CN111398402B - 基于线性离子阱梯度隔离策略的离子构象分布表征方法 - Google Patents

基于线性离子阱梯度隔离策略的离子构象分布表征方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于线性离子阱梯度隔离策略的离子构象分布表征方法，S1，产生目标物离子；S2，将离子隔离，设定线性离子阱的初始隔离宽度；S3，获得初始隔离宽度下的信号强度值；S4，缩小隔离宽度，再次检测，获得对应隔离宽度下的信号强度值；S5，多次重复步骤S4，直至隔离宽度缩小至定值或小于定值时停止重复；S6，获得相对信号强度；S7，对相对信号强度取对数值，并将所得的对数值对相应的隔离宽度作图，得到最终谱图。该方法将目标离子隔离在线性离子阱中，通过改变隔离宽度，使具有不同构象的离子随着隔离宽度缩小顺次逐出离子阱，对在不同隔离宽度下留在阱中的离子数量进行测量汇总成谱图。由此，便获得了目标离子的构象分布图。

Description

基于线性离子阱梯度隔离策略的离子构象分布表征方法
技术领域
本发明涉及一种离子构象分布表征方法，尤其涉及一种使用线性离子阱质谱仪，并利用梯度隔离策略来表征离子的构象分布的表征方法。
背景技术
分子，尤其是生物分子的理化性质和生物功能与分子的结构密切相关，因此，分子结构的表征在化学和生物学研究中具有非常重要的意义。到目前为止，人们已经发展出了多种技术手段，从不同角度对分子的结构进行表征，如核磁共振法(Nuclear magneticresonance，NMR)，红外光谱法(Infrared spectroscopy，IR)和紫外光谱法(Ultravioletspectroscopy，UV)等。然而，由于分子结构的复杂性和多样性，分子结构的全面表征仍然是一个巨大的挑战。近年来，质谱(Mass spectrometry，MS)凭借其极高的灵敏度、高分辨率，以及多种定性分析手段，已经成为了分子结构表征中不可或缺的分析工具。
通过对目标离子进行碎裂，利用碎裂规律来解析目标离子的结构是使用质谱进行分子结构表征最为常用的策略。它能够提供目标离子的官能团信息。碰撞诱导解离(Collision-induced dissociation，CID)利用交流电压来激发目标离子，使得目标离子更加剧烈地与背景气体产生碰撞，导致目标离子的碎裂，产生特征碎片离子。CID被广泛用于表征有机小分子和生物大分子的结构，是目前质谱中最为常用的碎裂技术之一。高能碰撞诱导解离(High energy collision-induced dissociation，HCD)与CID相比，在较短的激发时间内对目标离子施加了更高的振动能量，使得目标离子与背景气体产生更为激烈的碰撞，从而产生更多的碎片离子，由此获得更为丰富的离子结构信息。HCD在生物分子的结构表征中更为常用，如多肽和蛋白质等。
电子捕获解离(Electron capture dissociation，ECD)遵循了另一种离子碎裂机制。ECD将低能量的电子引入傅里叶变换离子回旋共振(Fourier transform ioncyclotron resonance，FT-ICR)质谱仪的磁室中。在磁室中，电子被带有正电荷的多肽离子捕获。捕获后，电子所携带的过多能量导致多肽离子的骨架断裂，从而获得有关多肽离子氨基酸序列的信息。ECD需要使用FT-ICR质谱仪，这极大地限制了它的应用。电子转移解离(Electron transfer dissociation，ETD)则弥补了ECD的上述不足。它利用携带电子的阴离子与带正电的多肽阳离子发生反应，将电子转移到多肽阳离子上，电子转移所释放的能量导致多肽离子的骨架断裂，产生碎片离子。ECD不需要用到FT-ICR，但却能产生与ECD相似的碎裂结果。
