括的性格である。他の技術でこの能力を有するものは無い。
【0039】
【表1】
【0040】
註:既知の化学構造を有する任意の分子をいつでもこのデータベースに加えることができる。このデータベースは正確な一アイソトープ質量で構成されている。ユニークな実験式を有する分子は全てユニークな正確な質量を持っている。この質量は一定であり、且つ本明細書で論じた方法から独立しており、複雑試料中の全成分を非標的化様式で分析することを可能にしている。
【0041】
図2は、2列の質量スペクトルを示す。上部のスペクトルは緑色段階のイチゴの抽出物由来のものであり、下部のスペクトルは赤色段階のイチゴの抽出物由来のものである。上に示した質量範囲で500以上のユニークな化学物質が観察された(100-350amu;これは分析された全体の質量範囲(100-5000)の部分集合に過ぎない)。
【0042】
図3、4、および5は、代謝産物の分離を例示するため、だんだん小さくなる質量範囲を示している。
【0043】
図5は、165000以上での質量スペクトルの分離を示している。全ての代謝産物を分離するためにこの極めて高い分離が必要であり、このようにして二つの試料を比較でき、変化がもしあればそれを測定することができる。
【0044】
第II表 処理されたデータの例示(ファイルID、質量、強度、実験式、相対誤差)
【表2】
【0045】
註:質量スペクトルは13Cアイソトープが最初に除去されるように処理する(これは高度な分解性および質量の正確性の故にFTMS分析においてのみ可能である)。次いで、残りのピークを、研究者が選択した特定の制約を使用し、機器に含まれる質量分析プログラムを用いて自動分析する(上の例では、炭素(C)、水素(H)、酸素(O)、窒素(N)、硫黄(S)、または燐(P)の適当な組み合わせを有するピークのみを報告する)。すると、最終データセットは1ppm(err)未満の測定精度を有する一アイソトープの単一荷電代謝産物のみを含むことになる。
【0046】
第III表 処理されたデータから作製したデータベースの例示
【表3】
【0047】
註:第III表では、緑色段階に対する赤色段階のイチゴにおける代謝産物の相対発現に従いデータを並べ替えた。このデータは任意のフィールドで体系化できる。観察されたことは、代謝産物C10H20O10は緑色段階で観察される濃度の少なくとも22923%の濃度を有するということである(この代謝産物は緑色段階では観察されず、そのため数値はバックグラウンドノイズの%である)。この代謝産物はその実験式により、イチゴに観察されそれらに赤色を与える主要な色素、ペラルゴニジン-3-グルコシドであると同定できる。
このプロセスを自動化する。
【0048】
第IV表 イチゴの色調形成における代謝産物と遺伝子発現データの比較(赤色段階対緑色段階)
【表4】
【0049】
註:図7から12および第IV表は、発達中に起こる変化を研究する際の、非標的化代謝プロファイリングの力を示す。非標的化代謝プロファイリングにより研究者は代謝経路全体を同時に監視することができる。このように多様な範囲の被検体を同時に分析できる方法は他に無い。上に例示した被検体は全て、本明細書に示した方法および概念を用いて収集した非標的化データから抽出した。
【0050】
3-メチルスルフィニルヘプチルグルコシノレートの相対変化を例示した。
【0051】
第V表 異なるアラビドプシス・タリアナ突然変異体のグルコシノレートの比較
アラビドプシスグルコシノレート突然変異体
【表5】
観察された19のグルコシノレート分子(17が報告された)
【0052】
註:第V表では、遺伝的突然変異体をそれらの野生型と比較するための当該技術の適用可能性を例示する。4種の突然変異体(TU1、TU3、TU5、およびTU7)の非標的代謝プロフィールをそれらの野生型と比較した。ここに本発明者等は、標的化分析を用いて過去に分析されたグルコシノレートを同定および監視できるばかりでなく、かつて同定されなかったグルコシノレートを同定することができたことを示す。本発明者等の分析の全てに該当することであるが、他の代謝産物も全て評価のために利用可能である。
【0053】
第VI表 二つの試料を直接比較することにより作製したデータベースの例示(燐酸塩(エステル)の存在下または不在下でのニンジン根exuate)。-P画分に増大が観察された代謝産物の一覧。
【表6】
【0054】
註:第VI表は、異なる環境条件下での生物の代謝プロフィールを比較するため、本発明者等の技術を如何に使用できるかを例示している。ここに本発明者等は、燐酸塩(エステル)条件に対する植物の反応を調節することに関与する重要分子を検出および同定することができた。この能力により、研究者は、環境条件の変化が生物の生体機能にどのような影響を及ぼすのかを決定することができる。
【0055】
第VII表 -P画分に増大が観察された、選択された代謝産物のMS/MSデータ
【表7】
【表8】
【0056】
第VIII表 MS/MSデータを用いた代謝産物の関係の決定
【表9】
【0057】
第IX表 タバコの花の分析で観察された未知ピークの質量分析
未知ピークの質量分析
検定定数:
ML1:108299134.679450
ML2:-16.576817
ML3:-2029.796744
【0058】
検定結果:
観察された未知のものの質量:595.16572
実験式探索結果:C27H30O15[+H]+
質量:595.16575
質量誤差:0.04ppm
提唱された代謝産物:C15H10O6 - ラムノグルコシド
(グレープフルーツの花に存在)
【0059】
註:図16および17ならびに第IX表は、本発明者等の技術が如何にして他では得られない意義深い情報を提供するかを示している。この例において、研究者は、タバコの花の主たる色成分は分かっている(C15H10O6-グルコシド)と考えたが、本発明者等の分析は、タバコの花の主たる色成分が実際はラムノグルコシドであることを示した。これは、分析後に未知成分を同定できるという力を示している。現在この型の分析を提供する技術は、他には存在しない。
【0060】
第X表 イチゴ抽出物において監視した代謝産物の数の例示。異なる抽出法およびイオン化条件で観察された代謝産物の一覧。
【0061】
第X表および図18は、本発明の総合的性格を例示している。本発明者等の技術は、様々な環境、遺伝的、および発達条件の下での生物の代謝プロフィールを総合的に比較することを可能にする。
【0062】
