KR20070029126A - 단백질 해석 방법 - Google Patents

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KR20070029126A
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요시오 야마우치
다카시 신카와
도시아키 이소베
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요시오 야마우치
다카시 신카와
도시아키 이소베
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Abstract

본 발명의 목적은 단백질의 동정 및 이의 정량 정보를 보다 간단한 처리로 수득할 수 있는 단백질 분석 방법을 제공하는 데에 있는 것으로, 본 발명의 단백질 분석 방법은 2종의 단백질 함유 시료를 각각 제한 효소로 특정 아미노산 부위를 절단하여 펩티드 사슬 함유 시료로 준비하는 공정, 동위체에 따라 다른 질량차를 갖는 표지 화합물을 펩티드 사슬 함유 시료에 포함되는 펩티드 사슬을 수식하여 펩티드 사슬에 질량차를 부여하는 공정, 각 동위체 표지 펩티드 사슬 함유 시료를 혼합하여 상기 혼합 시료를 각 펩티드 사슬마다 분별 정량하여 함량비를 구하는 공정, 각 펩티드 사슬로부터 아미노산 배열을 특정할 펩티드 사슬을 선택하고 상기 펩티드 사슬의 아미노산 배열의 특징을 확인하는 공정, 펩티드 사슬에 대응하는 단백질을 특정하는 공정, 및 펩티드 사슬의 분별 정량값에 기초하여 특정한 단백질의 함량의 비를 구하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

단백질 해석 방법{PROTEIN ANALYSIS METHOD}
본 발명은 단백질의 해석 방법, 특히 질량 분석계를 사용한 해석 방법의 개량에 관한 것이다.
최근의 게놈 프로젝트와 같은 유전자 정보의 해석 프로젝트의 진전에 따라 밝혀진 팽대한 유전자 정보와, 세포 내에서 복잡하게 상호 작용하고 있는 다양한 단백질의 관련을 밝힘으로써 유전자의 기능 해석이 진행되고 있다. 프로테옴 해석은 세포의 기능을 지탱하는 다양한 단백질의 관계를 종합적으로 파악하고자 하는 시도이다. 그러나 현재의 분석 기술에서는 단백질의 해석에는 많은 시간과 노력이 필요하므로, 이와 같이 다양성이 풍부한 단백질의 집합인 프로테옴의 변화를, 종합적으로 또한 신속하게 파악하는 방법이 요구되고 있다.
종래 단백질의 분리 분석으로서 일반적으로 실시되고 있는 전기 영동법에서는 높은 분리능으로 분리할 수 있는 한편, 자동화가 곤란하고 재현성이나 정량성의 확보가 어렵다는 문제가 있었다.
그래서, 최근 액체 크로마토그래프와 질량 분석계, 데이터 해석 시스템을 결합하여 시료의 분리로부터 단백질의 동정에 이르는 과정을 일관하여 자동적으로 실시하는 대규모 단백질 동정 시스템이 개발되고 있다.
또한, 정상 상태와 질병 상태 사이에서의, 세포 단백질의 양의 변화나 발생 중인 조직, 병든 조직, 또는 유전적으로 변이된 조직에서 발현하는 단백질의 양을 확인하려는 수요도 높아지고 있다. 즉, 세포 내의 단백질의 동정 뿐만 아니라, 단백질의 양이라는 정량 정보도 동시에 요구되고 있다.
이 때문에, ICATTM(등록상표) 시약을 사용한 시료간의 정량비교가 널리 행해지고 있다(예를 들어, 일본 공개특허공보 2003-107066호 참조). 그러나, 상기 ICATTM(등록상표)법에서는 전처리 조작이 번잡하다는 문제가 있었다.