紫外光解离(Ultraviolet photodissociation，UVPD)也被用于多肽和蛋白质离子的碎裂。紫外光子的能量可以导致大多数生物分子从基态转变为电子激发态。从激发态回到基态时所释放的能量导致了生物分子的碎裂。与上述碰撞激发的碎裂方法相比，UVPD能产生更为丰富的碎片信息。
氢/氘交换(Hydrogen/deuterium exchange，HDX)使用了一种非碎裂的方式来获取离子的官能团信息。HDX主要用于检测具有活性H原子的官能团，如羟基(-OH)，氨基(-NH2)和羧基(-COOH)。将分析物溶解在重水(D2O)中，这些官能团的H原子会被D原子取代。通过解析质谱图中相应谱峰质荷比(mass-to-charge ratio，m/z)的偏移，便可计算出分子中官能团的数量。此外，HDX还可用于表征蛋白质分子的构象。氢/氘交换的速率受蛋白质分子构象的影响。通过测量蛋白质的氘化率随时间的变化，便可以获得关于蛋白质构象的信息，从而揭示蛋白质分子在不同环境因素下的构象变化。
通过解析电喷雾离子化(Electrospray ionization，ESI)所产生的蛋白质多电荷离子所带的电荷数，也可以用来进行蛋白质分子结构的表征。天然状态的蛋白质分子通常具有折叠结构。一些可以结合电荷的官能团被包裹在分子内部。因此，具有天然结构的蛋白质分子离子化后具有较少的电荷数和较窄的电荷数分布，在质谱图中处在较高的m/z区域。相比之下，变性状态的蛋白质分子通常具有非折叠构象，原本包裹在分子内部的很多官能团被暴露出来，在ESI过程中，能够加合更多电荷。因此，变性状态的蛋白质分子离子化后具有较多的电荷数和较宽的电荷数分布，在质谱图中处在较低的m/z区域。
事实上，分子的构象存在着一个动态平衡。给定一定数量的分子，大多数分子保持着具有较低能量的构象，只有少数分子处于具有较高能量的构象中。分子在不同构象之间存在着一个分部。遗憾的是，目前还没有方法能够表征分子在构象上的分布。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于线性离子阱梯度隔离策略的离子构象分布表征方法，实现了对离子构象分布的精确测量。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种基于线性离子阱梯度隔离策略的离子构象分布表征方法，包括如下步骤：
S1，通过ESI或纳喷雾对样品溶液进行离子化，产生目标物离子；
S2，将离子注入线性离子阱质谱进行隔离，设定线性离子阱的初始隔离宽度；
S3，对初始隔离宽度内被隔离的离子进行检测，获得初始隔离宽度下的信号强度值；
S4，按定值缩小隔离宽度，再次对被隔离的离子进行检测，获得对应隔离宽度下的信号强度值；
S5，多次重复步骤S4，直至隔离宽度缩小至定值或小于定值时停止重复；
S6，将获得的所有信号强度值进行归一化计算，获得相对信号强度；
S7，对相对信号强度取对数值，并将所得的对数值对相应的隔离宽度作图，得到最终谱图。
优选地，初始隔离宽度的设定过程如下：
首先，多次调整隔离宽度，并对隔离宽度内被隔离的离子进行检测；获得对应隔离宽度下的信号强度值；
其次，将获得的最强信号强度值对应的隔离宽度设定为初始隔离宽度。
优选地，所述初始隔离宽度为2-3Da。
优选地，在步骤S2中，离子注入时间为100ms。
优选地，隔离宽度的中心与目标离子的m/z相等。
优选地，所述线性离子阱的压力为1.5×10-5Torr。
优选地，所述定值为0.1Da。
综上所述，本发明的有益技术效果为：
