CN111351876A - 一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其先以宿主细胞蛋白建立蛋白数据库，再取抗体药样品结合宿主细胞蛋白数据库进行分析，抗体药样品分析包括取抗体药样品并向其中加入内标标准蛋白作为参比，进行数据非依赖性采集的质谱分析，定量检测抗体药品中的宿主细胞蛋白；所述的宿主细胞蛋白数据库能用于后续相同宿主细胞的抗体药检测，具有成分明确、杂质含量明确、通量高、速度快等优势，为抗体药中杂质蛋白检测开辟了一条新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法。
背景技术
单克隆抗体药物在肿瘤、风湿性关节炎、自身免疫性疾病等方面有着独特疗效，在临床上应用越来越广泛。宿主细胞蛋白(Host Cell Proteins,HCPs)是抗体药中的主要杂质之一，主要来自于宿主细胞的分泌蛋白和死亡宿主细胞的结构蛋白。痕量的杂质蛋白残留可能会在人体产生严重的免疫反应，因此生物药物制品中所含杂质蛋白成分和质量控制非常重要。目前HCPs检测主要通过Elisa方法，但该方法检测成分不明确、假阳性高等缺点。因此，开发出一种可以进行宿主细胞蛋白定性定量的方法尤为迫切。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其先以宿主细胞蛋白建立蛋白数据库，再取抗体药样品结合宿主细胞蛋白数据库进行分析，抗体药样品分析包括取抗体药样品并向其中加入内标标准蛋白作为参比，进行数据非依赖性采集的质谱分析，定量检测抗体药品中的宿主细胞蛋白；所述的宿主细胞蛋白数据库能用于后续相同宿主细胞的抗体药检测，具有成分明确、杂质含量明确、通量高、速度快等优势，为抗体药中杂质蛋白检测开辟了一条新的途径。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其先以宿主细胞蛋白建立蛋白数据库，再取抗体药样品结合宿主细胞蛋白数据库进行分析，抗体药样品分析包括取抗体药样品并向其中加入内标标准蛋白作为参比，进行数据非依赖性采集的质谱分析，定量检测抗体药品中的宿主细胞蛋白；所述的宿主细胞蛋白数据库能用于后续相同宿主细胞的抗体药检测。
根据以上方案，所述的以宿主细胞蛋白建立蛋白数据库包括如下步骤：
步骤S11，取标准品蛋白并混合均匀，得标准蛋白混合液，再将标准蛋白混合液加入到宿主细胞蛋白样品中；
步骤S12，取步骤S11获得的宿主细胞蛋白样品加入1M的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(Tris-HCl)和胰蛋白酶(Trypsin)进行酶解，酶解后加入1M的二硫苏糖醇(DTT)孵育，再离心取上清液；
步骤S13，取步骤S12中获得的上清液加入20％三氟乙酸(TFA)，将pH调至2-3，再取上清液进行高pH反相色谱分馏，将混合物分成多个级别的组分，每个组分均冷冻干燥，再用1％甲酸(FA)复溶，再加入iRT标准肽段后进行高效液相色谱-串联质谱分析，分析质谱数据并建立宿主细胞蛋白数据库；
所述的串联质谱条件为：分析时长：120min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：60,000(@m/z 200)，最大增益控制(AGC target)：3e6，一级最大进样时间(一级Maximum IT)：25ms；肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后触发采集20个二级质谱图谱(MS2 scan)，二级质谱分辨率：15,000at m/z200，最大增益控制(AGC target):1e5，二级最大进样时间(二级Maximum IT)：50ms，MS2解离模式(MS2 Activation Type):高能碰撞解离(HCD)，隔离窗口(Isolation window)：1.5Th，碰撞能量(Normalized collision energy)：27。
根据以上方案，所述的抗体药样品分析包括如下详细步骤：
步骤S21，取标准品蛋白并混合均匀，得标准蛋白混合液，再将标准蛋白混合液加入到抗体药样品中；
步骤S22，取抗体药样品加入1M的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(Tris-HCl)和胰蛋白酶(Trypsin)进行酶解，酶解后加入1M的二硫苏糖醇(DTT)孵育，再离心取上清液；
步骤S23，取步骤S22中获得的上清液加入20％三氟乙酸(TFA)，将pH调至2-3，再将上清夜进行脱盐处理，冷冻干燥，再用1％甲酸(FA)复溶，再加入iRT标准肽段后进行高效液相色谱-串联质谱分析；
