CN112763644B - 一种用于检测驴奶粉中掺入牛奶粉的特征肽组合物及检测方法 - Google Patents
一种用于检测驴奶粉中掺入牛奶粉的特征肽组合物及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于检测驴奶粉中掺入牛奶粉的特征肽组合物及其检测方法，所述特征肽组合物包括驴奶特征肽和牛奶特征肽，其中驴奶特征肽的氨基酸序列为YNQLQLQAIYAQEQLIR、LNFLQYLQALR、TNSYQIIPVLR和EEYINELNR，牛奶特征肽的氨基酸序列为SLFSHAFEVVK和WENDECAQK。使用本发明特征肽组合物通过高效液相色谱‑质谱联用技术能够定性驴奶粉中的牛奶粉掺假，具有较好的灵敏度，并且本发明选择蛋白中的特征肽段作为检测物质，适用于变性蛋白的检测，因此可以满足同时检测样品中的变性蛋白与非变性蛋白，保证了方法的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测领域，具体涉及一种用于检测驴奶粉中掺入牛奶粉的特征肽组合物。
背景技术
乳是食物中营养较为完全的食物，初产乳其营养成分接近血液。乳中含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等营养物质。乳蛋白中含有人体所必须的氨基酸；乳脂肪多为短链和中链脂肪酸，易被人体吸收。驴奶营养成分丰富，含有溶菌酶、多不饱和脂肪酸和矿物质元素硒等多种生物活性成分，因而具有多种生物活性和丰富的有益健康功能，例如低过敏性等。因此驴奶粉也逐渐受到消费者的青睐。然而驴奶的产量较低且受到季节性变化的影响，导致驴奶原料成本较高。因此受到经济利益驱使，价格较低、产量较高的奶牛奶粉掺入驴奶粉的掺假现象出现。这种掺假行为不仅损害消费者的合法权益，掺入的牛奶粉更会对牛奶过敏消费者的健康造成威胁。
现阶段定性鉴别驴奶和牛奶的方法主要有基于DNA检测的PCR法，电泳法和光谱扫描方法。
申请号为CN201510431604.6的中国发明专利公开了一种检测驴奶中是否含有牛奶的引物、探针组合物及试剂盒的方法，其主要是通过提取样品中DNA,然后利用专利中给出的引物、探针组合物或试剂盒对DNA进行PCR扩增,收集荧光信号,根据荧光信号判断待检测样品中是否含有驴奶或/和牛奶成分。PCR法操作简单，具有较高的特异性，DNA受到温度和压力的影响较小，PCR方法更为稳定。但PCR方法也存在明显的缺陷，由于PCR法基于指数扩增的检测机理，其检测误差较大，同时奶中的DNA主要来自白细胞与脱落的乳腺细胞，这与动物的品种，饲养，健康条件以及生理期有关，所以奶中的DNA含量不稳定，不好建立标准化的检测方法。
申请号为CN201310257746.6的中国发明专利公开了一种鲜驴奶中掺入牛奶的快速检测方法，只要是通过紫外分光光度计的光谱扫描功能对水，鲜驴奶和鲜牛奶进行光谱扫描，将扫描的曲线进行数学转换，通过比较驴奶和牛奶的转换曲线以实现对驴奶和牛奶的快速鉴别。此光谱法具有操作方便，检测速度快，设备简单，成本低的优点。但对于不同品种的驴奶和驴奶产品中掺入的牛奶并没有大样品量的模型，数据存在一定的误差，无法做到精准定性。
液相色谱-质谱联用技术法已经成为物种鉴定的主要方法之一。此种鉴定方法灵敏度高，特异性好。该方法通过比对选择特异性多肽作为生物标记物，对不同物种来源的食物进行溯源调查。许多文献报道了利用该方法进行肉类，乳制品和阿胶等进行了定性鉴定，但未见关于驴奶的蛋白层次定性鉴定方面的研究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测驴奶粉中掺入牛奶粉的特征肽组合物。使用该特征肽组合物可以准确检测驴奶粉中牛奶粉的掺假，具有较高的特异性、灵敏度。
本发明的第一方面提供一种用于检测驴奶粉中掺入牛奶粉的特征肽组合物，包括驴奶特征肽和牛奶特征肽，其中驴奶特征肽的氨基酸序列为YNQLQLQAIYAQEQLIR、LNFLQYLQALR、TNSYQIIPVLR和EEYINELNR，牛奶特征肽的氨基酸序列为SLFSHAFEVVK和WENDECAQK。
本发明的第二方面提供一种检测驴奶粉中掺入牛奶粉的检测方法：包括以下步骤：
(1)对待测的驴奶粉进行复溶；
(2)对复溶所得到的纯乳品进行蛋白浓度测定；
(3)取一定量的蛋白进行蛋白变性处理，使用胰蛋白酶酶解；
(4)酶解所得到的肽段用高效液相色谱-质谱联用技术进行检测；
(5)质谱分析结束后从离子色谱图中提取特异性肽段，如果特异性肽段包含上述驴奶特征肽和牛奶特征肽，说明驴奶粉中掺入了牛奶粉，如果特异性肽段仅包含上述驴奶特征肽，不包括上述牛奶特征肽，说明驴奶粉中未掺入牛奶粉。
优选的，所述的复溶按照奶粉与蒸馏水的比例为1:20(w/v)涡旋混匀，在40℃水浴中震荡30min。
优选的，所述取一定量蛋白约200μg。
优选的，使用二硫苏糖醇(DTT)进行变性，加入10μL 120mM DTT(溶于8M尿素和0.1M Tris-HCl，pH8.5缓冲液中)涡旋混匀后37℃反应1h。