본 발명은 상기 과제를 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 단백질의 동정 및 그 정량 정보를 보다 간단한 처리로 수득할 수 있는 단백질 분석 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명의 단백질 해석 방법은 질량 분석계를 사용하여 2종의 단백질 함유 시료를 대비하여, 각각의 시료에 포함되는 단백질의 동정 및 각각의 시료에 포함되는 동종의 단백질의 양과 비를 해석하는 단백질 해석 방법에 있어서, 상기 2종의 단백질 함유 시료를 각각 제한 효소에 의해 특정 아미노산 부위를 절단하여 펩티드 사슬 함유 시료로 만드는 공정, 동위체에 따라 다른 질량차를 갖는 표지 화합물을 상기 각각의 펩티드 사슬 함유 시료에 포함시켜 펩티드 사슬을 수식(修飾)하고, 각각의 펩티드 사슬 함유 시료에 포함되는 동종의 펩티드 사슬에 질량차를 부여하는 공정, 각 동위체 표지 펩티드 사슬 함유 시료를 혼합하여, 상기 혼합 시료를 각 펩티드 사슬마다 분별 정량하여 MS 스펙트럼을 측정하고 동위체 표지에 따라 질량차가 부여된 동종의 펩티드 사슬에 대한 함량비를 구하는 공정, 상기 MS 스펙트럼을 참조하여 각 펩티드 사슬로부터 아미노산 배열을 특정하기 위한 펩티드 사슬을 선택하고 상기 펩티드 사슬로부터 생성되는 생성 이온의 질량 스펙트럼에 의해 상기 펩티드 사슬의 아미노산 배열의 특성을 정하는 공정, 상기 펩티드 사슬의 아미노산 배열에 기초하여 이미 알려진 DNA 배열에서 대응하는 단백질을 특정하는 공정, 및 상기 동위체 수식 펩티드 사슬의 질량차에 의한 분별 정량치에 기초하여 상기 특정한 단백질의 상기 각 단백질 함유 시료에 포함되는 함량의 비를 구하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 단백질 해석 방법에서 상기 표지 화합물로서 O-메틸-이소우레아와 이에 안정한 동위체를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 단백질 해석 방법에 있어서, 상기 동종의 펩티드 사슬의 함량비를 구하는 공정에서, 상기 수식 화합물에 따라 질량차가 부여된 동종의 펩티드 사슬의 2개의 MS 스펙트럼의 피크를 비교할 때, 천연에 존재하는 동위체 원소에 의한 펩티드 사슬의 동위체 피크와 중복 부분을 삭제하여 정량비를 보정하는 것이 바람직하다.
본 발명에 관한 단백질 분석 방법에 의하면 간단한 처리로 단백질 정량 정보를 수득하는 것이 가능해진다.
도 1은 본 발명에 관한 실시형태의 단백질 분석 방법의 설명도이고,
도 2는 데이터 처리의 설명도이다.
이하 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시형태를 설명한다. 도 1은 본 실시형태의 단백질 해석 방법의 흐름을 도시한 설명도이다. 본 실시형태의 단백질 해석 방법은 탠덤(tandem)형 질량 분석계를 사용하여 2종의 단백질 함유 시료를 대비하고, 각각의 시료에 포함되는 단백질의 동정 및 각각의 시료에 포함되는 동종의 단백질의 양비를 해석하는 것이다.
2종의 단백질 시료로서는 예를 들어 동종의 생체 조직에 대해서 하나는 정상 상태의 샘플로부터 채취한 것, 또 한쪽은 질병 상태의 샘플로부터 채취한 것 등이 상정된다. 그리고, 그들의 단백질 함유 시료에 포함되는 단백질 성분의 발현량을 정량 비교한다.
본 실시형태의 단백질 해석 방법의 공정은 시료의 전처리 공정(도 1에서의 혼합 시료를 준비하는 단계까지)과 탠덤형 질량 분석계에 의해 수득한 데이터의 해석 공정(도 1에서는 MS 스펙트럼에 의한 함량비 결정, MS/MS 스펙트럼 및 데이터베이스에 의한 단백질의 동정(同定) 부분)으로 크게 나누어진다.
