CN111595971B - 一种灰尘中尘螨过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物的检测方法 - Google Patents

一种灰尘中尘螨过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种灰尘中尘螨过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物的检测方法。本发明建立了一种能够同时测定灰尘中两种主要尘螨过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物Nitrated Der f1和Nitrated Der p1的检测方法。灰尘样品中的尘螨过敏原蛋白及其硝化产物经酶解消化成小分子的多肽，选择其中的一条丰度最高的多肽作为尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的特征多肽，超高效液相色谱‑串联质谱(UPLC‑MS/MS)对这些特征多肽进行定性定量，通过换算从而对尘螨过敏原蛋白及其硝化产物进行定性和定量分析。本方法选择性好，准确度和分析通量高，本方法克服了传统ELISA(酶联免疫吸附法)方法检测通量低，可能存在结构类似物的交叉反应和无法准确定量硝化蛋白的缺点。

Description

一种灰尘中尘螨过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物的 检测方法
技术领域
本发明属于环境健康的过敏原蛋白检测领域，是一种利用超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC/ESI-MS/MS)，选择尘螨主要过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物Nitrated Der f1和Nitrated Der p1为研究对象，建立的能够同时测定灰尘中两种尘螨主要过敏原蛋白含量及其硝化产物(共四种过敏原蛋白)的定量检测方法。
背景技术
随着工业化程度的提高，哮喘、过敏性鼻炎、湿疹等过敏性疾病在全世界范围内呈逐年增高的趋势，世界卫生组织(WHO)已经把过敏性疾病列为“21世纪重点研究和预防的疾病”。目前全球已有大量研究证实了尘螨与过敏性哮喘、过敏性鼻炎、湿疹等过敏性疾病密切相关。尘螨在全世界各个国家都有分布，全世界范围内最为常见的尘螨种类是屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)和粉尘螨(Dermatophagoides farinae)。尘螨中的某些蛋白质被认为是导致过敏的主要成分。免疫学研究证明，I类过敏原蛋白是引发尘螨过敏性疾病的主要因素，超过80％的尘螨过敏患者对I类过敏原蛋白(粉尘螨I类过敏原蛋白Derf1和屋尘螨I类过敏原蛋白Der p1)的皮肤针刺试验和血清IgE检测呈阳性。
有研究表明，O3浓度水平的升高和NOX的存在会引起过敏原蛋白的硝化，从而提高过敏原蛋白的致敏性，使得人体罹患过敏性疾病的风险增加。蛋白质的硝化主要是指蛋白质中酪氨酸残基被硝化成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)的过程。空气污染是当前我国面临的主要环境问题之一。尽管经过近几年的强力治理，PM10、PM2.5、SO2等典型大气污染物已经得到初步的控制，但O3的浓度却在逐年升高，这使得过敏原蛋白被硝化的可能性大大增强，给人们的健康增添极大的隐患。因此，环境中过敏原蛋白和硝化过敏原蛋白的存在及含量状况亟需得到大家的重视。
1988年世界卫生组织(WHO)召开的尘螨与哮喘国际研讨会上制定了暂行的评价标准：Der p1含量超过2μg·g-1足以引起过敏症状，是致敏和哮喘发生的危险因素，Der p1含量超过10μg·g-1则足以诱发对尘螨过敏的哮喘病人急性发作或更重的临床病症。未硝化的过敏原蛋白在环境中超过一定含量就可以对人体健康构成威胁，使得罹患尘螨过敏性疾病的机率大大增加，而已有的研究表明，硝化后的过敏原蛋白其致敏性会增强，使得人体健康的风险更大，因此，对人居环境中尘螨过敏原蛋白及其硝化产物准确定性定量显得尤为重要。通过研究环境灰尘样本中尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的含量水平，揭示环境中尘螨过敏性疾病的健康风险，从而对有效地预防和避免尘螨过敏提出有效建议。
目前最常使用的检测过敏原的分析方法是基于抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，ELISA方法灵敏度高，检测时间短，但目前市面上大部分试剂盒都是针对单一过敏原设计的，无法对多种过敏原同时进行检测，检测通量较低，并可能存在结构类似物的交叉反应，此方法难以适用于当今环境中多种过敏原的高通量及痕量检测。ELISA也可以用于硝化蛋白质的测定，但ELISA方法以硝化牛血清蛋白为对象制作标准曲线，而所检测的样品中硝化蛋白与抗体的结合能力可能与硝化牛血清蛋白不同，因此ELISA方法只是半定量检测硝化蛋白的方法，而且抗体也并非目标硝化蛋白质的特应性抗体。