本发明要求保护的一种基于线性离子阱梯度隔离策略的离子构象分布表征方法实现了对离子构象分布的精确测量。该方法将目标离子隔离在线性离子阱中，通过改变隔离宽度(隔离的m/z范围)，将隔离宽度从3Da逐步缩小至0.1Da，使得具有不同构象的离子随着隔离宽度的缩小顺次被逐出离子阱，对在不同隔离宽度下留在阱中的离子数量进行测量，并汇总成谱图。由此，便获得了目标离子的构象分布图。本发明提供的方法能够获得有关离子构象的信息，未来在化学和分子生物学研究中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是TMA(A)，n-BA(B)，i-BA(C)和t-BA(D)的一级质谱图。
图2是TMA，n-BA，i-BA和t-BA的结构和构象分布图。
图3是Cs+(A)，I-(B)和MnO4 -(C)三种无机离子的构象分布图。
图4是离子阱在不同压力下(0.8×10-5，1.1×10-5和1.5×10-5Torr)，t-BA的构象分布。
图5是DMEA和PZ的结构和构象分布图。
图6是BTMA和OTMA的结构式和构象分布图。
图7是不同条件下获得的细胞色素c的质谱图和构象分布图。
图8是不同条件下获得的溶菌酶的质谱图和构象分布图。
图9是不同条件下获得的G5，G6和G7的构象分布图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
本发明所使用的质谱仪器为线性离子阱质谱仪。
通过ESI或纳喷雾(Nano-ESI)对样品溶液进行离子化，产生目标物离子。离子进入线性离子阱质谱进行隔离和检测。离子阱的初始隔离宽度设定为2.5Da(可根据需要进行调整)，离子注入时间为100ms，隔离范围的中心与目标离子的m/z相等，离子阱压力为1.5×10-5Torr。隔离完成后，对所隔离的离子进行检测，获得该隔离宽度下的信号强度值。之后，将隔离宽度缩小0.1Da，在新的隔离宽度下重复上述测量过程。如此循环，直至隔离宽度缩小至0.1Da。记录下在不同隔离宽度下所获得的信号强度值，对这些信号强度进行归一化，得到相对信号强度。对相对信号强度取对数值(1g值)。将所得的对数值对相应的隔离宽度作图，得到最终的谱图。
检测效果：
通过对不同种类离子构象分布的测量可以得出，具有不同结构的离子表现出不同的构象分布。具有柔性结构的分子，构象容易发生改变，它们具有较宽的构象分布，表明它们存在大量构象异构体。与此相反，具有刚性结构的分子，构象难以发生改变，它们具有窄的构象分布，表明仅存在少量构象异构体。
对蛋白质分子构象分布的研究表明，具有天然折叠结构的蛋白质分子和具有变性非折叠结构的蛋白质分子在构象的分布上存在着显著差异。处在天然折叠状态的蛋白质分子具有较为紧凑的球状结构。随着蛋白质分子表面所带电荷数的增加，由于电荷之间的排斥力，使得蛋白质分子变得更加刚性。因此，随着电荷数的增加，蛋白质分子的构象分布变窄。与此相反，处在变性非折叠状态的蛋白质分子具有较为松散的线性结构。然而，由于分子内部不同官能团之间的相互作用，分子仍然保持着部分折叠。电荷数的增加使得蛋白质分子克服了这些分子内的相互作用，分子结构变得更为舒展和柔软。因此，随着电荷数的增加，蛋白质分子的构象分布变得更宽。
对低聚糖分子构象分布的研究表明，随着葡萄糖单体数量的增加，低聚糖分子的构象分布变得更宽。质子化的低聚糖离子和钠离子(Na+)加合的低聚糖离子在构象的分布上存在着显著差异。质子化的低聚糖离子具有较宽的构象分布。相比之下，Na+加合的低聚糖离子具有较窄的构象分布。这是由于低聚糖分子的质子化离子和Na+加合物的结构不同所导致的。相比于H+而言，Na+具有明显更大的离子半径。加合Na+后，低聚糖分子的构象变化受到了限制，其构象分布因此变窄。
机理探讨：
不同的异构体离子具有不同的碰撞截面积(Collision cross sections，CCS)。具有不同CCS的异构体离子与缓冲气分子发生碰撞，其运动轨迹所受到的影响不同。具有较小CCS的异构体离子与缓冲气分子的碰撞概率较低，动能衰减程度较小。这使得它们更容易被弹出离子阱。在隔离宽度较宽的情况下，这些异构体离子便可被弹出离子阱。具有较大CCS的异构体离子与缓冲气分子的碰撞更为频繁，动能降低更为明显。这使得它们更容易被保留在离子阱中。当隔离宽度较窄时，这些异构体的离子才能被弹出离子阱。随着隔离宽度的减小，具有不同CCS的异构体依次被弹出。因此，异构体的CCS和数量差异较大的化合物，则具有较宽的构象分布。