시료의 전처리 공정에서는 비교하는 2종의 단백질 함유 시료의 처리를 실시한다. 여기에서의 주된 목적은 각각의 시료에 대해서, 동위체에 따라 다른 질량수를 갖는 표지 화합물을 표지하고, 질량차에 의해 어떤 시료에서 유래하는 단백질인지 표지를 붙이는 데에 있다. 또한, 질량 분석계에 의해 단백질의 1차 구조를 결정하기 위해서는 단백질 성분을 보다 짧은 펩티드 사슬로 절단할 필요가 있다.
그래서 우선 처음으로, 2종의 단백질 함유 시료(도 1에서는 각각 시료 A 및 시료 B라고 함)에 대해서, 시료 중의 단백질 성분을 제한 효소로 특정의 아미노산 부위를 절단하여 펩티드 사슬로 만들고 본래의 시료로부터 펩티드 사슬 함유 시료 A 및 시료 B를 수득한다. 여기에서, 펩티드 사슬이라는 것은 아미노산의 갯수가 수개부터 수십개인 것을 가리키는 것으로 한다. 즉, 질량 분석계에 의해 분석 가능한 길이의 것을 가리킨다.
다음에 각각의 펩티드 사슬 함유 시료에 질량차를 갖는 표지 화합물을 수식한다. 상기 표지 화합물로서 그것을 구성하는 원소의 일부를 동위체 원소로 바꿈으로써 질량수가 다른 2개의 것을 준비한다. 도 1에서는 펩티드 사슬 함유 시료 A에 대해서 가벼운 표지 화합물, 동일하게 시료 B에 대해서 무거운 표지 화합물을 수식한 경우를 나타내고 있다.
이와 같이 하여 동위체가 표지된 각각의 펩티드 사슬 함유 시료를 혼합한다.
다음에 이렇게 하여 수득한 혼합 시료를 액체 크로마토그래프 및 탠덤형 질량 분석계에 의해 분석을 실시한다. 본 실시형태에서는 우선 액체 크로마토그래프에 의해 각 펩티드 사슬마다 분리한다.
그리고, 각 펩티드 사슬은 탠덤형 질량 분석계로 보내고, 제 1 질량 분석계에서 MS 스펙트럼, 제 2 질량 분석계에서 MS/MS 스펙트럼을 수득한다. 이렇게 하여 수득된 데이터의 해석은 이하와 같이 하여 실시된다.
각 펩티드 사슬은 시료 A 유래의 것과 시료 B 유래의 것이 있고, 동위체 표지에 의해 일정한 질량차가 부여되어 있다. 이 때문에, 상기 MS 스펙트럼 데이터에서는 시료 A 유래의 펩티드 사슬의 피크와 시료 B 유래의 펩티드 사슬의 피크가 분리되어 나타난다. 이들의 각 피크 높이(또한, 피크 면적 등)를 비교함으로써, 상기 펩티드 사슬의 시료 A에서의 함유량과 시료 B에서의 함유량의 비를 구할 수 있다.
다음에 상기 펩티드 사슬이 어떤 단백질의 일부였는지를 특정하기 위해, 상기 각 펩티드 사슬의 MS/MS 스펙트럼 데이터를 해석한다. 이 때, 상기 MS 스펙트럼을 참조하여, 측정한 각 펩티드 사슬 중, 어떤 펩티드 사슬에 대해서 단백질의 특정을 실시할지를 선택할 수 있다.
선택된 펩티드 사슬에 대해서, 주지의 해석 기술에 의해 MS/MS 스펙트럼 데이터로부터 각 펩티드 사슬의 아미노산 배열을 결정할 수 있다. 즉, 펩티드 사슬의 아미노산 배열에 기초하여 기지 DAN 배열을 기억한 공지된 데이터베이스에 의해, 그 펩티드 사슬에 대응하는 유전자 및 단백질을 특정할 수 있다.
상기에서 펩티드 사슬의 시료 A에서의 함유량과 시료 B에서의 함유량의 비는 확인되었으므로, 그 펩티드 사슬에 대응한 단백질에 대해서, 시료 A에서의 함유량과 시료 B에서의 함유량의 비를 확인할 수 있다.