优选的，使用10μL 600mM碘乙酰胺(IAA)(溶于8M尿素和0.1M Tris-HCl，pH8.5缓冲液中)避光室温反应15min。
优选的，使用胰蛋白酶按照蛋白与酶的比例为20:1的比例进行酶切。
优选的，高效液相色谱的条件为：色谱柱：XBridge Peptide BEH C18 Column，3.5μm，4.6mm×150mm；流动相A为0.1％甲酸-2％乙腈-98％水溶液；流动相B为0.1％甲酸-2％水-98％乙腈溶液；流速0.4mL/min；柱温40℃，进样体积10μL。
优选的，质谱条件为：ESI正离子扫描参数：气帘气(CUR)压力35psi，碰撞气(CAD)：Medium，离子化电压4500V，离子源温度500℃，雾化气(GS1)65psi，辅助气(GS2)50psi；正离子扫描MRM模式：MRM检测窗口120s，扫描时间3s。
与现有技术相比，本发明有益效果在于：
(1)本发明通过高分辨质谱筛选得到驴奶和牛奶的特异性肽段，可以实现对驴奶粉中牛奶粉掺假的快速检测。该方法具有高灵敏度，高特异性的优点。
(2)本发明选择蛋白中的特异性肽段作为检测物质，适用于变性蛋白的检测，因此可以满足同时检测样品中的变性与非变性蛋白，保证了方法的准确性。
附图说明
图1为驴奶肽段提取离子流色谱图；
图2为牛奶肽段提取离子流色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1特征肽段的筛选和确定
将取来的奶样冷冻干燥后，分别取200mg驴奶粉和牛奶粉进行复溶，加入4mL水后涡旋混匀，在40℃水浴中震荡30min。
将每个样品取100μL进行25倍稀释，使用定量荧光方法测定蛋白质含量。根据Qubit蛋白测定试剂盒(ThermoFisher Scientific)的说明，所有测定试剂必须在室温下操作。每个样品制备200μL Qubit工作溶液，该溶液以Qubit试剂与Qubit缓冲液的比例为1：200制备。将10μL三种标准液与190μL Qubit工作溶液混合。此外，将5μL样品溶液添加到195μL Qubit工作溶液中。在室温下孵育15分钟后，在Qubit 3.0荧光计系统中进行测试。
根据所测得样品蛋白浓度，每个样品取200μg蛋白至1.5mL棕色管中，用MS水定容至200μL，加入10μL 120mM DTT(溶于8M尿素和0.1M Tris-HCl,pH8.5缓冲液中)涡旋混匀后37℃反应1h。反应结束后加入10μL 600mM IAA(溶于8M尿素和0.1M Tris-HCl,pH8.5缓冲液中)避光室温反应15min。结束后将所有溶液移取到含膜(10KDa)离心管中，12000×g离心10min，加入100μL MS水后再次离心。此步骤重复三次，洗掉膜上盐分。将收集管中的离心废液倒掉，并水洗三次。
加入100μL碳酸氢铵(ABC)(50mM)溶液，加入4μL胰蛋白酶溶液，37℃水浴条件下过夜膜上酶切。酶切后12000×g离心15min，加100μL ABC(25mM)溶液，再次离心。此步骤重复三次。弃掉膜，收集管放入真空干燥机进行旋干。干燥后加入100μL MS水再次进行干燥。此步骤重复三次。用100μL A相(98％质谱水+2％乙腈+0.1％甲酸)进行复溶，涡旋混匀，12000×g离心15min，取上层液体80μL置于液相小瓶中进行上样。
将QTOF得到的结果文件，以及根据各物种名称在Uniprot数据库检索驴关键词：equus asinus和奶牛关键词：Bos taurus，下载蛋白数据库导入ProteinPilot 5.0软件进行搜库后得到所有肽段列表，选取响应高、得分>20、氨基酸个数6～20、可信度>95％、无漏切的肽段作为预选特征肽段。将所有肽段进行物种间的对比，去除相同序列的肽段。将筛选剩下的肽段使用SKYLINE软件进行理论肽段信息构建，并与二级质谱图进行比对，选响应值较高的离子峰，得到候选特异性肽段信息。其中保留时间默认为20min。
将得到的候选特异性肽段信息使用QTRAP5500的MRM模式进行验证，根据得到的离子色谱图确定物种特异性肽段，最终确定了驴奶的特征肽为YNQLQLQAIYAQEQLIR、LNFLQYLQALR、TNSYQIIPVLR和EEYINELNR，牛奶的特征肽为SLFSHAFEVVK和WENDECAQK。其质谱参数见表1。
表1：特征肽段的MRM检测参数
实施例2检测试验
检测试验样品来自市场的两种驴奶粉和三种牛奶粉。前处理所有步骤直至进入质谱分析前都与实施例1中相同。为了验证实验结果的可靠性和灵敏度，在所采集的可靠冻干驴奶粉中加入0.1％、0.2％、0.3％、0.5％和1％的牛奶粉。一共十个样品进行前处理。前处理注意不要使奶粉相互接触，以免发生污染。样品处理结束后将表1检测参数输入到QTRAP5500的MRM模式窗口中，进行质谱检测。质谱分析结束后提取特异性肽段的离子流色谱图，提取出则表示有这类物种的存在。检测结果显示，市售样品的驴奶粉中均能提取到驴特异性肽段，未提取到牛特异性肽段，牛奶粉中均能提取到牛特异性肽段。这表明特异性肽段具有良好的稳定性和特异性。模拟掺假的样品中均能检测到牛奶粉的存在，可以证明此方法的检测限至少为0.1％，具有高灵敏度。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院，黑龙江飞鹤乳业有限公司