(1)四甲基铵(Tetra-methyl-ammonium，TMA)，正丁胺(n-Butylamine，n-BA)，异丁胺(i-Butylamine，i-BA)和叔丁胺(t-Butylamine，t-BA)的构象分布。
TMA，n-BA，i-BA和t-BA溶解于超纯水中浓度为1mM，分别加入5mM醋酸铵(NH4Ac)，得到四个待测样品溶液，使用本发明的方法对该溶液进行检测。
四种化合物的离子具有相同的m/z为74.1Da(图1，TMA，n-BA，i-BA和t-BA溶解于超纯水中，浓度为1mM，分别加入5mM NH4Ac，得到四个待测样品溶液。分别使用质谱进行一级谱图扫描，得到上述质谱图，四种化合物的离子具有相同的m/z 74.1Da)。然而，这四种化合物具有不同的分子结构(图2A)，因此表现出不同的构象分布(图2B)。TMA的构象分布非常狭窄，即使隔离宽度减小到0.3Da，也没有异构体被弹射。当隔离宽度进一步降低至0.3Da以下时，观察到相对强度的轻微降低。这表明小部分异构体被逐出离子阱。然而，大多数TMA离子保留在阱中，这意味着大多数TMA离子具有相同的构象。
与TMA相比，n-BA表现出更宽的构象分布。当隔离宽度减小到1.2Da时，异构体开始被逐出离子阱。随着隔离宽度的减小，更多异构体被逐出。隔离宽度减小时相对强度也随之减小，说明有一定数量的异构体被逐出离子阱。异构体的连续逐出意味着n-BA比TMA具有更多的构象。这种现象在i-BA上更为明显。当隔离宽度减小到1.4Da时，i-BA的异构体便开始被逐出。随着隔离宽度从1.4减小至0.1Da，异构体持续被逐出，表明i-BA具有比n-BA更多的构象。与上述三种分子相比，t-BA具有最多的构象数。t-BA的异构体在隔离宽度为2.5Da时便开始被逐出离子阱。当隔离宽度从2.0减小到1.9Da时，有大比例的异构体被逐出。之后，随着隔离宽度的减小，更多t-BA异构体被逐出离子阱。
(2)无机离子包括铯离子(Cesium ion，Cs+)，碘离子(Iodide ion，I-)和高锰酸根离子(Permanganate ion，MnO4 -)的构象分布。
氯化铯，碘化钠和高锰酸钾溶解于超纯水中，得到浓度分别为100μM，50μM and 50μM的待测样品溶液，使用本发明的方法对该溶液进行检测，结果如图3所示。
Cs+和I-是没有分子结构的单原子离子，因此Cs+和I-没有构象异构体。这与实验结果相吻合(图3)。即使隔离宽度从2.0减小到0.1Da，在Cs +和I-所获得的谱图中也未观察到相对强度的降低。
MnO4 -的结构比Cs+和I-稍微复杂一点。它具有四面体结构，其中四个氧原子配位在中心锰原子周围。MnO4 -也没有构象异构体，实验结果证实了这一点。
与MnO4 -相比，TMA的情况更为复杂。TMA离子也具有四面体结构，其中四个甲基键合在中心氮原子周围。然而，由于甲基具有旋转运动，因此TMA存在构象异构体。旋转运动不会改变TMA的整体四面体骨架。因此，不同TMA异构体的构象彼此相似。在所获得的谱图中观察到弱响应(图2B)。对于n-BA，i-BA和t-BA，分子的骨架由于碳链的旋转而改变。不同异构体之间的构象差异比TMA更显著。因此，这三种丁胺具有更宽的构象分布。
(3)在离子阱不同气压下，t-BA的构象分布。
