CN118112160A - 一种鉴定蚕蛹中11种过敏蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定蚕蛹中11种过敏蛋白的方法：将待测蚕蛹样品进行细胞裂解、蛋白酶解、脱盐处理后，得到待测供试品溶液；待测供试品溶液进行超高效液相串联高分辨质谱检测，根据11种过敏蛋白及其对应的特征肽段，检测结果中，含有上述任一过敏蛋白对应的全部特征肽段，即可鉴定待测蚕蛹样品含有该过敏蛋白。本发明通过比对实验所得的图谱与蛋白质数据库中的理论图谱进行蛋白质鉴定，匹配的肽段利用BLAST分析工具进行UniProtKB数据库比对，以检查物种间同源性，确保这些肽段对于其所属的蚕蛹过敏原具有特异性。最终得到11种过敏蛋白对应的的特征肽段，可实现高通量的11个致敏蛋白同时检测。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种鉴定蚕蛹中11种过敏蛋白的方法。
背景技术
蚕等昆虫是一种新的、替代的和可行的蛋白质来源。蚕蛹蛋白(SPP)富含18种人类必需氨基酸，其中8种人类必需氨基酸占总氨基酸量的42％以上。但目前食品领域内成熟且商业化的蚕蛹相关产品较少，主要瓶颈在于蚕蛹具有致敏性，部分人食用蚕蛹后会出现头晕、恶心、呕吐等不良反应，甚至会出现直接休克的严重致敏反应。因此，要充分地开发和利用蚕蛹蛋白资源，同时考虑到食品安全性，必须解决蚕蛹致敏问题。
目前，研究蚕蛹过敏原的检测技术一般分为核酸技术和蛋白技术。核酸技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增等；蛋白技术主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫印迹、免疫层析、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS等)。基于核酸的检测技术主要通过检测DNA达到检测致敏原的目的，属于间接检测致敏原；基于免疫反应的致敏原检测技术主要利用抗原和抗体的特异性结合，通过同位素、荧光、酶等标记技术放大信号实现致敏原的定性定量检测，应用较为广泛。然而，该技术的特异性和灵敏度主要取决于抗原、抗体的制备质量，检测氨基酸序列高度相似的致敏蛋白时，会因存在交叉反应导致假阳性、假阴性结果。另外ELISA和PCR方法均不能区分致敏原的蛋白种类和来源物种。
LC-MS技术是一种鉴定致敏蛋白的非免疫技术，具有灵敏度高、选择性好、准确性强等优点，其中高分辨质谱技术(HRMS)在质量准确度和分辨率方面更具分析优势，同时具有全扫描、高通量、特异性高的特点。这对于从源头出发，筛选出无致敏原和少致敏原的蚕蛹种质资源，为特色的食用蚕蛹品种的研发、选育和推广提供基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定蚕蛹中11种过敏蛋白的方法，通过超高效液相串联高分辨质谱检测(UPLC-HRMS)一次分离并鉴定11种过敏蛋白，通量高，响应效果好、稳定性高、特异性强。
本发明采用的技术方案是：
一种鉴定蚕蛹中11种过敏蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将待测蚕蛹样品进行细胞裂解、蛋白酶解、脱盐处理后，得到待测供试品溶液；
(2)待测供试品溶液进行超高效液相串联高分辨质谱检测，11种过敏蛋白及其对应的特征肽段如下：
表1
(3)检测结果中，含有上述任一过敏蛋白对应的全部特征肽段，即可鉴定待测蚕蛹样品含有该过敏蛋白。
进一步，所述步骤(2)中，高效液相串联高分辨质谱的条件为：
高效液相色谱条件为：
色谱柱：BEH C18，规格为2.1×50mm，1.7μm；
流动相A：0.1vol％甲酸的水溶液；
流动相B：0.1vol％甲酸的乙腈溶液；
梯度洗脱程序为：0min，95％B；3min，95％B；95min，20％B；108min，35％B；112min，90％B；115min，90％B；117min，3％B；120min，3％B。
质谱条件为：
检测方式:Full Scan-ddMS2
电离模式：ESI+
雾化气温度：350℃
锥孔气流速：50L/h；
离子源温度：320℃
毛细管电压：4000V
动态排除：45s
Full Scan分辨率：60000