この特許文書中、「含む」という語は、その非制限的意味において、当該語に続く事物が包含されることを意味しているが、特に言及されていない事物が除外される訳ではない。不定冠詞「a」による或る要素の表示は、その文脈が明らかに1つの、そしてただ一つの要素があることを要求していない限り、1以上の要素が存在する可能性を排除しない。
【0063】
請求の範囲に定義した本発明の精神および範囲を逸脱することなく、示された態様に修飾を施し得るということは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明の教示に従う複雑な試料の非標的化分析を示す側面正面図である。
【図2】 複雑な混合物中の代謝産物が如何にして相互に分離されるかを示す、FTMSから集められた生のデータ(質量スペクトル)の例示である。質量範囲は100-350amuを示した。
【図3】 複雑な混合物中の代謝産物が如何にして相互に分離されるかを示す、FTMSから集められた生のデータ(質量スペクトル)の例示である。10amuの質量範囲を示した。
【図4】 複雑な混合物中の代謝産物が如何にして相互に分離されるかを示す、FTMSから集められた生のデータ(質量スペクトル)の例示である。1amuの質量範囲を示した。
【図5】 複雑な混合物中の代謝産物が如何にして相互に分離されるかを示す、FTMSから集められた生のデータ(質量スペクトル)の例示である。質量範囲は100-350amu0.1amuウインドウを示した。
【図6】 イチゴ色素経路の例示である(生物の異なる発達段階の比較)。
【図7】 異なる発達段階のイチゴ抽出物由来のフェニルアラニンの、抽出された質量スペクトルの例示である。
【図8】 異なる発達段階のイチゴ抽出物由来の桂皮酸塩(エステル)の、抽出された質量スペクトルの例示である。
【図9】 異なる発達段階のイチゴ抽出物由来の4-クマル酸塩(エステル)の、抽出された質量スペクトルの例示である。
【図10】 異なる発達段階のイチゴ抽出物由来のナリンゲニンの、抽出された質量スペクトルの例示である。
【図11】 異なる発達段階のイチゴ抽出物由来のペラルゴニジンの、抽出された質量スペクトルの例示である。
【図12】 異なる発達段階のイチゴ抽出物由来のペラルゴニジン-3-グルコシドの、抽出された質量スペクトルの例示である。
【図13】 アラビドプシス・タリアナ中のグルコシノレート突然変異体の例示である(遺伝的突然変異体と野生型との比較および未知代謝産物の同定)。3-メチルチオブチルグルコシノレートにおける相対変化を例示した。
【図14】 アラビドプシス・タリアナ中のグルコシノレート突然変異体の例示である(遺伝的突然変異体と野生型との比較および未知代謝産物の同定)。3-メチルスルフィニルプロピルグルコシノレートにおける相対変化を例示した。
【図15】 アラビドプシス・タリアナ中のグルコシノレート突然変異体の例示である(遺伝的突然変異体と野生型との比較および未知代謝産物の同定)。3-メチルスルフィニルヘプチルグルコシノレートにおける相対変化を例示した。
【図16】 タバコの花の分析の例示である(タバコにおける赤色の原因であると予想される代謝産物の位置決定)。
【図17】 タバコの花の分析の例示である(タバコの色に関与していると思われる未知代謝産物の位置決定)。
【図18】 イチゴの発生において観察された代謝上の変化の例示である。
Claims (20)
- 複数の複雑試料の非標的化分析のための方法であって、
(a)複数の複雑試料をフーリエ変換イオンサイクロ(登録商標)トロン質量分析機(FTMS)に導入する工程であって、該試料の各々は、目的とする代謝産物を先験的に選択することなく複数の未同定代謝産物を含む工程;
(b)FTMSに導入された複雑試料の各々において検出された複数の未同定代謝産物についてのデータを同時に得て、同定し、および定量する工程であって、ここで、同定データは正確な質量を含み、定量データは代謝産物の相対強度および/または絶対強度である工程;
(c)該同定および定量データを含むデータベースを作り出す工程;ならびに
(d)該データベースを分析する工程であって、ここで、分析工程が、以下:
(i)該データベースを分析し、試料間で異なる強度の代謝産物を決定し、そのように決定された1もしくはそれ以上の代謝産物を既知の代謝産物の既知のデータベースに合致させることによって、または1もしくはそれ以上の代謝産物の実験式によって、または1もしくはそれ以上の代謝産物のMS/MSフラグメントデータによって、同定データを用いて、そのように決定された1またはそれ以上の代謝産物を同定する工程;
(ii)該データベースと既知の代謝産物の既知のデータベースとを比較し、同定データを用いて、そのように比較された1またはそれ以上の代謝産物を同定し、1またはそれ以上の代謝産物からの該同定データを該既知の代謝産物の既知のデータベースに合致させる工程;および
(iii)代謝産物濃度によってデータベースを体系化する工程
からなる群から選択される工程である工程
を含む方法。 - 請求項1の工程(a)の後に、さらに、以下:
i)軟イオン化源を用いて代謝産物をイオン化する工程;
ii)さらなる質量選択的前分離を伴うかまたは伴わない、イオンサイクロ(登録商標)トロン共鳴(ICR)セルに該イオン化された代謝産物を移す工程;および
iii)同時にMS/MSを行いつつまたは行わずにICRセル中で該イオンを分離および測定する工程
を含み、そして、該分析工程は、該データベースを分析し、試料間で異なる強度の代謝産物を決定し、そのように決定された1またはそれ以上の代謝産物を既知の代謝産物の既知のデータベースに合致させることによって、または1もしくはそれ以上の代謝産物の実験式によって、または1もしくはそれ以上の代謝産物のMS/MSフラグメントデータによって、同定データを用いて、そのように決定された1またはそれ以上の代謝産物を同定する工程である、請求項1に記載の非標的化分析のための方法。 - 前記複雑試料が生物学的試料である、請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的試料が代謝産物の生体抽出物である、請求項3に記載の方法。
- 前記複雑試料がコンビナトリアル化学合成試料である、請求項1に記載の方法。
- 前記正確な質量を用いて、1またはそれ以上の代謝産物の実験式を計算する、請求項1に記載の方法。
