JP6831337B2 - 質量スペクトルデータを処理する技術 - Google Patents

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Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、参照により本明細書に組み込む、２０１５年５月２９日付けの米国仮特許出願第６２／１６８，１２３号、「質量スペクトルデータを処理する技術」の優先権を主張する。
本出願は、全体として、サンプルの質量スペクトル分析を行うことによって得られるデータを処理する技術に関する。
質量分析法（ＭＳ）は、サンプル中の分子種を同定し定量化するのに広く使用されている。分析中、サンプルからの分子は質量分析部（mass analyzer）に導入され、イオン化されて電荷を獲得することによって、イオンを形成する。分析器は、分子の質量対分子が獲得した電荷の比で、即ち質量電荷比ｍ／ｚで、分子のイオンのそれぞれに応答する。検出器は、イオンの特定のｍ／ｚでイオンの強度に関連する信号を生成する。
クロマトグラフ分離技術が、サンプルを質量分析計に注入する前に行われることがある。クロマトグラフィは、溶液中に保持されているものなどの化合物を分離する技術であり、化合物は、溶液と接触している分離媒体に対して異なる親和性を呈する。溶液がかかる不動の媒体を通って流れるにつれて、化合物は互いに分離する。一般的なクロマトグラフ分離装置としては、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）及び液体クロマトグラフ（ＬＣ）が挙げられる。質量分析計に連結されると、結果として得られるシステムは、ＧＳ／ＭＳ又はＬＣ／ＭＳシステムと呼ばれる。ＧＣ／ＭＳ又はＬＣ／ＭＳシステムは、一般的にはオンラインシステムであり、ＧＣ又はＬＣの出力がＭＳに直接連結される。
ＬＣ／ＭＳシステムでは、サンプルは特定の時間に液体クロマトグラフィシステムに注入され、それによってシステムが起動してデータが獲得される。液体クロマトグラフィでは、サンプルが時間に伴って溶出して、分離された検体がカラムから出る。特定の検体がカラムから出る時間は、その保持時間と呼ばれる。液体クロマトグラフから出る溶出液は、質量分析計のイオン化源に継続的に導入される。分離が進行するにしたがって、ＭＳによって発生する質量スペクトルの合成が展開し、溶出液の組成の変化を反映する。
一般的に、規則的な時間間隔で、コンピュータベースのシステムがスペクトルをサンプリングし記録する。イオンの強度応答は、そのスペクトルに見られるピークの高さ又は面積である。従来のＬＣ／ＭＳシステムによって発生するスペクトルは、更に分析されることがある。イオンの質量又は質量電荷比の測定は、そのイオンを包含するスペクトルピーク（強度対ｍ／ｚ）を調べることによって得られる。イオンの保持時間は、そのイオンを包含するクロマトグラムピーク（強度対時間）を調べることによって得られる。
二段階の質量分析（タンデム型質量分析法とも呼ばれるＭＳ／ＭＳ）も行われることがある。ＭＳ／ＭＳの１つの特定のモードは、プロダクトイオンスキャニングとして知られており、特定のｍ／ｚ値の親プリカーサーイオンが、質量分析の第１段階で第１の質量フィルタ／分析器によって選択される。選択されたプリカーサーイオンは、次に衝突セルに通され、そこでフラグメンテーションされてプロダクトフラグメントイオンが生成される。プロダクトフラグメントイオンは、次に、第２の質量フィルタ／分析器で分析される。
本明細書の技術の一態様は、サンプル分析を行う方法であり、方法は、質量分析を行う質量分析計を含む１つ又は２つ以上の機器を使用してサンプルを分析するステップであって、質量分析計が分析においてスケジュールにしたがって動作し、スケジュールが、複数のスキャンをそれぞれ含む複数のサイクルに使用される質量分離ウィンドウを含み、分析が、複数のサイクルのうち各サイクルの開始時に第１の低エネルギースキャンを行うことであって、第１の低エネルギースキャンがプリカーサーイオンのｍ／ｚ範囲を表す関連ｍ／ｚ範囲を有する、ことと、第１の低エネルギースキャンの関連ｍ／ｚ範囲に対してフラグメンテーションが行われるまで、上昇エネルギースキャンで異なる質量分離ウィンドウを反復して使用することとを含む、ステップと、分析の結果として実験データを取得するステップであって、実験データが、質量分析計を使用して１つ又は２つ以上の低エネルギーデータの獲得を行う際に得られる低エネルギースキャンデータを含む、ステップと、低エネルギースキャンデータを使用して、プリカーサー電荷クラスタを決定するステップと、第１のプリカーサーイオンを同定するプリカーサー電荷クラスタの部分を連鎖させることによって、第１のプリカーサーイオンのピークプロファイルを決定するステップであって、該部分中のプリカーサー電荷クラスタのそれぞれが、異なる低エネルギースキャンによるものである、ステップと、を含む。方法は、ｍ／ｚ及び保持時間を含む複数の次元を有する有界領域を決定するステップと、有界領域に対してフラグメンテーションが行われるまで、上昇エネルギースキャンで異なる質量分離ウィンドウを反復して使用するステップとを含んでもよい。分析は、イオンモビリティースペクトロメトリーを行うことを含んでもよく、有界領域の複数の次元はドリフト時間を含む。スケジューラは、第１の低エネルギースキャンの関連ｍ／ｚ範囲に対して、上昇エネルギーデータ獲得が行われているか否かを追跡してもよい。質量分離ウィンドウの少なくとも第１の部分は、フラグメンテーションに対してほぼ同じ数のプリカーサーイオンを選択することにしたがって決定されたサイズ及び関連ｍ／ｚ範囲を有してもよく、分析は、第１の部分の各質量分離ウィンドウに対して上昇エネルギーデータ獲得を行うことを含んでもよく、それにより、各質量分離ウィンドウ内のｍ／ｚ値を有する、随伴する低エネルギースキャンのイオンが、上昇エネルギーデータ獲得においてフラグメンテーションされる。スケジュールは、複数のサイクルのそれぞれにおける中央及び平均のクロマトグラフピーク幅、並びに行われるスキャンの最小数のいずれかにしたがって決定される、複数のサイクルのそれぞれのサイクル時間を含んでもよい。スケジュールの質量分離ウィンドウは、狭帯域質量分離ウィンドウ及び広帯域質量分離ウィンドウを含んでもよい。狭帯域分離ウィンドウのそれぞれは、第１の最小値から第１の最大値までの範囲の対応するサイズを有してもよく、広帯域分離ウィンドウのそれぞれは、第２の最小値から第２の最大値までの範囲の対応するサイズを有してもよく、第１の最大値は第２の最小値よりも小さくてもよい。狭帯域質量分離ウィンドウ及び広帯域質量分離ウィンドウのそれぞれの中央ｍ／ｚ値は、スキャンサイクルと共に変化してもよい。方法は、第１の低エネルギースキャンの第１のプリカーサー電荷クラスタを構築する第１の処理を行うステップを含んでもよく、第１の処理は、第１の低エネルギースキャンで第１のイオンを選択するステップであって、第１のイオンが、第１の低エネルギースキャンにおける全てのイオンのうち最小のｍ／ｚ値である第１のｍ／ｚを有する、ステップと、複数のΔｍ／ｚ値を受け取るステップであって、複数のΔｍ／ｚ値のそれぞれが、複数の電荷状態の異なる１つと関連付けられ、各Δｍ／ｚ値が、複数の電荷状態のうちの関連する異なる１つを有する同位体クラスタのうち任意の２つの連続する同位体間の理論上のｍ／ｚ距離を表す、ステップと、複数の電荷状態の降順にしたがって複数のΔｍ／ｚ値を横断して、複数のΔｍ／ｚ値の１つと第１のイオンに対する第１のｍ／ｚの合計に等しい関連ｍ／ｚ値を有する第２のイオンが、第１の低エネルギースキャン中に存在するか否かを判断するステップであって、横断するステップが、単一のイオンを探索して第２のイオンとして定量化した後で終了する、ステップと、複数のΔｍ／ｚ値の１つと第１のイオンに対する第１のｍ／ｚの合計に等しい関連ｍ／ｚ値を有する第２のイオンが、第１の低エネルギースキャン中に存在するとの判断に応答して、第２のイオンが、第１のイオンに続く連鎖中の次の同位体であると判断するステップとを含んでもよい。方法は、第１の低エネルギースキャンからの更なるイオンを連鎖に追加するステップであって、更なるイオンのそれぞれが、第１のｍ／ｚと複数のΔｍ／ｚ値のうち１つの倍数との合計に等しい関連ｍ／ｚを有する、ステップを含んでもよい。第１の低エネルギースキャンにおけるイオンの連鎖は、候補のプリカーサー電荷クラスタであってもよく、方法は、同位体モデルを使用して、候補のプリカーサー電荷クラスタを検証する処理を行うステップを含んでもよい。処理は、同位体モデルにしたがって、候補のプリカーサー電荷クラスタに含まれるイオンの属性を改訂するステップを含んでもよい。第１のプリカーサーイオンに対する第１のプリカーサー電荷クラスタは、第１の低エネルギースキャンに含まれてもよく、方法は、質量誤差に基づいて、第１の低エネルギースキャンにおいて第１のプリカーサーイオンに対する干渉があるか否かを判断し、それにより、同じ時間の少なくとも一部分に対して別のイオンが第１のプリカーサーイオンとして共溶出する、ステップと、第１の低エネルギースキャンにおける第１のプリカーサーイオンに対する第１の質量誤差が、規定の容認可能な質量誤差範囲外か否かを判断するステップと、第１の質量誤差が規定の容認可能な質量誤差範囲外であるとの判断に応答して、第１のプリカーサーイオンに対する干渉があると判断するステップと、第１の低エネルギースキャンに続く複数のスキャンに関して、第１のプリカーサーイオンに対する干渉があると判断するステップであって、複数のスキャンに対する質量誤差が規定の容認可能な質量誤差範囲内である、ステップと、複数のスキャンに続く第２の低エネルギースキャンにおけるプリカーサーイオンに対する第２の質量誤差が、規定の容認可能な質量誤差範囲内であるか否か、かつ第２の質量誤差が、第１の質量誤差に対して補完的な質量誤差値であるか否かを判断するステップと、第２の質量誤差が規定の容認可能な質量誤差範囲外であり、第１の質量誤差に対して補完的な質量誤差値ではないとの判断に応答して、第１のプリカーサーイオンに対する干渉が終わり、第２の質量誤差が第１の質量誤差に対して補完的な質量誤差値であると判断するステップとを含んでもよい。実験データは、質量分析計を使用して上昇エネルギーデータ獲得を行ったときに得られる、上昇エネルギースキャンデータを含んでもよい。プリカーサー電荷クラスタの部分は、低エネルギースキャンの第１の組におけるプリカーサー電荷クラスタのフラグメンテーションの結果として発生するフラグメントイオンを含む、対応する上昇エネルギースキャンを有する低エネルギースキャンの第１の組に含まれてもよい。方法は、プリカーサー電荷クラスタの部分から第１のプリカーサー電荷クラスタを選択するステップであって、第１のプリカーサー電荷クラスタが、対応する第１の上昇エネルギースキャンを有する第１の低エネルギースキャンに含まれる、ステップと、第１のプリカーサー電荷クラスタのフラグメンテーションによって生じる、第１の上昇エネルギースキャンからの１つ又は２つ以上のフラグメントイオンのフラグメントセットを決定するステップとを含んでもよい。方法は、第１のプリカーサー電荷クラスタ及びフラグメントセットを含む、複合プリカーサープロダクトイオンスペクトルを構築するステップと、複合プリカーサープロダクトイオンスペクトルをデータベースに記憶するステップとを含んでもよい。ピークプロファイルを形成するように連鎖させた、プリカーサー電荷クラスタの部分におけるプリカーサー電荷クラスタのそれぞれは、異なる低エネルギースキャン内にあってもよく、プリカーサー電荷クラスタのそれぞれは、各プリカーサー電荷クラスタの強度と異なる低エネルギースキャンにおける合計イオン強度の比を表す、関連するイオン電流を有してもよい。第１の低エネルギースキャンにおける第１のプリカーサー電荷クラスタは、部分内のプリカーサー電荷クラスタに対する全イオン電流のうち最大イオン電流を有してもよい。サンプルは１つ又は２つ以上のタンパク質を含んでもよい。５つのポイントの最小数が、ピークを形成するのに使用されてもよい。方法は、サンプルを含む複数のサンプルの複数の注入を行うステップと、１つ又は２つ以上の機器を使用して複数のサンプルのそれぞれを分析するステップとを含んでもよく、複数のサンプルのそれぞれの分析が、ｍ／ｚ及び保持時間を含む第２の複数の次元を有する第２の有界領域に対してフラグメンテーションが行われるまで、上昇エネルギースキャンで異なる質量分離ウィンドウを反復して使用することを含み、第２の有界領域が、複数の注入のうち少なくとも２つの連続する注入にわたるサンプル分析の結果として、第１の時間に完全にサンプリングされ、それにより、２つの連続する注入のうち第１の注入において複数のサンプルのうち第１のものを分析した結果として得られる第１の実験データが、２つの連続する注入のうち第２の注入に対する第２のスケジュールを自動的に決定するスケジューラに対する入力として提供され、スケジューラが、第１の実験データを使用して、第２の有界領域のうちまだサンプリングされていない第１の部分を判断し、第２の注入に対して行われるサンプル分析と関連して第１の部分のサンプリングをスケジューリングする。第２の有界領域の第２の複数の次元は、ドリフト時間を含んでもよく、第２の有界領域の完全なサンプリングは、第２の有界領域の第２の複数の次元のそれぞれと関連付けられた範囲を完全にサンプリングすることを含んでもよい。スケジューラによって第２のスケジュールを決定するのに使用される第１の実験データは、複数の異なるｍ／ｚ範囲ビンのそれぞれにおける検出イオンの頻度、サンプリングされた保持時間対ｍ／ｚの分布、サンプリングされたドリフト時間対ｍ／ｚの分布、及びサンプリングされたドリフト時間対保持時間の分布を表す、イオン流束に関する情報のうち任意の１つ又は２つ以上を含んでもよい。
本明細書の技術の別の態様によれば、システムであって、質量分析を行う質量分析計を含む１つ又は２つ以上の機器と、コードを実行するプロセッサと、実行されると、サンプル分析方法を行うコードが格納された、メモリとを備え、方法は、１つ又は２つ以上の機器を使用してサンプルを分析するステップであって、質量分析計が分析においてスケジュールにしたがって動作し、スケジュールが、複数のスキャンをそれぞれ含む複数のサイクルに使用される質量分離ウィンドウを含み、分析が、複数のサイクルのうち各サイクルの開始時に第１の低エネルギースキャンを行うことであって、第１の低エネルギースキャンがプリカーサーイオンのｍ／ｚ範囲を表す関連ｍ／ｚ範囲を有する、ことと、第１の低エネルギースキャンの関連ｍ／ｚ範囲に対してフラグメンテーションが行われるまで、上昇エネルギースキャンで異なる質量分離ウィンドウを反復して使用することと、を含む、ステップと、分析の結果として実験データを取得するステップであって、実験データが、質量分析計を使用して１つ又は２つ以上の低エネルギーデータの獲得を行う際に得られる低エネルギースキャンデータを含む、ステップと、低エネルギースキャンデータを使用して、プリカーサー電荷クラスタを決定するステップと、第１のプリカーサーイオンを同定するプリカーサー電荷クラスタの部分を連鎖させることによって、第１のプリカーサーイオンのピークプロファイルを決定することであって、該部分中のプリカーサー電荷クラスタのそれぞれが、異なる低エネルギースキャンによるものである、ステップと、を含む。
図面中、類似の参照符号は一般に、異なる図全体を通して同じ部分を指す。また、図面は必ずしも縮尺通りではなく、その代わり、一般に、本明細書に記載される技術の原理を例証するにあたって強調がなされている。
本明細書の技術の一実施形態によるシステムを示すブロック図である。 本明細書の技術の一実施形態による一連の質量スペクトルを示す３つの関連するグラフである。 本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよい構成要素及びデータの一例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよいＭＳスキャンデータの例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよいＭＳスキャンデータの例を示す図である。 分子の指紋又はパターンに含まれる情報を生成する、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理を例証する例を示す図である。 分子の指紋又はパターンに含まれる情報を生成する、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理を例証する例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態でスキャンごとに検出されてもよいＰＣＣ（プリカーサー電荷クラスタ）の溶出ピークの一例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよい情報を示す表である。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップを示すフローチャートである。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップを示すフローチャートである。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップを示すフローチャートである。 本明細書の技術による一実施形態における分子の指紋に含まれてもよい情報の一例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップを示すフローチャートである。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップを示すフローチャートである。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップを示すフローチャートである。 本明細書の技術による一実施形態で溶出時間にわたって使用されてもよい異なる衝突エネルギー設定を示す模式図である。 本明細書の技術による一実施形態で溶出時間にわたって使用されてもよい異なる衝突エネルギー設定を示す模式図である。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップを示すフローチャートである。 教師ありクラスタリング（supervisedclustering）などの本明細書の技術による一実施形態で使用されるたんぱく質抗体（ＰＡ）に含まれてもよい情報の一例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい様々なワークフローを例証する例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップを示すフローチャートである。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい様々なワークフローを例証する例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい様々なワークフローを例証する例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよいプリカーサーΔ質量及び関連するモノアイソトピック質量の表の一例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップを示すフローチャートである。 ジスルフィド結合形成を例証する一例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい様々なワークフローを例証する例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップを示すフローチャートである。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップを示すフローチャートである。 本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよい様々な保持時間におけるプリカーサーイオンｍ／ｚ（質量対電荷）値の頻度分布を例証する一例を示す図である。 本明細書に記載される多重モード獲得（ＭＭＡ）技術を行う一実施形態による、異なるサイクルスキャンにおける可変の質量分離ウィンドウ（ＭＩＷ）及びデータ獲得を例証する一例を示す図である。 本明細書に記載されるＭＭＡ技術の一実施形態で使用されてもよい、異なるｍ／ｚビン又は間隔の頻度分布ヒストグラムの一例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよい、ＭＩＷ設定が単一サイクルで可変のｍ／ｚウィンドウ及び可変の幅を含むことを例証する一例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよい様々な所定の衝突エネルギー値の表の一例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップを示すフローチャートである。 本明細書の技術による一実施形態の様々なデータ獲得技術と関連して行われてもよいものなど、補間を使用したプリカーサーイオン又はＰＣＣ強度の決定を例証する一例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよいワークフローを例証する一例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよいシミュレータ入力の例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよいシミュレータ入力の例を示す図である。 図３５のワークフローを行う一実施形態のスケジュールと関連付けられた入力及び出力の一例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態において図３５のワークフローで使用されてもよい空間マッピングの一例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよい電荷状態ベクトルを例証する一例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態において、プリカーサー電荷クラスタに対する電荷状態の割当てと関連して使用されてもよい表の一例を示す図である。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップを示すフローチャートである。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい様々な技術を示す模式図である。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい様々な技術を示す模式図である。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい様々な技術を示す模式図である。 本明細書の技術による一実施形態における強度フィルタ処理を示す模式図である。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップを示すフローチャートである。 本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップを示すフローチャートである。
本明細書で使用するとき、以下の用語は概して指示される意味を指す。
「クロマトグラフィ」は、化合物の分離で使用される装置及び／又は方法を指す。クロマトグラフィ装置は、一般的に、流体及びサンプル検体を、圧力及び／又は電気力及び／又は磁力下で移動させる。「クロマトグラム」という語は、文脈に応じて、本明細書では、クロマトグラフィ手段によって得られるデータ又はデータ表現を指す。クロマトグラムは、２つ以上の値でそれぞれ構成される一連のデータ点を含むことができ、これらの値の１つは、スキャン時間又は対応するクロマトグラフィ保持時間であってもよく、残りの値は、一般的に強度又は大きさの値と関連付けられ、それらはサンプルの溶出成分の量又は濃度に対応する。本明細書の技術と関連して、サンプル検体は、１つ又は２つ以上の化合物、分子、又は対象の成分を含んでもよい。
サンプル検体は、組成物、混合物、溶液、物質、固体、組織、又はより一般的には、分析される任意の物質を指してもよい。本明細書の技術と関連して、サンプルは、１つ又は２つ以上の化合物、分子、又は対象の成分を含んでもよい。サンプル又は対象の成分は、一般に、例えば、有機化合物、代謝物、及び有機化合物などの小分子、並びにタンパク質又はペプチドなどの大分子を含む、任意の分子であってもよく、あるいはそれらを含んでもよい。
保持時間は、文脈においては、溶出成分がその最大強度に達する、クロマトグラフィプロファイルにおける時間を指す。
イオンは、文脈においては、質量分析計（ＭＳ）を使用して検出され、ＬＣ／ＭＳシステムでの実験を行った結果として発生する、サンプル検体のイオン化分子である。そのため、イオンは、その保持時間、ｍ／ｚ（質量電荷比）、及び強度測定値によって特徴付けられる。
ＬＥ（衝突セルの低エネルギー状態）は、プリカーサーイオンデータを指し、獲得方法とは独立している。ＬＥデータは、データ依存型及び独立型両方の獲得モードを利用して獲得することができる。
ＨＥ（衝突セルの高エネルギー状態）は、プロダクト／フラグメントイオンデータであり、獲得方法とは独立している。ＨＥデータは、データ依存型及び独立型両方の獲得モードを利用して獲得することができる。高エネルギーモードはまた、上昇エネルギー（ＥＥ）モードと呼ばれることもある。
ドリフトは、文脈においては、ガス相におけるイオンモビリティーの測定値を指す。質量分析計内に蓄積した更なる実験セルが、ドリフト並びにｍ／ｚによって、ガス相イオンをそれらのモビリティーにしたがって分離して、イオン分離の更なる次元を提供する。イオンモビリティーは、ドリフト時間の適切な校正及び変換によって、衝突断面積（ＣＣＳＡ）として表現される、イオン化分子の構造上のサイズに関係する。この技術は、イオンモビリティースペクトロメトリー（ＩＭＳ）と呼ばれる。
イオン指紋は、検証に使用される全ての実験データにわたる各プロダクトイオンの相対強度のばらつきにおける基準を含む、分子全体の検証されたプロダクトイオンスペクトルを指す。
本明細書の技術による一実施形態では、イオンの強度値は、その測定強度に対応するピークを表すその曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいてもよい。各強度値は、記録されたパルスのガウス分布によって形成されるものなど、曲線下面積として決定されてもよい。このように、本明細書に記載されるような様々な強度比は、面積比として特徴付けられてもよい。
一般に、ＬＣ／ＭＳシステムが、サンプル分析を行うのに使用されてもよく、例えば、タンパク質又はペプチド、並びに医薬品又は除草剤などの小分子を、その質量、電荷、保持（溶出）時間、及び強度の観点で経験的に説明してもよい。分子がクロマトグラフィカラムから溶出すると、その強度プロファイル又はピーク形状が特定の時限にわたって出現し、その保持時間にその最大又はピーク信号に達する。質量分析と関連するものなどのイオン化及び（場合によっては）フラグメンテーションの後、化合物が関連するイオンのセットとして出現する。
ＬＣ／ＭＳ分離では、イオン化分子は、単一又は複数の帯電状態で存在してもよい。ＭＳ／ＭＳはまた、ＬＣ分離と組み合わせて行うことができるタンデム型質量分析と呼ばれることもある（例えば、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳと表される）。
次に、技術及び実施形態について、ＬＣ／ＭＳ実験を行うことによってサンプルを分析するシステムにおけるサンプル分析向けなどであってもよい、サンプルを分析する例示的な方法及び装置を参照して記載する。本明細書に記載される技術は、他の実施形態と関連して使用されてもよく、例証及び例示の目的で本明細書に提供され列挙され得るようなものよりも広範な用途を有してもよいことが認識されるであろう。
図１は、本明細書の技術にしたがって使用されてもよいシステムの概略図である。サンプル１０２は、インジェクタ１０６を通して、液体クロマトグラフィシステム１０４の流体流に注入される。ポンプ１０８は、移動相溶媒をインジェクタに供給し、カラム１１０を通してサンプルを給送して、サンプル検体混合物を、カラムから出てそれらの保持時間によって観察される溶出成分へと分離する。
カラムからの出力は、質量分析計１１２に導入されて分析される。一実施形態で使用される質量分析計１１２に含まれる特定の構成要素は、利用される質量分析計の特定のタイプに伴って変わってもよいことが注目されるべきである。要素１１２の説明に続いて、いくつかの構成要素が質量分析計１１２に含まれてもよいが、それらは単純にするために図１には示されない。最初に、サンプルが、質量分析計の脱溶媒和／イオン化デバイスによって脱溶媒和されイオン化される。脱溶媒和は、例えば、ヒータ、ガス、ガスと組み合わせたヒータ、又は他の脱溶媒和技術を含む、任意の技術であることができる。イオン化は、例えば、電気スプレー電離（ＥＳＩ）、大気圧化学電離（ＡＰＣＩ）、マトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ）、又は他のイオン化技術を含む、任意のイオン化技術によるものであることができる。イオン化によって得られるイオンは、イオンガイドに適用される電圧勾配を伴って、質量分析計の衝突セルに供給される。衝突セルは、（低エネルギーモードで）プリカーサーイオンを通すのに、又は（高エネルギーモードで）プリカーサーイオンをフラグメンテーションするのに使用することができる。
本明細書の他の箇所で更に詳細に記載されるように、参照により本明細書に組み込まれるＢａｔｅｍａｎらへの米国特許第６，７１７，１３０号（「Ｂａｔｅｍａｎ」）に記載されているものを含む、交流電圧を衝突セルに印加してフラグメンテーションを行うことができる、異なる技術が使用されてもよい。スペクトルは、低エネルギーではプリカーサー（衝突なし）に、高エネルギーではフラグメント（衝突の結果）に集中する。
分離技術としては、ｍ／ｚ、ｍ／ｚと強度、ｍ／ｚと強度とイオンモビリティードリフトなどの基準によって、又はｍ／ｚ、ｍ／ｚと強度、ｍ／ｚと強度とドリフトのいずれかを含む、標的化合物のリストを包含若しくは除外することによって、プリカーサーイオンが選択される、質量選択ウィンドウの連続適用が挙げられる。ここでは、ｍ／ｚ値が選択され、第１の質量分析部、一般的には四重極が質量分離ウィンドウに設定され、質量分離ウィンドウ内にあるプリカーサーイオンのみが衝突セルへと移送されてフラグメンテーションが起こる。スペクトルは、選択されたプリカーサー（衝突なし）及びそれらのフラグメント（衝突の結果）に集中する。
質量分析計１１２では、衝突セルの出力は質量分析部に向けられる。質量分析部は、四重極、飛行時間（ＴＯＦ）、イオントラップ、磁気セクター質量分析部、並びにそれらの組み合わせを含む、任意の質量分析部であることができる。質量分析計の検出器は、質量分析部から発するイオンを検出する。検出器は質量分析部と一体であることができる。例えば、ＴＯＦ質量分析部の場合、検出器は、イオンの強度を計数する、即ち衝突するイオンの数を計数する、マイクロチャネルプレート検出器であることができる。
記憶媒体１２４は、分析用にイオン検出（ｍ／ｚ、保持時間、モビリティードリフト、強度計数など）を記憶する、恒久的記憶装置を提供してもよい。例えば、記憶媒体１２４は、ディスク、フラッシュベースの記憶装置など、内部又は外部コンピュータデータ記憶デバイスであることができる。分析用コンピュータ１２６は記憶データを分析する。データはまた、記憶媒体１２４に記憶する必要なしに、リアルタイムで分析することができる。リアルタイム分析では、質量分析計の検出器は、分析されるデータを最初に恒久的記憶装置に記憶することなく、コンピュータ１２６に直接渡す。
質量分析計１１２の衝突セルは、プリカーサーイオンのフラグメンテーションを行う。フラグメンテーションは、ペプチドの一次配列を決定するのに使用し、続いて元のタンパク質の識別情報をもたらすことができる。衝突セルは、ヘリウム、アルゴン、窒素、空気、又はメタンなどのガスを含む。帯電プリカーサーがガス原子と相互作用すると、結果として得られる衝突により、プリカーサーが壊れてフラグメントイオン又はプロダクトイオンになることによって、プリカーサーをフラグメンテーションすることができる。かかるフラグメンテーションは、ペプチドプリカーサーのＭＳスペクトルが得られる低電圧状態（例えば、低エネルギー、＜５Ｖ）と、衝突によって誘発されるプリカーサーのフラグメントのＭＳスペクトルが得られる高電圧状態（例えば、高エネルギー若しくは上昇エネルギー、＞１５Ｖ）との間で衝突セルの電圧を切り替えることによって、Ｂａｔｅｍａｎに記載されている技術を使用して遂行することができる。高電圧及び低電圧は、それぞれイオンに運動エネルギーを付与するのに使用されるので、高エネルギー及び低エネルギーと呼ばれることがある。
かかるＭＳ／ＭＳの獲得に関して電圧をいつどのように切り替えるかを判断する、様々なプロトコルを使用することができる。例えば、従来の方法は、標的又はデータ依存モード（データ依存型の獲得、ＤＤＡ）のどちらかで、電圧を生じさせる。これらの方法はまた、標的プリカーサーの結合されたガス相分離（又は事前選択）を含む。低エネルギースペクトルは、リアルタイムでソフトウェアによって取得され検査される。所望の質量が低エネルギースペクトルで指定の強度値に達すると、衝突セルの電圧は高エネルギー状態に切り替えられる。高エネルギースペクトルが、次に、事前選択されたプリカーサーイオンに対して得られる。これらのスペクトルは、低エネルギーで見られるプリカーサーペプチドのフラグメントを含む。十分な高エネルギースペクトルが収集された後、データ獲得は、高エネルギー衝突分析に適した強度の他のプリカーサー質量を継続して検索するのに、低エネルギーに復帰する。
分析されたサンプルの質量分析と関連して、プリカーサーイオン及びプロダクトイオンなどのイオン情報を取得するのに、本明細書に記載されるようなシステムと共に異なる適切な方法が使用されてもよいことが注目されるべきである。従来の切替え技術を用いることができるが、実施形態はまた、電圧が単純な交番サイクルで切り替えられるフラグメンテーションプロトコルとして特徴付けられてもよい、Ｂａｔｅｍａｎに記載されている技術も使用してもよい。この切替えは、十分な高頻度で行われるので、複数の高エネルギー及び低エネルギースペクトルが単一のクロマトグラフィピーク内で得られる。従来の切替えプロトコルとは異なり、サイクルはデータの内容（ｍ／ｚ）とは独立している。Ｂａｔｅｍａｎに記載されているかかる切替え技術は、プリカーサーイオン及びプロダクトイオン両方の質量分析を有効に同時に行う。Ｂａｔｅｍａｎでは、高エネルギー及び低エネルギー切替えプロトコルは、ペプチド混合物の単一注入におけるＬＣ／ＭＳ分析の一部として適用されてもよい。単一の注入又は実験行程から獲得されるデータにおいて、低エネルギースペクトルは、主に未フラグメンテーションプリカーサーからのイオンを含み、高エネルギースペクトルは、主にフラグメンテーションプリカーサーからのイオン（例えば、プロダクトフラグメントイオン）を含む。例えば、プリカーサーイオンの一部分がフラグメンテーションされてプロダクトイオンを形成してもよく、同時間に、又は例えば、低電圧（例えば、主にプリカーサーを通す）と高電圧又は上昇電圧（例えば、主にプリカーサーフラグメントを発生させる）との間でＭＳモジュールの衝突セルに、高速切替え又は交流電圧を適用してフラグメンテーションを調整することによる高速遷移で、プリカーサーイオン及びプロダクトイオンが同時に分析される。高（又は上昇）エネルギーと低エネルギーとの間での交番の高速遷移による、Ｂａｔｅｍａｎの上記技術にしたがったＭＳの動作はまた、本明細書では、Ｂａｔｅｍａｎ技術及び高−低プロトコルと呼ばれることがある。
概して、Ｂａｔｅｍａｎ技術を使用してシステムを動作させるときなど、サンプル１０２はＬＣ／ＭＳシステムに注入される。ＬＣ／ＭＳシステムは、低エネルギースペクトルのセットと高エネルギースペクトルのセットとの、２組のスペクトルを生成する。低エネルギースペクトルのセットは、主にプリカーサーと関連付けられるイオンを含む。高エネルギースペクトルのセットは、主にプリカーサーフラグメントと関連付けられるイオンを含む。これらのスペクトルは記憶媒体１２４に記憶される。データ獲得の後、これらのスペクトルを、記憶媒体から抽出し、分析用コンピュータ１２６のアルゴリズムによって、獲得後に表示し処理することができる。
高−低プロトコルによって獲得したデータによって、低エネルギー及び高エネルギー両方のモードで収集された全てのイオンの保持時間、質量電荷比、及び強度を正確に決定することが可能になる。一般に、異なるイオンが２つの異なるモードで見られ、そこで、各モードで獲得されるスペクトルが、別個に又は組み合わせて更に分析されてもよい。
一方又は両方のモードで見られるような共通のプリカーサーからのイオンは、本質的に、同じ保持時間を共有し（またしたがってほぼ同じスキャン時間を有し）、同じＬＣピーク形状を共有するようになる。高−低プロトコルによって、単一のモード内及びモード間におけるイオンの異なる特性の意味がある比較が可能になる。この比較は、次に、低エネルギー及び高エネルギー両方のスペクトルで見られるイオンをグループ化するのに使用することができる。低エネルギースペクトルのプリカーサーイオンを、プリカーサーイオンから発する高エネルギースペクトルのフラグメントイオンとグループ化するか又は関連付ける、様々な技術が本明細書に記載される。
図２は、本明細書の技術を用いる一実施形態による、低エネルギー及び高エネルギーモードを交互に適用することによって得られるピークの溶出中に、スペクトルが取得される時間を示している。図２は、溶出プリカーサーと関連付けられるクロマトグラフィプロファイルを、複数のスペクトルスキャンにわたって、その高エネルギー及び低エネルギー両方のスペクトルデータから再構築できることを示している。
ピーク２０２は、単一のプリカーサーのＬＣ溶出ピークプロファイルを表している。水平軸は時間であり、例えば、サンプル溶出中のＭＳスキャン時間又は対応する保持時間などである。垂直軸は、プリカーサーがクロマトグラフィカラムから溶出する際の、クロマトグラフィプロファイルの時間で変動する濃度の任意表現である。
したがって、ＬＣピーク２０２の第１のグラフは、低エネルギースペクトル（即ち、未フラグメンテーションプリカーサーからのスペクトル、「ＭＳ」と表示）及び上昇エネルギースペクトル（即ち、フラグメンテーションプリカーサー、つまりプロダクトイオンからのスペクトル、「ＭＳＥ」と表示）の、時間に伴う交互の収集を示している。第２及び第３のグラフ２０４ａ及び２０４ｂはそれぞれ、ＭＳ及びＭＳＥスペクトル収集スキャンと、Ｂａｔｅｍａｎ技術を使用して生成されてもよいような、プリカーサーと関連付けられるピーク２０２の再構築とを示している。図２のプロット２０４ａ（低エネルギー）及び２０４ｂ（高エネルギー）は、水平軸が時間を表し、垂直軸がイオンの強度を表す、同じクロマトグラフィピーク２０２を示している。
質量分析計の質量分解能が高く、本質的に発生する同位体の存在が遍在的であることにより、質量分析計に入る分子は、グループ化して一連の同位体質量ピークとなり、本明細書ではそれを同位体クラスタと呼ぶ。これらのピークの存在及びその異なる強度は、特定の分子の基本的組成の特徴である。したがって、質量分析計によってイオン化された分子は、一連の同位体電荷クラスタを生成し、それにより、分子を表す固有の同位体クラスタは電荷状態の分布を呈する。したがって、特定の同位体分布及び電荷状態ｚを有するイオン化分子は、質量スペクトルにおいて、その電荷状態の逆数（ｌ／ｚ）によってそれぞれ分離された一連のｍ／ｚピークとして観察される。また、イオン化分子の電荷分布に応じて、各同位体クラスタが特定のｍ／ｚ空間で観察され、電荷が大きいほどｍ／ｚが小さく、またピーク間隔が小さい。
低エネルギーモードで生成されるイオンは主にプリカーサーイオンのものなので、それらの質量スペクトルは（前述したように）同位体電荷クラスタとして現れる。高エネルギーモードでは、イオンは主にプリカーサーのプロダクトフラグメントイオンである。そのため、フラグメントイオンの同位体電荷クラスタ分布は、プリカーサーの結果として得られるフラグメント質量及び低減された電荷状態に応じて決まる。
ピーク２０２のプロットでは、異なる密度の交互の棒は、図示されるＬＣピークの溶出中に低エネルギー及び高エネルギー電圧を用いてスペクトルが収集された時間を表す。棒は均一な時間で交番する。プロット２０４ａは、低エネルギー電圧が衝突セルで印加されて、低エネルギースペクトルをもたらした時間を例示的に示している。プロット２０４ｂは、高エネルギー電圧が衝突セルで印加されて、高エネルギースペクトルをもたらした時間を示している。２０４ａ及び２０４ｂに示されるように、クロマトグラフィピークは、高エネルギー及び低エネルギーモードによって複数回サンプリングされる。このように、サンプルは、低エネルギー及び上昇エネルギー両方のモードで同位体電荷クラスタを生成する。
したがって、単一の実験行程又はサンプル注入に対して、Ｂａｔｅｍａｎに記載されているような高−低プロトコルを使用してＭＳ機器を動作させたとき、分析によって、主にプリカーサーイオンデータを含む、２０４ａによって表される低エネルギー質量スペクトルデータの第１のセットと、主にフラグメントイオンデータを含む、２０４ｂによって表される高エネルギー又は上昇エネルギー質量スペクトルデータの第２のセットとが取得されてもよい。
更に詳細に後述されるように、質量スペクトル分析の結果として生成されるかかるデータは、一般に、スキャン時間又は獲得時間を含む。
いくつかの実施形態では、図１のシステムは、分離の更なる次元としてイオンモビリティースペクトロメトリー（ＩＭＳ）を更に行うため、質量分析部の構成要素（又は別個の構成要素若しくは機器として）を更に含んでもよい。かかる実施形態では、質量スペクトルデータの更なる処理は、結果として得られる第１の形態の質量スペクトルデータスキャン時間を、対応する保持時間に、また対応するイオンモビリティードリフト時間に変換してもよい。本明細書の他の箇所で更に詳細に記載されるように、本明細書の技術は、スキャン時間を用いた第１の形態の質量スペクトル分析データに対する処理を行ってもよい。
図１に戻ると、動作の際、サンプル１０２は、インジェクタ１０６を介してＬＣ １０４に注入される。ポンプ１０８は、カラム１１０を通してサンプルを給送し、サンプルは、カラム１１０から出る保持時間によって特徴付けられる溶出構成要素内へと分離される。インジェクタ１０６を通してポンプ１０８によって提供される高圧の溶媒流によって、サンプル１０２が、液体クロマトグラフィシステム１０４のクロマトグラフィカラム１１０を通して移行させられる。カラム１１０は、一般的に、表面が結合分子を含む、シリカビーズのパッキングを備える。カラム１１０からの出力流体流は、分析のためにＭＳ １１２に方向付けられる。一実施形態では、ＬＣ １０４は、マサチューセッツ州ミルフォード（Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のＷａｔｅｒｓ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）システムなど、超高性能液体クロマトグラフィ（ＵＰＬＣ）システムであってもよい。
ＭＳ １１２の質量分析部は、例えば、四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析部を含む、様々な構成において縦列で配置することができる。縦列構成によって、既に質量分析された分子のオンラインでの衝突修正及び分析が可能になる。例えば、三連四重極型質量分析部（Ｑ１−Ｑ２−Ｑ３又はＱ１−Ｑ２−ＴＯＦ質量分析部など）では、第２の四重極（Ｑ２）が、第１の四重極（Ｑ１）によって分離されたイオンに加速電圧を付与する。これらのイオンは、Ｑ２に明確に導入されるガスと衝突する。イオンはこれらの衝突の結果としてフラグメンテーションする。これらのフラグメントは、第３の四重極（Ｑ３）によって、又はＴＯＦによって更に分析される。一実施形態では、ＭＳ １１２は、例えば、マサチューセッツ州ミルフォード（Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のＷａｔｅｒｓ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＳＹＮＡＰＴ Ｇ２（商標）Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒなどの、ＱＴＯＦ質量分析計であってもよい。
出力として、ＭＳ １１２は、時間に伴って収集される一連のスペクトル又はスキャンを発生させる。質量電荷スペクトルは、ｍ／ｚの関数としてプロットされる強度である。要素ごとに、スペクトルの単一の質量電荷比はチャネルと呼ばれることがある。時間に伴って単一の質量チャネルを検査することによって、対応する質量電荷比に対するクロマトグラムが得られる。獲得された質量電荷スペクトル又はスキャンは、コンピュータ１２６にアクセス可能である、要素１２４によって表されるハードディスクドライブ又は他の記憶媒体などの、記憶媒体に記録することができる。一般的に、スペクトル又はクロマトグラムは、値の配列として記録され、記憶装置１２４に記憶される。１２４に記憶されたスペクトルは、分析などに続いて、表示などのために、コンピュータ１２６を使用してアクセスされてもよい。制御手段（図示なし）は、ＭＳ １１２など、システム１００の構成要素に対して必要な動作電位をそれぞれ提供する、様々な電力源（図示なし）に対する制御信号を提供する。これらの制御信号は機器の動作パラメータを決定する。制御手段は、一般的に、コンピュータ１２６など、コンピュータ又はプロセッサからの信号によって制御される。
分子がカラム１０６から溶出すると、ＭＳ １１２に搬送することができる。保持時間は特性的な時間である。つまり、保持時間ｔにカラムから溶出する分子は、実際には、時間ｔを本質的に中心とする時限にわたって溶出する。時限にわたる溶出プロファイルは、クロマトグラフィピーク又はＬＣピークと呼ばれる。クロマトグラフィピークの溶出プロファイルは、一般的に、鐘形又はガウス曲線によって特徴付けられる。ピークの鐘形は、一般的に、その半値幅（ＦＷＨＭ）によって説明される幅を有する。分子の保持時間は、ピークの溶出プロファイルの頂点の時間である。質量分析計によって生成されたスペクトルに現れるスペクトルピークは、同様の形状を有し、同様の形で特徴付けることができる。
記憶装置１２４は、任意の１つ又は２つ以上のタイプのコンピュータ記憶媒体及び／又はデバイスであってもよい。当業者には認識されるように、記憶装置１２４は、コンピュータ可読命令、データ構造、プログラムモジュール、又は他のデータなどの情報を記憶するのに、任意の方法又は技術で実装される、揮発性及び不揮発性、取外し可能及び取外し不能の媒体を含む、様々な異なる形態のうち任意の１つを有する、任意のタイプのコンピュータ可読媒体であってもよい。コンピュータ記憶媒体としては、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ若しくは他のメモリ技術、ＣＤ−ＲＯＭ、（ＤＶＤ）、又は他の光記憶装置、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶装置若しくは他の磁気記憶デバイス、あるいはコンピュータプロセッサ、又はより一般的にはコンピュータ若しくは他の構成要素の任意のプロセッサによってアクセスすることができる、所望のコード、データなどを記憶するのに使用することができる他の任意の媒体が挙げられるが、それらに限定されない。
コンピュータ１２６は、任意の市販の若しくは専有のコンピュータシステム、プロセッサボード、ＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）、又はコンピュータ可読媒体に記憶されたコードを実行するように構成されたコンピュータプロセッサを含む他の構成要素であってもよい。プロセッサは、コードを実行する際、コンピュータシステム１２６に、記憶装置１２４に記憶されたデータにアクセスしてそれを分析するなど、処理ステップを行わせてもよい。コンピュータシステム、プロセッサボードなどは、より一般的には、コンピューティングデバイスと呼ばれることがある。コンピューティングデバイスはまた、コンピュータプロセッサに処理ステップを行わせる実行可能コードが記憶されている、１２４によって表されるものなどのコンピュータ可読媒体を含むか、あるいは別の方法でそれにアクセスするように構成されてもよい。
システム１００は、ＬＣ／ＭＳ実験を行ってサンプルを分析し、サンプル中の少なくとも１つの化合物又は分子のプリカーサーイオン及びプロダクト又はフラグメントイオンに対する質量スペクトルを発生させるのに使用されてもよい。発生した質量スペクトルは、異なる用途に対する様々な技術のいずれかと関連して使用するため、更に分析及び／又は処理されてもよい。本明細書の技術と関連して、質量スペクトルデータは、関連付けられたプロダクトイオンを有するプリカーサー分子を同定し定量化するために分析されてもよい。
システム１００を使用する任意の好適な方法は、サンプル注入からプリカーサーイオン及びプロダクトイオンの両方を取得するのに使用されてもよい。Ｂａｔｅｍａｎに記載されているような高−低プロトコルにしたがってＭＳ機器を動作させるなど、いくつかの方法は、プリカーサーイオン及びプロダクトイオン両方の有効な同時の質量分析を提供する。例えば、溶出されたプリカーサーの時間の一部分がフラグメンテーションされてプロダクトイオンを形成し、プリカーサーイオン及びプロダクトイオンは、同時間に、又は例えば高速遷移で、実質的に同時に分析される。したがって、一実施形態は、Ｂａｔｅｍａｎに記載されている技術又は他の好適な技術を使用して、ＭＳ機器を動作させてもよい。一実施形態は、本明細書の他の箇所に記載されている技術を使用して、どのプロダクトイオンが特定のプリカーサーから得られるかを判断してもよく、それにより、かかるプロダクトイオンが、溶出プリカーサーの乗算と関連付けられるか、又はそれに関係するものとして特徴付けられてもよい。
本明細書の他の箇所に記載される技術にしたがって、プリカーサーイオン及びプロダクトイオンと関連付けられるピークのピーク形状、幅、及びスキャン時間が比較されて、どのプロダクトイオンが特定のプリカーサーイオンと関連付けられるかが判断されてもよい。共通の元の分子から得られるイオン（プリカーサー及びフラグメント）は、それらの相対強度など、同様の特性を有する。分子がＬＣから溶出するにしたがって、その強度が最大まで増加し、次に検出限界（ＬＯＤ）を下回るまで強度が減少する。そのプリカーサーのプロダクトイオンは、プロダクトイオンとその親プリカーサーの強度比が一定のままである点で同じように挙動するが、それぞれ絶対強度が一貫して変化する。したがって、プリカーサーイオン及びそれらの関連付けられたプロダクトのスキャン内及びスキャン間の相対強度は、一貫していなければならず、本明細書の他の箇所に記載されるように、共通のピーク形状又はプロファイルを示している。
上述したようなＬＣ／ＭＳ実験では、イオンは、そのスキャン時間、質量電荷比又は質量、電荷状態、及び強度によって説明及び／又は参照することができる。元の分子は複数のイオンを生じさせることができ、それにより、かかるイオンはそれぞれ、プリカーサー又はフラグメントのどちらかである。これらのフラグメントは、元の分子を分解するプロセスから生じる。これらのプロセスは、イオン化源で、又はＭＳ １１２の衝突セルで行うことができる。フラグメントイオンは、共通の溶出する元の分子から得られるので、それらは定義上、そのクロマトグラフィピークプロファイルにわたる各スキャンに対するフラグメンテーション効率（プロダクトイオン面積／プリカーサーイオン面積）を反映する強度比で存在する。イオン形成、フラグメンテーション、及びイオン検出の時間は、一般に、元の分子のピーク幅よりもはるかに短い。例えば、半値幅（ＦＷＨＭ）で測定される一般的なクロマトグラフィピーク幅は、５〜３０秒である。イオン形成、フラグメンテーション、及び検出の時間は、一般的にミリ秒未満である。
クロマトグラフィ時間スケールにおいて、図２に示されるものなど、交互のＬＥ及びＨＥスキャンを得るデータ獲得に対して、Ｂａｔｅｍａｎ技術又は高−低プロトコルを使用する一実施形態では、イオン形成、フラグメンテーション、及び検出の時間は、一態様では、本質的に瞬間のプロセスとして特徴付けられてもよい。要するに、元の分子から得られる、かかる実施形態において観察されるイオンのスキャン時間の差は、事実上ゼロである。つまり、元の分子から得られたイオン間のミリ秒未満の保持時間差は、クロマトグラフィピーク幅と比べて小さい。
無処置のプリカーサーイオンの衝突によって誘発される解離から発生するイオンに関して、フラグメント又はプロダクトイオンはそれらの親プリカーサーイオンと関連付けられる。質量分析計を、Ｂａｔｅｍａｎの１３０号特許に記載されているような高−低データ獲得モード（本明細書では、上昇−低データ獲得モードとも呼ばれる）で使用することによって、それらの関連付けは、後に続くフラグメンテーションのために機器が単一のプリカーサーを事前選択するのを必要とすることなく遂行される。より具体的には、関連付けられたイオンは、複数のプリカーサーが本質的に同じスキャン時間で同時にフラグメンテーションしているとき、適切にグループ化される。
連続質量分離によって獲得されるデータに関して、フラグメンテーションのためにイオンが選択される時間、及びフラグメンテーションされる時間は、プロダクトイオン／プリカーサーイオンの適正な強度比を計算するために、それ自体は実質的に異なることができ、プリカーサーイオンの強度をその実際のフラグメンテーション時間において外挿することが必要である。これは、後及び前のＬＥスキャンからプリカーサーイオンの強度値間で線形回帰を生成し、関連する時間間隔を適用することによって達成される。
カラム１１０などのクロマトグラフィ支持マトリックスから溶出する分子の溶出時間及びクロマトグラフィピークプロファイルは、支持マトリックスと移動相との間における分子の物理的相互作用の関数である。分子が支持マトリックスと移動相との間で有する相互作用の程度は、その分子のクロマトグラフィプロファイル及び溶出時間を表す。複雑な混合物では、各分子は化学的に異なる。その結果、各分子は、クロマトグラフィマトリックス及び移動相に対して異なる親和性を有することができる。結論として、各分子は固有のクロマトグラフィプロファイルを呈することができる。
一般に、特定の分子のクロマトグラフィプロファイルは固有であり、その分子の物理化学的性質を説明する。所与の分子のクロマトグラフィピークプロファイルを特徴付けるのに任意に使用されるパラメータとしては、中でも特に、最初の検出（リフトオフ）の時間、正規化された傾斜、ピーク頂点の時間に対する反曲点の時間、最大応答（ピーク頂点）の時間、反曲点におけるピーク幅、半値幅（ＦＷＨＭ）、ピーク形状の非対称性、最後の検出（タッチダウン）の時間が挙げられる。
更に詳細に後述するように、より一般的には、本明細書の技術は、同じ又は異なる実験から得られる、本明細書の他の箇所に記載されるような第１の形態の１つ又は２つ以上のＭＳデータセットの処理と関連して使用されてもよい。ＭＳデータセットは、Ｂａｔｅｍａｎに記載されている高−低プロトコル又は他の任意の好適な方法にしたがって、ＭＳ機器を動作させることによって得られてもよい。
図３を参照すると、本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよい構成要素を例証する一例が示されている。例３００は、図１のシステム１００に示されるものなどのサンプル分析を行う、ＬＣ及びＭＳ機器などの機器を表す機器システム１００を含む。この例では、単一のプリカーサー、プリカーサーのｍ／ｚ範囲、又はＬＥ及びＨＥデータセットの集合間の非常に狭い時間ウィンドウ内におけるプリカーサーの全体のｍ／ｚスケールに対して、ＭＳ（ＬＥ）及びＭＳ／ＭＳ（ＨＥ）データが獲得される、サンプルを分析する実験が行われてもよい。一例として、ＬＥ及びＨＥデータは、Ｂａｔｅｍａｎの高−低プロファイルにしたがって獲得されて、単一のサンプル分析に対するＭＳスキャンデータ３０１が生成される。上述したように、また本明細書の他の箇所に示されるように、単一の実験行程又は注入に対するかかるＭＳスキャンデータ３０１のセットは、低エネルギー（ＬＥ）スキャンデータセット３０２及び高エネルギー（ＨＥ）スキャンデータセット３０４の２つのデータセットを含んでもよい。要素３０２は、ＭＳ機器を低エネルギーモードで動作させたときに獲得されるＭＳスキャンデータを表してもよく、要素３０４は、ＭＳ機器を高エネルギーモードで動作させたときに獲得されるＭＳスキャンデータを表してもよい。この例では、データセット３０２及び３０４は、質量フィルタ処理をしていない全ての検出イオンに対する全スキャンデータを含んでもよい。
