DE112011102604T5

DE112011102604T5 - Verfahren zur Analyse einer Stoffstruktur

Info

Publication number: DE112011102604T5
Application number: DE112011102604T
Authority: DE
Inventors: Osamu Kanie
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2010-09-07
Filing date: 2011-09-07
Publication date: 2013-05-23
Also published as: JP2012058002A; JP5441064B2; US8575543B2; WO2012033111A1; US20130153760A1

Abstract

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Analyse einer Struktur eines interessierenden Stoffs unter Verwendung von Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie (TQ-MS), wobei das Verfahren das Sammeln von MSn-Informationen von aus der TQ-MS-Messung erhaltenen Daten gestattet. Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Analyse einer Struktur eines interessierenden Stoffs bereitgestellt, umfassend: (a) Durchführen einer Triple-Quadrupol-Massenspektrometriemessung in Bezug auf den interessierenden Stoff bei gleichzeitigem Variieren eines CID-Energiewerts; (b) bei gegebenen CID-Energiewerten Berechnen prozentualer Vorläuferionengehalte gegenüber einem Gesamtionengehalt sowie prozentualer Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt; (c) Extrahieren von Werten für die prozentualen Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt, wobei es sich bei den Werten um Werte für die prozentualen Produktionengehalte bei den jeweiligen CID-Energiewerten handelt, die entsprechende, in Schritt (b) berechnete Werte für prozentuale Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt ergeben; (d) Berechnen von Summen für alle Kombinationen der in Schritt (c) extrahierten Werte für die prozentualen Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt; und (e) aus Funktionen, worin die Werte für prozentuale Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt als x und die berechneten Werte der Summen von Kombinationen als y angegeben sind, Auswählen solcher, die sich an eine Gerade annähern lassen, und Analysieren der Struktur des interessierenden Stoffs basierend auf m/z-Werten von Produktionen, die jeweils die ausgewählten Funktionen ergeben.

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer Struktur eines interessierenden Stoffs, wobei eine Triple-Quadrupol-Massenspektrometriemessung in Bezug auf den interessierenden Stoff sowie ein vorbestimmter Dekonvolutionsprozess in Bezug auf die erhaltenen Daten zur Analyse der Struktur des interessierenden Stoffs durchgeführt werden.
STAND DER TECHNIK
Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie (TQ-MS) wurde häufig in Kombination mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) verbunden mit dem Verfahren der Elektrosprayionisation (ESI) eingesetzt (siehe Siuzdak, G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 11290–11297; Yu, X., Cui, D., Davis, M. R. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1999, 10, 175–183; Gygi, S. P., Aebersold, R. Chem. Biol. 2000, 4, 489–494; Villas-Boas, S. G., Mas, S., Akesson, M., Smedsgaard, J., Nielsen, J. Mass Spectrom. Rev. 2005, 24, 613–646; Korfmacher, W. A. Drug Discovery Today 2005, 10, 1357–1367). Ein derartiges Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie(LC-MS)-System lässt sich zur Gewinnung von Strukturinformationen verwenden, da damit die Analyse der Fragmentierung eines Ions unter Bedingungen der kollisionsinduzierten Dissoziation (CID) erleichtert wird. Weiterhin kann man anhand einer Retentionszeit einer gegebenen Spezies auf der Chromatographiesäule die Affinität der Spezies zu einer in der HPLC eingesetzten stationären Phase bestimmen und so Informationen über die Struktur sammeln. Allerdings weist diese Technik den Nachteil auf, dass die Technik nur MS/MS-Informationen liefert. Darüber hinaus gestattet die Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometrie (QIT-MS) eine mehrstufige MS/MS-Analyse, die detaillierte Strukturinformationen liefert (siehe Gygi, S. P., Aebersold, R. Chem. Biol. 2000, 4, 489–494; Villas-Boas, S. G., Mas, S., Akesson, M., Smedsgaard, J., Nielsen, J. Mass Spectrom. Rev. 2005, 24, 613–646; March, R. E. Mass Spectrom. Rev. 2009, 28, 961–989; Jonscher 1, K. R., Yates III, J. R. Anal. Biochem. 1997, 244, 1–15; March R. E. Int. J. Mass Spectrom. 2000, 200, 285–312; March R. E. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1998, 12, 1543–1554). Allerdings ist es in der Praxis schwierig, mehrstufige MS/MS-Experimente während der Elutionszeit einer Verbindung bei der HPLC-Analyse durchzuführen. Dementsprechend ist es zur Gewinnung neuer Einblicke in Strukturinformationen innerhalb des für die HPLC-Analyse benötigten Zeitraums wichtig, einen Nachteil der TQ-MS zu überwinden, der keine sequenzielle Massenspektralanalyse (MSⁿ) zulässt.
In der Vergangenheit wurde energieaufgelöste Massenspektrometrie (ERMS) mit QIT-MS geprüft, um ein Verfahren zur Aufklärung von Strukturen komplexer Glykane und von Konfigurationen glykosidischer Verknüpfungen zu entwickeln. In den meisten Fällen ergeben sich für natriumhaltige Ionen verschiedener Oligonukleotide einfache ERMS-Spektren, wobei eine Reihe von Spitzen einem Vorläuferion sowie mehreren Produktionen entspricht. Diese Spitzen werden analysiert und unter Verwendung sigmoidaler Boltzmann-Gleichungen angenähert (siehe Kurimoto, A., Daikoku, S., Mutsuga, S., Kanie, O. Anal. Chem. 2006, 78, 3461–3466; Daikoku, S., Ako, T., Kato, R., Ohtsuka, I., Kanie, O. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2007, 18, 1873–1879; Shioiri, Y., Suzuki, K., Kanie, O. J. Mass Spectrom. 2008, 43, 1132–1139; Shioiri, Y., Kurimoto, A., Ako, T., Daikoku, S., Ohtake, A., Ishida, H., Kiso, M., Suzuki, K., Kanie, O. Anal. Chem. 2009, 81, 139–145). In seltenen Fällen können komplexere ERMS-Spektren erhalten werden. Im Verlauf der Aufklärung von Gasphasenreaktionen von Glykanen wurde gezeigt, dass dabei ein komplexes Spektrum erhalten wurde und dass das MSⁿ-Spektrum einige Informationen hinsichtlich Fragmentierungsreaktionen eines Produktions (Informationen zu MSⁿ⁺¹) enthielt, die normalerweise nicht bei einem CID-Prozess von QIT-MS erhalten wurden. Derartige Informationen werden allerdings als weniger wichtig für eine QIT-MS-Analyse angesehen, da ein QIT-MS-Gerät zur Durchführung von MSⁿ-Experimenten eingesetzt werden kann. Im Gegensatz dazu sind die obengenannten MSⁿ⁺¹-Informationen sehr wichtig für eine TQ-MS-Analyse, da sich ein TQ-MS-Gerät nicht für MSⁿ-Experimente einsetzen lässt. Zudem wären solche MSⁿ⁺¹-Informationen auch bei Anwendung des TQ-MS-Verfahrens in Kombination mit HPLC zur Strukturaufklärung von Nutzen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Analyse einer Struktur eines interessierenden Stoffs unter Verwendung von Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie (TQ-MS), dem Verfahren, das das Sammeln von MSⁿ-Informationen von aus der TQ-MS-Messung erhaltenen Daten gestattet.
Vom Erfinder waren zur Lösung des vorstehend genannten Problems umfangreiche Untersuchungen durchgeführt worden, in deren Folge entdeckt wurde, dass MSⁿ-Informationen gesammelt werden können, indem man Verhältnisse von Produktionengehalten zum Gesamtionengehalt in Bezug auf ein bei einer TQ-MS-Messung erhaltenes ERMS-Spektrum berechnet und eine lineare Regressionsanalyse an Summen beliebiger willkürlicher Kombinationen der Verhältnisse von Produktionen durchführt, wodurch MSⁿ-Informationen gesammelt werden können. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Entdeckung fertiggestellt.
Insbesondere betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung Folgendes.