이상이 본 실시형태의 개략적인 설명이다. 이하에, 각 공정에 대해서 상세하게 설명한다.
우선, 최초의 공정에서는 2종류의 단백질 함유 시료 A 및 시료 B에 대하여, 각각의 시료를 제한 효소로 특정 아미노산 부위를 절단하여, 펩티드 사슬로 단편화한다. 상기 제한 효소로서는 Lys-C/P를 사용하여 리신의 C 말단측에서 절단하면 좋다.
다음 공정에서는 상기와 같이 펩티드로 단편화된 시료에 대하여, 질량차를 갖는 표지 화합물을 수식함으로써 시료 A 및 시료 B에 각각 포함되는 펩티드 사슬에 질량차를 부여한다.
표지 화합물로서 하기 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 O-메틸-이소우레아(O-methyle-isourea)를 사용한다.
Figure 112006050346480-PCT00001
Figure 112006050346480-PCT00002
(상기 화학식 1 및 화학식 2에 있어서, C 및 N의 좌측 상단의 숫자는 질량수를 표시함)
즉, 무거운 표지 화합물(화학식 2)은 가벼운 표지 화합물(화학식 1)의 질량수 14의 질소원자 N 및 메틸기 이외의 질량수 12의 탄소원자 C를, 각각 질량수 15의 질소원자 N, 질량수 14의 탄소원자 C라는 안정한 동위체로 치환하고 있다. 이 때문에, 무거운 표지 화합물(질량수 45)과 가벼운 표지 화합물(질량수 42)에서는 3Da의 질량차를 갖는 것이 된다.
상기의 O-메틸-이소우레아는 하기의 반응에서 리진 잔기 부분과 결합된다.
Figure 112006050346480-PCT00003
따라서, 가벼운 시약으로 시료 A에 포함되는 펩티드 사슬 및 무거운 시약으로 시료 B에 포함되는 펩티드 사슬을 각각 동위체 수식한다. 그 후, 이들의 동위체 표지를 한 시료 A 및 시료 B를 혼합한다.
다음에 상기의 혼합 시료를 액체 크로마토그래프(LC)에 의해 분리한다. 무거운 표지 화합물과 가벼운 표지 화합물에는 화학적 성질의 차이는 없는, 즉 동종의 펩티드 사슬이면 시료 A 유래의 것과 시료 B 유래의 것은 질량수 이외의 부분에는 차이가 없으므로, LC에 의한 분리에서는 동종의 시료 A 유래의 펩티드 사슬과 시료 B 유래의 펩티드 사슬은 동일한 피크로서 나타난다. 혼합 시료는 LC에 의한 분리 후 질량 분석계로 분석을 실시한다.
본 실시형태에서는 질량 분석계로서 사중극(四重極) 비행 시간형의 탠덤형 질량 분석계(MS/MS)를 사용하여, MS 스펙트럼 및 MS/MS 스펙트럼을 측정한다. 상기 장치의 구성으로서는 종래와 동일한 것을 사용할 수 있다. 또한, 이 이외에도 푸리에 변환 질량 분석계(FT-MS)도 사용 가능하다. LC에 의해 분리된 혼합 시료는 ESI(일렉트로 스프레이 이온화법) 등으로 펩티드 사슬을 이온화하여 제 1 질량 분석계로 보내어진다. 제 1 질량 분석계에서 상기 이온으로부터 특정의 전구 이온이 선택되고 제 2 질량 분석계로 보내어진다. 상기 전구 이온은 아르곤 가스 등을 조사함으로써 더욱 작은 생성 이온으로 단편화되어 제 2 질량 분석계에서 검출된다. 이와 같이 선택된 펩티드 이온에 대해서, 이를 단편화한 생성 이온의 질량 스펙트럼(MS/MS 스펙트럼)이 수득된다. 또한, 동시에 생성 이온으로 단편화되기 전의 펩티드 사슬에 대한 MS 스펙트럼 데이터도 수득된다.