改变离子阱的气压，分别为0.8×10-5，1.1×10-5和1.5×10-5Torr。使用本发明的方法对t-BA进行检测，结果如图4所示。随着气压的增加，t-BA的构象分布变得更宽。这进一步佐证了离子的构象分布与CCS有关。在较高的气压下，由于离子与缓冲气分子之间的碰撞，离子更容易被冷却而保留在离子阱中。这使得原本在较宽的隔离宽度下就能被弹出的离子，需要在较窄的隔离宽度下才能被弹出。也就是说，离子的弹出朝着更窄的隔离宽度迁移。在较窄的隔离宽度处弹出的离子数量增加了。因此，在较高的气压下，离子构象分布的变化变得更加剧烈。
(4)N，N-二甲基-1，2-乙二胺(N，N-dimethyl-1，2-ethanediamine，DMEA)和哌嗪(Piperazine，PZ)的构象分布。
DMEA和PZ溶解于超纯水中，浓度为10μM，分别加入5mM NH4Ac，得到三个待测样品溶液，使用本发明的方法对该溶液进行检测，结果如图5所示。
这三种分子的结构是相关的(图5A)。DMEA具有较为柔性的线性结构，没有分子内环，因此具有较宽的构象分布(图5B)。当隔离宽度从2.0降至1.9Da和从0.8降至0.1Da时，相对强度显著降低。这表明较大比例的DMEA离子具有相应的构象。当隔离宽度从1.3减小到0.9Da时，相对强度缓慢降低，表明相应的异构体仅占很小的比例。在1.8至1.4Da的隔离范围内几乎没有观察到相对强度的降低，这意味着没有异构体被逐出。也就是说，在该隔离范围内几乎没有中间构象的异构体。因此，隔离宽度为1.9和1.3Da所对应的两种异构体之间，存在着显著的构象差异。
与DMEA相比，PZ具有分子内六元环，结构更加稳固。六元环强烈地限制了碳链的折叠和卷曲运动，导致异构体的数量有限，并且，不同异构体之间的构象差异远小于DMEA的构象差异。从所得谱图中可以观察到非常窄的构象分布。当隔离宽度从0.5减小到0.1Da时，异构体逐渐被逐出。相对强度的降低不明显，说明异构体的比例较小。
(5)丁基三甲基铵(Butyl-trimethyl-ammonium，BTMA)和辛基三甲基铵(Octyl-trimethyl-ammonium，OTMA)的构象分布。
BTMA和OTMA溶解于超纯水中，浓度为5μM。分别加入5mM NH4Ac，得到两个待测样品溶液，使用本发明的方法对该溶液进行检测，结果如图6所示。
TMA，BTMA和OTMA，这三种物种是具有相似结构的同系物(图2A和图6A)，区别在于分子中一条碳链的长度。TMA的碳链长度最短，其潜在异构体的数量最少。因此，TMA的构象分布最窄(图2B)。BTMA具有比TMA更长的碳链，有四个碳原子。其潜在异构体的数量多于TMA。因此，BTMA比TMA的构象分布更宽(图6B)。OTMA具有最长的碳链，有8个碳原子。其潜在异构体的数量最多。因此，OTMA具有最宽的构象分布(图6B)。
(6)细胞色素c的构象分布。
细胞色素c溶解于超纯水中，浓度为10μM的母液。向该溶液中加入10mM NH4Ac，获得具有天然折叠结构的细胞色素c样本；向该溶液中加入5mM盐酸(HCl)，获得具有变性非折叠结构的细胞色素c样本。使用本发明的方法对该溶液进行检测，结果如图7所示：
细胞色素c溶解于超纯水中，浓度为10μM的母液。向该溶液中加入10mM NH4Ac，获得具有天然折叠结构的细胞色素c样本。(图7A)具有天然折叠结构的细胞色素c的一级质谱图。(图7B)具有天然折叠结构的细胞色素c离子的构象分布。
细胞色素c溶解于超纯水中，浓度为10μM的母液。向该溶液中加入5mM盐酸(HCl)，获得具有变性非折叠结构的细胞色素c样本。(图7C)具有变性非折叠结构的细胞色素c的一级质谱图。(图7D)具有变性非折叠结构的细胞色素c离子的构象分布。
对于具有天然折叠结构的细胞色素c样本而言，带有7+和8+电荷数的离子是丰度最高的离子(图7A)。7+电荷数离子具有较窄的构象分布(图7B)。隔离宽度从1.3降至0.1Da时，相对强度显著降低。尤其是从0.8至0.7Da时，信号强度的降低更为显著。这表明7+电荷数的细胞色素c离子的构象分布不均匀，相当大一部分离子具有0.8至0.7Da隔离范围所对应的构象。8+电荷数的细胞色素c离子具有非常相似的结果，但构象分布更窄。
