DE102011017084A1 - Massenspektrometriedaten-Erfassungsmodus zur Erzielung einer zuverlässigeren Proteinquantifizierung - Google Patents

Abstract

Hierin werden Verfahren und Systeme beschrieben, die eine einheitliche/einzigartige Plattform zur Analytquantifizierung ermöglichen. Die Verfahren und Systeme betreffen die Bestimmung des Ausmaßes an Interferenz in einem Vorläuferion-Isolationsfenster, die aus einer Verunreinigung resultiert. Sobald der Verunreinigungsgrad bestimmt wurde, können mehrere Verfahren zur Verringerung des Ausmaßes an Interferenz in einem darauf folgenden MS/MS-Spektrum eingesetzt werden. Die hierin beschriebenen Verfahren und Systeme ermöglichen eine erhöhte Quantifizierungsgenauigkeit, während hohe Durchsatzniveaus aufrechterhalten werden.

Description

• Diese Patentanmeldung beansprucht den Vorteil und die Priorität der vorläufigen US-amerikanischen Patentanmeldung 61/324,065, eingereicht am 14. April 2010, mit dem Titel „MASSENSPETROMETRIEDATEN-ERFASSUNGSMODUS ZUR ERZIELUNG EINER ZUVERLÄSSIGEREN PROTEINQUANTIFIZIERUNG, die hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist.
• ERKLÄRUNG BEZÜGLICH STAATLICH GEFÖRDERTER FORSCHUNG ODER ENTWICKLUNG
• Diese Erfindung wurde mit Beihilfe von der US-amerikanischen Regierung gemacht, die von den folgenden Behörden gewährt wurde: NIH GM080148. Die US-amerikanische Regierung hat gewisse Rechte an dieser Erfindung.
• ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
• Die Fähigkeit zur Identifizierung von Proteinen und zur Bestimmung ihrer chemischen Strukturen hat sich in den Biowissenschaften zu einem zentralen Thema entwickelt. Die Aminosäuresequenz von Proteinen stellt eine Verknüpfung zwischen Proteinen und deren codierenden Genen über den genetischen Code und im Prinzip eine Verknüpfung zwischen Zellphysiologie und Genetik bereit. Die Identifizierung von Proteinen stellt einen Einblick in komplexe zelluläre Regulationsnetzwerke bereit.
• Ionenfallen-Massenspektrometer gehören zu den am weitesten verbreiteten Plattformen für die Molekularanalyse – welche sich über Naturprodukte hin zu Pharmazeutika bis bin zu biologischen Präparaten, wie Proteine, erstreckt. Die meisten auf Massenspektrometern basierenden Versuche beginnen mit der Isolation einer Gruppe von Verbindungen aus einer Menge von Proben mittels einer Art von Extraktionstechnik, z. B. Proteine aus Geweben, Zelllysaten oder Flüssigkeiten, gefolgt von dem proteolytischen Verdau dieser Proteine zu Peptiden (d. h. Bottom-up-Proteomik). Häufig, jedoch nicht notwendiger Weise werden die Massenspektrometer dann mit einer Form von Trennungen, z. B. elektrophoretisch oder chromatographisch, gekoppelt. Innerhalb von nur einigen wenigen Stunden können Massenspektralgeräte eigenständig Zehntausende molekulare Spezies mittels Tandem-Massenspektrometrie untersuchen.
• In der Chemie ist quantitative Analyse die Bestimmung der absoluten oder relativen Häufigkeit einer, mehrerer oder aller bestimmten Substanzen, welche in einer Probe vorliegen. Bei biologischen Proben kann eine quantitative Analyse, die mittels Massenspektrometrie durchgeführt wird, die relative Häufigkeit von Peptiden und Proteinen bestimmen. Die allgemein anerkannte Methodik zur Durchführung einer massenspektrometrischen Quantifizierung wird unter Verwendung eines Massenspektrometers erzielt, das zur MS/MS-Fragmentierung in der Lage ist (d. h. Tripel-Quadrupol- oder Ionenfallen-Massenspektrometer). Der Quantifizierungsprozess kann die isobare Markierung von Peptidvorläufern beinhalten, welche bei Kombination mit Nacherfassungssoftware die relative Häufigkeit von Peptiden bereitstellt. Wenn ein Peptidvorläufer jedoch zur Tandem-Massenspektrometrie ausgewählt wird, liegen oftmals störende Spezies mit ähnlichen Masse-zu-Ladung-Verhältnissen vor, welche koisoliert und einer Aktivierung unterzogen werden. Diese Spezies sind oftmals andere isobar markierte Peptide mit einer anderen relativen Quantifizierung, welche daher die quantitative Messung des Peptids von Interesse stören.
• Bei der isobaren Markierung handelt es sich um ein wichtiges quantitatives Verfahren, da es das Multiplexen ermöglicht und direkt auf klinische Proben anwendbar ist. Eine signifikante Fehlerquelle tritt jedoch auf, wenn ein anderes eluierendes Peptidion einen m/z-Wert aufweist, welcher sehr nahe dem des ausgewählten Vorläufers liegt (~50%, unsererseits/in unserem Fall). Das Ergebnis ist die Isolierung beider Spezies, welche folglich gemeinsam dissoziiert werden, um ein zusammengesetztes MS/MS-Spektrum zu erzeugen. Die resultierenden Reporter-Ionenverhältnisse spiegeln die relativen Häufigkeiten beider Peptide nicht genau wider; wodurch sowohl die Präzision als auch der dynamische Bereich der Quantifizierung eingeschränkt wird, da das mittlere Peptidverhältnis nahe 1:1 liegt.
• Die zunehmende Popularität von iTRAQ für quantitative Proteomikanwendungen hat verstärkte Anstrengungen zur Einschätzung von dessen Relevanz, Genauigkeit und Präzision zur biologischen Deutung angeregt. Vor kurzem haben einige Forscher damit begonnen, die Genauigkeit und Präzision der iTRAQ-Quantifizierung sowie Nachteile, die die Anwendbarkeit und den erzielbaren dynamischen Bereich von iTRAQ behindern zu beurteilen. Einige Ergebnisse legen nahe, dass eine Überlagerung von störenden Faktoren zu Unterschätzungen führen kann [Ow et al., „iTRAQ Underestimation in Simple and Complex Mixtures: ,The Good, the Bad and the Ugly'", Journal of Proteome Research, Internetveröffentlichung, 16. September 2009]. Es ist deutlich, dass bei iTRAQ und anderen Proteinmarkierungsverfahren verlockendes Potential besteht, eine genaue Quantifizierung bereitzustellen, welche sich über mehrere Größenordnungen erstreckt. Dieses Potential kann jedoch von mehreren Faktoren eingeschränkt werden. Erstens beispielsweise erfordert das Vorhandensein von isotopen Verunreinigungen oftmals eine Korrektur der Massenspektraldaten, um eine genaue Quantifizierung bereitzustellen, welche derzeit die Verfügbarkeit genauer isotoper Faktoren benötigt. Zweitens ist die Interferenz des gemischten MS/MS-Beitrags, die während der Vorläuferauswahl auftritt, ein Problem, dessen Minimierung derzeit sehr schwierig ist.
• ZUSAMMENFASSUNG
• Hierin werden Verfahren und Systeme beschrieben, welche eine einheitliche/einzigartige Plattform zur Analytquantifizierung ermöglichen. Die Verfahren und Systeme beziehen sich auf die Bestimmung des Betrags/Anteils an Interferenz in einem Vorläufer-Ion-Isolierungsfenster, welche aus einer Verunreinigung resultiert. Sobald der Verunreinigungsgrad bestimmt ist, können mehrere Verfahren zur Verringerung des Betrags/Anteils an Interferenz in einem darauf folgenden MS/MS-Spektrum eingesetzt werden. Die hierin beschriebenen Verfahren und Systeme ermöglichen eine erhöhte Quantifizierungsgenauigkeit, während hohe Durchsatzniveaus aufrechterhalten werden.
• In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zum Analysieren eines Analyten unter Anwendung von Massenspektrometrie bereitgestellt, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Bereitstellung eines Analyten; (b) Erzeugung einer Verteilung von Vorläuferionen aus dem Analyten; (c) Analyse der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferionen, wodurch Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten, welche der Verteilung von Vorläuferionen entsprechen, erzeugt werden; (d) Identifizierung eines Vorläufer-Peaks, welcher einem Vorläuferion entspricht, in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten; (e) Fragmentierung von Ionen, welche einem vorher ausgewählten Bereich von m/z-Einheiten um den Vorläufer-Peak herum entsprechen, wobei der vorher ausgewählte Bereich innerhalb von 0,01 bis 10 m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks liegt, wodurch Fragment-Ionen erzeugt werden; (f) Messung der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Fragment-Ionen, wodurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden; (g) Bestimmung des Betrags/Anteils an Interferenz innerhalb des vorher ausgewählten Bereichs von m/z-Einheiten um den Vorläufer-Peak herum und (h) Analyse der Vorläufer-Ionen-Massenspektrometriedaten und der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, für welche der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, und Nicht-Analyse der Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, für welche der Betrag/Anteil an Interferenz größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist; wodurch der Analyt unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert wird.
• In einer alternativen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Analysieren eines Analyten unter Anwendung von Massenspektrometrie bereitgestellt, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Bereitstellung eines Analyten; (b) Erzeugung einer Verteilung von Vorläuferionen aus dem Analyten; (c) Analyse der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferionen, wodurch Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten, welche der Verteilung von Vorläuferionen entsprechen, erzeugt werden; (d) Identifizierung eines Vorläufer-Peaks, welcher einem Vorläuferion entspricht, in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten; (e) Bestimmung des Betrags/Anteils an Interferenz innerhalb eines Bereichs von 0,01 bis 10 m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks; (f) Fragmentierung der Ionen, welche dem Vorläufer-Peak entsprechen, vorausgesetzt, dass der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, wodurch Fragment-Ionen erzeugt werden; und Nicht-Fragmentierung der Ionen, welche dem Vorläufer-Peak entsprechen, vorausgesetzt, dass der Betrag/Anteil an Interferenz größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist; (g) Messung der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Fragment-Ionen, wodurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden; und (h) Analyse der Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten; wodurch der Analyt unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert wird.
• In einer alternativen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Analysieren eines Analyten unter Verwendung von Massenspektrometrie bereitgestellt, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Bereitstellung eines Analyten; (b) Erzeugung einer Verteilung von Vorläuferionen aus dem Analyten; (c) Analyse der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferionen, wodurch Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten, welche der Verteilung von Vorläuferionen entsprechen, erzeugt werden; (d) Identifizierung eines Vorläufer-Peaks, welcher einem Vorläuferion entspricht, in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten; (e) Bestimmung des Betrags/Anteils an Interferenz innerhalb eines vorher ausgewählten Bereichs von m/z-Einheiten um den Vorläufer-Peak herum, wobei der vorher ausgewählte Bereich innerhalb von 0,01 bis 10 m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks liegt; (f) Fragmentierung von Ionen, welche dem vorher ausgewählten Bereich entsprechen, wodurch Fragment-Ionen erzeugt werden; (g) Messung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von Fragment-Ionen, welche einem vorher ausgewählten Bereich entsprechen, wenn der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, und Nicht-Messung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von Fragment-Ionen, welche einem vorher ausgewählten Bereich entsprechen, wenn der Betrag/Anteil an Interferenz größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist, wodurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden; und (h) Analyse der Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten; wodurch der Analyt unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert wird.
• Die hierin beschriebenen Verfahren und Systeme können eine Anpassung des Bereichs von m/z-Einheiten beinhalten, so dass die Interferenz in dem Bereich kleiner als ein ausgewählter Wert ist. In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zum Analysieren eines Analyten unter Verwendung von Massenspektrometrie bereitgestellt, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Bereitstellung eines Analyten; (b) Erzeugung einer Verteilung von Vorläuferionen aus dem Analyten; (c) Analyse der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferionen, wodurch Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten, welche der Verteilung von Vorläuferionen entsprechen, erzeugt werden; (d) Identifizierung eines Vorläufer-Peaks, welcher einem Vorläuferion entspricht, in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten; (e) Bestimmung des Betrags/Anteils an Interferenz innerhalb eines vorher ausgewählten Bereichs von 0,01 bis 10 m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks; (f) Anpassung des Isolierungsbereichs von m/z-Einheiten, so dass der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist; und (g) Analyse der Ionen innerhalb des angepassten Bereichs von m/z-Einheiten; wodurch der Analyt unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert wird.
• Das Verfahren kann beispielsweise umfassen, dass die Anpassung des Bereichs von m/z-Einheiten, so dass das Ausmaß an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, Folgendes umfasst: (i) Identifizierung eines Vorläufer-Peaks mit der größten Intensität innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten; (ii) Identifizierung eines Interferenz-Peaks am niedrigsten m/z innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten dessen Intensität größer oder gleich 25% der Intensität des Vorläufer-Peaks mit der größten Intensität ist; (iii) Identifizierung eines Interferenz-Peaks bei dem größten m/z innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten dessen Intensität größer oder gleich 25% der Intensität des Vorläufer-Peaks mit der größten Intensität ist; (iv) Identifizierung eines Mittelpunkts der m/z-Einheiten zwischen dem Interferenz-Peak bei dem niedrigsten m/z und dem Interferenz-Peak bei dem größten m/z und (v) Auswahl des Bereichs von m/z-Einheiten auf 75% einer m/z-Differenz zwischen dem Interferenz-Peak am niedrigsten m/z und dem Interferenz-Peak am größten m/z, zentriert auf den Mittelwert der m/z-Einheiten zentriert ist.
• Das Verfahren kann außerdem beispielsweise umfassen, dass die Anpassung des Bereichs von m/z-Einheiten, so dass das Ausmaß an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, Folgendes umfasst: (i) Einstellung des Bereichs der m/z-Einheiten auf innerhalb 10 m/z des Vorläufer-Peaks; (ii) Bestimmung des Betrags/Anteils an Interferenz innerhalb des Bereichs der m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks und (iii) Verringerung des Bereichs der m/z-Einheiten um 0,1 m/z, falls der Betrag/Anteil an Interferenz innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist.
• Das Verfahren kann weiterhin beispielsweise umfassen, dass die Anpassung des Bereichs von m/z-Einheiten, so dass das Ausmaß an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, Folgendes umfasst: (i) Einstellung des Bereichs der m/z-Einheiten auf innerhalb 10 m/z des Vorläufer-Peaks; (ii) Bestimmung des Betrags/Anteils an Interferenz innerhalb des Bereichs der m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks und (iii) Verringerung des Bereichs der m/z-Einheiten um 0,1 m/z, falls der Betrag/Anteil an Interferenz innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist.
• Das Verfahren kann weiterhin beispielsweise umfassen, dass die Anpassung des Bereichs von m/z-Einheiten, so dass das Ausmaß an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, Folgendes umfasst: (i) Einstellung des Bereichs der m/z-Einheiten auf innerhalb 10 m/z des Vorläufer-Peaks; (ii) Bestimmung des Betrags/Anteils an Interferenz innerhalb des Isolierungsbereichs der m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks und (iii) Verringerung des Bereichs der m/z-Einheiten um 0,01 m/z, falls der Betrag/Anteil an Interferenz innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist.
• Das Verfahren kann beispielsweise erweitert werden, so dass es zusätzliche Schritte beinhaltet, welche Folgendes umfassen: (h) Fragmentierung der Ionen, welche dem Vorläufer-Peak entsprechen, wodurch Fragment-Ionen erzeugt werden; (i) Messung der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Fragment-Ionen, wodurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden; und (j) Analyse der Vorläuferionen-Massenspektrornetriedaten und der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, für welche der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als der ausgewählte Wert ist, und Nicht-Analyse der Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, für welche der Betrag/Anteil an Interferenz größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist.
• Das Verfahren kann beispielsweise erweitert werden, so dass es zusätzliche Schritte beinhaltet, welche Folgendes umfassen: (h) Fragmentierung der Ionen, welche dem Vorläufer-Peak entsprechen, vorausgesetzt, dass der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als der ausgewählte Wert ist, wodurch Fragment-Ionen erzeugt werden; und Nicht-Fragmentierung der Ionen, welche dem Vorläufer-Peak entsprechen, vorausgesetzt, dass der Betrag/Anteil an Interferenz größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist; (i) Messung der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Fragment-Ionen, wodurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden; und (j) Analyse der Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten.
• Der Betrag/Anteil an Interferenz kann unter Verwendung vieler verschiedener Verfahren bestimmt werden. In einer Ausführungsform wird beispielsweise der Betrag/Anteil an Interferenz durch Berechnung eines Interferenzverhältnisses bestimmt und der ausgewählte Wert ist ein Interferenzverhältnis von kleiner oder gleich 0,5. In einer Ausführungsform wird der Betrag/Anteil an Interferenz durch Berechnung eines Interferenzverhältnisses bestimmt und der ausgewählte Wert ist ein Interferenzverhältnis von kleiner oder gleich 0,25. In einer Ausführungsform wird der Betrag/Anteil an Interferenz durch Berechnung eines Interferenzverhältnisses bestimmt und der ausgewählte Wert ist ein Interferenzverhältnis von kleiner oder gleich 0,1. In einer Ausführungsform wird der Betrag/Anteil an Interferenz durch Berechnung eines Interferenzverhältnisses einer größten Interferenz-Peak-Intensität innerhalb des Bereichs der m/z-Einheiten zu einer größten Vorläufer-Peak-Intensität innerhalb des Bereichs der m/z-Einheiten bestimmt. In einer Ausführungsform wird der Betrag/Anteil an Interferenz durch Berechnung eines Interferenzverhältnisses der Summe aller Interferenz-Peak-Intensitäten innerhalb des Bereichs der m/z-Einheiten zu der Summe aller Vorläufer-Peak-Intensitäten innerhalb des Bereichs der m/z-Einheiten bestimmt.
• Die Verfahren hierin können ausgeübt werden, wobei nur bestimmte Peaks zur Berücksichtigung ausgewählt werden. Die Auswahl bestimmter Peaks zur Berücksichtigung kann beispielsweise die Genauigkeit, die Empfindlichkeit oder den Durchsatz der Verfahren steigern. In einer Ausführungsform werden nur Peaks mit einer Intensität von größer oder gleich 50% des intensivsten Vorläuferionen-Peaks in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten berücksichtigt. In einer Ausführungsform werden nur Peaks mit einer Intensität von größer oder gleich 25% des intensivsten Vorläuferionen-Peaks in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten berücksichtigt. In einer Ausführungsform werden nur Peaks mit einer Intensität von größer oder gleich 10% des intensivsten Vorläuferionen-Peaks in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten berücksichtigt. In einer Ausführungsform werden nur Peaks mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von größer als 10 zu 1 berücksichtigt. In einer Ausführungsform werden nur Peaks mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von größer als 4 zu 1 berücksichtigt. In einer Ausführungsform werden nur Peaks mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von größer als 2 zu 1 berücksichtigt. In einer Ausführungsform werden nur Peaks mit einem Isotopenhäufigkeitsmuster, welche auf eine ionische Spezies hindeutet, berücksichtigt.
• Andere Techniken können die Genauigkeit, die Empfindlichkeit und/oder den Durchsatz der hierin beschriebenen Verfahren steigern. In einem Gesichtspunkt dieser Ausführungsform werden die Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und die Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten nur Von Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten analysiert, welche auf eine einzige Vorläuferspezies hindeuten. In einem Gesichtspunkt umfassen die Verfahren weiterhin das Verwerfen von Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, für welche der Betrag/Anteil an Interferenz größer als der ausgewählte Wert ist und/oder das Verwerfen von Produkt-Ionen, für welche die Interferenz größer als der ausgewählte Wert ist.
• Die hierin beschriebenen Verfahren können erweitert werden, so dass sie einen weiten Bereich von Vorläuferionenmassen abdecken. In einem Gesichtspunkt dieser Ausführungsform umfassen die Verfahren weiter die Wiederholung der Schritte (d)– (g) für wenigstens einen Teil der Vorläuferionen-Peaks in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten. In einem anderen Gesichtspunkt dieser Ausführungsform umfassen die Verfahren weiter die Wiederholung der Schritte (d)–(g) für im Wesentlichen alle Vorläuferionen-Peaks in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten.
• Die Auswahl des Bereichs der m/z-Einheiten ist wichtig, um sowohl die Empfindlichkeit zu erhöhen als auch die Interferenz von Nicht-Vorläuferionen zu verringern. Die Bezugnahme auf einen Bereich von m/z-Einheiten um einen Vorläufer-Peak herum bezieht sich auf den Bereich, welcher sich sowohl zur hohen m/z-Seite eines Vorläufer-Peaks als auch zur niedrigen m/z-Seite eines Vorläufer-Peaks erstreckt. Die Bezugnahme auf einen Bereich von 0,1 bis 10 m/z-Einheiten um einen Vorläufer-Peak herum bezieht sich beispielsweise auf einen Bereich von 0,1 bis 10 m/z-Einheiten kleiner als die m/z-Einheitsposition des Vorläufer-Peaks und einen Bereich von 0,1 bis 10 m/z-Einheiten größer als die m/z-Einheitsposition des Vorläufer-Peaks. Wenn der Bereich von m/z-Einheiten zu eng ist, wird die Empfindlichkeit des Verfahrens verringert; wenn der Bereich zu breit ist, wird die Interferenz erhöht. In einem Gesichtspunkt dieser Ausführungsform umfassen die Verfahren weiter die Anpassung des m/z-Isolierungsbereichs, so dass der Betrag/Anteil an Interferenz im m/z-Bereich kleiner als der ausgewählte Wert ist. In einem weiteren Gesichtspunkt beträgt der Bereich von m/z-Einheiten 0,01 bis 5 m/z-Einheiten, für manche Anwendungen beträgt der Bereich von m/z-Einheiten 0,01 bis 2 m/z-Einheiten.
• Vorläuferionen können unter Verwendung einer breiten Auswahl von Ionisierungstechniken und Ionenquellen erzeugt werden. In einer Ausführungsform wird die Verteilung von Vorläuferionen beispielsweise durch eine Elektrospray-Ionisierungsquelle oder eine MALDI-Quelle erzeugt.