ＭＳスキャンデータ３０１は、データ処理（ＤＰ）エンジン３１０に対する入力として提供されてもよい。ＤＰエンジン３１０は、ＭＳスキャンデータ３０１を処理する１つ又は２つ以上のソフトウェアモジュールとして具体化されてもよく、それにより、かかる処理は、プリカーサー電荷クラスタ（ＰＣＣ）形成３１２、各ＯＣＣに対するスキャンごとのピーク検出３１４、及びＰＣＣ又はプリカーサー−フラグメントイオンの関連付け及びフィルタ処理３２０を行うことを含む。ＤＰエンジン３１０はまた、１つ又は２つ以上の他のモジュール３２２を含んでもよい。出力として、ＤＰエンジン３１０は、１つ又は２つ以上のＳＳＰＰＩＳ（単一スキャンプリカーサー−プロダクトイオンスペクトル）３５０を生成してもよい。ＳＳＰＰＩＳは、単一のＰＣＣと、それに関連する、単一スキャンを反映するプロダクト又はフラグメントイオンを表す。ＤＰエンジン３１０の上記モジュールのそれぞれによって行われる処理は、ＰＣＣ、ＳＳＰＰＩＳなどと共に、本明細書の他の箇所に更に詳細に記載される。やはり以下のパラグラフで更に詳細に記載されるように、１つ又は２つ以上のＳＳＰＰＩＳは、特定の分子を一意に同定する質量指紋を得るのに使用されてもよい。いくつかの実施形態では、関連又は関係するＳＳＰＰＩＳは、本明細書の他の箇所で更に詳細に記載されるような、１つ又は２つ以上のＣＰＰＩＳ（複合プリカーサー−プロダクトイオンスペクトル）３５２へと更に組み合わされてもよい。
それに加えて、ＤＰエンジン３１０はまた、アンマッチしたイオンの残留セット３５４を出力してもよい。本明細書の他の箇所で更に詳細に記載されるように、残留セット３５４は、任意のアンマッチしたＰＣＣ及び／又はアンマッチしたフラグメントイオンを含んでもよい。
ＤＰエンジン３１０は、本明細書では教師なしクラスタリングと呼ばれる第１の処理モードで動作してもよく、それにより、単一のＰＣＣの強度、及びＬＣピーク溶出プロファイルにわたる周囲のＳＳＰＰＩＳのそれぞれに含まれるそのプロダクトイオンの強度を追跡することによって、ＣＰＰＩＳの形成が一連のＳＳＰＰＩＳから行われる。追跡されたプリカーサー電荷クラスタ、又はその同位体の１つ又は２つ以上に対する、特定のアルゴリズム的に決定された強度比の関係にしたがう、各ＳＳＰＰＩＳのプロダクトイオンのみが保持される。
ＬＣピークが１つを超える重なり合う溶出成分を呈することがある一般的な状況では、ＳＳＰＰＩＳの作成によって、プロダクトイオンスペクトルが獲得された同じ質量分離ウィンドウ内に複数のプリカーサー電荷クラスタ（ＰＣＣ）が見出される場合、それらに対して同じ高エネルギープロダクトイオンスペクトルが割り当てられる。これは、ＭＳスキャンデータを生成得るＢａｔｅｍａｎの高−低プロトコルに常に当てはまる。このように、単一スキャン獲得のプロダクトイオンは、一般に、それらの割り当たられたＰＣＣに対して一対多の関係を有する。このように、１つの特定のＳＳＰＰＩＳの廃棄されたプロダクトイオンは、異なるＰＣＣに属する異なるＳＳＰＰＩＳで保持されるフィルタ処理済みイオンとなる。このプロセスの最高点は、関連するＳＳＰＰＩＳで保持されるプロダクトイオンが、特定のプリカーサー電荷クラスタに属する正当なものである可能性が最も高い、ＣＰＰＩＳの作成をもたらす。
ＤＰエンジン３１０はまた、本明細書では教師ありクラスタリングと呼ばれる第２の処理モードで動作してもよく、それにより、データベース若しくはライブラリに記憶されていてもよいものなど、既知の指紋又は標的分子又は化合物のプリカーサー−プロダクトイオンを、ユーザ若しくはアルゴリズム規定のマッチング基準セット内の全てのＳＳＰＰＩＳにマッチさせることによって、ＣＣＰＩＳの形成が一連の１つ又は２つ以上のＳＳＰＰＩＳから行われる。
本明細書の他の箇所に記載されるように、モジュール３１２、３１４、及び３２０は、教師あり及び教師なし両方のクラスタリングモードに対する処理を行ってもよい。一実施形態では、モジュール３１２及び３１４は、教師あり及び教師なし両方のクラスタリングモードに対して、ＭＳスキャンデータ３０１の同じ処理を行ってもよい。モジュール３２０によって行われる処理は、ＤＰエンジン３１０が教師なしクラスタリングモード又は教師ありクラスタリングモードのどちらで動作しているかに応じて変動してもよい。
図４を参照すると、本明細書の技術による一実施形態で処理される質量スペクトルデータに含まれてもよい情報の一例が示されている。例３００は、ＭＳスキャンデータ３０１の第１の形態に含まれてもよい情報を示している。要素４０１ａは、Ｂａｔｅｍａｎの高−低プロトコルにしたがってＭＳ機器を動作させたときに、図３と関連して上述した実験を行った結果として得られる、（図３でＬＥスキャンデータセット３０２として表される）プリカーサーイオンスペクトルデータを表してもよい。要素４０１ｂは、Ｂａｔｅｍａｎの高−低プロトコルにしたがってＭＳ機器を動作させたときに、図３と関連して上述した実験を行った結果として得られる、プロダクト又はフラグメントイオンスペクトルデータを表してもよい。特に、Ｂａｔｅｍａｎの高−低プロトコルにしたがって動作するＭＳ機器を利用する一実施形態では、４０１ａ及び４０１ｂのデータは、単一の実験又は行程で獲得されてもよく、それにより、交互のスキャンはプリカーサー及びプロダクトイオンスペクトルと関連付けられる。例４００では、表４０１ａのスキャンＩ、及び対応する表４０１ｂのスキャンＩ’’は、実質的に同じＩ番目のスキャン時間に対して獲得されるデータを表し、したがって対応するスキャンを表し、Ｉは、この例では０よりも大きい整数であるスキャン数を表す。対応するスキャン数１の場合、表４０１ａの情報はスキャン数の列４０２の１によって表され、同じスキャン数に対する表４０１ｂの情報は、対になるスキャン数の列４２２の１’’によって表される。例３００では、対応するスキャンの対１及び１’’は実質的に同じスキャン時間を有し、それにより、対のスキャン１は、表４０１ａのデータ又は低エネルギースキャンデータを有し、同じ対のスキャン１’’は、表４０１ｂのデータ又は高エネルギースキャンデータを有する。
表４０１ａ及び４０１ｂによって示されるように、データセット４０１ａ、４０１ｂのそれぞれは、異なる質量スペクトルスキャンに対する複数のスキャン時間に関する情報を含んでもよい。各スキャンに対して、１つ又は２つ以上の検出質量及び関連する強度のリストが、質量分析を行うことによって得られてもよい。例えば、表４０１ａを参照すると、列４０２はスキャンのリストを表し、列４０４はスキャンにおける検出質量を表し、列４０６は列３０４の検出質量の強度を表す。スキャン１の場合、セル又はエントリ４１０によって表される表４０１ａの行は、検出された質量及び関連する強度を列挙している。スキャン２の場合、セル又はエントリ４１２によって表される表４０１ａの行は、検出された質量及び関連する強度を列挙している。表４０１ａの各行は、その行における検出質量の強度を表す質量及び強度を含む。例えば、ｉ１はスキャン１で検出された質量ｍ１の強度であり、ｉ２はスキャン１で検出された質量ｍ２の強度である。表４０１ｂは、表４０１ｂと関連して記載したものと同様の、ただしフラグメントイオンデータと関連付けられた交互の対応するスキャンに関する情報を含んでもよい。例３００を参照すると、４１０及び４３０は、対応するスキャン１及び１’’に対する、対応する低及び高エネルギースキャンデータを表し、４１２及び４３２は、対応するスキャン２及び２’’に対する、対応する低及び高エネルギースキャンデータを表す。
実質的に同じスキャン時間を有する対応するスキャンの対（表４０１ａからのものと、表４０１ｂからの第２のもの）は、特定の実験に応じて、保持時間又はドリフト時間を表してもよいことが注目されるべきである。例えば、質量分析の前に行われる分離処理が、イオンモビリティースペクトロメトリーを伴わず、ＬＣ又はＧＣなどのためのクロマトグラフィ分離を含む場合、スキャン時間は保持時間を表す。質量分析の前に行われる分離処理が、イオンモビリティースペクトロメトリーを含むがクロマトグラフィ分離は含まない場合、スキャン時間はドリフト時間を表す。クロマトグラフィ及びイオンモビリティースペクトロメトリーが両方とも、質量分析の前に行われる場合、スキャン時間は、保持時間又はドリフト時間のどちらかを表してもよい。例えば、ＬＣ／ＩＭＳ／ＭＳを用いて、連続するスキャン時間のセットは、単一の保持時間と関連付けられる複数のドリフト時間の群を表すスキャングループを形成してもよく、それにより、（ドリフト時間に対応するスキャン時間の）スキャングループは、クロマトグラフィ保持時間に対応する２つのスキャン時間内又はそれらの間に収まるように特徴付けられてもよい。例えば、図５を参照すると、Ｎ回のスキャンをそれぞれ含むスキャングループ４５１及び４５２の一例が示されている。ＬＣ／ＩＭＳ／ＭＳ実験では、各スキャングループ４５１、４５２は、異なる保持時間と関連付けられてもよい。４５１などの単一のスキャングループ内で、個々のスキャン時間はそれぞれ異なるドリフト時間に対応してもよい。
質量スペクトルデータは、例証のため、本明細書に記載されるものに代わる形態を有してもよい。本明細書の技術を使用して操作される、図４及び図５に示されるものなどのプリカーサー及びプロダクトイオン質量スペクトルデータは、一態様では、ピーク検出を行い、スキャン及びスキャン時間を対応する保持時間及び／又はドリフト時間に対してマッピング若しくは翻訳するなどの、他のソフトウェアによってまだ処理されていない第１の形態の質量スペクトルデータとして特徴付けられてもよい。
図４及び図５と関連して記載されたようなものと同様の情報を含む質量スペクトルデータは、Ｂａｔｅｍａｎの高−低プロトコルにしたがって上述したようなものとは異なる方法で、実験に対してＭＳ機器を動作させたときに得られてもよいことが注目されるべきである。
図６を参照すると、分子の指紋又はパターンに含まれる情報を生成する、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理を示す一例が示されている。例６００では、Ｐ１ ６０２は、サンプルの単一分子又は溶出成分である、親プリカーサーを表してもよい。親プリカーサー又は単一分子は、例ではＰ１ Ａ０、Ｐ１ Ａ１、Ｐ１ Ａ２、及びＰ１ Ａ３である、同位体パターン又はクラスタ６０４を有する。各Ｐ１ Ａｉ（「ｉ」は、この例６０４では、０．．．３の包括範囲内の値）は、プリカーサーＰ１の同位体分布を表す。本明細書の記載と関連して、同位体パターン又はクラスタ６０４は、単にプリカーサーと呼ばれることもある。同位体パターン６０４を有するプリカーサーに、ＭＳ機器と関連するものなどのイオン化６０６が行われると、プリカーサーはイオン化されて、異なる電荷状態６１０をそれぞれ有する一連のＰＣＣがもたらされる。各プリカーサー電荷クラスタ又はＰＣＣ ６１０ａ〜６１０ｃは、同一の同位体分布を有する。同位体間のΔｍ／ｚ間隔は、Ａｉ内及びＡｉ間の強度比が一定であっても、電荷と共に変動する。この例では、溶出成分Ｐ１ ６０２のイオン化によって、３つのプリカーサー電荷クラスタ又はＰＣＣ ６１０ａ〜ｃが得られる。ＰＣＣ１ ６１０ａは＋１の電荷を有し、ＰＣＣ２ ６１０ｂは＋２の電荷を有し、ＰＣＣ３ ６１０ｃは＋３の電荷を有する。上記プリカーサーイオン又はＰＣＣ ６１０ａ〜ｃのそれぞれは、ＭＳ機器による処理と関連するものなどのフラグメンテーション処理６１２の結果として更にフラグメンテーションされてもよく、それによって一連のフラグメントセット６１４がもたらされる。より具体的には、この例では、ＰＣＣ ６１０ａ〜ｃのそれぞれにフラグメンテーション６１２が行われて、フラグメンテーションイオン６１４ａ〜ｃの関連付けられたセットがもたらされる。例６００では、プリカーサーイオン又はＰＣＣをフラグメンテーションした結果として生成されたプロダクト又はフラグメントイオンは、６１４ａ〜ｃに含まれる各Ｆによって表されてもよい。ＰＣＣ１ ６１０ａがフラグメンテーションされて、ＰＣＣ１から発するフラグメント又はプロダクトイオンを含む、断片カセット６１４ａが得られてもよい。ＰＣＣ２ ６１０ｂがフラグメンテーションされて、ＰＣＣ２から発するフラグメント又はプロダクトイオンを含む、断片カセット６１４ｂが得られてもよい。ＰＣＣ３ ６１０ｃがフラグメンテーションされて、ＰＣＣ３から発するフラグメント又はプロダクトイオンを含む、断片カセット６１４ａが得られてもよい。
一実施形態では、プリカーサーイオンの電荷状態のＳＳＰＰＩＳを比較することによって分子のイオン指紋が判断される場合、データがドリフト又はＣＣＳＡを含むことを要する。イオンモビリティーは、電荷によってプリカーサーイオンを分離する。電荷状態は、クロマトグラフィ溶出に対して影響を有さず、そのため、プリカーサーの全ての電荷状態は時間に伴って同様に進む。イオンモビリティーは、異なる電荷状態を分離して、ＤＰが、プリカーサー及びプロダクト内及びそれらの間の必要な強度比を、それらの電荷状態によって計算する手段を提供する。次に、結果を比較し、縮小して単一のイオン指紋又は複合プリカーサープロダクトイオンスペクトル又はＣＰＰＩＳにすることができる。
本明細書の技術による一実施形態では、Ｐ１ ６０２によって表される分子の指紋は、６１０ａ〜ｃで表される３つのＰＣＣのそれぞれに対する、６１４ａ〜ｃで表される３つの同一の検証されたフラグメントイオンパターンから成る。本明細書に記載されるように、本明細書の技術による一実施形態はまた、イオン指紋に含まれる各プロダクトイオンに対するプリカーサー及びプロダクトイオンの面積比（例えば、本明細書の他の箇所に記載される様々なＡＲ値）と関連付けられる、エラーインジケータ又は一貫性インジケータを記憶してもよい。
本明細書の技術による一実施形態では、各ＰＣＣと関連付けられる属性は、ｍ／ｚ、ｍ／ｚと保持時間、ｍ／ｚと保持時間とドリフト時間、又は任意の全てのイオン検出前分離測定値、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。ＰＣＣ又はプリカーサーのイオンのｍ／ｚ又は記録は、Ａ０同位体又はモノアイソトープである。単一のスキャンにおける、６１０ａ〜ｃのそれぞれによって表されるものなどのＰＣＣ又はプリカーサーイオンの強度は、その単一のスキャンに対する単一のＰＣＣの同位体全ての強度の合計であってもよい。例えば、スキャンＳ１においてＰＣＣ１ ６１０ａによって表されるプリカーサーイオンの強度は、スキャンＳ１に対してＰＣＣ１ ６１０ａで生じるような、Ｐ１ Ａ０、Ｐ１ Ａ１、Ｐ１ Ａ２、及びＰ１ Ａ３の強度の合計である。
また、親プリカーサーＰ１の強度又は濃度は、ＰＣＣ ６１０ａ〜ｃのそれぞれの強度又は濃度の合計に等しいことが注目されるべきである。それに加えて、プリカーサーの同位体６０４の数は、その電荷状態のそれぞれが６１０に反映されるように、その基本的組成及び濃度の関数である。強度分布は全ての電荷状態に対して一定であるが、所与の基本的組成は電荷状態とは独立しており、電荷状態当たりの同位体の数は、電荷状態によるＰ１のモル分布の関数である。特定のＰＣＣの観察可能な同位体の数は、質量分析部のダイナミックレンジ及び検出限界によって決定される。
本明細書の他の箇所に示されるように、図３のＤＰエンジン３１０によって発生するＳＳＰＰＩＳは、単一のＰＣＣ及びそれに関連するプロダクトイオンを表す。ＳＳＰＰＩＳは、低エネルギーの単一スキャンそれぞれで、各プリカーサー電荷クラスタに対して作成されてもよい。比較の上昇エネルギースキャンによるプロダクトイオンは、例えば、それらの親プリカーサーに対する強度及びｍ／ｚによって、又はプロダクトイオンの標的セットに対する比較によって、フィルタ処理後に同じスキャンの各ＰＣＣと共有されるか又は関連付けられて、固有のＳＳＰＰＩＳが作成される。
図６の例を参照すると、親分子Ｐ１は、全て同じ保持時間を有するが強度又は濃度が異なり、質量が異なり、電荷が異なり、ｍ／ｚ値が異なり、またドリフト時間が異なる、３つのＰＣＣ又はプリカーサーイオンをもたらす。やはり図示されるように、３つのＰＣＣのそれぞれは更に解離されて、それら自体のプロダクト又はフラグメントイオンパターン６１４が作成されてもよい。
プリカーサーイオン又はＰＣＣの解離又はフラグメンテーションを行うのにＭＳ機器の衝突セルが使用される一実施形態では、次にプロダクト／フラグメントイオンパターンがもたらされてもよく、それによって電荷が保存される。換言すれば、フラグメントイオンの電荷がその親の電荷を上回る可能性はない。一般に、プロダクトイオンを検出させるために帯電させなければならないことを所与として、プリカーサーイオンが解離して、親プリカーサーの電荷状態から１を引いた電荷状態のフラグメントイオンとなる。一般に、電荷は、フラグメンテーションするプリカーサーが２つの補完的なイオンを生成するという点で保存され、Ｆ１＋Ｆ２＝プリカーサーの元素質量＋その電荷状態×１．００７（プロトンの質量）である。例えば、ＰＣＣ２＋２ ６１０ｂは、６１４ｂの２つのフラグメントＦｍ及びＦｎにフラグメンテーションされてもよく、かかるフラグメントはそれぞれ１＋の電荷を有する。ＰＣＣ３＋３ ６１０ｃは、２つのフラグメントＦｘ及びＦｙにフラグメンテーションされてもよく、Ｆｘは１＋の電荷を有し、Ｆｙは２＋の電荷を有する。本明細書の他の箇所に記載されるように、各フラグメント又はプロダクトイオンはまた、関連する強度、電荷状態、質量ｍ／ｚなどを有してもよい。
ＰＣＣ１ ６１０ａの第１のＳＳＰＰＩＳは、６１４ａのフラグメントイオンを含んで生成されてもよく、それによって、フラグメントイオン６１４ａは、ＰＣＣ１ ６１０ａのフラグメンテーションと関連付けられるか又はそれによって生成されるものと表される。ＰＣＣ２ ６１０ｂの第２のＳＳＰＰＩＳは、６１４ｂのフラグメントイオンを含んで生成されてもよく、それによって、フラグメントイオン６１４ｂは、ＰＣＣ２ ６１０ｂのフラグメンテーションと関連付けられるか又はそれによって生成されるものと表される。ＰＣＣ３ ６１０ｃの第３のＳＳＰＰＩＳは、６１４ｃのフラグメントイオンを含んで生成されてもよく、それによって、フラグメントイオン６１４ｃは、ＰＣＣ３ ６１０ｃのフラグメンテーションと関連付けられるか又はそれによって生成されるものと表される。
ＬＣ／ＭＳ／ＩＭＳ分析を行う一実施形態では、Ｐ１などの同じプリカーサーから発するＰＣＣ ６１０ａ〜ｃなどのＰＣＣは、それらの関連するドリフト時間に関して、時間寸法の点で差別化されてもよい。かかる実施形態では、ＰＣＣのそれぞれから発する様々なフラグメントイオンはまた、６１４によって示されるものなど、様々なフラグメントイオンのドリフト時間における差に基づいて決定されてもよい。ＬＣ／ＭＳ分析を行い、それによってＩＭＳを省略する一実施形態では、かかるドリフト時間の差別化は利用不能であり、したがって、全てのＰＣＣは同じスキャンで溶出するものとして観察されてもよい。かかる実施形態では、したがって、ＰＣＣのそれぞれから発する様々なフラグメントイオンを分離又は関連付けするのに、ドリフト時間を次元として使用することは不可能である。このように、ＬＣ／ＭＳを使用し、ＩＭＳを省略するかかる実施形態では、同じフラグメントイオンの一部は、フラグメントイオンがＰＣＣ６１０ａ〜ｃのうち複数から発することが可能な場合、フラグメントイオンセット６１４ａ〜ｃの複数のセットに含まれてもよい。例えば、フラグメントイオンをその元のＰＣＣと更に関連付けるための分離の次元として使用するのに、ドリフト時間は利用不能なので、フラグメントＦｋが＋１の電荷状態を有してもよく、したがって場合によってはＰＣＣ６１０ａ〜ｃのいずれかから発してもよく、６１４ａ〜ｃのそれぞれに含まれてもよい一実施形態を考慮する。
図６ａを参照すると、同位体パターン又はクラスタ６５４、６５５、及び６５６をそれぞれ有する、３つの異なるプリカーサーＰ１、Ｐ２、及びＰ３を例証する一例が示されている。この例では、Ｐ１〜Ｐ３は、同じスキャンで溶出する３つのプリカーサーを示している。Ｐ１はイオン化されて、ＰＣＣ１ ６６０ａとなってもよい。Ｐ２はイオン化されて、ＰＣＣ２ ６６０ｂとなってもよい。Ｐ３はイオン化されて、ＰＣＣ３ ６６０ｃとなってもよい。ＰＣＣ ６６０ａ〜ｃは同じＬＥスキャンに現れる。ＰＣＣ ６６０ａ〜ｃは、フラグメンテーション６６２されて、フラグメントイオンセット６６４ａ〜ｃに含まれるフラグメントイオンを生成してもよく、それにより、６６４ａ〜ｃの全てのフラグメントイオンは同じ単一のフラグメントイオンスキャン（例えば、同じＨＥスキャン）に含まれてもよい。
以下のパラグラフに記載される技術を使用して、ＰＣＣ１ ６６０ａの第１のＳＳＰＰＩＳは、６６４ａのフラグメントイオンを含んで生成されてもよく、それによって、フラグメントイオン６６４ａは、ＰＣＣ１ ６６０ａのフラグメンテーションと関連付けられるか又はそれによって生成されるものと表される。ＰＣＣ２ ６６０ｂの第２のＳＳＰＰＩＳは、６６４ｂのフラグメントイオンを含んで生成されてもよく、それによって、フラグメントイオン６６４ｂは、ＰＣＣ２ ６６０ｂのフラグメンテーションと関連付けられるか又はそれによって生成されるものと表される。ＰＣＣ３ ６６０ｃの第３のＳＳＰＰＩＳは、６６４ｃのフラグメントイオンを含んで生成されてもよく、それによって、フラグメントイオン６６４ｃは、ＰＣＣ３ ６６０ｃのフラグメンテーションと関連付けられるか又はそれによって生成されるものと表される。
このように、単一分子又は単一の溶出成分を表すＰ１プリカーサーの指紋は、それに関連するＰＣＣ１ ６６０ａの第１のＳＳＰＰＩＳからの情報と共に、ＰＣＣ及び／又はイオンの物理的若しくは化学的性質に関するＰＣＣ及び各フラグメントイオンの属性情報、並びに本明細書の他の箇所に記載される１つ又は２つ以上のメトリック及び関連エラーインジケータなどの属性情報など、追加情報を含んでもよい。同様の方法で、単一分子又は単一の溶出成分を表すＰ２プリカーサーの指紋は、それに関連するＰＣＣ２ ６６０ｂの第１のＳＳＰＰＩＳからの情報を含んでもよく、単一分子又は単一の溶出成分を表すＰ３プリカーサーの指紋は、それに関連するＰＣＣ３ ６６０ｃの第１のＳＳＰＰＩＳからの情報を含んでもよい。
図６に記載されるように、図６ａのＰＣＣ ６６０ａ〜ｃのそれぞれは、複数の電荷状態で存在してもよく、イオンモビリティーが獲得ワークフローの一部である場合、第１の例として、異なる電荷状態に対して記載のプロセスを適用することによってフラグメントイオン指紋が生成される。イオンモビリティーがない場合、イオン指紋は、ＰＣＣ又はプリカーサーイオン６６０ａ〜ｃ及びプロダクトイオン６６４ａ〜ｃの面積比を比較することによって生成され、最初に、親と同様に挙動しているプロダクトイオンを同定し、次に、親分子のクロマトグラフィ溶出を反映したスキャンにわたってそれらの面積比を比較する。
本明細書に更に詳細に後述されるように、獲得したスキャンデータは、単一スキャンごとに処理されてもよい。プロダクト又はフラグメントイオンのフラグメンテーションパターン、及びＰＣＣなど、その親イオンに対する関係は、プロダクトイオンとそれに関連するＳＳＰＰＩＳなどのその親との強度関係として定義されてもよく、それら２つの間の面積比又は強度比は、そのクロマトグラフィプロファイルを定義するスキャン内及びスキャン間で（ある実験変数内で）一貫していなければならない。本明細書の技術は、本発明者らによって認識されるような、ＰＣＣなどの親イオンとそのフラグメントとの間におけるかかる原理及び関係を利用する。詳述するため、プリカーサーのフラグメンテーションパターンはその溶出にわたって一貫している。そのため、プリカーサーイオンとその構成成分であるプロダクトイオンとの強度関係は、干渉がない状態で一定のままであるべきである。フラグメンテーション中に発生するプロダクトイオン、プリカーサーイオン、又はＰＣＣの数は、その長さ／質量及び濃度の関数である。溶出プロファイルを定義する、スキャンにわたってＰＣＣの強度が変動（例えば、増加及び／又は減少）する速度は、そのプリカーサーから発するプロダクトイオンのものと同じである。同様に、一貫して適用される衝突エネルギー（ｅＶ）を所与として、フラグメンテーション効率（プロダクトイオン強度／プリカーサーイオン強度）も、プロダクトイオンの強度をその溶出成分の一部であることが分かっている全てのプロダクトイオンの強度で割ったもののように、その溶出プロファイルを定義する全てのスキャンにわたって（ある実験変数内で）一定のままである。
本明細書の技術は、単一スキャン及びスキャンごとの基準で親プリカーサーイオン又はＰＣＣに対するプロダクトイオンのアライメントを追跡し検証する検証ヒューリスティックスを使用する。更に詳細に後述されるように、メトリックＡＲ１（面積比１）は、単一の（同じ）スキャン時間におけるＰＣＣに対するプロダクトイオンの強度又は面積比として定義される。本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよい単一スキャンのスキーマを所与として、各ＰＣＣは、その強度が溶出ピークにわたって追跡される。ＰＣＣが最高値であるスキャンは枢動点（ＰＰ）又は頂点と称される。ＰＣＣ及び関連又はマッチするフラグメントイオンに対するＡＲ１メトリックは、溶出ピークの全てのスキャン／スキャン時間にわたって（ある指定の許容差内で）同じであるべきである。それに加えて、別の検証技術として、ピークにおける全ての隣接するスキャンは、別のメトリックＡＲ２（面積比２、更に詳細に後述）を使用してピボットスキャンに対して比較される。概して、ＡＲ２値は、ＰＣＣ及びマッチした（潜在的な）プロダクトイオンの両方に対して決定されてもよい。ＰＣＣのＡＲ２は、ＰＰ又は頂点スキャンにおけるＰＣＣに対する、ピークの任意の隣接するスキャンにおけるＰＣＣの強度又は面積比として定義されてもよい。同様に、プロダクト又はフラグメントイオンのＡＲ２は、ＰＰ又は頂点スキャンにおける同じイオンに対する、ピークの任意の隣接するスキャンにおけるフラグメントイオンの強度又は面積比として定義されてもよい。スキャン内（ＡＲ１）又はスキャン間（ＡＲ２）でマッチしたＰＣＣ及びそのプロダクトイオンの強度又は面積比は、統計的変数内で一貫しているべきである。曲線下面積（ＡＵＣ）による定量的確度及び精度は、ピークにわたって存在するスキャンが最小数であることを説明する。これによって、どのイオンが同様に挙動しているかを判断するのに必要な統計を提供するのに十分な単一のスキャンがピークにわたって存在することが担保される。
以下、教師なしクラスタリングに関して一実施形態で行われてもよい処理について記載する。それは、実験及びデータ分析が行われているサンプルに特定の分子が含まれるという先験的知識なしに、溶出成分又は分子の指紋を決定するのに使用される。ＬＣ／ＭＳ又はＬＣ／ＩＭＳ／ＭＳなど、サンプルの実験を行うことと関連して、同時に溶出する（例えば、ほぼ同じ保持時間を有する）複数の分子があってもよい。本明細書の技術による一実施形態における教師なしクラスタリングは、一般に、溶出成分に対する指紋を決定するのに使用されてもよく、更に、同じ又は類似の溶出時間を有する２つの重なり合うか又は干渉する成分に対して、かかる指紋を生成するのを容易にしてもよい。このように、教師なしクラスタリングは、フラグメントイオンをそれらの元の分子又は成分と適正に関連付け又はマッチさせ、フラグメントイオンをそれらの元のＰＣＣ適正に関連付け又はマッチさせるのに使用されてもよい。後述されるように、また本明細書の技術による一実施形態において本明細書の他の箇所に記載されるように、各ＰＣＣ及び関連するフラグメントイオンに関する情報は、単一のＳＳＰＰＩＳによって表されてもよいような単位として記憶され維持されてもよい。したがって、図６及び図６ａの例に示されるように、分子又は溶出成分の単一の指紋は、複数のＰＣＣ及びしたがって複数のＳＳＰＰＩＳからの情報を含んでもよい。更に詳細に後述されるように、サンプルに対するＰＣ／ＭＳ実験の結果として生成されるデータセットに関して、教師なしクラスタリングのための処理は、どのフラグメントイオンがそれらの正しいＰＣＣと関連付けられるかを判断してもよい。続いて、ＰＣＣ（及びそれらのマッチしたフラグメントイオン）と特定の溶出成分若しくは分子とのグループ化又は関連付けを判断する（例えば、どの１つ又は２つ以上のＰＣＣをグループ化し、単一の溶出成分若しくは分子と関連付けるべきかを判断する）、処理が行われてもよい。
図３に戻ると、ＤＰエンジン３１０のＰＣＣ形成モジュール３１２は、スキャンごとにＬＥスキャンデータセット３０２の処理を行って、各スキャン時間に対するＰＣＣのセットを決定してもよい。単一のスキャンにおける各ＰＣＣは、本明細書の他の箇所に記載されるような、関連するｍ／ｚ（一般的に、Ａ０モノアイソトープ）、電荷状態ｚ、及び強度を有する。同じＰＣＣは、その関連するｍ／ｚを使用して同定され、次に、ＬＣピーク検出モジュール３１４によって、一連の連続スキャンを通して追跡される。各スキャンに関して、ＰＣＣの強度も追跡される。上記追跡の結果は、ＰＣＣに対する異なる連続スキャンにおける強度のピーク応答を形成するべきであり、それによって単一のＰＣＣに対する溶出クロマトグラフィピークの強度エンベロープが表される。このように、単一のＰＣＣが連続スキャンにわたって追跡されて、図７に示されるようなＰＣＣからの溶出ピークが決定される。図７によって示されるものなど、単一のＰＣＣに対して結果として得られる追跡は、追跡された各ＰＣＣに対して行われてもよいことが注目されるべきである。
図７を参照すると、本明細書の技術による一実施形態における、単一のＰＣＣに対して決定されるＬＣピークの模式図が示されている。ピーク検出の一部として、強度が連続スキャンにおいて点Ｐｓｔａｒｔから点Ｈまで増加し、次いで連続スキャンにおいて点Ｈから点Ｐｅｎｄまで減少することを確認する処理が行われる。Ｐｓｔａｒｔは、ピークの第１のスキャン、又はＰＣＣのｍ／ｚが最初に検出できる時点を表す。Ｈは、ＰＣＣのｍ／ｚと関連付けられる検出強度が最大値であるピークの頂点を表す。Ｈはまた、枢動点（ＰＰ）と呼ばれることがある。Ｐｅｎｄは、ピークの最後若しくは終わりのスキャン、又はＰＣＣのｍ／ｚが検出されなくなる時点を表す。
単一のスキャン内で、プリカーサーイオンとそのプロダクトイオンとの間に関係があり、かかる関係は、プリカーサー及びそのプロダクトイオンのフラグメンテーションパターンの一部である。本明細書の技術による一実施形態では、異なるスキャンにおける同じプリカーサーイオン又はＰＣＣのＰＣＣ又はプリカーサーイオン比を表すＡＲ２（面積比２）のメトリックは、ＰＣＣから発生するマッチする又は関連するフラグメントイオンの決定と関連して決定され使用されてもよい。ＳＳＰＰＩＳが最初に形成されると、各プロダクトイオンはＡＲ１値を割り当てられ、ＡＲ１（面積比１）は、プロダクトイオンの強度をプリカーサーの強度で割ったものに等しい。一貫した衝突エネルギーがプリカーサーの溶出中のスキャンにわたって適用されるものと仮定して、溶出プロファイルの各スキャンメンバーに対するＡＲ１値は、ある実験誤差内で一貫しているべきである。
スキャンの間で、スキャンｔ１＝Ｘ強度及びスキャンｔ２＝Ｙ強度からの特定のＰＣＣの強度比は、比Ｘ／Ｙとなる。同じスキャンｔ１及びｔ２における同じＰＣＣと関連付けられるフラグメントは、ある指定の許容差内の同じ強度比を有することによって、同じように挙動するはずである。ＰＣＣの強度がスキャンｔ１及びｔ２の間で増加した場合、それに関連するフラグメントイオンも同様のはずである。ＰＣＣの強度がスキャンｔ１及びｔ２の間で減少した場合、それに関連するフラグメントイオンも同様のはずである。このように、ＰＣＣの上記強度比は、フラグメントを異なるＰＣＣ又はプリカーサーイオンから差別化又は区別し、適切に関連付けるのに使用されてもよい。
本明細書の技術による一実施形態では、任意のスキャン及びそれに対応する頂点間における同じプリカーサーイオン又はＰＣＣのＰＣＣ又はプリカーサーイオン比を表すＡＲ２（面積比２）のメトリックは、同じＰＣＣから発生するマッチする又は関連するフラグメントイオンの決定と関連して決定され使用されてもよい。任意のスキャンのプロダクトイオンは、同じＰＣＣに関連する場合、それらのＰＣＣ ＡＲ２比と同様に、頂点スキャンによる対応するイオンとのＡＲ２比を反映しなければならない。後述されるように、ＰＣＣ及びそのプロダクトイオンのそれぞれに対するＡＲ２比又はメトリックは、一般に、ＬＣピーク曲線上の各スキャン又は点に対して決定されてもよい。図７のスキャンＨ１及びＨ２におけるＦＷＨＭ点は、２つのかかる点である。
要約すると、単一のＰＣＣの場合、処理は、第１のステップで、図７に示されるようなピーク決定を行うために、異なるスキャンを通して特定のＰＣＣを追跡するように行われてもよい。第２のステップとして、特定のＰＣＣに対して最大又は最高強度を有する検出されたピークのスキャンは、ＡＲ２メトリックがそこから計算される頂点又は枢動点スキャンとして同定され表されてもよい。
第３のステップとして、２つのＦＷＨＭ点Ｈ１及びＨ２が決定されてもよい。第３のステップで、ピークの左側（ＬＨＳ若しくは上り坂）及びピークの右側（ＲＨＳ若しくは下り坂）の両方に対して、最大強度（例えば、頂点Ｈの強度）の高さの半分に対応する点又はスキャンが同定される。例えば、かかる処理は、Ｈの左側の点Ｈ１とＨの右側の点Ｈ２とを決定し、そこでの強度は最大値の１／２（又はＰＰ若しくは点Ｈにおける強度の１／２である。例えば、ピーク又は最大強度ＢＭＡＸはスキャン１００８の位置であってもよく、強度は、スキャン１００４ Ｈ１（ＰＰの左側）及びＨ２ １０１２（ＰＰの右側）において、ＩＭＡＸ／２であってもよい。このように、Ｈ１はピークのＬＨＳにおける半分の高さのスキャンを表し、Ｈ２はピークのＲＨＳにおける半分の高さのスキャンを表す。
図７に示されるＰＣＣに関する上り坂比Ｕ及び下り坂比Ｄを、次のように定義する。
上り坂比Ｕ＝Ｈ１強度／Ｈ強度 式１
及び、
下り坂比Ｄ＝Ｈ２強度／Ｈ強度 式２
式中、
Ｈは、同定されたピークピボットスキャンにおけるＰＣＣの最大強度、
Ｈ１は、点Ｈ１によって表される同定されたスキャンにおけるＰＣＣの強度、並びに、
Ｈ２は、点Ｈ２によって表される同定されたスキャンにおけるＰＣＣの強度。
２つのＦＷＨＭ点Ｈ１及びＨ２に対する上り坂比Ｕ及び下り坂比Ｄは、常に、ＦＷＨＭの定義により、約１／２のＰＣＣ強度比をもたらすことが注目されるべきである。上述の式１及び２は、特定の点又はスキャンＨ１及びＨ２それぞれに対するＡＲ２比のカスタマイズされた形態を表す。
一般に、ＰＣＣ及びそのプロダクトイオンのそれぞれに対するＡＲ２比は、ピーク又は曲線上の各スキャン又は点に対して決定されてもよい。スキャンＨ１及びＨ２に対するＦＷＨＭ点は、２つのかかる点の例である。このように、ＡＲ２比は、点Ｈ（例えば、ＰＰ若しくは頂点）のスキャン、及び一般にピーク又は曲線上の他の任意のスキャンＳｘ間のスキャンから、ＰＣＣ及びそのプロダクトイオン強度の両方に対して決定されてもよい。
ＡＲ２Ｐ＝Ｉｎｔ（スキャンＳｘ，ＰＣＣ）／Ｉｎｔ（スキャンＰＰ，ＰＣＣ） 式３ａ
ＡＲ２Ｆ＝Ｉｎｔ（スキャンＳｘ，Ｆｘ）／Ｉｎｔ（スキャンＰＰ，Ｆｘ） 式３ｂ
ＡＲ２に関して
式中、
Ｉｎｔ（スキャンＳｘ，ＰＣＣ）は、ＰＰ又はＨスキャン以外の別のスキャンを表す、あるスキャンＳｘにおけるＰＣＣの強度、並びに、
Ｉｎｔ（スキャンＰＰ，ＰＣＣ）は、ＰＣＣの強度が検出されたピーク中においてその最大値又は頂点にある、スキャンＨ（例えば、ＰＰ若しくはピークの頂点）におけるプリカーサーイオンの強度、並びに、
Ｉｎｔ（スキャンＳｘ，Ｆｘ）は、スキャンＳｘにおけるＰＣＣに属するｍ／ｚｘを有する特定のフラグメントイオンＦｘの強度、並びに、
Ｉｎｔ（スキャンＰＰ，Ｆｘ）は、スキャンＨ又はＰＰにおけるＰＣＣに属するｍ／ｚｘを有する特定のフラグメントイオンＦｘの強度、並びに、
ＡＲ２Ｆの値は、フラグメントイオンＦｘが真にＰＣＣに関連する場合の所与の許容差内にある、同じスキャンＳｘにおけるＡＲ２Ｐの同様の値を反映する。
本明細書に記載される一実施形態では、（式３ａに基づいた）ＰＣＣに対するＡＲ２値は、次のように、スキャンＨ１及びＨ２におけるＦＷＨＭ点に対して最初に決定されてもよい。
ＡＲ２＝上り坂比Ｕ＝下り坂比Ｄ
＝Ｉｎｔ（Ｈ１，ＰＣＣ／Ｉｎｔ（Ｈ，ＰＣＣ）＝Ｉｎｔ（Ｈ２，ＰＣＣ）／Ｉｎｔ（Ｈ，ＰＣＣ）
式中、
Ｉｎｔ（Ｈ，ＰＣＣ）は、プリカーサーの強度が検出されたピーク中においてその最大値又は頂点にある、スキャンＨにおけるＰＣＣの強度、
Ｉｎｔ（Ｈ１，ＰＣＣ）は、ＰＣＣの強度がピークの上り坂又はＬＨＳ上のＦＷＨＭにある、スキャンＨ１におけるＰＣＣの強度、並びに、
Ｉｎｔ（Ｈ２，ＰＣＣ）は、ＰＣＣの強度がピークの下り坂又はＲＨＳ上のＦＷＨＭにある、スキャンＨ２におけるＰＣＣの強度である。
ＦＷＨＭの定義によって、ＦＷＨＭスキャンに関するＰＣＣのＡＲ２は、ある予期される許容差内で常に１／２となる。
第４のステップで、スキャンＨ、Ｈ１、及びＨ２に対するフラグメント又は上昇エネルギースキャンデータを検査し、スキャン間で特定のフラグメントに対して質量又はｍ／ｚをマッチさせ、フラグメントに対する強度比（ＩＲ）を、（式３ａを使用して決定されるような）ＰＣＣのＡＲ２値のものとマッチさせることによって、スキャン間でＰＣＣに対してマッチするフラグメントイオンを決定する処理が行われてもよい。以下のフラグメントに対するＩＲは、式３ｂによって表されるような、フラグメントイオンＡＲＦに対するＡＲ２値であることが注目されるべきである。
更に例証するため、スキャンＨ及びＨ１の間でマッチするフラグメントの第１のセットを決定し、またスキャンＨとＨ２との間でマッチするフラグメントの第２のセットを決定する処理が行われてもよい。例えば、スキャンＨのフラグメントＦ１は、スキャンＨ１のフラグメントＦ１’’にマッチするように決定されるが、その条件は次のものである。
Ｆ１の質量又はｍ／ｚが、ある指定の質量許容差内でＦ１’’の質量又はｍ／ｚにマッチすること、並びに、
次式のように計算される強度比ＩＲ
ＩＲ＝スキャンＨ１におけるＦ１’’の強度／スキャンＨにおけるＦ１の強度
が、ある指定の許容差内で（同じスキャンＨ及びＨ１に対する関連するＰＣＣの）ＡＲ２にマッチすること。
例えば、スキャンＨ１がスキャン時間１００４であって、フラグメントイオンＦ１が質量ｍ１及び強度５，０００で存在し、フラグメントイオンＦ２が質量ｍ２及び強度５，０００で存在すると仮定する。スキャンＨがスキャン時間１００８であって、フラグメントイオンＦ１が質量ｍ１及び強度１０，０００で存在し、フラグメントイオンＦ２が質量ｍ２及び強度６，０００で存在すると仮定する。更に、この例に関して、スキャンＨ２がスキャン１０１２であって、フラグメントイオンＦ２が質量ｍ２及び強度３，０００で存在すると仮定する。
そこで、上記に基づいて、スキャンＨ及びＨ１のフラグメントイオンＦ１に関して、ＩＲ＝５，０００／１０，０００＝１／２であり、これはＰＣＣに対する１／２のＡＲ２値にマッチする。したがって、Ｆ１は、ＰＣＣのマッチするフラグメントの第１のセットに含まれる。
スキャンＨ及びＨ１のＦ２に関して、ＩＲ＝５，０００／６，０００＝０．８３であり、これはＰＣＣに対する１／２のＡＲ２値にマッチしない。したがって、Ｆ２は、ＰＣＣのマッチするフラグメントの第１のセットに含まれない。
スキャンＨ及びＨ２のＦ２に関して、ＩＲ＝３，０００／６，０００＝１／であり、これはＰＣＣに対する１／２のＡＲ２値にマッチする。したがって、Ｆ２は、ＰＣＣのマッチするフラグメントの第２のセットに含まれる。
したがって、ＡＲ２値は、ＰＣＣの検出されたピークにおける各スキャン（例えば、スキャンＨ以外の各スキャン）に対して決定され、ＰＣＣに対するマッチする又は関連するフラグメントイオンのセットを決定する、フィルタ処理又は検証で使用される検証基準に含まれてもよい。したがって、ピークに対する各スキャン点について、ＰＣＣのＡＲ２値が存在する。例えば、ＰＣＣの検出されたピークに１２の点又はスキャンが存在する場合、ＰＣＣに対して１１のＡＲ２値があることになる（１２の点のうち１つはピーク若しくはＰＰの頂点であるため）。
上記でＩＲとして表されるメトリックは、より一般的には、式３ｂのように特徴付けられてもよく、本明細書では、ＰＣＣとして同じ２つのスキャンにおいて（ＰＣＣではなく）フラグメントイオンの強度又は面積比に対して決定される別のＡＲ２値と呼ばれてもよいことが注目されるべきである。上述されるように、また本明細書の他の箇所に示されるように、ＡＲ２値は、２つの異なるスキャン時間に関してＰＣＣに対して決定され、ＦがＰＣＣのフラグメンテーションと関連付けられるか又はそれによって生成される場合、ＰＣＣはある指定の許容差内で同じであるはずなので、ＡＲ２値は、同じ２つの時間におけるフラグメントイオンＦに対して決定される。
強度がＬＣピークを辿らないようにして、所与のスキャンでＰＣＣが干渉される例では、近接スキャンの強度は線形回帰補間であり、上り坂及び下り坂が頂点スキャンと比較されるときは、範囲外のスキャンにおけるＰＣＣの強度が大きい場合、ガウスピーク形状を所与として、２つのＡＲ１及びＡＲ２値は一貫しているべきである。そのため、任意の近接スキャンを比較すると、頂点と他の任意のスキャンとの間のＡＲ２値を計算する際、ＰＣＣの強度は、第１の例では、近接スキャンに関して線形回帰及び補間を行うことによって検証される。
一実施形態では、上述したように、スキャンＨ１及びＨ２に対するＡＲ２値にしたがって、かかるスキャンに関してマッチするフラグメントの数を決定する処理が行われてもよい。次に、スキャンＨ１に対して決定される第１のマッチするフラグメントセット、及びスキャンＨ２に対して決定される第２のマッチするフラグメントセットについて、検証処理が行われてもよい。かかる検証処理は、（ＡＲ１（面積比１）のメトリックなどの他のメトリックを含む他の基準、及び更に詳細に後述される他の基準を使用するなど、１つ又は２つ以上の追加の検証基準を使用することを含んでもよい。例えば、かかる検証処理は、セット中のマッチするフラグメントの数が少なくとも指定の最小数であるか否かを判断することを含んでもよい（例えば、図８、及び本明細書の他の箇所に記載される関連する処理を参照）。点又はスキャンＨ１及びＨ２に対して決定されたマッチするフラグメントセットの検証において検証処理が成功した場合、処理は、曲線上の他のスキャン又は点に対して継続してもよい。別の方法では、Ｈ１及び／又はＨ２に対する検証処理が失敗した場合、特定のＰＣＣと関連付けられるフラグメントイオンを決定する、代替の技術が使用されてもよい。
一実施形態では、処理は更に、（図７の点Ｘ１によって表されるような）Ｈ１及びＨの中点における、次に（図７の点Ｘ２によって表されるような）スキャンＨ及びＨ２の間の中間におけるスキャンに対して、マッチするフラグメントの数を決定することに進んでもよい。点Ｘ１及びＸ２における各スキャンに関して、上述したもの、並びに点Ｈ１及びＨ２における各スキャンと関連して本明細書の他の箇所に記載されるものと、同様の処理が行われてもよい。例えば、Ｘ１及びＸ２によって表される各スキャンに関して、ＡＲ２（面積比２）値を決定し、スキャンに関してマッチするフラグメントセットを決定し、次に、マッチするフラグメントセットが任意の更なる検証基準（例えば、ＡＲ１、及び本明細書に記載される他の基準）に合格するかを判断する。かかる検証基準は、マッチするフラグメントセットが最小数のフラグメントを含むことを含んでもよい。それに加えて、基準はまた、１つ又は２つ以上の他のスキャンに関して、スキャンの検出されたフラグメントの数を比較することを含んでもよい。例えば、ＰＣＣの強度がスキャンＳ１からスキャンＳ２まで増加するにしたがって、検出されたフラグメントの数は同様に増加し、それにより、スキャンＳ１の検出されたフラグメントの数＜スキャンＳ２の検出されたフラグメントの数であることが予期される。かかる基準はまた、スキャンＳ１及びＳ２におけるフラグメントの強度を検査し、それにより、スキャンＳ１のフラグメントＦ１の強度が同様に、スキャンＦ２のＦ１の強度よりも小さいべきであることを含んでもよい。
かかる処理は、ＰＣＣのピークのかかる点が全て処理されるまで、処理された他の２つの連続スキャン点間に位置する次のスキャン点を繰り返し決定することによって反復されてもよい。このように、中間スキャン点の繰り返される処理は、ＰＣＣのピーク又は曲線の上側部分（例えば、Ｈ１からＨ２までのスキャン点を包括的に含む上側部分）におけるスキャンに対して、また、ＰＣＣのピーク又は曲線の下側部分におけるスキャン（例えば、点ＰｓｔａｒｔからＨ１までのスキャン、及びＨ２からＰｅｎｄまでのスキャン）に対して行われることが注目されるべきである。一実施形態では、検証処理が、ＦＷＨＭ点Ｈ１及びＨ２の下にあるピークの下側部分のスキャンに対して決定されるフラグメントのセットを検証するのに失敗した場合、検証処理に失敗したスキャンのフラグメントのセットは除外されてもよく、処理は、ＰＣＣのピークの下側部分における任意の残りのスキャンを継続してもよい。
次に記載されるのは別のメトリックであり、どのフラグメントイオンが各ＰＣＣと関連付けられるかの判断と関連して、フラグメントイオンの検証又はフィルタ処理に使用される検証基準にやはり含まれてもよい、ＡＲ１（面積比１）メトリックである。
各スキャンＳｊに対して、スキャンＳｊにおける各プロダクト又はフラグメントイオンＦｉは、次式のように表されてもよいＡＲ１（面積比１）を有する。
ＡＲ１＝スキャンＳｊにおけるＦｉの強度／スキャンＳｊにおけるＰＣＣの強度
例えば、スキャンＳ１で、強度ＸのフラグメントＦ１、強度ＹのＦ２、及び強度ＺのＰＣＣ Ｐ１があるものとする。スキャンＳ１に対して２つのＡＲ１値があり、第１のＡＲ１値はＸ／Ｚ、第２のＡＲ１値はＹ／Ｚである。
本明細書の技術による一実施形態の処理は、ＡＲ１値を使用してＡＲ２値を検証してもよい。ＡＲ２を使用して決定され、上述したような検証処理に合格する、マッチしたフラグメントＦｉそれぞれに対して、ここで、特定のフラグメントＦｉに対するＡＲ１値を使用して、更なる検証処理が行われてもよい。Ｆｉに対するＡＲ１を使用して行われるかかる更なる検証処理は、フラグメントＦ１に関して（ピークの）スキャン１〜Ｎに対するＡＲ１値を比較してもよい。全てのかかるＡＲ１値がある許容差内で同じではない場合、フラグメントＦ１はＰＣＣ Ｐ１とマッチしない（その強度は、上記ＡＲ１及びＡＲ２値を計算するのに使用される）。
特定のＰＣＣに対するスキャンデータ及び関連するフラグメントイオンを検証するのに使用される検証基準は、更に、以下に記載されるフラグメンテーション効率に基づいて別のメトリックを含んでもよい。
一般に、良好に行われた実験では、過剰な衝突エネルギーを用いて動作することによって、プリカーサーイオンを過度にフラグメンテーションしないことが望ましい。これによって、質量Ｍ１を有する未フラグメンテーションＰＣＣ又はプリカーサーイオンＰ１の一部分が、各スキャンに対する上昇エネルギー又はフラグメントイオンスペクトルに現れる。本明細書の技術は、次のことを判断してもよい。
１．Ｐ１が、スキャンＳ１のフラグメントイオン又はＥＥスキャンデータに現れるか。現れた場合、
２．スキャンＳ１に対するＥＥスキャンデータにおけるＰ１の強度を決定する。
ＰＣＣ又はプリカーサーＰ１が、スキャンＳ１に対するプロダクト又はフラグメントイオンＦ１及びＦ２と関連付けられると判断されたものと仮定する。スキャンＳ１の場合、Ｐ１は、ＬＥ又はプリカーサースキャンにおける強度Ｘ１と、ＥＥフラグメントイオンスキャンにおける強度Ｘ２とを有する。以下の関係Ｒ１は、検証基準に含まれてもよく、特定のスキャンＳ１のデータが有効であるために、真であると評価しなければならない。
関係Ｒ１
強度差Ｘ１−Ｘ２＞スキャンＳ１のＥＥスキャンデータにおける全てのフラグメント又はプロダクトイオンの強度の合計
上記関係Ｒ１は、左側（ＬＨＳ）の「Ｘ１−Ｘ２」を含む。Ｘ１が、フラグメンテーション前のＬＥデータにおけるＰ１の開始強度又は量を表し、Ｘ２が、フラグメンテーション後のＰ１の残りの強度又は量を表す場合、式Ｘ１−Ｘ２は、ＥＥスキャンデータにフラグメンテーションイオンとして現れてもよい、Ｐ１の合計強度又は量に対する最大値又は上界を表す。Ｒ１の右側（ＲＨＳ）は、スキャンＳ１のＥＥスキャンデータにおける全てのフラグメント又はプロダクトイオンの強度の実際の計算された合計であり、それによって、ＥＥスキャンデータにおける全ての観察可能なフラグメントイオンの強度の合計が表される。Ｒ１のＲＨＳは、Ｒ１のＬＨＳによって表される最大値又は上界よりも小さいべきである。
本明細書の技術による一実施形態では、検証基準はまた、ＰＣＣとマッチするか又は関連付けられるものとして、各スキャンに対して決定されるフラグメントイオンの数を検査することを含んでもよい。図７を参照すると、一般に、ＰｓｔａｒｔとＨとの間の点に対するスキャン時間が増加するにしたがって（例えば、Ｐｓｔａｒｔからピークの頂点まで上向きに移動する）にしたがって、マッチすべきフラグメントイオンの数は増加することが予期されることがある。それに加えて、Ｐｓｔａｒｔ及びＨの包括範囲における点Ｐ１及びＰ２に対して、Ｐ１が、点Ｐ２と関連付けられる別のスキャン時間よりも短いスキャン時間を有する場合、点Ｐ１に対して決定された第１のセットに含まれる１つ又は２つ以上のフラグメントイオンが、点Ｐ２に対して決定された１つ又は２つ以上のフラグメントの第２のセットにも含まれることが予期される。同様の方法で、一般に、ＨとＰｅｎｄとの間の点に対するスキャン時間が増加する（例えば、ピークの頂点からＰｅｎｄまで下向きに移動する）にしたがって、マッチすべきフラグメントイオンの数は減少することが予期されることがある。それに加えて、Ｈ及びＰｅｎｄの包括範囲における点Ｐ３及びＰ４に対して、Ｐ３が、点Ｐ４と関連付けられる別のスキャン時間よりも短いスキャン時間を有する場合、点Ｐ４に対して決定された第１のセットに含まれる１つ又は２つ以上のフラグメントイオンが、点Ｐ３に対して決定された１つ又は２つ以上のフラグメントの第２のセットにも含まれることが予期される。
上述したように、特定のＰＣＣに関するフラグメンテーションの結果として得られるフラグメントの予期される数は、特定のＰＣＣによって変動することがあり、ＰＣＣの複雑性及び強度に応じて決まることがある。同様に、ＰＣＣ又はプリカーサーイオンと関連付けられるものとして決定される、マッチしたフラグメント又はスキャン中のフラグメントの数は、ＰＣＣ又はプリカーサーイオンの複雑性及び強度に応じて決まることがある。一実施形態では、スキャンにおいて予期される特定のＰＣＣに対するマッチしたフラグメントの最小数は、ＬＥスキャンにおけるＰＣＣの強度、並びにＰＣＣの複雑性に関連する（例えば、それを表す）ＰＣＣの属性を含む、基準に基づいて決定されてもよい。一実施形態では、スキャンにおけるＰＣＣの複雑性を表す属性は、分子量Ｍｒ（分子の基本的組成に基づく無電荷質量）であってもよい。変形例として、一実施形態は、ＰＣＣの複雑性を表すのに使用される属性を分子と共に変動させてもよい。例えば、単純な又は小さい分子の場合、分子量Ｍｒ（分子の基本的組成に基づく無電化質量）が使用されてもよい。ペプチド、又はより複雑な分子の場合、Ｍｒではなく、ＰＣＣの長さが推定されてもよい。ＰＣＣ又はプリカーサーイオンの長さは、その複雑性に伴って変動してもよい。例えば、ペプチドなどの複雑な分子の場合、スキャンＴ１におけるＰＣＣはアミノ酸鎖であり、決定される長さはアミノ酸鎖の長さであってもよい。
したがって、一般に、スキャンＳ１のＰＣＣとマッチさせるか又は関連付ける必要があるフラグメントイオンの最小数は、そのスキャンＳ１のＬＥスキャンデータにおけるＰＣＣの複雑性Ｃ及びＰＣＣの強度Ｉを有する関数として表されてもよい（例えば、スキャンＳ１及びＰＣＣ又はプリカーサーイオンＰ１の場合、Ｇ（Ｃ，Ｉ）＝スキャンＳ１においてＰ１とマッチされるか又は関連付けられるべきフラグメントイオンの最小数）。一実施形態では、フラグメントの最小数は、当業者の専門家知識及び最優良事例に基づいて予め定められてもよい情報を含む、図８に示されるものなどの、値の表を使用して決定されてもよい。かかる最小値は、例えば、異なるＭＳ機器のメーカーによって供給又は決定される情報に基づいて提供されてもよい。
図８を参照すると、ＰＣＣ又はプリカーサーイオンに関して予期される、マッチするフラグメントの最小数を決定する、本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよい表の一例が示されている。表８００は、ＰＣＣ又はプリカーサーイオンの複雑性を表す属性の値の列８０２と、ＬＥスキャンにおけるＰＣＣ又はプリカーサーイオンの異なる強度を表す値の列８０４と、マッチするフラグメントの最小数を同定する列８０６とを含んでもよい。したがって、表８００の行は、同じ行の列８０２及び８０４にある値の特定の組み合わせに対して予期される、マッチするフラグメントの最小数を同定する。一実施形態では、列８０２の複雑性を表す属性は、任意の好適な属性であってもよく、例えば、分子量Ｍｒ、複雑な分子などのアミノ酸鎖の長さなど、そのいくつかの例が上述されている。
図８に示されるような表は、大量の干渉がある大誤差を除去するため、特定のスキャン時間のＰＣＣに対して予期される、マッチするフラグメントイオンの最小数を指定するのに利用されてもよい。一実施形態では、表で指定された最小数は、例えば、５０〜６０％の範囲のフラグメンテーション効率に基づいてもよい（例えば、その場合、フラグメンテーション効率は、本明細書の他の箇所に記載される関係Ｒ１に基づいて経験的に決定されてもよい）。
一実施形態では、図８に示されるものなどの表の使用は、ＰＣＣに関して検出される曲線又はピーク（例えば、図７に示されるものなど）において、特定のスキャンに対する特定のＰＣＣとマッチするか又は関連付けられるものとして決定される、フラグメントイオンのセットに対する検証基準及び検証処理と関連する最終ステップとして行われてもよい。
本明細書の技術による一実施形態では、マッチするフラグメントイオンが様々なスキャン時間において決定されている特定のＰＣＣについて、検証基準がＰＣＣのピークの上半分（例えば、ＬＨＳのＦＷＨＭ（Ｈ１スキャン）からＲＨＳのＦＷＨＭ（Ｈ２スキャン）までに含まれる全てのスキャン時間に関して満たされない場合、曲線又はピーク上の他のスキャン点の更なる処理は行われなくてもよい。例えば、ＡＲ１、ＡＲ２、及びマッチするフラグメントイオンの最小数の検証基準が、ＰＣＣのピーク又は曲線の上半分のスキャンに関して満たされない場合、一実施形態は、代替の技術を使用してもよい。ピーク又は曲線の上半分のスキャンに関してマッチするフラグメントを決定するかかる処理は、上半分の任意のスキャン点のうち最初に生じたものが検証処理に失敗する（例えば、一実施形態で使用される検証基準に関して、ＡＲ１、ＡＲ２、マッチするフラグメントの最小数などが合格しない）と終了されてもよい。検証の失敗が、曲線又はピークの上半分における任意のスキャン時間に起こった場合、特定のＰＣＣにマッチするフラグメントイオンを決定する代替の技術が利用されてもよい。検証の失敗が、ＰＣＣのピーク又は曲線の下側部分におけるスキャン（例えば、点ＰｓｔａｒｔからＨ１までのスキャン、及びＨ２からＰｅｎｄまでのスキャンに関して起こった場合、処理は、下側部分の他の残りのスキャンを用いて継続してもよく、それにより、特定の失敗したスキャンに対して決定された任意のデータ又はフラグメントが除外される。
本明細書の技術による一実施形態はまた、特定の分子又は成分と関連付けられる各フラグメント又はプロダクトイオンに対して決定されてもよい、別のメトリックＡＲ３（面積比３）を使用してもよい。フラグメントＦｉに対するＡＲ３は次式のように表されてもよい。
ＡＲ３＝フラグメントＦｉ（強度）／ＰＣＣにマッチした全てのフラグメントの強度の合計
式中、
Ｆｉ（強度）は、ＰＣＣと関連付けられるフラグメントＦｉの強度、並びに、
「ＰＣＣにマッチした全てのフラグメントの強度の合計」は、ＰＣＣにマッチした全てのフラグメントの強度の数学的総和を表す。
一実施形態では、ＡＲ３は、特定のＰＣＣとマッチするか又は関連付けられるものとして決定された各フラグメントイオンに対して、スキャンごと又はスキャン時間基準で（例えば、ＡＲ１値に関して本明細書に記載されるのと同様の方法で）決定されてもよい。フラグメントイオンＦ１に対してＡＲ３値を使用して行われる検証処理は、（特定のＰＣＣのピークにわたって）フラグメントイオンＦ１に対するスキャン１〜ＮのＡＲ３値を比較してもよい。かかるＡＲ３がある許容差内で全て同じではない場合、フラグメントＦ１はその特定のＰＣＣとマッチしない（それにより、スキャンに対するＡ３の分母として合計されたフラグメントイオンは全て、スキャンにおいてＰＣＣと関連付けられるか又はそれにマッチしたものとして判断される）。
したがって、教師なしクラスタリングのこの時点で、図７に示されるものなどの検出されたピーク又は曲線を有する各ＰＣＣに関して、ゼロ又はそれ以上のフラグメントのセットが、ＰＣＣのピークにわたる各スキャンに対して決定されてもよい。本明細書に記載されるものなどの検証基準を使用して、フラグメントイオンのかかるセットはそれぞれ、更にフィルタ処理又は改良されてもよい。検証基準及び関連する処理が、特定のスキャン時間における特定のフラグメントイオンセットに対して満たされないいくつかの場合では、フラグメントイオンセットは、廃棄されるか、又はそれ以上考慮されなくてもよく（例えば、スキャン時間が、本明細書の他の箇所に記載されるようなピークの下側部分にある場合など）、処理は他のスキャン時間からの他のフラグメントセットを用いて継続してもよい。検証基準及び関連する処理が、特定のスキャン時間における特定のフラグメントイオンセットに対して満たされないいくつかの場合（例えば、スキャン時間が、本明細書の他の箇所に記載されるような、点Ｈ１及びＨ２の間のピークの上側部分にある場合など）では、検証基準を使用する処理が停止して、検証基準を使用してピークにわたる他のスキャン時間からの他のフラグメントセットを評価してもよく、どのフラグメントイオンがＰＣＣと関連付けられるかを判断する代替の技術を使用してもよい。