- 請求項1の工程(c)で作り出されるデータベースが実験式により1またはそれ以上の既知代謝産物を探索することによって分析される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1の工程(c)で作り出されるデータベースが正確な質量により1またはそれ以上の既知の代謝産物を探索することによって分析される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1の工程(c)で作り出されるデータベースが代謝産物の実験式により既知の代謝産物を同定することによって分析される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1の工程(c)において作り出されたデータベースが、1またはそれ以上の「被験」試料と1またはそれ以上の「対照」試料との比較によって分析され、その結果、「被験」試料中に存在する代謝産物の強度を、対照試料およびその他の被験試料に比較して決定できる、請求項1に記載の方法。
- 請求項1の工程(c)において作り出されたデータベースが、任意の2またはそれ以上の試料を互いに比較することによって分析され、その結果、いくつかの試料には見出されるが、他では見出されない代謝産物の強度の存在または不在が決定される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1の工程(c)において作り出されたデータベースが、1またはそれ以上の被験試料と1またはそれ以上の対照試料との比較によって分析され、その結果、被験試料中に存在する代謝産物の強度の存在または不在が、対照試料または他の被験試料に比較して決定される、請求項1に記載の方法。
- FTMSが、クロマトグラフィー分離システムと共に使用される、請求項1に記載の方法。
- FTMSが軟イオン化源を備えている、請求項1に記載の方法。
- FTMSが追加の質量選択的前分離を備えている、請求項1に記載の方法。
- 前記複雑試料由来のデータベース中に含まれるデータが、遺伝的に修飾された「被験」生物および遺伝的に修飾されていない「対照」生物由来であり、ここで、該データが、遺伝的修飾により影響を受けた遺伝子の機能を決定する目的のための、同じ該生物からの遺伝子発現データと比較される、請求項1に記載の方法。
- 前記複雑試料由来のデータベース中に含まれるデータが、「被験」環境および「対照」環境に暴露された生物由来であり、ここで、該データが、被験環境により影響を受けた遺伝子の機能を決定する目的のための同じ該条件下の同じ該生物からの遺伝子発現データと比較される、請求項1に記載の方法。
- 前記複雑試料由来のデータベース中に含まれるデータが、異なる発達段階にある生物由来であり、ここで、該データが、該生物の発達の変化により影響を受ける遺伝子の機能を決定する目的のための、同じ該発達段階にある同じ該生物からの遺伝子発現データと比較される、請求項1に記載の方法。
- 前記複雑試料由来のデータベース中に含まれるデータが、健康な生物および病的生物由来であり、ここで、該データが、該生物の疾病状態により影響を受けた遺伝子の機能を決定する目的のための、同じ該生物からの遺伝子発現データと比較される、請求項1に記載の方法。
- ヒト疾病を研究するための請求項1に記載の方法。
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US20040121311A1 (en) | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Methods for rapid detection and identification of bioagents in livestock |
US7226739B2 (en) | 2001-03-02 | 2007-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc | Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations |
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US8073627B2 (en) * | 2001-06-26 | 2011-12-06 | Ibis Biosciences, Inc. | System for indentification of pathogens |
US7217510B2 (en) | 2001-06-26 | 2007-05-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for providing bacterial bioagent characterizing information |
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EP1456667B2 (en) * | 2001-12-08 | 2010-01-20 | Micromass UK Limited | Method of mass spectrometry |
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DE60337003D1 (de) * | 2002-03-22 | 2011-06-16 | Phenomenome Discoveries Inc | Verfahren zur visualisierung von nicht gezielten metabolomischen daten, erzeugt durch ionenzyklotronresonanz -fouriertransformation-massenspektrometer |
US6792333B2 (en) * | 2002-06-04 | 2004-09-14 | Semiconductor Energy Laboratory Co., Ltd. | Product management method, program for performing product management, and storage medium having recorded the program therein |
CA2508726A1 (en) | 2002-12-06 | 2004-07-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
US8057993B2 (en) | 2003-04-26 | 2011-11-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of coronaviruses |