• In einer Ausführungsform wird ein Massenspektrometersystem zur Analyse eines Analyten bereitgestellt, wobei das System Folgendes umfasst: eine Ionenquelle zum Erzeugen von Ionen aus dem Analyten; eine erste Ionentrennungsoptik in Verbindung stehend mit der Ionenquelle zum Trennen von Tonen nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; einen ersten Ionendetektor in Verbindung stehend mit der ersten Ionentrennungsoptik zum Erfassen von Ionen, welche nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden; eine Ionenfragmentierungsoptik in Verbindung stehend mit der ersten Ionentrennungsoptik zum Erzeugen von Ionenfragmenten; eine zweite Ionentrennungsoptik in Verbindung stehend mit der Ionenfragmentierungsoptik zum Trennen von Ionen nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; einen zweiten Ionendetektor in Verbindung stehend mit der zweiten Ionentrennungsoptik zum Erfassen von Tonen, welche nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden; eine Steuerung, welche an die erste und zweite Ionentrennungsoptik, den ersten und zweiten Ionendetektor und die Ionenfragmentierungsoptik betreibbar angeschlossen ist; wobei die Steuerung die Ionenoptiken und die Ionendetektoren derart steuert, dass: (a) eine Verteilung von Vorläuferionen aus dem Analyten erzeugt wird; (b) die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferionen analysiert werden, wodurch Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden, welche der Verteilung von Vorläuferionen entsprechen; (c) ein Vorläufer-Peak, welcher einem Vorläuferion entspricht, in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten identifiziert wird; (d) der Betrag/Anteil an Interferenz innerhalb eines Bereichs von 0,01 bis 10 m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks bestimmt wird; (e) die Ionen, welche dem Vorläufer-Peak entsprechen, fragmentiert werden, wodurch Fragment-Ionen erzeugt werden; (f) die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Fragment-Ionen gemessen werden, vorausgesetzt, dass der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, wodurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden; und die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Fragment-Ionen nicht gemessen werden, vorausgesetzt, dass der Betrag/Anteil au Interferenz größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist; und (g) die Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und die Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten analysiert werden.
• In einer alternativen Ausführungsform wird ein Massenspektrometersystem zur Analye eines Analyten bereitgestellt, wobei das System Folgendes umfasst: eine Ionenquelle zum Erzeugen von Ionen aus dem Analyten; eine erste Ionentrennungsoptik in Verbindung stehend mit der Ionenquelle zum Trennen von Ionen gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; einen ersten Ionendetektor in Verbindung stehend mit der ersten Ionentrennungsoptik zum Erfassen von Ionen, die welche nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden; eine Ionenfragmentierungsoptik in Verbindung stehend mit der ersten Ionentrennungsoptik zum Erzeugen von Ionenfragmenten; eine zweite Ionentrennungsoptik in Verbindung stehend mit der Ionenfragmentierungsoptik zum Trennen von Ionen nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; einen zweiten Ionendetektor in Verbindung stehend mit der zweiten Ionentrennungsoptik zum Erfassen von Ionen, welche nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden; eine Steuerung, die an die erste und zweite Ionentrennungsoptik, den ersten und zweiten Ionendetektor und die Ionenfragmentierungsoptik betreibbar angeschlossen ist; wobei die Steuerung die Ionenoptiken und die Ionendetektoren derart steuert, dass: (a) eine Verteilung von Vorläuferionen aus dem Analyten erzeugt wird; (b) die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferionen analysiert werden, wodurch Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden, welche der Verteilung von Vorläuferionen entsprechen; (c) ein Vorläufer-Peak, welcher einem Vorläuferion entspricht, in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten identifiziert wird, (d) Ionen welche einem vorher ausgewählten Bereich von m/z-Einheiten um den Vorläufer-Peak herum entsprechen, fragmentiert werden, wobei der vorher ausgewählte Bereich innerhalb von 0,01 bis 10 m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks liegt, wodurch Fragment-Ionen erzeugt werden; (e) die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Fragment-Ionen gemessen werden, wodurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden; (f) den Betrag/Anteil an Interferenz innerhalb des vorher ausgewählten Bereichs von m/z-Einheiten um den Vorläufer-Peak herum gemessen wird und (g) die Vorläufer-Ionen-Massenspektrometriedaten und die Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten analysiert werden, für welche der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, und die Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und die Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten nicht analysiert werden, für welche der Betrag/Anteil an Interferenz größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist.
• In einer alternativen Ausführungsform wird ein Massenspektrometersystem zur Analyse eines Analyten bereitgestellt, wobei das System Folgendes umfasst: eine Ionenquelle zum Erzeugen von Ionen aus dem Analyten; eine erste Ionentrennungsoptik in Verbindung stehend mit der Ionenquelle zum Trennen von Ionen gemäß ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; einen ersten Ionendetektor in Verbindung stehend mit der ersten Ionentrennungsoptik zum Erfassen von Ionen, welche nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden; eine Ionenfragmentierungsoptik in Verbindung stehend mit der ersten Ionentrennungsoptik zum Erzeugen von Ionenfragmenten; eine zweite Ionentrennungsoptik in Verbindung stehend mit der Ionenfragmentierungsoptik zum Trennen von Ionen nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; einen zweiten Ionendetektor in Verbindung stehend mit der zweiten Ionentrennungsoptik zum Erfassen von Ionen, welche nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden; eine Steuerung, welche an die erste und zweite Ionentrennungsoptik, den ersten und den zweiten Ionendetektor und die Ionenfragmentierungsoptik betreibbar angeschlossen ist; wobei die Steuerung die Ionenoptiken und die Ionendetektoren derart steuert, dass: (a) eine Verteilung von Vorläuferionen aus dem Analyten erzeugt wird; (b) die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferionen analysiert werden, wodurch Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden, welche der Verteilung von Vorläuferionen entsprechen; (c) ein Vorläufer-Peak, welcher einem Vorläuferion entspricht, in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten identifiziert wird,; (d) den Betrag/Anteil an Interferenz innerhalb eines vorher ausgewählten Bereichs von m/z-Einheiten um den Vorläufer-Peak herum bestimmt wird, wobei der vorher ausgewählte Bereich innerhalb von 0,01 bis 10 m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks liegt; (e) Ionen welche dem vorher ausgewählten Bereich entsprechen, fragmentiert werden, wenn der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, wodurch Fragment-Ionen erzeugt werden; und Ionen nicht fragmentiert werden, welche dem vorher ausgewählten Bereich entsprechen, wenn der Betrag/Anteil an Interferenz größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist; (f) Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Fragment-Ionen gemessen werden, wodurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden; und (g) die Vorläufer-Ionen-Massenspektrometriedaten und die Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten analysiert werden.
• Die Steuerung kann den Betrag/Anteil an Interferenz unter Verwendung vieler verschiedener Verfahren bestimmen. In einer Ausführungsform bestimmt die Steuerung beispielsweise den Betrag/Anteil an Interferenz innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten durch Berechnung eines Interferenzverhältnisses und der ausgewählte Wert ist ein Interferenzverhältnis von kleiner oder gleich 0,5. In einem Gesichtspunkt bestimmt die Steuerung beispielsweise den Betrag/Anteil an Interferenz innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten durch Berechnung eines Interferenzverhältnisses und der ausgewählte Wert ist ein Interferenzverhältnis von kleiner oder gleich 0,25. In einem anderen Gesichtspunkt bestimmt die Steuerung beispielsweise den Betrag/Anteil an Interferenz innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten durch Berechnung eines Interferenzverhältnisses und der ausgewählte Wert ist ein Interferenzverhältnis von kleiner oder gleich 0,1. In einem Gesichtspunkt bestimmt die Steuerung den Betrag/Anteil an Interferenz durch Berechnung eines Interferenzverhältnisses der größten Interferenz-Peak-Intensität innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten zu der größten Vorläufer-Peak-Intensität innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten. In einem anderen Gesichtspunkt bestimmt die Steuerung den Betrag/Anteil an Interferenz durch Berechnung eines Interferenzverhältnisses der Summe aller Interferenz-Peak-Intensitäten innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten zu der Summe aller Vorläufer-Peak-Intensitäten innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten.
• Die Auswahl bestimmter Peaks zur Berücksichtigung durch die Steuerung kann beispielsweise die Genauigkeit, die Empfindlichkeit oder den Durchsatz der Systeme steigern. In einer Ausführungsform berücksichtigt die Steuerung beispielsweise nur Peaks mit einer Intensität von größer oder gleich 50% des intensivsten Vorläufer-ionen-Peaks in den Vorläufer-ionen-Massenspektrometriedaten. In einem Gesichtspunkt berücksichtigt die Steuerung nur Peaks mit einer Intensität von größer oder gleich 25% des intensivsten Vorläuferionen-Peaks in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten berücksichtigt. In einem anderen Gesichtspunkt berücksichtigt die Steuerung nur Peaks mit einer Intensität von größer oder gleich 10% des intensivsten Vorläuferionen-Peaks in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten berücksichtigt. In einem Gesichtspunkt berücksichtigt die Steuerung nur Peaks mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von größer als 10 zu 1. In einem anderen Gesichtspunkt berücksichtigt die Steuerung nur Peaks mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von größer als 4 zu 1. In einem weiteren Gesichtspunkt berücksichtigt die Steuerung nur Peaks mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von größer als 2 zu 1. In einem Gesichtspunkt berücksichtigt die Steuerung nur Peaks mit einem Isotopenhäufigkeitsmuster, welches auf eine ionische Spezies hindeutet.
• Die Steuerung kann die Ionenoptiken und die Ionendetektoren steuern, um die Genauigkeit, die Empfindlichkeit und/oder den Durchsatz der hierin beschriebenen Systeme zu steigern. In einem Gesichtspunkt dieser Ausführungsform analysiert die Steuerung nur Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten für Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, welche auf eine einzige Vorläuferspezies hindeuten. In einer verwandten Ausführungsform verwirft die Steuerung weiter Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, für welche das Interferenzverhältnis größer als der ausgewählte Wert ist. In einem Gesichtspunkt steuert die Steuerung die Ionenoptiken und die Ionendetektoren derart, dass Produkt-Ionen verworfen werden, bei denen der Betrag/Anteil an Interferenz größer als der ausgewählte Wert ist.
• Die hierin beschriebenen Systeme können konfiguriert werden, um einen weiten Bereich von Vorläuferionenmassen abzudecken. In einem Gesichtspunkt dieser Ausführungsform steuert die Steuerung beispielsweise die Ionenoptiken und die Ionendetektoren derart, dass die Schritte (e)–(f) für wenigstens einen Teil der Vorläuferionen-Peaks in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten wiederholt werden. In einem Gesichtspunkt steuert die Steuerung die Ionenoptiken und die Ionendetektoren derart, dass die Schritte (c)–(f) für im Wesentlichen alle Vorläuferionen-Peaks in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten wiederholt werden.
• Die Auswahl des Bereichs von m/z-Einheiten ist wichtig, um sowohl die Empfindlichkeit zu erhöhen als auch die Interferenz von Nicht-Vorläuferionen zu verringern. Falls der Bereich von m/z-Einheiten zu eng ist, wird die Empfindlichkeit des Verfahrens verringert; falls der Bereich zu breit ist, wird die Interferenz erhöht. In einem Gesichtspunkt dieser Ausführungsform steuert die Steuerung die Ionenoptiken und die Ionendetektoren derart, dass der m/z-Bereich angepasst wird, so dass der Betrag/Anteil an Interferenz im m/z-Bereich kleiner als der ausgewählte Wert ist. In einem Gesichtspunkt beträgt der Bereich von m/z-Einheiten 0,01 bis 5 m/z-Einheiten. In einem weiteren Gesichtspunkt beträgt der Bereich von m/z-Einheiten 0,01 bis 2 m/z-Einheiten.
• Vorläuferionen können unter Verwendung einer großen Auswahl von Ionisationstechniken und Ionenquellen erzeugt werden. In einer Ausführungsform ist die Ionenquelle beispielsweise eine Elektrospray-Ionisationsquelle oder eine MALDI-Quelle.
• Die hierin beschriebenen Systeme und Verfahren sind zur Analyse einer großen Auswahl von Analyten von Nutzen. In einer Ausführungsform umfasst der Analyt beispielsweise Proteine oder Peptide. In einem Gesichtspunkt umfasst der Analyt phosphorylierte Proteine oder Peptide. In einem anderen Gesichtspunkt umfasst der Analyt kotranslational modifizierte Proteine oder Peptide. In einem Gesichtspunkt umfasst der Analyt posttranslational modifizierte Proteine oder Peptide. In einem weiteren Gesichtspunkt umfasst der Analyt kleine Moleküle, pharmazeutische Verbindungen, Oligonukleotide oder Zucker. In einem anderen Gesichtspunkt umfasst der Analyt isobar markierte Proteine oder Peptide.
• In einer Ausführungsform umfasst der Analyt beispielsweise Proteine oder Peptide und der Analyt wird analysiert, um die Menge an Proteinen oder Peptiden in der Analyten zu quantifizieren. In einem anderen Gesichtspunkt umfasst der Analyt ein oder mehrere Proteine. In einem Gesichtspunkt werden das eine oder die mehreren Proteine verdaut. In einem weiteren Gesichtspunkt sind die hierin beschriebenen Verfahren und Systeme zur Identifizierung von Peptiden von Nutzen, welche dem einen oder den mehreren Proteinen entsprechen. In einem Gesichtspunkt sind die hierin beschriebenen Verfahren und Systeme zur Bestimmung von Mengen des einen oder mehreren Proteine von Nutzen. In einem Gesichtspunkt sind die hierin beschriebenen Verfahren und Systeme zur Bestimmung einer Zusammensetzung des einen oder der mehreren Proteine von Nutzen. In einem Gesichtspunkt sind die hierin beschriebenen Verfahren und Systeme zur Bestimmung einer posttranslationalen Modifizierung des einen oder der mehreren Proteine von Nutzen. In einer verwandten Ausführungsform deuten das eine oder die mehreren Proteine auf einen Krankheitszustand hin.
• Mit den hierin beschriebenen Systemen und Verfahren kompatible Analyten können verarbeitet sein. In einer Ausführungsform wird der Analyt beispielsweise vor dem Erzeugen der Verteilung von Vorläuferionen aus dem Analyten fraktioniert.
• Die hierin beschriebenen Verfahren können auf einer großen Auswahl von Geräten durchgeführt werden. In einer Ausführungsform können die Verfahren beispielsweise in einem Tandem-Massenspektrometergerät oder einem Multistufen-Massenspektrometergerät umgesetzt werden.
• KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
• 1 stellt Quantifizierungsergebnisse für ein Protein bereit, von dem bekannt ist, dass es in der Y-Achsen-Zelllinie im Vergleich zur X-Achsen-Zelllinie hinaufreguliert ist: humanes Histon H4. Die blauen Datenpunkte sind jene, die weniger als 25% Interferenz aufweisen – wenn sie alleine analysiert werden (blaue angepasste Linie), zeigen sie eine ~5-fache Hinaufregulation mit guter Korrelation (R² = 0,86). Wenn alle Datenpunkte ungeachtet der Interferenz analysiert werden (violette angepasste Linie), wird nur eine ~2-fache Hinaufregulation beobachtet, und mit verhältnismäßig schlechter Korrelation (R² = 0,44). Wenn nur die roten Datenpunkte mit hoher Interferenz allein analysiert werden (rote angepasste Linie), zeigen sie eine ~1,5-fache Hinaufregulation aufgrund der Tatsache, dass das mittlere Proteinverhältnis 1:1 ist.
• 2 stellt Daten aus der iTRAQ-Reporter-Region für zwei in 1 eingezeichnete Spektren bereit, eines mit 9% Interferenz (Feld A), das wie erwartet einen hohen Grad an Hinaufregulation zeigt (m/z-114-Peak ist viel intensiver als m/z 115), im Vergleich zu einem Spektrum mit 73% Interferenz (Feld B), wo Herabregulation vorliegt.
• 3 stellt ein Beispiel eines Abschnitts eines MS¹-Spektrums mit einem zur Fragmentierung ausgewählten Vorläufer (Ladungszustand +2) in Blau und zwei Interferenzspezies in Rot (beide Ladungszustand +3) bereit.
• 4 stellt einen Graphen bereit, welcher die Auswirkungen von Interferenz auf den dynamischen Protein-Bereich und die Genauigkeit zeigt. Eine extrahierte Menge von „Goldstandard”-Proteinen mit einer Quantifizierung mit hoher Verlässlichkeit und geringer Interferenz wurde verwendet, um die Referenzproteinveränderung zu bestimmen. Die Veränderung des Proteinverhältnisses, wurde untersucht während Spektren mit fortschreitend höheren Interferenzniveaus hinzugefügt wurden (rote Serie). Der Trend ist besonders für stark hoch- oder herabregulierte Proteine (blaue Serie) offensichtlich, bei denen ~70% der Veränderung verloren geht, wenn keine Interferenzfilterung durchgeführt wird. Interferenz führt auch zu einer schlechteren Quantifizierungspräzision, wie durch die wachsenden Fehlerbalken bei zunehmender Interferenz gezeigt wird.
• 5 stellt Graphen bereit, welche Vorläufer-Interferenz in LC-MS/MS zeigen. Feld (A) stellt einen Graphen bereit, welcher ein Beispiel eines Vorläufers aus einem komplexen MS¹-Scan mit gemischten störenden Spezies zeigt. Feld (B) stellt einen Graphen bereit, der Interferenzniveaus für 130.303 Vorläufer bei verschiedenen Isolierungsfensterbreiten zeigt.
• 6 stellt Graphen bereit, welche die Auswirkungen von Vorläufer-Interferenz auf die Proteinquantifizierung zeigen. Feld (A) stellt einen Graphen bereit, welcher einen verringerten dynamischen Bereich und eine verringerte Präzision in Abhängigkeit von der Vorläufer-Interferenz zeigt, wie durch Vergleich mit „Goldstandard”-Proteinen mit minimaler Interferenz und somit verlässlicher Quantifizierung beurteilt. Die Felder (B) und (C) stellen Graphen bereit, welche einen Vergleich eines einzelnen Proteins zeigt, der Condensin-Komplex-Untereinheit 1 zeigen, welches das in ES-Zellen hinaufreguliert wird und welches ohne bzw. mit QuantMode quantifiziert wurde.
• 7 stellt Graphen bereit, welche die Vorteile von QuantMode zeigen. Feld (A) stellt einen Graphen bereit, der PSMs zeigt, welche für 19 LC-MS/MS-Analysen von SCX-Fraktionen ohne und mit QuantMode identifiziert und quantifiziert wurden. Feld (B) stellt einen Graphen bereit, welcher Peptide zeigt, welche für 19 LC-MS/MS-Analysen von SCX-Fraktionen ohne und mit QuantMode identifiziert und quantifiziert wurden. Feld (C) stellt einen Graphen bereit, welcher Proteine zeigt, welche für 19 LC-MS/MS-Analysen von SCX-Fraktionen ohne und mit QuantMode identifiziert und quantifiziert wurden. Obgleich die Identifizierungen geringfügig abnehmen, steigen die Quantifizierungen erheblich an.
• AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
• Unter Bezugnahme auf die Zeichnungen weisen gleiche Ziffern auf gleiche Elemente hin und dieselbe Nummer, die in mehr als einer Zeichnung vorkommt, bezieht sich auf dasselbe Element. Im Allgemeinen haben die hierin verwendeten Begriffe und Ausdrücke ihre in der Technik anerkannten Bedeutungen, welche durch Bezugnahme auf Standardtexte, Fachblattquellen und Zusammenhänge, die Fachmännern bekannt sind, gefunden werden können. Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um ihre spezifische Verwendung im Zusammenhang der Erfindung zu verdeutlichen.
• Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „Produkt-Ion” und „sekundäres Ion” in der vorliegenden Beschreibung austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Ion, welches während eines Fragmentierungsprozesses eines Vorläuferions produziert wird. Der Begriff „sekundäres Produkt-Ion” bezieht sich, wie hierin verwendet, auf ein Ion, bei dem es sich um das Produkt aufeinander folgender Fragmentierungen handelt.
• Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Analyse” auf einen Prozess zur Bestimmung einer Eigenschaft eines Analyten. Analyse kann beispielsweise die physikalischen Eigenschaften von Analyten feststellen, wie Massen- oder atomare oder Substituentenzusammensetzung.
• Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Analyt” auf eine Verbindung oder Zusammensetzung, welche der Gegenstand einer Analyse ist. Analyten beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Proteine, Peptide, kleine Moleküle, pharmazeutische Verbindungen, Oligonucleotide und Zucker.
• Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Ionenquelle” auf eine Gerätekomponente, welche Ionen aus einer Probe produziert. Beispiele von Ionenquellen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Elektrospray-Ionisationsquellen und matrixgestützte Laserdesorptions-/-ionisierungsquellen (MALDI-Quellen).
• Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Massenspektrometrie” auf eine Analysetechnik zur Bestimmung der elementaren Zusammensetzung eines Analyten. Massenspektrometrietechniken sind zur Aufklärung der chemischen Strukturen von Analyten, wie Peptiden und anderen chemischen Verbindungen, von Nutzen. Das Massenspektrometrieprinzip besteht im Ionisieren von Analyten, um geladene Spezies oder Speziesfragmente zu erzeugen, und Messen von ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen. Die Durchführung einer massenspektrometrischen Analyse eines Analyten führt zur Erzeugung von Massenspektrometriedaten, welche mit den Masse-zu-Ladung-Verhältnissen des Analyten und Analytfragmenten zusammenhängen. Massenspektrometriedaten, die einem Analytion und Analytionenfragmenten entsprechen, werden in Masse-zu-Ladung-Einheiten (m/z-Einheiten) dargereicht, welche die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Analytionen und/oder Analytionenfragmente darstellen.
• Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Interferenz” auf eine Spezies, welche in einer Analyse nachgewiesen wird und welche den Nachweis einer Spezies oder eines Analyten von Interesse stört. Interferenz kann sich auf den Nachweis eines Proteins oder Proteinfragments beziehen, welches kein Protein oder Proteinfragment von Interesse ist und welches den genauen Nachweis oder die genaue Quantifizierung des Proteins oder Peptidfragments von Interesse stört. Interferenz kann als ein Interferenzverhältnis quantifiziert werden, wie ein Verhältnis eines Betrags/Anteils eines Interferenzsignals zu einem Betrag/Anteil eines Analytsignals. In einer Massenspektralanalyse kann sich Interferenz als ein Interferenz-Peak manifestieren, welcher dem Nachweis einer Spezies entspricht, bei der es sich nicht um einen Analyten von Interesse handelt.
• Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Signal-Rausch-Verhältnis” auf eine Maßeinheit, welche quantifiziert, wie stark ein Signal von Rauschen oder einem unerwünschten Signal verschlechtert wird. Er kann sich auch auf das Verhältnis von Signalleistung zur Rauschleistung, welche das Signal verschlechtert, beziehen. Ein Verhältnis, welches höher als 1:1 ist, weist auf mehr Signal als Rauschen hin und ist für einige Anwendungen wünschenswert.
• Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Masse-zu-Ladung-Verhältnis” auf das Verhältnis der Masse einer Spezies zum Ladungszustand einer Spezies. Der Begriff „m/z-Einheit” bezieht sich auf eine Maßeinheit des Masse-zu-Ladung-Verhältnisses. Die Thomson-Einheit (als Th abgekürzt) ist ein Beispiel einer m/z-Einheit und ist als absoluter Wert des Verhältnisses der Masse eines Ions (in Dalton) zur Ladung des Ions (bezüglich der Elementarladung) definiert.
• Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Ionenoptik” auf eine Gerätekomponente, welche den Transport und die Manipulation geladener Teilchen, beispielsweise Ionen, durch Anlegen von elektrischen und/oder Magnetfeldern unterstützt. Das elektrische oder Magnetfeld kann statisch oder wechselnd sein oder kann sowohl statische als auch Wechselkomponenten enthalten. Ionenoptische Gerätekomponenten beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Ionendeflektoren, welche Ionen ablenken, Ionenlinsen, welche Ionen fokussieren, und Multipole (wie Quadrupole), welche Ionen auf einen spezifischen Raum oder eine spezifische Trajektorie begrenzen. Zu Ionenoptiken zählen Multipol-RF-Gerätekomponenten, welche mehrere Stäbe enthalten, welche sowohl statische elektrische und/oder Magnetfelder als auch elektrische und/oder Magnetwechselfelder aufweisen.
• Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Massenspektrometer” auf ein Gerät, welches Ionen aus einer Probe erzeugt, welche Ionen nach der Masse trennt und die Masse und Häufigkeit der Ionen erfasst. Massenspektrometer beinhalten Mehrstufen-Massenspektrometer, welche die massegetrennten Ionen fragmentieren und die Produkt-Ionen einmal oder mehrere Male nach Masse trennen. Zu Mehrstufen-Massenspektrometern zählen Tandem-Massenspektrometer, welche die massegetrennten Ionen fragmentieren und die Produkt-I-onen einmal nach Masse trennen.
• Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Krankheitszustand” auf eine Erkrankung, welche bei einem Patienten Schmerzen, eine Funktionsstörung, Leiden, soziale Probleme und/oder den Tod verursachen kann. Hierin beschriebene Verfahren und Systeme können zur Diagnose eines Krankheitszustands von Nutzen sein.
• Die Begriffe „Peptid” und „Polypeptid” werden in der vorliegenden Beschreibung gleichbedeutend verwendet und beziehen sich auf eine Klasse von Verbindungen, die sich aus Aminosäureresten zusammensetzen, welche durch Amidbindungen (oder Peptidbindungen) chemisch miteinander gebunden sind. Peptide und Polypeptide sind polymere Verbindungen, welche mindestens zwei Aminosäurereste oder modifizierte Aminosäurereste umfassen. Modifizierungen können natürlich vorkommend oder nicht natürlich vorkommend sein, wie Modifizierungen, welche durch chemische Synthese erzeugt werden. Modifizierungen von Aminosäuren in Peptiden beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Phosphorylierung, Glykosylierung, Lipidierung, Prenylierung, Sulfonierung, Hydroxylierung, Acetylierung, Methylierung, Methioninoxidation, Alkylierung, Acylierung, Carbamylierung, Iodierung und die Zugabe von Kofaktoren. Peptide beinhalten Proteine und beinhalten weiterhin Zusammensetzungen, welche durch Abbau von Proteinen erzeugt werden, beispielsweise durch proteolytischen Verdau. Peptide und Polypeptide können durch im Wesentlichen vollständigen Verdau oder partiellen Verdau von Proteinen erzeugt werden. Zu Polypeptiden zählen beispielsweise Polypeptide, welche 1 bis 100 Aminosäureeinheiten, gegebenenfalls für einige Ausführungsformen 1 bis 50 Aminosäureeinheiten und gegebenenfalls für einige Ausführungsformen 1 bis 20 Aminosäureeinheiten umfassen.
• „Protein” bezieht sich auf eine Klasse von Verbindungen, welche ein oder mehrere Polypeptidketten und/oder modifizierte Polypeptidketten umfassen. Proteine können durch natürlich vorkommende Prozesse modifiziert werden, wie posttranslationale Modifizierungen oder kotranslationale Modifizierungen. Beispielhafte posttranslationale Modifizierungen oder kotranslationale Modifizierungen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Phosphorylierung, Glykosylierung, Lipidierung, Prenylierung, Sulfonierung, Hydroxylierung, Acetylierung, Methylierung, Methioninoxidation, die Zugabe von Kofaktoren, Proteolyse und Zusammenfügen von Proteinen zu makromolekularen Komplexen. Die Modifizierung von Proteinen kann auch nicht natürlich vorkommende Derivate, Analoga und funktionelle Mimetika beinhalten, welche durch chemische Synthese erzeugt werden. Zu beispielhaften Derivaten zählen chemische Modifizierungen, wie Alkylierung, Acylierung, Carbamylierung, Iodierung oder eine beliebige Modifizierung, welche das Protein derivatisiert.
• Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Steuerung” auf eine Gerätekomponente, welche zur Steuerung eines Geräts oder Systems programmiert werden kann, wie in der Technik wohl bekannt ist. Steuerungen können beispielsweise, wie hierin beschriebenen, zur Steuerung von Massenspektrometersystemen programmiert werden. Steuerungen können beispielsweise zur Ausführung von Ionenmanipulations- und Probenanalyseverfahren, wie hier beschrieben, auf wie hier in beschriebenen Systemen und Geräten programmiert werden.
• Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „fraktioniert” oder „fraktionieren” auf die physikalische Trennung einer Probe, wie in der Technik wohl bekannt ist. Eine Probe kann gemäß physikalischen Eigenschaften, wie Masse, Länge oder Affinität für eine andere Verbindung, unter anderem unter Anwendung von Chromatographietechniken, wie sie in der Technik wohl bekannt sind, fraktioniert werden. Die Fraktionierung kann in einer Trennstufe erfolgen, welche dahingehend wirkt, dass eine Probe von Interesse nach einer oder mehreren physikalischen Eigenschaften fraktioniert wird, wie in der Technik wohl bekannt ist. Trennstufen können nebst anderen Techniken Flüssig- und Gaschromatographietechniken einsetzen. Trennstufen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Flüssigchromatographietrennsysteme, Gaschromatographietrennsysteme, Affinitätschromatographietrennsysteme und Kapillarelektrophoresetrennsysteme.
• Beispiel 1: VERFAHREN ZUR ERFASSUNG VON MASSENSPEKTROMETRIEDATEN IN ECHTZEIT ZUR VERBESSERTEN PROTEINQUANTIFIZIERUNG MIT ISOBAR MARKIERTEN PEPTIDEN
• Einleitung
• Bei der isobaren Markierung handelt es sich um ein wichtiges quantitatives Verfahren, da es das Multiplexen ermöglicht und direkt auf klinische Proben anwendbar ist. Eine signifikante Fehlerquelle tritt jedoch auf, wenn ein anderes eluierendes Peptidion einen m/z-Wert aufweist, welcher sehr nahe dem des ausgewählten Vorläufers liegt (~50%, unsererseits). Das Ergebnis ist die Isolierung beider Spezies, welche dementsprechend gemeinsam dissoziiert werden, um ein zusammengesetzes MS/MS-Spektrum zu ergeben. Die resultierenden Reporterionenverhältnisse spiegeln die relativen Häufigkeiten beider PePtide nicht genau wider; wodurch sowohl die Präzision als auch der dynamische Bereich der Quantifizierung eingeschränkt wird, da das mittlere Peptidverhältnis nahe 1:1 liegt. Hier beschreiben wir eine Erfassungsstrategie, weLche die Sammlung von Tandem-Massenspektren von koisolierten Vorläufern verhindert.
• Verfahren
• Wir haben eine Datenerfassungsstrategie entwickelt, welche „QuantMode” genannt wurde und welche eine spontane Analyse der Vorläuferreinheit in den Hochauflösungs-MS1-Orbitrap-Daten durchführt, bevor sie mit der Fragmentierung fortfährt. Dieser zusätzliche Schritt in der datenabhängigen Vorläuferauswahllogik wurde in der Gerätefirmware eines LTQ Orbitrap Velos von Thermo Scientific implementiert. Wir haben diesen Ansatz an Ganzzelllysaten von humanen embryonalen H1-Stammzellen (H1-ES-Zellen), H9-ES-Zellen, induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) und neonatalen Vorhautfibroblasten (NFF) getestet. Diese Proben wurden separat mit Trypsin verdaut und mit vier unterschiedlichen iTRAQ-4-plex-Markern markiert. Die Peptide wurden kombiniert und mittels LC-MS/MS analysiert, wobei ein datenabhängiges Top-10-HCD-Verfahren angewendet wurde.
• Für jeden Vorläuferkandidaten berechnen wir zuerst unser Fenster von Interesse um den Vorläufer herum im MS^1-Massenspektrum, indem das Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z) des aktuellen Vorläufers genommen und die Hälfte der benutzerspezifizierten Vorläuferisolierungsfensterbreite (in der Regel 3,6 m/z für eine 3-m/z-Isolierung) addiert und subtrahiert wird. Wir rufen dann eine Gerätefirmwarefunktion auf, welche den n-ten intensivsten Peak innerhalb dieses Fensters zurückliefert. Während Peaks noch immer in dem Fenster verfügbar sind, erlangen wir das m/z und die Intensität des nächsten Intensivsten. Wir berechnen die Massendifferenz zu dem Vorläufer, indem wir das aktuelle m/z minus des Vorläufer-m/z nehmen und dann mit der Ladung multiplizieren. Wir gleichen auf die Möglichkeit ab, dass es ein Isotopenpeak des Vorläufers ist, indem diese Massendifferenz durch den erwarteten Isotopenabstand (die Masse eines C-13-Isotops minus eins C-12-Isotops, 1,00335 Da) dividiert wird, wobei auf die nächste ganze Zahl gerundet wird, mit dem erwarteten Isotopenabstand multipliziert wird und dieser Wert von der Massendifferenz subtrahiert wird. Wir nennen diesen Wert den angepassten Massenfehler. Dieser wird dann in Einheiten von Teilen pro Million (ppm) umgewandelt, indem durch die ungefähre Vorläufermasse (Vorläufer-m/z mal Ladung) dividiert und mit einer Million multipliziert wird.
• Wenn der absolute Wert des angepassten Massenfehlers kleiner als oder gleich der benutzerspezifizierten Massenfehlertoleranz (in der Regel +/–25 ppm) ist, urteilen wir, dass dieser Peak ein Vorläufer-Peak ist. Wenn seine Intensität größer als die des intensivsten Vorläufer-Peaks ist, welcher bisher beobachtet wurde, stellen wir eine Vorläuferintensitätsvariable auf seine Intensität ein. Wenn der absolute Wert des ppm-Massenfehlers größer als die Massentoleranz ist, prüfen wir, ob die Intensität größer als die des intensivsten Interferenz-Peaks ist, der bisher beobachtet wurde. Wenn dies der Fall ist, stellen wir eine Interferenzintensitätsvariable auf seine Intensität ein.
• Dieser Vorgang wird für jeden Peak innerhalb des Fensters von Interesse fortgesetzt. Nachdem jeder Peak ausgeschöpft wurde, berechnen wir die Vorläuferinterferenz als die maximale Verunreinigungsintensität dividiert durch die maximale Vorläuferintensität. Wenn dieser Wert größer als der benutzerspezifiziert Schwellenwert (in der Regel 0,25) ist, überspringen wir diesen Vorläufer; andernfalls wird die Analyse dieses Vorläufers normal fortgesetzt.
• Vorläufige Daten
• Wir erlangten dreifache nLC-MS/MS-Analysen des H1/H9/iPS/NFF-Peptid-Gemischs für jeden der drei Modi: QuantMode deaktiviert, QuantMode aktiviert und QuantMode-Steuerung (wobei Berechnungen durchgeführt, aber keine Vorläufer ausgesehlossen wurden). Die Anzahl von bei einer FDR von 1% identifizierten PSM für diese drei Strategien war 12.582 ± 208, 9752 ± 54 bzw. 12.554 ± 125. Dies übertrug sich in 7154 ± 185, 5202 ± 111 und 7062 ± 18 einzigartige Peptide. Ein Vergleich der Durchläufe mit deaktivierter QuantMode und QuantMode-Steuerung demonstriert, dass die QuantMode-Berechnungen keine statistisch signifikante Auswirkung auf den Arbeitszyklus haben. Die Durchläufe mit aktivierter QuantMode identifizierten aufgrund der niedrigeren Gesamtzahl erfasster Tandem-Massenspektren zuversichtlich 22% weniger PSM und 27% weniger einzigartige Peptide als bei deaktivierter QuantMode. Für die Durchläufe mit deaktivierter QuantMode waren jedoch 69% der Spektren für die Quantifizierung unbrauchbar, da sie Vorläufer-Interferenz von größer als 25% enthielten, wodurch sich nur 3944 ± 46 quantifizierbare PSM ergaben. In den Durchläufen mit aktivierter QuantMode waren alle 9752 PSM quantifizierbar – eine Zunahme von 147% gegenüber den Durchläufen mit deaktivierter QuantMode. Im Hinblick auf Proteine wurden 1617 ± 16, 1192 ± 44 bzw. 1618 ± 14 bei einer FDR von 1% für die drei Strategien identifiziert. Obwohl die Anzahl der identifizierten Proteine mit aktivierter QuantMode um 26% abnahm, führten die Durchläufe mit deaktivierter QuantMode wiederum zu einem signifikanten Verlust quantifizierbarer Proteine: 53% auf 759 ± 15. Im Gegensatz dazu war bei aktivierter QuantMode jedes einzelne Protein der nachgewiesenen 1192 quantifizierbar – eine Zunahme von 57%. Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass, wenn Quantifizierung Priorität genießt, QuantMode massive Anstiege der Anzahl quantifizierbarer Spektren und Proteine aus Versuchen mit isobarer Markierung liefert.
• Beispiel 2: VERSUCHSDETAILS
• Zellwachstum und -lyse
• Humane embryonale Stammzellen (Linien H1 und H9) und induzierte pluripotente Zellen (Linie DF-19-9-7T, siehe J. Y. Yu; K. J. Hu; K. Smuga-Otto; S. L. Tian; R. Stewart; Il Slukvin; J. A. Thomson, Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science 2009, 324, (5928), 797–801) wurden in einem Feeder-unabhängigen System gehalten, wie zuvor beschrieben [siehe T. E. Ludwig; V. Bergendahl; M. E. Levenstein; J. Y. Yu; M. D. Probasco; J. A. Thomson, Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods 2006, 3, (8), 637–646]. Alle ES- und iPS-Zelllinien wurden vor den Versuchen unter Anwendung von Standard-G-Barding-Chromosom-Analyse karyotypisiert (Cytogenetics Research Lab, WiCell Research Institute, Madison, WI, USA). Bei Erreichen einer Konfluenz von 70% wurden die Zellen enzymatisch unter Verwendung von Dispase (Invitrogen) bei einem Teilungsverhältnis von 1:4 passagiert. Humane neonatale Vorhautfibroblasten (Kat.-Nr. CRL-2097^TM, ATCC) wurden im Wesentlichen gemäß ATCC-Empfehlungen kultiviert. Kurz gesagt, die Zellen wurden in 10%-igem FBS (Hyclone Laboratories Incorporated), 1 mM L-Glutamin (Invitrogen), 0,1 mM Beta-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) und 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren in DMEM (beide von Invitrogen) gehalten. Bei einer Konfluenz von etwa 70% wurden die Zellen bei einem Teilungsverhältnis von 1:3 unter Verwendung von Tryp-LE (Invitrogen) passagiert.
• Alle Zellen wurden durch Vereinzelung für 10 Minuten mit einem passenden Volumen von vorgewärmtem (37°C) 0,05%-igen Tryp-LE, um die Kulturoberfläche zu bedecken, geerntet. Nach der Zellablösung wurde ein äquivalentes Volumen von entweder eiskaltem Wachstumsmedium im Fall von Fibroblastzellen oder eiskalter DPBS (Invitrogen) im Fall von ES-Zellen zugegeben, bevor die Zellen gesammelt wurden. Die Zellpellets wurden anschließend zweimal in eiskalter PBS gewaschen und bei –80°C gelagert. Ungefähr 10⁸ Zellen wurden für jede Analyse gesammelt.
• Die Proben wurden mittels Beschallung in Lysepuffer lysiert, der 40 mM NaCl, 50 mM Tris, 2 mM MgCl₂, 50 mM NaF, 50 mM b-Glyceraldehydphosphat, 1 mM Natriumorthovanadat, 10 mM Natriumpyrophosphat, 1 Mini-EDTA-freien Protease-Inhibitor (Roche Diagnostics) und 1 phosSTOP-Phosphatase-Inhibitor (Roche Diagnostics) enthielt.
• Verdau und iTRAQ-Markierung
• Cysteinreste wurden mit DTT reduziert, unter Verwendung von Iodacetamid alkyliert und in einem Zwei-Schritt-Verfahren verdaut. Proteinase Lyx-C (Wako Chemicals) wurde zugegeben (Enzym-Protein-Verhältnis = 1:100) und für ungefähr 2 Stunden bei 37°C in Lysepuffer inkubiert. Die Proben wurden dann mit 50 mM Tris, pH, verdünnt, bis die Harnstoffkonzentration 1,5 M war, und mit Trypsin (Promega) (Enzym-Protein-Verhältnis = 1:50) über Nacht bei 37°C verdaut. Die Reaktionen wurden unter Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA) gequencht. Die Proben wurden vollständig getrocknet und unter Verwendung von C18-Festphasenextraktionssäulen (SPE-Säulen) (SepPak, Waters) aufgereinigt. Die iTRAQ-Markierung wurde entsprechend den vom Hersteller bereitgestellten Protokollen durchgeführt. Kurz gesagt, die getrockneten Proben wurden in 34 μl Lösungspuffer resuspendiert. Die Marker wurden in 70 μl verdünnt. Um sicherzustellen, dass jede der vier Proben die gleiche Proteinmenge enthielt, wurde ein kleines 1:1:1:1-Aliquot hergestellt und mittels Massenspektrometrie analysiert. Summierte Reporterionenverhältnisse aus diesem Versuch wurden zum Mitteilen von Mischverhältnissen der verbliebenen markierten Verdaue verwendet. Nach dem Mischen wurden die Proben vollständig getrocknet und mittels Festphasenextraktion (SPE) aufgereinigt.
• Fraktionierung
• Die markierten Peptide wurden in starker Kationenaustauschpuffer (SCX-Puffer) A [5 mM KH₂PO₄, 30% Acetonitril (pH 2,65)] resuspendiert und auf eine Polysulfoethylaspartamid-Säule (9,4 × 200 mm; PolyLC) injiziert. Trennungen wurden unter Verwendung einer quaternären Pumpe Surveyor LC (Thermo Scientific) bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 3,0 ml/min durchgeführt. Der folgende Gradient wurde für die Trennung verwendet: 0–2 min, 100% Puffer A, 2–5 min, 0–15% Puffer B, 5–35 min, 15–100% Puffer B. Puffer B wurde für 10 Minuten auf 100% gehalten. Schließlich wurde die Säule vor der Neukalibrierung ausgiebig mit Puffer C und Wasser gewaschen. Die folgenden Puffer wurden verwendet: Puffer A [5 mM KH₂PO₄, 30% Acetonitril (pH 2,65)], Puffer B [5 mM KH₂PO₄, 30% Acetonitril, 350 mM KCl (pH 2,65)], Puffer C [50 mM KH₂PO₄, 500 mM KCl (pH 7,5)]. Die Proben wurden von Hand gesammelt und mittels SPE entsalzt.
• Massenspektrometrie
• Tandem-Massenspektrometrie wurde unter Verwendung eines NanoAcquity-UPLC-Systems (Waters) durchgeführt, welches mit einer dcQLT-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) gekoppelt war. Die Proben wurden auf eine Vorsäule (ID von 75 μm, mit 5 cm C18-Teilchen gepackt, Alltech) für 10 min bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 μm/min geladen. Die Proben wurden dann über eine analytische Säule (ID von 50 μm, mit 15 cm C18-Teilchen gepackt, Alltech) unter Verwendung eines linearen 120-min-Gradienten von 1% bis 35% Acetonitril mit 0,2% Ameisensäure und einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 nl/min eluiert. Weitere 30 min wurden zum Waschen und Äquilibrieren der Säulen aufgewendet. Das Säulenherstellungsverfahren wurde zuvor beschrieben [siehe G. C. McAlister; D. Phanstiel; C. D. Wenger; M. V. Lee; J. J. Coon, Analysis of Tandem Mass Spectra by FTMS for Improved Large-Scale Proteomics with Superior Protein Quantification. Analytical Chemistry 2010, 82, (1), 316–322].
• Allen Massenspektrometergeräteverfahren bestanden in einem MS¹-Scan (Auflösungsleistung = 60.000), gefolgt von datenabhängigen MSZ-Scans (Auflösungsleistung = 7500) der zehn intensivsten Vorläufer. Proteinidentifizierungsversuche verwendeten ausschließlich Beam-CAD (HCD) mit Orbitrap-Massenanalyse an. Einige Phosphopeptididentifizierungsversuche beinhalteten abwechselnde HCD- und ETD-MSZ-Scans. Jegliche mit ETD identifizierte Peptide wurden unter Anwendung des entsprechenden HCD-Scans quantifiziert. Einmal ausgewählte Vorläufer wurden für 60 s unter Verwendung eines Fensters von –0,55 Th bis 2,55 Tb auf eine Ausschlussliste gesetzt. Vorläufer mit nicht zugeordneten Ladungszuständen oder Ladungszuständen von Eins (und Zwei für ETD-Scans) wurden ebenfalls ausgeschlossen. AGC-Sollwerte waren 1.000.000 für die MS¹-Analyse und 50.000 für die Orbitrap-MS²-Analyse.
• Datenbanksuche und FDR-Analyse
• Peakinformationen wurden aus RAW-Dateien extrahiert und unter Verwendung von DTA Generator in eine durchsuchbare Textdatei gedruckt [siehe D. M. Good; C. D. Wenger; G. C. McAlister; D. L. Bai; D. F. Hunt; J. J. Coon, Post-Acquisition ETD Spectral Processing for Increased Peptide Identifications. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2009, 20, (8), 1435–1440]. Fragment-Ionen, welche mit den iTRAQ-Reagenzien in Zusammenhang standen, und geladene reduzierte Vorläufer wurden gelöscht. Der Open Mass Spectrometry Search Algorithm (OMSSA; Version 2.1.4) [siehe L. Y. Geer; S. P. Markey; J. A. Kowalak; L. Wagner; M. Xu; D. M. Maynard; X. Y. Yang; W. Y. Shi; S. H. Bryant, Open mass spectrometry search algorithm. Journal of Proteome Research 2004, 3, (5), 958–964] wurde zum Suchen von Spektren im Vergleich zur Humandatenbank des International Protein Index (IPI; http://www.ebi.ac.uk/IPI/), Version 3.57 [siehe P. J. Kersey; J. Duarte; A. Williams; Y. Karavidopoulou; E. Birney; R. Apweiler, The International Protein Index: An integrated database for proteomics experiments. Proteomics 2004, 4, (7), 1985–1988], mit voller Enzymspezifität verwendet. Eine Massentoleranz von ±4,5 Da wurde für den Vorläufer verwendet, während eine monoisotopische Massentoleranz von ±0,01 Da für Fragment-Ionen verwendet wurde. Wie vor kurzem gezeigt [siehe E. J. Hsieh; M. R. Hoopmann; B. Maclean; M. J. Maccoss, Comparison of Database Search Strategies for High Precursor Mass Accuracy MS/MS Data. J Proteome Res 2009], stellen die Durchführung von Datenbanksuchen mit weiten Vorläufertoleranzen und die Filterung während FDR-Berechnungen eine größere Identifizierungsempfindlichkeit bereit als die Durchführung von Suchen mit engen Vorläufertoleranzen. Carbamidomethylierung von Cysteinen, iTRAQ 4-plex am N-Terminus und iTRAQ 4-plex an Lysinen wurden als unveränderliche Modifizierungen festgelegt, während Oxidation von Methioninen und iTRAQ 4-plex an Tyrosinen als variable Modifizierungen festgelegt wurden. Es wurde eine False-Discovery-Rate-Analyse (FDR-Analyse) mit maßgeschneiderter Software durchgeführt, die Kombinationen von Erwartungswert-Score (e-value-Score) und Vorläufer-Massenfehler iterativ prüft, um Schwellenwerte zu finden, die eindeutige Peptid-Identifizierungen maximieren, während eine FDR von 1% erfüllt wird. Die Peptide wurden unter Befolgung von zuvor festgelegten Richtlinien in Proteine gruppiert [siehe A. I. Nesvizhskii; R. Aebersold, Interpretation of shotgun proteomic data – The Protein interference Problem. Molecular & Cellular Proteomics 2005, 4, (10), 1419–1440]. Peptidniveau-P-Scores für einzigartige Peptide, welche jedem Protein entsprachen, wurden multipliziert, um Protein-P--Scores zu erhalten. Die Proteine wurden mit diesem Score gefiltert, um eine FDR von 1% zu erzielen.
• Peptid- und Proteinquantifizierung
• iTRAQ-Quantifizierung wurde von maßgeschneiderter Software, TagQuant, durchgeführt. TagQuant ist in der Programmiersprache C# geschrieben. Reporterion-Intensitäten wurden extrahiert und mit Injektionszeiten multipliziert, um Zählwerte zu ermitteln. Eine Verunreinigungskorrektur wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [siehe I. P. Shadforth; T. P. J. Dunkley; K. S. Lilley; C. Bessant, i-Tracker: For quantitative proteomics using iTRAQ (TM). Bmc Genomics 2005, 6]. Die Intensitäten wurden standardisiert, so dass das Gesamtsignal von jedem Kanal (114, 115, 116 und 117) gleich war. Reporterion-Intensitäten für jeden Kanal wurden für alle Peptide in einem gegebenen Protein mit drei Ausnahmen summiert: (1) Scans, welche Peptiden entsprachen, welche in mehreren Proteingruppen gefunden wurden, wurden nicht zur Quantifizierung verwendet; (2) Peptide, von denen festgestellt wurde, dass sie phosphoryliert, acetyliert oder methyliert waren, wurden nicht zur Proteinquantifizierung verwendet und (3) wenn Peaks, welche nicht mit dem Vorläufer zusammenhingen, im MS¹-Scan innerhalb von +/–1,8 Tb des ausgewählten Vorläufers bei einer Intensität von größer als 25% des ausgewählten Vorläufers vorlagen, wurde der resultierende MS²-Scan nicht zur Quantifizierung verwendet.
• Beispiel 3: WEITERE VERSUCHSERGEBNISSE
• Tabelle Ex3_1 zeigt jeden Schritt der Berechnung jedes Peaks im Fenster als entweder ab Vorläufer oder Interferenz, berechnet dann die gesamte Vorläufer-Interferenz für die Vorläuferregion des MS¹-Spektrums in 3. Tabelle Ex3_1