検証基準を使用する上述したような処理は、ＰＣＣの検出されたピークの異なるスキャン時間に対してフラグメントの複数のセットを決定する。この時点で、処理が行われて、ＰＣＣに対するＳＳＰＰＩＳが形成されてもよい。かかる処理は、ＰＣＣの溶出ピークのスキャン時間にわたるフラグメントの複数のセットを組み合わせて、ＰＣＣと関連付けられる単一のフラグメントセットにすることを含んでもよく、それによって、ＰＣＣからのフラグメンテーション若しくは解離と関連付けられる、又はそれによって生成されるフラグメントのセットを表す。一実施形態では、ＰＣＣの検出されたピークのスキャン時間に対するフラグメントの複数のセットは組み合わされて、全てのかかる複数セットの合併集合としての単一のセットにされてもよく、それにより、組み合わされたフラグメントイオンの単一のセット及びＰＣＣは、ＰＣＣに対するＳＳＰＰＩＳを形成してもよい。
ＰＣＣのＳＳＰＰＩＳを形成するにあたって、ＰＣＣの検出されたピークのスキャン時間にわたるフラグメントの複数のセットを組み合わせることの一部として、ＡＲ１、ＡＲ２、ＡＲ３、及び一実施形態で使用されてもよい他の任意のものなどの異なるメトリックの値が組み合わされてもよい。一実施形態では、平均が、ＡＲ１、ＡＲ２などに対して決定されてもよい。例えば、ＰＣＣのピークにわたる１２の点又はスキャン時間、及び関連する１２のＡＲ２値（１２の点に対して１つずつ）がある場合、平均ＡＲ２値は、かかる１２のＡＲ２値全ての平均としてＰＣＣに対して決定されてもよい。フラグメントイオンＦ１は、１２のスキャン時間のうち８つのフラグメントイオンセットに現れてもよく、このＦ１は８つのＡＲ１値（８つのスキャン時間に対して１つずつ）を有し、平均ＡＲ１値は、かかるＡＲ１値全ての平均としてＦ１に対して決定されてもよい。同様に、平均は、本明細書に記載される他の面積又は強度比メトリック（例えば、フラグメントイオンに対するＡＲ２）に対して決定されてもよい。平均はまた、ＰＣＣ及び／又はＰＣＣと関連するフラグメントイオンと関連する１つ又は２つ以上の他の属性に対して得られてもよい（例えば、ＰＣＣに対してマッチされる単一のフラグメントイオンセットに含まれる）。例えば、一実施形態では、フラグメントイオンのｍ／ｚは、フラグメントイオンの平均ｍ／ｚ値（例えば、フラグメントイオンが現れる全てのスキャン時間のＥＥスキャンデータに対する平均ｍ／ｚ）であってもよい。変形例として、一実施形態は、ピークの頂点又は点Ｈのスキャン時間に生じる、フラグメントイオンのｍ／ｚ値を使用してもよい。
処理のこの時点で、フラグメントの単一のセットは、各ＰＣＣと関連付けられるか又はそれに対してマッチされてもよく、それにより、ＳＳＰＰＩＳが各ＰＣＣに対して作成されている。例えば、図６を参照すると、処理は、フラグメントセット６１４ａがＰＣＣ１ ６１０と関連付けられ、フラグメントセット６１４ｂがＰＣＣ２と関連付けられ、フラグメントセット６１４ｃがＰＣＣ３と関連付けられていると判断している。処理は、次に、特定の溶出成分又は分子と関連付けられる、ＰＣＣ（及び関連若しくはマッチしたフラグメントイオン、またしたがってかかるＳＳＰＰＩＳのグループ化）を更にグループ化するか又は組み合わせるように行われてもよい。例えば、処理は、特定の３つのＰＣＣ ６１０ａ〜ｃに対して３つのＳＳＰＩＳを選択しグループ化するように行われ、それによって、これら３つのＰＣＣが、Ｐ１ ６０２など、同じ溶出成分又は分子から発することを表してもよい。したがって、３つのＰＣＣ ６１０ａ〜ｃ及びそれらの関連するフラグメントイオンセット６１４ａ〜ｃを（上記と関連付けられる属性と共に）グループ化した凝集の結果は、溶出成分又は分子の指紋若しくはパターンに含まれる情報である。単一の溶出成分又は分子の指紋の情報を含む上記凝集の結果はまた、本明細書では、ＣＰＰＩＳ（複合プリカーサー−プロダクトイオンスペクトル）と呼ばれることもある。
組み合わされてＣＰＰＩＳとなる特定のＳＳＰＰＩＳは、任意の好適な技術を使用して、マッチしたセットとして決定されてもよい。例えば、一実施形態は、ＳＳＰＩＳのそれぞれの検出されたピークそれぞれの各スキャン時間において、ＰＣＣの（指定の許容差内の）同じ相対分子量Ｍｒをマッチさせることによって組み合わされるマッチしたセットとして、３つのＰＣＣ ６１０ａ〜ｃに対する３つのＳＳＰＰＩＳを決定してもよい。それに加えて、処理は、マッチしたセットの各ＳＳＰＰＩＳにおいてＰＣＣに対して検出されたピークのそれぞれが、各ピークが（ある指定の許容差内の）ほぼ同じスキャン時間ウィンドウに現れる、同様のピーク形状及びプロファイルを有することを担保してもよい。マッチしたセットの各ＳＳＰＰＩＳのうちどのプロダクトイオンが組み合わされるべきであるかを検証する処理は、更に、ＳＳＰＰＩＳ内及びＳＳＰＰＩＳ間でｍ／ｚ、ＡＲ１、及びＡＲ２を使用することを含んでもよい。したがって、プリカーサーのＡＲ２値は、ガウス型にしたがうことが予期される。したがって、ＳＳＰＰＩＳは、それらのｍ／ｚ、ＡＲ１、及びＡＲ２の値が（ある許容差内で）一貫していない場合に、マッチしたセットから除外されてもよい。
一実施形態では、マッチしたセットの各ＳＳＰＰＩＳからのフラグメントイオンセットは、溶出分子又は成分に対してＣＰＰＩＳフラグメントイオンセットを形成するように、合併集合動作と同様に、組み合わされてもよい。例えば、図６を参照すると、ＣＰＰＩＳフラグメントイオンセットは、６１４ａ〜ｃのフラグメントの合併集合として決定されてもよい。代替例として、処理は更に、６１４ａ〜ｃにおけるフラグメントの合併集合として決定された、ＣＰＰＩＳフラグメントイオンセットに含まれるフラグメントイオンを更にフィルタ処理又は還元してもよい、追加の検証処理を行うことを含んでもよい。
ＣＰＰＩＳを作成する際に単一の溶出成分又は分子に対するＳＳＰＰＩＳのかかる凝集を行うことと関連して、関連する属性（ｍ／ｚ、ＡＲ１、ＡＲ３などのメトリックを含む）、並びにＰＣＣ及びそれに関連するフラグメントイオンの測定もまた、組み合わされてもよいことが注目されるべきである。一実施形態では、ＡＲ１及びＡＲ３に対するエラーインジケータも、それらの関連するＣＶであってもよい。
当該分野で知られているように、ＡＲ１若しくはＡＲ３などのメトリックに関する変数又はＣＶの係数は、次式に表される、標準偏差σと平均μの比として定義されてもよい。
Figure 0006831337
 ＣＶは、個体群の平均に関する変動性の程度を示す。したがって、例えば、フラグメントイオンＦ１のＡＲ１に対するＣＶは、ＰＣＣのピークにわたって、あるいは溶出成分又は分子と関連付けられる全てのＰＣＣ若しくはＳＳＰＰＩＳＣＶに関して、Ｆ１の強度と関連付けられる一貫性の誤差又はレベルを表すのに使用されてもよい。
図９を参照すると、教師なしクラスタリングに関する本明細書の技術による一実施形態で行われてもよいものを要約した、処理のフローチャートが示されている。フローチャート１２００は、上述された処理を要約している。ステップ１２０２で、サンプルを使用して、ＨＥスキャンデータ及びＬＥスキャンデータを得る実験が行われてもよい。サンプルは、１つ又は２つ以上の溶出成分又は分子を含んでもよい。ステップ１２０４で、ＬＥスキャンデータにおけるイオンのＰＣＣを決定する処理が行われてもよい。ステップ１２０５で、各ＰＣＣに対してピーク検出が行われてもよい。ステップ１２０６で、ＰＣＣのそれぞれに対して、ＡＲ１値、ＡＲ２値、及び他の基準を含む検証基準と関連する、ＰＣＣと関連付けられる（例えば、マッチする）フラグメントイオンのセットを決定する処理が行われてもよい。検証基準は、最初のフラグメントイオンをフィルタ処理又は改良し、各ＰＣＣに対して改訂されたフラグメントイオンセットを決定するのに使用されてもよい。ステップ１２０８で、検証処理の失敗によって、関連するフラグメントイオンのセットとマッチしないＰＣＣのそれぞれに関して、関連するフラグメントイオンのセットを決定する代替の技術が使用されてもよい。ステップ１２１０で、ＳＳＰＰＩＳが各ＰＣＣに対して決定され、ＰＣＣとそのＰＣＣから発するフラグメントイオンの関連するフラグメントイオンセットとを含む、ＰＣＣに対するＳＳＰＰＩＳを形成する処理が行われてもよい。ステップ１２１２で、溶出成分又は分子に対してＣＰＰＩＳを構築する処理が行われてもよい。ＣＰＰＩＳは、溶出成分又は分子から発するＰＣＣをそれぞれ含む、ＳＳＰＰＩＳの１つ又は２つ以上のセットを決定することによって、各溶出成分又は分子に対して決定される。溶出成分又は分子のＣＰＰＩＳは、１つ又は２つ以上のＳＳＰＩＳのセットを組み合わせることによって構築される。ＣＰＰＩＳは、溶出分子の指紋として使用されてもよい。
図９と関連して、本明細書の他の箇所の記載と一致する処理の場合、ＳＳＰＰＩＳは各ＬＥ単一スキャンの各ＰＣＣに対して作成されてもよく、プロダクトイオンは比較のＥＥスキャンから得られる。比較のＥＥスキャンにおけるプロダクトイオンは、（親プリカーサーに対する強度及びｍ／ｚによるフィルタ処理を通して）各単一のＰＣＣと共有されて、固有のＳＳＰＰＩＳが作成される。
図１０を参照すると、本明細書の技術による一実施形態で、図９のステップ１２０６で行われてもよい処理（例えば、ＰＣＣのそれぞれと関連付けられるフラグメントイオンのセットを決定する）の更なる詳細を提供するフローチャート１２５０が示されている。フローチャート１２５０は、各ＰＣＣに対して行われてもよい。ステップ１２１４で、関連するピークを有するＰＣＣに対して、Ｈ又はＰＰ（ＰＣＣの最大強度を有する頂点にある）、Ｈ１及びＨ２（ＦＷＨＭスキャン点）に対応するピークのスキャン時間／点を決定する。ステップ１２１６で、ＦＷＨＭスキャン点Ｈ１及びＨ２の場合、Ｈ１は第１の現在のスキャン点Ｃ１であり、Ｈ２は第２の現在のスキャン点Ｃ２である。ステップ１２１８で、ＡＲ１及びＡＲ２値がＣ１及びＣ２に対して決定される。ステップ１２２０で、検証基準にしたがって（例えば、ｍ／ｚ、ＡＲ１値、及びＡＲ２値、及び他の基準によってフラグメントイオンをマッチさせることによって）、Ｃ１に対する第１のマッチするフラグメントイオンセット及びＣ２に対する第２のマッチするフラグメントイオンセットを決定する処理が行われる。ステップ１２２２で、第１及び第２のマッチするフラグメントイオンセットが検証基準に合格したか否かに関して判断が行われる。合格しなかった場合、処理はステップ１２２４に進んで、ＰＣＣに対するフラグメントイオンセットを決定する代替の技術が使用されてもよい。ステップ１２２２が「はい」と評価した場合、制御はステップ１２２６に進んで、処理がＰＣＣピークの上側部分にある全ての点に関して完了しているか否かの判断が行われる。ステップ１２２６が「はい」と評価した場合、制御はステップ１２２８に進んで、ＰＣＣピークの下側部分にある残りのスキャン点（例えば、ＰｓｔａｒｔからＨ１まで、及びＨ２からＰｅｎｄまでのスキャン点）の処理を行い、下側部分のＳＳＰＰＩＳのＨ１をＰｓｔａｒｔに、Ｈ２をＰｅｎｄにマッチさせることに関連して、スキャンＨのＳＳＰＰＩＳにおけるより多量のマッチするプロダクトイオンのみが、一貫したＡＲ１及びＡＲ２比とマッチするという点で、更なるフィルタ処理が達成される。
ステップ１２２６が「いいえ」と評価した場合、制御はステップ１２３０に進んで、ピークの上側部分における中点Ｃ１及びＣ２の次のセット（例えば、スキャンＨ１からＨ２までの上側部分にあるスキャン点の次のセット）が決定される。本明細書に記載されるように、中点の次のセットはそれぞれ、Ｈと現在の点Ｃ１、Ｃ２の間、又はＰｓｔａｒｔとＣ１、及びＣ２とＰｅｎｄとの間で、スキャン時間又は距離を半分にすることによって決定されてもよい。ステップ１２３０から、制御は１２１８に進んで、スキャン点の次のセットが処理される。
図１１を参照すると、ＰＣＣピークの下側部分にある残りのスキャン点を処理する、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップのフローチャートが示されている。フローチャート１３００は、図９のステップ１２２８で行われてもよい処理の更なる詳細を提供する。ステップ１３０２で、処理は、ピークの下側部分にある中点Ｃ１、Ｃ２の次のセットを決定してもよい。ステップ１３０２は、図１０のステップ１２３０に類似しているが、中点がＰＣＣピークの下側部分に位置することが異なる。ステップ１３０４で、ＡＲ１及びＡＲ２値がＣ１及びＣ２に対して決定される。ステップ１３０４は、図１０のステップ１２１８に類似している。ステップ１３０６で、検証基準にしたがって、Ｃ１に対する第１のマッチするフラグメントイオンセット及びＣ２に対する第２のマッチするフラグメントイオンセットを決定する処理が行われる。ステップ１３０６は、図１０のステップ１２２０に類似している。ステップ１３０８で、第１及び第２のマッチするフラグメントイオンセットが検証基準に合格するか否かに関して判断が行われる。ステップ１３０８は、図１０のステップ１２２２に類似している。ステップ１３０８が「いいえ」と評価した場合、処理はステップ１３１２に進んで、検証基準に合格しないフラグメントイオンセットを除外する。制御はステップ１３１０に進む。ステップ１３０８が「はい」と評価した場合、制御はステップ１３１０に直接進む。ステップ１３１０で、ＰＣＣピークの下側部分にある全てのスキャン点に対して処理が行われたか否かの判断が行われる。処理が行われた場合、処理は停止する。そうでなければ、ステップ１３１０が「いいえ」と評価した場合、制御はステップ１３０２に進む。
図１２を参照すると、本明細書の技術による一実施形態において、溶出成分又は分子に関してＣＰＰＩＳに含まれ、溶出成分又は分子を同定する指紋として使用されてもよい、情報の一例が示されている。例９００は、第１の列ＰＣＣ ９０２と、第２の列の関連するフラグメント又はプロダクトイオン９０４とを有する表を含む。表の各行は、本明細書の技術を使用して決定されてもよいような、ＰＣＣと、それに関連付けられるか又はマッチしたフラグメントイオンとを表す。例は、２つの関連するＰＣＣであるＰＣＣ１及びＰＣＣ２を有する分子を示しており、ＰＣＣ１及びその関連するフラグメントイオンは行９１０に含まれ、ＰＣＣ２及びその関連するフラグメントイオンは行９１２に含まれる。一般に、各行９１０、９１２は、ＰＣＣ及びその関連するフラグメントイオンに対する、様々な属性などの情報を含んでもよい。更に例証するため、要素９３０は、本明細書の技術による一実施形態で生成され使用されてもよいような、行９１０の上方に関する更なる詳細を提供する。行９１２は、例９００には示されないが、９３０と同様の情報を含んでもよい。
要素９３０に示されるように、ＰＣＣ１はフラグメントイオンＦ１及びＦ２と関連付けられてもよい。ＰＣＣ１の属性は、ｍ／ｚ及び電荷状態ｚを含む。各フラグメントＦ１、Ｆ２の属性は、ｍ／ｚ、ＡＲ１、ＡＲ３、ＡＲ１及びＡＲ３に対するＣＶ、並びに本明細書に記載され当該分野で知られているような他の属性を含んでもよい。ＰＣＣ及びフラグメントイオンに対して、本明細書の技術による一実施形態で記憶されてもよいような他の属性は、例えば、疎水性値、ドリフト時間、又はイオンモビリティーが使用される場合の衝突断面積（ＣＣＳＡ）などを含んでもよい。
個々のフラグメントイオン及びＰＣＣと共に、また各分子の指紋と共に、図１２に示されるＣＶなどの１つ又は２つ以上の誤差値が記憶されてもよい。本明細書に記載される、かかる誤差値は、指紋データの一貫性又は適合度の基準としてのＣＶを含んでもよい。一般に、関連するＣＶを有する教師なしクラスタリングを使用して生成されるデータのパターン又は指紋を使用して同定される分子の場合、１つ又は２つ以上の関連するＣＶによって示されるものなどの一貫性が大きいほど、結果として得られるデータが良好である。更に一般的には、ＣＶ以外のエラーインジケータが、本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよい。例えば、ＣＶよりもむしろ、一実施形態は、一般に、標準偏差、変数など、任意の好適なエラーインジケータ又は一貫性インジケータを使用してもよい。
図１２に含まれる各ＰＣＣに関して、ＰＣＣの同位体パターン又はクラスタ（例えば、図６の６０４によって表されるものなど）が記憶されてもよいことが注目されるべきである。
本明細書の技術による一実施形態は、（同じ成分若しくは分子を含む、同じサンプル又は異なるサンプルに対して）教師なしクラスタリングを複数回繰り返し、データの集合的結果を組み合わされた形でライブラリ又はデータベースに記憶してもよい。したがって、教師なしクラスタリングは反復する形で行われてもよく、反復ごとに、全ての反復に対して得られた分子の組み合わされた又は集合的な指紋の結果が最新のものに更新される。更なる反復が行われるにしたがって、分子の指紋と関連付けられたＣＶ又は他のエラーインジケータも更新されて、行われたかかる反復全てが反映される。
教師なしクラスタリングの複数の例からの指紋情報を組み合わせることと関連して、第１の分子に対する第１の指紋情報は、マッチング基準に基づいて、現在ライブラリ又はデータベースにある既存の第２の指紋情報に対するマッチとして決定されてもよいことが注目されるべきである。かかるマッチング基準は、一般に、ｍ／ｚ、スキャン／保持時間、ドリフト時間などの属性を含む１つ又は２つ以上の属性と、指紋のＰＣＣ及び／又はフラグメントと関連付けられた１つ又は２つ以上の面積又は強度比（例えば、ＡＲ１、ＡＲ２、ＡＲ３）などのメトリックとの間での、マッチ（指定の許容差内）を決定することを含んでもよい。
かかるマッチング基準は、例えば、スキャン時間、ｍ／ｚ、及びＡＲ１、ＡＲ３値など）に基づいて、（許容差内で）マッチする、統計的に顕著な数（ライブラリ内の他の全てのＣＰＰＩＳに対するマッチしたプロダクトイオンの相対数）のマッチするフラグメントがあるか否かを判断することを含んでもよい。かかるマッチが判断された場合、第１の指紋情報は、既存の第２の指紋情報と組み合わされてもよい。ＣＰＰＩＳのかかる組み合わせは、更に、繰り返すｍ／ｚ値のみに指紋を限定し、任意の関連するメトリック（例えば、ＡＲ１値、ＡＲ３値など）と、ＣＶなどのエラーインジケータとを更新することによって、指紋をフィルタ処理する。組み合わされた形態で維持されるＡＲ１値などの関連するメトリックは、例えば、メトリックの平均値であってもよい。ＡＲ１値は、指紋における任意のマッチされ検証されたプロダクトイオンの強度を所与として、ＰＣＣの強度値を推定するのに利用することができる。
教師なしクラスタリングの複数の例からの指紋情報を組み合わせることと関連して、第１の指紋情報がマッチング基準による既存の分子の指紋にマッチしないと判断された場合、新しい分子に対する第１の指紋情報が、新しい指紋としてライブラリ又はデータベースに追加されてもよいことが注目されるべきである。
特定数の教師なしクラスタリングの反復が行われた後などの第１の時点で、全ての分子に対して結果として得られた集合的な指紋データを評価する、追加の処理が行われてもよい。かかる評価は、指紋データと関連付けられるＣＶ及び他のエラーインジケータを検査して、どのプリカーサー及び／又は関連するフラグメントが、特定の分子を同定する際に「最良に」又は最も一貫しているかを判断することを含んでもよい。
例えば、第１のＰＣＣと第２のＰＣＣとの間で比較される第１のフラグメントは、比較したときに、低いエラー（例えば、指定の閾値よりも低いなど）又は高い一貫性を示す関連するＣＶと、高いエラー又は低い一貫性（例えば、指定の閾値よりも高いなど）を示すＡＲ１値及び／又はＡＲ２値と関連付けられる第２のフラグメントと、を有する、ＡＲ１及び／又はＡＲ２値を有してもよい。第２のフラグメントのＡＲ１及び／又はＡＲ２値のＣＶ（第２のＰＣＣに対する第１のＰＣＣ、若しくは第２のＣＰＰＩＳに対する第１のＣＰＰＩＳ）など、これらのエラーインジケータに基づいて、評価の間、第２のフラグメントがデータベースから除去されるべきであると判断され、教師なしクラスタリング技術を使用して観察された結果の高いエラー若しくは容認不能な非一貫性により、ＰＣＣのＳＳＰＰＩＳ又はＣＰＰＩＳと実際には関連付けられないと判断されてもよい。ライブラリ又はＣＰＰＩＳに含まれてもよいものなどの第１のフラグメントのＡＲ１値に対するＣＶなど、エラーインジケータに基づいて、評価の間、教師なしクラスタリング技術を使用して観察された低いエラー及び一貫性により、教師なしクラスタリングの繰り返される実施によって第１のフラグメントがＰＣＣと関連付けられることが確認されていると判断されてもよい。したがって、かかる評価の結果として、組み合わされたか又は集合的な結果は、例えば、評価に基づいて分子と関連付けられる指紋の１つ又は２つ以上の特定のフラグメントを除去及び／又は追加するなど、改訂又は更新されてもよい。かかる評価は、指紋のＰＣＣが残されるか、あるいは、プリカーサーと関連付けられるＡＲ１値に対するＣＶなどのエラーインジケータを使用して指紋から除去されるべきであるかを判断してもよい（例えば、ＡＲ１値などの１つ又は２つ以上の関連するエラーインジケータが、フラグメントイオンに関して上述したような方法で指定の閾値レベルを満たさない場合、ＰＣＣを除去若しくは除外する）。
図１３を参照すると、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい、処理ステップのフローチャートが示されている。フローチャート１０００は上述された処理を要約している。ステップ１００２で、結果として得られるＳＳＰＩＳの現在のセットが生成され、次に更に１つ又は２つ以上のＣＰＰＩＳへとグループ化される場合において、教師なしクラスタリングが行われてもよい。ステップ１００４で、ＣＰＰＩＳの現在のセットは、教師なしクラスタリング技術の前の実行から得られるデータを含む、既存の組み合わせデータセットなど、任意の既存のデータと組み合わされてもよい。ステップ１００４は、分子の指紋を表すプリカーサーイオン及び関連するフラグメントイオンの結果を組み込んだ、現在の組み合わせデータセットをもたらしてもよい。ステップ１００４は、合併集合にあるデータセットを組み合わせることで得られてもよく、それにより、指紋のフラグメント又はＰＣＣが除去されてもよい。組み合わせデータセットは、例えば、ライブラリ又はデータベースに記憶されてもよい。
ステップ１００６で、評価処理を行う時間か否かに関して決定がなされる。上述したように、ステップ１００６は、例えば、教師なしクラスタリングの指定数の反復が行われたか否か、指定の時間量が経過したか否かなどを判断することを含んでもよい。ステップ１００６が「いいえ」と評価した場合、制御はステップ１００２に進む。ステップ１００６が「はい」と評価した場合、制御は、ステップ１００８に進んで、教師なしクラスタリングの複数の実行から生成された、組み合わされた情報を含むライブラリ又はデータベースの現在のバージョンなど、現在の組み合わせデータセットを評価する。ステップ１００８で、現在の組み合わせデータセットを評価する評価処理が行われる。本明細書の他の箇所に記載されるように、かかる評価は、分子を同定する各指紋、指紋のイオンなどと関連付けられたエラーインジケータを検査して、組み合わせデータセットに対する何らかの更新又は改訂が必要か否かを判断することを含んでもよい。かかる更新又は改訂は、ステップ１００８の評価にしたがって、ステップ１０１０で行われてもよい。ステップ１００８及び１０１０は、例えば、プリカーサー又はＰＣＣと関連付けられたどの１つ又は２つ以上のフラグメントが指紋に残るべきか、またプリカーサー又はＰＣＣと関連付けられたどの１つ又は２つ以上のフラグメントが指紋から除去されるべきか、指紋のどの１つ又は２つ以上のプリカーサー又はＰＣＣが残るべきか、また指紋のどの１つ又は２つ以上のＰＣＣ（及び関連するフラグメント）が除去されるべきかを判断する。ステップ１０１０は、例えば、フラグメントイオンのＡＲ１、ＡＲ２、及び場合によってはＡＲ３値に対してＣＶを使用するなどして、ＰＣＣと現在関連付けられているフラグメントイオンを指紋から除去すべきか否かを判断することを含んでもよく、それによって、同定する目的で、フラグメントイオンがＰＣＣ又はプリカーサーと実際には関連付けられていないと結論付けられる。ステップ１０１２で、ステップ１０１０の結果として生成された、更新された組み合わせデータセットは、分子を同定する指紋のライブラリ又はデータベースとして使用されてもよい。
したがって、フローチャート１０００は、教師なしクラスタリングを複数回反復した結果を、分子を同定するのに使用される各指紋と関連付けられたエラーインジケータ又は一貫性インジケータにしたがって改訂又は更新されている組み合わせデータセットに組み込むことが行われてもよい、プロセスについて記載している。フローチャート１０００の出力は、例えば、分子を同定するのに使用されるライブラリ又はデータベースの特定のバージョンであってもよい。フローチャート１０００の処理は、１回以上繰り返されて、ライブラリ又はデータベースの第２及び更なるその後のバージョンを決定してもよい。このように、フローチャート１０００の処理は、ライブラリ又はデータベースとして使用される、検証され改良された組み合わせデータセットを生成するように行われてもよい。改良された組み合わせデータセットは、教師なしクラスタリングを使用することによって決定される指紋を有する既知の分子を含むサンプルを使用して、繰返し実験を行うことによって生成されてもよい。
一実施形態では、フローチャート１０００の処理は、指紋と関連付けられたエラー又は一貫性インジケータが指定の閾値レベルを満たし、それによって指紋データが「定常状態」にあることが示されるまで繰り返されてもよい。例えば、かかる処理は、教師なしクラスタリングを使用して得られた指紋が、指紋が指定の一貫性レベル内で一貫している（例えば、教師なしクラスタリングによって得られた集合的データ中の相対的な一貫性を表す、指定の閾値未満のＣＶ値を有する）ことを判断するのに使用される、結果として得られる集合的データを示す、関連するエラー又は一貫性インジケータを有するまで行われてもよい。分子を同定する指紋に対して得られるかかる一貫性は、指紋が分子を適正に同定し、指紋が指紋のＰＣＣをその１つ又は２つ以上のフラグメントイオンと適正に関連付けているという点で、関連する高レベルの信頼度を表す。
本明細書の技術による一実施形態は、異なる機器タイプに対して、あるいはより具体的には、イオンの解離又はフラグメンテーションに使用される異なる技術それぞれに対して、異なるライブラリ又はデータベースを生成及び／又は利用してもよい。例えば、本明細書の技術は、フラグメンテーションのために衝突セルを使用するＭＳ機器に対する第１のライブラリ又はデータベース、イオントラップＭＳ機器であるＭＳ機器に対する第２のライブラリ又はデータベースなどを生成及び／又は利用してもよい。
一貫したデータを有する検証されたライブラリが教師なしクラスタリングを使用して生成されると、サンプルが特定の分子を含むか否かを同定するため（同定の前にサンプルが特定の分子を含むか否かが不明の場合）、ライブラリの指紋に対する比較が行われてもよい。例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように、検証されたライブラリが教師ありクラスタリングと関連して使用されてもよい。それに加えて、検証されたライブラリはまた、サンプルに対する差又は異形を更に同定するため、特定の分子を含むことが分かっているサンプルと共に使用されてもよい。例えば、サンプルは、ライブラリの第１の指紋を有する、第１のペプチドなどの第１の分子を含むことが分かっていてもよい。サンプルはまた、他の分子を含んでもよい。このように、本明細書の他の箇所に記載される教師ありクラスタリングなど、サンプルの処理は、第１の指紋を生成することが予期される。サンプルを処理したときにやはり生成された、更なるアンマッチしたイオン（例えば、検証されたライブラリのいずれの分子にもマッチしないＰＣＣ及び／又はフラグメントイオン）が存在する場合、それらの更なるアンマッチしたイオンは、サンプル中にやはり存在する別の分子又は成分による干渉の結果として生成されたものであることがある。
一般に、複数の実験によるＳＳＰＰＩＳは、個別に記憶されてもよく、又は別の方法で、本明細書ではデータベースに記憶されたＣＰＰＩＳとも呼ばれるものなど、任意の好適な組み合わされた形態で記憶されてもよいことが注目されるべきである。本明細書の技術による一実施形態では、本明細書の技術は、ＳＳＰＰＩＳの形態でデータ上で動作してもよく、ＳＰＰＩＳを生成してもよい。ＳＰＰＩＳは、組み合わされた形態又はＣＰＰＩＳなどの組み合わせデータセットの形で記憶されてもよい。ＣＰＰＩＳは、本明細書に記載される処理に用いるため、それに関連するＳＳＰＰＩＳの形に分解されてもよい。
以下、教師ありクラスタリングに関連して使用されてもよい技術について記載する。教師ありクラスタリングは、既知の標的化合物（指紋データベース若しくはシミュレートされたデータベースからのものなど）のＰＣＣ及び関連するフラグメントイオンを、サンプルの実験結果から得られたＳＳＰＰＩＳと比較することによって、教師ありＣＰＰＩＳを作成することを指し、それにより、かかる比較は、保持時間、ドリフト（ＩＭＳが行われた場合）、ｍ／ｚ、ＡＲ１、ＡＲ２、及びマッチしたプロダクトイオンが既知のものの場合はＡＲ３に関して、マッチ及び許容差の既知のセットを使用してもよい。
一般に、教師ありクラスタリングでは、分子に関する既知の指紋又はパターンを有する標的ライブラリ（例えば、どの指紋が特定の溶出成分又は分子に関するものであるかのライブラリ）が存在する。実験（例えば、ＬＣ／ＭＳ若しくはＬＣ／ＭＳ／ＩＭＳ実験など）が行われる所与のサンプルに関して、実験データは、本明細書に記載される教師ありクラスタリング技術を使用して処理されて、サンプルが既知の分子又は溶出成分を含むか否かが判断されてもよい。かかる判断は、サンプルの実験データが、ライブラリから得られてもよいような、既知の分子の既知のパターン又は指紋にマッチするか否かを判断することによって行われてもよい。既知の分子の指紋情報を含む標的ライブラリは、任意の好適な方法で生成又は取得されてもよい。例えば、標的ライブラリは、本明細書に記載されるような教師なしクラスタリングを使用して生成される、検証されたライブラリのバージョンであってもよい。標的ライブラリに対するデータは、例えば、シミュレータなどを使用して生成されてもよい。教師ありクラスタリングによれば、例えば、サンプルの実験データセットを分析した結果としてＰＣＣが得られてもよい。ライブラリに問い合わせて、ライブラリ内にＰＣＣに関する既存の情報があるか否かを判断する、処理が行われてもよい。かかる判断は、実験データセットから得られるようなＰＣＣの属性情報を、ライブラリ内のＰＣＣの属性情報とマッチさせることによって行われてもよい。ＰＣＣに関するかかる属性情報は、例えば、ｍ／ｚ、ＡＲ１、ＡＲ３値などを含んでもよい。
本明細書の技術による一実施形態は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｒｏｍａｎｏｓ，Ｓ．Ｊ．，Ｈｕｇｈｅｓ，Ｃ．Ｇｏｌｉｃｋ，Ｄ．，Ｃｉａｖａｒｉｎｉ，Ｓ．，Ｇｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｖ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｋ．，Ｈｏｙｅｓ，Ｊ．Ｂ．，Ｖｉｓｓｅｒｓ，Ｊ．Ｐ．Ｃ．、及びＬａｎｇｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｉ．（２０１１）、Ｓｉｍｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｄａｔａ ａｎｄ ｓｅａｒｃｈ ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １１、Ｉｓｓｕｅ ６：１１８９〜１２１１に記載されているような、シミュレータ又はモデリングソフトウェアを使用してもよい。
マッチするＰＣＣ入力が標的ライブラリに見出された場合、教師なしクラスタリングに関して本明細書の他の箇所に記載されるように、標的ライブラリからのＰＣＣの情報を使用して、更なる処理が行われてもよいが、頂点又はピークスキャン（例えば、ＰＰ若しくはＨスキャン）のスキャンデータを使用するのではなく、ＰＣＣに関するライブラリからの標的指紋を使用して処理が行われる点が異なる。例えば、Ｈスキャンからのフラグメントを使用又は比較するのではなく、ＰＣＣに関するライブラリからのフラグメントが使用される。更に例証するため、教師なしクラスタリングを行ったときなどの、ＨスキャンのフラグメントをＨ１及びＨ２スキャンのフラグメントと比較するのではなく、教師ありクラスタリングは、別の方法として、実験データから得られたＨ１及びＨ２スキャンのフラグメントを、ライブラリから得られたＰＣＣのフラグメントイオン情報と比較する。一実施形態では、第１の例において、ライブラリからのフラグメントはｍ／ｚによってＨスキャンとマッチされる。これらのマッチしたプロダクトイオンには、次に、教師なしクラスタリングに関して記載されるのと同一の処理が行われる。
教師ありクラスタリングを用いて、ＬＥスキャンデータにおけるＰＣＣを決定するのに分析されるスキャンデータセットを得るため、教師なしクラスタリングを用いて上述したように、サンプルを使用して実験が行われる。次に、更なる処理が、ライブラリからのＰＣＣにマッチする生成されたデータの特定のＰＣＣに対して行われてもよい。例えば、生成されたデータは、ライブラリ内のＰＣＣ１にマッチするｍ／ｚを有するＰＣＣ１の溶出ピークを含んでもよい。教師なしクラスタリングについて本明細書の他の箇所に記載されるように、ＬＥスキャンデータにおいてＰＣＣ１に関して検出されたピークが検査されて、分子の溶出ピークを特徴付ける条件を満たすことが担保されてもよい。例えば、検出されたピークは、ピークのスキャン点における強度の適切な分布（例えば、Ｐｓｔａｒｔから頂点まで増加し、頂点からＰｅｎｄまで減少する）を有するはずである。
この例を続けると、ライブラリは、ＰＣＣ１が１５のフラグメントイオンＦ１〜Ｆ１５と関連付けられることを示している。教師なしクラスタリングのようにＥＥスキャンデータをスキャンＨからのフラグメントと共に使用するのではなく、教師ありクラスタリングの処理は、フラグメントイオンＦ１〜Ｆ１５と、ライブラリから得られた関連する属性及び情報とを使用して行われる。教師なしクラスタリングと同様に、かかる処理は、第１の数のフラグメントが、ＰＣＣ１に関するライブラリ内のＦ１〜Ｆ１５とスキャンＨ１に関するＥＥデータ中のフラグメントとの間で一致することを判断してもよい。同様に、スキャンＨ２の場合、第２の数のフラグメントが、ＰＣＣ１に関するライブラリ内のＦ１〜Ｆ１５とスキャンＨ２に関するＥＥデータ中のフラグメントとの間でマッチすると判断する処理が行われてもよい。かかるマッチするは、教師なしクラスタリングに関連して上述されたような検証基準及び処理を使用して行われてもよいが、ＨスキャンからではなくライブラリからのＰＣＣ１の情報を使用する点が異なる。例えば、ＰＣＣの溶出ピークのスキャンに関するフラグメントイオンセットは、フラグメントに関するＡＲ１、ＡＲ２、及びＡＲ３値、又はそれらの任意の組み合わせに基づいて、ｍ／ｚのマッチ及び強度比のマッチにしたがって、ライブラリ内のＦ１〜Ｆ１５の情報に対してマッチされてもよい。ＡＲ値は、実験的計算との比較のため、ライブラリに含まれてもよいことが注目されるべきである。
以下、教師なしクラスタリングについて本明細書の他の箇所に記載されるものではなく、教師ありクラスタリングで使用される、様々なメトリックに関する違いの更なる詳細について記載する。
１つの違いは、ＡＲ１、ＡＲ２、及びＡＲ３のメトリック計算が、ｍ／ｚによってライブラリフラグメントにマッチするプロダクトイオンに対してのみ行われることである。教師なしクラスタリングと同様に、教師ありクラスタリングは、ｍ／ｚ（ある許容差内）によってライブラリフラグメントイオンをＨスキャンにマッチさせることによって始まり、その後の全ての処理は教師なしクラスタリングと同一である。
教師なしクラスタリングに関連して、処理は次に、Ｈ１及びＨ２スキャンに関するフラグメントイオンデータ又はＥＥスキャンデータを検査する。スキャンＨ１の場合、ＥＥスキャンデータを検査し、スキャンＨ１からのＥＥスキャンデータのどのフラグメントイオンが、ライブラリ内のＰＣＣ情報のフラグメントイオンＦ１〜Ｆ１５のいずれかにマッチするかを判断する。教師なしクラスタリングに関連して記載されるように、かかるフラグメントのマッチは、ｍ／ｚ、ＡＲ１、ＡＲ２、及びＡＲ３の強度比値（指定の許容差内）をマッチさせることによって、スキャンＨ１とライブラリとの間で判断されてもよい。
このように、ライブラリ内で同定されるようなＰＣＣのフラグメントイオンと、スキャンＨ１に対するＥＥスキャンデータのフラグメントとの間で、ＰＣＣに関してマッチするフラグメントの第１のセットを決定する、処理が行われる。また、同様に、ライブラリ内で同定されるようなＰＣＣのフラグメントイオンと、スキャンＨ２に対するＥＥスキャンデータのフラグメントとの間で、マッチするフラグメントの第２のセットを決定する、処理が行われる。例えば、次の場合に、ライブラリ内のフラグメントＦ１は、スキャンＨ１のフラグメントＦ１’’にマッチすると判断される。
ライブラリ内のＦ１のｍ／ｚが、ある指定の許容差内で、スキャンＨ１のＦ１’’のｍ／ｚにマッチし、並びに、
次式のように計算される強度比ＩＲ
ＩＲ＝スキャンＨ１におけるＦ１’’の強度／ＨからのＦ１の強度
が、ある指定の許容差内で、同じ２つのスキャンＨ１及びＨに対するＰＣＣ強度のＡＲ２値にマッチする。第２の実施形態として、ライブラリからのＦ１などのフラグメントイオンの予測強度は、Ｆ１のＡＲ１値を使用して得られてもよい。特に、Ｆ１の推定強度はマッチしたＰＣＣから得られてもよく、それにより、ライブラリからのＡＲ１値は、スキャンＨ１のＰＣＣの強度によって乗算されてもよい。同様に、ライブラリから得られる任意のフラグメントイオンのＡＲ１値は、溶出ピークの任意のスキャンにおけるＰＣＣ強度を決定するのに使用されてもよい。本明細書の他の箇所に示されるように、ＡＲ１＝プロダクトイオンの強度／プリカーサーイオン又はＰＣＣの強度である。そのため、ＰＣＣ強度を所与として、フラグメントイオンの強度は、フラグメントイオンのＡＲ１×ＰＣＣ強度を乗算することによって得られる。
ＰＣＣピークの各スキャン時間におけるフラグメントイオンセットの検証処理は、教師なしクラスタリングを用いて本明細書の他の箇所に記載されるように行われて、ＰＣＣのピークのそれらのスキャン時間に対して、ＰＣＣに関するライブラリ内のフラグメントイオンとＥＥスキャンデータに含まれるフラグメントイオンとの間のマッチが判断されてもよい。例えば、上述されたように、処理は、スキャンＨ１及びＨ２に関するＡＲ２値にしたがって、それらに関するライブラリ内のマッチするフラグメントＦ１〜Ｆ１５の数を判断してもよい。次に、スキャンＨ１に対して決定される第１のマッチするフラグメントセット、及びスキャンＨ２に対して決定される第２のマッチするフラグメントセットについて、検証処理が行われる。かかる検証処理は、教師なしクラスタリングを用いて本明細書の他の箇所に記載されるような、１つ又は２つ以上の検証基準を使用することを含んでもよい。教師なしクラスタリングと同様に、かかる検証処理は、ＡＲ１値を使用してＡＲ２値を検証すること、及び関係Ｒ１が真であるか否かを判断すること（即ち、フラグメントイオンの強度はそのＰＣＣの強度よりも大きくてはならない）を含んでもよい。ＡＲ１メトリックは、教師なしクラスタリングに関して本明細書の他の箇所に記載されるように、教師ありクラスタリングにおいて決定されてもよい。検証処理は、ライブラリ内に表されるフラグメントイオンＦ１に関して、ＰＣＣのピークにおけるスキャンのＡＲ１値を比較してもよい。ＰＣＣのピークの全てのスキャンに関する全てのかかるＡＲ１値（実験データセットを使用して決定されるような）が、ある許容差内で、ライブラリからのＦ１のＡＲ１値にマッチしない場合、フラグメントＦ１はＰＣＣとマッチせず、その強度はＡＲ１及びＡＲ２値の計算に使用される。
かかる検証処理は、Ｈ１に関する第１のマッチするセット及びＨ２に関する第２のマッチするセットのそれぞれにおけるマッチするフラグメントの数が、少なくとも指定の最小数であるか否かを判断すること（例えば、本明細書の他の箇所で考察される、図８の表を使用して決定されてもよいなど）を含んでもよい。教師ありクラスタリングに対して行われるかかる処理は、ＡＲ２値、並びに最小数を満たすマッチするフラグメントの関連する数を各スキャンが有するか否かの検証基準に関して、教師なしについて上述されたようなものと同様である。例えば、ＰＣＣのピークスキャンＨ１及びＨ２の間でスキャン点を横断し、Ｈ１からＨ２までの各スキャン点が、ライブラリからのＰＣＣに関する既知のフラグメントにマッチする少なくとも最小閾値数のフラグメントを有するか否かを判断する、処理が行われてもよい。
ＰＣＣピークの全てのスキャン点に関するマッチするフラグメントイオンセットの判断は、教師なしクラスタリングに関して本明細書の他の箇所に記載されるのと同様の方法で行われてもよい。
上述されたものは、標的ライブラリに問い合わせて、特定のＰＣＣに対するＦ１〜Ｆ１５など、フラグメントイオンのセットが返されるプロセスであり、次に、ＰＣＣピークのスキャンに対してマッチするフラグメントイオンセットを決定し、かかるスキャンのそれぞれが、（各ＥＥスキャンデータのフラグメントイオンとライブラリからのＦ１〜Ｆ１５との間で）少なくとも必要な最小数のフラグメントイオンのマッチを有するか否かを判断する、処理が行われてもよいことが注目されるべきである。検出されたＰＣＣのピークの各スキャン点に対して、本明細書に記載されるような基準（例えば、様々な比又はＡＲ値、フラグメントイオンのマッチの最小閾値数など）が提供されてもよく、スキャン点に関してかかる基準が満たされた場合、そのスキャンに関するＳＳＰＰＩＳは、標的ライブラリ内の標的ＰＣＣに対するマッチと見なされる。いくつかの例では、実験データの検出されたＰＣＣが、検討中のライブラリの標的ＰＣＣにマッチするという同定は、単一のスキャンマッチのみを用いて（例えば、実験データから得られるＤＤＡを用いるなど）行われてもよい。検出されたＰＣＣに対して、本明細書に記載されるようにＡＲ３値が計算されてもよい。教師なしクラスタリングを用いてやはり本明細書に記載されるように、同じ溶出分子と関連付けられる、複数のマッチしたＳＳＰＰＩＳをグループ化する処理が行われてもよい。ＡＲ１値と同様に、ＡＲ３値は全てのＳＳＰＰＩＳにわたって（指定の許容差内で）一貫していなければならない。
一実施形態では、標的ライブラリには、シミュレータを使用して生成されるものなど、理論上のデータが取り込まれてもよい。ライブラリ内の標的ＰＣＣとサンプルに対する実験データセットのＰＣＣとの間のマッチが決定されると、ライブラリ内の標的ＰＣＣに関する情報が、ＰＣＣに対する実験データセットから本明細書に記載される処理によって得られた情報を使用して、置換又は補充されてもよい。例えば、実験データから決定されるようなＰＣＣのＳＳＰＰＩＳに関する情報は、ライブラリ内の標的ＰＣＣに関して理論的に生成された情報（例えば、保持時間）に置き換わってもよい。
本明細書の他の箇所に更に詳細に記載されるように、教師ありクラスタリングは、多くの異なるアプリケーション及びワークフロープロセスと関連して使用されてもよい。例えば、標的ライブラリからの特定のフラグメントイオンセットは、標的分子の任意の修飾又は変異型を見つけるため、実験データセットから得られる全てのＳＳＰＰＩＳに関して問い合わされてもよい。入力されたフラグメントイオンセットは、本質的に、所与のＰＣＣにマッチされる。分子の任意の変異型は、修飾に至るまでは、非変異形態のものと同様のフラグメンテーションスペクトル（フラグメントイオンリスト）を生成する。かかるマッチするフラグメントイオンセットの探索に応答する入力として、マッチしたフラグメントイオンと関連付けられたＰＣＣが返されてもよい。上記は、教師ありクラスタリングが標的ライブラリと共に使用されてもよい別の方法である。このように、教師ありのＳＳＰＰＩＳ同定及びそれに続くＣＰＰＩＳ形成において、ＳＳＰＰＩＳにＰＣＣが存在することは要件ではない。標的ペプチドの有効な同定には、そのＰＣＣが存在する必要があるが、教師ありプロセスは、プロダクトイオンの統計的に有意なマッチ数を所与として、標的ペプチドの何らかの修飾（配列、化学、翻訳後）、変異型（点変異体）、又は切断ミス形態を同定する能力を伴って、本明細書の技術にしたがって動作する一実施形態をもたらす。統計的に有意な数のプロダクトイオンがマッチする場合、標的プリカーサーのｍ／ｚと、全てのマッチしたＳＳＰＰＩＳに存在するプリカーサーのものとの間で、Δｍ／ｚが計算されてもよい。Δｍ／ｚは、修飾のソースを同定する意図で、既知のΔｍ／ｚ値のルックアップテーブルと比較されてもよい。これは、本明細書の他のプロセスと関連して更に詳細に記載される。同様に、マッチしたプロダクトイオンが、切断ミスを示す単一のフラグメンテーション経路（ｙ’’又はｂフラグメントイオン）のみを反映している場合、ペプチドのフラグメンテーションパターンに対してマッチしたＳＳＰＰＩＳそれぞれから残留（アンマッチ）プロダクトイオンを問い合わせることによって、配座のためにそのペプチドの近接配列が検索されてもよい。これは、プリカーサーの変異型又は修飾に関連して、本明細書の他の箇所に更に詳細に記載される。
このように、教師ありクラスタリングは、サンプルが、標的ライブラリ内の指紋情報を有する特定の既知の分子を含むと同定することの一部として、そのサンプルに対して得られる実験スキャンデータセットを用いて行われてもよい。例えば、実験スキャンデータから得られた全てのＳＳＰＰＩＳが標的ライブラリ内の既知の分子のＳＳＰＰＩＳ情報にマッチする場合、サンプルに対して結果として得られるＣＰＰＩＳは、標的ライブラリ内で同定されるような既知の分子のみを含むものと確認されている。しかしながら、あるいは、サンプルの教師ありクラスタリングは、実験スキャンデータセットにおいて同定された一部のＰＣＣ及び一部のフラグメントイオンにマッチしないことがあり、それらは、残留の、親がない、又はアンマッチしたＰＣＣ及びフラグメントイオンと呼ばれることもある。例えば、図３の要素３５４は、かかるアンマッチしたイオンのデータの残留セットを表している。この場合、サンプルのＣＰＰＩＳは、標的ライブラリに含まれるような、既知又は標的の分子のマッチしたＰＣＣ及びフラグメントイオンを含む。サンプルに対して同定されたＣＰＰＩＳに含まれない、アンマッチしたＰＣＣ及びフラグメントイオンの残留セットは、何らかの変異型、ライブラリに含まれない未知の又は同定されなかった分子などを表してもよい。本明細書の他の箇所に記載されるように、残留セットは更に処理又は分析されてもよい。
上述されたように、教師ありクラスタリングは教師なしクラスタリングと同じ処理を行うが、教師なしクラスタリングにおける比較のための標的又はベンチマークが、スキャンにわたって追跡されるＰＣＣの溶出ピークの頂点を表すスキャンＨである、本明細書に示される点が異なる。対照的に、教師ありクラスタリングでは、標的は、ライブラリからの既知のパターン又は指紋（例えば、ＳＳＰＰＩＳ若しくはＣＰＰＩＳ）を有する既知の成分又は分子として指定される。少なくとも１つの実施形態では、教師ありクラスタリングで使用される標的ライブラリは、最初にシミュレータによって生じ、それによってライブラリが理論上のデータを含んでもよい。
本明細書に記載されるような教師ありクラスタリングは、異なる標的を考慮した変形を伴う（例えば、教師なしは溶出ＰＣＣピークのスキャンからの情報を使用するが、教師ありはライブラリからの情報を使用する）、同じＡＲ（面積比又は強度比）メトリックを使用してもよい。
一般に、教師ありクラスタリングと関連して使用される標的ライブラリなどの標的は、任意の好適な方法で、生成されるか、又はより一般的には取得されてもよい。例えば、標的は、過去の実験、シミュレーション、教師なしクラスタリングなどのいずれかから生成された、ペプチドなどの既知の分子又は化合物の情報を含むライブラリから得られてもよい。
教師ありクラスタリングは、多くの異なる用途及び使用法を有し、そのうちいくつかが本明細書に記載される。例えば、教師ありクラスタリングは、本明細書に記載されるように、サンプルがライブラリに含まれるような関連する指紋を有する既知の分子を含むか否かを同定するため、既知の分子の標的ライブラリと共に使用されてもよい。このように、教師ありクラスタリングは、試験中のサンプルに既知の分子が存在するかしないかを確認するのに使用されてもよい。それに加えて、教師ありクラスタリングはまた、試験中のサンプルが任意の残留した若しくはアンマッチしたＰＣＣ及び／又はフラグメントイオンを含むか否かを判断することと関連して使用されてもよく、それによって、サンプルが１つ又は２つ以上の同定されない分子、変異型などを含んでもよいことが示されてもよい。
図１４を参照すると、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい、処理の別のフローチャート１１００が示されている。サンプルは、既知の第１の分子、及び既知又は未知の更なる変異型、異形、第２の分子などを含んでもよい。この時点で、上述されたものなど、第１の分子を表す一貫した指紋データを含むことが検証されている、標的ライブラリ又はデータベースがあるものと仮定する。かかるライブラリ又はデータベースを使用して、フローチャート１１００の処理が行われてもよい。ステップ１１０２で、第１の既知の分子及び更なる変異型、異常、又は第２の分子を含むサンプルを使用して、実験が行われる。ステップ１１０４で、検証されたライブラリ又はデータベースと、サンプルに対してステップ１１０４から得られる実験データとを使用して、教師ありクラスタリングが行われてもよい。教師ありクラスタリングの結果として、実験データのイオンの第１の部分がクラスタリングされてＳＳＰＰＩＳとなり、ライブラリの標的ＳＳＰＰＩＳにもマッチした。やはりステップ１１０４の結果として、ライブラリ又はデータベースにマッチしなかった、実験データのイオンの残りの第２の部分がある。実験データの残りの第２の部分は、１つ又は２つ以上のＳＳＰＰＩＳ（例えば、ＰＣＣ及び関連するフラグメントの１つ又は２つ以上の例）へとクラスタリングされず、したがってライブラリ又はデータベースによって表されるＳＳＰＰＩＳにマッチしない、実験データの親なしの又はアンマッチしたイオンの残りのセットである。このように、イオンの残りの第２の部分は、既知の更なる変異型、異常、又は更なる第２の分子を特徴付けるイオンを含む。ステップ１１０６で、アンマッチしたイオンの残りのセットの教師なしクラスタリングによって、変異型、異常、更なる分子などを表すＳＳＰＰＩＳの結果として得られるセットを生成する。このように、ステップ１１０６の教師なしクラスタリングに関して生成される、ＳＳＰＰＩＳの結果として得られるセットは、変異型、異常、更なる分子などを表す指紋として使用されてもよく、第２のデータベース又はライブラリを構築するのに使用されてもよい（例えば、図１３と関連して上述される処理を使用するなど）。一実施形態は、同じ化合物又は分子を含む、同じ１つ又は２つ以上のサンプルを使用する複数の実験に対して、フローチャート１１００の処理を繰り返し行ってもよい。かかる繰り返される処理は、更なる変異型、異常、更なる分子などの指紋を表す、ＳＳＰＰＩＳの複数のセットを得るのに使用されてもよい。複数の実験のステップ１１０６によるＳＳＰＰＩＳの複数のセットは、本明細書に記載されるように組み合わされて、更なる変異型、異常、更なる分子などの指紋の集合的データを形成してもよい。
次に、標的ライブラリを使用する教師ありクラスタリング技術の更なる実施形態又は変形例について記載する。
図１４Ａを参照すると、教師ありクラスタリングの技術による一実施形態で行われてもよい、処理ステップのフローチャート１７００が示されている。処理は、図９に関連したものなど、本明細書の他の箇所に記載されるような、ステップ１２０２、１２０４、及び１２０５を行うことを含んでもよい。ステップ１７０２で、可変の現在のＰＣＣが処理されるべき次のＰＣＣに割り当てられてもよい。ステップ１７０４で、実験データの現在のセットにおける全てのＰＣＣが処理されているか否かに関して判断が行われる。ステップ１７０４が「はい」と評価した場合、制御はステップ１７１２に進む。ステップ１７１２の処理は、本明細書の他の箇所に記載されるような、ステップ１２１０及び１２１２、並びに任意に更なる処理を含んでもよい。ステップ１７１２の更なる処理は、例えば、既存のライブラリ情報（例えば、ＰＣＣ及び関連するフラグメントに関するもの）を、実験データの現在の処理から得られる情報と置き換えることを含んでもよい。例えば、ライブラリが、シミュレータを使用して得られるような理論的に生成される情報を含む場合、ライブラリは、ＰＣＣ又はプリカーサーを使用したかかる既存の情報、及びフローチャート１７００の処理の結果として実験データから得られた関連するフラグメントイオン情報を置き換えるように更新されてもよい。
ステップ１７０４が「いいえ」と評価した場合、制御は現在のＰＣＣの処理に進む。ステップ１７０６で、マッチするＰＣＣが現在のＰＣＣに関してライブラリに見出されるか否かが判断される。本明細書の他の箇所に記載されるように、かかるマッチするＰＣＣは、（ある指定の許容差内の）マッチするｍ／ｚ、ｍ／ｚと保持時間、ｍ／ｚと保持時間とドリフト時間、又はより一般的には、イオン検出前分離方法の任意の組み合わせに基づいてもよい。ステップ１７０６が「いいえ」と評価した場合、制御はステップ１７０２に進む。ステップ１７０６が「はい」と評価した場合、制御はステップ１７０８に進んで、ライブラリからのマッチするＰＣＣに対するフラグメントイオン情報（１つ又は２つ以上のフラグメントイオンについて）が検索される。ステップ１７１０で、ＰＣＣのＨ又は頂点スキャンに関する実験データのＨＥスキャンデータが、ライブラリから得られるようなＰＣＣのフラグメントイオンにマッチするフラグメントイオンのみを含むようにフィルタ処理されてもよい。例えば、ＰＣＣのスキャンＨ又は頂点スキャンに関するＨＥスキャンデータは、Ｆ１〜Ｆ１５と表される１５のフラグメントイオンを含み、ライブラリは、同じＰＣＣに対して５つのフラグメントイオンＦ１〜Ｆ５を含む。ステップ１７１０のかかるフィルタ処理は、ＨＥスキャンデータをフィルタ処理して、フラグメントイオンＦ１〜Ｆ５に関する情報のみを含む第１のフィルタ処理されたフラグメントイオンセットを決定する。第１のフィルタ処理されたフラグメントイオンセットの情報は、後に続く処理で使用され、スキャンＨ又は頂点スキャンに関するＨＥスキャンデータのフラグメントＦ６〜Ｆ１５についての残りのフラグメントイオン情報は、後に続く処理ステップで更に利用されなくてもよい。処理は、ステップ１２０６に進んで、本明細書の他の箇所（図９に関連したものなど）に記載されるような処理を行う。この場合、ＰＣＣの頂点又はＨスキャンに使用されるフラグメントイオン情報は、第１のフィルタ処理されたフラグメントイオンセットのフラグメントイオンのみに関する、実験データのＨＥスキャンデータにおけるフラグメントイオン情報に限定される。ステップ１２０６から、処理はステップ１７０２に進む。
解離中に多くのプロダクトイオンを生成するペプチド又は他の複雑な分子とは異なり、小分子は少数しか生成しない場合が多い。それに加えて、小分子は、それらのフラグメントのように一価である場合が多い。それらの強度比（ＡＲ１）は、ペプチドからのフラグメントイオンと比較した場合、非常に低い場合が多い。一価であって強度が低いため、多くの同位体はもたらされない。ここで、プリカーサープロダクトイオン面積の関係を使用した、どのプロダクトイオンがどのプリカーサープロダクトイオンと関連付けられるかの同定及び検証には、より多数の同様の実験が比較されることのみを要する。しかしながら、本明細書の技術による一実施形態は、機器制御ソフトウェアがスキャンごとに衝突エネルギーを変更できることを所与として、多くの小分子研究室によって用いられる、５０％の生存収率戦略（例えば、５０％のＰＣＣ収率規則）を活用してもよい。ここでは、アライメントの同定及び検証のために更なる直交性を提供する、分子の溶出全体を通したフラグメンテーションパターンの変形例である。共溶出小分子のプロダクトイオンは、所与の衝突エネルギーで異なる５０％の生存収率を有するようになるので、それらは「真の」親プリカーサーから発する者とは分離される。以下のパラグラフに更に詳細に記載されるように、本明細書の技術による一実施形態は、上記のものを、小分子用途に対して行われる実験及びデータ分析に組み込んでもよい。
本明細書の技術による一実施形態は、小分子に関して、溶出ピークを通して衝突エネルギーを変動させることによって、スキャンごとに溶出ピークにわたってフラグメンテーションパターンを変更してもよい。本明細書の他の箇所に記載されるように、フラグメンテーションパターンは、プロダクトイオンと、それに関連するＰＣＣなど、その親プリカーサーとの間の強度関係として特徴付けられてもよい。フラグメンテーションパターンは、分子溶出フラグメンテーションパターンにわたる複数サイクルを、衝突エネルギーサイクル内及びサイクル間で比較できることを所与として、２つの間の面積比又は強度が、クロマトグラフィ溶出にわたって（ある実験変数内で）一貫しているべきものである。本明細書の技術は、ＰＣＣなどの親イオンとそのフラグメントとの間におおける、かかる原理及び関係を利用する。詳述するため、プリカーサーのフラグメンテーションパターンはその溶出にわたって一貫している。そのため、同じ並びに異なる衝突エネルギーサイクルにおける、同じ衝突エネルギーでのプリカーサーイオンとその構成成分であるプロダクトイオンとの間の強度関係は、干渉がない状態で一定のままであるべきである。フラグメンテーション中に発生するプロダクトイオン、プリカーサーイオン、又はＰＣＣの数は、その長さ／質量及び濃度の関数である。ＰＣＣの強度は検出されたピークにわたって変動（例えば、増加及び／又は減少）するので、そのプロダクトイオンの強度も同様である。