所述的质谱分析条件是：分析时长：120min，检测模式：正离子；一级质谱扫描范围：350-1650m/z，质谱分辨率：120,000(@m/z 200)，最大增益控制(AGC target)：3e6，一级最大进样时间(一级Maximum IT)：50ms；MS2采用数据非依赖性采集(DIA)模式，设置30个DIA采集窗口，二级质谱分辨率：30,000(@m/z 200)，最大增益控制(AGC target)：3e6，二级最大进样时间(二级Maximum IT)：自动，MS2解离模式(MS2 Activation Type):高能碰撞解离(HCD)，碰撞能量(Normalized collision energy)：25，光谱数据类型(Spectral datatype):剖面(profile)；
步骤S24，使用标准蛋白掺入的摩尔量以及特征信息，绘制标准曲线；根据标准曲线的公式，结合宿主细胞蛋白特征信息计算出宿主细胞蛋白的摩尔数，并通过摩尔数转化为质量，再根据初始进样量计算宿主细胞蛋白的含量。
根据以上方案，所述的标准蛋白混合液包括100ppm的溶菌酶(lysozyme)、50ppm的肌红蛋白(myoglobin)、30ppm的乳铁蛋白(Lactoferrin)、15ppm的牛血清白蛋白(BSA)、5ppm的β-酪蛋白(β-Casein)和1ppm细胞色素c(Cytochrome c)。
根据以上方案，所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液的用量为20μL；所述的胰蛋白酶的用量为5μg；所述的酶解条件为37℃酶切反应20h；所述的二硫苏糖醇孵育为加入20μL，100℃孵育10min；所述的离心条件为13000g高速离心30min；所述的三氟乙酸的用量为10μL；所述的甲酸用量为10-15μL。
根据以上方案，所述的高效液相色谱的条件为，
缓冲液：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为含0.1％甲酸的84％乙腈水溶液，色谱柱以95％的A液平衡；流速为5μL/min，液相分离梯度如下：0min-2min，B相线性梯度从2％-5％；2min-92min，B相线性梯度从5％-25％；92min-100min，B相线性梯度从25％-40％；100min-105min，B相线性梯度从40％-100％并维持至120min。
本发明的有益效果是：
首次运用非数据依赖性采集方法(DIA)结合内标蛋白参比对HCPs进行非标记定量研究，为HCP杂质定量检测提供一种新的方法，较现有的检测方法相比，具有成分明确、杂质含量明确、通量高、速度快等优势。
附图说明
图1是实施例中的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明的技术方案进行说明。
本实施例中的iRT肽段序列是：
LGGNEQVTRYILAGVENSKGTFIIDPGGVIRGTFIIDPAAVIRGAGSSEPVTGLDAKTPVISGGPYEYRVEATFGVDESNAKTPVITGAPYEYRDGLDAASYYAPVRADVTPADFSEWSKLFLQFGAQGSPFLK。
本发明提供一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其先以宿主细胞蛋白建立蛋白数据库，再取抗体药样品结合宿主细胞蛋白数据库进行分析，抗体药样品分析包括取抗体药样品并向其中加入内标标准蛋白作为参比，进行数据非依赖性采集的质谱分析，定量检测抗体药品中的宿主细胞蛋白；所述的宿主细胞蛋白数据库能用于后续相同宿主细胞的抗体药检测。
取标准品蛋白并混合均匀，得标准蛋白混合液，所述的标准蛋白混合液包括100ppm的溶菌酶、50ppm的肌红蛋白、30ppm的乳铁蛋白、15ppm的牛血清白蛋白、5ppm的β-酪蛋白和1ppm细胞色素c。
所述的以宿主细胞蛋白建立蛋白数据库包括如下步骤：
步骤S11，将标准蛋白混合液加入到1mg宿主细胞蛋白样品中，
步骤S12，取步骤S11获得的宿主细胞蛋白样品加入20μL的1M的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(pH8.0)，补加纯水至800μL，再加入5μg(1:200)胰蛋白酶，800rpm震荡1min，37℃酶切反应20h，酶解后加入20μL的1M的二硫苏糖醇，100℃孵育10min，13000g高速离心30min，取上清液，
步骤S13，取步骤S12中获得的上清液加入10μL的20％三氟乙酸，将pH调至2-3，取300μg肽段采用高pH反相色谱分馏，肽段上样量100μg/column(50mM ABC体系)，将上清液混合物分成十个级别的组分，每个组分均冷冻干燥，再分别用10μL的1％甲酸复溶，采用OD280测定肽段浓度，再加入1μL的1*iRT标准肽段后进行高效液相色谱-串联质谱分析。