이와 같이 하여 수득된 MS 스펙트럼 데이터 및 MS/MS 스펙트럼 데이터는 컴퓨터에 보존되고, 이하와 같은 데이터 처리에 의해 시료에 포함되어 있는 단백질이 동정되고, 또한 2개의 시료에 포함되어 있는 단백질의 상대 비도 구해진다.
우선, MS 스펙트럼 데이터로부터 각 펩티드 사슬에 대해서, 시료 A 유래의 것과 시료 B유래의 것의 양비를 구할 수 있다. 즉, MS 스펙트럼의 하나의 펩티드 사슬의 피크(시료 A 유래의 것)과 상기 피크와 3질량차 떨어진 장소에 나타나는 피크(시료 B 유래의 것)를 비교함으로써, 시료 A에 포함되어 있던 어느 펩티드 사슬의 양과 시료 B에 포함되어 있던 그 펩티드 사슬의 양의 상대 비가 구해지게 된다.
단, 천연 원소의 대부분은 각 원소에 고유의 안정한 동위체가 존재한다. 이 때문에, 어떤 화합물의 분자량도 그 화합물을 구성하는 각 원소가 어떤 질량수의 동위체를 어느 정도 포함하고 있는지에 의해 몇 개의 피크가 존재하게 된다. 각각의 피크의 비는 화합물을 구성하는 원소의 동위체의 천연의 존재비로부터 구하는 것이 가능하다. 그래서, 상기와 같이 하여 동정한 단백질의 시료 A와 시료 B의 정량비를 비교할 때에는 상기 천연에 존재하는 동위체 피크 만큼을 고려에 넣고, 천연의 안정한 동위체에 의한 피크 부분을 삭제할 필요가 있다.
도 2가 이의 설명도이다. 도 2의 (a)에 도시한 바와 같이 MS 스펙트럼에서 하나의 펩티드의 피크(210a)에는 각각 천연에 존재하는 동위체의 피크(210b, 210c, 210d, 210e, …)가 부수된다. 도 2의 (a)에서는 상기 피크 중 가장 질량수가 낮은 것을 실선으로 다른 것을 점선으로 표시했다.
한편, 2종류의 단백질 시료 A 및 시료 B를 각각 다른 질량수를 갖는 표지 화합물 O-메틸-이소우레아로 수식했으므로, 혼합 시료의 MS 스펙트럼에서 가벼운 표지 화합물로 동위체 표지 펩티드의 피크(210a)에 대응하여, 질량수 3 만큼 떨어진 위치에 무거운 표지 화합물로 동위체 표지 펩티드의 피크(220)가 나타나게 된다. 이 때문에 가벼운 표지 화합물로 라벨화한 펩티드 사슬에 부수되는 천연에 존재하는 동위체의 피크 중 하나[도 2의 (b)의 "210d"]와 무거운 표지 화합물로 라벨화한 펩티드의 피크(220)가 무거워진다. 그래서, "220"의 피크로부터 "210d"의 피크를 삭제해 수득된 피크 높이(240)와 "210a"의 피크 높이(230)를 비교함으로써 각각의 피크에서 표시된 펩티드 사슬의 양비가 결정된다.
여기에서는 피크 중 가장 질량수가 작은 피크를 기준으로 하여 사용한 경우를 나타냈지만, 다른 부분, 예를 들어 피크 높이가 가장 높은 피크를 기준으로 하여 사용해도 좋다. 또한, 물론 피크 면적에 의해 해석해도 좋다.
다음에, MS/MS 스펙트럼으로부터는 각 펩티드 사슬의 아미노산 배열이 결정된다. 여기에서, 어떤 펩티드 사슬에 대해서 아미노산 배열의 특정을 실시할지는 상기 MS 스펙트럼에 의한 정보를 기초로 하여 선택할 수 있다. 이 선택은 해석의 목적에 따라 실시하면 좋다. 예를 들어, 시료 A와 시료 B 사이에서 다른 부분만을 해석하고 싶은 경우, 시료 A와 시료 B에서 함유량이 다른 펩티트 사슬에 대해서만 해석을 실시하면 좋다. 물론, 동량에 대해서 해석을 실시해도 또한 모든 펩티드 사슬에 대해서 해석을 실시해도 좋다. 이와 같이, 어떤 펩티드를 해석할지를 선택할 수 있으므로 효율 좋게 시료의 해석을 실시할 수 있다.