对于具有变性非折叠结构的细胞色素c样本而言，带有15+，17+和19+电荷数的离子具有较高的丰度(图7C)。它们具有相似的构象分布，均表现出较窄的分布，且具有显著的不均匀性(图7D)。然而，随着电荷数的增加，从15+增加到19+，构象分布逐渐变宽。这与具有折叠结构的细胞色素c离子正好相反，体现出二者之间构象分布的差异性。
机理探讨：
处在天然折叠状态的细胞色素c分子具有较为紧凑的球状结构。随着细胞色素c分子表面所带电荷数的增加，电荷之间的排斥力使得细胞色素c分子变得更加刚性。因此，随着电荷数的增加，细胞色素c分子的构象分布变窄。与此相反，处在变性非折叠状态的细胞色素c分子具有较为松散的线性结构。然而，由于分子内部不同官能团之间的相互作用，分子仍然保持着部分折叠。电荷数的增加使得细胞色素c分子克服了这些分子内的相互作用，分子结构变得更为舒展和柔软。因此，随着电荷数的增加，细胞色素c分子的构象分布变得更宽。
(7)溶菌酶的构象分布。
具有天然折叠结构的溶菌酶样品溶液的制备：溶菌酶溶解于超纯水中，浓度为10μM，加入10mM NH4Ac，得到具有天然折叠结构的溶菌酶待测样品溶液。
具有变性非折叠结构的溶菌酶样品溶液的制备：通过二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)还原溶菌酶以除去其二硫键。将溶菌酶以1mg/mL的浓度溶解在超纯水中，将DTT以5mM的浓度添加到样品中，所得溶液在95℃下培养15分钟，最后用超纯水稀释样品。溶菌酶的最终浓度为10μM。加入5mM HCl，得到待测样品溶液。
使用本发明的方法对两个溶液进行检测，结果如图8所示。
在溶菌酶上获得了与细胞色素c类似的结果(图8)。
具有天然折叠结构的溶菌酶样品溶液的制备：溶菌酶溶解于超纯水中，浓度为10μM，加入10mM NH4Ac，得到具有天然折叠结构的溶菌酶待测样品溶液。(图8A)具有天然折叠结构的溶菌酶的一级质谱图。(图8B)具有天然折叠结构的溶菌酶离子的构象分布。
具有变性非折叠结构的溶菌酶样品溶液的制备：通过二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)还原溶菌酶以除去其二硫键。将溶菌酶以1mg/mL的浓度溶解在超纯水中，将DTT以5mM的浓度添加到样品中，所得溶液在95℃下培养15分钟，最后用超纯水稀释样品。溶菌酶的最终浓度为10μM。加入5mM HCl，得到待测样品溶液。(图8C)具有变性非折叠结构的溶菌酶的一级质谱。(图8D)具有变性非折叠结构的溶菌酶离子的构象分布
对于具有天然折叠结构的溶菌酶样本而言，带有8+和9+电荷数的离子是丰度最高的离子(图8A)。8+电荷数离子具有较窄的构象分布(图8B)。隔离宽度从1.1降至0.1Da时，相对强度显著降低。尤其是从0.7至0.5Da时，信号强度的降低更为显著。这表明8+电荷数的溶菌酶离子的构象分布不均匀，相当大一部分离子具有0.7至0.5Da隔离范围所对应的构象。9+电荷数的细胞色素c离子具有非常相似的结果，但构象分布更窄。
对于具有变性非折叠结构的溶菌酶样本而言，带15+，16+，17+和18+电荷数的离子具有较高的丰度(图8C)。它们表现出较宽的构象分布，且具有显著的不均匀性(图8D)。然而，随着电荷数的增加，从15+增加到18+，构象分布逐渐变宽。这与具有折叠结构的溶菌酶离子正好相反，体现出二者之间构象分布的差异性。
(8)麦芽五糖(maltopentaose，G5)，麦芽六糖(maltohexaose，G6)和麦芽七糖(maltoheptaose，G7)的构象分布。