即取25μg样品，采用微升级液相Ultimate 3000进行色谱分离，缓冲液：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为含0.1％甲酸的84％乙腈水溶液，色谱柱以95％的A液平衡；色谱柱为M-Class CSH C18 
1.7μm,300μmX150mm(Waters)，流速为5μL/min，液相分离梯度如下：0min-2min，B相线性梯度从2％-5％；2min-92min，B相线性梯度从5％-25％；92min-100min，B相线性梯度从25％-40％；100min-105min，B相线性梯度从40％-100％并维持至120min。
样品经液相色谱分离后用Q-Exactive HF质谱仪(Thermo Scientific)进行质谱分析，分析时长：120min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：60,000(@m/z 200)，最大增益控制：3e6，一级最大进样时间：25ms；肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描后触发采集20个二级质谱图谱，二级质谱分辨率：15,000atm/z200，最大增益控制:1e5，二级最大进样时间：50ms，MS2解离模式:高能碰撞解离，隔离窗口：1.5Th，碰撞能量：27。
分析质谱数据，建立宿主细胞蛋白数据库，并将iRT肽段序列加入到数据库中，采用Maxquant软件对DDA数据进行分析，获取蛋白的鉴定信息。打开Spectronaut Pulsar软件。常规参数设置：Settings-DIA Analysis-BGS Factory Settings，数据库中共有3149个非冗余蛋白，25533条非冗余肽段。
所述的抗体药样品分析包括如下详细步骤：
步骤S21，将标准蛋白混合液加入到抗体药样品中。
步骤S22，取1mg抗体药样品加入20μL的1M的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(pH8.0)，补加纯水至800μL，再加入5μg(1:200)胰蛋白酶，800rpm震荡1min，37℃酶切反应20h，酶解后加入20μL的1M的二硫苏糖醇，100℃孵育10min，13000g高速离心30min，取上清液。
步骤S23，取步骤S22中获得的上清液加入10μL的20％三氟乙酸，将pH调至2-3，再将上清夜采用MCX SPE 96-Well plate进行脱盐处理，将脱盐后的肽段进行冷冻干燥，再用15μl的1％甲酸复溶，NanoDrop测定肽段浓度，再将肽段浓度稀释至4-5μg/μL，分别取5μL肽段(20-30μg)，各掺入1μL 1*iRT标准肽进行高效液相色谱-串联质谱分析；
采用微升级液相Ultimate 3000进行色谱分离，缓冲液：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为含0.1％甲酸的84％乙腈水溶液，色谱柱以95％的A液平衡；色谱柱为M-Class CSH C18
1.7μm,300μmX150mm(Waters)，流速为5μL/min，液相分离梯度如下：0min-2min，B相线性梯度从2％-5％；2min-92min，B相线性梯度从5％-25％；92min-100min，B相线性梯度从25％-40％；100min-105min，B相线性梯度从40％-100％并维持至120min。
高效液相色谱分离后的样品用Q-Exactive HF质谱仪(Thermo Scientific)进行DIA质谱分析，分析时长：120min，检测模式：正离子；一级质谱扫描范围：350-1650m/z，质谱分辨率：120,000(@m/z 200)，最大增益控制：3e6，一级最大进样时间：50ms；MS2采用数据非依赖性采集模式，设置30个DIA采集窗口，二级质谱分辨率：30,000(@m/z 200)，最大增益控制：3e6，二级最大进样时间：自动，MS2解离模式:高能碰撞解离，碰撞能量：25，光谱数据类型:剖面；导出质谱的蛋白鉴定及定量信息。
步骤S24，使用标准蛋白掺入的摩尔量以及特征信息，绘制标准曲线，如图1所示；根据标准曲线的公式，结合宿主细胞蛋白特征信息计算出宿主细胞蛋白的摩尔数，并通过摩尔数转化为质量，再根据初始进样量计算宿主细胞蛋白的含量，结果如下：
以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (6)
1.一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其特征在于，其先以宿主细胞蛋白建立蛋白数据库，再取抗体药样品结合宿主细胞蛋白数据库进行分析，抗体药样品分析包括取抗体药样品并向其中加入内标标准蛋白作为参比，进行数据非依赖性采集的质谱分析，定量检测抗体药品中的宿主细胞蛋白；所述的宿主细胞蛋白数据库能用于后续相同宿主细胞的抗体药检测。