扫描范围：m/z 350-1200
最大注入时间(ms)：25
ddMS2分辨率：15000
HCD碰撞能量(％)：30
进一步，所述色谱柱为BEH C18(2.1×50mm，1.7um)。
高效液相色谱中，
流动相的流速：0.3mL/min；
柱温：45℃；
进样量：10μL。
进一步，所述步骤(1)中，细胞裂解、蛋白酶解、脱盐处理的步骤优选为：
细胞裂解：
将待测蚕蛹样品匀浆，烘干后脱脂、研磨，得到脱脂蚕蛹粉；脱脂蚕蛹粉用蛋白提取液提取，离心后取上清液加热，涡旋后离心，得到裂解上清液；
所述蛋白提取液的成分为：2％十二烷基硫酸钠，0.1mol/L二硫苏糖醇，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷，pH值7.6；
蛋白酶解：
裂解上清液用尿素缓冲液处理，再用碘乙酰胺溶液(IAA溶液)烷基化，重悬后用胰蛋白酶进行酶解，收集上清液清洗、三氟乙酸酸化，冷冻干燥得到多肽样品；
所述尿素缓冲液的成分为：8mol/L尿素，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷，pH值8.5；
所述碘乙酰胺溶液的成分为：含有50mM碘甲酰胺的尿素缓冲液。
脱盐处理：
多肽样品溶于0.1％三氟乙酸溶液中，上样至已清洗的脱盐柱中，离心除去滤液，然后加入洗脱剂进行洗脱，收集滤液，冷冻干燥后用含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液进行复溶，得到供试品溶液。
所述洗脱剂为含0.1％三氟乙酸的50％乙腈水溶液。
更为优选的，优选所述步骤(1)按以下步骤进行：
A、细胞裂解：
A-1、将鲜蚕蛹匀浆，烘干后通过脂肪测定仪进行脱脂处理，再进行研磨得到脱脂蚕蛹粉；
A-2、称取100mg脱脂蚕蛹粉，加入1mL蛋白提取液涡旋1min；蛋白提取液的成分为2％十二烷基硫酸钠，0.1mol/L二硫苏糖醇，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷，盐酸调节pH至7.6；
A-3、8000g离心1min消除气泡后将上清液转移至EP管中，沸水浴3min；
A-4、超声5s取出5s，循环6次后再次沸水浴2min；
A-5、涡旋1min后10000g离心10min，得裂解上清液；
B、蛋白酶解
B-1、移取上述所得裂解上清液20μL加入300μL的尿素缓冲液进行稀释，10kda超滤管超滤浓缩10000r/min离心30min；所述尿素缓冲液的成分为：8mol/L尿素，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷，盐酸调节pH至8.5；
B-2、再次加入300μL的尿素缓冲液，10000r/min离心30min置换一次；
B-3、加入100μL的50mM的IAA溶液(含有50mM碘甲酰胺的尿素缓冲液)涡旋1min后，暗处反应30min；
B-4、每次加入200μL的UA Buffer，10000r/min离心30min置换，共3次；
B-5、每次加入200μL的50mM碳酸氢钠10000r/min离心30min置换，共2次；
B-6、加入100μL的50mM碳酸氢钠重悬蛋白质，转移至干净的EP管中；
B-7、加入10μL的0.2μg/μL胰蛋白酶，37℃水浴酶解8～12h；
B-8、10000g离心15min超滤浓缩，收集上清液；
B-9、再加入50μL的50mM碳酸氢钠滤洗2遍，合并上清液。
B-10、用10％三氟乙酸水溶液酸化至浓度为0.4％终止反应；冷冻干燥得到多肽样品。
C、脱盐处理
C-1、脱盐柱清洗：①脱盐柱底部白色尖端拔下并丢弃后，将其放入2mL离心管中；②5000g离心1min，除去脱盐柱中的溶液；③每次加入300μL乙腈，5000g离心1min，共3次；④每次加入300μL的0.1％三氟乙酸水溶液，5000g离心1min，共3次；
C-2、样品清洗：①将多肽样品溶解在300μL的0.1％三氟乙酸水溶液中并上样至已清洗的脱盐柱中；②将脱盐柱放入2mL离心管中，3000g离心1min，丢弃滤液；用300μL的0.1％三氟乙酸水溶液洗涤，重复2次，共洗涤3次样品；