US7964343B2 (en) | 2003-05-13 | 2011-06-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
US8158354B2 (en) | 2003-05-13 | 2012-04-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
US7425700B2 (en) | 2003-05-22 | 2008-09-16 | Stults John T | Systems and methods for discovery and analysis of markers |
US20120122102A1 (en) | 2003-09-11 | 2012-05-17 | Rangarajan Sampath | Compositions for use in identification of bacteria |
US8546082B2 (en) | 2003-09-11 | 2013-10-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
US8097416B2 (en) | 2003-09-11 | 2012-01-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
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US20050266411A1 (en) | 2004-05-25 | 2005-12-01 | Hofstadler Steven A | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA |
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EP1869180B1 (en) | 2005-03-03 | 2013-02-20 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of polyoma viruses |
CA2611065A1 (en) * | 2005-06-03 | 2006-12-07 | Mds Inc. Doing Business Through Its Mds Sciex Division | System and method for analysis of compounds using a mass spectrometer |
JP2009502137A (ja) | 2005-07-21 | 2009-01-29 | アイシス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド | 核酸変種の迅速な同定および定量のための方法 |
CA2772688A1 (en) | 2005-09-12 | 2007-03-22 | Phenomenome Discoveries Inc. | Methods for the diagnosis of colorectal cancer and ovarian cancer health states |
JP5303273B2 (ja) * | 2005-09-15 | 2013-10-02 | フェノメノーム ディスカバリーズ インク | フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法についての方法及び装置 |
US7462818B2 (en) * | 2005-11-04 | 2008-12-09 | Agilent Technologies, Inc. | Determination of chemical empirical formulas of unknown compounds using accurate ion mass measurement of all isotopes |
KR20080104350A (ko) * | 2006-02-28 | 2008-12-02 | 페노미넘 디스커버리스 인코포레이티드 | 치매 및 다른 신경 장애의 진단을 위한 방법 |
WO2007109881A1 (en) * | 2006-03-24 | 2007-10-04 | Phenomenome Discoveries Inc. | Biomarkers useful for diagnosing prostate cancer, and methods thereof |
WO2007118222A2 (en) | 2006-04-06 | 2007-10-18 | Ibis Biosciences, INC | Compositions for the use in identification of fungi |
CN101479230A (zh) * | 2006-05-26 | 2009-07-08 | 菲诺梅诺米发现公司 | 用于诊断多发性硬化的生物标记及其方法 |
US9149473B2 (en) | 2006-09-14 | 2015-10-06 | Ibis Biosciences, Inc. | Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens |
WO2008033575A2 (en) | 2006-09-15 | 2008-03-20 | Metabolon, Inc. | Methods of identifying biochemical pathways |
EP2115458A4 (en) * | 2007-02-01 | 2011-06-08 | Phenomenome Discoveries Inc | METHOD FOR DIAGNOSIS OF HEALTH CONDITIONS FOR OVARIAL CARCINOMA AND THE RISK OF HEALTH CONDITIONS IN OVARIAL CARCINOMA |
CA2695167C (en) | 2007-02-08 | 2011-11-01 | Phenomenome Discoveries Inc. | Methods for the treatment of elevated cholesterol levels |
WO2008104002A2 (en) | 2007-02-23 | 2008-08-28 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic dna analysis |
