JP5441064B2 - 物質の構造解析方法 - Google Patents

Description

本発明は、目的物質について、三連四重極質量分析法による測定を行い、得られたデータについて所定のデコンボリューション処理を行うことにより目的物質の構造を解析する方法に関する。

三連四重極質量分析法（triple-quadrupole mass spectrometry;TQ-MS）は、エレクトロスプレイイオン化（electrospray ionization；ESI）法と統合した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と組合せて、頻繁に使用される（非特許文献１〜５参照）。このような液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）システムは、衝突誘起解離（collision-induced dissociation;ＣＩＤ）条件下においてイオンの断片化の分析を容易とすることから、構造情報を得るために用いることができる。さらに、クロマトグラフィーカラムにおける所定の種の保持時間から、ＨＰＬＣにおいて用いられる固定相に対する種の親和性を決定でき、構造情報を得ることができる。しかし、この技術は、ＭＳ／ＭＳ情報しか提供しないという問題がある。また、四重極イオントラップ型質量分析法（quadrupole ion trap mass spectrometry;ＱＩＴ−ＭＳ）によれば、綿密な構造情報を提供するマルチステージＭＳ／ＭＳ分析が可能となる（非特許文献３，４，６〜９を参照）。しかし、ＨＰＬＣ分析における化合物の溶出期間中にマルチステージＭＳ／ＭＳ実験を行うことは、実際上は、困難である。したがって、ＨＰＬＣ分析に必要とされる時間内において構造情報について新たな洞察を得るためには、連続の質量スペクトル解析（ＭＳ^ｎ）が可能ではないというＴＱ−ＭＳの欠点を解消することが重要である。

これまで、複雑なグリカンの構造及びグリコシド結合の形態を解明するための方法を開発するために、ＱＩＴ−ＭＳを用いたエネルギー分解質量分析（energy-resolved mass spectrometry;ＥＲＭＳ）が調査されている。ほとんどの場合、様々なオリゴ糖のナトリウム化イオンについて得られたＥＲＭＳスペクトルは、プレカーサーイオン及び複数のプロダクトイオンに対応する一連のピークを含むものであり、単純なものである。これらのピークは、ボルツマン・シグモイド方程式（Boltzmann sigmoidal equations）によって解析され、近似処理される（非特許文献１０〜１３参照）。まれに、より複雑なＥＲＭＳスペクトルが得られることもある。グリカンの気相反応を解明する過程において、複雑なスペクトルが得られ、ＭＳ^ｎスペクトルは、ＱＩＴ−ＭＳのＣＩＤ工程では通常得られないプロダクトイオンの断片化反応に関する情報（ＭＳ^ｎ＋１の情報）を含んでいることが明らかにされている。しかし、ＱＩＴ−ＭＳ装置はＭＳ^ｎ実験を実施するために利用できるので、このような情報は、ＱＩＴ−ＭＳ分析には余り重要ではないと考えられる。その一方、ＴＱ−ＭＳ装置は、ＭＳ^ｎ実験に用いることができないことから、上述のＭＳ^ｎ＋１の情報は、ＴＱ−ＭＳ分析にとって極めて重要になる。また、構造の解明のために、ＴＱ−ＭＳ法がＨＰＬＣと組合せて用いられる場合、このようなＭＳ^ｎ＋１情報は有用となる。

Siuzdak, G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 11290-11297. Yu, X.; Cui, D.; Davis, M. R. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1999, 10, 175-183. Gygi, S. P.; Aebersold, R. Chem. Biol. 2000, 4, 489-494. Villas-Boas, S. G.; Mas, S.; Akesson, M.; Smedsgaard, J.; Nielsen, J. Mass Spectrom. Rev. 2005, 24, 613-646. Korfmacher, W. A. Drug Discovery Today 2005, 10, 1357-1367. March, R. E. Mass Spectrom. Rev. 2009, 28, 961-989. Jonscher1, K. R.; Yates III, J. R. Anal. Biochem. 1997, 244, 1-15. March R. E. Int. J. Mass Spectrom. 2000, 200, 285-312. March R. E. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1998, 12, 1543-1554. Kurimoto, A.; Daikoku, S.; Mutsuga, S.; Kanie, O. Anal. Chem. 2006, 78, 3461-3466. Daikoku, S.; Ako, T.; Kato, R.; Ohtsuka, I.; Kanie, O. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2007, 18, 1873-1879. Shioiri, Y.; Suzuki, K.; Kanie, O. J. Mass Spectrom. 2008, 43, 1132-1139. Shioiri, Y.; Kurimoto, A.; Ako, T.; Daikoku, S.; Ohtake, A.; Ishida, H.; Kiso, M.; Suzuki, K.; Kanie, O. Anal. Chem. 2009, 81, 139-145.