本明細書の技術にしたがって、一実施形態は、小分子を含むサンプルに対して行われる実験において、衝突エネルギーをスキャンごとに変化させてもよい。実験は、小分子を含むサンプルに対して行われ、結果としてＬＥスキャンデータ及びＥＥスキャンデータが得られたものと仮定する。本明細書に記載されるＬＥスキャンデータは、主にプリカーサー又はＰＣＣスキャンデータを含み、ＥＥスキャンデータは主にフラグメントイオンスキャンデータを含む。かかるＬＥ及びＥＥスキャンデータセットが検査されて、特定のＰＣＣ又はプリカーサーイオンに関して、ＬＥスキャンデータのようにＰＣＣ又はプリカーサーイオンの強度の約１／２又は５０％（例えば、ある指定の許容差内）でＥＥスキャンデータに現れる、ＰＣＣ又はプリカーサーイオンをもたらす衝突エネルギー（ＣＥ）を決定してもよい。本明細書の他の箇所に記載されるように、スキャンデータの異なるセットにおけるマッチするｍ／ｚに基づいて、同じイオンが、ＬＥスキャンデータ及びＥＥスキャンデータなど、スキャンデータの異なるセットにおいて探索されてもよい。
第１のステップとして、ＬＥスキャンデータが検査されて、ＰＣＣ又は親プリカーサーイオンの強度が得られてもよい。例えば、スキャンＳ１のＬＥスキャンデータにおけるＰＣＣ又は親プリカーサーイオンの強度が、１０ｅ６であると仮定する。第２のステップとして、ＥＥスキャンデータが検査されて、スキャンＳ１におけるＥＥスキャンデータのＰＣＣが探索され、スキャンＳ１におけるＥＥスキャンデータに現れるようなＰＣＣの強度が得られる。例えば、ＬＥスキャンデータのスキャンＳ１におけるＰＣＣ又は親プリカーサーイオンの強度が１０ｅ３であり、それによって、ＰＣＣの５０％がフラグメンテーションされておらず、ＰＣＣの５０％がフラグメンテーションされていることを表すものと仮定する。第３のステップとして、ＬＥスキャンのスキャンＳ１及びＥＥスキャンのスキャンＳ１におけるＰＣＣ又はプリカーサーイオンの強度の差が決定されてもよい。上記の差は、スキャンＳ１のＰＣＣ又はプリカーサーイオンから生成される任意のフラグメントイオンの予期される合計強度に対する最大値又は上界を表す。この例を続けると、上記を所与として、１０ｅ６−１０ｅ３＝１０ｅ３は、スキャンＳ１のＰＣＣ又はプリカーサーイオンから生成される任意のフラグメントイオンの予期される合計強度に対する最大値又は上界を表すことを意味する。それに加えて、差１０ｅ３はまた、スキャンＳ１に対するＬＥスキャンデータのように、ＰＣＣ又はプリカーサーイオンの強度１０ｅ６の５０％に等しい。このように、本明細書の技術による一実施形態は、スキャンＳ１のＰＣＣ又はプリカーサーイオンのフラグメンテーションと関連して使用される特定のＣＥに言及してもよく、その場合、かかるＣＥは、ＰＣＣ又はプリカーサーイオンの約５０％のフラグメンテーションをもたらす。本明細書の記載において、上記は、５０％のＰＣＣ収率規則と呼ばれることもある。
本明細書の技術による一実施形態は、ＣＥエネルギーが各スキャンに対して変更され、時間に伴ってＣＥエネルギーを変動させて、サイクル又は期間を形成する後続のスキャンにおける一連のＣＥ値を通して循環する、実験を行ってもよい。ＣＥサイクル又は期間は、ステップのＣＥ間隔などにおいて、後続のスキャンの第１の部分における最小ＣＥ値から、ＣＥが最大値又は頂点値に達するまでＣＥを増加させ、次いで、ＣＥはそれに続いて、ＣＥ間隔又はステップにおいて最小ＣＥ値に達するまで減少され、それにより、ＣＥサイクル又は期間が次に繰り返される。
図１５を参照すると、ＣＥ値がＣＥサイクル又は期間を含むピークを形成するように、ＣＥをスキャンごとにどのように変動させてもよいかを模式的に示す、例１４００が示されている。点Ａ、Ｃ、Ｅ、及びＧは、ＣＥサイクル又は期間におけるＣＥ最小値を表してもよく、点Ｂ、Ｄ、及びＦは、ＣＥサイクル又は期間におけるＣＥ最大値を表してもよい。単一のＣＥサイクル又は期間は、２つの連続するＣＥ期間又はサイクルにおける、同じＣＥ値の対の間で表されてもよい。例えば、単一のＣＥサイクル又は期間は、点Ａ及びＣの間で表されてもよく、それにより、点Ａから新しいＣＥサイクル又は期間が始まる点Ｃまでの各スキャンにおいて、ＣＥは異なるＣＥ値に設定される。一実施形態は、各スキャンにおいて、ＣＥサイクル又はピークの上り坂で最小値から最大ＣＥ値までＣＥ値を漸増し、また、各スキャンにおいて、ＣＥサイクル又はピークの下り坂で最大ＣＥ値から最小ＣＥ値まで、スキャン当たり所定の量で、ＣＥ値を漸減させてもよい。かかるＣＥ値は、各スキャンにおいて、ソフトウェア及び／又はハードウェアを使用してスキャンごとのＣＥ設定又は選択を制御する、数学関数によるものなどの任意の好適な技術を使用して決定されてもよい。
図１５及びその他に示されるものなど、本明細書に記載される一実施形態では、ＣＥサイクルは、上り坂のＣＥが同じＣＥサイクルの下り坂では逆順で繰り返されるような、ガウスピーク又は曲線として特徴付けられてもよい。例えば、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、ＣＥサイクル１５１０ａの上り坂における点を表し、点Ｌ６、Ｌ５、及びＬ４は、ＣＥサイクル１５１０ａの下り坂における点を表し、点又はスキャンＬ１及びＬ６は同じＣＥを有し、点又はスキャンＬ２及びＬ５は同じＣＥを有し、点又はスキャンＬ３及びＬ４は同じＣＥを有する。同様の方法で、各サイクルのＣＥは、例えば、Ｌ７が、Ｌ３及びＬ４と同じＣＥを有するＣＥサイクル１５１０ｂにおける点又はスキャンを表し、Ｌ８が、Ｌ５と同じＣＥを有するＣＥサイクル１５１０ｂにおける点又はスキャンを表し、Ｌ１１が、点Ｌ２、Ｌ５、及びＬ８と同じＣＥを有するＣＥサイクル１５１０ｂにおけるスキャンを表すようにして繰り返される。同様に、Ｌ９は、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ７と同じＣＥを有するＣＥサイクル１５１０ｃにおける点又はスキャンを表し、Ｌ１０は、Ｌ５及びＬ８と同じＣＥを有するＣＥサイクル１５１０ｂにおける点又はスキャンを表す。このように、ガウス型のピーク又は曲線を形成するＣＥ値で構成されるＣＥサイクルを使用することで、頂点又はピークＣＥ値以外の各ＣＥ値が、各ＣＥ曲線内で２回生じる。更に、更に詳細に後述するように１つのクロマトグラフィピークに「ｎ個の」ＣＥサイクルがある場合、かかるＣＥ値（ピークＣＥ値以外）はそれぞれ、単一のクロマトグラフィピーク内で２ｎ回生じる。
ＣＥが変更される各ＣＥサイクル又は期間におけるスキャン又はスキャン事例の数は、少なくとも中央又は平均クロマトグラフィピーク幅を２で割ったものであることが注目されるべきである。より形式的には、ＣＥがスキャンごとに変更されると仮定して、ＣＥサイクルにおけるスキャン数を表すＣＥサイクルの期間Ｔは、次式のように表されてもよい。
Ｔ≦溶出又はクロマトグラフィピークのＦＷＨＭ 式ＣＥ ＣＹＣＬＥ
式中、
Ｔは、ＣＥがスキャンごとに変更される、単一のＣＥサイクルにおけるスキャンの整数を表すＣＥサイクルの期間、並びに、
溶出又はクロマトグラフィピークのＦＷＨＭは、サンプル中の溶出成分又は分子と関連付けられる、中央又は平均の溶出又はクロマトグラフィピークのＦＷＨＭを表す（例えば、ＦＷＨＭ＝平均又は中央溶出又はクロマトグラフィピーク幅／２）。
一般に、式ＣＥ ＣＹＣＬＥは、より形式的には、単一の分子と関連付けられた任意の溶出ピークにおけるスキャンに対して少なくとも１つのＣＥサイクルが生じる、実験を行う要求を表す（例えば、単一の分子又は成分の任意の溶出ピークは、少なくとも１つのＣＥサイクルを経験するか、又はＣＥサイクルの各ＣＥを少なくとも１回経験する）。
単一のＰＣＣの単一の溶出ピークに対してＣＥエネルギーを変更するとき、ＬＥスキャンデータ及びＥＥスキャンデータが検査されて、５０％のＰＣＣ収率規則を保持するスキャンを決定してもよい
（例えば、ＰＣＣ又はプリカーサーイオンが、ＥＥスキャンデータにおいて、ＬＥスキャンデータによる強度の約５０％である強度を有するスキャン）。
連続する後続のスキャンにおけるＬＥスキャンデータのＰＣＣのマッチするｍ／ｚに基づいて、本明細書の他の箇所に記載されるように、特定のＰＣＣが異なるスキャンにわたって追跡されて、それに関連する溶出ピークを決定してもよいことが注目されるべきである。それに加えて、検出されたピークの各スキャンのＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣと関連付けられた強度は、変動するＣＥによるスキャン間の予期される相対強度パターンに追随する。例えば、ＣＥをスキャンＮからＮ＋１に増加すると、ＰＣＣ又はプリカーサーイオンが経験するフラグメンテーションもスキャンＮからＮ＋１に増加することが予期される。このように、スキャンＮからＮ＋１まで、ＥＥスキャンデータにおいて表されるようなＰＣＣのフラグメンテーションから生成されたフラグメントイオンと関連する強度は増加されるので、ＥＥスキャンにおけるＰＣＣの強度は減少する。換言すれば、スキャンＮのＣＥ＜スキャンＮ＋１のＣＥである場合、スキャンＮに対するＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣの強度＞スキャンＮ＋１に対するＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣの強度である（スキャンＮにおけるＰＣＣのフラグメンテーションによって生成されるフラグメントイオンの強度＜スキャンＮ＋１におけるＰＣＣのフラグメンテーションによって生成されるフラグメントイオンの強度であるため）。
同様の方法で、ＰＣＣに対する検出ピークのスキャンの場合、ＣＥが頂点のＣＥ最大値からＣＥ最小値まで減少するにつれて変動するＣＥにしたがって、スキャン間のＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣの強度は、スキャン間の相対強度パターンに追随することが予期される。例えば、ＣＥがＮからＮ＋１に減少すると、ＰＣＣ又はプリカーサーイオンが経験するフラグメンテーションもスキャンＮからＮ＋１に減少することが予期される。このように、スキャンＮからＮ＋１まで、ＥＥスキャンデータにおいて表されるようなＰＣＣのフラグメンテーションから生成されたフラグメントイオンと関連する強度は減少されるので、ＥＥスキャンにおけるＰＣＣの強度は増加する。換言すれば、スキャンＮのＣＥ＞スキャンＮ＋１のＣＥである場合、スキャンＮに対するＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣの強度＜スキャンＮ＋１に対するＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣの強度である。スキャン間の上記予期される相対強度パターンは、ＰＣＣのピークを決定し、スキャン間のＰＣＣを追跡するため、ＰＣＣのマッチするｍ／ｚと組み合わせて使用されてもよい。
５０％のＰＣＣ収率規則が保持されるＰＣＣの溶出ピークのスキャンにおいて、ＡＲ２比が、追跡された溶出ピークの各スキャンのＰＣＣに対して決定され、（ピークのスキャン間のマッチするｍ／ｚ及び予期される相対強度パターンに加えて）更なる検証基準として本明細書の他の箇所に記載されるのと同様の方法で比較されて、溶出ピークが（ピークのスキャン間のマッチするｍ／ｚ及び予期される相対強度パターンを有する）特定のＰＣＣに対するものであることが担保されてもよい。決定されたＡＲ２比は、この場合、ＡＲ２に関する式に関連してなど、本明細書の他の箇所に記載されるようなものと同様であるが、ＬＥスキャンデータのＰＣＣ強度に基づいた、溶出ピークの頂点又はＰＰスキャンにおけるＰＣＣの強度を使用するのではなく、ＡＲ２比が、５０％のＰＣＣ収率規則を保持するスキャンＭに関してＥＥスキャンデータと同じようにＰＣＣの強度を使用する点が異なる。任意の２つの隣接したスキャン間における衝突エネルギーの変更が、フラグメンテーションパターンに影響することが注目されるべきである。このように、スキャン間のＡＲ２比は、上述されたものとは異なり、イオンタイプ間で一貫しないが、同じ衝突エネルギーで獲得されるスキャン間で再現可能である。それは、クロマトグラフィ溶出にわたって比較されてもよい、同じ又は類似の衝突エネルギーを有するスキャン又は点に対するフラグメンテーションのパターンの類似性である。ＡＲ２比のこの特定のものを使用して、ＣＥを変動させたときのＰＣＣの溶出ピークにおけるものなど、異なるスキャンにわたってＥＥスキャンデータに現れるような、残留する未フラグメンテーションＰＣＣ又はプリカーサーイオンの強度の追跡が行われてもよい。
図１６を参照すると、異なるスキャンのＬＥスキャンデータにおけるＰＣＣの強度に基づいて決定されてもよいような、ＰＣＣに対する溶出ピーク１５１２を模式的に示す例１５００が示されている。この例１５００では、ＰＣＣの単一の溶出ピーク１５１２に３つのＣＥ期間１５１０がある。したがって、ＣＥは、単一の溶出ピーク１５１２の間に３回、ＣＥの期間を通して変更されるか又は循環する。３つのＣＥ期間１５１０に対するピーク又は曲線は、このグラフ上で、以下のパラグラフにおける例証及び説明のため、単一の溶出ピークと重ね合わされている。
第１のステップとして、５０％のＰＣＣ収率規則を保持する溶出ピークにおける１つ又は２つ以上のスキャンが決定されてもよい。この例では、点Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３が、ピーク１５１２を有する追跡されたＰＣＣに関して５０％のＰＣＣ収率規則が真である、かかる点又はスキャンを表してもよい。上述したように、点Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のそれぞれは、ＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣの強度が、同じスキャンに関してＬＥスキャンデータにおけるＰＣＣの強度の約５０％である、スキャンを表す（例えば、点Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のそれぞれによってやはり表される特定のＣＥにおいて、ＰＣＣに対するフラグメンテーション効率が約５０％である）。
第２のステップとして、点Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のそれぞれを含む、単一のＣＥ期間に対する関連するＣＥピーク又は曲線が決定されてもよい。次に、単一のＣＥピーク又は曲線、及びＣＥピークにおけるスキャンに関して行われてもよいが、単一のＣＥ期間を表すかかるＣＥピーク又は曲線それぞれに関して繰り返されてもよい、処理について記載する。例えば、点Ｘ１は、例１５００において点Ａ、Ｂ、及びＣによって形成される曲線で示される、第１のＣＥ期間１５１０ａと関連付けられるスキャンに含まれるスキャンを表す。点Ｘ１（ＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣの強度がＬＥスキャンデータにおけるＰＣＣの強度の約５０％であるスキャンを表す）を、Ｈスキャン（例えば、頂点若しくはＰＰスキャン）として使用して、次に記載されるように、一連のＡＲ２比が比較され、ＣＥ期間内及び期間の間の両方で検証基準として使用されてもよい。換言すれば、教師なし及び教師ありクラスタリングなどを用いて、本明細書の他の箇所に記載されるように、ＡＲ１及びＡＲ２値は、ＨスキャンとしてＰＣＣ（例えば、１５１２）の溶出ピークの頂点を使用して、どのプロダクトイオンがＰＣＣと整列されるかを判断するのに利用される。ＰＣＣ溶出ピークの頂点を、ＡＲ１及びＡＲ２値を計算する際にＰＰとして使用するのではなく、スキャンＸ１がＰＰとして使用されてもよく、点Ｈ１及びＨ２（それぞれ上り坂及び下り坂のＦＷＨＭ点を表す）が、今度はＰＰとして使用されるスキャンＸに対して決定される。フラグメンテーションが衝突エネルギーの関数であり、記載される実施形態では、衝突エネルギーがスキャンごとに変化していることを所与として、同じＣＥサイクルで生じる類似の（又は指定の許容差内でほぼ同じ）衝突エネルギーのスキャン間、並びに同じＣＥを有するスキャン間の両方でＡＲ１及びＡＲ２の比較が行われてもよく、その場合、かかるスキャンは、異なる衝突エネルギーサイクルにおけるものである（例えば、本明細書の技術による一実施形態では、中央クロマトグラフィピーク幅（ＦＷＨＭ）ごとに最低２つのサイクルが必要であるようなもの）。
一例として、一般的な小分子は、獲得速度が１００ミリ秒である３秒幅のクロマトグラフィピーク幅（ＦＷＨＭ）を有し、３０００ミリ秒／１００ミリ秒、即ち３０スキャンである。最低２つの衝突エネルギーサイクルを要することで、１０の異なる衝突エネルギーが可能になり、５つの異なる衝突エネルギーを適用することで６つの衝突エネルギーサイクルが可能になる。衝突エネルギーの数は、中央クロマトグラフィピーク幅（ＦＷＨＭ）の獲得速度によって決定される。
したがって、ＡＲ１及びＡＲ２比は、以下を有する衝突エネルギーサイクル内の各スキャン点に対して決定されてもよい。
ＡＲ１＝Ｉｎｔ（Ｆ１．．．Ｆｎ）／Ｉｎｔ（Ｓ１，ＰＣＣ）
式中、
ｎは、スキャンＳ１のＥＥスキャンデータにおけるフラグメントイオンの数に等しく、
Ｉｎｔ（Ｆ１．．．Ｆｎ）は、スキャンＳ１のＥＥスキャンデータにおける「ｎ個の」フラグメントイオンのうち任意の１つの強度を表し、
Ｉｎｔ（スキャンＳ１，ＰＣＣ）は、Ｆ１〜Ｆｎが発するＰＣＣ又はプリカーサーイオンの、スキャンＳ１のＬＥスキャンデータにおける強度である（例えば、親プリカーサーイオン又はＰＣＣに対する比に基づいて、Ｆ１〜Ｆｎのｎ個のフラグメントのそれぞれに対して異なるＡＲ１値が決定されてもよい）。並びに、
ＡＲ２＝Ｉｎｔ（スキャンＳ１，ＰＣＣ）／Ｉｎｔ（スキャンＭ，ＰＣＣ）ＰＣＣのＡＲ２に関する式Ｖ３式中、
Ｉｎｔ（スキャンＭ，ＰＣＣ）は、５０％のＰＣＣ収率規則がＰＣＣの強度に対して保持される、ＰＣＣに対するＣＥ期間のスキャンＭに関する、ＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣ又はプリカーサーイオンの強度、並びに、
Ｉｎｔ（スキャンＳ１，ＰＣＣ）は、スキャンＭ以外のＰＣＣに対するＣＥ期間の別のスキャンを表す、あるスキャンＳ１のＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣ又はプリカーサーイオンの強度である。
同様に、フラグメントイオンに関して、式Ｖ３に基づいてＡＲ２値を決定することができる。
ＡＲ２＝Ｉｎｔ（スキャンＳ１，Ｆ１）／Ｉｎｔ（スキャンＭ，Ｆ１）フラグメントイオンのＡＲ２に関する式Ｖ３
式中、
Ｉｎｔ（スキャンＭ，Ｆ１）は、５０％のＰＣＣ収率規則がＰＣＣの強度に対して保持される、ＰＣＣに対するＣＥ期間のスキャンＭに関する、ＥＥスキャンデータにおけるフラグメントイオンＦ１の強度、並びに、
Ｉｎｔ（スキャンＳ１，Ｆ１）は、スキャンＭ以外のフラグメントイオンＦ１に対するＣＥ期間の別のスキャンを表す、あるスキャンＳ１のＥＥスキャンデータにおけるＦ１の強度である。
それに加えて、ＡＲ２は、上述の式に基づいて、ただし、２つの異なるＣＥサイクルにおける対応する点の２つのスキャンに関して定義されてもよい（例えば、１５１０ａ及び１５１０ｂにおける２つの異なるＣＥサイクルのＬ２及びＬ１１など、同じＣＥ１が２つのスキャンに適用され、ＣＥサイクル１５１０ａ、１５１０ｂ、及び１５１０ｃにおけるスキャンＬ３、Ｌ７、及びＬ９それぞれに同じＣＥ２が適用される場合）。式中、
Ｉｎｔ（スキャンＭ，ＰＣＣ）は、ＰＣＣに対するＣＥ期間の任意のスキャンＭに関する、ＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣ又はプリカーサーイオンの強度、並びに、
Ｉｎｔ（スキャンＳ１，ＰＣＣ）は、後に続く衝突エネルギーサイクルそれぞれにおけるスキャンＭの比較又は対応する位置の、ＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣ又はプリカーサーイオンの強度であり（例えば、Ｓ１及びＭは、同じＣＥが適用される場合の後に続くＣＥサイクルの対応する点における対応するスキャンである）、また、
Ｉｎｔ（スキャンＭ，Ｆ１）は、ＣＥ期間の任意のスキャンＭに関する、ＥＥスキャンデータにおけるフラグメントイオンＦ１の強度、並びに、
Ｉｎｔ（スキャンＳ１，Ｆ１）は、後に続く衝突エネルギーサイクルそれぞれにおけるＭの対応又は比較スキャンを表す、あるスキャンＳ１のＥＥスキャンデータにおけるＦ１の強度である（例えば、Ｓ１及びＭ１は、同じＣＥが適用される場合の異なるＣＥサイクルにおける対応するスキャンである）。
図１５を参照して更に例証するため、フラグメントＦ１に対して決定されるＡＲ１値は、Ｓ１及びＳ２の両方にほぼ同じＣＥが使用される場合、同じＣＥサイクルのスキャンＳ１及びＳ２において同じであることが予期される（例えば、ＡＲ１は、スキャンの対Ｌ３及びＬ４においてＦ１に対して同じであることが予期され、ＡＲ１は、スキャンの対Ｌ２及びＬ５においてＦ１に対して同じであることが予期される）。Ｆ１に対するＡＲ１値は、３つの異なるＣＥサイクルの対応するスキャンＬ３、Ｌ４、Ｌ７、及びＬ９において同じであることが予期され、その場合、複数のＣＥサイクルにわたって、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ７、及びＬ９の全てで同じＣＥが使用される。上記式Ｖ３を使用してＰＣＣ又はプリカーサーイオンに対して決定されるＡＲ２値は、同じＣＥが適用される、同じＣＥサイクルのスキャンＬ３、Ｌ４で同じであることが予期される。それに加えて、式Ｖ３を使用する同じＰＣＣに対するＡＲ２値は、同じＣＥが適用されるＣＥサイクル内で、又はＣＥサイクルにわたって、スキャンＬ３、Ｌ４、Ｌ７、及びＬ９で同じであることが予期される。
また、スキャンＬ３において上記式Ｖ３を使用してフラグメントＦ１に対して決定される第１のＡＲ２値は、スキャンＬ３において上記式Ｖ３を使用して、Ｆ１を生じるＰＣＣに対して決定される第２のＡＲ２値と同じであることが予期される。更に、上記第１及び第２のＡＲ２値はまた、スキャンＬ４、Ｌ７、及びＬ９において上記式Ｖ３を使用する、元のＰＣＣ及びＦ１に対するＡＲ２値と同じであることが予期される。更にまた、上記第１及び第２のＡＲ２値（スキャンＬ３におけるＰＣＣ及びＦ１に対する）はまた、スキャンＬ４、Ｌ７、及びＬ９において上記式Ｖ３を使用して、Ｆ１と同じＰＣＣからやはり生じる別のフラグメントＦ２に対して決定される、ＡＲ２値と同じであることが予期される。
このように、ＡＲ１及びＡＲ２両方の比が追跡されてもよく、ＣＥが変更されるＣＥ期間の類似のスキャン（ほぼ同じＣＥを有する）にわたって、ある指定の許容差内でほぼ同じであることが予期される。本明細書の他の箇所に記載されるように、ＡＲ２比が決定され、（スキャンにわたってＬＥスキャンデータに基づいて追跡されるような）ＰＣＣ溶出ピークの点Ｈ１及びＨ２に関して比較される場合、ＰＣＣ溶出ピークではなくＣＥ期間のピークに関して決定されるＦＷＨＭ点である点Ｈ１及びＨ２に対して、類似のＡＲ２比が決定されてもよい。例えば、Ｘ１を含む第１のＣＥ期間１５１０ａは、点Ａ、Ｂ、及びＣの間に形成される第１のピーク又は曲線である。第１のＣＥ期間１５１０ａのＦＷＨＭ点は、第１のＣＥ期間１５１０ａのＰＰとしてのスキャンＸ１の使用に関して決定されてもよい（図１６に示されるものなど）。これらの比はまた、フラグメントイオンのアライメントを検証するためのメトリックとして使用されてもよい。
例えば、第１のＡＲ１値は、第１の衝突エネルギーＣＥ１を使用して、第１のＣＥサイクル１５１０ａの第１のスキャンＳ１におけるその親プリカーサーイオン又はＰＣＣに対して、フラグメントイオンＦ１に関して決定されてもよい。親イオン又はＰＣＣに関するＦ１の第２のＡＲ１値は、スキャンＳ２がスキャン１の場合と同じ衝突エネルギーＣＥ１を使用する、第２のＣＥサイクル１５１０ｂの対応するスキャンＳ２において決定されてもよい。Ｆ１に対する上記ＡＲ１値の両方が近似しているはずであることが予期される。
一般に、ＣＥサイクルの期間≦ＰＣＣ溶出ピークのＦＷＨＭである。本明細書の技術による一実施形態では、ＡＲ２比を決定するのに使用されるＨ１及びＨ２スキャン点は、次式の間隔に基づいて計算されてもよい。
ＣＥ期間における＃ＣＥ又はスキャン／３＝間隔 式ＩＮＴＥＲＶＡＬ
式中、
「ＣＥ期間における＃ＣＥ又はスキャン」は、単一のＣＥサイクル又は期間におけるＣＥ又はＥＥスキャンの数である。
例えば、スキャンＸ１はスキャン５であり、また、各ＣＥ期間に１０のＣＥ又は１０のＥＥスキャン（例えば、１５１０ａ、１５１０ｂ、及び１５１０ｃのそれぞれに１０のＣＥ又はスキャン）があるものと仮定する。上記式ＩＮＴＥＲＶＡＬに基づいて、決定される間隔は３と１／３であり、３の整数値に丸み付けられてもよい。この場合、スキャン５をＰＰとして使用して、ＡＲ２値を計算するのに使用されるＨ１及びＨ２点は、ＰＰ＋３スキャン（例えば、点Ｈ２としてスキャン８を表す５＋３）及びＰＰ−３スキャン（例えば、点Ｈ１としてスキャン２を表す５−３＝２）であってもよい。
本明細書に記載される一実施形態では、ＡＲ２値は、第一に、２つの異なるＣＥサイクルの対応するスキャン（例えば、異なる衝突エネルギーサイクルからであるが、同じ衝突エネルギーを両方有するスキャン）の間で、また次式のようにＣＥ期間のスキャンＨ１及びＨ２におけるＦＷＨＭ点に対して決定されてもよい。
ＡＲ２＝上り坂比Ｕ＝下り坂比Ｄ 式Ｂ１
＝Ｉｎｔ（Ｈ１，Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）／Ｉｎｔ（Ｈ，Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）＝Ｉｎｔ（Ｈ２，Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）／Ｉｎｔ（Ｈ，Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）
式中、
Ｉｎｔ（Ｈ，Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）は、ＰＣＣの５０％の収率規則がＣＥピークに留まるスキャンＭのＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣの強度、
Ｉｎｔ（Ｈ１，Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）は、ＣＥピークの上り坂又はＬＨＳにおけるスキャンＨ１のＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣの強度、並びに、
Ｉｎｔ（Ｈ２，Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）は、ＣＥピークの上り坂又はＬＨＳにおけるスキャンＨ２のＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣの強度である。ＣＥは、同じＣＥサイクルのスキャンＨ１及びＨ２の両方でほぼ同じであることが注目されるべきである。
本明細書の他の箇所に記載されるように、処理は次に、スキャンＨ＝Ｍ（この例では＝Ｘ１）、並びにＭに対して決定されるＨ１及びＨ２に対するプロダクト又はフラグメントイオンのスキャンデータを検査してもよい。かかる処理は、同様の衝突エネルギーのサイクル間並びにｍ／ｚ及び強度比による衝突エネルギー比較の間で、フラグメントイオンをマッチさせることを含む。
スキャンＨ及びＨ１の間でマッチするフラグメントイオンの第１のセットと、スキャンＨ及びＨ２の間でマッチするフラグメントイオンの第２のセットとが決定されてもよい。例えば、スキャンＨのフラグメントイオンＦ１は、次の場合に、スキャンＨ１のフラグメントイオンＦ１’’にマッチすると判断される。
ある指定の許容差内で、Ｆ１のｍ／ｚがＦ１’’のｍ／ｚにマッチし、次式のように計算される強度比ＩＲ
ＩＲ＝スキャンＨ１におけるＦ１’’の強度／スキャンＨにおけるＦ１の強度が、Ｈ及びＨ１に対応する次のＣＥサイクルのスキャンに関して決定されるような、フラグメントＦ１又はその元のＰＣＣに対して、ある指定の許容差内で次の衝突エネルギーサイクルにおけるその比較のＡＲ２にマッチする（例えば、式Ｖ３を使用して決定されるようなＡＲ２にマッチする）（次のＣＥサイクルの対応するスキャンＨ’’がスキャンＨと同じＣＥを有し、次のＣＥサイクルの対応するＨ１’’がスキャンＨ１と同じＣＥを有する場合）。
上記ＩＲはＡＲ２値の別の表現であり、また、スキャンＨ及びＨ１に関してＰＣＣを発するフラグメントＦＵに関して、式Ｖ３を使用して決定されるようなＡＲ２値と同じであることが予期されることが注目されるべきである。
同様の方法で、本明細書の他の箇所に記載されるように、５０％のＰＣＣ収率規則を保持するスキャンをＰＰとして使用して、各ＣＥサイクルの曲線又はピークの異なるスキャン点に対して異なるＡＲ２値を決定する処理が行われてもよい。それに加えて、５０％のＰＣＣ収率規則を保持するＰＰとして使用して、ＡＲ１及びＡＲ３比などの本明細書に記載される他の任意の比が決定されてもよい。
上記の更なるＡＲ１、ＡＲ２、及び／又はＡＲ３値は、溶出ＰＣＣピークを検証するのに、本明細書に記載されるような他の検証基準と共に、またやはり本明細書に記載されるような特定のＰＣＣと関連付けられるフラグメントイオンをフィルタ処理又は検証する検証基準として、更なる検証基準として使用されてもよい。
５０％のＰＣＣ収率規則を保持するスキャンＭを、ＡＲ１及びＡＲ２値など、様々な比を決定するためにＰＰ又はＨスキャンとして使用するものの変形例として、一実施形態はまた、（１５１０ａなどの単一のＣＥ期間における全てのスキャンに関するＥＥスキャンデータの全てのセットに対して）ＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣの強度がその最小値にあるＣＥサイクル又はピークのスキャンを使用してもよく、それによって、ＰＣＣのフラグメンテーションが最大であるスキャンが表される。
５０％のＰＣＣ収率規則を保持するスキャンＭを、ＡＲ２値を決定するためにＰＰ又はＨスキャンとして使用するものの更なる変形例として、一実施形態は、より一般的には、（１５１０ａなどの単一のＣＥ期間における全てのスキャンに関するＥＥスキャンデータの全てのセットに対して）ＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣの強度が約５０％以下であるＣＥサイクル又はピークのスキャンを使用してもよい。より一般的には、一実施形態は、約５０％以下であってもよい閾値比率を選択し、それによって、様々な比（例えば、本明細書に記載される、ＡＲ１、ＡＲ２など）を計算するのにＨスキャン又はＰＰとして使用するスキャンを選択することを表してもよく、その際、ＥＥスキャンデータにおけるＰＣＣの強度は、ほぼ閾値比率以下である（例えば、指定の閾値比率を越えず、それによってＰＣＣのフラグメンテーションの閾値レベル又は最小レベルが表される）。
本明細書の技術による一実施形態はまた、溶出ピーク１５１２を有する特定の分子に対する理想的なＣＥを決定してもよい。かかる理想的なＣＥは、サンプルが溶出ピーク１５１２を有する特定の分子を含むか否かを判断する、標的とされたデータの獲得のためなど、他の実験に使用するＣＥを確立するのに使用されてもよい。５０％のＰＣＣ収率規則を保持する以下のＣＥは、溶出ピーク１５１２を有する特定のＰＣＣに対する理想的なＣＥとして使用されてもよい。理想的なＣＥは、教師なし及び／又は教師ありクラスタリングを使用して、複数の実験にわたる平均値として決定され記憶されてもよい。同様に、ＣＶ、標準偏差などのエラーインジケータが、理想的なＣＥに関して追跡されてもよい。
上記は、小分子を用いる特に有用な技術として特徴付けられてもよい。しかしながら、当業者には認識されるように、かかる技術は、小分子と共に使用するようには制限されず、一般医、任意の好適なサイズの任意の分子と共に使用されてもよい。
図１７を参照すると、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい、上述の処理を要約したフローチャート１６００が示されている。ステップ１６０１で、単一のＣＥサイクル又は期間におけるスキャンの数は、式ＣＥ ＣＹＣＬＥを使用して本明細書の他の箇所に記載されるように決定されてもよい。それに加えて、単一のＣＥサイクルにおける各スキャンの特定のＣＥ値又は設定は、単一のＣＥサイクルにおける各スキャンに対して、ＣＥが変更されてもよい場合に決定されてもよい。単一のＣＥサイクル又は期間に含まれる特定のＣＥは、任意の好適な方法で決定されてもよく、そのいくつかが本明細書に記載される。例えば、一実施形態は、数学関数を使用して、単一のＣＥ期間又はサイクルのスキャンにおける連続するＣＥ値を決定してもよい。かかるＣＥ値は、例えば、複数のＣＥサイクル又は期間全体にわたって循環される異なるＣＥ値を表すピークの波又は一連のピークを形成してもよい。ステップ１６０２で、ＣＥサイクル及び各ＣＥサイクルにおけるＣＥに基づいて、連続するスキャンそれぞれでＣＥが変更されるＨＥ及びＬＥスキャンデータを得るため、サンプルを使用して実験が行われてもよい。次に、ステップ１２０４で、ＬＥスキャンデータのイオンに対するＰＣＣを決定し、ステップ１２０５で各ＰＣＣに対してピーク検出を行う処理が行われてもよい。図１７のステップ１２０４及び１２０５は、教師なしクラスタリングに関して図９と関連して記載したようなものと同様である。
ステップ１６０６で、ＡＲ１値、ＡＲ２値、及び他の基準を含む検証基準にしたがって、ＰＣＣのそれぞれと関連する（例えば、マッチする）フラグメントイオンのセットを決定する処理が行われてもよい。検証基準は、最初のフラグメントイオンをフィルタ処理又は改良し、各ＰＣＣに対して改訂されたフラグメントイオンセットを決定するのに使用されてもよい。ステップ１６０６の処理は、図９、図１０、及び図１１と関連して記載されたものなどのステップ１２０６の処理と同様であるが、ステップ１２０６のかかる処理が（ＰＣＣ溶出ピークではなく）各ＣＥスキャンサイクルに関して行われてもよい点が異なる。それに加えて、Ｈスキャン又はＰＰスキャンは異なってもよく、ＰＣＣ溶出ピーク強度の頂点を（ステップ１２０６のように）Ｈスキャン又はＰＰとして使用するのではなく、ステップ１６０６は、ＡＲ２及びＡＲ１値を計算する際の代替のＨスキャン又はＰＰとして、５０％のＰＣＣ収率規則を保持する（又はより一般的には、ＰＣＣのフラグメンテーションがその最大値である）単一のＣＥサイクル又は期間のスキャンを使用してもよい。やはり本明細書に記載されるように、５０％のＰＣ収率規則は５０％の閾値レベルを使用し、ステップ１６０６は、より一般的には、任意の好適な閾値レベル又は閾値比率を使用して行われてもよい。ステップ１２０８、１２１０、及び１２１２は、次に行われてもよく、図９と関連してなど、本明細書の他の箇所に記載されるものと同様である。
単クローン抗体は、体内のバクテリアなどの異質な侵入物を認識するタンパク質である。かかる単クローン抗体は、例えば、身体の免疫系に特定の疾病を標的とさせるなど、様々な治療及び医療目的で、体内に注入されてもよい。
ソース又は宿主は、かかる異質な侵入物を認識する単クローン抗体を製造又は生成してもよい。例えば、ソース又は宿主は、所望の単クローン抗体を生成するのに使用される、ラット、ウシなどの動物であってもよい。単クローン抗体を分離又は精製し、精製された抗体（ＰＡ）の指紋（例えば、プリカーサーイオン又はＰＣＣ、及びそれぞれに対する関連するフラグメントイオン）を決定する処理が行われてもよい。ソース又は宿主によって生成されるようなＰＡが「純粋」であり、ＰＡ以外の他の任意のタンパク質（例えば、ソース若しくは宿主からのものなど）、構成成分、又は化合物を含まないことを確認又は担保する処理が行われてもよい。ＰＡ中に任意の宿主タンパク質があるか否かを判断する、かかる処理が行われてもよい。当該分野で知られているように、ＦＤＡは、例えば、ＰＡが「純粋」であり、またＰＡのみを含み、宿主細胞タンパク質又は他の汚染物質は何ら含まないことが検証又は確認されている点で、ＰＡに対する制限及び要件を有する。
宿主細胞タンパク質などに対する、任意の汚染物質の量又は濃度は非常に低くてもよく、したがって、利用される技術が、ＰＡ以外の汚染タンパク質又は他の分子の、０．１％濃度などのかかる非常に低い濃度レベルを検出することができるべきであることが注目されるべきである。
ＰＡは既知のタンパク質であってもよく、それに対して、ペプチドの標的ライブラリ、関連するフラグメントイオン、並びに関連するプリカーサー及びフラグメントイオン情報が決定されてもよい。一実施形態では、シミュレータ又はモデリングソフトウェアが、タンパク質の特定のペプチドに関しては、全てのプリカーサーイオンを、また各プリカーサーイオンに関しては、かかるプリカーサーイオンそれぞれをフラグメンテーションすることによって生成される、関連するフラグメントイオンを予測するのに使用されてもよい。上記は、ＰＡなどのタンパク質の標的ライブラリが生成されてもよい、１つの方法である。より一般的には、本明細書の技術による一実施形態は、ＰＡの標的ライブラリに取り込むのに使用される情報を得るのに、任意の好適な技術を使用してもよい。本明細書の技術によれば、一実施形態は、シミュレータを使用して、教師ありクラスタリングの標的として使用されるＰＡに対してＣＣＰＩＳを予測し生成してもよい。
例えば、図１８に示されるように、例えば、ペプチド１〜Ｍとして表される１００以上のペプチドに関する情報を含んでもよい、単一のＰＡに関するライブラリに含まれてもよい、情報の表現の一例が示される。各ペプチドに対して、ライブラリは、プリカーサーイオン及び関連するフラグメントイオンのセットを同定してもよい。例えば、ペプチド１に対して、プリカーサーイオン化の結果として、プリカーサーイオン１〜Ｎが生成されてもよい。それに加えて、ライブラリは、かかるプリカーサーイオンそれぞれに対して、かかるプリカーサーイオンのフラグメンテーションの結果として生成されるフラグメントイオンを同定してもよい。例えば、プリカーサーイオン１は、フラグメンテーションされると、関連するフラグメントイオンのセットを生成する。本明細書に記載されるように、ライブラリ中の各プリカーサーイオンは、単一のＰＣＣに対応してもよく、別の方法では、同じプリカーサーイオンの異なる電荷状態を表す、１つ又は２つ以上のＰＣＣの組み合わされたセットとしての単一のプリカーサーに関する情報を表してもよい。それに加えて、ライブラリは、例えば、各イオンのｍ／ｚ、保持時間、イオンの異なる強度又は面積比（例えば、ＡＲ１及びＡＲ３メトリックに関する値）など、プリカーサー及びプロダクトイオンに関するイオン情報を含んでもよい。
図１９を参照すると、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい、例示のワークフローが示されている。実験１８５４は、ＰＡが「純粋」であり、ＰＡのみを含むか否かを判断するのに、ＰＡを含むサンプル１８５２に対して行われてもよい。かかる処理は、分析中のサンプルが任意の宿主細胞タンパク質汚染物質又は他の汚染物質を含むか否かを判断してもよい。本明細書に記載されるように、また当該分野で知られているように、実験１８５４は、タンパク質消化及びＬＣ／ＭＳ又はＬＣ／ＩＭＳ／ＭＳ分析を行うことを含んでもよい。ＬＥ及びＨＥスキャンデータ１８５５が実験に対して得られてもよく、その実験が更に、本明細書に記載される教師ありクラスタリング技術１８５６を使用して、教師ありクラスタリングの標的ライブラリとして使用されるＰＡタンパク質１８５７に関するライブラリを用いて処理されてもよい。例えば、１８５６によって表されるかかる処理は、マッチしたイオンが更なる考慮からデジタル的に除去される、図１４Ａに記載されるような教師ありクラスタリングを使用して行われてもよい。
１８５６によって表されるかかる処理は、教師ありクラスタリングを行い、アンマッチしたイオンの残留又は残存セット１８５８を生成することを含んでいてもよい。本明細書の他の箇所に記載されるように、アンマッチしたイオンの残留又は残存セット１８５８は、ＰＡライブラリ１８５７の情報にマッチしないと判断された、アンマッチしたプリカーサーイオン又はＰＣＣ及びアンマッチしたフラグメントイオンを含んでもよい。
この時点で、後続の処理は、２つの代替のワークフローのうち１つを使用してもよい。第１の後続の処理ワークフローは、更に詳細に後述される、１８６０、１８６２、１８６４、及び１８６６によって表される処理を含む。第２の後続の処理ワークフローは、１８７０、１８７２、及び１８７４によって表される処理を含む。
第１の後続の処理ワークフローと関連して、アンマッチしたイオンの残留又は残存セット１８５８は、教師なしクラスタリング１８６０による処理のために入力されてもよい。出力として、教師なしクラスタリング１８６０は、ＰＣＣ又はプリカーサーイオン及び関連するフラグメントイオンのマッチしたイオンセットを含む出力１８６２を決定してもよい。１８５８の各ＰＣＣに対して、教師なしクラスタリング１８６０は、出力１８６２に含まれるような、１つ又は２つ以上の関連又はマッチするフラグメントイオンのセットを決定してもよい。マッチしたイオンセット１８６２は、次に、宿主細胞タンパク質汚染物質１８６４の第三者ＤＢ又はライブラリに対して問い合わせ１８６６されてもよい（例えば、プリカーサーイオン及び関連するフラグメントイオンの任意のマッチしたセットが、ＤＢ又はライブラリ１８６４内にあるもののいずれかにマッチするかを判断し、それによって、マッチしたイオンセット１８６２が宿主細胞タンパク質汚染物質を含むことを同定するため、マッチしたイオンセット１８６２を検索する）。
第２の後続の処理ワークフローと関連して、宿主細胞プロテオーム１８６８は、本明細書の他の箇所に記載されるような形でモデリングソフトウェア１８７０に入力されて、（例えば、図１８、図１２などにある情報を含む）宿主細胞タンパク質汚染物質１８７４のＤＢ又はライブラリを生成してもよい。アンマッチしたイオンの残留又は残存セット１８５８は、宿主細胞タンパク質汚染物質のＤＢ又はライブラリを標的ライブラリとして使用する、教師ありクラスタリング１８７２による処理のために入力されてもよい。この方法で、教師ありクラスタリング１８７２は、残留セット１８５８のアンマッチしたイオンと宿主細胞タンパク質汚染物質のＤＢ又はライブラリとの間で十分な数のマッチがなされるか否かを同定して、残留物１８５８が任意の宿主細胞タンパク質を同定することを同定又は確認するのに使用されてもよい。
図２０を参照すると、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい、処理ステップのフローチャートが示されている。フローチャート１９００は、図１９と関連して上述されたような処理を要約している。ステップ１９０２で、ＰＡを含むサンプルに対して、実験のためのＬＥスキャンデータ及びＨＥスキャンデータを得るのに、実験が行われてもよい。ステップ１９０４で、実験データを使用して、またＰＡタンパク質ライブラリを標的ライブラリとして使用して、教師ありクラスタリングが行われてもよい。本明細書の他の箇所の記載と同じく、標的ライブラリ内の各プリカーサーイオン又はＰＣＣに関して、ＬＥスキャンデータにおいてマッチがあるか否か、またかかるマッチしたＰＣＣそれぞれに関して、ＨＥスキャンデータが標的ライブラリで同定されたようなＰＣＣに対する任意のフラグメントイオンを含むか否かを判断するため、ステップ１９０４の教師ありクラスタリングが行われてもよい。結果として、ライブラリのＰＡに関する好適な数のプリカーサーイオン又はＰＣＣ及び関連するフラグメントイオンは、実験のためのＬＥ及びＨＥスキャンデータに含まれるようなイオン情報にマッチするはずである。ステップ１９０６で、アンマッチしたプリカーサーイオン又はＰＣＣの残留又は残存セット、及びＰＡライブラリに関してステップ１９０４でマッチが判断されなかった実験データのイオンとしてのアンマッチしたフラグメントイオンを決定する処理が行われてもよい。ステップ１９０６から、一実施形態は、あるいは、ステップ１９０８及び１９１０を行うように進んで、第１の後続のワークフローを形成してもよく、又はステップ１９１２及び１９１４を行うように進んで、第２の後続のワークフローを形成してもよい。
第１の代替例として、処理は、ステップ１９０６からステップ１９０８に進んで、ステップ１９０６からの残留又は残存するアンマッチしたイオンに関して教師なしクラスタリングを行って、マッチしたＰＣＣ及び関連するフラグメントイオンのＳＳＰＰＩＳ又はセットを生成してもよい。処理は、ステップ１９１０に進んで、ライブラリとＰＣＣ及び関連するフラグメントイオン（ステップ１９０８の処理によって決定されるようなもの）のマッチしたセットとの間のマッチに関して、宿主細胞タンパク質汚染物質のＤＢ又はライブラリを検索する。ステップ１９１０で使用されるＤＢ又はライブラリは、例えば、第三者が提供するライブラリであってもよい。
第２の代替例として、処理は、ステップ１９０６からステップ１９１２に進んでもよい。ステップ１９１２で、本明細書に記載されるようなモデリングソフトウェアを使用するなど、宿主細胞タンパク質汚染物質のＤＢ又はライブラリを生成する処理が行われてもよい。ステップ１９１４で、次に、残留セット（ステップ１９０６で生成される）におけるＤＢ又はライブラリ（ステップ１９１２で生成される）のマッチしたＰＣＣ及び関連するフラグメントイオンのＳＳＰＰＩＳ又はセットを検索する、教師ありクラスタリングが行われてもよい。
図２１を参照すると、特定の精製された抗体（ＰＡ）の標的ライブラリを生成する、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理の一例２１０１が示されている。ＰＡライブラリ２１１７は、特定のタンパク質又は分子の存在に関するサンプルの検証と関連してなど、本明細書に記載される他の技術と関連して使用されてもよい。ＰＡライブラリ２１１７はまた、サンプル中の変異型、異常、汚染物質などの検出及び／又は同定と関連して使用されてもよい。例えば、本明細書に記載されるように、ＰＡライブラリは、プリカーサーの変異型又は修飾、ジスルフィド結合ペプチド、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、及び宿主細胞タンパク質汚染物質のいずれかを検出する、サンプルの分析と関連して使用されてもよい。したがって、図２１は、本明細書の技術による一実施形態で教師ありクラスタリングを行うのと関連して、標的ライブラリとして後で使用するためにＰＡライブラリが生成されてもよい、１つの方法を示している。
処理の第１の部分として、ＰＡライブラリ２１１７は、最初に、理論上のデータを取り込んでもよい。一実施形態では、本明細書の他の箇所で言及されるシミュレータ又はシミュレーションソフトウェアなどのモデリングソフトウェア２０２１は、ＰＡプロテオーム２０２０を入力として備えてもよい。出力として、モデリングソフトウェア２０２１は、ＰＡに対する理論上のペプチドマップを生成する。ペプチドマップは、ＰＡに関してペプチド及び関連するイオンとを含んでもよい。例えば、ペプチドマップは、プリカーサーイオン又はＰＣＣ、及びかかるＰＣＣそれぞれに対して、ＰＣＣのフラグメンテーションを通して生成される関連するフラグメントイオンなどを含んでもよい。モデリングソフトウェア２０２１によって理論的に生成されるペプチドマップは、最初に、ＰＡライブラリ２１１７にペプチド及びＰＡのフラグメントイオン情報を取り込むのに使用されてもよい。ＰＡライブラリ２１１７に取り込むのに使用されるペプチドマップは、全てのシステインがジスルフィドを有さないように修飾されている、ＰＡに対するイオン情報を含むことが注目されるべきである。標的ＰＡライブラリは、全ての標的ペプチドの全ての理論上の「インシリコ」ＣＰＰＩＳを含む。
ライブラリ２１１７に最初に理論上のペプチドマップを取り込んだ後、ＰＡを含むことが分かっているサンプル２１１２に対して実験２１１４が行われてもよい。本明細書に記載されるように、また当該分野で知られているように、実験２１１４は、タンパク質消化及びＬＣ／ＭＳ又はＬＣ／ＩＭＳ／ＭＳ分析を行うことを含んでもよい。この実験では、サンプル調製は、還元及びアルキル化を行うことを含み、それにより、サンプル中の全てのシステインがジスルフィドを有さない（例えば、トリプシンペプチドのみを有する）ように修飾される。ＬＥ及びＨＥスキャンデータ２１１５が、実験２１１４に対して得られてもよい。ＬＥ及びＨＥスキャンデータ２１１５は、本明細書に記載される教師ありクラスタリング技術２１１６を使用して、教師ありクラスタリング標的ライブラリとして使用されるＰＡタンパク質２１１７のライブラリを用いて更に処理されてもよい。例えば、２１０６によって表されるかかる処理は、図１４Ａに記載されるような教師ありクラスタリングを使用して行われてもよい。上述したように、ライブラリ２１１７の情報は、全てのシステインがジスルフィドを有さないように修飾されているＰＡに関するイオン情報を含む。システインが修飾され、分析されたサンプル中にジスルフィドを有さないようにして、サンプルが２１１４に記載されるように調製された場合、システインを含有するものを含むライブラリ２１１７内の全てのペプチドは、実験データセット２１１５内の対応するイオン情報にマッチされるはずである。出力として、教師ありクラスタリング２１１６は、ＰＡライブラリ２１１７を更新するのに使用されてもよい、マッチしたイオン情報２１２２を生成してもよい。本明細書に記載されるように、教師ありクラスタリング２１１６は、２１１５のＬＥスキャンデータにおける標的ＰＡライブラリ２１１７の各標的プリカーサーイオン又はＰＣＣの存在を探す。かかるマッチした標的プリカーサーイオン又はＰＣＣそれぞれに関して、マッチした標的プリカーサーの関連する標的フラグメントイオンが、次に、ライブラリ２１１７から検索され、そのプリカーサーの標的フラグメントイオンのうちどれが実験データ中に存在するかを判断する、更なる処理と関連して使用される。このように、教師ありクラスタリング２１１６の終了時に、マッチしたイオン情報２１１２は、実験データセット２１１５のＬＥスキャンデータにおいてマッチしたライブラリ２１１７の各標的ＰＣＣ又はプリカーサーイオンと、かかるマッチしたＰＣＣ又はプリカーサーイオンそれぞれに対して、マッチしたＰＣＣ又はプリカーサーイオンから発するフラグメントイオンの関連するフラグメントイオンセットとを同定してもよい。教師ありクラスタリングの結果として生成される関連するフラグメントイオンセットは、教師ありクラスタリング２１１６によって、実験データセット２１１５のマッチしたＰＣＣ又はプリカーサーイオンと関連付けられると判断された、ＰＡライブラリ２１１７のフラグメントイオンを同定する。例えば、ライブラリ２１１７は、マッチした標的ＰＣＣ又はプリカーサーイオンに対して１５のフラグメントイオンを含んでもよい。しかしながら、教師ありクラスタリングは、それら１５のフラグメントイオンのうち１０のみが、実際の実験データセット２１１５におけるマッチした標的ＰＣＣ又はプリカーサーイオンと関連付けられると判断してもよい。
このように、教師ありクラスタリング２１１６を完了した後、マッチしたイオン情報２１１２は、ＰＡライブラリ２１１７の更新又は再取込みに使用されてもよい（例えば、それによって、実際の実実験データ２１１５に基づいて、理論上の又はシミュレートされた２１１７のイオン情報をマッチしたイオン情報２１１２と置き換える）。例えば、図１４Ａ及び関連する本明細書の記載を再び参照すると、ＰＡライブラリ２１１７に、最初に、理論上のデータが取り込まれ、教師ありクラスタリング２１１６と関連して使用されてもよい。ライブラリ２１１７内のＰＣＣ又はプリカーサーイオンにマッチする実験データセット２１１５の各ＰＣＣ又はプリカーサーイオンに関して、ＰＣＣ及びそれに関連するフラグメントイオンに対するライブラリ２１１７の理論上のイオン情報は、実験データセットから得られるようなイオン情報と置き換えられるか、又はそれを含むように更新されてもよい。それに加えて、ここで記載される処理に関して、一実施形態は、マッチしたＰＣＣ又はプリカーサー及び関連するフラグメントイオンに関して、実験データセットに含まれるようなイオン情報を使用してもよい。
以下、プリカーサーの変異型又は修飾の同定と関連して行われてもよい技術について記載する。
ここでの説明の文脈では、「変異型」は、精製された抗体又は治療薬と関連付けられたペプチドの一点突然変異と見なされてもよい。より広義では、本明細書の技術は、より一般的に適用され、ペプチドの任意の修飾型である「変異型」と共に使用されてもよい。一般的な修飾としては、酸化（Ｍ、Ｗ）、メチル化（Ｋ、Ｒ）、アセチル化（Ｋ、Ｒ）、標識（ＳＩＬＡＣ）、リンカー、又は性薬物を伴うライカー（liker）（例えば、ＡＤＣ）、グリカン、リン酸などが挙げられるが、それらに限定されない。プリカーサーとそのプロダクトイオンとの関係に沿って、変異型／修飾の地点までのペプチドのフラグメンテーションパターンはほぼ同一である。変異型／修飾が、保持時間の物理化学的属性に対して、またＩＭＳが用いられる場合は、ドリフト時間又は断面積（ＣＣＳＡ２）に対して及ぼす影響は、ペプチドの長さの関数である。例外である特定の化学的修飾がある。例えば、ＡＤＣと関連して、リンカー及びその細胞毒性薬物は、非常に疎水性が高く、ペプチドの保持時間に対して顕著な影響を有する。
最初の検証又はスクリーニングにおいて、統計的に有意な数のマッチしたプロダクトイオンがあることを所与として（プリカーサーイオンのマッチが存在することは必須ではない）、ペプチドの修飾／変異型を正確に同定することができる。本明細書で更に詳細に後述されるような処理は、マッチしたＳＳＰＰＩＳ中にプリカーサーイオンが存在しないことを認識し、更なる処理を始動させ、それにより、マッチしたＳＳＰＰＩＳ（１つのみが存在する）中のプリカーサーイオンと標的ｍ／ｚとの間のΔｍ／ｚが計算され、既知の変異型／修飾のルックアップテーブルと比較される。マッチが見出された場合、修飾／変異型のプロダクトイオンスペクトルが生成され、新しいＣＰＰＩＳ（変異型）の作成における同定及び包含を検証するため、プリカーサーのピークエンベロープ内の全てのＳＳＰＰＩＳと比較される。このアプローチの成功は、ペプチドのアミノ酸直鎖及びそのフラグメンテーションパターンにおける修飾／変異型の位置の関数である。明瞭にするため、Δｍ／ｚが、Ｃ末端からの第２のアミノ酸残基の修飾又は点変異体（変異型）であり、フラグメンテーション（例えば、衝突解離）によって生成されたプロダクトイオンの９０％がｙ’’イオンである場合、修飾／変異型のｙ’’２〜ｙ’’ｍａｘからのｙ’’イオンは全て、Δｍ／ｚを有することになる。そのため、これらのプロダクトイオンは検証処理においてマッチすることがない。他方で、十分な数のｂイオンがフラグメンテーション中に生成され、それらのうち統計的に有意な数がマッチした場合、ペプチドの修飾／変異型は同定されるであろう。
プリカーサーイオンに関するΔｍ／ｚに基づいた第１の合格において変異型が同定されない場合、全ての可能なアミノ酸交換（一点突然変異）の正確な質量差を反映したΔｍ／ｚ値のルックアップテーブルを使用して、処理が更に行われてもよい。Δｍ／ｚ、Δ時間、及びΔドリフト時間（ＩＭＳが利用される場合）は、抽出されたプロダクトイオンに追加されてもよい。これらのプロダクトイオンは、次に、ｍ／ｚ、保持時間、及びドリフト時間におけるユーザ定義のマッチ許容差内にある、全てのＳＳＰＰＩＳに対してスクリーニングされる。プリカーサーのΔｍ／ｚがプロダクトイオンのΔｍ／ｚと一貫しており、変異型ＣＰＰＩＳが作成された場合に、マッチが見出される。変異型が見出されると、同定されたプロダクトイオンは、配列における修飾／変異型の位置についての洞察を与えてもよい。上述したように、プロダクトイオンのｍ／ｚ値は、修飾の地点まで一貫している。Δｍ／ｚの第１の組込みを示すプロダクトイオンのｍ／ｚ値は、変異アミノ酸の一般位置をアルゴリズムに伝える。暫定的な同定が行われると、変異型の全ての可能な部位に対してプロダクトイオンが生成され、マッチしたＳＳＰＰＩＳに常在する他のプロダクトイオンと比較される。この時点で、処理は、修飾又は変異型の正確な位置を同定することを試みてもよい。上述した位置的な限定と同様に、Ｎａ＋及びＫ＋付加物は、共通のフラグメントイオンタイプ（ｂ、ｙ’’）のどちらか又は両方のｍ／ｚ値を大幅に変更する。ナトリウム付加又はカリウム付加電荷がＣ末端に局在する場合、フラグメンテーションで生成されたｙ’’イオンは、ナトリウム付加又はカリウム付加のΔｍ／ｚを含むようになる（それらが未修飾ペプチドに対してマッチしないように制限される）。同じことが、ｙ’’イオンをそれらの補体であるｂイオンと置き換える、ｎ末端にも当てはまる。Ｎａ＋及びＫ＋付加物の形成はガス相で起こる。そのため、ペプチドのＮａ＋及びＫ＋付加物は、同一の保持時間及びドリフト時間を有するようになる。これが該当する場合、処理は、Ｎａ＋及びＫ＋付加物を検索し、Δｍ／ｚが上述したルックアップテーブルに追加されてもよいので、かかる修飾は標的ペプチドの修飾／変異型の１つとして同定されてもよい。本明細書の技術による一実施形態は、同定を支援する確証的なプロダクトイオンデータがあるか否かに関わらず、任意の可能な変異型を報告してもよい。