  m/z (Th)	Intensität	Massendifferenz (Da)	Angepasste Massendifferenz (Da)	Angepasste Massendifferenz (ppm)	Klassifizierung
  584,34357	261.074,5	–3,01708	–0,01708	–14,57705768	Vorläufer
  584,61639	334.621,8	–2,47144	–0,47144	–402,3541026	Interferenz
  584,82275	433.377,2	–2,05872	–0,05872	–50,11503671	Interferenz
  584,85291	758.840,9	–1,9984	0,0016	1,365532335	Vorläufer
  584,95477	1.799.723,6	–1,79468	0,20532	175,2319369	Interferenz
  585,28955	1.777.294,4	–1,12512	–0,12512	–106,7846286	Interferenz
  585,54456	277.682,5	–0,6151	0,3849	328,4958724	Interferenz
  585,62378	1.120.313,1	–0,45666	–0,45666	–389,7399977	Interferenz
  585,81934	387.908,2	–0,06554	–0,06554	–55,93561829	Interferenz
  585,85211	10.112.623	0	0	0	Vorläufer
  585,95898	400.330,9	0,21374	0,21374	182,4180509	Interferenz
  586,31384	423.499,9	0,92346	–0,07654	–65,3236531	Interferenz
  586,35242	5.230.559	1,00062	0,00062	0,52914378	Vorläufer
  586,85449	2.352.339,8	2,00476	0,00476	4,062458698	Vorläufer
  586,87622	455.403,9	2,04822	0,04822	41,15373076	Interferenz
  586,99615	5.065.744,5	2,28808	0,28808	245,864097	Interferenz
  587,33136	4.521.541	2,9585	–0,0415	–35,41849495	Interferenz
  			Max. Interferenzintensität		5.065.744,5
  			Max. Vorläuferintensität		10.112.623
  			Interferenz		0,500932795