本発明の目的は、三連四重極質量分析法（TQ-MS）を用いた物質の構造解析方法であって、TQ-MS測定により得られたデータからＭＳ^ｎ情報の取得を可能とする方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、ＴＱ−ＭＳ測定において取得されたＥＲＭＳスペクトルに関し、総イオン量に対する各プロダクトイオン量の比率を求め、該プロダクトイオンの比率の任意の組合せの合計について線形回帰分析することによりＭＳ^ｎ情報を取得できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。

すなわち、本発明の態様は以下に関する。
〔１〕 （ａ）目的物質について、ＣＩＤエネルギーの値を変化させて三連四重極質量分析（ＴＱ−ＭＳ）測定を行い、
（ｂ）各ＣＩＤエネルギーの値において、プレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率と、特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する百分率とを求め、
（ｃ）工程（ｂ）において求めたプレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率の各値を与えるＣＩＤエネルギーの各値における、前記特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する百分率の各値を抽出し、
（ｄ）工程（ｃ）において抽出した前記特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する百分率の各値について、全ての組合せの和を求め、
（ｅ）プレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率の値をｘとし、かつ前記求めた各組合せの和の値をｙとする関数のうち直線近似できるものを選択し、選択した各関数を与えるプロダクトイオンのｍ／ｚ値から目的物質の構造を解析することを含む、
物質の構造解析方法。
〔２〕 工程（ｂ）において、ＣＩＤエネルギーの値をＸ軸とし、かつ百分率の値をＹ軸として、プレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率と、特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する百分率とをプロットしてグラフを作成する、〔１〕に記載の方法。
〔３〕 工程（ｃ）において、プレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率をＸ軸として、前記特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する各百分率をＹ軸方向にプロットしてグラフを作成する、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕 工程（ｄ）において、プレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率をＸ軸として、前記求めた各組合せの和の値をＹ軸方向にプロットしてグラフを作成する、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 工程（ｅ）における直線近似を以下の式（４）を用いて行う、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法：

式中、Ｓｙｘは、線形回帰曲線の残差を示し、x_j及びy_jは、データjの座標要素を示し、a_j及びb_jは、回帰曲線の座標要素を示し、ｎ−２は、自由度である。
〔６〕 工程（ｅ）において、ＭＳ^ｎ情報を取得する、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕 前記目的物質が糖鎖である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。

本発明によれば、従来、TQ-MS測定では不可能とされていたＭＳ^ｎ情報の取得が可能となり、目的物質についてのより詳細な構造解析が可能となる。

イオンＸに関しＱＩＴ‐ＭＳによって得られた典型的な解離プロファイルを示す。図１のaは、プレカーサーイオンＸからフラグメントイオン（ｆ_１−ｆ_４）が生成されることを示すＣＩＤスペクトルを示す。図１のｂは、イオンＸの解離に関し観測されるＥＲＭＳスペクトルを示し、データはボルツマン・シグモイド方程式（Boltzmann sigmoidal equations）により、通常、分析することができる。図１のｃは、プレカーサーイオンＸをｘ軸とし、個々のプロダクトイオンをｙ軸として、図１ｂのＥＲＭＳを再プロットしたグラフ（比率プロット）を示す。 図２のaは、ガングリオシドＧＤ１ａ（１）のメチルエステルのナトリウム化イオンのＥＲＭＳスペクトルを示す。図２のｂは、図１aのＥＲＭＳの比率プロットを示す。図２のｃは、プレカーサーイオン（m/z 1916.1）の断片化を示す。いくつかのグリコシド結合の開裂に対応する解離が観測され、最も豊富なイオンは、Ｎ−アセチルガラクトサミニル開裂を伴ったｙ−イオンであった。 イオンＸの解離のＥＲＭＳを示し、プロダクトイオンの一つ（ｆ_１）は、さらに、ｆ_３及びｆ_４に解離する。図３のａは、解離スキムを示す。図３のｂは、ＥＲＭＳスペクトルを示し、いくつかのプロダクトイオンの曲線は、ボルツマン・シグモイド方程式によって近似することができない。図３のｃは、ＥＲＭＳの比率プロットを示し、一連の曲線の合計は直線となる。 ＱＩＴ−ＭＳにおいて得られた［２＋Ｎａ］^＋のＥＲＭＳスペクトルを示す。図４のａは、ＥＲＭＳスペクトルを示す。図４のｂは、図１ａのＥＲＭＳの比率プロットを示す。黒丸は全てのプロダクトイオンの合計を示し、白い四角の記号はｍ／ｚ４６６．２及びｍ／ｚ６２８．３のイオンの合計を示す。図４のｃは、プレカーサーイオン（ｍ／ｚ６４６．３）の断片化を示す。ＰＡ及びＮ−アセチル基において生じたガラクトシル開裂及び脱水に対応する解離が観測された。 ＴＱ−ＭＳにおいて得られた［２＋Ｎａ］^＋のＥＲＭＳスペクトルを示す。図５のａは、ＥＲＭＳスペクトルを示す。図５のｂは、図５ａのＥＲＭＳの比率プロットを示す。図５のｃは、該比率プロットにおける個々のプロダクトイオンの強度の任意の合計を示す。図５のｄは、プレカーサーイオン（ｍ／ｚ６４６．３）の断片化を示す。ＰＡ及びＮ−アセチル基（ｆ_１及びｆ_３）で生じたガラクトシル開裂（ｆ_２）及び脱水に対応する解離が観測された。さらに、ＱＩＴ−ＭＳでは観測されなかったｆ_４〜ｆ_６等の他のフラグメントが観測された。 ＴＱ−ＭＳにおいて得られたナトリウム付加化合物２の解離経路を示す。