G5，G6和G7溶解于超纯水，得到浓度为10μM的母液。向溶液中加入5mM HCl，获得质子化的G5，G6和G7三个样本；向该溶液中加入5mM氯化钠(NaCl)，获得钠离子(Na+)加合的G5，G6和G7三个样本。使用本发明的方法对该溶液进行检测，结果如图9所示。
这三种化合物具有非常相似的结构，它们都是由葡萄糖聚合而成的低聚糖。G5，G6和G7分别具有5，6和7个葡萄糖单元。质子化的G7离子具有较宽的构象分布(图9A)。当隔离宽度从2.9降至2.7Da和从1.2降至0.1Da时，相对强度显著降低。这表明较大比例的G7离子具有相应的构象。隔离宽度为2.9和2.7Da所对应的两种异构体之间，存在着显著的构象差异。当隔离宽度从7.0减小到4.0Da时，相对强度缓慢降低，表明相应的异构体仅占很小的比例。在3.9至2.9Da，2.7至2.0Da和1.9至1.2Da的隔离范围内几乎没有观察到相对强度的降低，这意味着没有异构体被逐出。也就是说，在该隔离范围内几乎没有中间构象的异构体。
质子化的G5和G6离子具有非常相似的结果，当隔离宽度从2.4降至2.2Da时，G6离子的相对强度显著降低。同样，当隔离宽度从2.0降至1.9Da时，G5离子的相对强度显著降低。这表明在相应的隔离宽度，异构体之间存在着显著的构象差异。
G7具有7个葡萄糖单元，数量最多，分子链最长，其潜在异构体的数量最多。因此，G7具有最宽的构象分布。G6的链长度比G7短，有6个葡萄糖单元。其潜在异构体的数量少于G7。因此，G6比G7的构象分布更窄。G5的链长度最短，因此，G5具有最窄的构象分布。
与质子化离子相比较，G5，G6和G7的Na+加合物具有较窄的构象分布(图9B)。这可能是由于离子本身存在Na+导致的。Na+稳定了低聚糖的构象。与质子化的离子相似，G7的Na+加合物具有最宽的构象分布。而G5的Na+加合物具有最窄的构象分布。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于线性离子阱梯度隔离策略的离子构象分布表征方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，通过ESI或纳喷雾对样品溶液进行离子化，产生目标物离子；
S2，将离子注入线性离子阱质谱进行隔离，设定线性离子阱的初始隔离宽度；
S3，对初始隔离宽度内被隔离的离子进行检测，获得初始隔离宽度下的信号强度值；
S4，按定值缩小隔离宽度，再次对被隔离的离子进行检测，获得对应隔离宽度下的信号强度值；
S5，多次重复步骤S4，直至隔离宽度缩小至定值或小于定值时停止重复；
S6，将获得的所有信号强度值进行归一化计算，获得相对信号强度；
S7，对相对信号强度取对数值，并将所得的对数值对相应的隔离宽度作图，得到最终谱图。
2.根据权利要求1所述的基于线性离子阱梯度隔离策略的离子构象分布表征方法，其特征在于，初始隔离宽度的设定过程如下：
首先，多次调整隔离宽度，并对隔离宽度内被隔离的离子进行检测；获得对应隔离宽度下的信号强度值；
其次，将获得的最强信号强度值对应的隔离宽度设定为初始隔离宽度。
3.根据权利要求1所述的基于线性离子阱梯度隔离策略的离子构象分布表征方法，其特征在于，所述初始隔离宽度为2-3Da。
4.根据权利要求1所述的基于线性离子阱梯度隔离策略的离子构象分布表征方法，其特征在于，在步骤S2中，离子注入时间为100ms。
5.根据权利要求1所述的基于线性离子阱梯度隔离策略的离子构象分布表征方法，其特征在于，隔离宽度的中心与目标离子的m/z相等。
6.根据权利要求1所述的基于线性离子阱梯度隔离策略的离子构象分布表征方法，其特征在于，所述线性离子阱的压力为1.5×10-5Torr。
7.根据权利要求1所述的基于线性离子阱梯度隔离策略的离子构象分布表征方法，其特征在于，所述定值为0.1Da。
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