CN111766323A

CN111766323A - 一种用于检测骆驼奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法

Info

Publication number: CN111766323A
Application number: CN202010661645.5A
Authority: CN
Inventors: 张九凯; 陈颖; 苗金梁; 韩建勋; 邢冉冉; 李淑娟
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2020-07-10
Filing date: 2020-07-10
Publication date: 2020-10-13
Anticipated expiration: 2040-07-10
Also published as: CN111766323B

Abstract

本发明公开了一种用于检测骆驼奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法。所述特征肽包括骆驼和奶牛的特征肽，其中骆驼奶的特征肽氨基酸序列为NEDNHPQLGEPVK、IASEDGGK和FLDDDLTDDK，牛奶的特征肽氨基酸序列为QVLSNTVPAK。使用本发明特征肽组合通过高效液相色谱‑质谱联用技术能够定性骆驼奶中的牛奶掺假成分，具有较好的灵敏度，并且本发明选择蛋白中的特征肽段作为检测物质，适用于变性蛋白的检测，因此可以满足同时检测样品中的变性蛋白与非变性蛋白，保证了方法的准确性。

Description

一种用于检测骆驼奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测骆驼奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法，属于食品质量安全检测领域。

背景技术

骆驼奶具有"沙漠白金"之称，营养成分丰富，脂肪球小、易于消化，是理想的动物性食用饮品。同时，骆驼奶含有溶菌酶、多不饱和脂肪酸等多种生物活性成分，因而具有多种有益健康的功能，例如骆驼乳蛋白及其水解产物具有抗菌消炎的功能等，因此逐渐受到消费者的青睐。然而骆驼奶的产量受到品种、营养状况、环境、饮水、繁殖、健康状况、泌乳阶段、挤奶频率、挤乳方式及是否有幼驼等因素的影响，导致骆驼奶原料成本较高。因此受到经济利益驱使，价格较低、产量较高的奶粉掺入骆驼奶粉的掺假现象出现。这种掺假行为不仅损害消费者的合法权益，掺入的牛奶更会对牛奶过敏消费者的健康造成威胁。

现阶段定性鉴别骆驼奶和牛奶的方法比较少，有基于DNA检测的PCR法和指纹图谱法。

申请号为201910709532.5的中国发明专利公开了一种肉乳中骆驼和奶牛源性同步检测的引物和探针及试剂盒，此方法给出了骆驼和奶牛的检测正反向引物序列，通过DNA提取，利用两个物种阳性标准品做DNA定量标准曲线，可以实现对掺假的定性和定量。此方法的引物、探针及试剂盒的特异性好、灵敏度高。但对于一些加工乳制品如奶粉等，加工过程会破坏DNA，从而影响DNA的提取，且乳中DNA的来源受到泌乳个体的健康和季节性影响。

申请号为201510470889.4的中国发明专利公开了一种原奶或液体奶真实性鉴别方法和系统，涉及骆驼奶中牛奶掺假检测。此方法是将采集到的样本进行氨基酸指纹、脂肪酸指纹、或脂肪酸气相色谱指纹的采集，使用化学计量学软件进行分析，建立定性模型。此方法可以准确可靠的对奶样本进行真伪鉴别。但此种方法灵敏度不高，也依赖于模型的建立，不能灵敏准确的检测到骆驼乳中牛乳的掺假。

液相色谱-质谱联用技术法已经成为物种鉴定的主要方法之一。此种鉴定方法灵敏度高，特异性好。该方法通过比对选择特异性多肽作为生物标记物，对不同物种来源的食物进行溯源调查。许多文献报道了利用该方法进行肉类，乳制品和阿胶等进行了定性鉴定，但未见关于骆驼奶的蛋白层次定性鉴定方面的研究。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测骆驼奶粉中掺入牛奶粉的特征肽组合。使用该特征肽组合可以准确检测骆驼奶粉中牛奶粉的掺假，具有较高的特异性、灵敏度。

一种用于检测骆驼奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法，包括骆驼奶特征肽和牛奶特征肽，其中骆驼奶的特征肽氨基酸序列为NEDNHPQLGEPVK、IASEDGGK和FLDDDLTDDK，牛奶的特征肽氨基酸序列为QVLSNTVPAK。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