本発明の物質の構造解析方法は、（ａ）目的物質について、ＣＩＤエネルギーの値を変化させてＴＱ−ＭＳ測定を行い、（ｂ）各ＣＩＤエネルギーの値において、プレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率と、特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する百分率とを求め、（ｃ）工程（ｂ）において求めたプレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率の各値を与えるＣＩＤエネルギーの各値における、前記特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する百分率の各値を抽出し、（ｄ）工程（ｃ）において抽出した前記特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する百分率の各値について、全ての組合せの和を求め、（ｅ）プレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率の値をｘとし、かつ前記求めた各組合せの和の値をｙとする関数のうち直線近似できるものを選択し、選択した各関数を与えるプロダクトイオンのｍ／ｚ値から目的物質の構造を解析することを含むことを特徴とする。

本発明において、「ＣＩＤエネルギー」とは、ＣＩＤ（collision induced dissociation;衝突誘起解離）を起こすときに加えるエネルギーを一般的に示し、具体的には、イオンを振動させるためのある周波数の交流電場の電圧を示す。「プレカーサーイオン」とは、前駆体としての目的物質に対応するイオンを意味し、「プロダクトイオン」とは、プレカーサーイオンについてＴＱ−ＭＳ測定を行うことにより得られる各ｍ／ｚを有するフラグメントイオンを意味する。また、「ｍ／ｚ」とは、質量数（ｍ）と電荷（ｚ）との比を示す。また、「ＭＳ^ｎ情報」とは、プレカーサーイオンが多段階に分解されることによって生成するプロダクトイオンのｍ／ｚ値、シグナル強度、CIDエネルギー等から得られるプレカーサーイオンの構造に関する情報を意味する。

本発明では、工程（a）において、目的物質に対応するプレカーサーイオンから特定のｍ／ｚを有するプロダクトイオンが生成するまで、ＣＩＤエネルギーの値を変化させてＴＱ−ＭＳ測定を行う。好ましくは、プレカーサーイオンの強度がほぼ０となるまで、ＣＩＤエネルギーの値を変化させてＴＱ−ＭＳ測定を行う。

本発明の構造解析の対象となる目的物質は、ＴＱ−ＭＳ測定に供試できるものであれば、特に限定されるものではないが、糖鎖であることが好ましい。糖鎖としては、生体組織又は細胞等から得られたものでもよいし、合成されたタンパク質に結合したものから得られたものでもよく、また、それらを酸加水分解又は酵素分解したり、ＨＰＬＣ等で分離精製したもの等を用いることができる。また、化学合成された糖鎖を用いることもできる。

次いで、工程（ｂ）において、変化させたＣＩＤエネルギーの各値において、プレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率と、特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する百分率とを求める。具体的には、工程（ａ）において得られたＴＱ−ＭＳ測定データに基づいて、ＣＩＤエネルギーの各値におけるプレカーサーイオンの強度の総イオン強度に対する百分率と、特定のｍ／ｚのプロダクトイオン強度の総イオン強度に対する百分率とを求める。すなわち、ＣＩＤエネルギーを印加してＴＱ−ＭＳ測定を開始する時点では、プレカーサーイオン量は総イオン量に相当し、その百分率の値は１００％となる。