[1]. Verfahren zur Analyse einer Struktur eines interessierenden Stoffs, enthaltend: (a) Durchführen einer Triple-Quadrupol-Massenspektrometriemessung in Bezug auf den interessierenden Stoff bei gleichzeitigem Variieren eines CID-Energiewerts; (b) bei gegebenen CID-Energiewerten Berechnen prozentualer Vorläuferionengehalte gegenüber einem Gesamtionengehalt sowie prozentualer Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt; (c) Extrahieren von Werten für die prozentualen Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt, wobei es sich bei den Werten um Werte für die prozentualen Produktionengehalte bei den jeweiligen CID-Energiewerten handelt, die entsprechende, in Schritt (b) berechnete Werte für prozentuale Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt ergeben; (d) Berechnen von Summen für alle Kombinationen der in Schritt (c) extrahierten Werte für die prozentualen Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt; und (e) aus Funktionen, worin die Werte für prozentuale Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt als x und die berechneten Werte der Summen von Kombinationen als y angegeben sind, Auswählen solcher, die sich an eine Gerade annähern lassen, und Analysieren der Struktur des interessierenden Stoffs basierend auf m/z-Werten von Produktionen, die jeweils die ausgewählten Funktionen ergeben.
[2] Verfahren nach [1], wobei in Schritt (b) die CID-Energiewerte einer X-Achse und alle Prozentwerte einer Y-Achse zugewiesen werden und die prozentualen Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt und die prozentualen Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt darin aufgetragen werden, so dass ein Graph erzeugt wird.
[3] Verfahren nach [1] oder [2], wobei in Schritt (c) die prozentualen Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt in Y-Achsenrichtung aufgetragen werden, während die prozentualen Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt einer X-Achse zugewiesen werden, so dass ein Graph erzeugt wird.
[4] Verfahren nach einem der Punkte [1] bis [3], wobei in Schritt (d) die berechneten Summenwerte für Kombinationen in Y-Achsenrichtung aufgetragen werden, während die prozentualen Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt einer X-Achse zugewiesen werden, so dass ein Graph erzeugt wird.
[5] Verfahren nach einem der Punkte [1] bis [4], wobei die Geradenannäherung in Schritt (e) unter Anwendung der Formel (4) erfolgt:
wobei Syx für ein Residuum einer linearen Regressionskurve steht; x_j und y_j für Koordinaten der Daten j stehen; a_j und b_j für Koordinaten der Regressionskurve stehen; und n – 2 einen Freiheitsgrad bedeutet.
[6] Verfahren nach einem der Punkte [1] bis [5], wobei MSⁿ-Informationen in Schritt (e) gesammelt werden.
[7] Verfahren nach einem der Punkte [1] bis [6], wobei es sich bei dem interessierenden Stoff um eine Zuckerkette handelt.