• 1 stellt Quantifizierungsergebnisse für ein Protein bereit, von dem bekannt ist, dass es in der Y-Achsen-Zelllinie im Vergleich zur X-Achsen-Zelllinie hinaufreguliert ist: humanes Histon H4. Die blauen Datenpunkte sind jene, welche weniger als 25% Interferenz aufweisen – wenn sie für sich analysiert werden (blaue angepasste Linie), zeigen sie eine ~5-fache Hinaufregulation mit guter Korrelation (R² = 0,86). Wenn alle Datenpunkte ungeachtet der Interferenz analysiert werden (violette angepasste Linie), wird nur eine ~2-fache Hinaufregulation beobachtet, und mit verhältnismäßig schlechter Korrelation (R² = 0,44). Wenn nur die roten Datenpunkte mit hoher Interferenz für sich analysiert werden (rote angepasste Linie), zeigen sie eine ~1,5-fache Hinaufregulation aufgrund der Tatsache, dass das mittlere Proteinverhältnis 1:1 ist.
• 2 stellt Daten aus der iTRAQ-Reporter-Region für zwei in 1 eingezeichnete Spektren bereit, eines mit 9% Interferenz (Feld A), welches wie erwartet einen hohen Grad an Hinaufregulation zeigt (m/z-114-Peak ist viel intensiver als m/z 115), im Vergleich zu einem Spektrum mit 73% Interferenz (Feld B), wo Herabregulation vorliegt.
• 3 stellt ein Beispiel eines Abschnitts eines MS¹-Spektrums mit einem zur Fragmentierung ausgewählten Vorläufer (Ladungszustand +2) in Blau und zwei Interferenzspezies in Rot (beide Ladungszustand +3) bereit.
• 4 stellt einen Graphen bereit, der die Auswirkungen von Interferenz auf den dynamischen Protein-Bereich und die Genauigkeit zeigt. Eine extrahierte Menge von „Goldstandard”-Proteinen mit einer Quantifizierung mit hoher Verlässlichkeit und geringer Interferenz wurde verwendet, um die Bezugsproteinveränderung zu bestimmen. Die Veränderung des Proteinverhältnisses, während Spektren mit fortschreitend höheren Interferenzniveaus hinzugefügt wurden (rote Serie), wurde untersucht. Der Trend ist für stark hoch- oder herabregulierte Proteine (blaue Serie) besonders offensichtlich, bei denen ~70% der Veränderung verloren geht, wenn keine Interferenzfilterung durchgeführt wird. Interferenz führt auch zu einer schlechteren Quantifizierungspräzision, wie durch die wachsenden Fehlerbalken bei zunehmender Interferenz gezeigt.
• Die Tabellen Ex3_2 bis Ex3_4 stellen Ergebnisse bereit, die eine aktivierte spontane Filterung („QuantMode an”) mit normaler Datenerfassung („QuantMode aus”) für drei separate Versuche vergleichen. Die bereitgestellten Informationen variieren geringfügig, die grundlegende Idee ist jedoch für alle drei gleich – bei spontaner Filterung geht ein kleiner, jedoch signifikante Prozentanteil von Peptidspektrum-Übereinstimmungen (PSM), Peptiden und Proteinen verloren. Dies wird jedoch von der Tatsache, dass bei aktivierter Echtzeit-Filterung nahezu alles quantifizierbar ist, mehr als wettgemacht. Tabelle Ex3_2

  	Replikat	PSM	Einzigartige Peptide	Quantifizierbare PSM	Proteine	Quantifizierbare Proteine
  QuantMode aus	1	12.449	7076	3924	1629	742
  	2	12.476	7021	3911	1599	768
  	3	12.822	7365	3996	1622	767
  	Mittelwert	12.582	7154	3944	1617	759
  	St.-Abw.	208	185	46	16	15
  QuantMode an	1	9718	5281	9718	1240	1240
  	2	9815	5249	9815	1181	1181
  	3	9724	5075	9724	1154	1154
  	Mittelwert	9752	5202	9752	1192	1192
  	St.-Abw.	54	111	54	44	44
  QuantMode-Steuerung	1	12.446	7041	3915	1606	752
  	2	12.691	7073	3882	1633	754
  	3	12.524	7073	4071	1615	769
  	Mittelwert	12.554	7062	3956	1618	758
  	St.-Abw.	125	18	101	14	9

  Tabelle Ex3_3

  	PSM	Quantifizierbare PSM	Peptide	Quantifizierbare Peptide	Proteine	Quantifizierbare Proteine
  QuantMode aus		59.954		28.281		4661
  	130.303		52.058		6173
  		(46,0%		(54,3%)		(75,5%)
  QuantMode an		114.236		45.686		5704
  	114.243		45.687		5704
  		(100,0%)		(100,0%)		(100,0%)
  	–16.060	+54.282	–6371	+17.405	–469	+1043
  (Diff.)
  	(–12,3%)	(+90,5%)	(–12,2%)	(+61,5%)	(–7,6%)	(+22,4%)

  Tabelle Ex3_4

  	Soll-PSM	Quantifizierbare Soll-PSM	Soll-Proteine	Quantifizierbare Soll-Proteine
  Kontrolle	7257	3041	1235	708
  Schwellenwert 0%	3261	3261	784	784
  Schwellenwert 5%	3935	3935	786	786
  Schwellenwert 10%	4474	4474	788	788
  Schwellenwert 15%	5076	5076	869	869
  Schwellenwert 20%	5789	5789	917	917
  	5988	5988	957	957
  Schwellenwert 25%
  	(–25,5%)	(+84,5%)	(–22,5%)	(+35,2%)
  Schwellenwert 50%	7330	3872	1197	793
  Schwellenwert 75%	7623	3318	1229	711
  Schwellenwert 100%	7068	2996	1136	642
  Schwellenwert unendlich	7080	2863	1203	646