工程（ｂ）において、ＣＩＤエネルギーをＸ軸とし、かつ百分率をＹ軸として、上記の通り得られたプレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率と、特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する百分率とをプロットしてグラフを作成し、各ｍ／ｚ値を有するプレカーサーイオン及びプロダクトイオンに関するＥＲＭＳスペクトルを取得してもよい。本明細書では、このようなＥＲＭＳスペクトルの一例として、下記実施例に関する図５ａのグラフが示されている。ＥＲＭＳスペクトルは、ＣＩＤエネルギー及び上記各イオン量の百分率の二つをパラメータとする複数のデータポイントを含む。

続いて、工程（ｃ）では、工程（ｂ）において求めたプレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率の各値を与えるＣＩＤエネルギーの各値における、前記特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する百分率の各値を抽出する。

工程（ｃ）において、プレカーサーイオンの百分率をＸ軸とし、かつプロダクトイオンの百分率をＹ軸として、上記抽出した特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する百分率の各値をプロットすることによりグラフを作成してもよい。本明細書では、このようなグラフの一例として、下記実施例に関する図５ｂのグラフが示されている。

続いて、工程（ｄ）において、工程（ｃ）において抽出した前記特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する百分率の各値について、全ての組合せの和を求める。

工程（ｄ）において、プレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率をＸ軸として、前記求めた各組合せの和の値をＹ軸方向にプロットしてグラフを作成してもよい。本明細書では、このようなグラフの一例として、下記実施例に関する図５ｃのグラフが示されている。このようにして得られるグラフには、特定のｍ／ｚ値を有するプロダクトイオンの各組合せに係る百分率の合計を示す複数の曲線が含まれる。

続いて、工程（ｅ）において、プレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率の値をｘとし、かつ工程（ｄ）において求めた各組合せの和の値をｙとする関数のうち直線近似できるものを選択し、選択した各関数を与えるプロダクトイオンのｍ／ｚ値から目的物質の構造を解析する。

上述の通り、工程（ｄ）においてグラフを作成した場合には、該グラフに含まれる複数の曲線のうち直線近似できるものを選択すれば良い。

直線近似の方法としては、当業者に公知の各種手法を用いることができる。例えば、一般に知られる最小二乗法、下記式（４）又は式（５）を用いることにより、工程（ｄ）における直線近似を行うことができる。

式（４）中、Ｓｙｘは、線形回帰曲線の残差を示し、x_j及びy_jは、データｊの座標要素を示し、a_j及びb_jは、回帰曲線の座標要素を示す。ｎ−２は、自由度である。ここで、閾値としてのＳｙｘ値は、ＴＱ−ＭＳにおいて得られたデータに応じて適宜決定することができる。好ましくは、Ｓｙｘ＝２を閾値として用いることが好ましく、この場合、Ｓｙｘの値が２以下となる曲線が直線近似により選択される。

式（５）中、x_j及びy_jは、データｊの座標要素を示し、p及びqはデータ座標のそれぞれの平均を示す。ここで、閾値としてのＲ^２値は、ＴＱ−ＭＳにおいて得られたデータに応じて適宜決定することができる。好ましくは、Ｒ^２＝0.90を閾値として用いることが好ましく、この場合、Ｒ^２の値が0.90以上となる曲線が直線近似により選択される。

本発明では、上記の通り、直線近似を行うことにより選択した各関数（グラフにおける曲線）を与えるプロダクトイオンのｍ／ｚ値から目的物質の構造を解析する。具体的には、直線近似できた関数を与える組合せに係るプロダクトイオンのｍ／ｚ値等を比較することにより、プレカーサーイオンからどのような順序で各プロダクトイオンが生成したかを解析することができる。例えば、下記実施例で使用した試料（ガリリ抗原三糖）が構造未知の化合物Ｘであると仮定した場合、本発明によれば、下記の解離経路及び構造情報を取得することが可能である。

上記解離経路において、Ｈｅｘは、ヘキソース（六炭糖）を示し、ＨｅｘＮＡｃは、Ｎ−アセチルヘキソサミンを示す。上記解離経路の情報から、化合物Ｘの構造は、Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃであることが明らかとなる。

すなわち、本発明の解析によれば、ＴＱ−ＭＳ測定においても、ＭＳ^ｎ情報を抽出することが可能となる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。