Die vorliegende Erfindung gestattet das Sammeln von MSⁿ-Informationen, das bei herkömmlichen TQ-MS-Messungen für unmöglich gehalten wurde, und ermöglicht so eine detailliertere Strukturanalyse eines interessierenden Stoffs.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein typisches für ein Ion X mit QIT-MS erhaltenes Dissoziationsprofil. 1a zeigt ein CID-Spektrum, mit dem gezeigt wird, dass ein Vorläuferion X Fragmentionen (f₁–f₄) produziert. 1b zeigt ein für die Dissoziation eines Ions X beobachtetes ERMS-Spektrum, bei dem sich die Daten normalerweise mit sigmoidalen Boltzmann-Gleichungen analysieren lassen. 1c zeigt eine nochmalige graphische Auftragung (Verhältnisdiagramm) der ERMS aus 1b, wobei das Vorläuferion X der x-Achse und die einzelnen Produktionen der y-Achse zugewiesen sind.
2a zeigt ein ERMS-Spektrum eines natriumhaltigen Methylesterions eines Gangliosids GD1a (1). 2b zeigt ein Verhältnisdiagramm der ERMS aus 1a. 2c zeigt die Fragmentierung des Vorläuferions (m/z 1916,1). Es wurden Dissoziationen beobachtet, die einigen Brüchen mehrerer glykosidischer Verknüpfungen entsprechen, wobei als häufigstes Ion ein y-Ion mit einer N-Acetylgalactosaminyl-Spaltung vorlag.
3 zeigt eine ERMS der Dissoziation eines Ions X, wobei eines der Produktionen (f₁) weiter zu f₃ und f₄ dissoziiert. 3a zeigt ein Dissoziationsschema. 3b zeigt ein ERMS-Spektrum, bei dem sich einige der Kurven der Produktionen nicht durch sigmoidale Boltzmann-Gleichungen annähern lassen. 3c zeigt ein ERMS-Verhältnisdiagramm, bei dem die Summierung einer Reihe von Kurven eine lineare Kurve ergibt.
4 zeigt ein mit QIT-MS erhaltenes ERMS-Spektrum von [2 + Na]⁺. 4a zeigt ein ERMS-Spektrum. 4b zeigt ein Verhältnisdiagramm der ERMS aus 1a. Geschlossene Kreise zeigen Summen aller Produktionen. Offene Quadrate zeigen Summen von Ionen mit m/z 466,2 und m/z 628,3. 4c zeigt Fragmentierung des Vorläuferions (m/z 646,3). Es wurden einige Dissoziationen beobachtet, die der Galactosylspaltung und der an PA und N-Acetylgruppe erfolgten Dehydratisierung entsprechen.
5 zeigt ein mit TQ-MS erhaltenes ERMS-Spektrum von [2 + Na]⁺. 5a zeigt ein ERMS-Spektrum. 5b zeigt ein Verhältnisdiagramm der ERMS aus 5a. 5c zeigt willkürliche Summierung von Intensitäten der einzelnen Produktionen im Verhältnisdiagramm. 5d zeigt Fragmentierung des Vorläuferions (m/z 646,3). Es wurden einige Dissoziationen beobachtet, die der Galactosylspaltung (f₂) und Dehydratisierung, die an PA und N-Acetylgruppe ablief (f₁ und f₃), entsprechen. Darüber hinaus wurden weitere Fragmente wie etwa f₄–f₆ beobachtet, die bei QIT-MS nicht beobachtet wurden.
6 zeigt einen Dissoziationsweg der mit TQ-MS erhaltenen natriumhaltigen Verbindung 2.
AUSFÜHRUNGSFORM ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Das Verfahren zur Analyse einer Struktur eines Stoffs gemäß der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren beinhaltet: (a) Durchführen einer TQ-MS-Messung in Bezug auf den interessierenden Stoff bei gleichzeitigem Variieren eines CID-Energiewerts; (b) bei gegebenen CID-Energiewerten Berechnen prozentualer Vorläuferionengehalte gegenüber einem Gesamtionengehalt sowie prozentualer Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt; (c) Extrahieren von Werten für die prozentualen Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt, wobei es sich bei den Werten um Werte für die prozentualen Produktionengehalte bei den jeweiligen CID-Energiewerten handelt, die entsprechende, in Schritt (b) berechnete Werte für prozentuale Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt ergeben; (d) Berechnen von Summen für alle Kombinationen der in Schritt (c) extrahierten Werte für die prozentualen Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt; und (e) aus Funktionen, worin die Werte für prozentuale Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt als x und die berechneten Werte der Summen von Kombinationen als y angegeben sind, Auswählen solcher, die sich an eine Gerade annähern lassen, und Analysieren der Struktur des interessierenden Stoffs basierend auf m/z-Werten von Produktionen, die jeweils die ausgewählten Funktionen ergeben.
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich „CID-Energie(-Energien)” allgemein auf eine Energie, die zur Auslösung von kollisionsinduzierter Dissoziation (CID) angewandt wird, und insbesondere auf eine Spannung eines alternierenden elektrischen Felds einer bestimmten Frequenz für vibrierende Ionen. „Vorläuferion(en)” bezieht sich auf Ion(en), die als Vorläufer einem interessierenden Stoff entsprechen, und „Produktion(en)” bezieht sich auf Fragmention(en), jeweils mit m/z-Wert(en), die durch Ausführen einer TQ-MS-Messung an einem Vorläuferion erhalten werden. Außerdem zeigt „m/z” ein Verhältnis von Massezahl (m) und Ladung (z). Darüber hinaus bezieht sich „MSⁿ-Informationen” auf Informationen über eine Struktur eines Vorläuferions, die aus m/z-Werten, Signalintensitäten, CID-Energien usw. von durch mehrstufigen Zerfall des Vorläuferions erzeugten Produktionen erhalten werden.
Bei der vorliegenden Erfindung wird in Schritt (a) eine TQ-MS-Messung bei gleichzeitigem Variieren eines CID-Energiewerts durchgeführt, bis Produktionen mit spezifischen m/z-Werten von einem Vorläuferion erzeugt werden, das einem interessierenden Stoff entspricht. Vorzugsweise wird die TQ-MS-Messung bei gleichzeitigem Variieren eines CID-Energiewerts durchgeführt, bis die Intensität des Vorläuferions etwa gleich „0” (null) wird.
Der interessierende Stoff, der der erfindungsgemäßen Strukturanalyse unterzogen wird, unterliegt keiner besonderen Beschränkung, solange er einer TQ-MS-Messung unterzogen werden kann. Allerdings ist bevorzugt, dass es sich bei dem interessierenden Stoff um eine Zuckerkette handelt. Die Zuckerkette kann aus biologischen Geweben, Zellen oder dergleichen gewonnen oder von einer Zuckerkette erhalten werden, die an ein synthetisiertes Protein bindet. Weiterhin lassen sich auch solche, die durch saure Hydrolyse oder enzymatischen Abbau davon erhalten werden, oder solche, die durch Trennen und Aufreinigen davon mittels HPLC oder dergleichen erhalten werden, einsetzen. Darüber hinaus können auch chemisch synthetisierte Zuckerketten eingesetzt werden.
Als nächstes werden in Schritt (b) bei gegebenen Werten für die variierte CID-Energie prozentuale Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt sowie prozentuale Produktionengehalte spezifischer m/z-Werte gegenüber dem Gesamtionengehalt berechnet. Insbesondere werden bei jeweiligen CID-Energiewerten basierend auf in Schritt (a) erhaltenen Daten der TQ-MS-Messung prozentuale Vorläuferionenintensitäten gegenüber der Gesamtionenintensität sowie prozentuale Produktionenintensitäten spezifischer m/z-Werte gegenüber der Gesamtionenintensität berechnet. Das heißt, dass an einem Punkt, an dem die TQ-MS-Messung durch Anwenden von CID-Energie darauf gestartet wird, der Vorläuferionengehalt dem Gesamtionengehalt entspricht, und der Prozentwert davon gleich 100% ist.
In Schritt (b) können die CID-Energien einer X-Achse und alle Prozentwerte einer Y-Achse zugewiesen werden, und die vorstehend erhaltenen prozentualen Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt und prozentualen Produktionengehalte spezifischer m/z-Werte gegenüber dem Gesamtionengehalt können aufgetragen werden, so dass ein Graph erzeugt wird, und ein ERMS-Spektrum in Beziehung zu einem Vorläuferion und jeweils m/z-Werte aufweisenden Produktionen kann aufgenommen werden. In der vorliegenden Beschreibung wird der Graph in 5a im Zusammenhang mit den unten beschriebenen Beispielen als ein Beispiel für ein solches ERMS-Spektrum gezeigt. Ein ERMS-Spektrum enthält mehrere Datenpunkte, die jeweils zwei Messgrößen aufweisen, CID-Energien und die obigen Ionengehalte.
Anschließend werden in Schritt (c) Werte für die prozentualen Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt extrahiert, wobei es sich bei den Werten um Werte für die prozentualen Produktionengehalte bei den jeweiligen CID-Energiewerten handelt, die die entsprechenden, in Schritt (b) berechneten Werte für die prozentualen Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt ergeben.