本明細書の技術の明確に有利な点は、スクリーニングされたＳＳＰＰＩＳにおけるＰＣＣの存在に対して中立なことである。主要なペプチドの同定はその親分子の存在によって向上するが、それは必須ではない。本明細書に記載される処理は、標的ＣＰＰＩＳを有する同位体を含む、統計的に有意な数のプロダクトイオンのマッチするのみを根拠として、プリカーサーの修飾／変異型を同定するのに使用されてもよい。
プリカーサーの変異型又は修飾を検出及び／又は同定する、本明細書の技術と関連する処理の第１の部分として、最初にサンプル中のＰＡの存在を検証するステップが行われてもよい。図２２を参照すると、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい、例示のワークフローが示されている。実験２１０４は、サンプル２１０２が実際にＰＡを含むか否かを判断するのに、ＰＡを含むサンプル２１０２に対して行われてもよい。本明細書に記載されるように、また当該分野で知られているように、実験２１０４は、タンパク質消化及びＬＣ／ＭＳ又はＬＣ／ＩＭＳ／ＭＳ分析を行うことを含んでもよい。この実験では、サンプル調製は、還元及びアルキル化を行うことを含み、それにより、サンプル中の全てのシステインがジスルフィドを有さない（例えば、トリプシンペプチドのみを有する）ように修飾される。ＬＥ及びＨＥスキャンデータ２１０５が、実験２１０４に対して得られてもよい。ＬＥ及びＨＥスキャンデータ２１０５は、本明細書に記載される教師ありクラスタリング技術２１０６を使用して、教師ありクラスタリング標的ライブラリとして使用されるＰＡタンパク質２１０７のライブラリを用いて更に処理されてもよい。例えば、２１０６によって表されるかかる処理は、図１４Ａに記載されるような教師ありクラスタリングを使用して行われてもよい。本明細書に記載されるように、ＰＡライブラリ２１０７は、任意の好適な技術を使用して生成されてもよく、プリカーサーイオン又はＰＣＣと、かかるＰＣＣそれぞれに対して、ＰＣＣのフラグメンテーションを通して生成された関連するフラグメントイオンとを含む（例えば、ＰＡライブラリ２１０７は、ＰＡに関するプリカーサー及び関連するプロダクトイオンのＣＰＰＩＳを含む）。例えば、ＰＡライブラリ２１０７は、図２１の処理と関連して記載されるような情報を含むように生成されてもよい。ライブラリ２１０７の情報はＰＡに関するイオン情報を含む。サンプルが２１０４に記載されるように調製された場合、ライブラリ２１０７内の全てのペプチドは、実験データセット２１０５の対応するイオン情報にマッチされるはずである。このように、一実施形態では、サンプル２１０２中におけるＰＡの存在は、ライブラリ２１０７の全てのペプチドを、教師ありクラスタリング２１０６を行った結果としての実験データセットのイオン情報に対してマッチさせることによって検証されてもよい。代替例として、サンプル２１０２中におけるＰＡの存在は、ライブラリ２１０７内の少なくとも指定された数のペプチドを、教師ありクラスタリング２１０６を行った結果としての実験データセットのイオン情報に対してマッチさせることによって検証されてもよい。処理の上記第１の部分はまた、ペプチドフラグメントの形成をもたらすタンパク質の化学又は酵素処理と、それに続く再現可能な形でのフラグメントの分離及び同定とを含む、タンパク質に対するアイデンティティ試験であるペプチドマッピングとも呼ばれることがある。
２１０６で教師ありクラスタリングを行った結果として、実験データセット２１０５の対応するイオン情報にマッチした、ライブラリ２１０７内のプリカーサーイオン又はＰＣＣ及び関連するフラグメントイオン（例えば、ＣＰＰＩＳ）を同定する、情報の第１のセット２１０６ａが得られてもよい。それに加えて、２１０６の処理の結果として、アンマッチしたイオンの残留又は残存セット（例えばアンマッチしたＰＣＣ及びアンマッチしたフラグメントイオン）を表す、情報の第２のセット２１０６ｂが得られてもよい。アンマッチしたイオン２１０６ｂの残留又は残存セットは、各スキャンにおいてライブラリのＰＣＣ又はプリカーサーにマッチしないイオンのセットを含んでもよい。
したがって、要素２１０６ａは、実験データセットの対応するイオン情報に対して同定又はマッチされたＰＡのペプチドを表す（例えば、要素２１０６ａは、ＰＡライブラリのマッチした標的（例えば、実験データセットのイオン情報に対してマッチしたライブラリのＰＣＣ又はプリカーサーイオン）を表す）。２１０６ａで同定されるようなＰＡライブラリのマッチしたＰＣＣ又はプリカーサー標的から、ここで、かかるマッチしたＰＣＣ又はプリカーサーイオンそれぞれのプロダクトイオンスペクトル（例えば、ＣＰＰＩＳ）を有し、それにより、プロダクトイオンスペクトルは関連するＰＣＣ又はプリカーサーイオンから発するフラグメントイオンを表す。それに加えて、２１０６ａにおけるマッチしたＰＣＣ及び関連するフラグメントイオンに対する、ＡＲ１値、ＡＲ２値などのイオン情報は、実験データセット２１０５に含まれるものとされてもよい。
この時点で、２１０６ａのマッチしたＰＣＣ又はプリカーサーイオン標的のフラグメントイオンに対して、アンマッチしたイオン２１０６ｂの残留又は残存セットを検索する処理が行われてもよい。マッチしたフラグメントイオンに関するフラグメントイオン情報は、実験データに含まれるものとされてもよい。例えば、ライブラリ２１０７は、ＰＣＣ又はプリカーサーイオンＰ１を含んでもよく、Ｐ１と関連付けられる（例えば、そのフラグメンテーションを介して生成される）２０のフラグメントイオンが存在することを示してもよい。教師ありクラスタリング２１０６を行う際、ライブラリの標的Ｐ１は、実験データセットの対応するＰ１にマッチされてもよい。
それに加えて、実験データセット２１０５は、Ｐ１と関連付けられる５つのみのフラグメントを含んでもよい。教師ありクラスタリングを用いる本明細書の技術による一実施形態では、ライブラリ２１０７は、２０のフラグメントイオンを５つのフラグメントイオン及び実験データセットの対応するフラグメントイオン情報と置き換えるように更新されてもよい。それに加えて、Ｐ１に対してマッチしたイオン情報２１０６ａにおける情報は、実験データセットのように、５つのフラグメントイオン及び関連するイオン情報のフラグメントイオンセットを含んでもよい。
図２２を参照すると、マッチしたイオンセット２１０６ａに含まれるのはイオン情報の行である。２１０６ａの各行は、教師ありクラスタリング２１０６においてライブラリ２１０７の対応するＰＣＣ又はプリカーサーイオンにマッチした、マッチしたＰＣＣ又はプリカーサーイオンを同定してもよい。２１０６ａの各行は、同じ行に含まれるマッチしたＰＣＣ又はプリカーサーイオンと関連付けられるものとして実験データセットにおいて同定される、フラグメントイオンのフラグメントイオンセットを含んでもよい。本明細書のこの例及び他の例と同じく、ＰＣＣ又はプリカーサーイオンは、Ｐｉ（「ｉ」は整数）と表されてもよく、プロダクト又はフラグメントイオンはＦｉと表されてもよい。例えば、２１０６ａは、ライブラリ２１０７の対応するＰＣＣ又はプリカーサーイオンにマッチしたＰ１を含む第１の行を含む。実験データセット２１０５において、Ｐ１は、フラグメントイオンセット２１１０ａと関連付けられることが（教師ありクラスタリング２１０６を介して）判断されている。２１０６ａは、ライブラリ２１０７の対応するＰＣＣ又はプリカーサーイオンにマッチしたＰ２を含む第２の行を含む。実験データセット２１０５において、Ｐ２は、フラグメントイオンセット２１１０ｂと関連付けられることが（教師ありクラスタリング２１０６を介して）判断されている。
マッチしたイオン情報２１０６ａのフラグメントイオンセットの場合、フラグメントイオンセットは、同じプリカーサーイオン又はＰＣＣから全て発しているものと判断されている関連又は関係するフラグメントイオンのセットを表し、ＰＣＣ又はプリカーサーイオンは、ライブラリ２１０７の対応するＰＣＣ又はプリカーサーイオンにマッチされている。
例２１００におけるイオンの残留又は残存セット２１０６ｂは、教師ありクラスタリング２１０６の一部としてのライブラリ２１０７の標的にマッチしない各スキャンのイオンの行を含んでもよい。例えば、２１０６ｂは、Ｐ３及びＦ１〜３を含むスキャンＸからのイオンの第１の行と、Ｐ４及びＦ８〜Ｆ１２を含むスキャンＹからのイオンの第２の行と、Ｐ６及びＦ１０〜１１を含むスキャンＺからのイオンの第３の行と、Ｐ５及びＦ５〜７を含むスキャンＸＸからのイオンの第４の行とを含む。本明細書の技術による一実施形態では、２１０６ｂの各行は、教師ありクラスタリングから生成されたが、ライブラリ２１０７の対応するＰＣＣ又はプリカーサーイオンにはマッチしていない、ＳＳＰＰＩＳに対応してもよい。
一実施形態は更に、２１０６ａのフラグメントイオン２１１０ａ〜ｂをフィルタ処理してもよい。例えば、各フラグメントイオンセット２１１０ａ〜ｂにおいて、処理は、最小強度閾値を満たすもののみを利用するようにフラグメントイオンをフィルタ処理してもよい。一実施形態では、各フラグメントイオンセット２１１０ａ〜ｂに関して、最小強度を表す閾値は、最大強度を有するセットにおけるフラグメントイオンの強度の１／３であってもよい。例えば、２１１０ａのＦ４が、２１１０ａの全てのフラグメントイオンの最大強度ＭＸを有するものと仮定する。この場合、２１１０ａのフラグメントイオンは、少なくともＭＸ／３の強度を有さない２１１０ａの任意のフラグメントイオンを更に処理することから除外されるようにフィルタ処理されてもよい。
同様のフィルタ処理が、２１０６ａのフラグメントイオンセットのそれぞれに対して行われてもよい。この例では、２１１０ａ及び２１１０ｂの全ての例証されるフラグメントイオンが、各フラグメントイオンセットの最大フラグメントイオン強度に関して決定された最小閾値強度に基づいて、かかるフィルタ処理基準を満たすものと仮定する。
残留物２１０６ａのフラグメントイオンのセット２１１２ａ〜ｄを検索して、残留物２１０６ａの任意のフラグメントイオンセットが、２１０６ａのフラグメントイオンセット２１１０ａ〜ｂの１つにマッチする閾値数のフラグメントイオンを含むか否かを判断する処理が行われてもよい。一般に、マッチしたイオン情報２１０６ａのフラグメントイオンセットと残留物２１０６ｂとの間のかかるマッチは、マッチするフラグメントの（指定の許容差内の）ｍ／ｚ、マッチするフラグメントのイオン強度比、並びにフラグメントイオンマッチの最小閾値数がマッチするｍ／ｚ及びマッチするフラグメントイオン強度比の基準を満たすことの判断を含む、マッチング基準を使用して行われてもよい。これについては更に詳細に後述される。
例えば、マッチしたイオン情報２１０６ａの第１のフラグメントイオンセット２１１０ａが検索され、残留物２１０６ｂの各フラグメントイオンセット２１１２ａ〜ｂと比較されて、マッチするｍ／ｚとマッチするフラグメントイオン強度比の基準を満たす、少なくとも閾値数のマッチするフラグメントがそれらの間にあるか否かが判断される。第１のフラグメントイオンセット２１１０ａは、フラグメントイオンセット２１１２ａと比較されて、２つのセット間でマッチするフラグメントの数が決定される。かかるマッチは、ある指定の許容差内で同じｍ／ｚを有するマッチするフラグメントを探してもよい。２１１０ａ及び２１１２ａに関するこの例では、両方のセットのＦ１〜Ｆ３がマッチするｍ／ｚ値を有するものと仮定する。
それに加えて、フラグメントイオン強度比基準がセット２１１０ａ及び２１１２ａの間で満たされなければならない。２１１０ａなどのフラグメントイオンセットの場合、フラグメントイオン強度比（ＦＩＩ）は、同じフラグメントイオンセット内の任意のフラグメントの最大強度に関して、その各フラグメントイオンＦｎに対して決定されてもよい。公式的には、これは次式のように表されてもよい。
ＦＩＩ Ｆｎ＝強度（Ｆｎ）／ＭＡＸフラグメント強度
式中、
Ｆｎは、ＦＩＩが決定されるフラグメントイオンセットのフラグメントイオンを表し、
ＭＡＸフラグメント強度は、Ｆｎとしての同じフラグメントイオンセット中の全てのフラグメントイオンの最大フラグメント強度を表す（例えば、フラグメントイオンセットが２１０６ａ又は２１０６ｂのどちらかによるものである場合）。
更に例証するため、ここまでは２１１０ａのＦ１〜Ｆ３が２１１２ａのＦ１〜Ｆ３に対してマッチするｍ／ｚ値を有するものと判断されており、それにより、結果として得られるフラグメントイオンセットがここまではＦ１〜Ｆ３を含み、Ｆ３がＦ１〜Ｆ３の最大強度を有する、フラグメントイオンセット２１１０ａについて検討する。本明細書の他の箇所の記載と同じく、２１１０ａのＦ１に対する第１のＦＩ、及び２１１２ｂのＦ１に対する第２のＦＩＩを決定し、次に上記第１のＦＩＩ及び第２のＦＩＩを比較して、ある指定の許容差内での上記第１のＦＩＩ及び第２のＦＥとのマッチを判断する、処理が行われてもよい。マッチしない場合、フラグメントイオンＦ１は、結果として得られるイオンフラグメントセットから除去され、処理を続けてもよい。ＦＩＩを決定し比較する上記処理は、結果として得られるフラグメントイオンセットの各Ｆｉに対して繰り返されてもよい。
処理のこの時点で、結果として得られるフラグメントイオンセットがＦ１〜Ｆ３を含み、２１１０ａ及び２１１２ｂのＦ１〜Ｆ３が、マッチするｍ／ｚ及びマッチするフラグメントイオン強度比基準を満たしていると判断されているものと仮定する。次に、結果として得られるフラグメントイオンセットが、少なくとも最小閾値数のフラグメントイオンを含むか否かを判断する処理が行われてもよい。例えば、一実施形態では、最小閾値数のフラグメントイオンは、次の整数値まで切り上げられて、Ｎ／２として表されてもよく、Ｎはセット２１１０ａにおけるフラグメントイオンの数であってもよい。結果として得られるフラグメントイオンセットが最小閾値数のフラグメントイオンを含む場合、処理は、全てのマッチング基準が満たされると判断してもよく、それにより、２１１０ａ及び２１１２ａは、マッチング基準にしたがってマッチするフラグメントイオンセットであるものと判断される。それに加えて、結果として得られるフラグメントイオンセットは、２１１２ａからのフラグメントイオンにマッチするフラグメントイオンセット２１１０ａの部分を同定する。別の方法として、結果として得られるフラグメントイオンセットが最小閾値数のフラグメントイオンを含まない場合、処理は、２１１０ａ及び２１１２ａがマッチするフラグメントイオンセットではないと判断してもよい。
上記例を続けると、Ｆ１、Ｆ２、及びＦ３は、２１１０ａのフラグメントイオンにマッチする２１１２ａのフラグメントイオンを表す、結果として得られるマッチするフラグメントイオンセットを形成すると判断されてもよい。２１１０ａと２１１２ａとの比較が、マッチするｍ／ｚ及びマッチするフラグメントイオン強度比のマッチング基準を満たす閾値数のフラグメントイオンに対するマッチをもたらさない場合、２１１０ａと２１１２ｂ、２１１０ａと２１１２ｃ、及び２１１０ａと２１１２ｄのフラグメントイオンを比較して、２２１２ｂ〜ｄのいずれかが２１１０ａに対するマッチであるか否かを判断することによって、処理を継続してもよい。同様の処理がまた、フラグメントイオン２１０６ａの各セットに対して行われてもよい（例えば、２１１０ｂを、２１１２ａ、２１１２ｂ、２１１２ｃ、及び２１１２ｄのそれぞれと比較する）。
上記例を続けると、Ｆ１、Ｆ２、及びＦ３は、２１１０ａのフラグメントイオンにマッチする２１１２ａのフラグメントイオンを同定する、結果として得られるマッチするフラグメントイオンセットを形成すると判断されている。かかるマッチに基づいて、処理は、修飾又は変異型が存在していると判断する。ここで、元の分子（例えば、元のＰＣＣ若しくはプリカーサー）に対する特定の修飾又は変異型を決定する処理が行われてもよい。この時点で、２１１０ａ及び２１１２ａと関連付けられた２つのＰＣＣ又はプリカーサーイオンのｍ／ｚ値間の差を計算することによって、プリカーサー又はＰＣＣの修飾のデルタ質量（Δ質量）を決定する処理が行われてもよい。２１１２ａと関連して、Ｐ３は、同じスキャンＸにおいて、フラグメントイオンセット２１１２ａとして出現してもよく、この例では、例えばＢａｔｅｍａｎ技術及び高−低プロトコル（本明細書の他の箇所に記載）を使用して、ＬＥ及びＨＥスキャンデータが生成されてもよいことが注目されるべきである。より一般的には、ＬＥ及びＨＥスキャンデータがどのように得られるかに応じて、プリカーサーＰ３は、スキャンＸによって表されるスキャンにおいて関連するフラグメントイオンを有するプリカーサーイオンであってもよい。また、単一のプリカーサーイオンＰ３のみが、アンマッチされ、またスキャンＸにおいてフラグメントイオンを有するものとして示されているが、２つ以上のプリカーサーイオンが単一のスキャンＸとそのように関連付けられてもよい（例えば、複数のプリカーサーイオンが、スキャンＸにおいてそれらのフラグメントイオンを有してもよい）ことが注目されるべきである。
この例では、Δ質量は、（２１１０ａにおける）Ｐ１の第１のｍ／ｚと（２１１２ａにおける）Ｐ３の第２のｍ／ｚとの間の差の絶対値として決定される。より一般的には、第１のイオンＩＸと第２のイオンＩＹとの間の質量差ＭＤは、次式のように表されてもよい。
ＭＤ＝ＡＢＳ（ＩＸ ｍ／ｚ−Ｉｙ ｍ／ｚ）
式中、
Ｉｘ ｍ／ｚはＩｘのｍ／ｚを表し、
Ｉｙ ｍ／ｚはＩｙのｍ／ｚを表し、
ＡＢＳは、差の数学的絶対値を表す。
ＭＤは、分子又はプリカーサーに対する修飾のｍ／ｚ差を表す、この例ではＰ１及びＰ３（Ｐ１＝Ｉｘ及びＰ３＝Ｉｙ）などの、２つのプリカーサーイオン又はＰＣＣに関して決定されてもよい。本明細書の技術による一実施形態は、表によって示されるような異なるプリカーサーの修飾をそれぞれ表す、ＭＤに対する異なる値によって索引付けされるルックアップテーブルを利用してもよい。例えば、一実施形態は、Ｕｎｉｍｏｄ．ｏｒｇを通して利用可能なものなど、分子に対して分かっている修飾又は変異型の表を使用してもよい。
次に、図２３を参照して、本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよい、表２２１０の一例について更に例証する。表２２１０は、列２２１２が対象のものであってもよい既知の修飾のｍ／ｚ差を含む、プリカーサーΔ質量修飾の表の一例である。ＭＤの値は、列２２１２のマッチする値（指定の許容差内のマッチ）を検索することによって、表２２１０に対するインデックスとして決定され使用されてもよい。計算されたＭＤ値が列２２１２の値にマッチする場合、対応するプリカーサー修飾に関する情報を得るため、表２２１０の行が検索されてもよい。要素２２２０は、表２２１０の最後の列にあるｍ／ｚ差を決定するのに利用される、モノアイソトピック質量を表してもよい。
プリカーサー修飾又は変異型の表２２１０は、本明細書の技術による特定の実施形態における対象にしたがって変動してもよいことが注目されるべきである。
計算されたＭＤ値と表の入力とでマッチが見出された場合、マッチした表入力によって表されるようなプリカーサーの修飾又は変異型があったものと判断される。
２２１０のマッチする表入力によって表されるプリカーサー修飾又は変異系に対応する、修飾されたプリカーサーのフラグメントに対するｍ／ｚ値を決定する、処理が行われてもよい。一実施形態は、例えば、シミュレータを使用して、表のマッチする入力によって提案される（例えば、Δ質量若しくはＭＤ一致によって提案される）修飾に対するフラグメント質量又はｍ／ｚ値を計算してもよい。
例えば、図２２及び上記例を再び参照して、上述されたように２１１２ａ及び２１１０ａの間でマッチが行われ、かかるマッチするフラグメントイオンセットに対して計算されたＭＤが表２２１０の入力にマッチし、それによってＭＤがプリカーサー修飾又は変異型に対応することを示すものと仮定する。上述のように、マッチしたイオン情報２１０６ａは、Ｐ１が、ライブラリ２１０７の対応するプリカーサー又はＰＣＣにマッチした、ＰＣＣ又はプリカーサーイオンであることを示す。この例では、Ｐ１は、修飾されている元のＰＣＣ又はプリカーサーイオンとして判断されてもよく、Ｐ１の特定のプリカーサー修飾又は変異型はＰ３によって表されてもよい（例えば、Ｐ３は、Ｐ３及びＰ１に関して計算されたＭＤに基づいて、２２１０のマッチする表入力によって表されるＰ１を修飾したもの又は変異型である）。
この時点で、シミュレータ又はモデリングソフトウェアを使用して、マッチする表入力によって提案される特定のプリカーサー修飾又は変異型に関して、予期されるフラグメントイオン及び関連するフラグメントイオンのｍ／ｚ値が決定されるか、又は理論的に計算されてもよい。シミュレータが、マッチする表入力によって表されるような、又は計算されたＭＤ値に基づいた、Ｐ１の修飾に関するフラグメントイオンのセットが、Ｆ１、Ｆ２’’、Ｆ３’’、Ｆ４であるものと仮定する（その場合、シミュレータは、フラグメントイオンＦ１、Ｆ２’’、Ｆ３’’、及びＦ４のそれぞれに対して、可能な他の情報と共にｍ／ｚ値を決定する）。以下のパラグラフにおける例証のため、Ｆ１、Ｆ２’’、Ｆ３’’、及びＦ４によって、プリカーサー修飾又は変異型の計算されたフラグメントイオンセットを形成させる。
次に、計算されたＭＤ値又は質量差によって提案されるように、プリカーサー修飾又は変異型を検証する処理が行われてもよい。かかる処理は、残留物２１０６ｂにおけるプリカーサー変異型のフラグメントイオンの１つ又は２つ以上を検索することを含んでもよい。より具体的には、かかる処理は、プリカーサー変異型Ｐ３のＰＣＣに対する溶出ピークのスキャン（例えば、図７は、ＰＣＣに対する溶出ピークのスキャンを示している）において、プリカーサー修飾の計算されたフラグメントイオンセットの修飾されたフラグメント（例えば、Ｆ２’’、Ｆ３’’、Ｆ４’’）の１つ又は２つ以上を検索してもよい。
例えば、図２２を再び参照すると、残留物２１０６ｂが、次のようなスキャンＹＹに関する別の行も含むものと仮定する。
スキャンＹＹ Ｐ３ Ｆ１ Ｆ２’’ Ｆ３’’
プリカーサーイオン又はＰＣＣ Ｐ３が関連するフラグメントＦ１、Ｆ２’’、及びＦ３’’の異なるセットと共に出現する、別のスキャンＹＹを表す。プリカーサー修飾又は変異型を検証するかかる処理は、Ｐ３によって表される修飾されたプリカーサーイオン又はＰＣＣが現れるスキャンＸ以外のスキャンに関して、残留物２１０６ｂを検索してもよい。この場合、Ｐ３は追加のスキャンＹＹに現れ、スキャンＹＹは、Ｐ３の溶出ピークのスキャンを表してもよい。Ｐ３が現れるマッチするスキャンＹＹに関して、修飾されたフラグメントＦ２’’、Ｆ３’’、又はＦ４’’のうち１つも現れるか否かが判断される。現れる場合、処理は、プリカーサー修飾又は変異型が存在することを確認し、そうでなければ、検証は、プリカーサー修飾又は変異型が存在することを確認しない。この例を続けると、修飾されたフラグメントＦ２’’及びＦ３’’は両方ともスキャンＹＹに現れ、それによってＰ３が、上述の計算されたＭＤ（例えば、計算されたＭＤにマッチする値を２２１２に有する表における入力）によって表されるような、特定のプリカーサー修飾又は変異型として確認又は検証される。
本明細書の技術にしたがって、一実施形態は、例えば、本明細書の他の箇所に記載されるようなＡＲ１及びＡＲ２の値を使用して、特定の修飾を更に検証する他の検証基準を更に利用してもよい。例えば、残留物２１０６ｂのイオン情報を使用して、Ｐ３が、図７に関連して本明細書に記載され例証されるようなスキャンにわたって追跡されてもよく、やはり本明細書に記載されるように、ＡＲ１及びＡＲ２値などの検証基準を使用して、Ｐ３に対する関係又は関連するフラグメントイオンのセットを決定する処理が行われてもよい。この場合、Ｐ３と関連付けられるフラグメントイオンのセットは、修飾されたフラグメントＦ２’’及びＦ３’’の１つ又は２つ以上を含むべきである。それに加えて、ＡＲ１などの検証基準を使用する本明細書の他の箇所の考察と同じく、Ｆ２’’に対して決定されるようなＡＲ１は、Ｐ３の溶出ピークのスキャンにわたって同じであるべきであり、Ｆ３’’に対して決定されるようなＡＲ１は、Ｐ３の溶出ピークのスキャンにわたって同じであるべきである。Ｐ３に対して決定されるＡＲ２値、並びにＦ２’’及びＦ３’’などのそのフラグメントは、Ｐ３の溶出ピークのスキャンにわたって同じであるべきである。例えば、Ｐ３の溶出ピークのスキャンＨ及びＭの場合、以下が（ある指定の許容差内で）真のままであるべきである。
スキャンＨにおけるＰ３の強度／スキャンＭにおけるＰ３の強度＝
スキャンＨにおけるＦ２’’の強度／スキャンＭにおけるＦ２’’の強度＝
スキャンＨにおけるＦ３’’の強度／スキャンＭにおけるＦ３’’の強度
上記は、少なくとも閾値数のフラグメントイオンに関して、フラグメントイオンセット２１１０ａ及び２１１２ａの間のマッチの判断に応答して行われる処理である。代替例として、次に、処理が、少なくとも閾値数のフラグメントイオンに関する、２１１０ａ及び２１１２ａの間のマッチを探索又は判断しない処理の場合について検討する。この場合、２１１０ａにおけるフラグメントイオンの数が、少なくとも４などの最小数である場合に、代替の処理が行われてもよい。かかる代替の処理は、（本明細書の他の箇所に記載されるように）ＭＤ値を決定することを含んでもよいが、このＭＤ値が、２１１０ａにおける「隣接する」フラグメントイオンの対に関する質量又はｍ／ｚ差を表すことが異なる。２つのプリカーサーイオン又はＰＣＣに関してＭＤについて上述されたようなかかる処理は、「隣接する」フラグメントイオンの対（例えば、２１１０ａのＦ１及びＦ２）に基づいて、ＭＤ値に対して繰り返されてもよい。ＰＩなど、特定のＰＣＣ又はプリカーサーイオンと関連付けられる、２１１０ａなどのフラグメントイオンに関して隣接するフラグメントイオンの対を決定する際、セット２１１０ａのフラグメントは、フラグメントの増加又は減少するｍ／ｚ値に関して順序付けられてもよい。２つのフラグメントイオンＦ１及びＦ２は、この文脈では、Ｆ１及びＦ２がｍ／ｚの順位において順序付けられた位置で互いに隣り合っている場合に、隣接していてもよい。
プリカーサーに対して決定されたＭＤ、又は上述されたようなフラグメントイオンの対に対するＭＤのどちらかが、表２１１０の質量Δ又は異なる入力にマッチしない場合に、かかるアンマッチしたＭＤは、表に組み込まれない、新しい若しくは追加のタイプ又はプリカーサー修飾を表してもよい。
図２４を参照すると、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい、処理ステップのフローチャート２３００が示されている。フローチャート２３００は上述されたような処理を要約している。ステップ２３０２で、質量又はｍ／ｚ差に基づいたプリカーサー修飾又は変異型の表が得られてもよい。表２２１０は、かかる表に含まれてもよい情報の一例である。ステップ２３０４で、処理されたサンプルに対して実験が行われ、実験データが得られてもよい。ステップ２３０４で、マッチしたイオン情報のセット２１０６ａ、及びイオン情報の残留又は残存セット２１０６ｂを得るため、教師ありクラスタリングも行われてもよい。処理は、ステップ２３０６で開始して、ライブラリ２１０７の対応するＰＣＣ又はプリカーサーイオンにマッチされた、ＰＣＣ又はプリカーサーイオンと関連付けられた２１０６ａの各フラグメントイオンセット全体を通して反復される。ステップ２３０６で、現在のフラグメントイオンセットが、マッチしたイオン情報２１０６ａの次のフラグメントイオンセットに割り当てられてもよい。ステップ２３０８で、マッチしたイオン情報２１０６ａの全てのフラグメントイオンセットが処理されているかについて判断が行われる。処理が行われた場合、処理は停止する。そうでなければ、ステップ２３０８が「はい」と評価した場合、制御はステップ２３１０に進んで、現在のフラグメントイオンセットと残留セットの同じスキャンにおけるフラグメントイオンの第２のセットとの間のマッチに関して、イオンの残留セット２１０６ｂを検索する。例えば、図２２を参照すると、ステップ２３１０の処理は、上述されるような２１１０ａ及び２１１２ａの間におけるマッチの判断をもたらしてもよい。ステップ２３１２で、残留物２１０６ｂ及びマッチしたイオン情報２１０６ａにおいて、マッチするフラグメントイオンセットが見出されるか否かについて判断が行われる。ステップ２３１２が「いいえ」と評価した場合、制御はステップ２３０６に進む。ステップ２３１２が「はい」と評価した場合、制御はステップ２３１４に進んで、マッチしたフラグメントイオンセットのＰＣＣ又はプリカーサーイオンに対するＭＤ値が決定される。ステップ２３１４は、例えば、図２２のＰ１及びＰ３に対するＭＤ値を決定してもよい。ステップ２３１６で、ＭＤ値に対してマッチする入力がプリカーサー又は修飾変異型の表で探索されるか否かに関して判断が行われる。ステップ２３１６が「はい」と評価した場合、制御はステップ２３２０に進む。ステップ２３２０で、ステップ２３１６でマッチしたプリカーサー変異型又は修飾のフラグメントイオンセットは、例えば、本明細書の他の箇所に示されるようなシミュレータを使用して、決定されてもよい。ステップ２３２２で、プリカーサー変異型又は修飾の存在を検証又は確認する検証処理が行われてもよい。例えば、本明細書に記載されるように、かかる検証処理は、プリカーサー修飾又は変異型（ステップ２３２０で生成されたような）及び残留物２１０６ｂに対して、シミュレートされたフラグメントイオンセットを使用して、Ｐ３がプリカーサー修飾又は変異型であることを確認してもよい。図２２及び上記例を参照すると、かかる検証処理は、残留物２１０６ｂにおける、Ｆ２’’又はＦ３’’などの修飾されたフラグメントの存在を検索してもよい。かかる検証処理は、例えば、イオンＰ３及び関連するフラグメントイオンＦ１、Ｆ２’’、及びＦ３’’に対して、ＡＲ１及びＡＲ２値を使用してもよい。ステップ２３２２から、処理はステップ２３０６に進む。
ステップ２３１６が「いいえ」と評価した場合、代替の処理が行われてもよい。本明細書に記載されるように、かかる処理は、２１０６ａのマッチしたプリカーサーイオン又はＰＣＣ Ｐ１に対して、２１１０ａに含まれる隣接するフラグメントイオンに関するＭＤ値を決定することを含んでもよい。
ジスルフィド結合ペプチドは、本明細書の技術を使用して同定され検証されてもよい。かかる技術について考察する前に、最初に、本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよいような、タンパク質の一例を示す図２５を参照する。タンパク質は、システイン（Ｃによって表される）、リジン（Ｋによって表される）、及びアルギニン（Ｒによって表される）などの様々なアミノ酸を含んでもよい。ジスルフィド結合は、要素２００２によって示されるように、システインに付着する。実験のためのサンプル調製及び処理の一部として、サンプル中のタンパク質に、様々な酵素消化（例えば、トリプシン）、及びペプチド切断を引き起こしてもよい他の処理が行われてもよい。一般的なペプチド切断部位は、例えば、アルギニン及びリジン部位を含んでもよい。
例えば、プロテオミクス分析中にタンパク質を質量分析によって同定するためのサンプル調製の一部として、ゲル内消化が行われてもよい。ゲル内消化は、例えば、タンパク質中のシステインの脱染、還元、及びアルキル化（Ｒ及びＡ）、タンパク質のタンパク質分解切断、並びに生成されたペプチドの抽出を含んでもよい。サンプル調製処理の一部として一般的に行われてもよいような、タンパク質に潜在的に埋め込まれたシスチン又はシステインの還元及びアルキル化（Ｒ及びＡ）によって、タンパク質のジスルフィド結合（例えば、２００２によって示されるようなもの）が不可逆的に破壊され、アミノ酸直鎖としてのタンパク質の三次構造が最適な展開が得られてもよい。かかるサンプル調製は、例えば、図２１と関連するものなど、本明細書に記載される様々なワークフローと関連して行われてもよい。
本明細書の技術による一実施形態は、システインがジスルフィド結合に関与しないシステイン含有ペプチドを同定する、ＰＡタンパク質構造の検証の一部として本明細書に記載されるような処理を行ってもよい。更に詳細に後述されるようなかかる処理と関連して、分析されるサンプルは、例えば、ゲル内消化を使用して調製されてもよく、それにより、サンプル調製は還元及びアルキル化（Ｒ及びＡ）を省略する。このようにして、サンプル中にシステイン又はシステインがあっても、本明細書に記載される技術を使用する後に続く検出に対して不活性のままである。例えば、図２１と関連して記載されるようにして生成される標的ＰＡライブラリを使用する教師ありクラスタリング技術は、システイン（ジスルフィド結合アンカーとして機能してもよい）を有する全てのペプチドを見つけるのに使用されてもよく、かかるシステインはやはりジスルフィド結合に関与しない。
本明細書の技術による一実施形態は、サンプル中にあるジスルフィド結合ペプチドを同定する処理を行ってもよい。更に詳細に後述されるように、標的ペプチド中に残留するシステインの存在によって、かかる処理が行われてもよい。ジスルフィド結合の局在化は、図２１と関連して記載されるような全てのシステイン含有ペプチドの線形配列を含む標的ライブラリ又はデータベースを使用して、本明細書に記載されるような教師ありクラスタリングを使用して行われてもよい。ジスルフィド結合ペプチド検出及び／又は検証に関して本明細書に記載される処理は、標的ライブラリ又はデータベースに問い合わせ、全てのシステイン含有ペプチドのＣＰＰＩＳを抽出することを含んでもよい。各システイン含有ＣＰＰＩＳのプロダクトイオンスペクトルは、生成される全てのＳＳＰＰＩＳプロダクトイオンスペクトルに対する他のペプチドと同様の方法でスクリーニングされてもよい。容認可能なクロマトグラフィピーク幅に及ぶＳＳＰＰＩＳの適切な数が同定された場合、ＣＰＰＩＳが作成される。正確に同定されたＳＳＰＰＩＳは、時間又はスキャン数の点で、溶出ペプチドに、スパンにわたる適切な強度分布（増加／減少）を説明する、マッチしたプロダクトイオン及びそれらの強度／面積を反映させる。マッチが見出されなかった場合、処理は次のシステイン含有ＣＰＰＩＳに移り、プロセスが繰り返される。統計的に有意な数のプロダクトイオン（例えば、指定の閾値数など）がマッチする場合、アルゴリズムは次に、任意のユーザ定義の数の可能なジスルフィド結合ペプチド間におけるΔｍ／ｚ値のマトリックス又は表を使用して処理を行う。次に、マッチしたペプチドとプリカーサーイオンのｍ／ｚとの間のΔｍ／ｚが計算され、マトリックスのΔｍ／ｚ値と比較される。マッチが見出された場合、処理は次に、検証及び結合の局在化のため、相手のペプチドのプロダクトイオンの比較に進む。統計的に有意な数のプロダクトイオンが２つのペプチドにマッチし、それらのＡＲ１及びＡＲ２比が全てのマッチしたＳＳＰＰＩＳにわたって繰り返された場合、ジスルフィド結合ＣＰＰＩＳが作成されてもよい。
本明細書の技術による一実施形態は、ジスルフィド結合ペプチドに対して更なる検証基準を使用してもよい。ジスルフィド結合に組み込まれた線形配列はそれぞれ、その実験値と一致しない、保持時間と、ＩＭＳが用いられる場合はドリフト時間とに存在する。実験において、治療薬は還元されアルキル化されて、システイン結合形成がないことが担保される。一貫したプロダクトイオンのセットが時間に伴って移動することにより、同定は不規則な事象へと大幅に制限される。ジスルフィド結合ペプチドの同定及び／又は検証に関する技術による一実施形態で行われてもよい処理は、以下のパラグラフで更に詳細に記載される。
ジスルフィド結合ペプチドを検出及び／又は同定する、本明細書の技術と関連する処理の第１の部分として、最初にサンプル中のＰＡの存在を検証するステップが行われてもよい。
図２６を参照すると、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい、例示のワークフローが示されている。２４２０によって示される第１の部分は、図２１と関連して本明細書の他の箇所に記載されるものと同様のステップを行うことを含んでもよい。実験２４０４ａは、ＰＡサンプル２４０２に対して行われる第１のかかる実験であってもよい。実験２４０４ａは、タンパク質消化及びＬＣ／ＭＳ又はＬＣ／ＩＭＳ／ＭＳ分析に対して行われるサンプル調製処理を含んでもよい。この第１の実験２４０４ａでは、サンプル調製は、還元及びアルキル化を行うことを含み、それにより、サンプル中の全てのシステインがジスルフィドを有さない（例えば、トリプシンペプチドのみを有する）ように修飾される。ＬＥ及びＨＥスキャンデータ２４０５ａが、実験２４０４ａに対して得られてもよい。ＬＥ及びＨＥスキャンデータ２４０５ａは、本明細書に記載される教師ありクラスタリング技術２４０６を使用して、教師ありクラスタリング標的ライブラリとして使用されるＰＡタンパク質のライブラリ２４０７を用いて更に処理されてもよい。
サンプルが２４０４ａに記載されるように調製された場合、ＰＡライブラリ２４０７内の全てのペプチドは、実験データセット２４０５ａの対応するイオン情報にマッチされるはずである。このように、一実施形態では、サンプル２４０２中におけるＰＡの存在は、ライブラリ２１０７の全てのペプチドを、教師ありクラスタリング２４０６を行った結果としての実験データセットのイオン情報に対してマッチさせることによって検証されてもよい。代替例として、サンプル２４０２中におけるＰＡの存在は、ライブラリ２４０７内の少なくとも指定された数のペプチドを、教師ありクラスタリング２４０６を行った結果としての実験データセット２４０５ａのイオン情報に対してマッチさせることによって検証されてもよい。処理の上記第１の部分はまた、ペプチドフラグメントの形成をもたらすタンパク質の化学又は酵素処理と、それに続く再現可能な形でのフラグメントの分離及び同定とを含む、タンパク質に対するアイデンティティ試験であるペプチドマッピングとも呼ばれることがある。
２４２０によって表される上記を行った後、同じＰＡサンプル２４０２の別の部分が、第２の実験２４０４ｂで処理されてもよい。サンプル調製を含む実験２４０４ｂは、実験２４０４ａと同じであってもよいが、実験２４０４ｂはサンプル調製を含み、還元及びアルキル化を行うのが省略される点が異なる。このようにして、サンプル処理は、２４０４ｂを介して分析されるサンプル中にある既存のジスルフィド結合を破壊しないように、還元及びアルキル化ステップを省略する。したがって、ジスルフィド結合がサンプル中に存在している場合、かかるジスルフィド結合は不活性のままであり、サンプル処理で破壊されない。
ＬＥ及びＨＥスキャンデータ２４０５ｂが、第２の実験２４０４ｂに対して得られてもよい。ＬＥ及びＨＥスキャンデータ２４０５ｂは、本明細書に記載される教師ありクラスタリング技術２４０９（例えば、図１４Ａのものなど）を使用して、教師ありクラスタリング標的ライブラリとして使用されるＰＡタンパク質のライブラリ２４０７を用いて更に処理されてもよい。ＰＡライブラリ２４０７は、２４２０のワークフローを行った結果として生成されてもよいことが注目されるべきである。
２４０９で教師ありクラスタリングを行った結果として、実験データセット２４０５ｂの対応するイオン情報にマッチしなかった、ライブラリ２１０７のペプチド又はプリカーサーイオン（若しくはＰＣＣ）及び関連するフラグメントイオン（例えば、ＣＰＰＩＳ）を同定する、またかかるペプチド又はプリカーサーもシステインを含有する、情報の第１のセット２４０６ａが得られてもよい。それに加えて、２４０９の処理の結果として、実験データセット２４０５ｂのアンマッチしたイオンの残留又は残存セット（例えばアンマッチしたＰＣＣ及びアンマッチしたフラグメントイオン）を表す、情報の第２のセット２４０６ｂが得られてもよい。アンマッチしたイオン２４０６ｂの残留又は残存セットは、各スキャンにおいてライブラリのペプチド（例えば、ＰＣＣ又はプリカーサー）にアンマッチした実験データセットＢ ２４０５ｂのイオンのセットを含んでもよい。
したがって、要素２４０６ａは、実験データセット２４０５ｂの対応するイオン情報に対して同定又はマッチされなかった、またジスルフィド結合の形成に必要なシステインアミノ酸を含有する、ＰＡのペプチド又はプリカーサー（例えば、要素２４０６ａは、ＰＡライブラリのアンマッチした標的を表す（例えば、システインを含有し、また実験データセットＢ ２４０５ｂのイオン情報に対してマッチしなかった、ライブラリ２４０７のＰＣＣ、ペプチド、又はプリカーサーイオン）を表す）。２４０６ａで同定されるようなＰＡライブラリのアンマッチしたシステイン含有ペプチド又はプリカーサー標的から、ここで、かかるアンマッチしたシステイン含有ペプチド又はプリカーサーイオンそれぞれのプロダクトイオンスペクトル（例えば、ＣＰＰＩＳ）を有し、それにより、プロダクトイオンスペクトルは関連するペプチド又はプリカーサーイオンのフラグメンテーションから発することが予期されるフラグメントイオンを表す。この例では、２４０６ａは、ライブラリ２４０７が、教師ありクラスタリング２４０９によって、実験データセットＢ ２４０５ｂの対応するプリカーサー及びフラグメントイオン情報に対してマッチしなかった、プリカーサー又はペプチドＰ１及びＰ２を含むことを表す。それに加えて、２４０６ａは、ライブラリが、ライブラリの標的プリカーサーＰ１に対する標的フラグメントイオンセット２４１０ａも含むこと、またライブラリが、ライブラリの標的プリカーサーＰ２に対する標的フラグメントイオンセット２４１０ａも含むことを示す。
本明細書の技術によれば、２４０５ｂと比較して、２４０５ａにおいて異なる保持時間をそれぞれ有する、プリカーサー又はペプチド２４０６ａを同定する処理が行われてもよい。例えば、本明細書に記載されるような異なるスキャンにわたってプリカーサー又はペプチドのＰＣＣを追跡して、異なるスキャン（図７に示されるものなど）にわたって溶出ピーク又はプロファイルを決定する処理が行われてもよく、それにより、追跡されたプリカーサーが最大強度を有する頂点又はスキャンが、その適切な保持時間として決定されてもよい。第２の実験においてプリカーサーがジスルフィド結合ペプチドではない場合、２つの同じ追跡されたプリカーサー又はペプチドが、２４０５ａ及び２４０５ｂで同じ保持時間を有することが予期される。したがって、プリカーサーＰ１がジスルフィド結合ペプチドに含まれる場合、Ｐ１は、２４０５ａ及び２４０５ｂで異なる保持時間を有することが予期される。同様に、プリカーサーＰ２がジスルフィド結合ペプチドに含まれる場合、Ｐ２は、２４０５ａ及び２４０５ｂで異なる保持時間を有することが予期される。ＩＭＳが実験２４０４ａ、２４０４ｂで利用される場合、Ｐ１又はＰ２などのプリカーサーが第２の実験２４０４ｂにおいてジスルフィド結合ペプチドに含まれる場合は、そのプリカーサーはまた、２４０５ａ及び２４０５ｂにおいて異なるドリフト時間又は異なる若しくは衝突する断面積（ＣＣＳＡ２）を有することが予期されることが注目されるべきである。
この例に関して、Ｐ１及びＰ２の両方が、２４０５ａ及び２４０５ｂにおいて異なる保持時間及びドリフト時間を有する、ライブラリ２４０７のアンマッチしたシステイン含有標的ペプチド又はプリカーサーであるものと仮定する。Ｐ１及びＰ２の組み合わせと関連付けられる閾値数のフラグメントイオンが、同じスキャンで残留物中に現れるか否かを判断する、残留物２４０６ｂを検索する処理が行われてもよい。例えば、この例では組み合わせフラグメントイオンセット（ＣＦＩＳ）＝｛Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３，Ｆ４，Ｆ５｝である、フラグメントイオンセット２４１０ａ及び２４１０ｂの合併集合を形成し、次に、同じスキャンにおいてＣＦＩＳの少なくとも閾値数のフラグメントにマッチする残留物２４０６ｂを検索する、処理が行われてもよい。この例における例証のため、スキャンＴは、２４１０ａ及び２４１０ｂに基づいてＣＦＩＳの全てのフラグメントイオンを含み、それによって、同じスキャンＴにおいて残留物２４０６ｂ中にシステインが現れる２つのペプチドＰ１及びＰ２を表すと判断されてもよい。
Ｐ１及びＰ２の間にジスルフィド結合を含む、新しい分子Ｍｎｅｗの理論上の質量を決定する処理が行われてもよく、その分子は次式のように表されてもよい。
Ｍｎｅｗ＝Ｍ１＋Ｍ２−（ｃ×水素の質量）
式中、
Ｍ１はＰ１の質量（例えば、Ｐ１のモノアイソトピック質量であってもよい）、
Ｍ２はＰ２の質量（例えば、Ｐ２のモノアイソトピック質量であってもよい）、
ｃは、Ｐ１及びＰ２の間のシステイン結合又はアンカーの数を表す０よりも大きい整数、並びに、
水素の質量は、約１．００７原子質量単位（ａｍｕ）である水素の原子質量を表す。
シミュレータ又はモデリングソフトウェア２０２１が、Ｍｎｅｗに対して理論上可能なｍ／ｚを決定するのに使用されてもよい。例えば、Ｍｎｅｗは、シミュレータが決定してもよい、＋３、＋５、及び＋７など複数の電荷状態を有してもよい。このように、シミュレータは、Ｍｎｅｗが２４０５ｂなどの実験データセットに現れてもよい、かかる複数の電荷状態に対する理論上のｍ／ｚ値を決定してもよい。したがって、かかるｍ／ｚ値はそれぞれ、ＭｎｅｗのＰＣＣのｍ／ｚに対応する。
次に、処理は続いて、Ｍｎｅｗに対する（シミュレータによって決定されるような）ｍ／ｚ値の１つにマッチするｍ／ｚに関して、２４０５ｂのＬＥスキャンデータを検索してもよい。例えば、シミュレータは、２４０５ｂのＬＥスキャンデータの対応するｍ／ｚ値にマッチされる、Ｍｎｅｗに対する第１のｍ／ｚ値を決定するものと仮定する。第１のｍ／ｚ値はＭｎｅｗのＰＣＣ＋３に対するｍ／ｚを表すものと仮定する。２４０５ｂのＬＥスキャンデータを検索して、ＭｎｅｗのＰＣＣ＋３に対するｍ／ｚを含む全てのスキャンが決定される。ＭｎｅｗのＰＣＣ＋３に対する第１のｍ／ｚ値が２４０５ｂのＬＥスキャンデータの任意のスキャンに現れる場合に、ジスルフィド結合ペプチドＭｎｅｗの存在又は検証が確認されてもよい。
次に、Ｍｎｅｗと関連付けられる、又はそれから発する、２４０５ｂのフラグメントイオンを決定する処理が行われてもよい。シミュレータを使用して、ジスルフィド結合ペプチド対Ｐ１及びＰ２の分子である分子Ｍｎｅｗに対して、全ての理論上のフラグメントイオンが計算されてもよい。分子Ｍｎｅｗに対するかかる理論上のフラグメントイオンは、実験データセットＢ ２４０５ｂに関して行われる教師ありクラスタリングの標的ライブラリとして使用される、新しいライブラリＬ１に含まれてもよい。本明細書の他の箇所の説明と同じく、かかる教師ありクラスタリングによって、ＭｎｅｗのＣＰＰＩＳが生成され、ジスルフィド結合分子又はペプチドＭｎｅｗはＰ１及びＰ２を含む。
上記例は、ジスルフィド結合対Ｐ１及びＰ２を含むペプチドであるＭｎｅｗの検出及び同定を示しており、Ｐ１及びＰ２は、教師ありクラスタリング２４０９によって、実験データセットＢ ２４０５ｂの対応するプリカーサー及びフラグメントイオン情報にマッチされなかった、標的ライブラリ２４０７の標的ペプチド又はプリカーサーイオンを表すことが注目されるべきである。したがって、Ｐ１及びＰ２は、ジスルフィド結合ペプチド対として含まれてもよい、ペプチド又はプリカーサー候補を表してもよい。ジスルフィド結合ペプチド対の候補であるペプチド又はプリカーサーはまた、ライブラリ２４０７の「マッチした」標的ペプチド又はプリカーサー（例えば、教師ありクラスタリングによって、実験データセットＢ ２４０５ｂの対応するプリカーサー及びフラグメントイオン情報にマッチされた、２４０７のペプチド又はプリカーサー）を含んでもよいが、かかるマッチした標的ペプチド又はプリカーサーは、かかるマッチした標的ペプチドをジスルフィド結合対に含むことと一貫する、他の異常な又は予期されない挙動を呈する。例えば、Ｐ３は、ライブラリ２４０７のマッチした標的プリカーサー又はペプチドを表すものと仮定する。Ｐ３は、２４０５ａ及び２４０５ｂにおいて異なる強度挙動を呈してもよい。実験２４０４ａ及び２４０４ｂが、上述されるようなサンプル処理における違い（２４０４ａは、２４０２の任意のジスルフィド結合対を破壊するサンプル処理を含み、２４０４ｂは、かかるサンプル処理を省略し、２４０２の任意の既存のジスルフィド結合対を保存する）以外は複製であるものと見なされてもよいことを想起する。したがって、同じペプチド、プリカーサー、又はＰＣＣが、２４０５ａ及び２４０５ｂの両方において類似の挙動を呈するはずである。例えば、Ｐ３は、Ｐ３にジスルフィド結合対が関与しない場合、両方の実験においてほぼ同じスキャン及びほぼ同じドリフト時間でその最大強度を有することが予期される。Ｐ３はまた、両方の実験において同じスキャンで類似の強度を呈するはずである。例えば、２４０５ａ及び２４０５ｂにおいて同じスキャンＳ１に対して、Ｐ３は、両方の実験において（ある許容差内で）ほぼ同じ強度を有するはずである。同様に、Ｐ３から発するフラグメントイオンもまた、両方の実験において同じスキャンで類似の強度を有するはずである。更に、Ｐ３及びそのフラグメントのＡＲ２値は、２４０５ａ及び２４０５ｂの両方で一貫しているはずである。例えば、Ｐ３の第１のＡＲ２値は、実験データセットＡ ２４０５ａのＬＥスキャンデータの２つのスキャンＳ１及びＳ２におけるＰ３の強度に関して計算されてもよく、Ｐ３の第２のＡＲ２値は、実験データセットＢ ２４０５ｂのＬＥスキャンデータの同じ２つのスキャンＳ１及びＳ２におけるＰ３の強度に関して計算されてもよく、それにより、Ｐ３がデータセットＢ ２４０５ｂを有する第２の実験においてジスルフィド結合に含まれない場合、第１のＡＲ２値及び第２のＡＲ２値は、ほぼ同じであることが予期される。同様に、Ｐ３のフラグメントイオンのＡＲ２値も、Ｐ３がデータセットＢ ２４０５ｂを有する第２の実験においてジスルフィド結合に含まれない場合、ほぼ同じであることが予期される。したがって、マッチした標的ペプチド又はプリカーサーＰ３の一貫しない又は異常な挙動を検出するのに、かかる強度及び／又は強度比の比較が使用されてもよく、それによって、Ｐ３がまた、２４０６ａのアンマッチした標的ペプチド又はプリカーサーと共に考慮されるべき候補のペプチド又はプリカーサーであることが表される。
図２７を参照すると、サンプル中におけるジスルフィド結合対の存在を検出する、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理のフローチャートが示されている。フローチャート２５００は上述された処理を要約している。
ステップ２５０２で、還元及びアルキル化を行い、それによって任意の既存のジスルフィド結合を破壊することを含む調製処理を使用して、ＰＡを含むサンプルを用いて第１の実験が行われてもよい。第１の実験データセットＡが、第１の実験に対して得られてもよく、教師ありクラスタリングが行われてもよい。教師ありクラスタリングで使用されるＰＡの標的ライブラリには、最初に、本明細書の他の箇所で言及されるシミュレータ又はモデリングソフトウェアなどを使用して、理論上のフラグメントイオン情報が取り込まれてもよい。かかる教師ありクラスタリングによって、サンプルがＰＡを含むことが検証され、また、標的ライブラリがデータセットＡからの実実験データを用いて更新されてもよい。
ステップ２５０４で、同じサンプルを使用し、調製処理が還元及びアルキル化を省略することによって任意の既存のジスルフィド結合を不活性なままにする点以外はステップ２５０２と同じ実験を行う、第２の実験が行われてもよい。第２の実験データセットＢが、第２の実験に対して得られてもよく、教師ありクラスタリングが行われてもよい。教師ありクラスタリングで使用される標的ライブラリは、ステップ２５０２の教師ありクラスタリングで更新されるような、ＰＡの更新された標的ライブラリであってもよい。ステップ２５０４における教師ありクラスタリングの結果として、標的ＰＡライブラリのマッチされなかった標的プリカーサー又はペプチドのセット２４０６ａが、教師ありクラスタリングで標的ＰＡライブラリにマッチされなかったイオンのスキャンを含む、残留又は残存セット２４０６ｂと共に決定されてもよい。
ステップ２５０６で、候補のペプチド又はプリカーサーの対Ｐ１及びＰ２が、指定の基準を満たすことが判断されてもよい。上述されるように、かかる基準は、それぞれの候補が少なくとも１つのシステインを含むと判断すること、対のフラグメントイオンの閾値数が単一のスキャンで第２の実験データセットＢの残留物に現れると判断すること、それぞれの候補が、実験データセットＡ及びＢにおいて異なる保持時間（及び、ＩＭＳが行われる場合は異なるドリフト時間）を有すると判断すること（例えば、実験データセットＡ及びＢの異なるスキャンにおける、関連する最大強度）、各候補が、マッチされなかった標的プリカーサー若しくはペプチドセット２４０６ａにあるか、あるいはライブラリの標的プリカーサーにマッチされ、また異常な又は一貫しない挙動を呈することを含んでもよい。プリカーサー又はペプチド候補のかかる一貫しない挙動は、サンプル中のジスルフィド結合に含まれていない候補に対して一貫しない。
ステップ２５０８で、ジスルフィド結合対としてＰ１及びＰ２を含む分子のＭｎｅｗが計算されてもよい。ステップ２５１０で、シミュレータ又はモデリングソフトウェアを使用して、Ｍｎｅｗが存在してもよいＰＣＣの様々な電荷状態が決定されてもよい。異なる電荷状態を有するかかるＰＣＣそれぞれについて、対応するｍ／ｚ値が決定されてもよい。ステップ２５１２で、第２の実験データセットＢのＬＥスキャンデータを検索して、ＭｎｅｗのＰＣＣのうち１つに対するｍ／ｚ値とマッチする、ＬＥスキャンデータにおけるｍ／ｚが探索されてもよい。ステップ２５１４で、かかるマッチするｍ／ｚが第２の実験データセットＢのＬＥスキャンデータにおいて探索されているか否かの判断が行われる。ステップ２５１４が「いいえ」と評価した場合、制御はステップ２５１６に進んで、第１及び第２の実験の両方で分析されるサンプル中の分子又はペプチドにおいて、Ｐ１及びＰ２がジスルフィド結合対を形成しないという判断が行われる。ステップ２５１４が「はい」と評価した場合、制御はステップ２５１８に進んで、第１及び第２の実験の両方で分析されるサンプル中の分子又はペプチドＭｎｅｗにおいて、Ｐ１及びＰ２がジスルフィド結合対を形成するという判断が行われる。制御は、ステップ２５２０に進んで、シミュレータ又はモデリングソフトウェアなどを使用して、Ｍｎｅｗに対する理論上のフラグメントイオンセットを計算し、最初に、Ｍｎｅｗの標的ライブラリにかかる情報を取り込む。Ｍｎｅｗ標的ライブラリは、第２の実験データセットＢに関して行われる教師ありクラスタリングの標的ライブラリとして使用されて、Ｍｎｅｗに対するＣＰＰＩＳが決定されてもよい。このように、Ｍｅｗ標的ライブラリはかかるＣＰＰＩＳ情報を用いて更新されてもよい。
ステップ２５０６で始まるステップが、候補のペプチド又はプリカーサーの単一の対に関するフローチャート２５００に示されていることが注目されるべきである。かかる処理は、候補のかかる対それぞれに対して繰り返されてもよい。
本明細書の技術による一実施形態はまた、サンプルが任意の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含むか否かを検出して同定する処理を行ってもよい。かかる技術は、同定されたジスルフィド結合対に関して本明細書に記載されるようなものに類似した処理を行うことを含んでもよい。当該分野で知られているように、ＡＤＣは、がん患者の治療向けに標的治療として設計された、非常に強力なバイオ薬物の分類として特徴付けられてもよい。ＡＤＣは、安定結合、化学結合、不安定な結合を有するリンカーを介して、生物活性細胞毒性（抗がん）ペイロード又は薬物（本明細書では、細胞毒性薬物若しくは複合体とも呼ばれる）とリンクされた抗体を含む、複雑な分子である。このように、細胞毒性薬物又は複合体は、抗体のペプチドの特定のアミノ酸（例えば、システイン若しくはその他）で、抗体に付着又はリンクされてもよい。
ＡＤＣを展開する際、抗がん剤（例えば、細胞毒素又は細胞毒）は、特定の腫瘍マーカー（例えば、理想的には、腫瘍細胞の中若しくは上にのみ見出されるタンパク質）を特異的に標的にする、抗体に結合される。抗体は、体内のこれらのタンパク質を追跡し、それらをがん細胞の表面に付着させる。抗体と標的タンパク質（抗原）との間の生化学反応によって、腫瘍細胞内の信号が作動し、それが次に抗体を細胞毒性薬物と共に吸収又はインターナライズする。ＡＤＣがインターナライズされた後、細胞毒性薬物が解放され、がんを死滅させる。この標的化により、理想的には、薬物は副作用が少なく、他の化学療法薬物よりも広い治療ウィンドウをもたらす。
図２８を参照すると、サンプル中におけるＡＤＣの存在を検出する、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい処理のフローチャート２６００が示されている。２６００においてＡＤＣがサンプル中に存在するか否かを判断する処理が行われる特定のＡＤＣに関して、細胞毒性薬物が後退に付着する地点、リンカーの質量、及び細胞毒性薬物又は複合体の質量を同定する、標的アミノ酸を含む入力が提供されてもよい。後続のステップに記載されるような処理と関連して、複合体又は細胞毒性薬物はシステインアミノ酸に付着してもよい。しかしながら、より一般的には、複合体又は細胞毒性薬物は、抗体のペプチドの任意のアミノ酸に付着してもよい。