＜材料及び方法＞
（材料)
ガングリオシドＧＤ１ａ（１）は、生化学工業株式会社（日本、東京）から購入し、エステル化した。ガリリ抗原三糖（２）は、Carbohydrate Synthesis Ltd.(オックスフォード、イギリス)から購入し、過去に報告されている手順（Hase, S.; Ikenaka, T.; Matsushima, Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978, 85, 257-263.）に従い、ピリジルアミノ化した。

（機器（ＭＳ）及びデータの収集）
試料は、ポジティブモードで、Pico View ESI (nanospray) source (New Objective, Inc. MA、米国)を装備した、四重極イオントラップ型質量分析装置Esquire 3000 plus (Bruker Daltonics GmbH, Bremen, Germany)、及びAPI Q-Star pulsar i (Applied Biosystems/SCIEX, ON、カナダ)を用いて分析した。

ＴＱ−ＭＳ測定として、上記API Q-Star pulsar i Q-TOF MS装置（Analyst QSによって制御）を用いて行った実験は、以下の通りである。データ収集は、m/z１００及び２０００の間のフルスキャンで、ポジティブモードで行った。試料（1 pmol/μＬ）をメタノールに溶解し、150 nL/minの流速で、塗布されたナノスプレーチップ(New Objective, Inc. MA、米国)を用いて、イオン源に導入した。ナノスプレーのための標準的なイオンスプレー電圧は、１６００Ｖとした。窒素ガスを、カーテンガス（１５psi）及び衝突ガスとして使用した。衝突ガス圧力２．８×１０^-３torrに相応し、かつプレカーサーイオンの荷電状態及びｍ／ｚ値にに応じて２３〜６９eVに渡る衝突エネルギーと一致する機器パラメータＣＡＤ＝２で、衝突誘起解離（ＣＩＤ）測定を行った。第一及び第二のデクラスタリングポテンシャル（declustering potentials）、すなわち、ＤＰ１及びＤＰ２は、それぞれ５０Ｖ及び１５Ｖであり、フォーカシングポテンシャル(focusing potential)は２５０Ｖであった。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、低解像度モード（単位解像度未満）における四重極によるプレカーサーイオンの選択を用いて取得した。その結果、衝突セルに親の全同位体群を送り、全ての断片の同位体群を得た。ここで報告されている全てのスペクトルは、１．０分間のスキャンの平均である。

一方、上記四重極イオントラップ型質量分析装置Esquire 3000 plusによる、ＱＩＴ-ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析のための詳細な実験条件は、過去に報告されている（Kanie, O.; Kurimoto, A.; Kanie, Y.; Daikoku, S.; Ohtake, A.; Suzuki, K. Proc. Jpn. Acad. Ser. B 2009, 85, 204-215.）。

（データの処理方法）
ＥＲＭＳのグラフを得るために、以下の方程式（１）を用いた。イオン“Ｉ_Ｐ”が一連のプロダクトイオンI₁,I₂,I₃,…I_iを生成する場合、個々のイオンについての相対イオン電流を、以下の方程式（１）で定義した。この方程式（１）を用いることにより、本発明のＥＲＭＳスペクトル（図５a）が得られる。

式中、^relＣは、観測されたイオンのうちの所定のイオンのイオン電流（％）を示し、総イオン電流のパーセンテージで表される。Ｃ_Ｉiは、焦点において観測されたイオン電流を示し、Ｃ_Ｉｐは、プレカーサーイオンのイオン電流を示す。計算は、エクセル（エクセル２０００、マイクロソフト社、ワシントン、米国）を用いて作成したプログラムを用いて行った。該プログラムは、ＤＳＵＭ関数に基づくものであり、考慮に入れる同位体範囲（ｗ）を選択するようにプログラムしたものである（本実験ではｗ＝２）。

^relCをC_IPに対してプロットすることにより、図5bに示すグラフが得られる。プレカーサーイオン及びプロダクトイオンのピークの個々の強度は、百分率で標準化し、以下の式（２）により表すことができる。

フラグメントイオン(I_i) が独立して生成した場合、すなわち、全てのフラグメントイオンがプレカーサーから直接生成された場合、各イオンの強度は以下の式（３）により表すことができる。

式中、０＜ｎ≦１である。

^relＣ_Ip＝０（ｘ＝０）（プレカーサーイオンはもはや存在しない）の場合、ｙ切片（^relＣ_Ii）は、I_iの最大の応答、又はI_iの「理想的」な強度である。このように、各断片の曲線は一次関数を用いてフィットさせることができる。この事は、ＥＲＭＳ実験のために収集したデータポイントを最小化できることを意味する。