In Schritt (c) können die Prozentwerte für Vorläuferionen einer X-Achse zugewiesen werden, und die Prozentwerte für Produktionen werden einer Y-Achse zugewiesen, und die vorstehend extrahierten Werte für die prozentualen Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt können darauf aufgetragen werden, so dass ein Graph erzeugt wird. In der vorliegenden Beschreibung wird der Graph in 5b im Zusammenhang mit den unten beschriebenen Beispielen als ein Beispiel für einen solchen Graphen gezeigt.
Anschließend werden in Schritt (d) Summen aller Kombinationen der in Schritt (c) extrahierten Werte für die prozentualen Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt berechnet.
In Schritt (d) können die prozentualen Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt einer X-Achse zugewiesen und die oben berechneten Summenwerte von Kombinationen in Y-Achsenrichtung aufgetragen werden, so dass ein Graph erzeugt wird. In der vorliegenden Beschreibung wird der Graph in 5c im Zusammenhang mit den unten beschriebenen Beispielen als ein Beispiel für einen solchen Graphen gezeigt. Der auf diese Weise erhaltene Graph enthält mehrere Kurven, die jeweils Summen der auf die Kombinationen von Produktionen gerichteten Prozentwerte, jeweils mit spezifischem m/z-Wert, darstellen.
Anschließend werden in Schritt (e) aus Funktionen, worin die Werte für prozentuale Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt als x und die in Schritt (d) berechneten Werte der Summen von Kombinationen als y angegeben sind, solche ausgewählt, die sich an eine Gerade annähern lassen, und die Struktur des interessierenden Stoffs wird basierend auf m/z-Werten von Produktionen analysiert, die jeweils die ausgewählten Funktionen ergeben.
Wie oben beschrieben, können bei Erzeugen des Graphen in Schritt (d) unter mehreren in dem Graphen enthaltenen Funktionen solche ausgewählt werden, die sich an eine Gerade annähern lassen.
Was die Techniken zur Geradenannäherung angeht, so können verschiedene dem Fachmann bekannte Techniken eingesetzt werden. Beispielsweise lässt sich die Geradenannäherung in Schritt (d) unter Verwendung einer allgemein bekannten Technik der kleinsten Quadrate durchführen, nämlich mit der Formel (4) oder (5).
In Formel (4) steht Syx für ein Residuum einer linearen Regressionskurve; x_j und y_j repräsentieren Koordinaten von Daten j und a_j und b_j repräsentieren Koordinaten der Regressionskurve. n – 2 bedeutet einen Freiheitsgrad. Der Wert für Syx als Schwellenwert lässt sich angemessen nach bei der TQ-MS erhaltenen Daten bestimmen. Dabei ist die Verwendung eines Werts von 2 für Syx bevorzugt, wobei in diesem Fall alle Kurven, deren Werte für Syx 2 oder weniger betragen, durch Geradenannäherung ausgewählt werden.
In Formel (5), repräsentieren x_j und y_j Koordinaten von Daten j; und p bzw. q repräsentieren Mittelwerte von Koordinaten der Daten. Der Wert für R² als Schwellenwert lässt sich angemessen nach bei der TQ-MS erhaltenen Daten bestimmen. Dabei ist die Verwendung eines Werts von 0,90 für R² als Schwellenwert bevorzugt, wobei in diesem Fall alle Kurven, deren Werte für R² 0,90 oder mehr betragen, durch Geradenannäherung ausgewählt werden.
In der vorliegenden Erfindung wird die Struktur eines interessierenden Stoffs bezogen auf m/z-Werte usw. von Produktionen analysiert, die jeweils durch Ausführen einer Geradenannäherung ausgewählte Funktionen (Kurven in einem Graphen) ergeben. Insbesondere lässt sich durch Vergleichen von m/z-Werten usw. von Produktionen in Kombinationen, die Funktionen ergeben, die sich an eine Gerade annähern lassen, analysieren, welche Reihenfolge der Produktionen aus dem Vorläuferion erzeugt worden war. Angenommen zum Beispiel, dass es sich bei der in den folgenden Beispielen verwendeten Probe (Galili-Antigen-Trisaccharid) um eine Verbindung „X” handelt, deren Struktur unbekannt war, kann der nachfolgend beschriebene Dissoziationsweg bzw. können die nachfolgend beschriebenen Strukturinformationen erfindungsgemäß erhalten werden.
Im obigen Dissoziationsweg steht „Hex” für eine Hexose und „HexNAc” für ein N-Acetylhexosamin. Auf der Grundlage der Informationen aus dem obigen Dissoziationsweg wird deutlich, dass die Struktur von Verbindung „X” Hex-Hex-HexNAc ist.
Somit lassen sich gemäß der Analyse der vorliegenden Erfindung sogar bei einer TQ-MS-Messung MSⁿ-Informationen extrahieren.
Die vorliegende Erfindung wird mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben. Dabei ist die vorliegende Erfindung jedoch nicht besonders auf die folgenden Beispiele beschränkt.
BEISPIELE
<Material und Methoden>
(Material)
Gangliosid GD1a (1) wurde von der Firma Seikagaku Corp. (Tokio, Japan) bezogen und verestert. Galili-Antigen-Trisaccharid (2) wurde von der Firma Carbohydrate Synthesis Ltd. (Oxford, UK) bezogen und nach einer bereits beschriebenen Vorgehensweise pyridylaminiert (Hase, S., Ikenaka, T., Matsushima, Y, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978, 85, 257–263.).
(Geräte (MS) und Datensammlung)
Proben wurden mit Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometern, Esquire 3000 plus (Broker Daltonics GmbH, Bremen, Deutschland) und API Q-Star pulsar i (Applied Biosystems/SCIEX, ON, Kanada), ausgestattet mit einer Pico View ESI(Nanospray)-Quelle (New Objective, Inc. MA USA), im Positivmodus analysiert.
Die Experimente unter Verwendung des QSTAR Pulsar i Q-TOF MS-Geräts (kontrolliert durch Analyst QS) als TQ-MS-Messung wurden wie folgt durchgeführt. Die Datensammlung erfolgte im Positivmodus mit einem vollen Scan zwischen m/z 100 und 2000. Proben (1 pmol/μl) wurden in MeOH gelöst und in eine Ionenquelle mit einer beschichteten Nanospray-Spitze (New Objective, Inc. MA, USA) bei einer Fließgeschwindigkeit von 150 nl/min eingeführt. Eine typische Ionenspray-Spannung für Nanospray betrug 1600 V. Stickstoffgas wurde sowohl als Curtain-Gas (15 psi) als auch als Kollisionsgas verwendet. Die Messungen der kollisionsinduzierten Dissoziation (CID) wurden bei dem Geräteparameter CAD = 2, der 2,8 × 10^–3 Torr beim Kollisionsgasdruck entspricht, sowie mit Kollisionsenergien im Bereich von 23 eV bis 69 eV, je nach Ladungszustand und m/z-Wert eines Vorläuferions, durchgeführt. Das erste bzw. zweite Declustering-Potential, d. h. DP1 bzw. DP2, betrug 50 V bzw. 15 V und das Fokussierungspotential 250 V. MS/MS-Spektren wurden unter Verwendung der Auswahl des Vorläuferions mit dem Quadrupol in einem Modus niedriger Auflösung (geringer als die Nominalmassenauflösung) aufgenommen. Dementsprechend wurde der gesamte Isotopencluster des Elternmoleküls in die Kollisionszelle geschickt, wodurch man die Isotopencluster für alle Fragmente erhielt. Bei allen hier angegebenen Spektren handelte es sich um über 1,0 min gemittelte Scans.
Inzwischen wurden bereits ausführliche experimentelle Bedingungen für die massenspektrometrische Analyse unter Verwendung eines QIT-MS/MS mit Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometern, Esquire 3000 plus, mitgeteilt (Kanie, O., Kurimoto, A., Kanie, Y., Daikoku, S., Ohtake, A., Suzuki, K., Proc. Jpn. Acd. Ser. B 2009, 85, 204–215).
(Allgemeine Datenhandhabung)
Um Graphen für die ERMS zu erhalten, wurde die unten angegebene Gleichung (1) angewandt. Produzierte ein Ion ”I_p” eine Reihe von Produktionen, I₁, I₂, I₃, ... I_i, wurden die relativen Ionenströme für einzelne Ionen durch die Gleichung (1) definiert. Durch Anwendung der Gleichung (1) erhält man ERMS-Spektren der vorliegenden Erfindung (5a).
wobei ^relC einen Ionenstrom (%) eines bestimmten Ions unter beobachteten Ionen repräsentiert und als Prozentanteil am Gesamtionenstrom ausgedrückt wird.
steht für einen in einem Fokus beobachteten Ionenstrom, und