2.根据权利要求1所述的抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其特征在于，所述的以宿主细胞蛋白建立蛋白数据库包括如下步骤：
步骤S11，取标准品蛋白并混合均匀，得标准蛋白混合液，再将标准蛋白混合液加入到宿主细胞蛋白样品中；
步骤S12，取步骤S11获得的宿主细胞蛋白样品加入1M的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液和胰蛋白酶进行酶解，酶解后加入1M的二硫苏糖醇孵育，再离心取上清液；
步骤S13，取步骤S12中获得的上清液加入20％三氟乙酸，将pH调至2-3，再取上清液进行高pH反相色谱分馏，将混合物分成多个级别的组分，每个组分均冷冻干燥，再用1％甲酸复溶，再加入iRT标准肽段后进行高效液相色谱-串联质谱分析，分析质谱数据并建立宿主细胞蛋白数据库；
所述的串联质谱条件为：分析时长：120min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：60,000(@m/z 200)，最大增益控制：3e6，一级最大进样时间：25ms；肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描后触发采集20个二级质谱图谱，二级质谱分辨率：15,000at m/z 200，最大增益控制:1e5，二级最大进样时间：50ms，MS2解离模式:高能碰撞解离，隔离窗口：1.5Th，碰撞能量：27。
3.根据权利要求1所述的抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其特征在于，所述的抗体药样品分析包括如下详细步骤：
步骤S21，取标准品蛋白并混合均匀，得标准蛋白混合液，再将标准蛋白混合液加入到抗体药样品中；
步骤S22，取抗体药样品加入1M的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液和胰蛋白酶进行酶解，酶解后加入1M的二硫苏糖醇孵育，再离心取上清液；
步骤S23，取步骤S22中获得的上清液加入20％三氟乙酸，将pH调至2-3，再将上清夜进行脱盐处理，冷冻干燥，再用1％甲酸复溶，再加入iRT标准肽段后进行高效液相色谱-串联质谱分析；
所述的质谱分析条件是：分析时长：120min，检测模式：正离子；一级质谱扫描范围：350-1650m/z，质谱分辨率：120,000(@m/z 200)，最大增益控制：3e6，一级最大进样时间：50ms；MS2采用数据非依赖性采集模式，设置30个DIA采集窗口，二级质谱分辨率：30,000(@m/z 200)，最大增益控制：3e6，二级最大进样时间：自动，MS2解离模式:高能碰撞解离，碰撞能量：25，光谱数据类型:剖面；
步骤S24，使用标准蛋白掺入的摩尔量以及特征信息，绘制标准曲线；根据标准曲线的公式，结合宿主细胞蛋白特征信息计算出宿主细胞蛋白的摩尔数，并通过摩尔数转化为质量，再根据初始进样量计算宿主细胞蛋白的含量。
4.根据权利要求2或3所述的抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其特征在于，所述的标准蛋白混合液包括100ppm的溶菌酶、50ppm的肌红蛋白、30ppm的乳铁蛋白、15ppm的牛血清白蛋白、5ppm的β-酪蛋白和1ppm细胞色素c。
5.根据权利要求2或3所述的抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其特征在于，所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液的用量为20μL；所述的胰蛋白酶的用量为5μg；所述的酶解条件为37℃酶切反应20h；所述的二硫苏糖醇孵育为加入20μL，100℃孵育10min；所述的离心条件为13000g高速离心30min；所述的三氟乙酸的用量为10μL；所述的甲酸用量为10-15μL。
6.根据权利要求2或3所述的抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法，其特征在于，所述的高效液相色谱的条件为，
缓冲液：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为含0.1％甲酸的84％乙腈水溶液，色谱柱以95％的A液平衡；流速为5μL/min，液相分离梯度如下：0min-2min，B相线性梯度从2％-5％；2min-92min，B相线性梯度从5％-25％；92min-100min，B相线性梯度从25％-40％；100min-105min，B相线性梯度从40％-100％并维持至120min。
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