I_iが独立していない場合、ＣＩＤエネルギーの範囲に渡るプレカーサー(I_p)に対する各プロダクトイオンの比率は直線的な関係ではない。この場合、I_pの任意の組合せの合計は直線的な関係になる。そこで、全てのmイオンからI_iのlイオンのC(m,l)を考慮し、このような組合せについて各データをプロットしてグラフ（図５ｃ）を作成し、線形回帰曲線の残差（Ｓｙｘ）の標準偏差を調査した。ここで、線形回帰曲線の残差（Ｓｙｘ）は、以下の式（４）により表される。

x_j及びy_jは、データｊの座標要素を示す。a_j及びb_jは、回帰曲線の座標要素を示す。ｎ−２は、自由度である。さらに、プレカーサーイオンの強度が１００％である場合には、プロダクトイオンの強度は０％となる。このように、座標（ｘ，ｙ）＝（１００，０）を通過する回帰曲線を考慮した。Ｓｙｘ≒０の場合、イオンの間には強い関係が存在する。なお、本実験では、閾値としてＳｙｘ＝２を用いた。

＜結果＞
（広範囲のＣＩＤエネルギーに対して得られるプレカーサーに対するフラグメントイオンの比率間の直線的な関係）
まず、ＣＩＤ条件下でのプレカーサーイオンＸのＭＳ／ＭＳ分析を検討する（図１ａ）。得られたスペクトル（図１ａ）は、イオンの個々のシグナルの強度を示す。未同定の化合物の構造を決定することを目的として、比較のためにそれらシグナルの比率を得るかもしれない。一方、ＣＩＤ条件下におけるイオンＸのＥＲＭＳ分析（図１ｂ）は、通常のＭＳ／ＭＳ分析によって得ることができる情報に加え、プレカーサーイオンの分裂に必要な活性化エネルギーに関係する情報を提供する。この事実から、衝突セルで起きている化学反応に関係する情報を抽出できるかもしれない。直線関係にある一連の曲線が第二のプロットにおいて見られ、プレカーサーイオンの各百分率に対する個々のイオンの百分率を示している（図１c）。このような場合に、適用されたＣＩＤエネルギーに関わらず、プレカーサーに対するフラグメントイオンの強度の比率が一定であるという重要な情報を得ることができる。この結果から、異なるＣＩＤエネルギーにおいて得られたＭＳ／ＭＳスペクトル同士の比較が可能であることが示され、複雑なグリカンの構造決定における断片ピークの比率の比較のために極めて重要な基準が得られる（Takegawa, Y.; Deguchi, K.; Ito, S.; Yoshioka, S.; Sano, A.; Yoshinari, K.; Kobayashi, K.; Nakagawa, H.; Monde, K.; Nishimura, S.-I. Anal. Chem. 2004, 76, 7294-7303、Kameyama, A.; Kikuchi, N.; Nakaya, S.; Ito, H.; Sato, T.; Shikanai, T.; Takahashi, Y.; Takahashi, K.; Narimatsu, H. Anal. Chem. 2005, 77, 4719-4725、Ashline, D.; Singh, S.; Hanneman, A.; Reinhold, V. Anal. Chem. 2005, 77, 6250-6262）。過去の報告において検体の大部分について観察されたように、異なるＣＩＤエネルギーに対するこのような直線性が、この種のＥＲＭＳスペクトル（図１ｂ）において一般に見受けられたことは注目すべきである（非特許文献１０〜１３）。

ここで、ＱＩＴ−ＭＳ装置を用いて得られるＥＲＭＳ分析について説明する。ガングリオシドＧＤ１ａ（化合物１）のメチルエステルの解離反応は、「単純」な断片化過程に続くものの典型例であると考えることができる（図２）。ＣＩＤ条件下で、多数のフラグメントイオン（m/z 1610.9, 1245.8, 940.6, 778.6, 及び693.2）が、ナトリウム化物１（m/z 1916.1: [M + Na] ⁺ ）から形成されたことが観測された。個々の一連のデータポイントは、ボルツマン・シグモイド方程式を用いて良好にフィッティングした。プレカーサー（前駆体）−プロダクト（生成物）の関係（比率プロット）は、図２ｂに示され通り、広範囲のＣＩＤエネルギーに渡って、プレカーサーに対するフラグメントイオンの比率が一定であることを示している。