C-3、肽段洗脱：①将脱盐柱放入新的2mL离心管中，加入300μL洗脱液，所述洗脱液为含0.1％三氟乙酸的50％乙腈水溶液，收集滤液，重复1次，合并2次滤液；②冷冻干燥后加入160μL含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液进行复溶，得到待测供试品溶液。
本发明的特征肽段按以下方法获得：
从Uniprot数据库(UniprotKB，http://www.uniprot.org)中检索并下载蚕蛹蛋白FASTA文件数据库并导入Thermo Fisher Scientific公司的Protein Discover2.5版本软件，对高分辨质谱进样的原始数据RAW格式文件进行搜库处理；Protein Discover软件参数设定如下：样品类型：定性；Cys烷基化：IAA；酶切试剂：胰蛋白酶；搜索工作：完整蛋白信息；为确定质谱检测的标志物，对经Uniprot数据库结果比对后得到的一系列肽段进行筛选；筛选原则如下：长度在6～20个氨基酸之间；m/z＜1200；不含任何修饰氨基酸(即不含半胱氨酸(C)与蛋氨酸(M))；不含内部胰蛋白酶切割位点；在酶切位点处没有连续的精氨酸(R)或赖氨酸(K)残基；
根据上述原则，对每个目标过敏蛋白筛选得到预选特征肽段，将所选择的预选特征肽段利用BLAST分析工具进行UniProtKB数据库比对，以检查物种间同源性，确保这些肽段对于其所属的蚕蛹过敏蛋白具有特异性。最终得到如表1所示的特征肽段，所选特征肽段仅存在于其所属蚕蛹过敏蛋白中，均可作为蚕蛹过敏蛋白定性定量蛋白质组学研究的候选靶肽。
进一步，所述步骤(3)中，根据本发明提供的各过敏蛋白的特征肽段，对待测样品的质谱结果进行分析，根据母子离子对数据，鉴定得到肽段序列，若含有任一过敏蛋白对应的全部特征肽段，即可鉴定待测蚕蛹样品含有该过敏蛋白。
进一步，所述步骤(3)中，可采用外标法定量，计算得到特征肽段的含量。
进一步，外标法定量的操作步骤为：将待测供试品溶液用高效液相串联高分辨质谱进行检测，得到待测供试品溶液的提取离子流色谱图，待测供试品溶液的各特征肽段的的峰面积与其对应的标准品的标准曲线比较，计算得到待测供试品溶液中各特征肽段的的含量。
特征肽段标准品可通过合成得到。
本发明的有益效果在于：
本发明将蚕蛹蛋白酶解为多肽，获得所有多肽的相对分子质量，所形成的专一性、特异性的肽段分子质量图谱。通过比对实验所得的图谱与蛋白质数据库(Uniprot)中的理论图谱进行蛋白质鉴定，匹配的肽段利用BLAST分析工具进行UniProtKB数据库比对，以检查物种间同源性，确保这些肽段对于其所属的蚕蛹过敏原具有特异性。最终得到11种过敏蛋白对应的的特征肽段，可实现高通量的11个致敏蛋白同时定性定量检测。
附图说明
图1为蚕蛹蛋白酶解产物的总离子流色谱图。
图2为Q00802特征肽段碎片离子匹配图，其中a图为特征肽段HLYEEK碎片离子匹配图，b图为特征肽段KSEVITNVVNK碎片离子匹配图。
图3为Q00801特征肽段QSLEYENQGK碎片离子匹配图。
图4为P09334特征肽段碎片离子匹配图，其中a图为特征肽段HHWYLEPSMYESDVMFFVYNR碎片离子匹配图，b图为特征肽段LIDQQNHNK碎片离子匹配图。
图5为P09338特征肽段QFNDALELGTIVNASGDR碎片离子匹配图。
图6为Q03383特征肽段碎片离子匹配图，其中a图为特征肽段NAADIINR碎片离子匹配图，b图为特征肽段WADEQTQGHIK碎片离子匹配图，c图为特征肽段DFHVDEK碎片离子匹配图，d图为特征肽段MIELPYK碎片离子匹配图。
图7为P80034特征肽段AIGFPDDDAIR碎片离子匹配图。
图8为Q9GV28特征肽段EADYTAPIYTPQNR碎片离子匹配图。
图9为Q27309特征肽段TYTVDIASPSGEAR碎片离子匹配图。
图10为Q9BLC5特征肽段ADLVNNLGTIAK碎片离子匹配图。
图11为Q8T113特征肽段NNAEDKVPEVEAALR碎片离子匹配图。
图12为Q1HPU0特征肽段碎片离子匹配图，其中a图为特征肽段LLAEDADGK碎片离子匹配图，b图为SLEVSEEK碎片离子匹配图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。
实施例1
样品：广西柞蚕蛹
一、样品处理
(1)细胞裂解
1、将蚕蛹用匀浆机进行匀浆，烘干后通过脂肪测定仪进行脱脂处理，再进行研磨得到脱脂蚕蛹粉。