（1）对采集得到的骆驼奶和牛奶进行冷冻干燥，所得到的冻干奶粉进行复溶；

（2）对复溶所得到的纯乳品进行测定蛋白浓度测定；

（3）取一定量的蛋白进行蛋白变性处理，使用胰蛋白酶酶解；

（4）酶解所得到的肽段用高效液相色谱-质谱联用技术进行检测。

优选的，所述的复溶按照奶粉与蒸馏水的比例为1:20（w/v）涡旋混匀，在40℃水浴中震荡30 min。

优选的，所述取一定量蛋白约200 µg。

优选的，使用DTT进行变性，加入10 µL 120 mL DTT（溶于8M尿素和0.1M Tris-HCl, pH8.5缓冲液中）涡旋混匀后37℃反应1 h。

优选的，使用10 µL 600 mM IAA（溶于8M尿素和0.1M Tris-HCl, pH8.5缓冲液中）避光室温反应15 min。

优选的，高效液相色谱的条件为：色谱柱：XBridge Peptide BEH C18 Column,300Å, 3.5µm,4.6mm×150mm;流动相 A 为 0.1%甲酸-2%乙腈-98%水溶液；流动相 B 为 0.1%甲酸-2%水-98%乙腈溶液；流速 0.4 mL/min；柱温 40℃，进样体积 10 µL。

优选的，质谱条件为：ESI 正离子扫描参数：气帘气（CUR）压力 35 psi，碰撞气（CAD）：Medium，离子化电压 4500 V，离子源温度 500℃，雾化气（GS1）65 psi，辅助气（GS2）50 psi；正离子扫描MRM模式：MRM检测窗口120 s，扫描时间3 s。

与现有技术相比，本发明有益效果在于：

（1）本发明通过高分辨质谱筛选得到骆驼奶和牛奶的特异性肽段，可以实现对骆驼奶中牛奶掺假的快速检测。该方法具有高灵敏度，高特异性的优点；

（2）本发明选择蛋白中的特异性肽段作为检测物质，适用于变性蛋白的检测，因此可以满足同时检测样品中的变性与非变性蛋白，保证了方法的准确性。

附图说明

图1为骆驼奶肽段提取离子流色谱图。

图2为牛奶肽段提取离子流色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等,若无特别说明,均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1特征肽段的筛选和确定。

将取来的奶样冷冻干燥后，分别取200 mg骆驼奶粉和牛奶粉进行复溶，加入4 mL水后涡旋混匀，在40℃水浴中震荡30 min。

将每个样品取100 µL进行25倍稀释，使用定量荧光方法测定蛋白质含量。根据Qubit蛋白测定试剂盒（ThermoFisher Scientific）的说明，所有测定试剂必须在室温下操作。每个样品制备200 µL Qubit工作溶液，该溶液以Qubit试剂与Qubit缓冲液的比例为1：200制备。将10 µL三种标准液与190 µL Qubit工作溶液混合。此外，将5 µL样品溶液添加到195 µL Qubit工作溶液中。在室温下孵育15分钟后，在Qubit 3.0荧光计系统中进行测试。

根据所测得样品蛋白浓度，每个样品取200 µg蛋白至1.5 mL棕色管中，用MS水定容至200 µL，加入10 µL 120 mL DTT（溶于8M尿素和0.1M Tris-HCl, pH8.5缓冲液中）涡旋混匀后37℃反应1 h。反应结束后加入10 µL 600 mM IAA（溶于8M尿素和0.1M Tris-HCl,pH8.5缓冲液中）避光室温反应15 min。结束后将所有溶液移取到含膜（10 KDa）离心管中，12000×g离心10 min，加入100 µL MS水后再次离心。此步骤重复三次，洗掉膜上盐分。将收集管中的离心废液倒掉，并水洗三次。

加入100 µL ABC（50 mM）溶液，加入4 µL胰蛋白酶溶液，37℃水浴条件下过夜膜上酶切。酶切后12000×g离心15min，加100 µL ABC（25mM）溶液，再次离心。此步骤重复三次。弃掉膜，收集管放入真空干燥机进行旋干。干燥后加入100 µL MS水再次进行干燥。此步骤重复三次。用100 µL A相（98%质谱水+2%乙腈+0.1%甲酸）进行复溶，涡旋混匀，12000×g离心15 min，取上层液体80 µL置于液相小瓶中进行上样。