（フラグメントの断片化に起因する、ＥＲＭＳにおけるプレカーサーに対するフラグメントイオン間の非直線性）
まれに、図３に示すような複雑なＥＲＭＳスペクトルが得られる。このようなデータの取扱いは、近似の困難性ゆえに、ＥＲＭＳの定量的な分析において問題となっており、これらのスペクトル自身は「構造指紋（structural fingerprints）」と考えることができるものの、それらはそのような定量的な分析に利用されていない（Daikoku, S.; Kurimoto, A.; Mutsuga, S.; Ako, T.; Kanemitsu, T.; Shioiri, Y.; Ohtake, A.; Kato, R.; Saotome, C.; Ohtsuka, I.; Koroghi, S.; Sarkar, S. K.; Tobe, A.; Adachi, S.; Suzuki, K.; Kanie, O. Carbohydr. Res. 2009, 344, 384-394.）。このような場合には、プレカーサーに対するフラグメントイオンの比率のいくつかは直線性を示し、その他は直線性を示さず、シグナル強度のいくつか（ｆ_１、ｆ_３及びｆ_４）の合計（ｆ_１’）が直線になる（図３ｃ）。フラグメントイオンｆ_３及びｆ_４は、ｆ_１の曲線が点線（ｆ_１’）から離れた地点において、ｆ_１から生成したものと考えられた。この結果から、フラグメントイオンの断片化反応は直線離脱の地点に対応するＣＩＤエネルギーにおいて起こり始めることが示された。

ピリジルアミノ化三糖誘導体（ガリリ抗原（Galili antigen）；２）が、ナトリウム付加種(m/z 646.3)として観察され、次いで、ＱＩＴ-ＭＳを用いたＥＲＭＳ実験に供試した（図４ａ）。一見して、m/z 628.3(f₁)及び466.2(f ₃ )を伴ったフラグメントイオンの生成の間には何らかの相関があるように思われた。これを確かめるため、これらのフラグメントイオンのピーク強度の合計を取得した（図４ｂ；白い四角の記号はこれらの二つのイオンの合計を表し、黒丸は全ての断片の合計である。）。ｆ_１及びｆ _３ の強度の合計が一次関数と一致することは、これらのイオンは緊密な関係を有することを示している。さらに、これらのイオンのＥＲＭＳプロファイルから、m/z 466.2のフラグメントイオンは、m/z 628.3のイオン及びm/z 646.3のイオン（最初のプレカーサー）から生成したことは明らかである。

（三連四重極ＭＳにより得られたＭＳ／ＭＳスペクトルに含まれるＭＳ^ｎ情報）
上述の通り、選択したフラグメントイオンの強度の合計を調査することによって断片化経路を得る分析方法の潜在的有用性が示されたので、次に、ＴＱ-ＭＳを用いて、イオン[2 + Na]⁺のＥＲＭＳスペクトルを調査した。ＴＱ-ＭＳにより得られたＥＲＭＳスペクトルのプロファイルは、ＱＩＴ-ＭＳにより得られたものと全く異なっており、また、より複雑であった（図５ａ）。個々のフラグメントイオンの「生成曲線」の間の明らかな差異に加えて、ＱＩＴ-ＭＳ実験では観察されなかったm/z 304.1及び322.2のイオンが観測された。また、ＱＩＴ-ＭＳの実験において観察されたように、m/z 628.3 (f₁) 及び 466.2 (f₃)のイオンは強力な関係を有しているものと考えられた。比率プロットは、また、フラグメントイオンの多くがそれらのプレカーサーと非直線関係を有することを示した（図５ｂ）。一対を超えるフラグメントイオンが互いに関係しているものと考えられたので、個々のフラグメントイオンの組合せの合計を調査した。任意の組合せ、即ち、全体のイオン（ｍ）からのイオン（ｌ）のＣ（ｍ,ｌ）を考慮し、比率プロットにおいて線形回帰曲線の残差（Ｓｙｘ）の標準偏差を調査した（図５ｃ）。Ｓｙｘ値が小さいほど、選択される対のイオンの間の関係はより強いと考えられる。図５ｃに表される曲線のうち、直線近似により選択された曲線を構成するプロダクトイオン（フラグメントイオン）の組合せを表１に示す。表中、丸印で示されるプロダクトイオンが各曲線を構成する要素であり、各曲線に対応するＳｙｘ値が示されている。例えば、一連のフラグメントイオンｆ_１〜ｆ _３ 、及びｆ _５ ［m/z 304 (f ₅ ), 466 (f₃), 484 (f₂), 628 (f₁)］は、一定の関係を示した。