• Beispiel 4: Datenerfassungsverfahren ermöglicht multiplexierte Proteinquantifizierung in großem Maßstab
• Wir beschreiben ein Datenerfassungsverfahren, den „QuantMode”-Algorithmus (oder „QuantMode”), welches den dynamischen Bereich der auf isobarer Markierung basierenden Proteinquantizierung verbessert. QuantMode mildert das tief greifende Problem der Vorläuferinterferenz – Koisolation von Verunreinigungen, welche die Quantifizierung verfälschen – mittels intelligenter Vorerfassungsgerätelogik. Die Anwendung auf ein Shotgun-Experiment ergab große Zunahmen an quantifizierbaren PSM (+91%), Peptiden (+65%) und Proteinen (+22%). Wir folgern, dass QuantMode die isobare Markierung zu einer brauchbaren Option für schnelle, multiplexierte quantitative Proteomik in großem Maßstab machen wird.
• Proteinidentifizierungsteclmologien haben sich schnell entwickelt, so dass der Aufbau von Katalogen der Tausende von Proteinen, die eine Zelle umfasst, unter Verwendung von Massenspektrometrie (MS) jetzt verhältnismäßig geradlinig ist [siehe L. M. F. de Godoy et al. Nature 455, 1251–1255 (2008); und D. L. Swaney, C. D. Wenger & J. J. Coon. J. Proteome Res. 9, 1323–1329 (2010)]. Zu wissen, wie die Häufigkeit diese Moleküle unter verschiedenen Umständen verändert, ist es nicht [siehe S. E. Ong & M. Mann. Nat. Chem. Biol. 1, 252–262 (2005)]. Eine Markierung mit stabilen Isotopen durch Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) stellt ein Mittel zur Erstellung von binären oder ternären Vergleichen bereit [siehe H. Jiang & A. M. English. J. Proteome Res. 1, 345–350 (2002); S. E. Ong et al. Mol. Cell. Proteomics 1, 376–386 (2002); und H. N. Zhu, S. Q. Pan, S. Gu, E. M. Bradbury & X. Chen. Rapid Commun. Mass Spectrom. 16, 2115–2123 (2002)]. Durch Verknüpfung dieser Zwei-Wege- oder Drei-Wege-Experimente können Vergleiche höherer Ordnung erzielt werden [siehe J. V. Olsen et al. Sci. Signal. 3, – (2010)]. Derartige multiplexierte Versuche in großem Maßstab sind von unschätzbarem Wert, da sie (1) die Messung von Zeitreihenversuchen ermöglichen, (2) die Sammlung von biologischen Replikaten ermöglichen und (3) einen direkten Vergleich von transkriptomischen und proteomischen Daten ermöglichen.
• Die Ausführung dieser Art einer vielschichtigen proteomischen Untersuchung ist jedoch ein mühsames Unternehmen und wurde in einer Handvoll von Versuchen von einer noch kleineren Gruppe von Forschern bewerkstelligt. Das erste Hindernis ist das Erfordernis, mehrere Gruppen von Zellen mit verschiedenen Markern zu züchten. Obgleich aufwändig ist dieser Schritt weniger einschränkend als das zweite Haupthindernis: Jeder binäre oder ternäre Satz muss separat analysiert werden. Bei Kombination mit der umfangreichen Fraktionierung, welche vor der Massenspektrometrie erforderlich ist, und dem Bedarf an technischen Replikaten erfordert ein Versuch in großem Maßstab mittels SILAC drei bis sechs Monate ständigen Gerätegebrauchs.
• Die isobare Markierung ist eine elegante Lösung dieses Problems, welche vor sieben Jahren eingeführt wurde [siehe A. Thompson et al. Anal. Chem. 75, 1895–1904 (2003), und P. L. Ross et al. Mol. Cell. Proteomics, 3, 1154–1169 (2004)] und eine relative Quantifizierung von bis zu acht Proteomen gleichzeitig ermöglicht [siehe L. Choe et al. Proteomics 7, 3651–3660 (2007)]. Trotz des Potenzials zur Ermöglichung schneller, multiplexierter quantitativer Proteomik wurde isobare Markierung nicht weithin für Untersuchungen in großem Maßstab angenommen [siehe R. Lu et al. Nature 462, 358 – U126 (2009)]. Vorläuferinterferenz – der Hauptnachteil dieser Technik – ist der Hauptgrund. Dieses Problem besteht bei SILAC nicht, da Abundanzmessungen in MS¹ durchgeführt werden. Selbst bei sehr komplexen Proben mit mehreren zehn bis Hunderten von koeluierenden Peptiden können Massenanalysatoren mit hoher Auflösungsleistung das Ziel (Target) von benachbarten Peaks, die weniger als 0,01 Th entfernt sind, leicht unterscheiden.
• Bei der isobaren Herangehensweise wird jedoch das Zielpeptid bei einer viel niedrigeren Auflösung, in der Regel 1–3 Th, isoliert und fragmentiert, um Reportermarker zu produzieren. Daher wird das quantitative Signal in der Reporterregion aus jeder Spezies in dem Isolationsfenster zusammengestellt [siehe S. Y. Ow et al. J. Proteome Res. 8, 5347–5355 (2009)], wie in 5, Feld (A), gezeigt. Bei hochkomplexen Gemischen, wie den in Versuchen in großem Maßstab analysierten, ist eine Koisolation mehrerer Spezies nicht die Ausnahme, sondern die Regel (siehe unten). Dieses Problem trägt den dynamischen Bereich ab, da gemessene Verhältnisse dazu tendieren, in Richtung des mittleren Verhältnisses von 1:1 komprimiert zu werden [siehe N. A. Karp et al. Mol. Cell. Proteomics (2010)], und hat folglich die Technik auf Anwendungen mit geringerer Probenkomplexität beschränkt.
• Um das Ausmaß des Vorläuferinterferenzproblems zu dokumentieren, verwendeten wir das handelsübliche iTRAQ-4-plex-Reagenz zum Vergleichen von vier Zelllinien: zwei humane embryonale Stammzelllinien (ES-Zelllinien; H1 und H9), eine induzierte pluripotente Stammzelllinie (iPS-Zelllinie) und deren Fibroblastvorläufer. Nach tryptischern Verdau und Markierung wurden die Gemische vereint, dann mittels starker Kationenaustauschchromatographie (SCX-Chromatographie) in 19 Pools aufgeteilt. Als Nächstes wurde jede Fraktion mittels nanoHPLC-MS/MS analysiert. Aus diesen Daten erhielten wir 130.303 Peptidspektrum-Übereinstimmungen (PSM) bei einer False-Discovery-Rate (FDR) von 1%. Für jede akzeptierte PSM untersuchten wir das vorhergehende MS¹-Spektrum und tabellarisierten das Ausmaß der Vorläuferinterferenz innerhalb verschiedener m/z-Fenster. Wie in 5, Feld (B), dargestellt, mit dem typischen 3-Th-Fenster, weist ungefähr die Hälfte aller identifizierten Vorläufer eine Interferenz von größer als 25% auf (die Definition von Interferenz ist im Folgenden angegeben). Eine Verschmälerung des Isolationsfensters verringert das Problem, selbst bei 1 Th überschreiten jedoch 30% der Vorläufer noch immer diesen Schwellenwert.
• Auf Basis der Bestätigung des weit verbreiteten Auftretens der Vorläuferinterferenz fragten wir uns als Nächstes, zu welchem Grad diese die quantitative Metrik verschlechtert. Die Standardstrategie zur Validierung von quantitativen Proteomiktechniken besteht darin, Proben mit unterschiedlichen Marker in bekannten Verhältnissen zu kombinieren. Diese Herangehensweise ist jedoch für die isobare Markierung nicht so aussagekräftig, da störende Spezies die gleiche Häufigkeitsverteilung wie das Ziel erzeugen.
• Stattdessen extrahierten wir aus dem ES/iPS/Fibroblasten-Datensatz eine Menge von „Goldstandard”-Proteinen. Diese 875 Proteine wurden mit mindestens 5 PSM und 3 einzigartigen Peptiden quantifiziert, welche alle weniger als 5% Vorläuferinterferenz aufwiesen. Wir nahmen an, dass die mit diesen strengen Anforderungen bestimmte Proteinquantifizierung der wahre Wert war. Wir untersuchten dann die Auswirkung der Zugabe von PSM mit fortschreitend höheren Vorläuferinterferenzniveaus auf die beobachtete Proteinquantifizierung für diese „Goldstandards”, wie in 2, Feld (A), gezeigt.
• Aus diesen Daten sind zwei verschiedene Trends offensichtlich. Erstens zeigen die Fehlerbalken, die sich mit zunehmender Interferenz ausweiten, eine Verringerung der quantitativen Präzision. Diese Beobachtung gilt sowohl für die gesamte Menge von 875 Proteinen (ausgefüllte Quadrate oben) als auch die Teilmenge von 101 Proteinen, die sich um das 5-fache oder mehr verändern (ausgefüllte Kreise unten). Zweitens ist eine drastische Verringerung des dynamischen Bereichs. Dieser Trend ist in der stark regulierten Teilmenge am offensichtlichsten, welche einen Verhältnisfehler von nahezu 70% zeigt. Anders ausgedrückt, ein Protein, welches tatsächlich um das 5-fache hinaufreguliert ist, wird durchschnittlich als eine nur 1,5-fache Hinaufregulation gemessen werden – eine Veränderung, welche die meisten Filter nicht passieren würde. Wir folgern, dass Vorläuferinterferenz sowohl ein umfassendes Problem und ein primärer beitragender Faktor zu einer signifikanten, weit reichenden Abschwächung des dynamischen Bereichs zur isobaren Markierung ist.
• Auf Basis dieser vorliegenden Information begründeten wir, dass das Entfernen oder zumindest Einschränken des Vorläuferinterferenzproblems bei der isobaren Markierung einen direkten Weg zur schnellen, multiplexierten Proteinquantifizierung in großern Maßstab bieten würde. Die Verengung der Vorläuferisolationsbreite auf 0,1 Th oder weniger könnte den Großteil der Interferenz eliminieren; derartige Isolationen mit hoher Auflösung werden jedoch nicht routinemäßig angewendet. Die Verringerung der Breite unter ~2 Th kann für LC-MS/MS-Versuche problematisch sein, da sie verursacht, dass Komponenten auf niedrigem Niveau aufgrund von Raumladungseffekten ineffektiv isoliert werden. Anstelle von engeren Isolationen ist eine andere offensichtliche Lösung die Filterung nach der Datenerfassung. Das heißt, durch Untersuchung von MS¹-Spektren können Vorläufer mit hohen Interferenzniveaus verworfen werden [siehe Y. Zhang et al. Mol. Cell. Proteomics (2009)]. Diese Lösung führt jedoch zum Verlust eines inakzeptabel beträchtlichen Teils der MS/MS-Spektren: ~50%, wie in 5, Feld (B), gezeigt.
• Eine besser durchdachte Lösung besteht darin, die Erfassung von Tandem-Massenspektren zu verhindern, welche nicht in brauchbaren quantitativen Daten resultieren. Deren Durchführung würde mehr Zeit verschaffen, so dass das Massenspektrometer andere Spezies abtasten kann, insbesondere jene mit geringerer Abundanz. Um diese Strategie zu verfolgen, führten wir eine Echtzeit-Vorläuferreinheitsprüfung als einen zusätzlichen Schritt in der datenabhängigen Logik. Wir änderten den Gerätesteuercode, so dass während des automatischen Vorläuferauswahlvorgangs Vorläuferkandidaten mit einer Interferenz über einem spezifizierten Schwellenwert ausgemustert werden, bis ein geeigneter Ersatz gefunden wurde. Wir nennen diese Erfassungstechnik QuantMode. Auf diese Weise sollte das Gerät niemals ein MS/MS-Spektrum mit einer Interferenz über dem benutzerspezifizierten Schwellenwert erfassen.
• Ein Beispiel, welches aus einem Shotgun-Experiment genommen wurde, eines einzelnen Proteins, welches mit herkömmlichen Datenerfassungsverfahren quantifiziert wurde, ist in 6, Feld (B), bereitgestellt. Dieses Protein, Condensin-Komplex-Untereinheit 1, wird zur Chromosomkondensation während der Mitose benötigt und wird während der M-Phase hinaufreguliert [siehe J. V. Olsen et al. Sci. Signal. 3, – (2010)]. ES-Zellen proliferieren schneller als Fibroblastzellen und sind durch einen höheren Prozentanteil an Zellen in der M-Phase gekennzeichnet [siehe K. A. Becker, J. L. Stein, J. B. Lian, A. J. Van Wijnen & G. S. Stein. J. Cell. Physiol. 210, 517–526 (2007)]; folglich zeigen ES-Zellen höhere Expressionsniveaus dieses Proteins. Bei Quantifizierung unter Anwendung eines herkömmlichen Erfassungsverfahrens (ausgefüllte Quadrate rechts) zeigt das Protein jedoch kaum einen Unterschied hinsichtlich der relativen Häufigkeit zwischen den zwei Zelllinien, wobei sich eine Steigung (m) von 0,823 zeigt – nahe 1:1. Die quantitative Präzision ist ebenfalls niedrig, mit einem Korrelationskoeffizienten (R) von 0,61. Im Gegensatz dazu wird eine signifikante Hinaufregulation von 3,32-fach erkannt, wenn nur PSM berücksichtigt werden, bei denen der Vorläufer eine Interferenz von weniger als 25% aufweist (ausgefüllte Kreise links). Filterung verbesserte ebenfalls die Präzision, wobei der Korrelationskoeffizient auf 0,74 anstieg. Unglücklicherweise ist diese verbesserte Quantifizierung zu Lasten der meisten PSM und Peptide des Proteins, da diese Zahlen von 58 auf 18 bzw. 35 auf 14 fallen.
• Man beachte, dass wir positive Fehler als diejenigen definieren, welche das beobachtete Proteinverhältnis extremer machen (z. B. 2:1 → 4:1 oder 1:2 → 1:4), während negative Fehler diejenigen sind, die das beobachtete Proteinverhältnis weniger extrem machen (z. B. 4:1 → 2:1 oder 1:4 → 1:2). Anders ausgedrückt, positive Proteinverhältnisfehler sind diejenigen, die sich von 1:1 weiter entfernen, während negative Fehler 1:1 näher kommen.
• Wenn dieses Protein mit aktivierter QuantMode quantifiziert wird, wie in 6, Feld (C), ausgefüllte Dreiecke, gezeigt, zeichnet sich ein übergeordnetes Bild ab. Die Steigung, 4,01, ist ungefähr identisch mit der mit Filterung nach der Erfassung beobachteten. Gleichfalls verbesserte sich der Korrelationskoeffizient auf 0,82, was gute Präzision demonstriert. Die Anzahl quantifizierbarer PSM und Peptide ist jedoch viel gleichwertiger mit den ohne QuantMode identifizierten, mit 41 bzw. 36. Somit ergibt QuantMode bei vergleichbaren Ergebnissen in Bezug auf die Identifizierung einen beträchtlichen Anstieg der Menge quantifizierbarer Daten gegenüber den mit herkömmlichen Erfassungsbedingungen erhaltenen. Für alle ohne und mit QuantMode quantifizierten Proteine wurden 148% mehr PSM und 91% mehr einzigartige Peptide verwendet, wenn QuantMode aktiviert war.
• Bei LC-MS/MS-Analysen von 19 SCX-Fraktionen von dem humanen Peptidgemisch, wobei jede Fraktion nacheinander ohne und mit QuantMode analysiert wurde, werden die Vorteile offensichtlich, wie in 7 gezeigt. Obwohl Identifizierungen geringfügig abnehmen (~10%), ergibt QuantMode signifikante Zunahmen der quantifizierbaren PSM (91%), Peptide (+65%) und Proteine (+22%). Ein Großteil dieser Zunahmen stammt von Spezies mit geringerer Häufigkeit, welche bei herkömmlichen Erfassungsansätzen wahrscheinlicher unerkannt bleiben.
• Die signifikante Zunahme quantifizierbarer Identifizierungen für diese drei Metriken ist zum Erlangen des vollständigsten Bilds wichtig, welches von massenspektrometriebasierter quantitativer Proteomik geliefert wird. Eine höhere Anzahl von PSM entspricht einer Zunahme technischer Replikate, die zum Erlangen einer statistischen Leistung entscheidend sind. Da nur ein einziges Peptid ausreicht, um ein Protein zu quantifizieren, kann die Bedeutung von mehr Peptiden, die zu einer höheren Sequenzabdeckung beitragen, übersehen werden. Posttranslationale Modifizierungen (PTM) spielen jedoch besonders in höheren Organismen eine wichtige Rolle bei der Regulierung biochemischer Prozesse. Eine höhere Sequenzabdeckung verringert die Wahrscheinlichkeit, dass diese PTM eine verfälschte Quantifizierung aufweisen. Die Beobachtung von mehr Peptiden – so dass ein größerer Betrag/Anteil unmodifiziert ist – bedeutet, dass die erhaltene Quantifizierung wahrscheinlicher das Protein insgesamt repräsentiert. Schließlich ist die Erhöhung der Anzahl quantifizierbarer Proteine, insbesondere jener, welche mit niedrigerer Häufigkeit auftreten, ohne Frage wichtig für eine verbesserte Proteomabdeckung.
• Zusammenfassend demonstrieren wir, dass isobare Markierungsverfahren unter einem systematischen Verlust an Präzision und dynamischem Bereich aufgrund des inhärenten Problems der Vorläuferinterferenz leiden. Wir beschrieben ein neues Datenerfassungsverfahren, QuantMode, das dieses Problem durch dynamisches Prüfen von MS¹-Scans auf das Vorliegen störender Spezies mildert. Die Anwendung des Verfahrens auf ein Shotgun-Experiment ergab große Zunahmen quantifizierbarer PSM, Peptide und Proteine. Wir folgern, dass diese Herangehensweise isobare Markierung zu einer praktikablen Option für schnelle, genaue, multiplexierte Proteinquantifizierung in großem Maßstab machen wird.
• Probenvorbereitung
• Humane embryonale Stammzellen (Linien H1 und H9) und induzierte pluripotente Stammzellen (Linie DF-19-9-7T, siehe J. Y. Yu et al. Science 324, 797–801 (2009)) wurden in einem Feeder-unabhängigen System gehalten, wie zuvor beschrieben [siehe T. E. Ludwig et al. Nat. Methods 3, 637–646 (2006)]. Humane neonatale Vorhautfibroblasten (Kat.-Nr. CRL-2097^TM, ATCC) wurden im Wesentlichen gemäß ATCC-Empfehlungen kultiviert. Alle Zellen wurden durch Vereinzelung für 10 Minuten mit einem passenden Volumen von vorgewärmtem (37°C) 0,05%-igenTryp-LE, um die Kulturoberfläche zu bedecken, geerntet. Nach der Zellablösung wurde ein äquivalentes Volumen von entweder eiskalter DPBS (Invitrogen) im Fall von ES-Zellen oder eiskaltem Wachstumsmedium im Fall von Fibroblastzellen zugegeben, bevor die Zellen gesammelt wurden. Die Zellpellets wurden anschließend zweimal in eiskalter PBS gewaschen und bei –80°C gelagert. Ungefähr 108 Zellen wurden für jede Analyse gesammelt.
• Die Proben wurden mittels Beschallung in Lysepuffer lysiert, der 40 mM NaCl, 50 mM Tris, 2 mM MgCl₂, 50 mM NaF, 50 mM b-Glyceraldehydphosphat, 1 mM Natriumorthovanadat, 10 mM Natriumpyrophosphat, 1 Mini-EDTA-freien Protease-Inhibitor (Roche Diagnostics) und 1 phosSTOP-Phosphatase-Inhibitor (Roche Diagnostics) enthielt.
• Cysteinreste wurden mit DTT reduziert, unter Verwendung von Iodacetamid alkyliert und in einem Zwei-Schitt-Verfahren verdaut. Proteinase Lyx-C (Wako Chemicals) wurde mit einem Enzym-Protein-Verhältnis von 1:100 zugegeben und für ungefähr 2 Stunden bei 37°C in Lysepuffer inkubiert. Die Proben wurden dann mit 50 mM Tris (pH 8.0) verdünnt, bis die Harnstoffkonzentration 1,5 M war, und mit Trypsin (Promega) mit einem Enzym-Protein-Verhältnis von 1:50 über Nacht bei 37°C verdaut. Die Reaktionen wurden unter Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA) gequencht. Die Proben wurden vollständig getrocknet und unter Verwendung von C18-Festphasenextraktionssäulen (SPE-Säulen) (SepPak, Waters) aufgereinigt. Die iTRAQ-Markierung wurde entsprechend den vom Hersteller bereitgestellten Protokollen durchgeführt und es wurde gemischt.
• Fraktionierung
• Die markierten Peptide wurden in starker SCX-Puffer A resuspendiert und auf eine Polysulfoethylaspartamid-Säule (9,4 × 200 mm; PolyLC) injiziert. Trennungen wurden unter Verwendung einer quaternären Pumpe Surveyor LC (Thermo Scientific) bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 3,0 ml/min durchgeführt. Der folgende Gradient wurde für die Trennung verwendet: 0–2 min, 100% Puffer A, 2–5 min, 0–15% Puffer B, 5–35 min, 15–100% Puffer B. Puffer B wurde für 10 Minuten auf 100% gehalten. Schließlich wurde die Säule vor der Neukalibrierung ausgiebig mit Puffer C und Wasser gewaschen. Die folgenden Puffer wurden verwendet: Puffer A – 5 mM KH₂PO₄, 30% Acetonitril (pH 2,65); Puffer B – 5 mM KH₂PO₄, 30% Acetonitril, 350 mM KCl (pH 2,65); Puffer C – 50 mM KH₂PO₄, 500 mM KCl (pH 7,5). Die Proben wurden von Hand gesammelt und mittels SPE entsalzt.
• Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie. Online-Chromatographie wurde mit einem NanoAcquity-UPLC-System (Waters) durchgeführt, das mit einer LTQ Orbitrap Velos (Thermo Scientific) gekoppelt war. Die Proben wurden auf eine Vorsäule (ID von 75 um, mit 5 cm C18-Teilchen gepackt, Alltech) für 10 min bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 μm/min geladen. Die Proben wurden dann über eine analytische Säule (ID von 50 μm, mit 15 cm C18-Teilchen gepackt, Alltech) unter Verwendung eines linearen 120-min-Gradienten von 1% bis 35% Acetonitril mit 0,2% Ameisensäure und einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 nl/min eluiert. Weitere 30 min wurden zum Waschen und Äquilibrieren der Säulen aufgewendet. Das Säulenherstellungsverfahren wurde zuvor beschrieben [siehe S. E. Martin, J. Shabanowitz, D. F. Hunt & J. A. Marto. Anal. Chem. 72, 4266–4274 (2000)].
• SCX-Fraktionen wurden abwechselnd mit deaktivierter, dann aktivierter QuantMode analysiert. Das Geräteverfahren war ein datenabhängiger Top-10-Versuch über 146 Minuten, der aus einem MS¹-Scan mit einer Auflösung von 30.000 und HCD-MS²-Scans mit einer Auflösung von 7500 bestand, die alle in der Orbitrap erfasst wurden. Die Sollwerte der automatischen Verstärkungsregelung (AGC) waren 1.000.000 für FTMS1 und 50.000 für FT-MSn. Ein Isolationsfenster von 3 Th wurde für MS/MS verwendet. Vorläufer mit unbekanntem Ladungszustand oder einem Ladungszustand von +1 wurden ausgeschlossen. Dynamischer Ausschluss wurde für 60 s nach einem Fragmentierungsereignis aktiviert. Die Rohdaten werden im Tranche-Online-Speicher für öffentliche Zugänglichkeit nach Akzeptierung des Manuskripts hinterlegt.
• Der QuantMode-Algorithmus zur spontanen Bestimmung der Inferferenz bestand im Iterieren durch alle Peaks innerhalb eines Fensters um den Vorläufer herum. Das Fenster wurde im Verhältnis zum eigentlichen Isolationsfenster um 20% vergrößert, von 3 Th auf 3,6 Th, um die empirische Beobachtung zu berücksichtigen, dass Spezies außerhalb des Isolationsfensters (besonders auf der niedrigen m/z-Seite) noch immer in signifikanten Niveaus bewahrt werden könnten. Das Peak-m/z wurde in Masse umgewandelt und mit der Vorläufermasse verglichen, wobei angenommen wurde, dass beide Spezies die gleiche Ladung aufwiesen. Das nächste Vielfache von 1,00335 Da (Kohlenstoff-13-Masse minus Kohlenstoff-12-Masse, dem hauptsächlichen beitragenden Faktor zu Peptid-Isotopen-Peaks) wurde subtrahiert und der restliche Massenfehler wurde in Teile pro Million (ppm) ungewandelt. Wenn der Massenfehler kleiner als ±25 ppm war, wurde der Peak als ein Vorläufer-Peak beurteilt und seine Intensität wurde mit der des aktuell intensivsten Vorläufers verglichen. Andernfalls wurde der Peak als ein Interferenz-Peak beurteilt und seine Intensität wurde mit der der aktuell intensivsten Interferenz verglichen. Sobald alle Peaks berücksichtigt wurden, wurde die Vorläuferinterferenz als die intensivste Interferenz-Peak-Intensität dividiert durch die intensivste Vorläufer-Peak-Intensität berechnet.
• Wir merken an, dass der QuantMode-Algorithmus leicht unter Verwendung der LTQ-COM-Bibliothek [siehe C. D. Wenger, M. T. Boyne, J. T. Ferguson, D. E. Robinson & N. L. Kelleher. Anal. Chem. 80, 8055–8063 (2008)], welche von Thermo bereitgestellt wird, oder ähnlichen Ressourcen, welche von anderen Gerätehändlern angeboten werden, umgesetzt werden könnte. Pseudocode für den Algorithmus lautet wie folgt:

  

  
• Datenanalyse
• Die resultierenden Massenspektren wurden mit der COMPASS-Softwaresammlung [siehe C. D. Wenger, D. H. Phanstiel, M. V. Lee & J. J. Coon (eingereicht)] verarbeitet. OMSSA-Suchen [siehe L. Y. Geer et al. J. Proteome Res. 3, 958–964 (2004)] wurden gegen eine verknüpfte Ziel-Köder-Version [siehe J. E. Elias & S. P. Gygi, Nat. Methods 4, 207–214 (2007)] des humanen International-Protein-Index-Datenbank [siehe P. J. Kersey et al. Proteomics 4, 1985–1988 (2004)] (Version 3.67) unter Anwendung einer durchschnittlichen Vorläufermassentoleranz von ±5,0 Da und einer monoisotopischen Produktmassentoleranz von ±0,01 Da durchgeführt. Carbamidomethylierung von Cysteinen (+57 Da) und iTRAQ 4-plex an Peptid-N-Termini und Lysinen (+145 Da) wurden als unveränderliche Modifizierungen festgelegt, während Oxidation von Methionine (+16 Da) und iTRAQ 4-plex an Tyrosinen (+145 Da) als variable Modifizierungen festgelegt wurden. Interferenzfilterung nach der Datenerfassung wurde unter Anwendung desselben, für die spontane Filterung oben beschriebenen Algorithmus durchgeführt.
• Obwohl die Beschreibung hierin viele genaue Angaben enthält, sollten diese nicht als den Schutzumfang der Erfindung einschränkend aufgefasst werden, sondern als lediglich Veranschaulichungen einiger der Ausführungsformen der Erfindung bereitstellend.
• ERKLÄRUNGEN BEZÜGLICH AUFNAHME DURCH BEZUGNAHME UND ÄNDERUNGEN
• Jede hierin zitierte Literaturquelle wird hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen. Wenn jedoch eine etwaige Unstimmigkeit zwischen einer zitierten Literaturquelle und der vorliegenden Offenbarung auftritt, hat die vorliegende Offenbarung Vorrang. Einige hierin bereitgestellte Literaturquellen werden durch Bezugnahme aufgenommen, um Einzelheiten in Bezug auf den Stand der Technik vor der Einreichung dieser Anmeldung bereitzustellen; andere Literaturquellen können zitiert werden, um zusätzliche oder alternative Geräteelemente, zusätzliche oder alternative Materialien, zusätzliche oder alternative Analyseverfahren oder Anwendungen der Erfindung bereitzustellen. In der Spezifikation erwähnte Patente und Veröffentlichungen weisen auf die Fähigkeitsniveaus der Fachmänner der Technik hin, die diese Erfindung betrifft. Hierin zitierte Literaturquellen werden hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen, um den Stand der Technik zu deren Veröffentlichungs- oder Einreichungsdatum aufzuzeigen; und es ist beabsichtigt, dass diese Informationen hierin bei Bedarf dazu eingesetzt werden können, um spezifische Ausführungsformen des Standes der Technik auszuschließen.
• Die Begriffe und Ausdrücke, die hierin eingesetzt wurden, werden als Begriffe zur Beschreibung und nicht Einschränkung verwendet, und es besteht keine Absicht bei der Verwendung derartiger Begriffe und Ausdrücke, etwaige Äquivalente der gezeigten oder beschriebenen Merkmale oder von Teilen davon auszuschließen; es wird jedoch anerkannt, dass verschiedene Modifizierungen innerhalb des Schutzumfangs der beanspruchten Erfindung möglich sind. Es sollte daher verstanden werden, dass, obwohl die Erfindung speziell mittels bevorzugter Ausführungsformen, beispielhafter Ausführungsformen und fakultativer Merkmale offenbart wurde, Fachmänner auf Modifizierungen und Änderungen der hierin offenbarten Konzepte zurückgreifen können und dass derartige Modifizierungen und Änderungen als innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung, wie sie von den angefügten Ansprüchen definiert wird, liegend erachtet werden. Die hierin bereitgestellten spezifischen Ausführungsformen sind Beispiele zweckdienlicher Ausführungsform der Erfindung und es wird einem Fachmann offensichtlich sein, dass die Erfindung unter Anwendung einer großen Zahl von Änderungen der in der vorliegenden Beschreibung dargestellten Geräte, Gerätekomponenten, Verfahrensschritte durchgeführt werden kann. Wie einem Fachmann offensichtlich sein wird, können für die vorliegenden Verfahren zweckdienliche Verfahren und Geräte eine große Zahl fakultativer Zusammensetzungs- und Verarbeitungselemente und -schritte beinhalten.
• Ein Durchschnittsfachmann wird zu schätzen wissen, dass Geräteelemente sowie Materialien, Formen und Abmessungen von Geräteelementen als auch Verfahren, bei denen es sich nicht um die spezifisch beispielhaft dargestellten handelt, in der Ausübung der Erfindung eingesetzt werden können, ohne auf übermäßiges Experimentieren zurückzugreifen. Adle in der Technik bekannten funktionellen Äquivalente beliebiger derartiger Materialien und Verfahren sollen von dieser Erfindung umfasst sein. Die Begriffe und Ausdrücke, welche eingesetzt wurden, werden als Begriffe zur Beschreibung und nicht Einschränkung verwendet, und es besteht keine Absicht bei der Verwendung derartiger Begriffe und Ausdrücke, etwaige Äquivalente der gezeigten oder beschriebenen Merkmale oder von Teilen davon auszuschließen; es wird jedoch anerkannt, dass verschiedene Modifizierungen innerhalb des Schutzumfangs der beanspruchten Erfindung möglich sind. Es sollte daher verstanden werden, dass, obwohl die vorliegende Erfindung speziell mittels bevorzugter Ausführungsformen und fakultativer Merkmale offenbart wurde, Fachmänner auf eine Modifizierung und Änderung der hierin offenbarten Konzepte zurückgreifen können und dass derartige Modifizierungen und Änderungen als innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung liegend erachtet werden.
• Wenn eine Markush-Gruppe oder andere Gruppierung hierin verwendet wird, sollen alle einzelnen Mitglieder der Gruppe und alle Kombinationen und möglichen Unterkombinationen der Gruppe einzeln von der Offenbarung umfasst sein. Jede Kombination von hierin beschriebenen oder beispielhaft dargestellten Komponenten oder Materialien kann zur Ausübung der Erfindung verwendet werden, sofern nicht anderweitig angegeben. Ein Durchschnittsfachmann wird zu schätzen wissen, dass Verfahren, Geräteelemente und Materialien, bei denen es sich nicht um die spezifisch beispielhaft dargestellten handelt, in der Ausübung der Erfindung eingesetzt werden können, ahne auf übermäßiges Experimentieren zurückzugreifen. Alle in der Technik bekannten funktionellen Äquivalente beliebiger derartiger Verfahren, Geräteelemente und Materialien sollen von dieser Erfindung umfasst sein. Wann immer in der Spezifikation ein Bereich angegeben wird, beispielsweise ein Temperaturbereich, ein Frequenzbereich, ein Zeitbereich oder ein Zusammensetzungsbereich, sollen alle Zwischenbereiche und alle Teilbereiche sowie alle Einzelwerte, die in den Bereichen beinhaltet sind, von der Offenbarung umfasst sein. Ein beliebiges Einzelelement oder beliebige mehrere Einzelelemente eines hierin offenbarten Bereichs oder einer hierin offenbarten Gruppe kann aus einem Anspruch dieser Erfindung ausgeschlossen werden. Die hierin veranschaulichend beschriebene Erfindung kann in geeigneter Weise bei Fehlen eines beliebigen Elements oder beliebiger Elemente ausgeübt werden, wobei eine Einschränkung oder Einschränkungen hierin nicht speziell offenbart sind.
• Wie hierin verwendet, ist „umfassend” gleichbedeutend mit „beinhaltend”, „enthaltend” oder „gekennzeichnet durch” und ist einschließlich oder nach oben offen und schließt zusätzliche, nicht vorgetragene Elemente oder Verfahrensschritte nicht aus. Wie hierin verwendet, schließt „bestehend aus” jedes Element, jeden Schritt oder jeden Bestandteil aus, der nicht in dem Anspruchselement angegeben ist. Wie hierin verwendet, schließt „im Wesentlichen bestehend aus” Materialien oder Schritte nicht aus, welche sich nicht wesentlich auf die grundlegenden und neuartigen Charakteristika des Anspruchs auswirken. Der Begriff „umfassend” soll breiter als die Begriffe „im Wesentlichen bestehend aus” und „bestehend aus” sein; der Begriff „umfassend”, wie hierin in seinem weitesten Sinne verwendet, soll jedoch die engeren Begriffe „im Wesentlichen bestehend aus” und „bestehend aus” umspannen; folglich kann der Begriff „umfassend” durch „im Wesentlichen bestehend aus” ersetzt werden, um Schritte auszuschließen, die sich nicht wesentlich auf die grundlegenden und neuartigen Charakteristika der Ansprüche auswirken, und „umfassend” kann durch „bestehend aus” ersetzt werden, um nicht vorgetragene Anspruchselemente auszuschließen.
• Die Begriffe und Ausdrücke, die eingesetzt wurden, werden als Begriffe zur Beschreibung und nicht Einschränkung verwendet, und es besteht keine Absicht bei der Verwendung derartiger Begriffe und Ausdrücke, etwaige Äquivalente der gezeigten oder beschriebenen Merkmale oder von Teilen davon auszuschließen; es wird jedoch anerkannt, dass verschiedene Modifizierungen innerhalb des Schutzumfangs der beanspruchten Erfindung möglich sind. Es sollte daher verstanden werden, dass, obwohl die vorliegende Erfindung speziell mittels bevorzugter Ausführungsformen und fakultativer Merkmale offenbart wurde, Fachmänner auf eine Modifizierung und Änderung der hierin offenbarten Konzepte zurückgreifen können und dass derartige Modifizierungen und Änderungen als innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung, wie sie von den angefügten Ansprüchen definiert wird, liegend erachtet werden.
• Obwohl die Beschreibung hierin viele genaue Angaben enthält, sollten diese nicht als den Schutzumfang der Erfindung einschränkend aufgefasst werden, sondern als lediglich Veranschaulichungen einiger der Ausführungsformen der Erfindung bereitstellend.
• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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• Zitierte Nicht-Patentliteratur
• Ow et al., „iTRAQ Underestimation in Simple and Complex Mixtures: ,The Good, the Bad and the Ugly'”, Journal of Proteome Research, Internetveröffentlichung, 16. September 2009 [0007]
• J. Y. Yu; K. J. Hu; K. Smuga-Otto; S. L. Tian; R. Stewart; Il Slukvin; J. A. Thomson, Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science 2009, 324, (5928), 797–801 [0067]
• T. E. Ludwig; V. Bergendahl; M. E. Levenstein; J. Y. Yu; M. D. Probasco; J. A. Thomson, Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods 2006, 3, (8), 637–646 [0067]
• G. C. McAlister; D. Phanstiel; C. D. Wenger; M. V. Lee; J. J. Coon, Analysis of Tandem Mass Spectra by FTMS for Improved Large-Scale Proteomics with Superior Protein Quantification. Analytical Chemistry 2010, 82, (1), 316–322 [0072]
• D. M. Good; C. D. Wenger; G. C. McAlister; D. L. Bai; D. F. Hunt; J. J. Coon, Post-Acquisition ETD Spectral Processing for Increased Peptide Identifications. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2009, 20, (8), 1435–1440 [0074]
• L. Y. Geer; S. P. Markey; J. A. Kowalak; L. Wagner; M. Xu; D. M. Maynard; X. Y. Yang; W. Y. Shi; S. H. Bryant, Open mass spectrometry search algorithm. Journal of Proteome Research 2004, 3, (5), 958–964 [0074]
• http://www.ebi.ac.uk/IPI/ [0074]
• P. J. Kersey; J. Duarte; A. Williams; Y. Karavidopoulou; E. Birney; R. Apweiler, The International Protein Index: An integrated database for proteomics experiments. Proteomics 2004, 4, (7), 1985–1988 [0074]
• E. J. Hsieh; M. R. Hoopmann; B. Maclean; M. J. Maccoss, Comparison of Database Search Strategies for High Precursor Mass Accuracy MS/MS Data. J Proteome Res 2009 [0074]
• A. I. Nesvizhskii; R. Aebersold, Interpretation of shotgun proteomic data – The Protein interference Problem. Molecular & Cellular Proteomics 2005, 4, (10), 1419–1440 [0074]
• I. P. Shadforth; T. P. J. Dunkley; K. S. Lilley; C. Bessant, i-Tracker: For quantitative proteomics using iTRAQ (TM). Bmc Genomics 2005, 6 [0075]
• L. M. F. de Godoy et al. Nature 455, 1251–1255 (2008) [0083]
• D. L. Swaney, C. D. Wenger & J. J. Coon. J. Proteome Res. 9, 1323–1329 (2010) [0083]
• S. E. Ong & M. Mann. Nat. Chem. Biol. 1, 252–262 (2005) [0083]
• H. Jiang & A. M. English. J. Proteome Res. 1, 345–350 (2002) [0083]
• S. E. Ong et al. Mol. Cell. Proteomics 1, 376–386 (2002) [0083]
• H. N. Zhu, S. Q. Pan, S. Gu, E. M. Bradbury & X. Chen. Rapid Commun. Mass Spectrom. 16, 2115–2123 (2002) [0083]
• J. V. Olsen et al. Sci. Signal. 3, – (2010) [0083]
• A. Thompson et al. Anal. Chem. 75, 1895–1904 (2003) [0085]
• P. L. Ross et al. Mol. Cell. Proteomics, 3, 1154–1169 (2004) [0085]
• L. Choe et al. Proteomics 7, 3651–3660 (2007) [0085]
• R. Lu et al. Nature 462, 358 – U126 (2009) [0085]
• S. Y. Ow et al. J. Proteome Res. 8, 5347–5355 (2009) [0086]
• N. A. Karp et al. Mol. Cell. Proteomics (2010) [0086]
• Y. Zhang et al. Mol. Cell. Proteomics (2009) [0091]
• J. V. Olsen et al. Sci. Signal. 3, – (2010) [0093]
• K. A. Becker, J. L. Stein, J. B. Lian, A. J. Van Wijnen & G. S. Stein. J. Cell. Physiol. 210, 517–526 (2007) [0093]
• J. Y. Yu et al. Science 324, 797–801 (2009) [0099]
• T. E. Ludwig et al. Nat. Methods 3, 637–646 (2006) [0099]
• S. E. Martin, J. Shabanowitz, D. F. Hunt & J. A. Marto. Anal. Chem. 72, 4266–4274 (2000) [0103]
• C. D. Wenger, M. T. Boyne, J. T. Ferguson, D. E. Robinson & N. L. Kelleher. Anal. Chem. 80, 8055–8063 (2008) [0106]
• L. Y. Geer et al. J. Proteome Res. 3, 958–964 (2004) [0107]
• J. E. Elias & S. P. Gygi, Nat. Methods 4, 207–214 (2007) [0107]
• P. J. Kersey et al. Proteomics 4, 1985–1988 (2004) [0107]