ステップ２６０２、２６０４、２６０６、２６０８、２６１０、２６１２、２６１４、２６１６、２６１８、及び２６２０はそれぞれ、図２７のステップ２５０２、２５０４、２５０６、２５０８、２５１０、２５１２、２５１４、２５１６、２５１８、及び２５２０と類似していることが注目されるべきである。
ステップ２６０２で、第１の実験が、ＰＡを含むサンプルを用いて行われてもよい。サンプルは、例えば、当該分野で知られているタンパク質消化技術を行うことによって処理されてもよい。例えば、かかるサンプル調製処理は、還元及びアルキル化を行うことを含んでもよい。調製されたサンプルは、次に、クロマトグラフィ分離、質量分析、ＩＭＳなどを含む実験を行うことによって分析されてもよい。第１の実験データセットＡが、第１の実験に対して得られてもよく、教師ありクラスタリングが行われてもよい。教師ありクラスタリングで使用されるＰＡの標的ライブラリには、最初に、本明細書の他の箇所で言及されるシミュレータ又はモデリングソフトウェアなどを使用して、理論上のフラグメントイオン情報が取り込まれてもよい。かかる教師ありクラスタリングによって、サンプルがＰＡを含むことが検証され、また、標的ライブラリがデータセットＡからの実実験データを用いて更新されてもよい。
ステップ２６０４で、ステップ２６０２と同じサンプルを使用し、同じ実験を行う第２の実験、及び同じサンプル処理が行われてもよい。第２の実験データセットＢが、第２の実験に対して得られてもよく、教師ありクラスタリングが行われてもよい。教師ありクラスタリングで使用される標的ライブラリは、ステップ２６０２の教師ありクラスタリングで更新されるような、ＰＡの更新された標的ライブラリであってもよい。ステップ２６０４における教師ありクラスタリングの結果として、標的ＰＡライブラリのマッチされなかった標的プリカーサー又はペプチドのセット（例えば、２４０６ａ）が、教師ありクラスタリングで標的ＰＡライブラリにマッチされなかったイオンのスキャンを含む、残留又は残存セット（例えば、２４０６ｂ）と共に決定されてもよい。
ステップ２６０６で、候補のペプチド又はプリカーサーＰ１が、指定の基準を満たすことが判断されてもよい。２５０６は候補の対を決定し、ステップ２６０６は単一の候補を決定することが注目されるべきである。ＡＤＣを用いて、かかる基準は、候補が、少なくとも１つのシステイン、又は細胞毒性薬物が付着する他の標的アミノ酸を含有すると判断することを含んでもよい。これは、検出又は同定される特定のＡＤＣに対する入力として提供される標的アミノ酸である。かかる基準は、候補Ｐ１に対する閾値数のフラグメントイオン（かかるフラグメントイオンが、ＰＡの標的ライブラリで指定される場合）が、第２の実験データセットＢの残留物において単一のスキャンで現れると判断することを含んでもよい。かかる基準は、候補Ｐ１が、実験データセットＡ及びＢ（例えば、実験データセットＡ及びＢの異なるスキャンにおける関連する最大強度）において、異なる保持時間（及び、ＩＭＳが行われる場合は異なるドリフト時間）を有すると判断することを含んでもよい。かかる基準は、候補Ｐ１が、マッチされなかった標的プリカーサー又はペプチドセット２４０６ａにあるか、あるいはライブラリの標的プリカーサーにマッチされず、また異常な若しくは一貫しない挙動を呈すると判断することを含んでもよい。プリカーサー又はペプチド候補のかかる一貫しない挙動は、サンプル中のＡＤＣに含まれていない候補に対して一貫しない。かかる非一貫性は、ジスルフィド結合の検出及び同定と関連して記載され、また、本明細書に記載される処理と関連して、第１及び第２の実験の差に関してなどの異常な又は一貫しない挙動を呈する、ライブラリのマッチした標的プリカーサー又はペプチドであってもよい、候補Ｐ１を決定するのに使用されてもよい。
ステップ２６０８で、Ｐ１、指定のリンカー、及び指定の細胞毒性薬物又は複合体を含む、ＡＤＣに関する質量を表すＭｘが計算されてもよい。Ｍｘは、上記のそれぞれに関する質量の合計として計算されてもよい。
ステップ２６１０で、シミュレータ又はモデリングソフトウェアを使用して、Ｍｘ、ＡＤＣが存在してもよいＰＣＣの様々な電荷状態が決定されてもよい。異なる電荷状態を有するかかるＰＣＣそれぞれについて、対応するｍ／ｚ値が決定されてもよい。ステップ２６１２で、第２の実験データセットＢのＬＥスキャンデータを検索して、ＭｘのＰＣＣのうち１つのｍ／ｚ値にマッチするＬＥスキャンデータのｍ／ｚが探索されてもよい。ステップ２６１４で、かかるマッチするｍ／ｚが第２の実験データセットＢのＬＥスキャンデータにおいて探索されているか否かの判断が行われる。ステップ２６１４が「いいえ」と評価した場合、制御はステップ２５１６に進んで、第１及び第２の実験の両方で分析されるサンプルのＡＤＣにＰ１が含まれないという判断が行われる。
ステップ２６１４が「はい」と評価した場合、制御はステップ２６１８に進んで、Ｐ１がＡＤＣに含まれ、ＡＤＣが第１及び第２の実験の両方で分析されるサンプルに含まれるという判断が行われる。制御は、ステップ２６２０に進んで、（シミュレータ又はモデリングソフトウェアなどを使用して）関連する質量Ｍｘを有するＡＤＣに対する理論上のフラグメントイオンセットが計算される。ＡＤＣの理論上のフラグメントイオンセットは、最初に、ＡＤＣの標的ライブラリに取り込むのに使用されてもよい。ＡＤＣ標的ライブラリは、第２の実験データセットＢに関して行われる教師ありクラスタリングの標的ライブラリとして使用されて、ＡＤＣに対するＣＰＰＩＳが決定されてもよい。このように、ＡＤＣ標的ライブラリはかかるＣＰＰＩＳ情報を用いて更新されてもよい。
ステップ２６０６で始まるステップが、単一のペプチド又はプリカーサー候補Ｐ１に関するフローチャート２６００に示されていることが注目されるべきである。かかる処理は他の候補に対して繰り返されてもよい。
次に、多重モード獲得（ＭＭＡ）と本明細書では呼ばれる技術について記載する。一態様では、ＭＭＡは、ＤＤＡとＢａｔｅｍａｎ技術、又は本明細書の他の箇所に記載される高−低プロトコルデータ獲得技術の組み合わせを含むものとして特徴付けられてもよい。ＭＭＡは、１つ又は２つ以上の更なる分離の次元に対する処理と組み合わせて、質量分析を行うことを含んでもよい。例えば、ＭＭＡはＬＣ／ＭＳ分析を含んでもよく、またＭＳを行うことを含んでもよい。以下のパラグラフで更に詳細に記載されるように、ＭＭＡは、可変サイズの質量分離ウィンドウ（ＭＩＷ）の連続的分離を提供し、それにより、ＭＩＷの幅（例えば、質量フィルタ処理若しくは選択を行うＭＳの四重極）が溶出時間にわたって調整される。一実施形態では、溶出時間範囲は、本明細書ではバケット又はビンと呼ばれる均等な部分に分割されてもよい。ＭＩＷの幅は変動されてもよく、幅は、特定の時間のバケット又はビン内にあるプリカーサーイオンの数の関数である。言い換えると、本明細書に記載されるＭＭＡ技術による一実施形態は、例えば、後続のフラグメンテーションのために第１のフィルタ処理四重極に入るプリカーサーイオンの数をほぼ同じに保つように、ＭＩＷ幅を時間にわたって変動させてもよい。上記の目標は、単一のサイクル内で、それぞれ異なる連続したＭＩＷを用いてフラグメンテーションされたほぼ同じ数のプリカーサーイオンを有することである。
ＭＭＡを用いて、最小ｍ／ｚ値から最大ｍ／ｚ値までのｍ／ｚ値の合計範囲が指定されてもよい。ｍ／ｚ値の合計範囲は複数のｍ／ｚ間隔に分割されてもよい。各ｍ／ｚ間隔は、ｍ／ｚ値の合計範囲内の上界及び下界を有する。以下のパラグラフに記載されるものなどのいくつかの実施形態では、ｍ／ｚ間隔はｍ／ｚ範囲の点で重なり合ってもよい。それぞれ異なるｍ／ｚ間隔に対してＭＭＡ技術と関連して行われる処理は、本明細書では、異なるサイクルと呼ばれることがある。例えば、合計ｍ／ｚ値範囲は、「ｎ」個のｍ／ｚ間隔に分割されてもよく、それにより、ｍ／ｚ間隔「ｉ」（１≦ｉ≦ｎ）に対してＭＭＡと関連して行われる処理は、サイクルｉと呼ばれることがある。
考慮されるｍ／ｚ値の合計範囲の特定の最小及び最大ｍ／ｚ値は、例えば、特定のサンプル（例えば、小分子、単一のタンパク質若しくは抗体、複数の未知のタンパク質の複雑な構造のサンプル）、行われる特定のサンプル処理（例えば、どの特定の酵素が使用されるか）など、１つ又は２つ以上の要因に伴って変動してもよい。例えば、本発明者らは、サンプルの一般的なトリプシン分析に関して実験のシミュレーションを行っており、一般に、シミュレートした実験の全てのイオンのうちほぼ５０％が、一般的なトリプシン分析に対して約３５０〜１３５０の合計ｍ／ｚ範囲内にあるｍ／ｚ値を持つイオンを有すると判断している。合計ｍ／ｚ範囲は、特定の分析、及び分析される対象のサンプルに伴って変動してもよいことが注目されるべきである。したがって、サンプル、実験、サンプル処理等に伴って変動してもよい、かかる１つ又は２つ以上の要因に基づいて、ｍ／ｚ値の合計範囲は、以下のパラグラフに記載されるＭＭＡ技術と共に使用することが指定されてもよい。
図２９を参照すると、溶出時間にわたるプリカーサーイオンの数に関する頻度又は計数の分布を示す一例が示されている。Ｙ軸上はｍ／ｚであり、Ｘ軸上は保持時間（ＲＴ）である。グラフにおける長方形又は点の太さは、特定のｍ／ｚ値を有する特定のＲＴビン又は範囲内におけるプリカーサーイオンの頻度又は数を表す。グラフ上のある地点における長方形又は点が大きいほど、グラフ上のその地点における特定のｍ／ｚ値及びＲＴと関連付けられたイオンの数又は頻度は多くなる。例えば、破線Ｑ及びＱ’の間の四角又は長方形は、プリカーサーイオンのほぼ５０％が約３５０〜１３５０の合計ｍ／ｚ範囲内にあることを示す。グラフ上の様々な長方形間の白い二等分線は、各ＲＴビンにおける中央値を表す。要素２８０２は、ＲＴビンのうち１つの中央値をそれぞれ表す３つのかかる線を同定する。
合計範囲の最小及び最大ｍ／ｚ値、異なるｍ／ｚ値を有するイオンの頻度に関する分布などは、以下のパラグラフに記載されるように、任意の好適な方法で得られてもよいことが注目されるべきである。例えば、一実施形態は、様々なサンプルに対して実際の実験を実施することによって、シミュレーションによってなどで、かかる情報を得てもよい。例えば、溶出時間にわたるプリカーサーイオンのｍ／ｚ値における頻度の分布に関する図２９に示される情報は、本明細書の他の箇所で考察されるものなどのシミュレータ又はモデリングソフトウェアを使用して得られてもよい。
例証のため、「ｎ」個のｍ／ｚ間隔又は区分に分割される３５０〜１３５０の合計ｍ／ｚ範囲が、ＭＭＡ技術の使用を例証するのに、後続の例及び説明と併せて使用されてもよい。しかしながら、合計ｍ／ｚ範囲は、一般に、所望のｍ／ｚ値の任意の範囲であってもよいことが注目されるべきである。
様々なｍ／ｚ値を有するプリカーサーイオンの数の頻度又は計数の分布に関する情報を、ＭＭＡ技術に使用して、ＭＩＷの幅又はサイズを変動させてもよい。以下のパラグラフに記載されるように、ＭＩＷのサイズ又は幅は、選択され、後に続くフラグメンテーションが行われるプリカーサーイオンの数が、サイクル内の溶出時間又はＲＴビンにわたってほぼ同じであるように選択されてもよい。
図２９に示されるのは、グラフ上にサイクルＡ、Ｂ、及びＣとして表される「ｎ」個のｍ／ｚ間隔のうち３つである。サイクルＡは、３５０〜５５０のｍ／ｚ間隔を有してもよい。サイクルＢは、４７５〜７００のｍ／ｚ間隔を有してもよい。サイクルＣは、５２５〜７５０のｍ／ｚ間隔を有してもよい。このように、図示される例では、異なるｍ／ｚ間隔又はサイクルのｍ／ｚ範囲が重なり合う。
ｍ／ｚ間隔の間に重なり合いがある場合、その特定の量が、本明細書に記載される処理と関連する入力として指定されてもよいことが注目されるべきである。例えば、第１の選択肢として、一実施形態は、ｎ個のサイクルと関連付けられるｍ／ｚ間隔の間に重なり合いがないことを示してもよい。第２の選択肢として、一実施形態は、それぞれ２つの連続するサイクル間に固定量の重なり合いが生じることを示してもよい。かかる重なり合いは、例えば、ｍ／ｚ値の絶対量又は数（例えば、２５）を示すことによって示されてもよい。別の選択肢として、一実施形態は、関数、式などに基づいてなど、２つの連続するサイクル間で重なり合いの量を変動させてもよい。
図３０を参照すると、本明細書の技術による一実施形態でサイクルＡ、Ｂ、及びＣと関連して使用されてもよいＭＩＷの更なる詳細を示す一例が示されている。
例２７００では、全体として、サイクルＡ、Ｂ、及びＣのそれぞれにおける異なるＭＩＷが示されている。この例の各サイクルは、１０のスキャンを含み、１つは低エネルギースキャン、１つは２７１１に示されるような最初のＭＩＷを網羅する上昇エネルギースキャン、８つは、そのサイクルに対してスケジューリングされた可変サイズのＭＩＷによる上昇エネルギースキャンである（例えば、図３１の２９３０につきなど）。本明細書の技術による一実施形態は、各サイクルの第１及び第２のスキャンに対して、Ｂａｔｅｍａｎ技術、本明細書の他の箇所に記載される又は高−低プロトコルデータ獲得技術を使用して、各サイクルの最初のＭＩＷ（例えば、最初のＭＩＷはサイクルに対する全ｍ／ｚ間隔である）に対するプリカーサー及び関連するフラグメントデータを得てもよい。後に続く各スキャン（３〜１０）は、そのサイクルのそのスキャンに対してスケジューリングされたＭＩＷ内のプリカーサーイオンのみのプロダクトイオンスペクトルを反映する。
サイクル１又はＡを参照すると、２７１０に示されるのは、ＭＩＷ幅を変動させ、各ＭＩＷ幅に対してサイクルＡ内で関連するｍ／ｚ範囲も変動させながら、溶出時間にわたって行われる四重極のプリカーサーイオンＭＩＷ（ＬＥ）及び上昇エネルギー（ＥＥ）又は高エネルギー（ＨＥ）における変動を表す、２つのタイムラインＬＥ及びＥＥである。同様に、サイクルＢを参照すると、２７２０に示されるのは、ＭＩＷ幅を変動させ、各ＭＩＷ幅に対してサイクルＢ内で関連するｍ／ｚ範囲も変動させながら、溶出時間にわたって行われる四重極のプリカーサーイオンＭＩＷ（ＬＥ）及び上昇エネルギーにおける変動を表す、２つのタイムラインＬＥ及びＥＥである。更に、サイクルＣと関連して、２７２０に示されるのは、ＭＩＷ幅を変動させ、各ＭＩＷ幅に対してサイクルＣ内で関連するｍ／ｚ範囲も変動させながら、溶出時間にわたって行われる四重極のプリカーサーイオンＭＩＷ（ＬＥ）及び上昇エネルギーにおける変動を表す、２つのタイムラインＬＥ及びＥＥである。
この例では、各サイクルに対して、スキャン１で表される第１のスキャンは、サイクルと関連付けられる全ｍ／ｚ間隔に対応するＭＩＷを使用する。例えば、サイクルＡの場合、要素２７１０は１０のスキャンを同定し、１つは、サイクルＡと関連付けられたｍ／ｚ間隔に対して全ｍ／ｚ範囲３５０〜５５０を表す。スキャン２は、最初のＭＩＷ（ｍ／ｚ＝３５０〜５５０）のプロダクトイオンスペクトルを反映する。３〜１０と番号付けされた残り８つのスキャンはそれぞれ、２９３０に示されるように、そのスキャンに対してスケジューリングされたＭＩＷウィンドウ内のプリカーサーイオンから発するフラグメントイオンのセットを反映する。
サイクルＡに関して記載したのと同様の方法で、サイクルＢの場合、要素２７２０は１０のスキャンを同定し、スキャン１は、全ｍ／ｚ範囲４７５〜７００を表し、スキャン２は、サイクルＢと関連付けられたｍ／ｚ間隔に対して最初のＭＩＷからのフラグメントイオンを表す。残り８つのスキャン３〜１０は、後に続く又は連続するスキャンにわたってどちらも変動する幅及び関連するｍ／ｚ範囲又はウィンドウを有する、スケジューリングされたＭＩＷ内のプリカーサーイオンのプロダクトイオンスペクトルを反映する。
サイクルＢに関して記載したのと同様の方法で、サイクルＣの場合、要素２７３０は１０のスキャンを同定し、スキャン１は、全ｍ／ｚ範囲５２５〜７５０を表し、スキャン２は、サイクルＣと関連付けられたｍ／ｚ間隔に対して最初のＭＩＷからのフラグメントイオンを表す。残り８つのスキャン３〜１０は、後に続く又は連続するスキャンにわたってどちらも変動する幅及び関連するｍ／ｚ範囲又はウィンドウを有する、スケジューリングされたＭＩＷ内のプリカーサーイオンのプロダクトイオンスペクトルを反映する。
本明細書の技術による実施形態では、サイクルＡのスキャン１の場合、ＬＥスキャンデータはｍ／ｚ範囲３５０〜５５０に対して得られてもよく、ＨＥスキャンデータはｍ／ｚ範囲５０ａｍｕから最大ｍ／ｚに対して得られてもよく、最大ｍ／ｚは、その時間におけるそのＭＩＷ及びＩＭＳが用いられる場合はドリフトの、最高のｍ／ｚ及びｚの関数である。サイクルＡのスキャン３〜１０の場合、ＬＥスキャンデータは得られない。それよりもむしろ、四重極は、かかるスキャンそれぞれに対してスケジューリングされたＭＩＷのみを伝達するように変動される。各スキャン３〜１０において、ＭＩＷは、そのサイクルの最初のＭＩＷのどの部分が２９３０に示されるようにサンプリングされているかに応じて、指定のより狭い又はより広いものであってもよい。ＭＩＷ幅の変動については、更に詳細に後述される。サイクルＡのスキャン３〜１０の場合、ＨＥスキャンデータは、特定のスキャンの特定の変動するＭＩＷ幅を使用して得られる。
サイクルＡ、Ｂ、及びＣのかかるスキャン３〜１０において変動するＭＩＷ幅、並びに各ＭＩＷと関連して変動するｍ／ｚ範囲を決定するのに使用されてもよい技術は、以下のパラグラフで更に詳細に記載される。ＭＩＷの幅は、一実施形態では、ＤＤＡがスイッチリストを作成するのと同様の方法で設定されてもよいことが注目されるべきである。あるいは、ＭＩＷの幅は、計装を制御するシミュレータ又は他のソフトウェアなどを使用して、事前プログラムされてもよい。それに加えて、各ＭＩＷと関連付けられるｍ／ｚ値の範囲又はウィンドウは、各スキャンと共に変化するようにプログラムされてもよい。
このように、図３０を参照すると、サイクルの長方形又は棒のそれぞれは、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよいデータ獲得を表す。例えば、サイクルＡでは、要素２７１１は、サイクルＡの単一の実行の中で獲得される様々なＬＥ及びＨＥデータセットを表す。要素２７１１は、サイクルＡの単一の実行の中で獲得されてもよいような、スキャン１に対する単一のＬＥスキャンデータセット、及びスキャン２〜１０に対する９つのＨＥデータセットを含む。サイクルＢでは、要素２７２１は、サイクルＢの単一の実行の中で獲得される様々なＬＥ及びＨＥデータセットを表す。要素２７２１は、サイクルＢの単一の実行の中で獲得されてもよいような、スキャン１に対する単一のＬＥスキャンデータセット、及びスキャン２〜１０に対する９つのＨＥデータセットを含む。サイクルＣでは、要素２７３１は、サイクルＣの単一の実行の中で獲得される様々なＬＥ及びＨＥデータセットを表す。要素２７３１は、サイクルＣの単一の実行の中で獲得されてもよいような、スキャン１に対する単一のＬＥスキャンデータセット、及びスキャン２〜１０に対する９つのＨＥデータセットを含む。
本明細書の技術による一実施形態では、単一のサイクルと関連付けられる処理は、次のサイクルを使用した継続処理の前の時限の間、繰り返されてもよい。例えば、以下を考慮する。実験は、１００分間の実験行程に対して合計溶出時間又は合計時間量を有する。指定されるｍ／ｚ間隔の数「ｎ」は２０であってもよく、それにより、各ｍ／ｚ間隔又はサイクルは５分間で実行されてもよい（例えば、１００／２０＝５）。ＭＳスキャン速度は、１０スキャン／秒又は６００スキャン／分であってもよい。したがって、３，０００のデータスキャンが各サイクルに対して５分で獲得されてもよい。この例では、サイクルＡと関連付けられた処理は５分間繰り返されてもよい。サイクルＡが５分の時限で実行されると、次に続くサイクルが５分間行われてもよく、２０＝サイクル全てがそれぞれ関連する処理を行うまでそれが続く。
一般に、以下のパラグラフで更に詳細に記載されるように、適切に同じ数のイオンが、後に続くフラグメンテーションのために時間に伴って質量フィルタを通るように選択するか、又はそれを可能にする目的で、ｍ／ｚ間隔内におけるイオンの数の頻度又は計数が増加すると、ＭＩＷの幅は減少する。このように、各スキャンにおけるＭＩＷの幅及びｍ／ｚウィンドウ又は範囲の属性は、異なるｍ／ｚ値におけるプリカーサーイオンの頻度の分布の関数として特徴付けられてもよい。
図３１を参照すると、本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよいサイクルＡに対するｍ／ｚ値の頻度分布を例証する一例が示されている。例２９００は、３５０〜５５０の関連するｍ／ｚ間隔を有するサイクルＡの分布を模式的に示している。本明細書の他の箇所で言及されるように、２９００の分布は任意の好適な方法で得られてもよい。例えば、分布は、シミュレータ又はモデリングソフトウェアを使用してシミュレートされるか又は理論的に決定されてもよく、実際の実験を行った結果として得られてもよく、その他であってもよい。
例２９００は、８つのｍ／ｚビン又はバケットを示し、各ｍ／ｚビンは２５ｍ／ｚ単位である。サイクルＡのｍ／ｚ間隔は３５０〜５５０であり、それにより、この例では、ｍ／ｚ間隔は３５０を含むが、終点５５０は含まない（例えば、ｍ／ｚ間隔３５０≦ｍ／ｚ≦５５０を表す）ことが注目されるべきである。図３１は、表される各ｍ／ｚビンに対する包括ｍ／ｚ値を指定している。例えば、第１のビンは３５０〜３７４の包括ｍ／ｚ範囲を有し、プリカーサーイオン頻度５がｍ／ｚ範囲内にある。第２のビンは３７５〜３９９の包括ｍ／ｚ範囲を有し、プリカーサーイオン頻度１５がｍ／ｚ範囲内にある。包括ｍ／ｚ範囲４２５〜４４９を有する第４のビンは、図示される全てのｍ／ｚビンの中で最大頻度６０を有する。ｍ／ｚビン又は間隔内のプリカーサーイオンの数を表す頻度又は計数が増加するにしたがって、ＭＩＷの幅は減少する。
要素２９２０は、ｍ／ｚ間隔３５０〜５５０を有するサイクルＡに対する分布と関連付けられるいくつかの性質を列挙している。この例では、ｍ／ｚ間隔３５０〜５５０は、１６０の合計イオン数（例えば、２９００における全ての頻度の合計）を有する。そのＭＩＷにわたるスキャンの数が＝８（例えば、図３０のスキャン３〜１０のように）に変更された場合、各スキャンでフィルタ処理されるか又は通過させられるプリカーサーイオンの平均数は約２０のはずである。これに基づいて、サイクルＡの各スキャンに対して、変動するＭＩＷ幅及びそれに関連するｍ／ｚウィンドウ又は範囲を決定するコードが実行されてもよい。この例では、サイクルＡのスキャンは、ＭＩＷを有してもよく、関連するｍ／ｚウィンドウは、同じサイクルＡにおける前のスキャンのｍ／ｚウィンドウと重なり合わない。全てのスキャン３〜１０にわたる全てのＭＩＷのｍ／ｚウィンドウは全ｍ／ｚ間隔を網羅してもよい。次のスキャンは、前のスキャンのｍ／ｚウィンドウが終わったところから始まる、関連するｍ／ｚウィンドウを有する（例えば、スキャン４は、そのＭＩＷに対してｍ／ｚ＝４００で始まる関連するｍ／ｚウィンドウを有し、前のスキャン３は、ｍ／ｚ＝３９９で終わる関連するｍ／ｚウィンドウを有する）。したがって、Ａなどのサイクル内で、処理は、そのサイクルＡに対する全ｍ／ｚ間隔を通して段階的に漸増する、関連するｍ／ｚウィンドウを有するように設定されてもよい。
要素２９３０は、サイクルＡの単一の実行に関する処理と関連して決定され使用されてもよい、各スキャン数３〜１０に対する、変動する幅及びｍ／ｚウィンドウを列挙している。
図３２を参照すると、サイクルＡの単一の実行に対して本明細書の技術による一実施形態で様々なスキャンに使用されてもよい、変動するＭＩＷ幅及びｍ／ｚウィンドウの更なる例証が示されている。例３０００は、検査を簡単にするために表２９３０から連載された情報を含む。それに加えて、例３０００は、サイクルＡの単一の実行における各スキャンに対して、関連するＭＩＷのｍ／ｚウィンドウ及びＭＩＷ幅を同定する表３０１０を含む。行３０１２は、各スキャンに対する異なるＭＩＷのｍ／ｚウィンドウを表す。行３０１４は、各スキャンに対する異なるＭＩＷ幅を表す。行３０１６は、低エネルギー又は高エネルギースキャンのどちらであるかに関する指示と共に、番号によって特定のスキャンを表す。
本明細書の他の箇所で言及されるように、サイクルＡは、行３０１６の１つのセルにそれぞれ対応する１０のスキャンセットを含む。スキャン「Ｘ」（Ｘは、１〜１０の包括範囲内の整数）に関して、指定する「ＸＬＥ」はそのスキャンＸがＬＥスキャンであることを表し、指定する「ＸＨＥ」はそのスキャンＸがＨＥスキャンであることを表す。このように、行３０１６の各セルは、単一の低エネルギースキャン又は単一の高エネルギースキャンのどちらかを表してもよい。
上記で言及されたように、また本明細書の他の箇所で言及されるように、スキャン１ ３０１６ａ（１ＬＥで表される）において、サイクルの全ｍ／ｚ間隔であるＭＩＷを使用して、ＬＥ「調査」スキャンに対するデータセットが獲得される。スキャン２ ３０１６ｂ（２ＨＥで表される）は、スキャン１からのＭＩＷを使用してプリカーサーイオンによって生成されるフラグメントイオンを含む高エネルギースキャンである。スキャン３〜１０では、指定のＭＩＷ（かかる各スキャンに対して、行３０１２及び３０１４によって示されるような、幅及びｍ／ｚウィンドウを有する）を設定し使用し、次に、そのスキャンの指定のＭＩＷ内にあるプリカーサーイオンに対してＨＥスキャンデータ獲得（３ＨＥ〜１０ＨＥによって表されるような）を行う処理が行われてもよい。例えば、要素３０１６ａは、２００のＭＩＷ幅を有する、３５０〜５４９を包含する全ｍ／ｚ間隔に対して設定されたＭＩＷに対してＬＥスキャンデータのセットが得られる第１のスキャンを表す、表３０１０の単一セルである。セル３０１６ｂは、３５０〜５４９を包括するｍ／ｚウィンドウに対して指定のＭＩＷ幅２００のｍ／ｚを有するプリカーサーイオンのフラグメンテーションを通してＨＥスキャンデータのセットが獲得される、第２のスキャンを表す。同様に、セル３０１６ｃ〜３０１６ｊは、残りのスキャン３〜１０に関して行３０１２及び３０１４に示される特定の設定に合わせてＭＩＷ幅及びｍ／ｚウィンドウを設定することを表す（例えば、スキャン３〜１０のそれぞれにおいて、ＨＥデータ獲得は、そのスキャンに対して指定された特定のＭＩＷのｍ／ｚウィンドウ内にあるｍ／ｚを有するプリカーサーイオンから生成される、フラグメントイオンに対して行われる）。
図３１の分布に基づいて、図３２の表３０１０のようなＭＩＷ幅及びｍ／ｚウィンドウを使用することによって、変動するＭＩＷ幅及びｍ／ｚウィンドウがもたらされるので、ほぼ同じ数の２０のプリカーサーイオンがフィルタ処理又は選択され、後に続くフラグメンテーションのために通過させることが可能になる。
図３１及び図３２と関連する上記例は、ＬＣ／ＭＳ実験のように、ｍ／ｚ値の関数である頻度分布を使用することを示していることが注目されるべきである。実験はまた、ＬＣ／ＭＳと組み合わせてＩＭＳを使用してもよく、それによって、ドラフト時間又は衝突断面積（ＣＣＳＡ２）である分離の別の次元が追加される。したがって、やはりＩＭＳを使用するような実施形態では、図３１に示されるようなＸ軸上のバケット又はビンは、ｍ／ｚ及びドリフト時間又はＣＣＳＡ２の両方の関数であってもよい。
それに加えて、本明細書の技術による一実施形態はまた、各スキャンにおいて、特定のＭＩＷ ｍ／ｚウィンドウ、保持時間（ＲＴ），及び／又はドリフト時間若しくはＣＣＳＡ２のうち１つ又は２つ以上と共に変動してもよい、衝突エネルギーを選択してもよい。例えば、本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよい３１００の表が示される、図３３が参照される。
表３１００は、所定の衝突エネルギー値のルックアップテーブルであってもよい。表３１００は、列３１１０によって示されるような、ｍ／ｚ、ＲＴ、及びドリフト時間又はＣＣＳＡ２のうち任意の１つ又は２つ以上によって索引付けされてもよい。列３１１２は、ｍ／ｚ、ＲＴ、及びドリフト時間又はＣＣＳＡ２の異なる値に対して使用される、異なる衝突エネルギーを提供してもよい。表３１００の各行は、ＲＴ、及びドリフト時間又はＣＣＳＡ２に対して指定された１つ又は２つ以上の値の特定のセットに対して、使用が推奨される対応する衝突エネルギー値又は範囲を同定してもよい。したがって、本明細書の技術による一実施形態は、表３１００を使用して、特定のＨＥスキャンと関連付けられた特定のＭＩＷ ｍ／ｚウィンドウに基づいて、各ＨＥスキャンの衝突エネルギーを変更又は選択してもよい。例えば、４２５〜４３２のｍ／ｚウィンドウを有するスキャン５に関して、図３２の要素３０２０を再び参照する。サイクルＡ処理の特定の実行において、ＲＴ又は溶出時間及びドリフト時間が、４２５〜４３２のｍ／ｚウィンドウと共に決定され選択されて、３１１０のマッチする入力を選択してもよい。マッチする入力３１１０を含む表３１００の行から、衝突エネルギー値が列３１１２から検索され、プリカーサーフラグメンテーション又はＨＥスキャン５ＨＥに対して選択された衝突エネルギーとして使用されてもよい。したがって、サイクルＡ処理の間、衝突エネルギーは、サイクル５ＨＥの検索された衝突エネルギー値に設定されてもよい。
本明細書の技術による一実施形態では、上記されたように、シミュレータ又はモデリングソフトウェアを使用して、様々なサイクルに対してＭＩＷ幅及びｍ／ｚ値を決定するのに使用される理論上の分布が決定されてもよい。かかる実施形態では、ソフトウェアに一連の入力が提供されてもよい。かかる入力は、合計溶出時間、ｍ／ｚ間隔の数、サンプル及びサンプル調製を特徴付ける１つ又は２つ以上のパラメータ、獲得時間（例えば、単一のスキャンの時間長）、ｍ／ｚ間隔間の重なり合いを特徴付ける１つ又は２つ以上のパラメータ、ＩＭＳが行われるか否か、一定の衝突エネルギーを使用するか否か、並びに図３３と関連して記載されるようなルックアップテーブルを使用して（例えば、ｍ／ｚ、ＲＴ、及び／又はドリフト時間若しくはＣＳＳＡ２にしたがって）ＨＥスキャンの衝突エネルギーを変更又は設定するか否かを含んでもよい。上記入力は、本明細書の他の箇所に更に詳細に記載される。入力に基づいて、シミュレータ又はモデリングソフトウェアは、様々なサイクルに関して上述されたような変動する幅及びｍ／ｚウィンドウを有するＭＩＷを決定してもよい。
本明細書に記載されるように、「ＳＳＰＰＩＳ」は、ＬＥスキャン及びそれに対応するＨＥスキャンからのデータを含む単一スキャンプリカーサー−プロダクトイオンスペクトルである。本明細書に記載されるように、かかるＬＥ及びＨＥスキャンデータセットは、様々な獲得方法と関連して得られてもよく、その方法のいくつかが本明細書に記載される。例えば、Ｂａｔｅｍａｎ技術又は高−低プロトコル技術が使用されてもよい。それに加えて、一実施形態は、上述したようなＤＤＡ及びＭＭＡなどの他の獲得技術を使用してもよい。ＤＤＡ及びＭＭＡ獲得に関して、ＳＳＰＰＩＳは、毎調査スキャンから選択されたプリカーサーイオンの質量分離ウィンドウ内の各ＰＣＣに対して構築されてもよい。ＭＭＡと関連して、「調査スキャン」は、質量又はｍ／ｚフィルタ処理がサイクルのｍ／ｚ間隔における全てのｍ／ｚを選択する、各サイクルの第１のスキャンであってもよく（例えば、図３２の３０１６ａを参照）、それによって、全てのかかるｍ／ｚのプリカーサーイオンがフラグメンテーションのために通過できるようにしてもよい。
獲得方法に関わらず、個々のＰＣＣはそれぞれ、最初にその随伴プロダクトイオンスペクトルを割り当てられてもよい。これは、ＭＭＡ又はＤＤＡ獲得などにおけるＭＩＷ内、又はＢａｔｅｍａｎ技術若しくは高−低プロトコル技術などに関連するＬＥスキャン内の、全てのプリカーサーイオンを含む。データがＩＭＳを作動させて獲得された場合、最初のプリカーサー及びプロダクトイオンのアライメントは、規定の許容差内でドリフト時間をマッチさせることによって達成されてもよい。
図３３Ｂを参照すると、ＭＭＡ技術による一実施形態で行われてもよい処理ステップのフローチャートが示されている。フローチャート３１５０は、上述された処理を要約した。ステップ３１５２で、指定の合計ｍ／ｚ範囲に対するｍ／ｚ値の頻度の分布が決定される。ステップ３１５４で、実験に対するサイクル数が決定され、各サイクルに対して、対応するｍ／ｚ間隔範囲が決定される。ステップ３１５６で、現在のサイクルが、後続のステップで処理が行われる次のサイクルに割り当てられてもよい。ステップ３１５８で、全ての「ｎ」個のサイクルに対して処理が完了しているか否かに関して決定がなされる。完了している場合、制御はステップ３１６０に進んで、「ｎ」個のサイクルのスキャンに対して決定された様々なＭＩＷを使用して実験が行われてもよい。ステップ３１５８が「いいえ」と評価した場合、制御はステップ３１６２に進む。現在のサイクルに対して、現在のサイクルのｍ／ｚ間隔に対するｍ／ｚ値の頻度の分布が決定される。例えば、図３１は、現在のサイクルに対してステップ３１５８と関連して行われてもよい、かかる処理を示している。ステップ３１６４で、最初の２つのスキャン以外の現在のサイクルの各スキャンに対して処理が行われる。最初の２つのスキャン以外のかかる各スキャンに対して、ＭＩＷ幅及び関連するｍ／ｚウィンドウを決定し、それにより、ほぼ同じ数のプリカーサーイオンが選択されるか、又は各スキャン（最初の２つのスキャン以外）において通過できるようにされる。例えば、ステップ３１６４は、図３２の表２９３０に示されるような情報を決定する。ステップ３１６６で、任意に、ＨＥスキャンと関連付けられたＭＩＷのｍ／ｚウィンドウ、並びに特定のＨＥスキャンと関連付けられたＲＴ及び／又はドリフト時間にしたがって、各ＨＥスキャンを行うときに使用される衝突エネルギーを選択する処理が行われてもよい。制御はステップ３１５６に進む。
このように、フローチャート３１５０は、ステップ３１６６で任意に決定された衝突エネルギーと共に、「ｎ」個のスキャンに対して特定のＭＩＷ幅及び関連するｍ／ｚウィンドウのスケジュールを決定する処理を行い、次に、上記を使用してステップ３１６０と関連するデータ獲得の実行に進む。
図３４を参照すると、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい、ＭＭＡ又はＤＤＡ獲得におけるＰＣＣの強度を決定する処理が記載される。関連するｍ／ｚを有する特定のＰＣＣに関して、様々なスキャンにおけるＰＣＣの強度が追跡されてもよい。ＤＤＡの場合、かかるスキャンは調査スキャンを含んでもよい。ＭＭＡの場合、かかるスキャンはサイクルの第１のスキャンを含んでもよい（例えば、図３２の要素３０１６ａ）。ＰＣＣ又はプリカーサーイオンの強度が調査スキャンにおいて既知であること、またＭＳ／ＭＳ獲得が時間的に連続しているという事実を所与として、調査スキャン及びフラグメンテーションにおけるプリカーサーイオンの強度は異なる。ＡＲ１は、フラグメンテーションされたときのプロダクトイオンと親プリカーサーの比である。ＭＩＷ内に５つのプリカーサーイオン又はＰＣＣがある場合、各プリカーサーイオンはそれ自体のプロダクトイオン又はＭＳ／ＭＳスペクトルを生成している。ＭＳ／ＭＳスペクトルにおけるプロダクトイオンは、全てのプリカーサーからの複合スペクトルを表す。これが当てはまる場合、複合プロダクトイオンは５つのプリカーサー全てで共有され、ｍ／ｚ及び面積又は強度によってフィルタ処理される。プロダクトイオン強度は、ｍ／ｚ又は強度が大きいことはなく、並びに最小強度はそれらのプリカーサーの１／２５０である。本明細書の技術によれば、フラグメンテーション時におけるＰＣＣ強度を決定する処理が行われてもよい。図３４は、これがどのように遂行されてもよいかを示している。各調査スキャンで、ＰＣＣの強度値が記録されてもよく、調査スキャン間の任意の所与の強度値を決定する線形回帰又は補間が行われてもよい。図３４に示されるのは、同じＰＣＣの強度が既知であり、時間にわたって追跡されて図示される曲線を形成する、１０のスキャンに対応する１０の点である。例えば、かかる１０の点は、ＰＣＣのｍ／ｚが選択される１０の調査スキャン又は時間に対応してもよい。ＰＣＣのフラグメンテーションは、例えば、２つの調査スキャンの間であってもよい点Ｐ１で起こってもよい。点Ｐ１におけるＰＣＣの強度は、線形補間又は当該分野で知られている他の任意の好適な技術を使用して決定されてもよい。
プロテオミクス研究では、一般に、ダイナミックレンジの有効範囲の深さはＤＤＡ獲得に限定される。方法の連続的性質により、サンプリングすることができるプリカーサーイオンの感度及び数の両方が限定される。そのため、データ独立型の獲得（ＤＩＡ）戦略の数は、そのうちいくつかが本明細書に記載されるが、これらの方法を導入しており、大部分ではサンプリングの問題に影響されず、いくつかは感度に対する限定を有する。ＤＩＡのアプローチによる１つの主要な制限は干渉であり、即ち、ＭＳ／ＭＳスペクトルはキメラ性が高く、多くの場合、従来のデータベースサーチエンジンを使用して同定することができない。イオン検出前の分離の利用可能な次元をそれぞれ利用する、本明細書の技術の少なくとも１つの実施形態では、以下のパラグラフに記載されるＭＭＡ戦略の特定の実装及びワークフローが利用されてもよい。一実施形態で使用されてもよい以下のパラグラフにおけるＭＭＡ戦略及びワークフローは、狭帯域及び広帯域両方のＤＩＡ獲得を単一の分析ワークフローにおいて多重化することを含む。本明細書の技術のいくつかの実施形態は、反復する性質を有するＭＭＡを行ってもよく、それにより、ＭＭＡワークフローは感度の損失を最小限にして干渉の副作用を制限する。定性的同定を、選択イオンクロマトグラム（ＳＩＣ）又は従来のデータベース検索戦略によって行うことができる。
高分解能ＤＩＡ獲得戦略は、新技術として強調され、定性的及び定量的「標的分析」の領域で高まる人気を示してきた。また、複雑なマトリックスにおける標的定量化の領域において、高分解能Ｑ−Ｔｏｆ及びＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析部を「採用する機が熟して」いることが広く容認されるようになってきた。より高分解能の質量分析部は、研究者が各ペプチドに対する最良の転移を前もって決定する必要性を排除することによって、アッセイの開発時間を低減させる。複雑な混合物中のペプチドを正確に定量化する能力は、周囲のマトリックスとは独立して各イオンの物理化学的属性を測定する、適用される分析ワークフローの能力に基礎を置いてもよい。ｍ／ｚに関して分解能が高いほど、クロマトグラフィ及びドリフトピーク幅は、イオン干渉の副作用を低減するのに極めて重要である。本明細書の技術と関連して使用されてもよいものなどのデータ処理ツールは、各イオンの面積がどの程度良好に測定されているかを反映するメトリックである、イオン純度スコア（ＩＰＳ）を計算してもよい。ＩＰＳは、半値、ｍ／ｚ、時間、及びドリフトを、それらそれぞれの実験手段に対して比較することによって計算される。測定されたｍ／ｚを評価する場合、ロックマスチャネルの分解能が比較に使用され、それにより、ＩＣＲに関して、質量分解能は、過渡的測定時間及びｍ／ｚの関数であり、分かっている過渡的測定時間及びｍ／ｚによって、比較のために理論上の質量分解能を計算する手段がもたらされる。クロマトグラフィ及びドリフトピーク幅に関して、それぞれの幅は、それぞれに対する勾配溶出全体にわたって計算された全ての値の中央値に対して比較される。
分解能の増加は、用いられる分離空間のいずれにおいても必ず結果を伴う。分析技術と関連して、選択性と分解能との関係は標準的なＳ曲線を辿る。変曲点を超える分解能設定は、多くの場合、実験の他の態様に対する悪影響、例えば感度の損失を有する。感度はイオン流束（イオン／単位時間）の関数である。より狭いクロマトグラフィピークはより高いイオン流束をもたらす。より狭いクロマトグラフィピークは、デューティサイクルを維持するため、より速いスキャン時間を要する。スキャン速度の増加と同時に、単位時間当たりのプロダクトイオンスペクトルの数が増加する場合、デューティサイクル又は感度のどちらかの純益がない。イオン流束は、一般に、イオンが単位時間当たりにＭＳ検出器から出力される速度（例えば、イオン数／単位時間、及びそれらがｍ／ｚ範囲にわたってどのように分布されるか）として定義されてもよい。イオン流束は、本明細書の他の箇所（例えば、ＭＭＡを伴うＭＩＷ選択サイズ及び範囲に関する説明と関連した図３１）に記載されるような、時間にわたる異なるｍ／ｚ値の頻度分布と類似している。
トラップ機器における質量分解能は、ｍ／ｚ及び過渡的測定時間の関数であり、狭いピークはより速いサンプリング速度を要し、同時に過渡的測定時間が増加することにより、それに比例して実験の質量分解能が低減される。Ｑ−Ｔｏｆのジオメトリに関して、分解能は測定時間とは独立しており、飛行時間分析器のデューティサイクル及び伝達によって感度が支配される。直交分離の数を増加させることによって、質量及びクロマトグラフィ分解能に対する応力を軽減して、それぞれの変曲点未満でそれぞれ動作させることが可能になる。適用される分析ワークフローが、複雑な混合物中のペプチドの最大数を、最も広いダイナミックレンジわたって、最高の確度及び精度で正確に同定し定量化する能力は、イオン検出の前に用いられる全ての分離技術の数及び分解能の直接的な結果として特徴付けられてもよい。
ＭＳＥＤＩＡワークフローは、低エネルギー状態と上昇エネルギー状態との間の衝突移動セルを用いて交互の形でＭＳフルスキャンデータを獲得する。当該技術で知られているように、また本明細書の他の箇所に記載されるように、ＭＳＥ（本明細書では、Ｂａｔｅｍａｎ技術又は高−低プロトコルとも呼ばれる）は、低エネルギー衝突によって誘発される解離と高エネルギー衝突によって誘発される解離とを交互に使用し、前者が定量化のためにプリカーサーイオンの正確な質量及び強度データを得るのに使用され、後者がプロダクトイオンの正確な質量を得るのに使用される、タンデム型質量分析データ獲得方法を指す。ＭＳＥ（例えば、Ｂａｔｅｍａｎ技術又は高−低プロトコル）の場合、プリカーサーイオンの選択はなく、全てのプリカーサーイオンは同時にフラグメンテーションされる。かかる一実施形態では、衝突エネルギーは、全ての電荷状態にわたってより完全なフラグメンテーションを提供するため、上昇エネルギー獲得時間にわたって低エネルギーから上昇エネルギー状態へと増やされてもよい。プロダクトイオンは、ピーク形状及び頂点保持時間（場合によっては、本明細書ではＲＴ又はｔとも呼ばれる）の類似性によって、それらの親プリカーサーに対して整列される。有効範囲の深さ、ペプチド同定の数は、その時の更に従来的なＤＤＡ獲得戦略と匹敵してもよい。しかしながら、これらのキメラ性が高いプロダクトイオンスペクトル内での同定には、専用のデータベース検索エンジンを要する。市販及びオープンソース両方のデータ処理及び検索ツールを使用して、ＭＳＥＤＩＡデータの処理及び検索ができないことは制限であった。この方法の選択性は、例えば、進行波イオンモビリティースペクトロメトリー（ＴＷＥＭＳ）を用いて改善された。ＴＷＩＭＳのジオメトリによって、検出前にイオンが二次元で分離される（ＩＭＳドリフト及びｍ／ｚ）。ＩＭＳの追加によってピーク能力が増加し、キメラ性が低減されるが、感度はほとんど低減されない。ＩＭＳで向上したデータセットに対して、プリカーサー及びプロダクトイオンは、それらそれぞれのピーク形状、並びに頂点の保持及びドリフト時間によって整列される（ｔｄも、本明細書で、ドリフト時間又はドリフト時間ビンを指すのに使用される）。これらの高精細ＭＳＥ（ＨＤＭＳＥ）ＩＭ（イオンモビリティー）−ＤＩＡプリカーサー及び生成スペクトルは、より深い有効範囲を可能にするより高い選択性とダイナミックレンジとを反映する。選択性は増加され、したがってプロダクトイオンスペクトル品質が改善されるが、ＨＤＭＳＥ ＩＭ−ＤＩＡプロダクトイオンスペクトルはキメラ性が高いままであり、大体において、専用のＤＩＡデータ処理ツールを依然として要する。このように選択性は改善されるが、より最近の高いスキャン速度のＤＤＡ機器と比較して、同様の数のペプチドを同定する能力が課題である。
ＤＩＡプロダクトイオンスペクトルは、選択イオンクロマトグラム（ＳＩＣ）を使用したスペクトルライブラリに対してプロダクトイオンスペクトルをスクリーニングすることによって、定性的同定が最良に遂行されるという推論に基づいて、従来のデータベース検索ツールを使用して同定するのには複雑すぎることがある点が示唆されてきた。そのため、ＳＩＣアプローチ（例えば、ＦＴ−ＡＲＭ、ＳＷＡＴＨ（Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｗｉｎｄｏｗ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ ＴＨｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒａ）獲得、及びＭＳＸ（多重化ＤＩＡ）獲得を含む）を利用する、多数の代替のＤＩＡ戦略が導入されてきた。プリカーサーイオン選択がない点でＭＳＥＤＩＡと類似しているが、ｍ／ｚスケールは、ユーザ定義のｍ／ｚ間隔を使用して連続的にサンプリングされる。ｍ／ｚスケールを狭くすることで、同時にフラグメンテーションされるペプチドの数が制限されて、プロダクトイオンスペクトルのキメラ性が低減される。これらのＤＩＡワークフローにおいて、ユーザ定義の質量分離幅は、所定の質量スケールにわたって段階的にされる（ＳＷＡＴＨ）か、又はその中で不規則に位置付けられる（ＭＳＸ）。一例として、ＭＳＸアプローチを用いて、一連の４Ｔｈ幅の質量分離ウィンドウが、５００〜９００ｍ／ｚの所定の質量範囲にわたって不規則にサンプリングされる。モデリング及びシミュレーションに関する以下のパラグラフ及び本明細書の他の箇所における考察と同じく、ｍ／ｚドメインこの部分（例えば、５００〜９００ｍ／ｚ）は、時間ドメイン全体にわたるプリカーサーイオン流束の最大密度を反映する。仮定は、より狭い（ただしＤＤＡよりは広い）質量分離ウィンドウから生成されるプロダクトイオンスペクトルのキメラ性が低くなり、ＳＩＣアプローチを介した同定を行いやすくなるというものである。方法はまた、重なり合うプロダクトイオンスペクトルを逆多重化し、プロダクトイオンを区別してグループ化することによって改善し、キメラ性を低減させることができる。マッチしたプロダクトイオンは、それぞれのｍ／ｚビンそれぞれに対して固有であるものを残して、重なり合う領域に割り当てられる。選択されたｍ／ｚウィンドウ（５００〜９００Ｔｈ）のイオン密度、及びより高いスキャン速度ＭＳ２（例えば、ＭＳ／ＭＳ）の獲得におけるより低い分解能を所与として、２つ以上の同時にフラグメンテーションするプリカーサーが、質量分解能内で類似のｍ／ｚのプロダクトイオンを生成する能力は高い。これらのイオンが枯渇することによって、選択性が増加する代わりに制限されることがある。
ＤＩＡのモードは、それら自体によってＤＤＡの既存の制限を克服しないことがある。デューティサイクルは依然としてスキャン速度の関数であり、スキャン速度が高いほど感度に対して悪影響である。ＳＷＡＴＨ又はＭＳＸとのデューティサイクルのある程度の類似を維持するためには、感度を完全に犠牲にしない獲得時間を設定するためにｍ／ｚドメインの幅を低減する必要がある。全ての溶出ペプチドに対してプロダクトイオンスペクトルが獲得されるが、ｍ／ｚ空間のサンプリングが大幅に制限されていることは、ｍ／ｚの大きい領域がサンプリングされずに残されることを意味する。全ｍ／ｚスケールのサンプリングには、更に速いスキャン速度、より幅広いｍ／ｚ分離ウィンドウ、又は複数の注入を要する。複数の注入を獲得しなければならないことは、デューティサイクルを増加させず、実験ピーク能力又はイオン干渉にも何ら影響しない。
本明細書に記載される技術を使用する一実施形態は、感度を損なうことなくＤＩＡ技術と共に利用可能な、改善された選択性を有するものとして特徴付けられてもよい。このため、以下のパラグラフに記載されるのは、ＭＭＡ獲得戦略が、イオン流束、ｍ／ｚ、及びドリフトを利用して、各ＤＩＡ獲得に対するＭＩＷの幅を設定する、本明細書の技術による一実施形態である。かかる一実施形態では、溶出時間は、スキャンサイクルへとセグメント化されてもよく、スキャンサイクルの数は、全ての溶出成分の平均クロマトグラフィ（ＦＷＨＭ）の関数であってもよい。正確なＡＵＣ（曲線下面積）定量化が、クロマトグラムピークのＦＷＨＭにわたって最低５つのデータ点を要することを所与として、５つのスキャンサイクルの下限が実施されてもよい。後述されるような少なくとも一実施形態では、各スキャンサイクルは、１７の別個のＤＩＡ獲得を含んでもよく、１つが低エネルギー、２つが広帯域（５０Ｔｈ＜ＭＩＷ＜５００Ｔｈ）、及び１４が狭帯域（１Ｔｈ＜ＭＩＷ＜５０Ｔｈ）のＨＤＭＳＥ ＩＭ−ＤＩＡ（高精細ＭＳＥイオンモビリティー）獲得である（例えば、ＨＤＭＳＥは、データ獲得に関するＢａｔｅｍａｎ技術又は高−低プロトコルであるＭＳＥと組み合わせてＩＭＳを行うことを表す）。後述されるように、また本明細書の他の説明と同じく、広帯域及び狭帯域獲得のそれぞれは、サイズ又は幅、及び各スキャンサイクルで変動してもよい関連するｍ／ｚ範囲を有するＭＩＷを使用してもよい。各ＭＩＷは、後続のフラグメンテーションのために低エネルギースキャンを通過することが可能にされるｍ／ｚ値の範囲を表すｍ／ｚ範囲を指定してもよい。したがって、ｍ／ｚ範囲を有するＭＩＷを使用することで、プリカーサーイオン又はｍ／ｚ範囲内のｍ／ｚを有する低エネルギースキャンのイオンを選択的にフラグメンテーションすることを可能にして、プリカーサーイオンの１つから発する生成フラグメントイオンの量が限定される。繰り返す低エネルギーＨＤＭＳＥ ＩＭ−ＤＩＡフルスキャン獲得以外に、少なくとも１つの実施形態では、各広帯域及び狭帯域ＨＤＭＳＥ ＩＭ−ＤＩＡ獲得に対する中央ｍ／ｚ値がスキャンサイクルと共に変化する。少なくとも一実施形態では、後に続くスキャンにおけるＭＩＷ間の重なり合いも可能にしながら、全ｍ／ｚ範囲を段階的にするため、広帯域及び狭帯域ＭＩＷのＭＩＷウィンドウを選択する処理が行われてもよい。スキャンサイクル間の中央ｍ／ｚの動的移動によって、変動するＭＩＷの成分として各プリカーサーを複数サンプリングすることが可能になる。逆多重化スキーマを使用して、本明細書に記載される技術は、感度をほとんど犠牲にすることなく、非常に弁別的なプロダクトイオンスペクトルを生成する。
非常に選択的なプロダクトイオンスペクトルは、従来のデータベース検索エンジンを使用して検索するか、又は既知のＳＩＣ技術を使用してマッチさせることができる。同定されたスペクトルは、分子イオンリポジトリ（ＭＩＲ）の推定的な区画に入れられてもよい。溶出分子又は成分に対するかかる推定的な同定（putative identification）（例えば、プリカーサー、及び各プリカーサーに対してそれに関連するフラグメントイオン）は、適正であるがまだ検証されていないものと推定又は確信されてもよい。少なくとも一実施形態では、最低５０の推定的な同定が入れられると、ＭＩＲ内部の検証アルゴリズムが始動される。検証アルゴリズムは、背景で動作して、３０の推定的に同定されたプロダクトイオンスペクトルの不規則なサンプリングを継続的に選択し、かかるスペクトル間の相関及び統計的有意性を決定する処理を行ってもよい。例えば、一実施形態は、当該分野で知られているドット積スペクトル相関及びピアソンの積率相関係数の両方を適用して、有意性を判断してもよい。例えば、ドット積スペクトル相関は、本明細書に参照により組み込まれる、Ｔｏｐｒａｋ，Ｕ．Ｈ．、Ｇｉｌｌｅｔ，Ｌ．Ｃ．、Ｍａｉｏｌｉｃａ，Ａ．、Ｎａｖａｒｒｏ，Ｐ．、Ｌｅｉｔｎｅｒ，Ａ．、及びＡｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．（２０１４）、Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｂｅｎｃｈｍａｒｋｉｎｇ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｓ ａｎｄ ａ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｆｅａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、１３（８）、２０５６〜２０７１に記載されており、ピアソンの積率相関係数は、本明細書に参照により組み込まれる、Ｍｏｒｒｅｅｌ，Ｋ．，Ｓａｅｙｓ，Ｙ．，Ｄｉｍａ，Ｏ．，Ｌｕ，Ｆ．，Ｖａｎ ｄｅ Ｐｅｅｒ，Ｙ．，Ｖａｎｈｏｌｍｅ，Ｒ．、及びＢｏｅｒｊａｎ，Ｗ．（２０１４）、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｖｉａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｐｒｏｄｕｃｔ ｐａｉｒ ｎｅｔｗｏｒｋｓ、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２６（３）、９２９〜９４５に記載されている。正の相関が見出された場合、複合プロダクトイオンスペクトル（本明細書の他の箇所に記載）が生成され、そのペプチドの分子イオンシグネチャーがＭＩＲに記憶されてもよい。
次に、以下のパラグラフで記載される本明細書の技術と共に一実施形態で使用されてもよい、材料及び方法が記載される。
サンプル調製において、酵母株Ｗ３０３ ＭＡＴα（ＡＴＴＣ：２４６５７）（Ｂｌｕｅ Ｓｋｙ ＢｉｏＳｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）を、対数初期から対数中期までＹＰＤ媒質中で成長させた。４，０００ｇ、５分間、４℃の遠心分離によって細胞を採取した。ペレットを、１００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６に懸濁させた。別に規定されない限り、全ての化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製であった。結果として得られる溶解物を９５℃まで５分間加熱し、次にＢｉｏｒｕｐｔｏｒ超音波処理器（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ，Ｌｉｅｇｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で２０ｋＨｚ、３２０Ｗ、６０秒サイクルで３０分間音波処理した。溶解を完了した後、上澄みを１６，０００ｇで５分間遠心分離して、タンパク質抽出物を浄化した。
更にサンプル調製と関連して、各サンプルの約５０μｇを凍結乾燥させ、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム中の０．０５％（ｗ／ｖ）のＲａｐｉＧｅｓｔ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏａｄ，ＵＳＡ）に溶解した。サンプルを、１０ｍＭのＤＴＴの存在下において６０℃で３０分間還元し、５０ｍＭのヨードアセタミド（ＩＡＡ）の存在下において周囲温度で更に３０分間暗所でアルキル化した。１：１０（ｗ／ｗ）の比でシーケンシング等級のＴＭＰＫ処理済みトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＭＩ）を添加することによって、タンパク質分解消化を開始し、３７℃で一晩培養した。ＲａｐｉＧｅｓｔを加水分解するために、０．５％（ｖ／ｖ）の最終濃度までＴＦＡを添加し、溶液を３７℃で２０分間培養してから、１３，０００ｒｐｍで３０分間ボルテックスし、遠心分離した。濃縮されたストックを、サンプル分析の前に、１００ｎｇ／μＬまで希釈した。
以下、上記サンプルの分析と関連して使用されてもよい、ＬＣ−ＭＳ構成が記載される。トリプシンペプチドのＩＤナノスケールＬＣ分離を、ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ、２０ｃｍ×７５μｍの分析用ＲＰカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を具備した、ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて行った。１マイクロリットルのサンプルをカラムに取り込んだ。移動相Ａは、０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸を含有する水であり、移動相Ｂは、０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸を含有するアセトニトリルであった。ペプチドを分析用カラムから溶出し、５〜３５％の移動相Ｂの勾配で、９０分間にわたって３００ｎｌ／分の流量で分離し、次に９０％の移動相Ｂを用いて１０分間カラムをすすいだ。カラムを最初の条件で２０分間再平衡化した。カラム温度は３５℃で維持した。ロックマス化合物［Ｇｌｕ１］−フィブリノペプチドＢ（５０ｎＭ）を、ＬＣシステムの補助ポンプによって２５０ｎｌ／分で、質量分析計のＮａｎｏＬｏｃｋＳｐｒａｙ源の基準噴霧器に送達した。