CN101675337A (zh) | 2007-04-13 | 2010-03-17 | 菲诺梅诺米发现公司 | 用于缩醛磷脂缺乏介导的衰老疾病的诊断和危险评估的方法 |
US9598724B2 (en) | 2007-06-01 | 2017-03-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
AU2008280806B2 (en) | 2007-07-26 | 2014-12-11 | Phenomenome Discoveries Inc. | Methods for the diagnosis, risk assessment, and monitoring of autism spectrum disorders |
US7884318B2 (en) * | 2008-01-16 | 2011-02-08 | Metabolon, Inc. | Systems, methods, and computer-readable medium for determining composition of chemical constituents in a complex mixture |
US8073635B2 (en) * | 2008-02-15 | 2011-12-06 | Dh Technologies Development Pte. Ltd. | Method of quantitation by mass spectrometry |
WO2010033625A1 (en) | 2008-09-16 | 2010-03-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Microplate handling systems and related computer program products and methods |
WO2010033627A2 (en) | 2008-09-16 | 2010-03-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample processing units, systems, and related methods |
US8550694B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-10-08 | Ibis Biosciences, Inc. | Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods |
EP2396803A4 (en) | 2009-02-12 | 2016-10-26 | Ibis Biosciences Inc | IONIZATION PROBE ASSEMBLIES |
US9719083B2 (en) | 2009-03-08 | 2017-08-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Bioagent detection methods |
US9393564B2 (en) | 2009-03-30 | 2016-07-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Bioagent detection systems, devices, and methods |
US8950604B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-02-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Lift and mount apparatus |
WO2011008972A1 (en) | 2009-07-17 | 2011-01-20 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems for bioagent identification |
WO2011014811A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests |
EP3098325A1 (en) | 2009-08-06 | 2016-11-30 | Ibis Biosciences, Inc. | Non-mass determined base compositions for nucleic acid detection |
CA2797960A1 (en) | 2009-10-01 | 2011-04-07 | Phenomenome Discoveries Inc. | Serum-based biomarkers of pancreatic cancer and uses thereof for disease detection and diagnosis |
ES2628739T3 (es) | 2009-10-15 | 2017-08-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Amplificación por desplazamiento múltiple |
WO2011115840A2 (en) | 2010-03-14 | 2011-09-22 | Ibis Biosciences, Inc. | Parasite detection via endosymbiont detection |
WO2013170204A1 (en) * | 2012-05-11 | 2013-11-14 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Augmented reality for workflow assistance |
WO2014176435A2 (en) | 2013-04-25 | 2014-10-30 | Bergo Vladislav B | Microarray compositions and methods of their use |
US10627407B2 (en) * | 2015-03-12 | 2020-04-21 | Mars, Incorporated | Ultra high resolution mass spectrometry and methods of using the same |