Claims (21)

1. Verfahren zum Analysieren eines Analyten unter Verwendung von Massenspektrometrie, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellung eines Analyten; (b) Erzeugung einer Verteilung von Vorläufer-Ionen aus dem Analyten; (c) Analyse der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläufer-Ionen, wodurch Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten, welche der Verteilung von Vorläuferionen entsprechen, erzeugt werden; (d) Identifizierung eines Vorläufer-Peaks, welcher einem Vorläuferion entspricht, in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten; (e) Fragmentierung von Ionen, welche einem vorher ausgewählten Bereich von m/z-Einheiten um den Vorläufer-Peak herum entsprechen, wobei der vorher ausgewählte Bereich innerhalb von 0,01 bis 10 m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks liegt, wodurch Fragment-Ionen erzeugt werden; (f) Messung der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Fragment-Ionen, wodurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden; (g) Bestimmung des Betrags/Anteils an Interferenz innerhalb des vorher ausgewählten Bereichs von m/z-Einheiten um den Vorläufer-Peak herum und (h) Analyse der Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, für welche der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, und Nicht-Analyse der Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, für welche der Betrag/Anteil an Interferenz größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist; wodurch der Analyt unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert wird.
2. Verfahren zum Analysieren eines Analyten unter Verwendung von Massenspektrometrie, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellung eines Analyten; (b) Erzeugung einer Verteilung von Vorläuferionen aus dem Analyten; (c) Analyse der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferionen, wodurch Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten, welche der Verteilung von Vorläuferionen entsprechen, erzeugt werden; (d) Identifizierung eines Vorläufer-Peaks, welcher einem Vorläuferion entspricht, in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten; (e) Bestimmung des Betrags/Anteils an Interferenz innerhalb eines vorher ausgewählten Bereichs von m/z-Einheiten um den Vorläufer-Peak herum, wobei der vorher ausgewählte Bereich innerhalb von 0,01 bis 10 m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks liegt; (f) Fragmentierung von Ionen, welche einem vorher ausgewählten Bereich entsprechen, wenn der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, wodurch Fragment-Ionen erzeugt werden; und Nicht-Fragmentieren von Ionen, welche einem vorher ausgewählten Bereich entsprechen, wenn der Betrag/Anteil an Interferenz größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist; (g) Messung der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Fragment-Ionen, wodurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden; und (h) Analyse der Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten; wodurch der Analyt unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert wird.
3. Verfahren zum Analysieren eines Analyten unter Verwendung von Massenspektrometrie, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellung eines Analyten; (b) Erzeugung einer Verteilung von Vorläuferionen aus dem Analyten; (c) Analyse der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferionen, wodurch Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten, welche der Verteilung von Vorläuferionen entsprechen, erzeugt werden; (d) Identifizierung eines Vorläufer-Peaks, welcher einem Vorläuferion entspricht, in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten; (e) Bestimmung des Betrags/Anteils an Interferenz innerhalb eines vorher ausgewählten Bereichs von m/z-Einheiten um den Vorläufer-Peak herum, wobei der vorher ausgewählte Bereich innerhalb von 0,01 bis 10 m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks liegt; (f) Fragmentierung von Ionen, welche dem vorher ausgewählten Bereich entsprechen, wodurch Fragment-Ionen erzeugt werden; (g) Messung von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von Fragment-Ionen, welche einem vorher ausgewählten Bereich entsprechen, wenn der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, und Nicht-Messen von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen von Fragment-Ionen, welche einem vorher ausgewählten Bereich entsprechen, wenn der Betrag/Anteil an Interferenz größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist, wodurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden; und (h) Analyse der Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten; wodurch der Analyt unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert wird.
4. Massenspektrometersystem zum Analysieren eines Analyten, wobei das System umfasst: eine Ionenquelle zum Erzeugen von Ionen aus dem Analyten; eine erste Ionentrennungsoptik in Verbindung stehend mit der Ionenquelle, um Ionen nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen zu trennen; einen ersten Ionendetektor in Verbindung stehend mit der ersten Ionentrennungsoptik, zum Erfassen von Ionen, welche nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden; eine Ionenfragmentierungsoptik in Verbindung stehend mit der ersten Ionentrennungsoptik zum Erzeugen von Ionenfragmenten; eine zweite Ionentrennungsoptik in Verbindung stehend mit der Ionenfragmentierungsoptik zum Trennen von Ionen nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; einen zweiten Ionendetektor in Verbindung stehend mit der zweiten Ionentrennungsoptik zum Erfassen von Ionen, welche nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden; eine Steuerung, welche an die erste und zweite Ionentrennungsoptik, an den ersten und zweiten Ionendetektor und die Ionenfragmentierungsoptik betreibbar/funktionsfähig angeschlossen ist; wobei die Steuerung die Ionenoptiken und Ionendetektoren derart steuert, dass: (a) eine Verteilung von Vorläuferionen aus dem Analyten erzeugt wird; (b) die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferionen analysiert werden, wodurch Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten, welche der Verteilung von Vorläuferionen entsprechen, erzeugt werden; (c) ein Vorläufer-Peak, welcher einem Vorläuferion entspricht, in den Vorläuferionen-Massenspekttrometriedaten identifiziert wird; (d) der Betrag/Anteil an Interferenz innerhalb eines vorher ausgewählten Bereiches von m/z-Einheiten um den Vorläufer-Peak herum bestimmt wird, wobei der vorher ausgewählte Bereich innerhalb von 0,01 bis 10 m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks liegt; (e) die Ionen fragmentiert werden, welche dem vorher ausgewählten Bereich entsprechen, wodurch Fragment-Ionen erzeugt werden; (f) die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Fragment-Ionen, welche einem vorher ausgewählten Bereich entsprechen, gemessen werden, wenn der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist; und die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Fragment-Ionen, welche einem vorher ausgewählten Bereich entsprechen, nicht gemessen werden, wenn das Ausmaß an Interferenz größer als oder gleich dem ausgewählten Wert ist, wodurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden; und (g) die Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und die Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten analysiert werden.
5. Massenspektrometersystem zum Analysieren eines Analyten, wobei das System umfasst: eine Ionenquelle zum Erzeugen von Ionen aus dem Analyten; eine erste Ionentrennungsoptik in Verbindung stehend mit der Ionenquelle zum Trennen von Ionen nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; einen ersten Ionendetektor in Verbindung stehend mit der ersten Ionentrennungsoptik zum Erfassen von Ionen, welche nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden; eine Ionenfragmentierungsoptik in Verbindung stehend mit der ersten Ionentrennungsoptik zum Erzeugen von Fragment-Ionen; eine zweite Ionentrennungsoptik in Verbindung stehend mit der Ionenfragmentierungsoptik zum Trennen von Ionen nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; einen zweiten Ionendetektor in Verbindung stehend mit der zweiten Ionentrennungsoptik zum Erfassen von Ionen, welche nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden; eine Steuerung, welche an die erste und zweite Ionentrennungsoptik, an den ersten und zweiten Ionendetektor und die Ionenfragmentierungsoptik betreibbar/funktionsfähig angeschlossen ist; wobei die Steuerung die Ionenoptiken und Ionendetektoren derart steuert, dass: (a) eine Verteilung von Vorläuferionen aus dem Analyten erzeugt wird; (b) die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferionen analysiert werden, wodurch Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten, welche der Verteilung von Vorläuferionen entsprechen, erzeugt werden; (c) ein Vorläufer-Peak, welcher einem Vorläuferion entspricht, in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten identifiziert wird; (d) Ionen, welche einem vorher ausgewählten Bereich von m/z-Einheiten um den Vorläufer-Peak herum entsprechen, fragmentiert werden, wobei der vorher ausgewählte Bereich innerhalb von 0,01 bis 10 m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks liegt, wodurch Fragment-Ionen erzeugt werden; (e) die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Fragment-Ionen gemessen werden, wodurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden; (f) der Betrag/Anteil an Interferenz innerhalb des vorher ausgewählten Bereichs von m/z-Einheiten um den Vorläufer-Peak herum gemessen wird; und (g) die Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und die Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, für welche der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, analysiert werden, und die Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und die Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, für welche der Betrag/Anteil an Interferenz größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist, nicht analysiert werden.
6. Massenspektrometersystem zum Analysieren eines Analyten, wobei das System umfasst: eine Ionenquelle zum Erzeugen von Ionen aus dem Analyten; eine erste Ionentrennungsoptik in Verbindung stehend mit der Ionenquelle zum Trennen von Ionen nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; einen ersten Ionendetektor in Verbindung stehend mit der ersten Ionentrennungsoptik zum Erfassen von Ionen, welche nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden; eine Ionenfragmentierungsoptik in Verbindung stehend mit der ersten Ionentrennungsoptik zum Erzeugen von Fragment-Ionen; eine zweite Ionentrennungsoptik in Verbindung stehend mit der Ionenfragmentierungsoptik zum Trennen von Ionen nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; einen zweiten Ionendetektor in Verbindung stehend mit der zweiten Ionentrennungsoptik zum Erfassen von Ionen, welche nach ihren Masse-zu-Ladung-Verhältnissen getrennt wurden; eine Steuerung, welche an die erste und zweite Ionentrennungsoptik, an den ersten und zweiten Ionendetektor und die Ionenfragmentierungsoptik betreibbar/funktionsfähig angeschlossen ist; wobei die Steuerung die Ionenoptiken und Ionendetektoren derart steuert, dass: (a) eine Verteilung von Vorläuferionen aus dem Analyten erzeugt wird; (b) die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferionen analysiert werden, wodurch Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten, welche der Verteilung von Vorläuferionen entsprechen, erzeugt werden; (c) ein Vorläufer-Peak, welcher einem Vorläuferion entspricht, in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten identifiziert wird; (d) der Betrag/Anteil an Interferenz innerhalb eines vorher ausgewählten Bereichs von m/z-Einheiten um den Vorläufer-Peak herum bestimmt wird, wobei der vorher ausgewählte Bereich innerhalb von 0,01 bis 10 m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks liegt; (e) Ionen, welche dem vorher ausgewählten Bereich entsprechen, fragmentiert werden, wenn der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, wodurch Fragment-Ionen erzeugt werden; und Ionen, welche dem vorher ausgewählten Bereich entsprechen, nicht fragmentiert werden, wenn der Betrag/Anteil an Interferenz größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist; (f) Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Fragment-Ionen gemessen werden, wodurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden; und (g) die Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und die Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten analysiert werden.
7. Verfahren zum Analysieren eines Analyten unter Verendung von Massenspektrometrie, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellung eines Analyten; (b) Erzeugung einer Verteilung von Vorläuferionen aus dem Analyten; (c) Analyse der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse von wenigstens einem Teil der Verteilung von Vorläuferionen, wodurch Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten, welche der Verteilung von Vorläuferionen entsprechen, erzeugt werden; (d) Identifizierung eines Vorläufer-Peaks, welcher einem Vorläuferion entspricht, in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten; (e) Bestimmung des Betrags/Anteils an Interferenz innerhalb eines Bereichs von 0,01 bis 10 m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks; (f) Anpassung des Bereichs von m/z-Einheiten derart, so dass der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist; und (g) Analyse der Ionen innerhalb des angepassten Bereichs von m/z-Einheiten; wodurch der Analyt unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Anpassung des Bereichs von m/z-Einheiten, so dass der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, umfasst: (i) Identifizierung eines Vorläufer-Peaks mit der größten Intensität innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten; (ii) Identifizierung eines Interferenz-Peaks am niedrigsten m/z innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten, dessen Intensität größer oder gleich 25% der Intensität des Vorläufer-Peaks mit der größten Intensität ist; (iii) Identifizierung eines Interferenz-Peaks bei dem größten m/z innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten, dessen Intensität größer oder gleich 25% der Intensität des Vorläufer-Peaks mit der größten Intensität ist; (iv) Identifizierung eines Mittelpunkts der m/z-Einheit zwischen dem Interferenz-Peak bei dem niedrigsten m/z und dem Interferenz-Peak bei dem größten m/z; und (v) Auswahl des Bereichs von m/z-Einheiten auf 75% einer m/z-Differenz zwischen dem Interferenz-Peak am niedrigsten m/z und dem Interferenz-Peak am größten m/z, zentriert auf den Mittelpunkt der m/z-Einheit.
9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Anpassung des Bereichs von m/z-Einheiten, so dass der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, umfasst: (i) Einstellung des Bereichs der m/z-Einheiten auf innerhalb 10 m/z des Vorläufer-Peaks; (ii) Bestimmung des Betrags/Anteils an Interferenz innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks; und (iii) Verringerung des Bereichs der m/z-Einheiten um 1 m/z, falls der Betrag/Anteil an Interferenz innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist.
10. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Anpassung des Bereichs von m/z-Einheiten, so dass das Ausmaß an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, umfasst: (i) Einstellung des Bereichs von m/z-Einheiten auf innerhalb 10 m/z des Vorläufer-Peaks; (ii) Bestimmung des Betrags/Anteils an Interferenz innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks; und (iii) Verringerung des Bereichs von m/z-Einheiten um 0,1 m/z, falls der Betrag/Anteil an Interferenz innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist.
11. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Anpassung des Bereichs von m/z-Einheiten, so dass das Ausmaß an Interferenz kleiner als ein ausgewählter Wert ist, umfasst: (i) Einstellung des Bereichs von m/z-Einheiten auf innerhalb 10 m/z des Vorläufer-Peaks; (ii) Bestimmung des Betrags/Anteils an Interferenz innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten des Vorläufer-Peaks; und (iii) Verringerung des Bereichs von m/z-Einheiten um 0,01 m/z, falls der Betrag/Anteil an Interferenz innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, welches weiterhin umfasst: (h) Fragmentierung der Ionen, welche dem Vorläufer-Peak entsprechen, wodurch Fragment-Ionen erzeugt werden; (i) Messung der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Fragment-Ionen, wodurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden; und (j) Analyse der Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, für welche der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als der ausgewählte Wert ist, und Nicht-Analyse der Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten, für welche der Betrag/Anteil an Interferenz größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, welches weiterhin umfasst: (h) Fragmentierung der Ionen, welche dem Vorläufer-Peak entsprechen, vorausgesetzt, dass der Betrag/Anteil an Interferenz kleiner als der ausgewählte Wert ist, wodurch Fragment-Ionen erzeugt werden; und Nicht-Fragmentierung der Ionen, welche dem Vorläufer-Peak entsprechen, vorausgesetzt, dass der Betrag/Anteil an Interferenz größer oder gleich dem ausgewählten Wert ist; (i) Messung der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der Fragment-Ionen, wodurch Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten erzeugt werden; und (j) Analyse der Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und der Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 13, wobei die Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten und die Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten nur für Vorlauferionen-Masserispektrometriedaten und Produkt-Ionen-Massenspektrometriedaten analysiert werden, welche auf eine einzige Vorläuferspezies hindeuten.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 14, wobei der Betrag/Anteil an Interferenz durch Berechnung eines Interferenzverhältnisses bestimmt wird und der ausgewählte Wert ein Interferenzverhältnis von kleiner oder gleich 0,5 ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 15, wobei der Betrag/Anteil an Interferenz durch Berechnung eines Interferenzverhältnisses einer größten Interferenz-Peak-Intensität innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten zu einer größten Vorläufer-Peak-Intensität innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten bestimmt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 15, wobei das Ausmaß an Interferenz durch Berechnung eines Interferenzverhältnisses der Summe aller Interferenz-Peak-Intensitäten innerhalb des Bereichs der m/z-Einheiten zu der Summe aller Vorläufer-Peak-Intensitäten innerhalb des Bereichs von m/z-Einheiten bestimmt wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 oder 17, wobei nur Peaks mit einer Intensität von größer oder gleich 10% des intensivsten Vorläuferionen-Peaks in den Vorläuferionen-Massenspektrometriedaten berücksichtigt werden.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 oder 17, wobei nur Peaks mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von größer als 2 zu 1 berücksichtigt werden.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 oder 17, wobei nur Peaks mit einem Isotopenhäufigkeitsmuster, welche auf eine ionische Spezies hindeutet, berücksichtigt werden.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 20, wobei der Bereich der m/z-Einheiten 0,01 bis 5 m/z-Einheiten beträgt.

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