トリプシンペプチドの質量分光分析を、質量分析計のＳｙｎａｐｔ Ｇ２−Ｓ１及びＸｅｖｏ Ｇ２−ＸＳ ＱＴ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｉｌｍｓｌｏｗ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）の両方を使用して行った。両方の機器は、それぞれ２０，０００及び２５，０００の公称質量分解能で、分解モードで動作させた。全ての実験は、正の電気スプレーイオン化モードで行い、イオン源ブロック温度及び毛管電圧はそれぞれ、８０℃及び２．５ｋＶに設定した。飛行時間分析器（ＴｏＦ）は、ｍ／ｚ５０〜１９９０からのＮａＣＳ１混合物を用いて外部で校正した。データは、［Ｇｌｕ１］−フィブリノペプチドＢの二電荷モノアイソトピックイオンを使用して、獲得後に補正したロックマスであった。基準噴霧器は３０秒の頻度でサンプリングした。正確な質量ＬＣ−ＭＳデータを、Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２−Ｓ１に対してはデータ独立型（ＨＤＭＳＥ ＩＭ−ＤＩＡ）獲得モードで、Ｘｅｖｏ Ｇ２−ＸＳ Ｑｔに対してはデータ独立型（ＭＳＥ ＤＩＡ）で収集した。全ての獲得は、０．０２５秒のスキャン間遅延で０．１秒間獲得された。低エネルギーＭＳモードでは、単位電荷当たり４ｅＶの一定の衝突エネルギーでデータを収集した。上昇エネルギーモードでは、衝突エネルギーは、ＤＤＡ獲得で使用されるのと同様のルックアップテーブルを使用して、最初の値から最後の値まで増やされた。
図３５を参照すると、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよいワークフローを例証する一例３５００が示されている。ワークフロー３５００は、実験が行われる上述のサンプルと関連して行われてもよい。
要素３５０２は、標的３５０２ａ、シミュレータ３５０２ｂ、モデリングパラメータ３５０２ｃ、及び校正方程式３５０２ｄを含む、ワークフローモデリング段階を表している。要素３５０４は、実験を行うのに使用される、スケジューラ３５０４ｂ、スケジューリングパラメータ３５０４ａ、並びに計装及び機器３５０３を含む、ワークフローの獲得段階を表している。少なくとも一実施形態では、要素３５０３は、一般に、上述の調製された酵母サンプルの分析のためなど、サンプル分析のため、クロマトグラフィ（例えば、ＬＣ）、質量分析、及び（任意に）イオンモビリティースペクトロメトリーを大ナウ、科学装置システムを表してもよい。少なくとも一実施形態では、スケジューラは、実験及びサンプル分析のためにデータ獲得を行うときに、質量分析計を制御するのに使用されるスケジュールを決定してもよい。本明細書の他の箇所の考察と同じく、質量分析計以外の１つ又は２つ以上の更なる機器も、サンプル分析を行うことと関連して使用されてもよいが、本明細書に記載されるようなスケジューラの一実施形態は、質量分析計によって行われる処理のみに影響してもよい。要素３５０６は、生のファイル３５０６ａ、データ処理３５０６ｂ、整列スペクトル処理３５０６ｃ、逆多重化３５０６ｄ、及びデータベース検索３５０６ｅを含む、一般的なワークフローのデータ処理又はデータ分析段階を表す。要素３５０８は、ＭＩＲ ３５０８ａ、検証処理３５０８ｂ、及び推定的なプロダクトイオンスペクトルリポジトリ３５０８ｃを含む、記憶ワークフローを表す。要素３５０５は、イオン流束３５０５ａ、ｍ／ｚ対ｔｒ ３５０５ｂ、ｍ／ｚ対ｔｄ ３５０５ｃ、及びｔｒ対ｔｄ ３５０５ｄに関する出力を生成する、空間マッピング段階を表す。
一般に、ワークフロー３５００は、２つの主要なワークフロー経路を示し、第１の経路は実線のコネクタ及び矢印によって定義され、第２の経路は破線の矢印及びコネクタによって定義される。第１の経路はシミュレータを使用するフローを表す。第２の経路によって表されるフローは、例えば、行われる各行程又は注入に対してなど、反復する形で、並びに本明細書の他の箇所に示されるように、複数の行程又は注入にわたって反復して使用されてもよい。
シミュレーション又はモデリングの標的３５０２ａを表すファイルは、シミュレータ３５０２ｂに入力される。上述された酵母サンプルと関連して、標的３５０２ａは、可能なペプチド、タンパク質、又は試験及び分析下のサンプル中にあってもよいプロテオーム全体を含んでもよい。一般に、標的３５０２ａは、シミュレータ３５０２ｂによってシミュレートされる分子のセットを同定する。したがって、標的３５０２ａは、分析されている特定のサンプルに伴って変動してもよい。例えば、サンプルが小分子、殺虫剤などを含んでいた場合、標的３５０２ａは、ワークフロー３５００を使用した分析下でサンプル中に生じることがある、かかる分子を同定するであろう。シミュレータ３５０２ｂは、標的３５０２ａの同定された分子の属性又は物理化学的性質をシミュレートする。例えば、標的分子３５０２ａに対してシミュレータ３５０２ｂによって決定されるモデル化された属性は、保持時間、ドリフト時間、フラグメンテーションパターン情報（例えば、プリカーサーイオンをフラグメンテーションした結果として生成される、プリカーサー及び関連するフラグメントイオン）、プリカーサー及びフラグメントイオンのｍ／ｚに対する、予期された、モデル化された、又はシミュレートされた属性値を含んでもよい。モデル化された属性は、一般に、本明細書に記載され、また当該分野においても知られている任意の属性に対して、モデル化された値を含んでもよい。
モデル化又はシミュレートされた属性（例えば、３５０２ａの標的分子に関するモデル化された物理的及び化学的性質）は、モデル化された入力を使用してＭＭＡスケジュールを設定／決定する、スケジューラ３５０４ａに入力される。データ獲得パラメータ３５４０ａは、本明細書の他の箇所に更に詳細に記載され、一般に、行われる特定の実験及びデータ分析に伴って変動する。例えば、スケジューラ３５０４ｂは、シミュレートされた保持時間などに基づいて獲得と関連して溶出分子又は成分が予期される、順序を決定することができる。スケジューラ３５０４ｂは、例えば、スキャンサイクル／クロマトグラフィＦＷＨＭの数、スキャン時間、広帯域及び狭帯域ｍ／ｚ分離幅（ＭＩＷ）、並びに衝突エネルギーテーブルなど、獲得タイムラインに影響するパラメータ３５０４ａを設定する。パラメータ３５０４ａはまた、任意のユーザ定義の最小値又はマッチ許容差など、ユーザ定義の情報を含んでもよい。
サンプル分析は、スケジューラ３５０４ｂによって生成されるＭＭＡ設定又はスケジュールにしたがって動作する質量分析計を含む、機器３５０３によって行われる。実験行程又は注入の結果として、生データ３５０６ａが生成され、それが次にデータ処理３５０６ｂにおいて処理される。データ処理３５０６ｂは、後述される、また本明細書の他の箇所に記載されるような、データ処理を含む。例えば、データ処理３５０６ｂは、単一のスキャン処理、電荷クラスタ群又はＰＣＣを構築する処理、及びＰＣＣの電荷状態又は電位／候補電荷状態を決定する処理を含んでもよい。アライメント処理３５０６ｃは、各スキャンにおいて、プリカーサー及びプロダクト又はフラグメントイオンを整列させる（例えば、単一のスキャンに対してＳＳＰＰＩＳを形成する）こと、また（例えば、時間に伴って溶出するイオン若しくはＰＣＣの曲線を形成するため）ｍ／ｚによって時間内のＰＣＣを組み合わせることを含んでもよい。したがて、３５０６ｃのアライメント処理は、単一のスキャンに対してＳＳＰＰＩＳを形成すること、及びＳＳＰＰＩＳを同じＰＣＣに対して時間に伴って組み合わせる（例えば、時間に伴って溶出する同じＰＣＣのプロファイル若しくはエンベロープを形成する）ことを含んでもよい。整列したプロダクト及びプリカーサー又はＳＳＰＰＩＳは、次に逆多重化３５０６ｄに入力される。
一般に、逆多重化３５０６ｄは、（例えば、実験データのＰＣＣ又はプリカーサーイオンのフラグメンテーションを通して生成されるものと判断される、実験データ中のプロダクトイオンを選択的に改良、フィルタ処理、又は制限する）特定のプリカーサーイオン又はＰＣＣと関連付けられた特定のプロダクトイオンの更なる改良として特徴付けられてもよい。逆多重化は、例えば、各溶出成分に対して最良に同定するプロダクトイオンスペクトルの決定（例えば、フラグメントイオンが溶出成分のプリカーサーイオンを同定するのに使用されてもよい、溶出成分に関して、ＣＰＰＩＳに含まれる最良のフラグメントイオンを決定すること）に対して、本明細書に記載されるような様々な基準を使用して、ＰＣＣと関連付けられたフラグメントイオンを更にフィルタ処理、除外、又は除去することを含んでもよい（例えば、基準は、ＡＲ１及びＡＲ２値並びに本明細書に記載されるような他のものを使用してもよい）。
逆多重化の終わりに、教師なしクラスタリングと関連するものなど、ＣＰＰＩＳが溶出成分又は分子に対して構築されてもよい（例えば、同じ溶出成分又は分子に対するＳＳＰＰＩＳを組み合わせる）。教師なしクラスタリングの場合、処理３５０６ｅは、３５０８ｂの更なる検証のため、ＣＰＰＩＳを推定的なリポジトリ３５０８ｃに追加することを含んでもよい。検証されると、ＣＰＰＩＳはＭＩＲ ３５０８ａに含まれてもよい。
教師ありクラスタリングの場合、ステップ３５０６ｅは、（例えば、ｍ／ｚ、保持時間、及びドリフト時間（ＩＭＳが使用される場合）に基づいて）実験データからのＳＳＰＰＩＳのタイムラインにわたって、標的ＣＰＰＩＳをリポジトリ３５０８ｃから抽出すること、及び問い合わせることを含んでもよい。標的ＣＰＰＩＳにマッチする実験データ中のＳＳＰＰＩＳ（例えば、マッチするプリカーサー又はＰＣＣ ｍ／ｚ）は、組み合わされて実験ＣＰＰＩＳにされ、次にリポジトリ３５０８ｃに追加されてもよい。後に続く検証３５０８ｂは、ＭＩＲ ３５０８ａの溶出成分又は分子に対する既存のＣＰＰＩＳを置換又は補充する、実験ＣＰＰＩＳを更に検証する処理を行ってもよい。
行われた実験からの結果は、空間マッピング３５０５の形態で（例えば、３５０６ｃから３５０５ａ、３５０５ｂ、３５０５ｃ、３５０５ｄ、次にスケジューラ３５０４ｂへの流路を介して）３５０６ｃからスケジューラ３５０４ｂに戻されてもよい。３５０４ｂ〜３５０６ｃにフィードバックする実験データに基づいて、スケジューラ３５０４ｂは、スケジュール又はＭＭＡ設定を修正又は改訂し、また更にパラメータを修正してもよい（例えば、衝突電圧又はエネルギーの改訂、ＭＩＷの変更などを行ってもよい）。少なくとも一実施形態では、ＭＭＡスケジュール及びパラメータは改訂されてもよく、そして、ここまで同定されてなかった分子（例えば、前の注入行程若しくは実験で実験データが獲得されなかった分子）を同定するか、又は次のサンプル注入若しくは行程を用いて実験データを生成してもよい。例えば、第１の行程では、スケジューラ３５０４ｂは、標的３５０２ａにおける分子のシミュレートされた属性又は性質などのシミュレートされた情報に基づいて、獲得スケジュール及び関連するパラメータ３５０４ａを決定してもよい。この第１の行程の後、３５０２ａにおける分子のある第１の部分に対して実験データが得られてもよい。第２の行程では、スケジューラは、第１の部分にはない３５０２ａの他の分子に対して実験データを得る目的で、獲得スケジュール及びパラメータ３５０４ａを選択してもよい。
データベース検索３５０６ａは、本明細書に記載される教師ありクラスタリングを含んでもよく、その場合、標的溶出成分のＣＰＰＩＳが実験データのＳＳＰＰＩＳにマッチするか否かを判断するため、標的溶出成分のＣＰＰＩＳが３５０８ｃから選択されてもよい。マッチする場合、マッチする標的溶出成分に関する更なる属性がリポジトリ３５０８ｃから得られ、校正方程式及び／又はモデリングパラメータ３５０２ｄの形態（例えば、どの衝突エネルギーが使用されるべきか、溶出成分に対する保持時間はどれか、この溶出成分の異なるＰＣＣ又はプリカーサーに対するドリフト時間はどれか、溶出成分に対するフラグメンテーションパターン（プリカーサー、及び各プリカーサーに対する関連するフラグメントイオン）はどれか）で入力としてシミュレータ３５０２ｂに提供されてもよい。
一実施形態では、シミュレータ３５０２ｂは、最初に、全ての標的３５０２ａに対してシミュレートされた理論上のフラグメントパターン（例えば、各プリカーサー及びフラグメンテーションを介して各プリカーサーから発する関連するフラグメントイオン）を生成することなどによって、標的３５０２ａ中の全ての分子の物理的及び化学的性質を予測、シミュレート、又はモデリングするのに使用されてもよい。例えば、標的３５０２ａは１０００の分子を有するものと仮定する。シミュレータ３５０２ｂは、最初に、１０００の分子に対してかかるシミュレートされた属性情報を生成して、第１の実験行程を行う際の最初のＭＭＡスケジュール及びパラメータ３５０４ａを決定してもよい。ここで、第１の実験は、最初のＭＭＡスケジュール及びパラメータに基づいて、これらの溶出分子のうち２００に対する属性又は性質を含む実験データを獲得するように行われる。第１の実験行程を通して得られる２００の分子の属性は、次に、ここでシミュレータに入力されるフィードバックを形成してもよい。しかしながら、シミュレータ３５０２ｂは、実験データがまだ獲得されていない標的セットの残り８００の分子に対して情報のシミュレートを継続してもよい。同様の方法で、シミュレータ３５０２ｂはまた、ＭＩＲ ３５０８ａからの情報を用いて更新されてもよく（３５０８ａから３５０２ａへの矢印）、その場合、シミュレータ３５０２ｂは、ＭＩＲ ３５０８ａからの入力を使用し、残りの溶出分子情報をシミュレートしてもよい。例えば、第１の溶出分子の場合、ＭＩＲは、ＲＴ、ドリフト時間、溶出分子のプリカーサーのプリカーサー及びプロダクトイオンスペクトルなどの属性／物理的性質を含む。しかしながら、第２の溶出分子の場合、ＭＩＲは何ら情報を含まなくてもよい。したがって、シミュレータは、第１の溶出分子に対するＭＩＲからの情報を使用し、それを出力してもよい。しかしながら、第２の溶出が継続する場合、シミュレータは、シミュレートされた属性情報（例えば、どのプロダクトイオンが第２の溶出分子のどのプリカーサーに対して予期されるかを表す理論上のフラグメンテーションパターン）を出力し使用し続けることになる。少なくとも１つの実施形態では、ＭＭＡスケジュール（本明細書では、スケジュール若しくは獲得スケジュールとも呼ばれる）及びパラメータが改訂されて、ここでは次のサンプル注入又は行程を用いて、前に同定されてなかった標的３５０２ａの分子を同定してもよい（例えば、ＭＭＡ設定又はスケジュール３５０４ｂ及びパラメータ３５０４ａを修正して、シミュレータがシミュレートされた属性情報をまだ生成している３５０２ａの分子に対する実際の実験データを得ることを標的とする）。
３５００における様々な項目及び処理ステップに関する更なる詳細が、以下のパラグラフ及び図面に提供される。
モデリング３５０２と関連して、生物システムに対する応力の摂動効果を正確にモデリングしシミュレートする能力には、シミュレートされているシステムの確実な知識及び理解を要する。ペプチドのアミノ酸の基本的組成及び線形配列は両方とも分かっているので、そのペプチドに対する全ての可能なプリカーサー及びプロダクトイオンのｍ／ｚ及びzを計算することができる。これは、全てのオープンソース及び市販のペプチドデータベース検索エンジンに対する一般的な「運用法」である。プリカーサーが生成できる同位体の数は、その基本的組成及び濃度に直接関係する。以下のパラグラフは、モデリング段階又はプロセス３５０２の個々の構成要素について更に記載する。
上記された酵母サンプルに関する特定の実験と関連して、標的ファイル３５０２ａが提供されてもよい。細胞溶解物からのイオンがＬＣ−ＭＳワークフローにおいてどのように分布するかを正確にシミュレートするため、所与のピーク容量を反映して、入力されるタンパク質リストは可能な限り濃度によって順序付けされなければならない。この目的を達成するため、例えば、インターネット上などの一般に利用可能なソースから、１００を越える生及び処理済みの酵母細胞溶解物のデータセットが得られる。生データファイルは、当該分野で知られており、また例えば、本明細書に参照により組み込まれる、Ｃｏｘ，Ｊ．及びＭａｎｎ，Ｍ．（２００８）、ＭａｘＱｕａｎｔ ｅｎａｂｌｅｓ ｈｉｇｈ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｏｎ ｒａｔｅｓ，ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｐｐｂ−ｒａｎｇｅ ｍａｓｓ ａｃｃｕｒａｃｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２６（１２）、１３６７〜１３７２に記載されている、Ｍａｓｃｏｔ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒ及びＭａｘＱｕａｎｔを使用して処理した。ＵｎｉＰｒｏｔ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（２０１４年７月３日、入力６７５２件）ｆａｓｔａデータベースに対して、例えば、本明細書に参照により組み込まれる、Ｃｏｘ，Ｊ．，Ｎｅｕｈａｕｓｅｒ，Ｎ．，Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ，Ａ．，Ｓｃｈｅｌｔｅｍａ，Ｒ．Ａ．，Ｏｌｓｅｎ，Ｊ．Ｖ．、及びＭａｎｎ，Ｍ．（２００１１）、Ａｎｄｒｏｍｅｄ：ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅａｒｃｈ ｅｎｇｉｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ＭａｘＱｕａｎｔ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｓｅａｅｒｃｈ、１０（４）、１７９４〜１８０５に記載されているような、当該分野で知られているＭａｓｃｏｔ，Ｘ！ Ｔａｎｄｅｍ ａｎｄ Ａｎｄｒｏｍｅｄａを使用して、全てのプロダクトイオンスペクトルを検索した。各検索結果に対して、各スコアを全てのスコアの合計で割ることによって、タンパク質スコアを正規化した。タンパク質の濃度は、その正規化されたスコアの直接的結果であるものと仮定して、結果を組み合わせ、再正規化し、降順で分類した。これは、順序付けられたデータベースがどのように構築されるかを構成する。酵母の順序付けされたデータベースは、シミュレータ３５０２ｂに対する入力（例えば、標的３５０２ａ）とし手の役割を果たした。順序付けされたデータベースに加えて、ユーザは、オンカラム充填、勾配及びＩＭＳ校正ファイル、並びにドリフト、クロマトグラフィ、及びｍ／ｚに対する分解能に関して、モデリングパラメータ３５０２ｃ及び校正方程式３５０２ｄを入力する。Ｈｉ３定量化戦略を使用して、オンカラム充填は、各タンパク質モル濃度を確立するシミュレートされたタンパク質全体にわたって分配される。Ｈｉ３定量化戦略は、例えば、本明細書に参照により組み込まれる、Ｓｉｌｖａ，Ｊ．Ｃ．，Ｇｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｖ．，Ｌｉ，Ｇ．Ｚ．，Ｖｉｓｓｅｒｓ，Ｊ．Ｐ．、及びＧｅｒｏｍａｎｏｓ，Ｓ．Ｊ．（２００６）、Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ＬＣＭＳＥ ａ ｖｉｒｔｕｒｅ ｏｆ ｐａｒａｌｌｅｌ ＭＳ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌｒａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、５（１）、１４４〜１５６に記載されているように、当該分野で知られている。
図３６Ａ及び図３６Ｂを参照すると、シミュレータ３５０２ｂに提供されてもよい異なる入力を更に例証する、例３６００及び３６０１が示されている。集合的に、３６００及び３６０１の要素は、モデリングパラメータ３５０２ｃ及び校正方程式３５０２ｄに含まれる情報のサンプリングを表してもよい。特に、３６００及び３６０１の表及びモデルは、ペプチド、タンパク質、又はプロテオーム全体の入力セットからプリカーサー及びプロダクトイオン流束を推定するのに、シミュレータによって使用される、表及びモデルのサンプリングを示している。パネルＡ ３６０６は、ペプチド配列長さに基づくｚの分布を反映している。パネルＢ ３６０２は、ｎ末端及びｃ末端に対する帯電可能な残留物（Ｋ、Ｒ、Ｈ）の位置付けを所与として、適用される調節（％）の表を表す。パネルＣ ３６０４は、ｍ／ｚによるイオン化順序（最高から最低へ）を決定する。各ペプチドの各電荷状態のｍ／ｚは、ｙ切片がイオン化順序を定義する曲線上に置かれる。パネルＤ ３６１４の曲線は、各ｚに割り当てられるペプチドの面積の比率を定義する。パネルＥ ３６１６及び表１ ３６０８は、各アミノ酸のＣＣＳＡ及び疎水性値をそれぞれ示す。シミュレータは、これらの値を使用して、各ペプチドの保持時間及び各電荷状態のＣＣＳＡを計算する。表２ ３６１２は、各ジペプチド結合に対する頻度の値を反映する。低エネルギーにおけるプリカーサーイオン強度から上昇エネルギーにおける残留物の強度を引いた差として定義される残留物の差に、計算された値を掛けて、フラグメントイオン強度が設定される。割り当てられた強度（１０００を掛けたもの）は、同位体にわたって分配される。
質量分析部内へと電気スプレーされると、ペプチドは複数の電荷状態を帯びることができる。パネルＡ ３６０６及びパネルＢ ３６０２はそれぞれ、ペプチド長さ及び特定の帯電可能な残留物の位置の関数としてのｚの分布を反映する。タンパク質は、アミノ酸組成が関与する限り、非常に類似している。パネルＣ ３６０４に反映された曲線はイオン化順序を割り当てる。各ペプチドは、それが取ることができる理論上の電荷状態の数に基づいて、ｍ／ｚ又は一連のｍ／ｚ値が割り当てられる。各ｍ／ｚ値の曲線上における位置は、０〜１（１は最良のイオン化）の順位に反映される。組成の類似性を所与として、最良から最低までのタンパク質ごとのペプチドイオン化の数は、長さの直接の関数である。それらのペプチドがどのように分配されるかは、パネルＤ ３６１４に示される。組成の類似性を仮定して、３６１４の各ビンを占めるペプチドの数も長さの関数である。これが当てはまる場合、ペプチドはタンパク質に対して、３６１４の１０個のビンにわたって分配される。どのペプチドがどのビンに常在するかは、それらのｍ／ｚ値がパネルＣ ３６０４の曲線上のどこにあるかの関数である。概して、１０ｋＤａ（ダルトン）のタンパク質はビン１つ当たり１つのペプチドをもたらし、それにより、１００ｋＤａのタンパク質は１０個をもたらす。順序が定義されると、最良のイオン化ペプチドの強度が、タンパク質のモル量を所与として割り当てられ、応答因子（ｃｔｓ／モル）が計算又は定義され、他の全てが、最良のイオン化ペプチドの強度を乗算することによって、それらの曲線上の位置に割り当てられる。各プリカーサーｍ／ｚがその強度を受け取ると、同位体モデリングアルゴリズムを使用して分配される。
物理化学的属性、保持時間、ドリフト時間、及び衝突断面積に対するモデリングアルゴリズムは、当該分野において、例えば、全て参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｒｏｋｈｉｎ、Ｏｌｅｇ Ｖ．、及びＶｉｃ Ｓｐｉｃｅｒ、「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１０）：１３〜１４、Ｐｅｔｒｉｔｉｓ、Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｏｎｓら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｌｕｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ＭＳ ｂｙ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７８．１４（２００６）、５０２６〜５０３９、並びにＭｅｅｋ、Ｊａｍｅｓ Ｌ．、「Ｐｒｅｄｉｃｉｔｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ｉｎ ｈｉｇｈ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ７７．３（１９８０）：１６３２〜１６３６、Ｍｏｒｕｚ、Ｌｕｍｉｎｉｔａら、「Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １２．８（２０１２）：１１５１〜１１５９、Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ、Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｊ．ら、「Ｕｓｉｎｇ ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｄａｔａ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｉｚｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ １０．５（２０１１）：２３１８〜２３２９、並びにＫｎａｐｍａｎ、Ｔｏｍ Ｗ．ら、「Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｖｅｌｌｉｎｇ ｗａｖｅ ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ２９８．１（２０１０）：１７〜２３において知られている。
パネルＥ ３６１６及び表１ ３６０８はそれぞれ、各アミノ酸の衝突断面積及び疎水性係数（ＨＩ）値を示す。基本的組成、線形配列、長さ、及びｚが分かっていると、所与のカラムタイプ、勾配プロファイル、流量、カラム温度、ガス密度、及び電界強度に対して、溶出及びドリフト時間を予測することができる。シミュレータ３５０２ｂは、これらの値を利用し、モデル化されたペプチド及びそれらそれぞれの電荷クラスタ群の溶出及びドリフト順序を推定する。実験値と予測値との間のばらつきは、測定可能な属性それぞれに対してどの程度良好にモデルが定義されているかの関数である。
ペプチドフラグメンテーションは、提供される機器プラットフォーム／ジオメトリとは独立している。同様のフラグメンテーション方法（例えば、低エネルギーＣＩＤ／衝突セル）及びそれらの機器は、同様のガス圧及び衝突エネルギー下で動作する。表２ ３６１２は、シミュレータによって利用される３つのフラグメンテーション表のうち１つの一区画を示している。各表は、アミノ酸の全ての可能な二元対（ＡＡ、ＡＣ、ＡＤなど）のマトリックスを反映する。順序付けられた入力ｆａｓｔａデータベースの構成と同様に、マッチしたプロダクトイオン強度はそれぞれ、そのペプチドのマッチしたプロダクトイオン全ての合計強度に対して正規化される。第１の表は、４００の可能な二元対それぞれに対して正規化された強度を反映する。第２のものは、可能な二元対（配列）それぞれの正規化された頻度を反映し、第３のものは、同定された対の頻度を表す。各二元対に対して、対がどの程度の頻度で同定されたかと、対がどの程度の頻度で同定されたかとの頻度比が計算される。次に、正規化された強度比値を、正規化された頻度で割り（現在／検出されたもの）、結果を二元対の総計に対して正規化する。３つのモデルを使用して、分数値を理論上のプロダクトイオンそれぞれに割り当てる。プロダクトイオン強度は、その分数値を、ペプチドの電荷クラスタ群の強度値に対して乗算することによって計算される。次に、割り当てられた強度は、適切な数の同位体へと分配される。フラグメンテーションモデリングプロセスの更に詳細な説明は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、「Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｂｅｎｃｈｍａｒｋｉｎｇ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｓ ａｎｄ ａ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｆｅａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、１３（８）、２０５６〜２０７１に見出すことができる。
少なくとも一実施形態では、３５００のＭＭＡ全体のワークフローは、自動化プロセスとして、完全なユーザ制御又は行程下にあってもよい。ワークフロー３５００の概略は、単一のサンプルに適用することができ、あるいは技術的又は生物学的複製の帰納的及び／又は徹底的分析のため、反復して実行することができる。上述されたように、実線の矢印及びコネクタは、最初のＭＭＡスケジュール設定及びパラメータ構成に対してシミュレートされたイオン流束を使用することを示す第１の経路を形成し、破線の矢印及びコネクタは、スケジューリングされた獲得（スケジューラ３５０４ｂによって生成される）の獲得タイムラインが前の注入のイオン流束に基づく、反復するワークフローを反映する第２の経路を形成する。
バッチ分析モードでは、獲得後処理は、最も高いスコアのペプチドを最小二乗適合に対する分子マーカーとして使用して、注入間の保持及び／又はドリフト時間のあらゆるばらつきを補正してもよい。それに加えて、一実施形態のスケジューラ３５０４ｂ及びＭＭＡスケジュールと関連して、各狭帯域及び広帯域獲得に対する中央ｍ／ｚは、同じサイクルの次のスキャンでは除外される。除外リストは累積的であり、ｍ／ｚスケールのどの部分が単位時間ごとに狭域でサンプリングされるべきかを継続して限定する。中央ｍ／ｚの一定した変化により、異なるプロダクトイオンスペクトルの獲得が、逆多重化アルゴリズムによって処理される場合、継続して増加する選択性のプロダクトイオンスペクトルを生成することが担保される。低エネルギースキャンの全ｍ／ｚドメインが、複数の分離ウィンドウ内で複数回サンプリングされると、プロセスは、生物学的サンプルの単一の混合物、複製、又はコホートの全ての注入が使い果たされるまで繰り返す。更に詳細に後述される例３７００におけるグレイのストリップ状の境界線Ｄ１は、同じｍ／ｚ空間の複数のサンプリングを示す。この反復アプローチによって、各溶出ペプチドに対して非常に特異的なプロダクトイオンスペクトルの作成が可能になる。全ての注射にわたる全スペクトルの全イオンに対して測定された全ての物理化学的属性が含まれる。ＭＭＡ戦略は、プロダクトイオンスペクトルの数及び選択性を著しく増加させるが、感度にはほとんど影響しない。各プロダクトイオンスペクトルの結果として得られる清浄性によって、ワークフローが、従来のデータベース検索に対して、並びにＳＩＣ標的化に対して理想的になる。
スケジューラ３５０４ｂによるサイクル時間の決定と関連して、図３７が参照される。標識なしの、等圧の、及び同位体標識付きのサンプルの非常に正確なＡＵＣ定量化を行う能力を維持するためには、そのピークの溶出ペプチドのＦＷＨＭにわたって最小で５つのデータ点を要する（例えば、図７の点Ｈ１及びＨ２の間など、２つの半値点間に５つのデータ点／５つのスペクトルを必要とする）。そのため、適切なスキャンサイクル時間、獲得速度、及びスキャンサイクルごとの獲得数を決定するための開始メトリックは、中央クロマトグラフィＦＷＨＭである。スケジューラ３５０４ｂは、ダイナミックレンジ（例えば、検出されたイオンに対する信号強度を表す計数の範囲）、検出器の検出範囲の基準、機器の応答因子（計数／注入モルの単位）、及びＬＯＤなどの入力を使用する、ＭＭＡタイムラインを構築するアルゴリズムを使用して、処理を行ってもよい。応答因子は、ユーザ定義であるか、又は例えば、参照により本明細書に組み込まれる、
Ｓｉｌｖａ，Ｊ．Ｃ．、Ｇｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｖ．、Ｌｉ，Ｇ．Ｚ．、Ｖｉｓｓｅｒｓ，Ｊ．Ｐ．、及びＧｅｒｏｍａｎｏｓ，Ｓ．Ｊ．（２００６）、Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ＬＣＭＳＥ ａ ｖｉｒｔｕｅ ｏｆ ｐａｒａｌｌｅｌ ＭＳ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、５（１）、１４４〜１５６などに記載されるように、実験的に決定されてもよい。
要素３７１０は、１つの例示的実施形態において、スキャンサイクル時間を決定するのに使用される情報を要約している。獲得速度は、ＬＯＤの５倍に比例する（最低の予期されるイオンに対して有用な信号を生成するＭＳ蓄積時間）が、最速スキャン時間（５０ｍｓ）を超えることはない。手動モードでは、スキャン速度、獲得時間、応答因子、及びダイナミックレンジを含む全てのパラメータが、ユーザ定義であってもよい。スキャンサイクル当たりの獲得数は、計算された獲得速度、機器のスキャン間遅延時間、基準（ロック）マスの獲得頻度を使用して決定される。スキャンサイクル時間の決定と関連して、中央ピーク幅、及びしたがって中央ＦＷＨＭは、実験行程から分かる。この例３７１０では、ＦＷＨＭが０．１８分又は１０．８秒であると仮定する。本明細書に記載されるような少なくとも１つの実施形態では、１０．８秒間隔内で最低５つの点、及びしたがって５つのスペクトル又はスキャンが望ましい。したがって、２．１６秒／スキャンサイクルの最小スキャンサイクル時間が、最小５つを担保するのに使用されてもよい。この特定の例では、１．８６秒のサイクル時間が、約６サイクル／ＦＷＭＨで、ＭＭワークフロー３５００と共に使用される（例えば、１０．８／６＝１．８秒）。
３７２０を参照すると、１．８６秒の第１のスキャンサイクルの場合、一実施形態は、１７のデータ獲得又は実験を、またしたがって、感度を損失することなく（１００ミリ秒の獲得時間で）単一ピークにわたって１７×６＝１０２の実験又は獲得を行ってもよい。１７のデータ獲得は、１つの低エネルギースキャンＡ１と、２つの広帯域スキャンＢ１と、１４の狭帯域スキャンＣ１とを含む。要素Ａ１は、３００〜１９５０ｍ／ｚ範囲にある全てのプリカーサーイオンが通される、単一の低エネルギー（ＬＥ）スキャンを表す。広帯域ＭＩＷ Ｂ１及び狭帯域ＭＩＷ Ｃ１に関して異なるＭＩＷが、選択的なプリカーサーイオンフラグメンテーションに利用されてもよい。５０〜５００ｍ／ｚ値の範囲又は幅をそれぞれ有する、２つの広帯域ＭＩＷ Ｂ１が選択されてもよい。１〜５０ｍ／ｚ値の範囲又は幅をそれぞれ有する、１４の狭帯域ＭＩＷ Ｃ１が選択されてもよい。一般に、特定のｍ／ｚ範囲内におけるプリカーサーイオンの数の密度に応じて、異なるＭＩＷ（中帯域又は狭帯域）が選択されてもよい。例えば、より低いイオン流束を有するｍ／ｚ範囲 Ａ１の領域では、中帯域ＭＩＷが使用されてもよい。より高い／最高のイオン流束のｍ／ｚ範囲 Ａ１の領域では、狭帯域ＭＩＷが使用されてもよい。このように、かかるより高い／最高のイオン流束の領域においてイオン干渉を最小限に抑え、イオン（例えば、プリカーサーから生成されたフラグメント）を空間的に分解又は分離するために、より高い／最高のイオン流束を有するｍ／ｚ範囲の部分には、より狭いＭＩＷが使用されてもよい。一実施形態では、後に続くスキャンサイクルにおいて、後に続くスキャンの各ＭＩＷと関連付けられるｍ／ｚ部分範囲をシフトさせるために、前のスキャンサイクルとは異なる中央点をそれぞれ有する、２つの広帯域ＭＩＷ及び１４の狭帯域ＭＩＷが選択されてもよい。各ＭＩＷのサイズは、ある連続する数のｍ／ｚ値に対応する、任意の規定のｍ／ｚビン内におけるプリカーサーイオンの所望の最大数に基づいて決定されてもよい（例えば、ｍ／ｚビンごとに１０以下のプリカーサーイオン）。これについては、前の注入からの様々な分布を示す図３８を参照して更に詳細に後述される。
ＩＭＷの決定と関連して、任意のプロダクトイオンスペクトルが占めることができる、限定された量のｍ／ｚ空間がある。したがって、最小限のキメラ性の干渉でその空間に取り込むことができるプロダクトイオンの数は、単位時間当たりに衝突セル内に存在する、プリカーサー個体群及びその凝集プロダクトイオンの関数である。図３８の例３７５０では、実験データから生成され、本明細書の技術による一実施形態におけるサイクル時間の特定のスキャンで使用されるＭＩＷを決定するなど、ＭＭＡスケジューラ３５０４ｂへの入力を提供するのに使用されてもよい、空間マッピング３５０５を例証する例が示されている。パネルＡ ３７５２は、２次元のｍ／ｚ対ｔｒビンへとグループ化されたプリカーサーイオンを示すイオン流束ヒートマップを表す。各ｍ／ｚ対ｔｒビンは、１０Ｔｈ幅及び０．２分幅である。パネルＢ ３７５４は、ｍ／ｚ対保持時間の分布を反映する。パネルＣ ３７５６は、ｍ／ｚ対ドリフトの分布を反映する。パネルＤ ３７５８は、保持時間ｔｒ対ドリフト時間ｔｄの分布を反映する。最高のイオン流束を有するｍ／ｚ範囲の密に取り込まれた部分は、３７５２の「＊」によって表され、また、３７５４及び３７５６では、密に取り込まれたｍ／ｚ範囲は境界線β及びβ’の間である。したがって、例えば、３７５４及び３７５６における境界線β及びβ’の間のｍ／ｚ範囲は、狭帯域ＭＩＷが使用されるｍ／ｚ範囲を表してもよく、広帯域ＭＩＷは、境界線β’の上及びβの下のｍ／ｚ範囲（境界線β及びβ’によって区切られる範囲外）で使用される。
３７１０に示されるような１００ｍｓのスキャン速度及び１０ｍｓのスキャン間遅延時間において、各スキャンサイクルは、それ自体の実験としてそれぞれ処理される約１０８のスペクトルを含んでもよい。１．８６秒の中央クロマトグラフィＦＷＨＭにわたってこれらのスペクトルがどのように分配されるかの例が、図３７の３７２０に示される。３７２０で、毎スキャンサイクルの第１の獲得は、低エネルギープリカーサーイオンスキャンであり、その後、（パネルＢ ３７５４に反映されるように）上下の境界線β及びβ’の外にある関連するｍ／ｚ範囲を有する、２つの広帯域上昇エネルギースキャンＢ１が続く。広帯域ＭＩＷ獲得の幅は、ドリフトビンごとに１０のプリカーサーイオンの限界によって定義されてもよい。狭帯域ＭＩＷと関連する第１の例として、スケジューラは、各スキャンサイクルに対して、境界線β及びβ’内の最高の正規化された強度を反映する、計算された数のプリカーサーイオンを選択する。かかるプリカーサーイオンに対するｍ／ｚ値は、狭帯域ＭＩＷの開始ｍ／ｚ範囲を決定するのに使用されてもよい。選択されたｍ／ｚ値を使用して、各狭帯域獲得のための幅は、ドリフトビンごとに最大１０のプリカーサーイオンと同様に計算されてもよい。このように、本明細書の他の箇所に記載されるように、各ＭＩＷと関連付けられたｍ／ｚ範囲及び幅は、ドリフト時間ビンごとに１０の最大数１０のプリカーサーイオンを含むことに基づいて、ＭＩＷの調整目標によって変動してもよい。変形例として、広帯域及び／又は狭帯域ＭＩＷと関連付けられた質量分離幅もユーザ定義であってもよい。同じ時間空間、ドリフト、及びｍ／ｚの部分は、ＭＩＷの中央のプリカーサーｍ／ｚが固有である限り、同じスキャンサイクル内で再サンプリングされてもよい。スキャンサイクル数を定義する中央クロマトグラフィＦＷＨＭを用いて、各プリカーサーは、単一のスキャンサイクルにおけるその溶出にわたって２回以上サンプリングされる機会を有する。プロセスは、現在のスキャンサイクルの狭帯域又は広帯域ＭＩＷのどちらかで全てのプリカーサーイオンがサンプリングされるまで繰り返す。スケジューラは、多次元空間のどの領域が狭帯域でサンプリングされているかを把握する。バッチ獲得モードで操作されて、中央ｍ／ｚ値の累積的な除外によって、パネルＢ ３７５４、Ｃ ３７５６、及びＤ ３７５８に示される境界線β及びβ’内のｍ／ｚ、時間、及びドリフト空間が、プロセスを繰り返す前に完全にサンプリングされてもよい（例えば、区切られた多次元空間全体に対して上昇エネルギースキャンデータを得る）ことが担保される。
区切られた多次元領域の規定の範囲（例えば、パネルＢ ３７５４、Ｃ ３７５６、及びＤ ３７５８の境界線β及びβ’によって表される）が、規定の範囲に対して再び繰り返される前にサンプリングされることを担保する上記処理は、一般に、単一の注入若しくは行程の中で行われてもよく、又は複数の注入又は行程にわたってもよい。複数の注入にわたる場合、使用するサンプルが、行われる分析に対して同じ又は共通の分子セットを含む（例えば、全てのサンプルが、標的３５０２ａで定義されるような分子を含む）限り、各注入又は行程において、同じサンプル又は異なるサンプルが使用されてもよい。複数の注入にわたる場合、第１の注入又は行程に関連する実験データ（例えば、イオン流束、網羅又はサンプリングされたｍ／ｚ範囲など）などの情報を、スケジューラによって使用して、第２の次の注入又は行程（例えば、次の第２の注入及び行程の各スキャン及びスキャンサイクルに対する広帯域及び／又は狭帯域ＭＩＷのｍ／ｚ範囲）のスケジュールが自動的に決定されて、多次元有界領域全体の完全なサンプリングが担保されてもよい。より一般的には、上記は、複数の注入、同じ注入の複数のサイクル及びスキャンサイクルなどにわたってもよい、ワークフロー処理の反復性及びフィードバックを示している。スケジューラ３５０４ｂは、一般に、多次元有界領域のどの部分が現在の時点で既にサンプリングされているかに関する情報を提供されてもよく、それによって、スケジューラは、まだサンプリングされていない多次元有界領域の残りの部分をサンプリングする処理を行ってもよい（例えば、現在の時点に続いて質量分析計及び／又はイオンモビリティースペクトロメトリー計のサンプリング及び動作のスケジュールを決定して、多次元有界領域に対して行われ得る繰返しの前に、多次元有界領域全体がサンプリングされていることを担保する）。本明細書に記載されるように、上記のフィードバックを注入間にスケジューラに提供する情報は、イオン流束及び他のデータなどの実験データを含んでもよい（例えば、図３８の例３７５０を参照）。
一般に、広帯域及び狭帯域ＭＩＷの幅は、アルゴリズムによって決定されてもよく、又は上記されたようにユーザ定義であってもよい。スケジューラは、前の獲得のタイムラインを確認して、広帯域及び狭帯域それぞれの獲得に対する中央ｍ／ｚが除外されるように新しい獲得タイムラインを設定する。ＭＭＡタイムラインの構築は、ユーザ定義のクロマトグラフィＦＷＨＭ又は前の実験の中央値どちらかを利用して行われてもよく、この例では、スケジューラがスキャンサイクルの数を６に設定する。この例の自動モードでは、獲得順序は、１つの低エネルギーフルスキャン、２つの広帯域（５０Ｔｈ＜ＭＩＷ＜５００Ｔｈ）スキャン、及びｎ個の狭帯域（１Ｔｈ＜ＭＩＷ＜５０Ｔｈ）スキャンを実行するように設定され、ここで、ｎはユーザ定義又はアルゴリズムで決定されるＬＯＤ（モード）の関数である。スケジューラは、スキャン間遅延時間及び応答因子（ｃｔｓ／モード）を最小限の入力として要する。応答因子（ＲＦ）は、基準質量から計算するか、又はユーザ定義であることができる。スキャン間遅延時間に加えて、ＬＯＤ／ＲＦアルゴリズムは獲得時間を決定する。スキャンサイクル時間を獲得時間で割って獲得数が設定され、狭帯域獲得の数（ｎ）はサイクル中のスキャンの合計数から３を引いたものに等しい。
サイクル時間、獲得速度、獲得数、及びＭＩＷの幅を設定するのに加えて、自動モードで動作させた場合、スケジューラ３５０４ｂはまた、各ＭＩＷに対して適用される衝突エネルギーを監視し、必要に応じて調節してもよい。ＭＭＡワークフローにおけるパラメータ３５０４ａの多くと同様に、衝突エネルギー表はユーザ定義であることができ、前の注入からのフラグメンテーション効率データを使用して常駐テーブルを最適化することができる。データ処理３５０６ｂと関連して本明細書の他の箇所に記載されるように、フラグメンテーション効率が各溶出ペプチドに対して計算されてもよい。二次元データ（時間及びｍ／ｚ）では、ｚに関わらず、同じペプチドからのプリカーサーイオンが同時にフラグメンテーションする。各ｚを効率的にフラグメンテーションするため、衝突エネルギーは、獲得時間それぞれにわたって最適値の間で切り換えられる。三次元データでは、効率的なフラグメンテーションに最適な衝突エネルギーはドリフト時間の関数として適用されるので、プリカーサーイオンはｍ／ｚ及びｚによって分離される。スケジューラは、入力データから一連のフラグメンテーションプロファイル（ｍ／ｚ対ｚ）を計算して、常駐衝突エネルギー表を最適化する。プリカーサーイオン及び質量分離ウィンドウの動的選択及び除外と同様に、バッチ分析モードで、プロセスの反復性によって衝突エネルギー表は継続的に最適化される。
次に、データ処理及び分析段階３５０６について更に詳細に記載する。本明細書の考察と同じく、単一のスキャン処理が行われる。３７００に示される例のＭＭＡシナリオ（例えば、６０分間のクロマトグラフィ分離空間、１．８６秒のサイクル時間、１００ｍｓの獲得、及び１０ｍｓのスキャン間遅延を有する）を考慮すると、約２，０００の低エネルギーＨＤＭＳＥ ＩＭ−ＤＩＡの全てのイオンスキャン又はスペクトルが獲得され、約４，０００の変動する質量分離幅の広帯域（５０Ｔｈ＜ＭＩＷ＜５００Ｔｈ）スキャン又はスペクトルが獲得され、約２４，０００の狭帯域（１Ｔｈ＜ＭＩＷ＜５０Ｔｈ）スキャン又はスペクトルが収集される。３５０６のＭＭＡデータ処理アルゴリズムは、各スキャンをそれ自体の独立実験として処理する。処理は、基準（ロック）マスチャネルからの情報にアクセスすることによって開始される。このチャネルの分析は２つの重要な情報、つまり、ｏａ−ＴＯＦ分析器の質量分解能と、溶出時間全体にわたるｍ／ｚ校正の安定性を提供する。獲得チャネルは時間順でスキャンごとに処理される。各スキャンに対して、ｍ／ｚ（２Ｄ）及びｍ／ｚドリフト（３Ｄ）ベクトルが、単一スキャンのセンタリングアルゴリズムを使用してセンタリングされる。センタリングプロセスの間、全ての次元（ｔｒ、ｔｄ、及びｍ／ｚ）において各イオンに対してＦＷＨＭが計算される。これらの値は、基準質量データと併せて、純度スコア、イオンの面積が固有のものか否かを判断するのに利用されるメトリック、又は干渉による複合物（例えば、そのイオン信号若しくは面積は、別の干渉するイオンによる寄与を有する）を計算するのに使用される。
データ処理３５０６ｂは、後述される図３９及び図４０の情報を含む情報を使用して処理を行うこと、またそれと併せて、同じスキャンにおけるイオンの候補の同位体クラスタを形成すること（例えば、それによってＰＣＣを形成すること）、電荷ｚをＰＣＣに割り当てること、並びにイオン干渉に関して補正することを含んでもよい。後述されるように、ＰＣＣを形成し、それに電荷状態を割り当てるかかる技術は、本明細書に記載される他の処理と関連して行われてもよい。例えば、ＰＣＣを形成し、それに電荷状態を割り当てることは、本明細書の他の箇所に記載される教師なしクラスタリングと関連して行われてもよい。少なくとも１つの実施形態では、イオン純度スコア、センタリングされたｍ／ｚドリフト、及び面積値がプリカーサーイオンに関して計算されると、各プリカーサーイオンのｍ／ｚ値が、その公称整数ｍ／ｚとその分数ｍ／ｚという２つの別個の値に分解される。例えば、６８０．３３のｍ／ｚを有する単一スキャンにおけるプリカーサーイオンの場合、公称ｍ／ｚ＝６８０、分数ｍ／ｚ＝０．３３である。
図３９を参照すると、異なるイオン電荷状態に対する公称ｍ／ｚ値対分数ｍ／ｚ値のプロットを例証する一例が示されている。この例３８５０では、特定の機器の分解能に基づいて、最大６つの可能な電荷状態が存在してもよく、３８５０のグラフは、イオンに対する公称ｍ／ｚ対分数ｍ／ｚの分布を示している。３８５０を取り込むのに使用される情報は、任意の好適な手段を使用して決定される既知のイオンデータを使用して構築されてもよい。例３８５０によって分かるように、特定の電荷状態に固有のベクトル、並びに同じｍ／ｚが複数のｚ値に対して取ってもよいベクトルを含む、電荷ベクトルが形成される。例えば、以下は、特定の電荷状態に固有の電荷状態ベクトルであってもよく、ラインＬ１及びＬ２の間は主に３＋（例えば、ｚ＝３）の電荷状態のイオンを含み、ラインＬ２及びＬ３の間は主に４＋の電荷状態のイオンを含み、ラインＬ３及びＬ４の間は主に５＋の電荷状態のイオンを含み、ラインＬ５及びＬ６の間は主に１＋の電荷状態のイオンを含み、ラインＬ６及びＬ７の間は主に４＋の電荷状態のイオンを含み、ラインＬ７及びＬ８の間は主に３＋の電荷状態のイオンを含み、ラインＬ１０及びＬ１１の間は主に５＋の電荷状態のイオンを含み、ラインＬ１１及びＬ１２の間は主に３＋の電荷状態のイオンを含み、ラインＬ１２及びＬ１３の間は主に４＋の電荷状態のイオンを含む。以下は、ラインＬ４及びＬ５の間（例えば、１＋、２＋、３＋、及び４＋などの複数の電荷状態のイオンを含む）、並びにラインＬ９及びＬ１０の間（例えば、２＋及び４＋などの複数の電荷状態のイオンを含む）に複数の電荷状態を含む、多重レーンの電荷状態ベクトルとして特徴付けられてもよい。更なるＩＭＳドリフト時間の次元が利用可能な場合、ドリフト時間対分数ｍ／ｚ部分のプロットが同様に形成されてもよく、プロットは、固有の電荷状態ベクトル及び多重レーンの電荷状態ベクトルの両方を示す。
上記は、固有及び多重レーン両方の電荷状態ベクトルを含んでもよい分布の例であり、分数ｍ／ｚ空間内の分離の異なる図を提供する。ｍ／ｚのモダリティは、電荷ｚに関連するように観察されてもよく、それにより、分数ｍ／ｚの分布が、特定の電荷状態に関して多重モードとして特徴付けられてもよい。例えば、ｚ＝４イオンはｚ＝２イオンと交互であることができ、ｚ＝６イオンはｚ＝３イオンと交互であることができる。しかしながら、一部の分数ｍ／ｚ値は所与の電荷状態に対して固有であってもよい。電荷状態ｚ＝２のイオンに対しては存在できない／しない、電荷状態ｚ＝４に対するいくつかの分数ｍ／ｚ値がある。同じことが、電荷状態ｚ＝６及びｚ＝３に関しても当てはまる。それに加えて、２＋及び４＋、又は３＋及び６＋のような特定の電荷状態の対は両方とも多重モードであり、更に調和級数の特性を反映する。ｚ＝３を一例として使用して、同位体間の予期される分数ｍ／ｚの差は、０／３、１／３、及び２／３に等しいであろう。これらは常に、２＋及び４＋、又は３＋及び６＋のような調和する電荷状態における分数ｍ／ｚの交互配置である。しかしながら、２つの２＋同位体系は、４＋系の同位体分布を模倣するようい交互配置することはできない。２つの３＋同位体系も６＋系を模倣することができない。多重レーン電荷状態ベクトルの１つにマッピングされたイオンに対するｚの適正な割当ては、モジュラー演算の関数として決定されてもよく、ｚ＝係数である。少なくとも１つの実施形態では、分数ｍ／ｚに基づいた１つ又は２つ以上の分布プロットなどの情報は、電荷状態分離を何らかの形で指示してもよく、それにより、電荷状態ベクトルが１つの電荷状態と一意に関連付けられる共に、多重レーン電荷状態ベクトルが複数の電荷状態と関連付けられる。かかるプロット（例えば、図３９のものなど）を使用して、各イオンに対する最初の又は候補の候補電荷状態割当てが行われてもよい。いくつかの場合では、最初の電荷状態割当ては、複数の可能な電荷状態を含むセットであってもよい。ドリフト時間の更なるＩＭＳの次元を追加することは、更なるプロット、例えば、ドリフト時間対分数ｍ／ｚを得るのに使用されてもよく、異なる電荷状態のグループ化に対するイオンの選別を改善することが可能になることが注目されるべきである。かかる最初の電荷状態割当てに続いて、可能な場合、後述されるような連鎖を使用して候補の同位体クラスタ又はＰＣＣを形成する、更なる処理が行われてもよい。
更に例証するため、次に、本明細書の技術による一実施形態で使用されてもよい表を含む図４０が参照される。表３８００は、係数がｚに等しく、モジューロ数が、分数ｍ／ｚが一巡してゼロで再開する前の一連における同位体の最大数に等しい、モジュラー演算を反映する。各セルにおいて表される分数値は、理論上の同位体／ｚ又は係数の比を反映する。表３８００の情報は、次に記載されるように、同位体を連鎖させてＰＣＣとするのに使用されてもよい。表３８００は、可能な電荷状態それぞれに対する行と、可能な同位体それぞれに対する列とを含む。この例では６つの可能な電荷状態があり、係数は、３８０４の行の値１＝６によって表されるようなｚである。それに加えて、電荷状態に応じて、６つ以下の同位体が含まれてもよい。各列は、可能な同位体Ａ０〜Ａ５のうち特定の１つに対応し、「Ａｎ」は、より一般的には特定の同位体を表し、「ｎ」は非負整数であり、特定の同位体に対する「ｎ」は、その特定の同位体と関連付けられた表３８００の列を表す。異なる同位体に対応する「ｎ」の値はモジューロ数３８０２を表す。表の入力は、特定の同位体Ａ１〜Ａ５が同位体Ａ０に対して単一のスキャン内にある、ｍ／ｚに関するステップ又はΔ距離を表す。表の各入力は、値の対（Ｘ、Ｙ）によって同定されてもよく、Ｘは「ｚ」又は係数行の識別子を表し、Ｙは特定のＡｎ同位体と関連付けられた列の識別子「ｎ」を表す。表の入力の値は、その入力に対する同位体数「ｎ」（例えば、Ｙ）を、その入力に対する電荷状態（例えば、Ｘ）で割ったものに等しい。より一般的には、表の各入力の値＝Ｙ／Ｘであり、入力は上述したように（Ｘ、Ｙ）によって同定される。
行３８０４ｄを参照してｚ＝３を使用すると、同位体間の予期される分数ｍ／ｚの差は、０／３、１／３又は．３３、及び２／３又は．６７に等しい。行３８０４ａを参照してｚ＝６を使用すると、同位体間の予期される分数ｍ／ｚの差は、０／６、１／６又は．１６７、２／６又は．３３、３／６又は．５、４／６又は．６６７、及び５／６又は．８３３に等しい。したがって、３＋及び６＋のような調和する電荷状態における分数ｍ／ｚの交互配置があるが、それは、電荷状態３に対する２つの連続する同位体間のΔｍ／ｚが、電荷状態６に対する２つの連続する同位体間のΔｍ／ｚの倍数であるためである（例えば、電荷状態３に対するＡ０とＡ１、又はＡ１とＡ２などの任意の２つの連続する同位体間の．３３３Δｍ／ｚは、電荷状態６に対するＡ０とＡ１などの任意の２つの連続する同位体間の／１６７Δｍ／ｚの倍数（２倍）である）。しかしながら、かかる交互配置が生じず、それにより、Ａ０同位体からの特定のΔｍ／ｚ距離（例えば、表入力に記憶される値）が表の単一の入力のみに現れる、表の特定の入力がある。例えば、３８０３ａ〜３８０３ｅによって表される表３８００の入力は、表の固有の入力であり、したがって電荷ｚがイオンに割り当てられてもよい例を表す。
更に、表３８００を使用して、同じスキャンの異なる同位体を連鎖又は接続して、以下に後述されるような候補のＰＣＣが形成されてもよい。処理は、低エネルギースキャンにおける最低のｍ／ｚイオン（例えば、スキャンにおける最低のｍ／ｚプリカーサーイオン）を選択して、最初のリンクがＡ０同位体であることを担保することによって始まる。全ての可能な電荷状態が分かっていて、次に処理は、２＋及び４＋、又は３＋及び６＋イオンの調和モダリティ効果に対処する最高の理論上の電荷状態で始まる。例えば、処理は、列１ ３８０２ａで始まり、最高の電荷状態ｚ＝６（行１）から最低の電荷状態ｚ＝１（行６）まで、連続順で下の列に移行する。値Ｄ（Δｍ／ｚを表す）を有する列の各入力から、スキャンのｍ／ｚ値が問い合わされて、A０のｍ／ｚ＋Dの合計に等しいｍ／ｚがスキャン中にあるか否かが判断される。例えば、スキャンＳ１のA０は６００．０のｍ／ｚを有するものと仮定する。入力３８０３ａ＝０．１６７の場合、６００．１６７（例えば、６００．０＋０．１６７）に等しいｍ／ｚがスキャンＳ１に存在するか？存在する場合、このマッチするｍ／ｚがＡ１同位体であると仮定される。本明細書の他の箇所に記載されるように、かかるｍ／ｚのマッチは、ある指定の許容差又は容認可能な誤差のレベル内で行われてもよい。次に、同じΔｍ／ｚ０．１６７を使用して他の同位体を共に連鎖させる、同位体の連鎖が継続する。スキャンＳ１の検索を継続して、同じＰＣＣの残りの同位体を探索し、探索されたイオン／同位体の連続する各対間の距離は０．１６７のｍ／ｚ距離又は距離を有する。上記例を続けると、スキャンＳ１において、処理は、６００．３３３、６００．５０、６００．６６７、及び６００．８３３のｍ／ｚ値を有する、４つの更なるマッチするｍ／ｚイオンを探索してもよい。上記例と関連して、推定されたＡ１同位体のｍ／ｚがＡ０のｍ／ｚから．１６７のｍ／ｚで探索されたので（例えば、．１６７は、電荷状態６に対して行１に位置する）、６つのイオンが６＋の電荷状態を有する候補のＰＣＣとして決定される。一番最近マッチした同位体のｍ／ｚから０．１６７のｍ／距離で探索されるスキャン中のイオンがなくなると、探索されないと、現在のＰＣＣの連鎖は停止する。例えば、６０１のｍ／ｚを有するイオンはスキャンＳ１では探索されなかった。
上記の変形例として、６００．１６７に等しいスキャンＳ１中のｍ／ｚは存在しないものと仮定する。この場合、処理は、次に高い電荷状態５に対して行３８０４ｂで指定されるようなΔｍ／ｚ＝０．２００を使用して、列３８０２ａを下方向に継続する。同じ問い合わせが行われて、Ａ０のｍ／ｚである６００に．２００を加えた合計の６００．２００に等しいｍ／ｚがスキャン中に存在するか否かが判断される。存在する場合、マッチするｍ／ｚは、Ａ１同位体のものであることが推定され、０．２００のΔｍ／ｚを更に使用して、上述されたように、同じＰＣＣの他の後続の同位体に連鎖させ、この場合、探索されるイオン／同位体の連続する各対は、０．２００のｍ／ｚ距離又は距離を有する。ＰＣＣは、この場合、５の電荷状態を有すると推定され、連鎖は、一番最近マッチした同位体のｍ／ｚから０．２００のｍ／ｚ距離のイオンがスキャン中で探索されなくなるまで、更なるイオンを探索し続ける。６００．２０に等しいｍ／ｚがスキャンＳ１中にない場合、処理は更に、列３８０３ａを連続的に横断し続け、行３８０４ｃの次に高い電荷状態４に対して、次のΔｍ／ｚ値＝０．２５０を使用する。
上記した列３８０３の下方への横断（最高から最低の電荷状態へ）は、１）６００に等しいｍ／ｚに列３８０３ａのｍ／ｚΔ値のうち１つを加えたものを有する、マッチするイオンが探索されるか、又は２）列の全ての入力が処理され、マッチするイオンが探索されなくなるまで継続する。６００のｍ／ｚを有する候補Ａ０を考慮しながら、３８０２ａの全ての入力が探索されると、低エネルギースキャンの２番目に低いｍ／ｚも同様に処理されてもよい。例えば、スキャンＳ１の２番目に低いｍ／ｚが６０２．５であると仮定して、ｍ／ｚ＝６００に関して上述されたのと同様の方法で、ｍ／ｚ＝６０２．５を有するイオンがＡ０同位体であるという推定に基づいて、同位体クラスタ又はＰＣＣを形成する目的で、ｍ／ｚ＝６０２．５であるこのイオンに対して処理が行われてもよい。