<120> 一种用于检测驴奶粉中掺入牛奶粉的特征肽组合物及检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 驴奶(Equus asinus)
<400> 1
Tyr Asn Gln Leu Gln Leu Gln Ala Ile Tyr Ala Gln Glu Gln Leu Ile
1 5 10 15
Arg
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 驴奶(Equus asinus)
<400> 2
Leu Asn Phe Leu Gln Tyr Leu Gln Ala Leu Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 驴奶(Equus asinus)
<400> 3
Thr Asn Ser Tyr Gln Ile Ile Pro Val Leu Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 驴奶(Equus asinus)
<400> 4
Glu Glu Tyr Ile Asn Glu Leu Asn Arg
1 5
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 牛奶(Bos taurus)
<400> 5
Ser Leu Phe Ser His Ala Phe Glu Val Val Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 牛奶(Bos taurus)
<400> 6
Trp Glu Asn Asp Glu Cys Ala Gln Lys
1 5
Claims (6)
1.一种用于检测驴奶粉中掺入牛奶粉的特征肽组合物，其特征在于，包括驴奶特征肽和牛奶特征肽，其中驴奶特征肽的氨基酸序列为YNQLQLQAIYAQEQLIR、LNFLQYLQALR、TNSYQIIPVLR和EEYINELNR，牛奶特征肽的氨基酸序列为SLFSHAFEVVK和WENDECAQK。
2.一种检测驴奶粉中掺入牛奶粉的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对待测的驴奶粉进行复溶；
（2）对复溶所得到的纯乳品进行蛋白浓度测定；
（3）取一定量的蛋白进行蛋白变性处理，使用胰蛋白酶酶解；
（4）酶解所得到的肽段用高效液相色谱-质谱联用技术进行检测；
（5）质谱分析结束后从离子色谱图中提取特异性肽段，如果特异性肽段包含驴奶特征肽和牛奶特征肽，说明驴奶粉中掺入了牛奶粉；如果特异性肽段仅包含驴奶特征肽，不包括牛奶特征肽，说明驴奶粉中未掺入牛奶粉；其中驴奶特征肽的氨基酸序列为YNQLQLQAIYAQEQLIR、LNFLQYLQALR、TNSYQIIPVLR和EEYINELNR，牛奶特征肽的氨基酸序列为SLFSHAFEVVK和WENDECAQK；
高效液相色谱的条件为：色谱柱：XBridge Peptide BEH C18 Column，300Å，3.5µm，4.6mm×150mm；流动相A为0.1%甲酸-2%乙腈-98%水溶液；流动相B为0.1%甲酸-2%水-98%乙腈溶液；流速0.4mL/min；柱温40℃，进样体积10µL；
质谱条件为：ESI正离子扫描参数：气帘气CUR压力：35psi，碰撞气CAD：Medium，离子化电压：4500V，离子源温度：500℃，雾化气GS1：65psi，辅助气GS2：50psi，正离子扫描MRM模式：MRM检测窗口120s，扫描时间3s。
3.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于，按照奶粉与蒸馏水的比例为1:20 w/v涡旋混匀，在40℃水浴中震荡30min。
4.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于，使用Qubit蛋白测定试剂盒进行蛋白浓度测定。
5.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于，取200µg蛋白进行变性处理，加入DTT反应后，加入IAA进行避光反应。
6.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于，使用胰蛋白酶按照蛋白与酶的比例为20:1的比例进行酶切。
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