repräsentiert einen Ionenstrom eines Vorläuferions. Berechnungen erfolgten unter Verwendung eines Programms, das mit Excel (Excel 2000, Microsoft Corp. Washington, USA) entwickelt worden war. Das Programm beruhte auf der DSUM-Funktion und wurde so programmiert, dass eine Bandbreite in Betracht zu ziehender Isotope (w) gewählt wurde (w = 2 in den Experimenten).
^relC wurde gegen
aufgetragen, so dass der in 5b dargestellte Graph erhalten wurde. Die einzelnen Intensitäten der Spitzen des Vorläuferions und der Produktionen werden in Prozent normiert und lassen sich so durch die nachfolgende Gleichung (2) ausdrücken.
Wird das Fragmention (I_i) unabhängig produziert; mit anderen Worten, werden alle Fragmentionen direkt aus einem Vorläufer produziert, so lässt sich die Intensität der einzelnen Ionen jeweils durch die nachfolgende Gleichung (3) beschreiben:
mit 0 < n < 1.
Gilt
= 0 (x = 0) (das Vorläuferion ist nicht mehr vorhanden), so stellt der y-Achsenabschintt (
) die Maximalantwort von I_i bzw. die „ideale” Intensität von I_i dar. Somit lassen sich die Kurven entsprechender Fragmente an eine lineare Funktion anpassen. Dies bedeutet, dass der für die ERMS-Experimente gesammelte Datenpunkt minimiert werden kann.
Ist I_i nicht unabhängig, so steht das Verhältnis eines jeden Produktions zum Vorläufer (I_p) über eine Bandbreite von CID-Energien nicht in einer linearen Beziehung. In diesem Fall wird die Summierung einer willkürlichen Kombination von I_p zu einer linearen Beziehung. Daher wurden C(m, 1) von 1 Ionen aus I_i von allen m Ionen betrachtet, entsprechende Daten für solche Kombinationen aufgetragen, so dass ein Graph erzeugt wurde (5c), und die Standardabweichung der Residuen (Syx) einer linearen Regressionskurve untersucht. Die Residuen (Syx) der linearen Regressionskurve werden durch die nachfolgende Gleichung (4) ausgedrückt.
x_j und y_j repräsentieren Koordinaten von Daten j. a_j und b_j repräsentieren Koordinaten einer Regressionskurve. n – 2 bedeutet einen Freiheitsgrad. Beträgt weiterhin die Intensität eines Vorläuferions 100%, so sind die Intensitäten aller Produktionen gleich 0%. So wurde eine Regressionskurve betrachtet, die durch die Koordinaten (x, y) = (100, 0) verläuft. Gilt Syx ≈ 0, so besteht eine starke Beziehung zwischen den Ionen. Außerdem wurde Syx = 2 als Schwellenwert im vorliegenden Experiment verwendet.
<Ergebnisse>
Lineare Beziehung zwischen für einen weiten CID-Energiebereich erhaltenen Fragmention-zu-Vorläufer-Verhältnissen
Zunächst wird die MS/MS-Analyse eines Vorläuferions X unter CID-Bedingungen betrachtet (1a). Das erhaltene Spektrum (1a) liefert die Intensitäten der einzelnen Ionensignale. Man könnte die Verhältnisse solcher Signale zu Vergleichszwecken gewinnen, um die Struktur einer nicht identifizierten Verbindung zu bestimmen. Andererseits liefert die ERMS-Analyse von Ion X unter CID-Bedingungen (1b) neben den Informationen, die sich mit einer gewöhnlichen MS/MS-Analyse gewinnen lassen, Informationen bezüglich der für den Bruch des Vorläuferions benötigten Aktivierungsenergie. In Anbetracht dieser Tatsache könnte man möglicherweise Informationen bezüglich den in einer Kollisionszelle auftretenden chemischen Reaktionen extrahieren. Im zweiten Diagramm, das Prozentwerte für einzelne Ionen gegenüber Prozentwerten des Vorläuferions zeigt (1c), kann man eine Reihe von Kurven mit einer linearen Beziehung sehen. In einem solchen Fall lässt sich die wichtige Information erhalten, dass das Verhältnis der Intensitäten von Fragmentionen zum Vorläufer konstant ist, unabhängig von den angewandten CID-Energien. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass es möglich ist, bei unterschiedlichen CID-Energien erhaltene MS/MS-Spektren miteinander zu vergleichen, wobei man eine sehr wichtige Grundlage für Vergleiche der Verhältnisse von Fragmentspitzen bei der Strukturbestimmung eines komplexen Glykans erhält (Takegawa, Y., Deguchi, K., Ito, S., Yoshioka, S., Sano, A., Yoshinari, K., Kobayashi, K., Nakagawa, H., Monde, K., Nishimura, S.-I. Anal. Chem. 2004, 76, 7294–7303; Kameyama, A., Kikuchi, N., Nakaya, S., Ito, H., Sato, T., Shikanai, T., Takahashi, Y., Takahashi, K., Narimatsu, H. Anal. Chem. 2005, 77, 4719–4725; Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Anal. Chem. 2005, 77, 6250–6262). Es sei angemerkt, dass derartige Linearitäten für unterschiedliche CID-Energien generell bei diesem Typ von ERMS-Spektren (1b) festgestellt wurden, wie für die meisten Analyten in früheren Experimenten beobachtet wurde (Kurimoto, A., Daikoku, S., Mutsuga, S., Kanie, O. Anal. Chem. 2006, 78, 3461–3466; Daikoku, S., Ako, T., Kato, R., Ohtsuka, I., Kanie, O. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2007, 18, 1873–1879; Shioiri, Y., Suzuki, K., Kanie, O. J. Mass Spectrom. 2008, 43, 1132–1139; Shioiri, Y., Kurimoto, A., Ako, T., Daikoku, S., Ohtake, A., Ishida, H., Kiso, M., Suzuki, K., Kanie, O. Anal. Chem. 2009, 81, 139–145).
Nachfolgend wird eine Analyse von unter Verwendung eines QIT-MS-Geräts erhaltener ERMS beschrieben. Die Dissoziationsreaktion von Methylester eines Gangliosids GD1a (Verbindung 1) lässt sich als typisches Beispiel für solche Reaktionen betrachten, die einem „einfachen” Fragmentierungsverlauf folgen (2). Es wurde beobachtet, dass unter CID-Bedingungen eine Reihe von Fragmentionen (m/z 1610,9, 1245,8, 940,6, 778,6 und 693,2) von natriumhaltiger 1 (m/z 1916,1: [M + Na⁺]⁺) gebildet wurden. Die einzelnen Datenpunktserien konnten mit sigmoidalen Boltzmann-Gleichungen gut angepasst werden. Die Vorläufer-Produkt-Beziehung (Verhältnisdiagramm) ist in 2b dargestellt und zeigt, dass die Fragmention-zu-Vorläufer-Verhältnisse über einen weiten CID-Energiebereich konstant sind.
Die nichtlineare Beziehung zwischen den Fragmention-zu-Vorläufer-Verhältnissen bei ERMS wird der Fragmentierung der Fragmente zugeschrieben.
In einigen seltenen Fällen erhält man komplexe ERMS-Spektren, wie in 3 dargestellt. Die Verwendung solcher Daten stellte sich bei einer quantitativen ERMS-Analyse aufgrund der schwierigen Annäherung als problematisch dar, und sie wurden nicht für eine solche Analyse verwendet, auch wenn diese Spektren selbst als „strukturelle Fingerabdrücke” betrachtet werden können (Daikoku, S., Kurimoto, A., Mutsuga, S., Ako, T., Kanemitsu, T., Shioiri, Y., Ohtake, A., Kato, R., Saotome, C., Ohtsuka, I., Koroghi, S., Sarkar, S. K., Tobe, A., Adachi, S., Suzuki, K., Kanie, O. Carbohydr. Res. 2009, 344, 384–394). In einem solchen Fall zeigen einige der Fragmention-zu-Vorläufer-Verhältnisse Linearität und andere nicht, und die Summe (f₁') einiger Signalintensitäten (f₁, f₃, und f₄) wird linear (3c). Es wurde gefunden, dass Fragmentionen f₃ und f₄ aus f₁ an einem Punkt gebildet wurden, an dem die Kurve von f₁ von der gestrichelten Linie (f₁') abweicht. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass die Fragmentierungsreaktionen eines Fragmentions bei der dem Punkt der Abweichung von der Linie entsprechenden CID-Energie aufzutreten beginnen.
Ein pyridylaminiertes Trisaccharidderivat (Galili-Antigen; 2) wurde als Natriumaddukt-Spezies beobachtet (m/z 646,3) und anschließend dem ERMS-Experiment mit QIT-MS unterzogen (4a). Auf den ersten Blick schien es, dass eine gewisse Korrelation zwischen der Erzeugung von Fragmentionen mit m/z 628,3 (f₁) und 466,2 (f₂) bestehen könnte. Um dies zu bestätigen, wurden Summierungen der Spitzenintensitäten dieser Fragmentionen erhalten (4b; die offenen Quadratsymbole repräsentieren die Summe dieser beiden Ionen, wobei geschlossene Kreise die Summe aller Fragmente darstellen.). Die Tatsache, dass sich die Summe der Intensitäten von f₁ und f₂ mit einer linearen Funktion anpassen lässt, deutet darauf hin, dass diese Ionen eine enge Beziehung zueinander haben. Weiterhin ist aus dem ERMS-Profil dieser Ionen ersichtlich, dass das Fragmention mit m/z 466,2 aus einem Ion mit m/z 628,3 ebenso wie aus einem Ion mit m/z 646,3 (ursprünglicher Vorläufer) gebildet wurde.
MSⁿ-Informationen, die in einem mit Triple-Quadrupol-MS erhaltenen MS/MS-Spektrum enthalten sind