将QTOF得到的结果文件，以及根据各物种名称在Uniprot数据库检索骆驼关键词：camelus bactrianus和奶牛关键词：Bos taurus，下载蛋白数据库导入ProteinPilot 5.0软件进行搜库后得到所有肽段列表，选取响应高、得分>20、氨基酸个数6~20、可信度>95%、无漏切的肽段作为预选特征肽段。将所有肽段进行物种间的对比，去除相同序列的肽段。将筛选剩下的肽段使用SKYLINE软件进行理论肽段信息构建，并与二级质谱图进行比对，选响应值较高的离子峰，得到候选特异性肽段信息。其中保留时间默认为20 min。

将得到的候选特异性肽段信息使用QTRAP5500的MRM模式进行验证，根据得到的离子色谱图确定物种特异性肽段，最终确定了骆驼奶的特征肽为NEDNHPQLGEPVK、IASEDGGK和FLDDDLTDDK，牛奶的特征肽为QVLSNTVPAK。其质谱参数见表1。

表1：特征肽段的MRM检测参数

实施例2检测试验。

检测试验样品来自市场的两种骆驼奶粉和三种牛奶粉。前处理所有步骤直至进入质谱分析前都与实施例1中相同。为了验证实验结果的可靠性和灵敏度，在所采集的可靠冻干骆驼奶粉中加入0.1%、0.2%、0.3%、0.5%和1%的牛奶粉。一共十个样品进行前处理。前处理注意不要使奶粉相互接触，以免发生污染。样品处理结束后将表1检测参数输入到QTRAP5500的MRM模式窗口中，进行质谱检测。质谱分析结束后提取特异性肽段的离子流色谱图，提取出则表示有这类物种的存在。检测结果显示，市售样品的骆驼奶粉中均能提取到骆驼特异性肽段，未提取到牛特异性肽段，牛奶粉中均能提取到牛特异性肽段。这表明特异性肽段具有良好的稳定性和特异性。模拟掺假的样品中均能检测到牛奶粉的存在，可以证明此方法的检测线至少为0.1%，具有高灵敏度。

序列表

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 一种用于检测骆驼奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 骆驼奶(Camelus bactrianus)

<400> 1

Asn Glu Asp Asn His Pro Gln Leu Gly Glu Pro Val Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 骆驼奶(Camelus bactrianus)

<400> 2

Ile Ala Ser Glu Asp Gly Gly Lys

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 骆驼奶(Camelus bactrianus)

<400> 3

Phe Leu Asp Asp Asp Leu Thr Asp Asp Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 牛奶(Bos taurus)

<400> 4

Gln Val Leu Ser Asn Thr Val Pro Ala Lys

1 5 10

Claims

1.一种用于检测骆驼奶中掺入牛奶的特征肽组合，其特征在于，包括骆驼奶特征肽和牛奶特征肽，其中骆驼奶的特征肽氨基酸序列为NEDNHPQLGEPVK、IASEDGGK和FLDDDLTDDK，牛奶的特征肽氨基酸序列为QVLSNTVPAK。

2.一种检测骆驼奶中掺入牛奶的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）对复溶所得到的纯乳品进行测定蛋白浓度测定；

3.如权利要求2所述方法，其特征在于，按照奶粉与蒸馏水的比例为1:20（w/v）涡旋混匀，在40℃水浴中震荡30 min。

4.如权利要求2所述方法，其特征在于，使用Qubit蛋白测定试剂盒进行蛋白浓度测定。

5.如权利要求2所述方法，其特征在于，取约200 µg蛋白进行变性处理，加入DTT反应后加入IAA进行避光反应。

6.如权利要求2所述方法，其特征在于，使用胰蛋白酶按照蛋白与酶的比例为20:1的比例进行酶切。

7.如权利要求2所述方法，其特征在于，高效液相色谱的条件为：色谱柱：XBridgePeptide BEH C18 Column,300Å,3.5µm,4.6mm×150mm;流动相 A 为 0.1%甲酸-2%乙腈-98%水溶液；流动相 B 为 0.1%甲酸-2%水-98%乙腈溶液；流速 0.4 mL/min；柱温 40℃，进样体积 10 µL。

8.如权利要求2所述方法，其特征在于，质谱条件为：ESI 正离子扫描参数：气帘气（CUR）压力 35 psi，碰撞气（CAD）：Medium，离子化电压 4500 V，离子源温度 500℃，雾化气（GS1）65 psi，辅助气（GS2）50 psi；正离子扫描MRM模式：MRM检测窗口120 s，扫描时间3 s。