2、称取100mg脱脂蚕蛹粉，加入1mL蛋白提取液(2％十二烷基硫酸钠，0.1mol/L二硫苏糖醇，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷，盐酸调节pH至7.6)涡旋1min。
3、8000g离心1min消除气泡后将上清液转移至EP管中，沸水浴3min。
4、超声5s取出5s，循环6次后再次沸水浴2min。
5、涡旋1min后10000g离心10min，取上清液。
(2)蛋白酶解
1、移取上述所得上清液20μL加入300μL的UABuffer(8mol/L尿素，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷，盐酸调节pH至8.5)进行稀释，10kda超滤管超滤浓缩10000r/min离心30min。
2、再次加入300μL的UABuffer，10000r/min离心30min置换一次。
3、加入100μL的50mM的IAA溶液(50mM的IAA，8mol/L尿素、0.1mol/LTrisHCl，pH8.5)涡旋1min后，暗处反应30min。
4、每次加入200μL的UABuffer，10000r/min离心30min置换，共3次。
5、每次加入200μL的50mM碳酸氢钠10000r/min离心30min置换，共2次。
6、加入100μL的50mM碳酸氢钠重悬蛋白质，转移至干净的EP管中。
7、加入10μL的0.2μg/μL胰蛋白酶，37℃水浴过夜酶解。
8、10000g离心15min超滤浓缩，收集上清液。
9、再加入50μL的50mM碳酸氢钠滤洗2遍，合并上清液。
10、用10％三氟乙酸酸化至浓度为0.4％终止反应。
11、冷冻干燥得到多肽样品。
(3)脱盐
1、脱盐柱清洗：①脱盐柱底部白色尖端拔下并丢弃后，将其放入2mL离心管中；②5000g离心1min，除去脱盐柱中的溶液；③每次加入300μL乙腈，5000g离心1min，共3次；④每次加入300μL的0.1％三氟乙酸，5000g离心1min，共3次。
2、样品清洗：①将上述所得多肽样品溶解在300μL的0.1％三氟乙酸中并上样至已清洗的脱盐柱中；②将脱盐柱放入2mL离心管中，3000g离心1min，丢弃滤液。用300μL的0.1％三氟乙酸水溶液洗涤，重复2次，共洗涤3次样品。
3、肽段洗脱：①将脱盐柱放入新的2mL离心管中，加入300μL洗脱液(含0.1％三氟乙酸的50％乙腈水溶液)，收集滤液，重复1次，合并2次滤液；②冷冻干燥后加入160μL含0.1％甲酸2％乙腈的水溶液进行复溶。
二、超高效液相串联高分辨质谱检测(UPLC-HRMS)
色谱柱：BEH C18(2.1×50mm，1.7um)
流动相A：0.1％甲酸水
流动相B：0.1％甲酸乙腈
流动相流速：0.3mL/min
柱温：45℃
进样量：10μL
梯度洗脱：0min，95％B；3min，95％B；95min，20％B；108min，35％B；112min，90％B；115min，90％B；117min，3％B；120min，3％B。
检测方式:Full Scan-ddMS2
电离模式：ESI+
雾化气温度：350℃
锥孔气流速：50L/h；
离子源温度：320℃
毛细管电压：4000V
动态排除：45s
Full Scan分辨率：60000
扫描范围(m/z)：350-1200
最大注入时间(ms)：25
ddMS2分辨率：15000
HCD碰撞能量(％)：30
三、数据分析
从Uniprot数据库(UniprotKB，http://www.uniprot.org)中检索并下载蚕蛹蛋白数据库并导入Thermo Fisher Scientific公司的Protein Discover 2.5版本软件，对高分辨质谱进样的原始数据raw格式文件进行搜库处理。Protein Discover 2.5版本软件参数设定如下：样品类型：定性；Cys烷基化：IAA；酶切试剂：胰蛋白酶；搜索工作：完整蛋白信息。为确定质谱检测的标志物，对经Uniprot数据库结果比对后得到的一系列肽段进行筛选。筛选原则如下：长度在6～20个氨基酸之间；m/z＜1200；不含任何修饰氨基酸(半胱氨酸(C)与蛋氨酸(M))；不含内部胰蛋白酶切割位点；在酶切位点处没有连续的精氨酸(R)或赖氨酸(K)残基。根据上述原则，每个目标过敏原筛选得到1-4条预选特征肽段，结果如表1所示。将所选择的预选特征肽段利用BLAST分析工具进行UniProtKB数据库比对，以检查物种间同源性，确保这些肽段对于其所属物种具有特异性。比对结果表明，所选特征肽段仅存在于其所属蚕蛹中，均可作为蚕蛹过敏原定性定量蛋白质组学研究的候选靶肽。