CN105467057A (zh) * | 2015-12-28 | 2016-04-06 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种柑橘类水果中708种农药残留gc-q-tof/ms侦测技术 |
CN105467056A (zh) * | 2015-12-28 | 2016-04-06 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种茄果类蔬菜中708种农药残留gc-q-tof/ms侦测技术 |
US10006925B2 (en) | 2016-05-30 | 2018-06-26 | Universal Diagnostics, S. L. | Methods and systems for metabolite and/or lipid-based detection of colorectal cancer and/or adenomatous polyps |
US11036779B2 (en) * | 2018-04-23 | 2021-06-15 | Verso Biosciences, Inc. | Data analytics systems and methods |
GB201809018D0 (en) | 2018-06-01 | 2018-07-18 | Highchem S R O | Identification of chemical structures |
CN109918056A (zh) * | 2019-03-07 | 2019-06-21 | 深圳市绘云生物科技有限公司 | 一种代谢物批量定量软件系统 |
CN110110743B (zh) * | 2019-03-26 | 2019-12-31 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种七类质谱谱图自动识别系统与方法 |
CN117233413A (zh) | 2019-08-05 | 2023-12-15 | 禧尔公司 | 用于样品制备、数据生成和蛋白质冠分析的系统和方法 |
JP7488903B2 (ja) | 2019-12-28 | 2024-05-22 | 中精普康(北京)医薬科技有限公司 | 結腸直腸癌又は腺腫を検出するためのバイオマーカー及びその方法 |
CN112540139B (zh) * | 2020-12-16 | 2022-07-15 | 杭州汇健科技有限公司 | 一种代谢谱检测用的分子量校准品试剂盒及其制备方法、使用方法 |
WO2023104771A2 (en) * | 2021-12-07 | 2023-06-15 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | An automated system for providing at least one sample for electrospray ionization in a mass spectrometer system |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999045150A1 (en) * | 1998-03-02 | 1999-09-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Mass spectrometric methods for biomolecular screening |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4978852A (en) | 1988-09-08 | 1990-12-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Hadamard transform measurement of MSN Fourier-transform mass spectra |
US4956788A (en) | 1988-11-28 | 1990-09-11 | University Of The Pacific | PC-based FT/ICR system |
US5233190A (en) | 1990-03-16 | 1993-08-03 | Leybold Inficon Inc. | Fourier transform molecular spectrometer |
US6017693A (en) | 1994-03-14 | 2000-01-25 | University Of Washington | Identification of nucleotides, amino acids, or carbohydrates by mass spectrometry |
US5668373A (en) | 1996-04-26 | 1997-09-16 | Trustees Of Tufts College | Methods and apparatus for analysis of complex mixtures |
GB9617852D0 (en) | 1996-08-27 | 1996-10-09 | Univ Manchester Metropolitan | Micro-organism identification |
GB9624927D0 (en) | 1996-11-29 | 1997-01-15 | Oxford Glycosciences Uk Ltd | Gels and their use |
ATE343132T1 (de) | 1998-08-12 | 2006-11-15 | Zycos Inc | Darstellung des profils und katalogisierung von exprimierten proteinmarkern |
US20020009394A1 (en) | 1999-04-02 | 2002-01-24 | Hubert Koster | Automated process line |
DE60026452T2 (de) | 1999-04-06 | 2006-08-10 | Micromass Uk Ltd. | Verfahren zur Identifizierung von Peptidensequenzen und Proteinensequenzen mittels Massenspektromterie |