이상과 같이 하여 펩티드 사슬의 아미노산 배열이 결정되면, 기지(旣知)의 DNA 배열을 기록한 공지된 데이터베이스 검색 소프트웨어[예를 들어 Mascot(Matrix Science사 제조)등]에 의해 그 아미노산 배열과 기지 단백질의 유전자 정보가 비교되고, 목적으로 하는 펩티드 사슬에 대응하는 단백질을 동정할 수 있다.
각 펩티드 사슬에 대한 시료 A 및 시료 B에서의 함유량의 비는 상기와 같이 MS 스펙트럼으로부터 확인할 수 있으므로, 단백질 자신의 함유량의 비도 그 단백질에 대응하는 펩티드 사슬의 함유량의 비로서 확인할 수 있다.
이와 같이 본 실시형태의 단백질 해석 방법에 의하면 MS/MS 스펙트럼으로부터 양쪽의 시료 A 및 시료 B 중에 포함되어 있던 단백질을 동정함과 동시에 MS 스펙트럼으로부터 이의 상대량을 결정할 수 있다.

Claims (3)

  1. 단백질 해석 방법으로서,
    질량 분석계를 이용하여 2종의 단백질 함유 시료를 대비함으로써 각각의 시료에 포함되는 단백질의 동정(同定) 및 각각의 시료에 포함되는 동종의 단백질 양의 비를 해석하며,
    하기 공정 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 해석 방법:
    (a) 상기 2종의 단백질 함유 시료를 각각 제한 효소로 특정 아미노산 부위를 절단하여 펩티드 사슬 함유 시료를 준비하는 공정;
    (b) 동위체에 따라 다른 질량차를 갖는 표지 화합물을 상기 각각의 펩티드 사슬 함유 시료에 포함된 펩티드 사슬에 수식(修飾)하여 각각의 펩티드 사슬 함유 시료에 포함된 동종의 펩티드 사슬에 질량차를 부여하는 공정;
    (c) 각 동위체로 표지한 펩티드 사슬 함유 시료를 혼합하고, 상기 혼합 시료를 각 펩티드 사슬마다 분별 정량하여 MS 스펙트럼을 측정하여, 동위체 표지에 의해 질량차가 부여된 동종의 펩티드 사슬에 대해서 함량비를 구하는 공정;
    (d) 상기 MS 스펙트럼을 참조하여 각 펩티드 사슬로부터 아미노산 배열을 특정할 펩티드 사슬을 선택하고, 상기 펩티드 사슬로부터 생성된 생성 이온의 질량 스펙트럼에 의해서 상기 펩티드 사슬의 아미노산 배열의 특정을 확인하는 공정,
    (e) 상기 펩티드 사슬의 아미노산 배열에 기초하여, 기지(旣知)의 DNA 배열 과 대응하여 단백질을 특정하는 공정; 및
    (f) 상기 동위체로 수식한 펩티드 사슬의 질량차에 의한 분별 정량값에 기초하여, 상기 특정한 단백질의 상기 각 단백질 함유 시료에 포함된 함량의 비를 구하는 공정.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 표지 화합물로서 O-메틸-이소우레아 및 이에 안정한 동위체를 이용하는 것을 특징으로 하는 단백질 해석 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 동종의 펩티드 사슬의 함량비를 구하는 공정에서, 상기 수식 화합물에 의해 질량차가 부여된 동종의 펩티드 사슬의 2개의 MS 스펙트럼의 피크를 비교할 때 천연에 존재하는 동위체 원소에 의한 펩티드 사슬의 동위체 피크와의 중복 부분을 삭제하여 정량비의 보정을 실시하는 것을 특징으로 하는 단백질 해석 방법.
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