Da der potentielle Nutzen des Analyseverfahrens zur Gewinnung eines Fragmentierungswegs durch Untersuchen der Summierung der Intensitäten ausgewählter Fragmentionen wie oben beschrieben bewiesen wurde, wurde anschließend das ERMS-Spektrum des Ions [2 + Na]⁺ mittels TQ-MS untersucht. Das Profil des so unter Verwendung von TQ-MS erhaltenen ERMS-Spektrums unterschied sich ziemlich deutlich von dem mit QIT-MS erhaltenen und war auch komplexer (5a). Neben dem offensichtlichen Unterschied zwischen den „Erzeugungskurven” der einzelnen Fragmentionen wurden im vorliegenden Fall Ionen mit m/z 304,1 und 322,2 beobachtet, die nicht in den QIT-MS-Experimenten beobachtet wurden. Zudem wurde gefunden, dass Ionen mit m/z 628,3 (f₁) und 466,2 (f₃) eine starke Beziehung zueinander haben könnten, wie beim Experiment am QIT-MS beobachtet. Ebenso zeigte das Verhältnisdiagramm, dass die meisten Fragmentionen eine nichtlineare Beziehung zu ihrem Vorläufer haben (5b). Da in Betracht gezogen wurde, dass mehr als ein Paar Fragmentionen in Beziehung zueinander standen, wurden kombinatorische Summierungen einzelner Fragmentionen untersucht. Dabei wurde eine willkürliche Kombination, nämlich C(m, 1) von Ionen (1) aus Gesamtionen (m), betrachtet und die Standardabweichung der Residuen (Syx) einer linearen Regressionskurve im Verhältnisdiagramm (5c) untersucht. Es wurde gefunden, dass die Beziehung zwischen dem (den) ausgewählten Paar(en) von Ionen umso stärker war, je kleiner der Syx-Wert war. Kombinationen von Produktionen (Fragmentionen), die durch Geradenannäherung unter den in 5c dargestellten Kurven ausgewählte Kurven bilden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. In Tabelle 1 handelt es sich bei durch Kreise dargestellten Produktionen um Komponenten, die entsprechende Kurven bilden, wobei Syx-Werte für die jeweiligen Kurven dargestellt sind. Beispielsweise zeigten die Fragmentionenreihen f₁–f₄ [m/z 304 (f₄), 466 (f₃), 484 (f₂) und 628 (f₁)] eine gewisse Beziehung. Tabelle 1