质谱RAW原始数据总离子流色谱图如图1所示，结果显示，酶解产物的分离情况较好，其色谱图谱峰尖锐，响应强度较高，峰形对称且重复性好，数据采集情况良好。
最终筛选出的11个过敏原及其特征肽段如下表1所示
表1蚕蛹中鉴定出的11个过敏原及其特征肽段
实施例2
特异性验证
取黄粉虫、蟋蟀、蝇蛆、蝉、猪肉、大豆、核桃为阴性样品，按相同前处理后，同样的检测方法进行实际样品的特异性验证，结果显示，均未检出表1中的特征肽段，不含有上述过敏原。
Claims (6)
1.一种鉴定蚕蛹中11种过敏蛋白的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)将待测蚕蛹样品进行细胞裂解、蛋白酶解、脱盐处理后，得到待测供试品溶液；
(2)待测供试品溶液进行超高效液相串联高分辨质谱检测，11种过敏蛋白及其对应的特征肽段如下：
(3)检测结果中，含有上述任一过敏蛋白对应的全部特征肽段，即可鉴定待测蚕蛹样品含有该过敏蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，高效液相串联高分辨质谱的条件为：
高效液相色谱条件为：
色谱柱：BEHC18，规格为2.1×50mm，1.7μm；
流动相A：0.1vol％甲酸的水溶液；
流动相B：0.1vol％甲酸的乙腈溶液；
梯度洗脱程序为：0min，95％B；3min，95％B；95min，20％B；108min，35％B；112min，90％B；115min，90％B；117min，3％B；120min，3％B。
质谱条件为：
检测方式:Full Scan-ddMS2
电离模式：ESI+
雾化气温度：350℃
锥孔气流速：50L/h；
离子源温度：320℃
毛细管电压：4000V
动态排除：45s
Full Scan分辨率：60000
扫描范围：m/z 350-1200
最大注入时间：25ms
ddMS2分辨率：15000
HCD碰撞能量：30％。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于高效液相色谱中，流动相的流速：0.3mL/min；柱温：45℃；进样量：10μL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述特征肽段按以下方法获得：从UniProtKB数据库中检索并下载蚕蛹蛋白FASTA文件数据库并导入Thermo Fisher Scientific公司的Protein Discover 2.5版本软件，对高分辨质谱进样的原始数据RAW格式文件进行搜库处理；Protein Discover软件参数设定如下：样品类型：定性；Cys烷基化：IAA；酶切试剂：胰蛋白酶；搜索工作：完整蛋白信息；为确定质谱检测的标志物，对经Uniprot数据库结果比对后得到的一系列肽段进行筛选；筛选原则如下：长度在6～20个氨基酸之间；m/z＜1200；不含任何修饰氨基酸；不含内部胰蛋白酶切割位点；在酶切位点处没有连续的精氨酸或赖氨酸残基；
根据上述原则，对每个目标过敏蛋白筛选得到预选特征肽段，将所选择的预选特征肽段利用BLAST分析工具进行UniProtKB数据库比对，以检查物种间同源性，确保这些肽段对于其所属的蚕蛹过敏蛋白具有特异性，得到11种过敏蛋白的特征肽段，所选特征肽段仅存在于其所属蚕蛹过敏蛋白中，均可作为蚕蛹过敏蛋白定性定量蛋白质组学研究的候选靶肽。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，根据本发明提供的各过敏蛋白的特征肽段，对待测样品的质谱结果进行分析，根据母子离子对数据，鉴定得到肽段序列，若含有任一过敏蛋白对应的全部特征肽段，即可鉴定待测蚕蛹样品含有该过敏蛋白。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，采用外标法定量，计算得到特征肽段的含量。
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