図４１を参照すると、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよい、処理ステップのフローチャートが示されている。フローチャート３８００は、技術による一実施形態で、表３８００を使用して連鎖を行って同位体の候補のＰＣＣを形成することと関連する、上述の処理を要約している。ステップ３９０２で、現在のスキャンにおけるイオンが選択され、選択されたイオンはスキャン中の最低のｍ／ｚを有する。スキャンは、プリカーサーイオンの低エネルギースキャンである。選択されたイオンは、他のイオンに連鎖してＰＣＣを形成する、候補のＡ０同位体である。Ｘ１＝スキャン中の全てのイオンのうち最低のｍ／ｚを有する選択されたイオンのｍ／ｚとする。ステップ３９０４で、ＭＡＸが、６などの最大の可能な電荷状態に割り当てられる。ステップ３９０６で、現在の電荷状態にＭＡＸが割り当てられる。ステップ３９０８で、現在の電荷状態に対して、Ａ０及びＡ１の間の理論上のｍ／ｚ距離にＤｅｌｔａが関連付けられる。より一般的には、上述されたように、Ｄｅｌｔａは、現在の電荷状態に等しい電荷状態を有する同位体クラスタにおける連続する同位体の各対間のｍ／ｚ距離を表す。Ｄｅｌｔａは、表３８００の入力の値を表す。例えば、現在の電荷状態＝６のとき、入力３８０３ａに基づいて、Ｄｅｌｔａは０．１６７に設定される。ステップ３９０８で始まるループにおいて、現在のＤｅｌｔａに対して処理が行われる。
ステップ３９１０で、Ｘ１＋Ｄｅｌｔａに等しいｍ／ｚが現在のスキャン中に存在するか否かの判断が行われる。ステップ３９１０が「はい」と評価した場合、制御はステップ３９１２に進んで、マッチするｍ／ｚが連鎖における次の同位体のものであると推定される。ステップ３９１２は、スキャン中の任意の後続のイオンに対して連鎖を行うことを含み、かかる後続のイオンはそれぞれ、前にマッチしたｍ／ｚとは別のＤｅｌｔａであるｍ／ｚを有する。最後にマッチしたｍ／ｚよりも大きいＤｅｌｔａであるｍ／ｚを有するものがそれ以上探索されないと、連鎖は停止する。連鎖によって形成されたＰＣＣ又は同位体クラスタには、現在の電荷状態に等しい電荷状態が割り当てられる。ステップ３９１０が「いいえ」と評価した場合、制御はステップ３９１４に進んで、全ての電荷状態に対して処理が完了したか否かの判断が行われる。処理が行われた場合、処理は停止する。別の方法として、ステップ３９１４が「いいえ」と評価した場合、制御はステップ３９１６に進んで、現在の電荷状態が１漸減され、列３８０２ａの次の入力など、表３８００の次の入力を用いて、ステップ３９０８で処理が継続する。
候補のＰＣＣを形成し、それに電荷状態を割り当てるのに使用された上述の処理は、選択された電荷状態に対するΔｍ／ｚ値に関して処理を行ってもよいことが注目されるべきである。例えば、フローチャート３９００の処理を行う前に、１つ又は２つ以上の可能な電荷状態のサブセットが、ステップ３９０２で選択された候補のＡ０イオンに対して決定されていてもよい。例えば、図３９のグラフ３８５０及び／又は他の情報などの他の手段を使用して、６つの可能な電荷状態の数が更に低減されてもよい。例えば、候補のＡ０イオンは、ラインＬ９及びＬ１０の間の多重レーン電荷ベクトルのうち１つにそのイオンを当てはめるｍ／ｚを有してもよく、２＋又は４＋の可能な電荷状態が割り当てられてもよい。この場合、フローチャート３９００の処理は低減されてもよく、それにより、それらの電荷状態に対して０．２５０及び０．５０のΔｍ／ｚ値のみを評価することが必要となる。
候補のＰＣＣが構築された後、ＰＣＣを検証する処理が行われてもよい。例えば、ＰＣＣの各同位体の面積又はイオン信号強度が、同位体モデルによって検証及び／又は調節される。同位体モデルは、アベラジンの基本的組成を使用して、理論上の同位体分布（例えば、イオン信号面積、強度、又は計数のもの）と、そのｍ／ｚ及びｚの理論上のペプチドに関してＬＯＤを上回る予測される同位体の数の両方を計算する。アベラジンの同位体モデルを生成することは、当該分野において知られており、また例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｖａｌｋｅｎｂｏｒｇ，Ｄ．、Ｊａｎｓｅｎ，Ｉ．、及びＢｕｒｚｙｋｏｗｓｋｉ，Ｔ．（２００８）、「Ａ ｍｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｉｔｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｄｉｓｔｒｉｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、１９（５）、７０３〜７１２に記載されている。
更なる例証のため、図４２を参照する。各イオンには、一連の測定又は計算された属性が割り当てられてもよい。少なくとも１つの実施形態では、これらの属性は、ｍ／ｚ、面積（例えば、イオンの強度の基準）、理論上の電荷状、ｍ／ｚに対する純度スコア、並びに三次元データの場合はｍ／ｚ及びドリフトを含んでもよい。例４０００を参照すると、図４０及び図４１と関連して上述されたような処理が行われてもよく、連鎖処理は、二次元スキャンから最低のｍ／ｚイオンを選択し、最初のリンクがＡ０であると確認することで始まる。４０１０において最低のｍ／ｚを有するイオンは、５４８．９７８４である。前の処理は、例えば、可能な３＋又は６＋電荷状態を最初にイオンに割り当てていてもよい。最高の電荷状態６＋で始まって、０．１６６７Ｔｈ（１／ｚ）（例えば、表入力３８０３ａ）が５４８．９７８４の最低のｍ／ｚに追加され、それにより、マッチに関してそのスキャンの完全なイオンリストに対して上記合計が問い合わされる。この例では、４０１０に示されるスキャンにマッチは見出されず、６＋の随伴するＡ１イオンはないと判断される。次に、処理は、次の理論上の電荷状態３＋を考慮し、０．３３３Ｔｈ（Ｍｚ）（例えば、入力３８０５から）が５４８．９７８４の最低ｍ／ｚに追加され、それにより、マッチに関してそのスキャンの完全なイオンリストに対して上記合計が問い合わされる。この場合、マッチするｍ／ｚイオンは５４９．３０５８に見出され、上記５４９．３０５８のｍ／ｚは候補のＡｉ同位体である。少なくとも１つの実施形態では、質量マッチの許容差（マッチするｍ／ｚ値を決定するのに使用される）は、先行する基準質量校正からの測定質量精度の±３倍に自動的に設定される。
この例では、ｍ／ｚ＝５４９．３０５８のＡ１同位体は、予期されるよりも低いイオン純度スコアを有してもよい（例えば、他のスコア又は閾値レベルに対して低くてもよい）。それに加えて、質量誤差があることがある。質量誤差は、以下のパラグラフにおいて本明細書の他の箇所に記載される。上記質量誤差は、Ａ１同位体に対して予測される値５４９．３１１７Ｔｈ（測定された質量精度の±３倍）よりもわずかに低いｍ／ｚの干渉イオンが存在することを提示するものと解釈されてもよい。更なる同位体Ａ２及びＡ３の検索が繰り返され、同位体関係の数は合計４に拡張される（例えば、Ａ０ ｍ／ｚ＝５４８．９７８４、Ａ１ ｍ／ｚ＝５４９．３０５８、Ａ２ ｍ／ｚ＝５５０．０、Ａ４ ｍ／ｚ＝５５０３０９０）。リンク２と３の間、及びリンク３と４の間の質量誤差は先行する校正の質量誤差に比例するので、疑われる干渉が確認又は検証されてもよい。
図４２の４０１０における破線の曲線４０１２は、３＋電荷クラスタの予測される同位体分布を示す。計算された同位体モデルは、４０１０の実験データに対してマッチされる。固有のｚ、又は検証されたｚの割当て、及びに高い純度スコアに反映する連鎖イオンの強度をアンカーとして使用して、Ａ１同位体と同じように複合イオン面積を補正してもよい。例えば、連鎖させたイオンのうち１つ（形成された候補のＰＣＣの同位体を表す）が、高い純度スコアを有し、イオンを単一の電荷状態にマッピングする固有の電荷状態ベクトルに含まれる場合、そのイオンの性質（例えば、強度、質量、電荷状態）を同位体モデル化のアンカーとして使用して、ＰＣＣの他の同位体が決定、予測、又はモデル化され、またＰＣにおけるかかる他の同位体の属性がモデル化されてもよい。例えば、ｍ／ｚ＝５４９．６４６のＡ２イオンはかかるアンカーイオンであってもよく、それにより、Ａ２の属性（例えば、ｍ／ｚ、強度又は面積、保持時間、ドリフト時間（用いられる場合））を使用して、同じＰＣＣのＡ１イオンに関して予期される理論上の属性（例えば、信号強度又は面積）がモデル化されてもよい。実験Ａ１イオンｍ／ｚ＝５４９．３０５８に対するかかるモデル化された属性を、モデル化された属性と比較して、実験データに対する補正又は調節が行われてもよく、またイオン干渉を検出するのに使用されてもよい。例えば、Ａ１イオンのモデル化された強度を使用して、Ａ１の実験データ強度が４０１０に示されるものから４０２０に示される結果へと補正又は調節されてもよい。それに加えて、４０１２によって示されるモデル同位体分布は、Ａ１イオンにおける干渉を示し、更なる補正作業が実験データに関して行われてもよい。実際の基本的組成と、同位体分布をモデル化するのに使用されるアベラジンとの間の任意のばらつきに対処するために、処理によって、「仮想イオン」を作成するなどの任意の補正作業を行う前、２０％のばらつきが可能になってもよい。仮想イオンは、残りのイオン面積、並びに実験データスキャンにおける関連する親に割り当てられた他の全ての属性に割り当てられてもよい。例えば、４０２０に示されるように、補正されたイオン面積を有する仮想イオンが、ｍ／ｚ＝５４９．３０５８のＡ１イオンに対して作成されてもよく、それによって、ｍ／ｚ＝５４９．３０５８の同じイオンを、考慮中である現在のＰＣＣの３＋Ａ１同位体として正確に割り当てること、並びにｍ／ｚ＝５４９．０３９８のＡ０イオンを有する電荷状態４＋の別の第２のＰＣＣと関連付けることが可能になる。したがって、要素４０１０及び４０２０は、どのようにしてｍ／ｚ＝５４９．３０５８の適応しない（例えば、低ＩＰＳ、大面積）のＡ１同位体が補正され、「仮想」イオンが作成されるかを示す。仮想イオンは、ｍ／ｚ＝５４９．３０５８を上述されたようなＡ０イオンとして使用して、電荷状態４の別のＰＣＣなど、他の候補のＰＣＣを作成するために行われる、後に続く連鎖処理と関連して使用されてもよい。
低エネルギープリカーサーイオンスキャンを処理して、上述されたような電荷状態が割り当てられたＰＣＣを形成した後、ＰＣＣは、それらのｍ／ｚ値に基づいて、また三次元データ（例えば、ＩＭＳを含む）、ドリフト時間を用いて、時間位わたって組み合わされてもよい。一般に、これは、個々のＰＣＣが形成される上述されたよりも高レベルで行われる、別のタイプの連鎖又は連結として特徴付けられてもよい。ここで、個々のＰＣＣを、異なるスキャンそれぞれにおいて組み合わせて、単一のＰＣＣに対する溶出プロファイル又はエンベロープとしても知られている、クロマトグラフィピークを形成する（例えば、図７に示されるものなど、同じＰＣＣに対して時間に伴ってピーク又はエンベロープを形成する）処理が行われる。
更に例証するため、次に図４３を参照すると、パネルＡ ４１１０及びＣ ４１２０は、ＰＣＣをそれらのｍ／ｚ値によって時間にわたって組み合わせ、したがって異なる時点で同じＰＣＣを追跡して、ＰＣＣの溶出プロファイル又はエンベロープを形成するために行われる処理を示している。少なくとも１つの実施形態では、各ＰＣＣに対して使用されるｍ／ｚは、Ａ０同位体のｍ／ｚであってもよい。パネルＡ ４１１０は、実験データの異なるスキャン時間において第１のｍ／ｚを有する第１のＰＣＣのプロットを示し、パネルＣ ４１２０は、実験データの異なるスキャン時間において第２のｍ／ｚを有する第２の異なるＰＣＣのプロットを示す。パネルＡ ４１１０及びＣ ４１２０は、各ＰＣＣの強度対スキャン時間のグラフ表示である。４１１０では、第１の追跡されたＰＣＣに関して、要素４１１１ａ Ｅ１は頂点（例えば、図７の点Ｈ）を表し、要素４１１１ｂ〜ｃ Ｅ２及びＥ３はピーク半値点（例えば、図７のＨ１及びＨ２）を表し、要素４１１１ｄ〜ｅ Ｅ４及びＥ５はピークベースライン点（例えば、ＰＣＣのピークプロファイルが開始及び終了に対して決定される場合）を表す。４１２０では、第２の追跡されたＰＣＣに関して、要素４１２１ａ Ｆ１は頂点（例えば、図７の点Ｈ）を表し、要素４１２１ｂ〜ｃ Ｆ２及びＦ３はピーク半値点（例えば、図７のＨ１及びＨ２）を表し、要素４１２１ｄ〜ｅ Ｆ４及びＦ５はピークベースライン点（例えば、ＰＣＣのピークプロファイルが開始及び終了に対して決定される場合）を表す。
それに加えて、４１１０及び４１２０の２つの追跡されたＰＣＣに関して、関連する誤差プロットが決定されてもよい。要素４１３０は、４１１０で時間にわたって追跡又は連鎖された、第１のＰＣＣに対する第１の誤差プロットを示す。要素４１４０は、４１２０で時間にわたって追跡又は連鎖された、第２のＰＣＣに対する第２の誤差プロットを示す。４１３０及び４１４０では、誤差は百万分率（ｐｐｍ）単位のｍ／ｚ誤差である。ｍ／ｚ（ｐｐｍ）誤差は、先行するＡ０のｍ／ｚを、連鎖において次に連結されたＰＣＣと比較することによって計算されてもよい。したがって、プロット４１１０の第１の点Ｐｎ及び第２の点Ｐｎ＋１に関して、Ｐｎ＋１の質量誤差又はｍ／ｚ誤差は、点Ｐｎ及びＰｎ＋１の間におけるｍ／ｚ値のΔ又は差を表し、ここで、Ｐｎは、Ｐｎ＋１の直前にピークを形成するのに使用される点である（例えば、質量誤差Ｐｎ＋１＝ｍ／ｚ Ｐｎ＋１−ｍ／ｚ Ｐｎ）。４１３０及び４１４０では、上下の境界線α及びα’は、例では±３ｐｐｍ（例えば、αは−３ｐｐｍ、α’は＋３ｐｐｍ）である、前のロックマス校正から計算された質量精度を反映する。４１３０では、Ｇ１ ４１３１ａは、ピーク又は頂点Ｅ１ ４１１１ａの質量誤差を表し、Ｇ２ ４１３１ｂは、半値点Ｅ２ ４１１１ｂの質量誤差を表し、Ｇ３ ４１３１ｃは、半値点Ｅ３ ４１１１ｃの質量誤差を表す。４１４０では、Ｋ１ ４１４１ａは、ピーク又は頂点Ｆ１ ４１２１ａの質量誤差を表し、Ｋ２ ４１４１ｂは、半値点Ｆ２ ４１２１ｂの質量誤差を表し、Ｋ３ ４１４１ｃは、半値点Ｆ３ ４１２１ｃの質量誤差を表す。
４１１０と４１２０との間のＦＷＨＭの視覚的比較は、４１２０の点の曲線又はプロファイルが４１１０の点によって形成されるものよりもはるかに幅広であって、４１２０において起こり得る干渉を示している。分析を通して、４１２０の干渉は、パネルＤ 点Ｋ１ ４１４１ｂ及びＫ２ ４１４１ａの間のパネルＤ ４１４０における質量誤差の情報に基づいて検証されてもよい。特に、第１の時点の点Ｋ２ ４１４１ｂは、容認可能な質量誤差範囲（境界α及びα’によって表される）からの、測定された質量誤差の有意な偏差を表し、それによって干渉が表される。Ｋ１ ４１４１ａ及びＫ３ ４１４１ｃなどの後続の時点は、容認可能な質量誤差範囲内の質量誤差を表し、それによって干渉イオンの干渉が残っていることを示す。したがって、Ｋ２ ４１４１ｂ以降の各点又はスキャンは、干渉を有するものと判断されてもよい。このように、溶出ピーク４１２０は、実際には、複数の異なるＰＣＣ（例えば、重なり合って４１２０の組み合わされた溶出プロファイルを生成する、２つ以上のプリカーサーイオン）に対するイオン強度の複合的又は集合的ピークであり、それにより、かかる干渉がＦ２ ４１２１ｂで始まり、４１２０の後に続く点におけるスキャンの残りに対して残る。干渉が６５．４などのスキャン時間から生じなくなった場合、スキャン時間６５．４において、Ｋ２ ４１４１ｂによって表される＋１２ｐｐｍの質量誤差の補数又は逆数として特徴付けられてもよい、対応する負の質量誤差が検出されるであろう。換言すれば、干渉がスキャン時間６５．４の先からは生じなくなった場合、スキャン時間６５．４において、約−１２ｐｐｍの質量誤差値が存在するであろう。
４１１１０における点に対するスキャン又はスペクトルの質量誤差には、容認可能な質量誤差範囲を超えるものはないので、かかるスキャン又はスペクトルのいずれに対しても決定される干渉がないことが注目されるべきである。
干渉と関連する別の例として、図４４の４２００を参照する。例４２００は、互いに干渉する２つの異なるＰＣＣに対する２つのクロマトグラフィピークＣ１ ４２１０及びＣ２ ４２２０を示す、要素４２０２を含む。要素４２０２は強度対スキャン時間を示す。実際に見られる複合の又は結果として得られるピークＣ３ ４２２２は、４２１０及び４２２０の合計の組み合わせであってもよい。１つの目的は、見られる複合ピークＣ３ ４２２２は、４２１０及び４２２０などの複数のイオンが実際に寄与し、次に４２１０及び４２２０などのその成分へと複合ピークＣ３を解析又は分解しようと試みるという事実を検出することである。第１の点又はスキャン時間Ｐ１において、容認可能な質量誤差範囲外にある第１の質量誤差が決定されてもよく、それにより、干渉の開始スキャンを表す。同様の方法で、第２の時点Ｐ２における第２の質量誤差の後に続く次の発生は、第２の質量誤差が容認可能な質量誤差範囲外にあり、それによって、第１の点Ｐ１で検出される干渉の終わりが表される場合に得られてもよい。上記第１及び第２の点Ｐ１及びＰ２の間の点に関する質量誤差は、容認可能な質量誤差範囲内であってもよい。要素４２０４は、４２０２の異なる点における対応するスキャンに対して得られてもよい質量誤差値を表す、質量誤差対スキャン時間を示す。特に、Ｘ１ ４２０４ａ及びＸ２ ４２０４ｂは、それぞれ点Ｐ１及びＰ２における、容認可能な質量誤差範囲を超える質量誤差を表してもよい。４２０４の残りの誤差値は全て容認可能な質量誤差範囲内にあってもよい。このように、Ｘ１及びＸ２は、可能な干渉の境界を表す点として使用されてもよい。干渉が疑われる時間に行われるスキャンは、追跡されたプリカーサーイオン又はＰＣＣに対するＣＰＰＩＳの形成と関連する考慮から除外されてもよい。代替例として、更に詳細に後述されるように、干渉するスキャンの実験データから抽出された情報を補正又は更に改良する作業が行われてもよい。
この例４２００では、容認可能な質量誤差範囲を超える質量誤差Ｘ１及びＸ２が検出されると、更なる処理が行われてもよい。Ｘ１における質量誤差は１０ｐｐｍであり、Ｘ２における質量誤差は−１０ｐｐｍなので、干渉はスキャン時間Ｐ１で始まり、スキャン時間Ｐ２で終わると判断されてもよい。ＣＰＰＩＳに含めるスキャン又はスペクトルを選択する際、一実施形態は干渉するスキャンを除外することを選んでもよい。代替例として、一実施形態は、フラグメンテーションパターンを検査することによるものなど、別の作業を行ってもよい。特に、干渉がＰ１からＰ２までで生じている状態でのフラグメントイオンスキャンは、複数の干渉するイオンのいずれかから発してもよい。しかしながら、Ｐ１の前又はＰ２の後にスキャンに現れるが、Ｐ１からＰ２までのスキャンには現れないフラグメントイオンｆｒａｇ１は、追跡されたプリカーサーイオン又はＰＣＣから発するものと判断されてもよい。同様の方法で、Ｐ１からＰ２までの干渉するスキャンに固有のフラグメントイオンｆｒａｇ２、（例えば、ｆｒａｇ２は、Ｐ１からＰ２までの１つ又は２つ以上のスキャンに現れるが、Ｐ１の前及びＰ２の後には現れない）は、干渉するプリカーサーイオンから発するが、追跡されたプリカーサーイオン又はＰＣＣからは発しないものと判断されてもよい。
一実施形態は、平均検出イオンピーク幅Ｗ１に基づいて、ＣＰＰＩＳの形成及び更なる分析と関連して使用される、スキャン又はスペクトルを更に除外してもよい。例えば、一実施形態は、検出されたピークのテール状の左端及び右端に含まれるスキャンを除外してもよい。少なくとも１つの実施形態では、平均ピーク幅Ｗ１±２の標準偏差以内のスキャンのみがＣＰＰＩＳ形成に使用されてもよい。
少なくとも１つの実施形態では、ピークの２つの左側及び右側の半値点間の少なくとも２つのスキャン又はスペクトルが、追跡されたＰＣＣ又はプリカーサーイオンに対してＣＰＰＩＳを形成するのに使用されてもよい。代替実施形態では、２つの左側及び右側の半値点間の単一のスキャン又はスペクトルのみが選択されてもよい。選択された特定のスキャン（及びしたがって、関連するプリカーサーイオンに対してＣＰＳを形成する際に使用される、かかる選択されたスキャンの特定のフラグメント又はプロダクトイオン）は、実験データに基づいて情報を除外及び／又は改良するのに使用される、本明細書に記載されるような１つ又は２つ以上の基準にしたがってもよい。例えば、一実施形態は、干渉が疑われる任意のスキャンを除外することを選んでもよく、かかる干渉は、容認可能な質量誤差範囲外にある１つ又は２つ以上の質量誤差を使用して決定されてもよい。一実施形態は、ＣＰＰＩＳを形成する際に使用するスキャンを選択してもよく、スキャンは２つの左側及び右側の半値点の間であり、追跡されたＰＣＣ又はプリカーサーイオンは、かかる点間の全てのスキャンの最大強度を有する。一実施形態は、ＣＰＰＩＳを形成する際に使用するスキャンを選択してもよく、スキャンは２つの左側及び右側の半値点の間であり、追跡されたＰＣＣ又はプリカーサーイオンは、かかる点間の全てのスキャンの最大イオン電流を有する。スキャン内のイオンに対するイオン電流は、スキャン内の全てのイオンの合計強度に対するそのイオンの相対強度として定義されてもよい。したがって、プリカーサーイオンが最大イオン電流を有するスキャンは、プリカーサーイオンがスキャン内の全てのイオンの合計強度に対して最大強度を有するスキャンである。例えば、スキャンＳ１では、プリカーサーイオンｐｒｅｃ１は１０の強度を有してもよく、スキャン内の全てのイオンの合計強度は２０であってもよいので、ｐｒｅｃ１はＳ１において１０／２０＝５０％のイオン電流を有する。スキャンＳ２では、プリカーサーイオンｐｒｅｃ１は１０の強度を有してもよく、スキャン内の全てのイオンの合計強度は２００であってもよいので、ｐｒｅｃ１はＳ２において１０／２００＝５％のイオン電流を有する。このような場合、Ｓ２はｐｒｅｃ１を特徴付けるように選択されてもよく、ｐｒｅｃ１はＳ２においてその最大イオン強度を有するので、Ｓ１は除外されてもよい。
干渉がない状態で、少なくとも１つの実施形態は、ピークの２つの半値点の間で１つ又は２つのスキャンを選択してもよく、選択された１つ又は２つのスキャンは、選択されてもよい可能性がある全ての候補スキャンの最大イオン電流を有する。全ての候補スキャンの最大イオン電流を有するスキャンは、かかる全ての候補スキャンの最高又は最大強度を有するスキャンでなくてもよいことが注目されるべきである。かかる全てのスキャンのうち最高のイオン電流を有するスキャンを選択することによって、選択されたスキャン。
疑われる又は検出される干渉（容認可能な質量誤差範囲を超える１つ又は２つ以上の質量誤差などに基づく）が存在する状態で、一実施形態は、干渉を有するあらゆるスキャンを除外することを選んでもよい。あるいは、一実施形態は、追跡されたＰＣＣ又はプリカーサーイオンから発するものと判断される特定のフラグメントイオンを更に改良する（例えば、このように、ＣＰＰＩＳに含まれるフラグメントイオン、及びプリカーサーイオンの推定的な同定を改良する）などのため、干渉するスキャン及び干渉しないスキャンの組み合わせを選択してもよい。例えば、第１の干渉するスキャンＳ１が選択されてもよく、第２の干渉しないスキャンＳ２が選択されてもよい。（Ｓ１ではなくＳ２における）Ｓ２に固有のフラグメントイオンの第１のセットＲ１は、追跡されたＰＣＣ又はプリカーサーイオンから発するものと判断され、Ｓ２の残りのフラグメントイオンは、プリカーサーイオンを同定する際に無視され／使用されなくてもよい。Ｓ１及びＳ２の両方に共通のフラグメントイオンの第２のセットＲ２が決定されてもよく、Ｒ２におけるかかるフラグメントイオンは、追跡されたＰＣＣ又はプリカーサーイオンからは発しないものと判断され、それよりもむしろ、干渉するイオンから発するものと判断される。
図４６Ａ及び図４６Ｂを参照すると、本明細書の技術による一実施形態で行われてもよいフローチャート４４００及び４４０１が示されている。フローチャート４４００及び４４０１は、図３５に示されるような１つの特定のワークフローに基づいて行われてもよい処理を要約している。ステップ４４０２で、シミュレータを使用して、図３５の標的３５０２ａで同定されるような溶出分子又は成分に対してモデル化される、シミュレートされた属性が提供されてもよい。ステップ４４０４で、スケジュールされたＭＭＡは、スケジュールされたＭＭＡ獲得及びパラメータを決定する処理を行ってもよい。ステップ４４０６で、ＭＳ及び／又はＭＳとＩＭＳを含む機器システムを使用して、サンプル分析が行われてもよい。サンプル分析は、ＭＭＡスケジュール及びパラメータにしたがったデータ獲得技術及びスケジューリングを通して行われてもよい。ステップ４４０６は、ＭＭＡスケジュールにしたがった、複数のスキャンサイクルにおける異なるＭＩＷの反復選択を含んでもよい。ステップ４４０８で、実験データがサンプル分析から生成されてもよい。後続のステップは、ステップ４４０８で得られた実験データを使用して行われてもよい、異なるデータ処理ステップを概説する。本明細書の他の考察と同じく、一実施形態は、フローチャート４４００及び４４０１に含まれるような追加のステップを行ってもよいことが注目されるべきである。ステップ４４１０で、属性の最初のセットが、実験データからの各イオンに対して行われてもよい。かかる属性は、例えば、１つ又は２つ以上の次元におけるｍ／ｚ、ＲＴ、ドリフト時間、純度スコア、FWMH、面積、又は信号強度などを含んでもよい。ステップ４４１２で、１つ又は２つ以上の電荷状態の最初の割当ては、低エネルギースキャンでプリカーサーイオン又はイオンに対して行われてもよい。ステップ４４１２は、図３９と関連して本明細書に記載されるものなどの情報を使用して、処理を行うことを含んでもよい。ステップ４４１４で、ＰＣＣが構築され、それぞれ電荷状態を割り当てられてもよい。ＰＣＣは、例えば、プリカーサーイオンの同位体モデルを含む入力にしたがって、また図４０の表３８００を使用して、同じプリカーサーイオンの同位体変化を連鎖させることによって構築されてもよい。ＰＣＣは、連鎖に使用するように選択された表３８００の入力と関連付けられる、電荷状態を割り当てられる。入力は、クラスタの同位体を連鎖させるのに使用される、特定のΔｍ／ｚを表す。特定のΔｍ／ｚは、連鎖されてＰＣＣを形成する、連続する同位体間の差である。ステップ４４１６で、ピーク溶出プロファイル又はエンベロープ（例えば、クロマトグラフィピーク）がプリカーサーイオンに対して決定される。ステップ４４１６は、（例えば、マッチするＡ０ ｍ／ｚに基づいて）同じＰＣＣを時間にわたって組み合わせるか又は連鎖させることを含んでもよい。ピークプロファイルはそれぞれ、点又はスキャンの最小数を使用して決定されてもよい。ステップ４４１８で、各プリカーサーイオンをプリカーサーイオンから発するフラグメントイオンと整列させる処理が行われてもよい。ステップ４４１８は、例えば、質量誤差に基づいてスキャンの干渉を検出し扱う処理を行うことを含んでもよい。ステップ４４２０で、各プリカーサーイオンに対して１つ又は２つ以上のスキャン及びそのフラグメントイオンを選択して、ＣＰＰＩＳ又は複合プリカーサープロダクトイオンスペクトルを形成する処理が行われてもよい。ステップ４４２２で、実験データにしたがって、シミュレータ、ＭＭＡスケジュール、及びパラメータが更新されてもよい。図示されないが、処理はまた、教師なしクラスタリングなどと関連して、推定的なＣＰＰＩＳをリポジトリ３５０８ｃに記憶することを含んでもよい。
各スキャンがそれ自体の独立実験として処理されることを所与として、全てのプロダクトイオンは、最初に、狭帯域のＭＳ質量分離ウィンドウ内の各プリカーサーイオンに割り当てられてもよい。フラグメンテーション効率は、各プリカーサーに対して、その強度をプロダクトイオンスペクトルで見出される任意の残留（残りの）強度と比較することによって計算される。フラグメンテーションの瞬間、プリカーサーイオンの強度は、電荷クラスタ連鎖における最初のリンクの獲得時間に対するその獲得時間の関数である。要素４１１０は、任意の２つのスキャンサイクル間のプリカーサーイオン強度における変化を示す。アスタリスクは、プリカーサーイオンがフラグメンテーションのために選択された時間を示す。アライメント処理は、線形回帰を使用して、４１１５に表されるように、選択されたプリカーサーを結合する２つのリンクを接続する、プレフラグメンテーション強度を補間してもよい。上向きの矢印は交差を意味する。
直接的関係が、フラグメンテーション効率と、プリカーサーイオンが生成することができるプロダクトイオンの数及びダイナミックレンジとの間に存在する。適切にフラグメンテーションされたプリカーサーは、過大又は過小にフラグメンテーションされたものよりも、その長さに対してより多くのプロダクトイオンを生成するであろう。親プリカーサーに対するプロダクトイオンのダイナミックレンジは、親のフラグメンテーション効率に反比例する。過大及び過小にフラグメンテーションされたプリカーサーは、一般に、それらのプリカーサー長さに対してより少数のプロダクトイオンを生成するが、それらは一般に、より幅広いダイナミックレンジを反映する。反復バッチ処理では、これらの効率を使用して、注入間の衝突エネルギー表が最適化される。図４４は、親プリカーサーイオン強度対フラグメンテーション効率の比率として表される、プロダクトイオン面積のダイナミックレンジを定義する２つの線形回帰線を示している。プロダクトイオンの割当ては、ダイナミックレンジのみによってではなく、ｍ／ｚ及びzによっても制限される。イオンの分子質量がその基本的組成を直接反映することを所与として、公称整数質量対分数ｍ／ｚのプロットも、プロダクトイオンの変化を決定するのに使用することができる。衝突によって誘発される解離（ＣＩＤ）をフラグメンテーションのメカニズムとして用いる機器の場合、電荷ｚのプリカーサーイオンのみが、ｚ−１の最大電荷を反映するプロダクトイオンを生成することができる。この規則に対する単一の例外は、ｚ＝１のプリカーサーイオンを用いてもたらされる。一価のプリカーサーイオンは一価のプロダクトイオンのみを生成することができる。このため、その親プリカーサーイオンのｚと同一基準の電荷ベクトルに常在しない、任意のプロダクトイオン又は連鎖同位体は、プロダクトイオンスペクトルからすぐに排除される。同様に、散乱を低減する意図で、ユーザは、ｚ＞１のプロダクトイオンをｚ＞２のプリカーサーイオンに対して整列させることを選定することができる。
（例えば、プリカーサーイオンのクロマトグラフィピーク又は溶出プロファイルを生成する、図４３と関連して記載されるように）プリカーサーイオンの連鎖プロセスを通して、逆多重化処理は、いつどのスキャンにおいて、プリカーサーイオンがフラグメンテーションされるかを決定してもよい。ＭＭＡと関連して上述されたように、スキャンサイクル内及びスキャンサイクルにわたって、広帯域及び狭帯域それぞれの獲得に対してＭＩＷの中心を制御することによって、並びに任意の続く注入において後で選択するために、それらのｍ／ｚ値を累積的に排除することによって、逆多重化処理が、任意のプロダクトイオンスペクトルの選択性を継続的に増加させる機会を与えられる。各反復に続いて、獲得後処理は、任意の２つの注入間における保持又はドリフト時間の任意のばらつきを補正する。注入間の保持及びドリフト時間における相対的な位置付けを連続的に改良することによって、逆多重化アルゴリズムが更なる重なり合うプロダクトイオンスペクトルにアクセスすることが可能になる。
それに加えて、逆多重化処理はまた、あらゆるスキャンにおける全てのイオンに関する、実際の又は補間されたプリカーサーイオン強度、質量校正誤差、実際の又は補正されたプロダクトイオン強度、及び純度スコアなど、全てのメタデータに対するアクセスを有する。このメタデータを利用して、逆多重化アルゴリズムは、プロダクトイオンを、規定の質量誤差内で同じｍ／ｚを有し、推定的なプリカーサーに比例する相対存在比の変化を呈するもののみに制限することによって、幅広い質量分離ウィンドウのキメラ効果を大幅に低減する。ｍ／ｚ及び強度比両方のマッチ許容差は、アルゴリズムで、前の基準質量校正に基づいて、イオン純度スコアによって決定することができ、又はユーザ定義であることができる。一般に、許容される面積比許容差は、実際のｍ／ｚよりもはるかに幅広い。換言すれば、マッチしたプロダクトイオン強度は、プリカーサーイオン強度が大きい場合は大きく、プリカーサーイオン強度が小さい場合は小さくなければならない。少なくとも１つの実施形態における全てのフィルタ処理の終わりに、各プロダクトイオンスペクトルは、後のデータベース検索のため、工業規格ｍｚＭＬ又はｍｇｆファイル形式のどちらかに書き込まれてもよい。同定はまた、教師ありクラスタリングと関連して本明細書に記載されるものなどのＭＩＲから、シミュレートされたプロダクトイオンスペクトル又は複合プロダクトイオンスペクトルを、問い合わせることによって行われてもよい。
図３５を再び参照すると、検索エンジンの計算された９５％の信頼区間を超えるスコアを反映するペプチドのプロダクトイオンスペクトルが、推定的な同定として３５０８ｃに入れられてもよい。ペプチドに対する固有の又はグローバル識別子を作成するため、ペプチド配列をそのｍ／ｚと連結してもよく、配列が修飾を含む場合、ｎ末端に対する修飾の位置も含まれる。かかる修飾を同定するのに使用されてもよい技術は、本明細書の他の箇所に記載される。同定されたペプチドに加えて、アンマッチしたプロダクトイオンスペクトルも入れられ、ペプチドに固有の識別子の代わりではあるが、グローバル識別子が割り当てられる。グローバル識別子は、その計算されたＣＣＳＡ（場合によっては、本明細書では、衝突断面積に対するＣＣＳ（Å２）とも呼ばれる）に連結される、丸められた（１小数位）プリカーサーイオンのｍ／ｚから成るという点で、ＵＰＣ（汎用プロダクトコード）と同様に使用される。推定的な同定（例えば、ペプチド配列又はグローバル識別子）の最小数（例えば、５０）が３５０８ｃに入れられると、背景で動作する検証処理３５０８ｃが行われてもよい。３５０８ｂの検証アルゴリズムは、最小で３０のマッチ又は同定されたプロダクトイオンスペクトルを不規則に選択することによって、ＣＰＰＩＳを作成することを継続して試みてもよい。検証処理は、例えば、ドット積スペクトル相関及びピアソンの積率相関係数（ｒ）を使用して、最初に有意性を判断してもよい。ピアソンの積率相関係数ｒが正の相関を反映した場合、一連のヌル相関を比較対象として要する。これらのヌル相関は、類似のｍ／ｚ及びｚの、ただし異なる線形配列のペプチドから作成される。一般に、相関は、ｒ≧０．７５の場合に有効と見なされ得る。
概して、ＤＤＡは、最も広い実験のダイナミックレンジにわたって、定性的なカバー深度及び定量的な精度を最大限にするには、速度及び感度が不足していると考えられてもよい。連続ＤＤＡ分析のサンプリングの制限に対処するため、ＭＳＸ及びＳＷＡＴＨなどのＤＩＡ戦略が開発されてきたが、これらのＤＩＡアプローチによる感度は依然として欠乏又は欠陥を有することがある。データ獲得のためのＢａｔｅｍａｎ技術又は高−低プロトコルのような、他のＤＩＡ方法は、感度によって制限されないが、非常にキメラ性の高いプロダクトイオンスペクトルを生成する。それは、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて取り込むことができる、固定量の質量の十分な空間がある。より高い分解能の質量分析部では、プロダクトイオンスペクトルにおけるアクセス可能なｍ／ｚ空間は、そこに含まれるプロダクトイオンの数、基本的組成、及び濃度によって制限される。ＭＩＷ内に含まれるペプチドの線形配列は異なるが、全てプロテオームの同じアミノ酸分布をサンプリングする。質量分離ウィンドウ内でプロダクトイオンスペクトルを獲得すると、その中及びそれ自体の分離ウィンドウによって、全ての同時にフラグメンテーションされるプリカーサーが、類似のｍ／ｚのものであることが担保される。濃度に対して、プロダクトイオンに対する同位体の数及び面積分布は、その基本的組成及び濃度の直接の関数である。電荷ベクトル（例えば、図３９）に示されるように、異なるプロダクトイオンからの異なる同位体は、同じｍ／ｚを共有することができる。ＭＩＷ内のペプチドに対するダイナミックレンジの２桁の大きさを仮定すると、１つのプロダクトイオンからの１つの同位体が第２のプロダクトイオンからの別のものと干渉する可能性が非常に高い。
プリカーサーイオンサンプリングを最大限にし、感度を維持し、プロダクトイオンの干渉を制限するために、本明細書に記載されるような最適な獲得方法を使用して、ＭＳ／ＭＳ獲得ごとに衝突セルに入るプリカーサーイオンの数が制御されてもよい。その数は、イオン検出の前に用いられるインラインの直交分離技術全ての複合分解能の関数である。単一の実験で行うことができる、正確なペプチド同定の数に関連する選択性は、スキャン速度及び／又はＭＩＷの関数ではない。それよりもむしろ、選択性は干渉の関数である。最も複雑な構造であっても、適用される分析ワークフローが十分な直交性を、即ち、ＩＭＳ、より高い質量分解能、狭いクロマトグラフィピーク、変動するＭＩＷウィンドウ、周囲のマトリックスからは独立して各イオンの属性を測定するモデル化及び多重化を用いる場合に、プリカーサー及びプロダクトイオンのより大きい補数の物理化学的属性を測定する能力を達成することができる。
定量的精度も、同位体的又は等圧的のどちらで標識付けられたペプチドに対するものかに関わらず、干渉の結果である。ｉＴＲＡＱ及びＴＭＴ標識付けに関して、報告されるイオン面積はそれぞれ、解離中に衝突セル内に２つ以上のペプチドが存在する場合に犠牲になる。ＡＵＣ分析による標識なし又は絶対的定量に関して、どちらかの面積が複合体である場合、計算される相対又は絶対存在比が犠牲になる。限定数のイオン検出前分離技術によって質が低下する分析ワークフローは、一般に、キメラ性を最小限に抑える目的で、非常に狭い質量分離幅及び質量分解能に依存する。ＭＩＷを＜１Ｔｈまで狭くすることによって同時フラグメンテーションの可能性が低減されるが、排除はされない。適切なサンプリング速度を担保するには非常に高速のスキャン速度を要するので、狭い質量分離幅は必然的にデューティサイクルを犠牲にする。ＭＳからＭＳ／ＭＳへの強度の切替えが、一般に、最も弱い対象のイオンの頂点強度に設定されることを所与として、感度は更に犠牲にされる。強度の切替えをかかるレベルに設定することで、プリカーサーがその頂点強度でサンプリングされることがほぼ担保される。狭いＭＩＷに依存するワークフローの場合、デューティサイクルを維持するにはより速い獲得速度が必要であるが、速いスキャン速度は、特にＭＳ／ＭＳ獲得の場合に、質量分解能に悪影響を及ぼす。
キメラ性のプロダクトイオンスペクトルに悪影響を生じることなくサンプリング速度を上昇させるには、高度な方法でサンプルの複雑性を扱うことができる、図３５のＭＭＡワークフローなどの分析ワークフローを要する。最大ピーク容量を利用するには、利用可能な分離空間、分解能（ｍ／ｚ、クロマトグラフィ、及びドリフトの次元における）、アクセス可能なダイナミックレンジ、及び最も重要な、研究中のサンプルの複雑性に関する徹底的な理解を要する。本明細書の技術による一実施形態に含まれる獲得スケジューラ３５０４ｂは、この情報を利用し、「複合分解能」を作成してもよい。一般に、分解能はｍ／ｚに関係するが、多次元空間でデータを獲得する場合、分解能／ピーク容量は複合物である。ＭＭＡワークフローでは、実験分解能／ピーク容量は、用いられるイオン検出前分離技術のそれぞれの分解能の積であるという点で乗法的である。本明細書に記載される一例では、図３８の３７５６に示されるようなドリフトによるｍ／ｚの分布は、全てのイオンの〜５０％がドリフト空間全体の狭い３０のドリフトビン部分内にあるという点で、図３８の３７５４の時間によるｍ／ｚの分布に非常に類似している。本明細書に記載されるデータ処理アルゴリズムの一実施形態は、スキャンごとのｍ／ｚ及びドリフトを中心にしており、結果として±１ドリフトビンのドリフト分解能が得られ、したがって、ＩＭＳが可能になることによって任意の単一のスキャンのピーク容量が〜１０倍に増加する。更に、図４３に示されるようなプリカーサーイオンの連鎖によって、面積比フィルタが逆多重化アルゴリズムに役立つことが可能になる。ＭＭＡワークフロー内において、スケジューラは、非常に正確なモデル又は前に処理されたデータから得られた前の知識によって誘導される、衝突セルを通してイオン流束を高度に支配することができる。
図３８の３７５２に示されるデータは、０．２分のビンによる１０Ｔｈのイオン密度を反映している。少なくとも１つの実施形態では、ＭＭＡが固定ＭＩＷモードで操作されるときの既定の設定があってもよい。ＭＩＷはユーザ定義可能であってもよい。自動モードでは、スケジューラは、ＭＩＷをアルゴリズムで決定される最大値に設定してもよい。例えば、二次元獲得の場合、ＭＩＷはプリカーサーイオンの数を１０に制限するように設定されてもよい。三次元データでは、ＭＩＷは、ドリフトビンごとの最大数のプリカーサーイオンが１０未満であるように設定されてもよい。三次元獲得に関して、ドリフトの関数としてのｍ／ｚの分布は、獲得ごとに同時にフラグメンテーションするプリカーサーの最大数を定義する。図３８の要素３７５４は、全てのプリカーサーの〜５０％が２５０Ｔｈ（±５０Ｔｈ）のＭＩＷ内に存在し、中央のｍ／ｚは時間と共に定常的に増加することを示している。第２及び第３の四分位数は、２つの線形回帰線β及びβ’によって時間と共に制限される。β及びβ’は発散性であって、時間に伴うｍ／ｚの広がりを表す。図３８の要素３７５６は、ｍ／ｚ対ドリフトを反映する同様のパターンを示す。これによって、ＭＭＡワークフローが、境界線β及びβ’の上下にあるｍ／ｚの領域内で狭帯域から広帯域の獲得へと、ＭＩＷを増加させることが可能になる。ＡＵＣ定量化を使用してペプチドの濃度又は相対存在比を正確に決定するため、最低５つのデータ点がそのピークＦＷＨＭにわたって獲得されなければならない。図３７に示されるデータは、例えば、スキャンサイクルの数、狭帯域及び広帯域獲得、並びにスキャン時間が、平均クロマトグラフィピーク幅に基づいてどのように計算されてもよいかを示す。
本明細書の技術による少なくとも１つの実施形態では、逆多重化処理は、既定のｍ／ｚ範囲がサンプリングされた全ての狭帯域獲得からのプロダクトイオンスペクトルを比較することを含んでもよい。プロダクトイオンは、±３のマッチ許容差×先行する基準質量精度（ｐｐｍ）、±１ドリフトビン、及び±２．５×既定のｍ／ｚ範囲で常在する各Ａ０同位体に対して計算された面積比を使用して、ｍ／ｚ、ドリフト、及び面積比によってマッチされてもよい。２つ以上のプリカーサーイオンが存在する例では、プロダクトイオンスペクトルは、プリカーサーイオンｚ及びその計算されたフラグメンテーション効率（例えば、図４０及び図４５）を利用して更にフィルタ処理されてもよい。広帯域プロダクトイオンスペクトルは同様に扱われてもよい。図３５のワークフローを実現するなど、本明細書の技術による実施形態では、自動化ワークフローの反復する性質として、全ての狭帯域及び広帯域獲得に対する中心ｍ／ｚの一定した移動によって、逆多重化及び検証アルゴリズムがプロダクトイオンスペクトルの選択性を継続的に改善する機会が提供される。
本明細書の技術を使用する少なくとも１つの実施形態では、９５％の信頼度を超える同定されたプロダクトイオンスペクトルが、他の全てのアンマッチしたプロダクトイオンスペクトルと共に、ＭＩＲの推定的な区画３５０８ｃに入れられてもよい。それぞれと関連付けられるのは、プリカーサー及びプロダクト両方のイオン全てに対する全てのメタデータである。かかる実施形態では、最低５０の推定的なペプチド同定又はマッチしたグローバル識別子が入れられると、検証アルゴリズム３５０８ｂはそれぞれに対してＣＣＰＩＳを作成しようとする。検証アルゴリズムは、例えば、ピアソンの標本相関係数及びＡＮＯＶＡを利用して、有意性に関して試験してもよい。有効な相関を所与として、各プロダクトイオンの正規化された強度における容認可能な変動を反映する誤差バーを含むＣＰＰＩＳが作成され、ＭＩＲ ３５０８ａの検証された区画へと移動される。
明確性及び有効範囲の深さは、複雑なプロテオミクスサンプルの正確な定性的及び定量的分析に関係するので、ピーク容量の直接関数である。任意の分析ワークフローのピーク容量は、イオン検出の前に適用される各直交分離技術からの全ての分解能の積として定義することができる。全ての分析技術と同様に、選択性が特異性と共に増加する程度は標準的なＳ曲線を辿る。変化率は、最初は低く、線形領域へと移動し、変曲点に達し、次に漸近的限界へと急速に近付く。漸近線を超える増加がある場合、データ品質に悪影響を有する可能性がある。イオン検出の前にインライン及びオフライン両方で更なる直交分離を用いることは、ピーク容量を最大限にすることに対して好影響を有することは明白である。更なる分離の次元が追加されるにしたがって、それぞれに適用される応力が少なくなって、それぞれが変曲点又はその付近で作用することが可能になる。一実施形態においてＭＭＡで用いられてもよい直交分離技術としては、１Ｄ及び２Ｄ ＵＰＬＣ、質量分解能、ＩＭＳ、多重化、面積比、及び分数ｍ／ｚを挙げることができるが、それらに限定されない。
ピーク容量を最大限にすることで、本明細書に記載されるようなデータ処理は、複雑な混合物のＤＩＡ分析と関連付けられた多くのイオン干渉を補正することができる。各イオンの測定されたＦＷＨＭ（ｍ／ｚ、ｔｒ、ｔｄ）を使用して、その面積がどの程度良好に測定されているかを反映する純度スコアが割り当てられる。ペプチドの各電荷状態に対するＡ０同位体及びそれに関連するプロダクトは、電荷ベクトル、同位体モデリング、及びイオン連鎖を使用して正確に同定される。同位体は、電荷群へとクラスタリングされ、それぞれの数及び面積分布が検証又は補正される。干渉が決定されている場合、仮想イオンが作成され、後に続くクラスタリングに利用可能にされる。データをスキャンごとに分析することで、注入内及び注入間のプロダクトイオンスペクトル間などで、ｍ／ｚ、面積変化率、及び継続性を比較する手段である、データ処理及び逆多重化アルゴリズムが提供される。前の注入の処理済みデータを使用して現在のＭＭＡワークフローを定義することによって、狭帯域ＤＩＡ獲得として前にサンプリングされなかったｍ／ｚの領域を問い合わせる能力である方法が提供される。
各広帯域及び狭帯域獲得の中央ｍ／ｚ値を一定して調節することによって、前のスキャンサイクル又は注入からのプロダクトイオンスペクトルを、他方をフィルタ処理するのに使用することができる。親プリカーサーのものを含む全てのプロダクトイオンスペクトルに対して結果として得られるメタデータを、ＭＩＲの推定的な部分に入れることによって、同定の状態に関わらず、プロダクトイオンスペクトルを比較することが可能になる。複合プロダクトイオンスペクトルは、ドット積スペクトル及びピアソンの積率相関係数から作成される。これらの複合プロダクトイオンスペクトルは、次に、処理され、クラスタリングされていないイオン検出に対して問い合わせすることができる。
本明細書に記載されるものの変形、修正、及び他の実現は、請求される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、当業者には想到されるであろう。したがって、本発明は、前述の例証的説明によってではなく、その代わりに以下の特許請求の範囲の趣旨及び範囲によって定義されるものとする。

Claims (20)

  1. 質量スペクトルデータを処理する方法であって、
    サンプルを使用して実験を行うステップであって、前記実験が質量分析計を使用して質量分析を行うことを含み、前記質量分析がスキャンを行い、各スキャンが、選択された範囲の質量電荷比値についてのデータを経時的に獲得する、ステップと、
    前記実験の質量分析の結果として、プリカーサーイオンデータ及びフラグメントイオンデータを獲得するステップと、
    前記プリカーサーイオンデータに含まれる１つ又は２つ以上のプリカーサー電荷クラスタを決定するステップと、
    前記プリカーサー電荷クラスタのうち第１のものに対してピーク検出を行うステップであって、前記第１のプリカーサー電荷クラスタが複数の前記スキャンにわたって追跡されて、前記第１のプリカーサー電荷クラスタの検出ピークを形成する、ステップと、
    検証基準にしたがって、前記第１のプリカーサー電荷クラスタと関連付けられた前記フラグメントイオンデータにおいて同定される、フラグメントイオンの第１のセットを決定するステップと、
    を含む、方法。
  2. 前記検証基準を使用して、フラグメントイオンの最初のセットをフィルタ処理又は改良し、フラグメントイオンの改訂されたセットを決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記質量分析計が、主にプリカーサーイオンを生成する低エネルギーモードと、主に前記プリカーサーイオンのフラグメントイオンを生成する上昇エネルギーモードとの間で切り替わり、前記切替えが、前記低エネルギーモード及び前記上昇エネルギーモードの適用を十分な頻度で交互に行うプロトコルにしたがうものであり、それにより、前記低エネルギーモード及び前記上昇エネルギーモードのそれぞれが、クロマトグラフィピーク幅の間に複数回適用され、前記プリカーサーイオンデータが前記低エネルギーモードのときに獲得される質量スペクトルデータであり、前記フラグメントイオンデータが前記上昇エネルギーモードのときに獲得される質量スペクトルデータである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記プリカーサー電荷クラスタのそれぞれが、単一の電荷状態でプリカーサーイオンを同定する、請求項１に記載の方法。
  5. 前記検証基準が、前記第１のプリカーサー電荷クラスタ、及び前記フラグメントイオンの第１のセットのフラグメントイオンのいずれかにおける１つ又は２つ以上の強度比を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 頂点スキャンが、前記第１のプリカーサー電荷クラスタの前記強度が前記複数のスキャンにおいて最大値であるスキャンであり、検証基準にしたがって、前記第１のプリカーサー電荷クラスタと関連付けられた前記フラグメントイオンデータにおいて同定される、フラグメントイオンの第１のセットを決定する前記ステップが、
    前記複数のスキャンのうち第１のものにおける前記第１のプリカーサー電荷クラスタと前記頂点スキャンとの第１の強度比を決定するステップと、
    前記第１のスキャンにおける前記第１のセットの第１のフラグメントイオンと前記頂点スキャンとの第２の強度比を決定するステップと、
    前記第１の強度比及び前記第２の強度比がほぼ同じであると判断するステップと、を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記プリカーサーイオンデータおよびフラグメントイオンデータは、前記複数のスキャンにわたって複数の質量分離ウィンドウから獲得される、請求項１に記載の方法。
  8. 装置であって、
    プロセッサと、
    実行されると質量スペクトルデータを処理する方法を行うコードが格納された、メモリと、を備え、前記方法が、
    サンプルを使用して実験を行うステップであって、前記実験が質量分析計を使用して質量分析を行うことを含み、前記質量分析がスキャンを行い、各スキャンが、選択された範囲の質量電荷比値についてのデータを経時的に獲得する、ステップと、
    前記実験の質量分析の結果として、プリカーサーイオンデータ及びフラグメントイオンデータを獲得するステップと、
    前記プリカーサーイオンデータに含まれる１つ又は２つ以上のプリカーサー電荷クラスタを決定するステップと、
    前記プリカーサー電荷クラスタのうち第１のものに対してピーク検出を行うステップであって、前記第１のプリカーサー電荷クラスタが複数の前記スキャンにわたって追跡されて、前記第１のプリカーサー電荷クラスタの検出ピークを形成する、ステップと、
    検証基準にしたがって、前記第１のプリカーサー電荷クラスタと関連付けられた前記フラグメントイオンデータにおいて同定される、フラグメントイオンの第１のセットを決定するステップと、
    を含む、装置。
  9. 前記検証基準を使用して、フラグメントイオンの最初のセットをフィルタ処理又は改良し、フラグメントイオンの改訂されたセットを決定するステップを含む、請求項８に記載の装置。
  10. 前記質量分析計が、主にプリカーサーイオンを生成する低エネルギーモードと、主に前記プリカーサーイオンのフラグメントイオンを生成する上昇エネルギーモードとの間で切り替わり、前記切替えが、前記低エネルギーモード及び前記上昇エネルギーモードの適用を十分な頻度で交互に行うプロトコルにしたがうものであり、それにより、前記低エネルギーモード及び前記上昇エネルギーモードのそれぞれが、クロマトグラフィピーク幅の間に複数回適用され、前記プリカーサーイオンデータが前記低エネルギーモードのときに獲得される質量スペクトルデータであり、前記フラグメントイオンデータが前記上昇エネルギーモードのときに獲得される質量スペクトルデータである、請求項８に記載の装置。
  11. 前記プリカーサー電荷クラスタのそれぞれが、単一の電荷状態でプリカーサーイオンを同定する、請求項８に記載の装置。
  12. 前記検証基準が、前記第１のプリカーサー電荷クラスタ、及び前記フラグメントイオンの第１のセットのフラグメントイオンのいずれかにおける１つ又は２つ以上の強度比を含む、請求項８に記載の装置。
  13. 頂点スキャンが、前記第１のプリカーサー電荷クラスタの前記強度が前記複数のスキャンにおいて最大値であるスキャンであり、検証基準にしたがって、前記第１のプリカーサー電荷クラスタと関連付けられた前記フラグメントイオンデータにおいて同定される、フラグメントイオンの第１のセットを決定する前記ステップが、
    前記複数のスキャンのうち第１のものにおける前記第１のプリカーサー電荷クラスタと前記頂点スキャンとの第１の強度比を決定するステップと、
    前記第１のスキャンにおける前記第１のセットの第１のフラグメントイオンと前記頂点スキャンとの第２の強度比を決定するステップと、
    前記第１の強度比及び前記第２の強度比がほぼ同じであると判断するステップと、を含む、請求項８に記載の装置。
  14. 前記プリカーサーイオンデータおよびフラグメントイオンデータは、前記複数のスキャンにわたって複数の質量分離ウィンドウから獲得される、請求項８に記載の装置。
  15. 質量スペクトルデータを処理する方法であって、
    サンプルを使用して実験を行うステップであって、前記実験が質量分析計を使用して質量分析を行うことを含み、前記質量分析がスキャンを行い、各スキャンが、選択された範囲の質量電荷比値についてのデータを経時的に獲得し、前記質量分析計が複数のスキャンのためのスケジュールにしたがって動作する、ステップと、
    前記複数のスキャンのうちの少なくとも１つのスキャン中に、質量分離ウィンドウ内のプリカーサーイオンデータを獲得するステップと、
    前記プリカーサーイオンデータを使用して１つ又は２つ以上のプリカーサー電荷クラスタを決定するステップと、
    前記プリカーサーイオンデータを使用して、前記複数のスキャンのうちの後続のスキャンのために前記質量分離ウィンドウを調整するステップと、
    前記プリカーサー電荷クラスタの部分を連鎖させることによって、前記第１のプリカーサーイオンのピークプロファイルを決定するステップと、
    を含む、方法。
  16. 前記獲得するステップは、上昇エネルギースキャンで異なる質量分離ウィンドウを反復して使用するステップを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. ｍ／ｚ及び保持時間を含む複数の次元を有する有界領域を決定するステップと、
    前記有界領域に対してフラグメンテーションが行われるまで、上昇エネルギースキャンで異なる質量分離ウィンドウを反復して使用するステップと、
    を含む、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記質量分析計が、主にプリカーサーイオンを生成する低エネルギーモードと、主に前記プリカーサーイオンのフラグメントイオンを生成する上昇エネルギーモードとの間で切り替わり、前記切替えが、前記低エネルギーモード及び前記上昇エネルギーモードの適用を十分な頻度で交互に行うプロトコルにしたがうものであり、それにより、前記低エネルギーモード及び前記上昇エネルギーモードのそれぞれが、クロマトグラフィピーク幅の間に複数回適用され、前記プリカーサーイオンデータが前記低エネルギーモードのときに獲得される質量スペクトルデータであり、前記フラグメントイオンデータが前記上昇エネルギーモードのときに獲得される質量スペクトルデータである、請求項１５に記載の方法。
  19. 前記プリカーサー電荷クラスタのそれぞれが、単一の電荷状態でプリカーサーイオンを同定する、請求項１５に記載の方法。
  20. 前記質量分離ウィンドウの少なくとも第１の部分が、フラグメンテーションに対してほぼ同じ数のプリカーサーイオンを選択することにしたがって決定されたサイズ及び関連ｍ／ｚ範囲を有する、請求項１５に記載の方法。
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