Syx-Wert	Fragmention (m/z)
Syx-Wert	f₆ (203,1)	f₄ (304,1)	f₅ (322,2)	f₃ (466,2)	f₂ (484,2)	f₁ (628,3)
0,00	o	o	o	o	o	o
0,49	o	o	-	o	o	o
0,49	-	-	o	-	-	-
1,19	-	o	-	o	o	o
1,19	o	-	o	-	-	-
1,35	-	o	o	o	o	o
1,35	o	-	-	-	-	-

Nimmt man das ERMS-Profil als Ganzes, so zeigte sich, dass ein Ion f₃ aus f₂, bei dem es sich um ein Produkt des Vorläufers (2 + Na⁺) handelte, gebildet wurde und dass f₃ f₄ produzierte. Dieses Ergebnis deutet an, dass die Analyse von am TQ-MS erhaltenen ERMS-Daten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens MS³- und/oder MS⁴-äquivalente Informationen lieferte. Das heißt, während der herkömmliche Stand der Technik zum Sammeln von MSⁿ-Informationen mehrere Läufe von MS/MS-Experimenten benötigte, gestattet gemäß der vorliegenden Erfindung ein Lauf von energieaufgelöster Massenspektrometrie (ERMS) mittels TQ-MS das Sammeln von MSⁿ-Informationen.
Strukturdetails
Aus den Ergebnissen in Tabelle 1 lassen sich spezifisch die folgenden Informationen gewinnen.