CA2303758C (en) | 1999-04-06 | 2004-01-06 | Micromass Limited | Improved methods of identifying peptides and proteins by mass spectrometry |
US6677114B1 (en) * | 1999-04-20 | 2004-01-13 | Target Discovery, Inc. | Polypeptide fingerprinting methods and bioinformatics database system |
IL146093A0 (en) | 1999-04-20 | 2002-07-25 | Target Discovery Inc | Method of separating a polypeptide or protein from a solution containing a plurality thereof |
US6446010B1 (en) * | 1999-06-15 | 2002-09-03 | The Rockefeller University | Method for assessing significance of protein identification |
CA2298181C (en) | 2000-02-02 | 2006-09-19 | Dayan Burke Goodnough | Non-targeted complex sample analysis |
JP2003521257A (ja) | 2000-02-07 | 2003-07-15 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ | (ポリ)ペプチドを同定しおよび/または特性決定するための方法 |
EP1285092A4 (en) | 2000-04-14 | 2003-07-16 | Metabolon Inc | METHOD FOR DISCOVERY OF MEDICINES, DISEASE TREATMENT AND DIAGNOSIS USE THE METABOLOMICS |
US7329489B2 (en) | 2000-04-14 | 2008-02-12 | Matabolon, Inc. | Methods for drug discovery, disease treatment, and diagnosis using metabolomics |
AU2001264867A1 (en) | 2000-05-31 | 2001-12-11 | The Johns Hopkins University | Methods for using mass spectrometry to identify and classify filamentous fungi, yeasts, molds and pollen |
SE517259C2 (sv) | 2000-06-14 | 2002-05-14 | Jan Eriksson | System för molekylidentifiering |
US6680203B2 (en) | 2000-07-10 | 2004-01-20 | Esperion Therapeutics, Inc. | Fourier transform mass spectrometry of complex biological samples |
ATE386986T1 (de) | 2001-07-06 | 2008-03-15 | Lipomics Technologies Inc | Erzeugen, betrachten, interpretieren und verwenden einer quantitativen datenbank von metaboliten |
IL160324A0 (en) | 2001-08-13 | 2004-07-25 | Beyond Genomics Inc | Method and system for profiling biological systems |
US20030108876A1 (en) | 2001-12-11 | 2003-06-12 | Speir Johnny Paul | Method for the application of FTMS to drug testing |
-
2000
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2005
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-
2007
- 2007-11-01 US US11/933,849 patent/US7865312B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999045150A1 (en) * | 1998-03-02 | 1999-09-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Mass spectrometric methods for biomolecular screening |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL150840A (en) | 2009-02-11 |
CA2298181C (en) | 2006-09-19 |
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US20040029120A1 (en) | 2004-02-12 |
US7865312B2 (en) | 2011-01-04 |
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US20080308723A1 (en) | 2008-12-18 |
WO2001057518A3 (en) | 2002-06-27 |
JP2003533672A (ja) | 2003-11-11 |
WO2001057518A2 (en) | 2001-08-09 |
AU784545B2 (en) | 2006-04-27 |
EP1255989A2 (en) | 2002-11-13 |
IL150840A0 (en) | 2003-02-12 |
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