ＥＲＭＳプロファイルを全体として見ると、プレカーサー(2+Na⁺)の生成物であるf₂からイオンf₃が生成されたことが明らかとなり、また、f₃がf ₅ を生成したことが明らかになった。この結果は、ＴＱ-ＭＳにおいて得られるＥＲＭＳデータを本発明による方法により分析すれば、ＭＳ^３及び／又はＭＳ^４に等しい情報が得られることを示している。すなわち、従来技術ではＭＳ^ｎ情報を取得するために複数回のＭＳ／ＭＳ実験を行わなければならなかったのに対し、本発明によれば、ＴＱ−ＭＳを用いた１回のエネルギー分解質量分析（ＥＲＭＳ）を行えばＭＳ^ｎ情報の取得が可能である。

（構造の詳細）
表１の結果から、具体的には、以下の情報が得られる。
・f₁=[2+Na⁺](プレカーサー:646)-H-₂O(18)
・f₂=[2+Na⁺]-Hex(162) f₃= f₁-Hex、かつ、f₃= f₂-H₂O
・f ₅ = f₁-2Hex、かつ、f ₅ = f₃-Hex
なお、「Hex」はヘキソース（六炭糖）を示し、括弧内の数値はｍ／ｚ値ないし分子量を示す。上記情報から、図６に示す通り、[２＋Ｎａ] ^＋ （プレカーサーイオン；試料ガリリ抗原三糖）の解離経路に関する情報を取得することができた。

プロダクトイオンの構造に関し、イオンf₂及びf _４ は、ＰＡ残基を伴った化合物であり、f₁、f₃及びf _５ は、PA残基とN-アセチル基との間の脱水イオンであった。ヘキソース由来Ｃイオン種（f _６ ）が、また、小さいシグナルとして観測された。ＣＩＤ条件下におけるイミダゾリン構造の情報について、過去に報告がある（Kurimoto, A.; Kanie, O. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2007, 21, 2770-2778.）。全てのフラグメントイオンが化合物２の構造と相応したが、これらのｍ／ｚ値のみからは限られた情報のみ利用可能であった。上記分析から得られた情報は、次の通り、更なる詳細を提供した。すなわち、図６に示す通り、プレカーサーイオン(2+Na⁺)は、二つのグリコシド結合の開裂及び還元末端の脱水を通して、生成イオンｆ_１、ｆ_２、ｆ _４ 及びｆ_６に断片化された。ｆ_２は、さらに、脱水及びグリコシル開裂を通して、ｆ_３及びｆ _５ を生成した。イオンｆ_１は、二つのグリコシル開裂によってｆ _５ に変換された。

Claims (6)

1. （ａ）目的物質について、ＣＩＤエネルギーの値を変化させて三連四重極質量分析（ＴＱ−ＭＳ）測定を行い、
   （ｂ）各ＣＩＤエネルギーの値において、プレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率と、特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する百分率とを求め、
   （ｃ）工程（ｂ）において求めたプレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率の各値を与えるＣＩＤエネルギーの各値における、前記特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する百分率の各値を抽出し、
   （ｄ）工程（ｃ）において抽出した前記特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する百分率の各値について、全ての組合せの和を求め、
   （ｅ）プレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率の値をｘとし、かつ前記求めた各組合せの和の値をｙとする関数のうち直線近似できるものを選択し、選択した関数の間で各関数を与えるプロダクトイオンの組合せを比較し、かつプロダクトイオンのｍ／ｚ値を比較することにより目的物質の構造を解析することを含む、
   物質の構造解析方法であって、
   工程（ｅ）において、ＭＳ ^ｎ 情報を取得する、方法。
2. 工程（ｂ）において、ＣＩＤエネルギーの値をＸ軸とし、かつ百分率の値をＹ軸として、プレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率と、特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する百分率とをプロットしてグラフを作成する、請求項１に記載の方法。
3. 工程（ｃ）において、プレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率をＸ軸として、前記特定のｍ／ｚのプロダクトイオン量の総イオン量に対する各百分率をＹ軸方向にプロットしてグラフを作成する、請求項１又は２に記載の方法。
4. 工程（ｄ）において、プレカーサーイオン量の総イオン量に対する百分率をＸ軸として、前記求めた各組合せの和の値をＹ軸方向にプロットしてグラフを作成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 工程（ｅ）における直線近似を以下の式（４）を用いて行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法：
   

   

   式中、Ｓｙｘは、線形回帰曲線の残差を示し、x_j及びy_jは、データjの座標要素を示し、a_j及びb_jは、回帰曲線の座標要素を示し、ｎ−２は、自由度である。
6. 前記目的物質が糖鎖である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

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