• f₁ = [2 + Na⁺] (Vorläufer: 646) – H₂O(18)
• f₂ = [2 + Na⁺]-Hex(162) f₃ = f₁ – Hex, und f₃ = f₂ – H₂O
• f₄ = f₁ – 2Hex, und f₄ = f₃ – Hex

Außerdem repräsentiert „Hex” eine Hexose, und die Werte in Klammern repräsentieren m/z-Werte bzw. Molekulargewichte. Aus den obigen Informationen könnten Informationen über einen Dissoziationsweg von [2 + Na⁺] (Vorläuferion; Probe Galili-Antigen-Trisaccharid) erhalten werden, wie in 6 dargestellt.
Im Hinblick auf die Struktur von Produktionen handelte es sich bei den Ionen f₂ und f₆ um Verbindungen mit PA-Resten und bei f₁, f₃ und f₄ um dehydratisierte Ionen zwischen den PA-Resten und N-Acetylgruppen. Ebenso wurde als kleineres Signal eine hexoseorientierte C-Ionen-Spezies (f₅) beobachtet. Die Ausbildung einer Imidazolinstruktur unter CID-Bedingungen ist bereits beschrieben (Kurimoto, A., Kanie, O. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2007, 21, 2770–2778). Zwar stimmten alle Fragmentionen mit der Struktur von Verbindung 2 überein, doch standen aus diesen m/z-Werten allein nur begrenzte Informationen zur Verfügung. Die aus der obigen Analyse gewonnenen Informationen lieferten wie folgt weitere Einzelheiten. Das heißt, wie in 6 dargestellt, das Vorläuferion (2 + Na⁺) fragmentierte durch den Bruch von zwei glykosidischen Verknüpfungen und Dehydratisierung am reduzierenden Ende zu den Produktionen f₁, f₂, f₅ und f₆. Fragment f₂ ergab ferner f₃ und f₄ durch Dehydratisierung und Glykosylbruch. Das Ion f₁ wurde durch zwei Glykosylspaltungen in f₄ überführt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Kurimoto, A., Kanie, O. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2007, 21, 2770–2778 [0051]

Claims

Verfahren zur Analyse einer Struktur eines interessierenden Stoffs, umfassend: (a) Durchführen einer Triple-Quadrupol-Massenspektrometriemessung in Bezug auf den interessierenden Stoff bei gleichzeitigem Variieren eines CID-Energiewerts; (b) bei gegebenen CID-Energiewerten Berechnen prozentualer Vorläuferionengehalte gegenüber einem Gesamtionengehalt sowie prozentualer Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt; (c) Extrahieren von Werten für die prozentualen Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt, wobei es sich bei den Werten um Werte für die prozentualen Produktionengehalte bei den jeweiligen CID-Energiewerten handelt, die entsprechende, in Schritt (b) berechnete Werte für prozentuale Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt ergeben; (d) Berechnen von Summen für alle Kombinationen der in Schritt (c) extrahierten Werte für die prozentualen Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt; und (e) aus Funktionen, worin die Werte für prozentuale Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt als x und die berechneten Werte der Summen von Kombinationen als y angegeben sind, Auswählen solcher, die sich an eine Gerade annähern lassen, und Analysieren der Struktur des interessierenden Stoffs basierend auf m/z-Werten von Produktionen, die jeweils die ausgewählten Funktionen ergeben.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (b) die CID-Energiewerte einer X-Achse und alle Prozentwerte einer Y-Achse zugewiesen werden und die prozentualen Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt und die prozentualen Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt darin aufgetragen werden, so dass ein Graph erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei in Schritt (c) die prozentualen Produktionengehalte, jeweils mit spezifischen m/z-Werten, gegenüber dem Gesamtionengehalt in Y-Achsenrichtung aufgetragen werden, während die prozentualen Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt einer X-Achse zugewiesen werden, so dass ein Graph erzeugt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei in Schritt (d) die berechneten Summenwerte für Kombinationen in Y-Achsenrichtung aufgetragen werden, während die prozentualen Vorläuferionengehalte gegenüber dem Gesamtionengehalt einer X-Achse zugewiesen werden, so dass ein Graph erzeugt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Geradenannäherung in Schritt (e) unter Anwendung der Formel (4) erfolgt:
wobei Syx für ein Residuum einer linearen Regressionskurve steht; x_j und y_j für Koordinaten der Daten j stehen; a_j und b_j für Koordinaten der Regressionskurve stehen; und n – 2 einen Freiheitsgrad bedeutet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei MSⁿ-Informationen in Schritt (e) gesammelt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich bei dem interessierenden Stoff um eine Zuckerkette handelt.