相比于ELISA方法，高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS/MS)利用测序级胰蛋白酶将目标蛋白酶切成相对分子质量较小的多肽混合物，利用一级质谱(MS)或串联质谱(MS/MS)技术检测多肽混合物中各多肽的相对分子质量或碎片离子信息，找到响应好且能够特异性代替目标蛋白的目标多肽。在质谱多反应监测模式(MRM)下，只对目标多肽进行定量分析，从而反算目标蛋白质的含量。高效液相色谱-质谱联用技术不仅能直接对目标过敏原进行鉴定，还可以同时分析不同亚型和修饰状况，方法的选择性、准确度和通量均有很大提高，目前已被广泛应用于食物过敏原蛋白质的研究中。但目前对于利用HPLC-MS/MS检测灰尘样品中的尘螨过敏原蛋白质及其硝化产物的研究还鲜见报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，利用超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC/ESI-MS/MS)，选择尘螨主要过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物Nitrated Derf1和Nitrated Der p1为研究对象，从而对灰尘中两种尘螨主要过敏原蛋白含量及其硝化产物的进行同时检测。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的，一种灰尘中尘螨过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物Nitrated Der f1和Nitrated Der p1的检测方法，该方法为：利用特征多肽AR-8、SR-12，特征多肽的硝化物NO2-AR-8，NO2-SR-12以及特征多肽的同位素标记物的最佳质谱参数对样品中的尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的特征多肽进行UPLC/ESI-MS/MS，，进而实现灰尘中的尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的定性与定量。其中，特征多肽AR-8的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，特征多肽SR-12的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，具体包括以下步骤：
(1)样品采集与前处理
采集人们主要活动场所地面上的灰尘样本，用硬纸板和毛刷小心收拢后用锡箔纸包好装入自封袋带回实验室，用普通筛子先粗略筛去肉眼可见的较大颗粒后，用镊子小心夹取纸屑和毛发等物后弃掉，处理后的灰尘样本在-20℃保存。取0.7g左右灰尘样品，按照1:100(w/v)的比例加入含1％牛血清白蛋白(BSA)和0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(1％BSA-PBST)。室温下超声粉碎(200V)2h，然后在4℃，100r·min-1振荡过夜，取上清液在4℃，3000×g条件下离心15min，离心后取上清液过0.22μm水系滤膜，-20℃下保存备用。
使用BCA蛋白定量试剂盒测定灰尘样品提取液中的总蛋白含量，根据实际测得的灰尘样品中所含的总蛋白质含量，取含400μg总蛋白的灰尘样品提取液于1.5mL低蛋白吸附管中，加入100μL 20ng·mL-1的同位素内标，加入200μL乙腈、200μL 50mmol·L-1NH4HCO3缓冲溶液，37℃下放置15min；加入200μL还原溶液(含45mmol·L-1DTT、20mmol·L-1TCEP和50mmol·L-1NH4HCO3缓冲液)，37℃下放置30min；加入200μL 100mmol·L-1IAA溶液，暗处37℃下混匀放置30min；加入220μL 90mmol·L-1DTT储备液猝灭残留的IAA；加入100μL胰酶(40ng·μL-1，HCl稀释)使得酶/底物为1:100(w/w)。在37℃下孵育24h后加入13μL 10％甲酸/水(v/v)，涡旋混匀后室温下放置10min；用真空离心浓缩仪使溶剂蒸发，并用200μL 5％乙腈/水(v/v)溶液重新溶解。随后4℃下14000r·min-1离心30min，上清液过0.22μm水系滤膜，滤液转移至含衬管的进样瓶中，-20℃下保存待分析。
(2)UPLC/ESI-MS/MS分析
选择Waters BEH C18柱(2.1mm×50mm×1.7μm)的色谱柱，前段串联了一根VanGuardTM保护柱(C18柱，2.1mm×5mm×1.7μm)，柱温设置为40℃，进样体积为10μL，色谱分离的流动相A为0.1％甲酸/乙腈(v/v)，B为0.1％甲酸/水(v/v)；流速为0.2mL·min-1，梯度洗脱的条件为：0min，5％A；4min，25％A；5min，95％A；5.5min，95％A；6min，5％A；7min，5％A。质谱运行模式为正电离和MRM模式，毛细管电压为1.07kV。脱溶剂气采用氮气，气体的温度和流速分别为350℃和800L/h。碰撞气采用氩气。
(3)尘螨过敏原蛋白及其硝化产物含量的计算
通过UPLC/ESI-MS/MS定性定量分析得尘螨过敏原蛋白及其硝化产物特征多肽的含量，尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的定性由特征多肽指示，尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的含量通过特征多肽的含量除以酶解效率换算可得。
进一步地，所述同位素内标配置如下：
(a)用20％乙腈/水(v/v)溶液配置浓度为1mg·mL-1的同位素多肽母液，即特征多肽的同位素标记物母液，100μL 1mg·mL-1的同位素多肽母液用20％乙腈/水(v/v)溶液逐步稀释至100μg·mL-1，10μg·mL-1，1μg·mL-1；100μL 1μg·mL-1的同位素单标用5％乙腈/水(v/v)溶液稀释至100ng·mL-1。
(b)同位素内标：各取200μL 100ng·mL-1的同位素单标于低蛋白吸附管中，用5％乙腈/水(v/v)溶液配置成1mL浓度为20ng·mL-1的同位素内标。
进一步地，同位素多肽包括13C6 14N4-AR-8和13C6 14N4-SR-12。
本发明的有益效果是：本发明不仅能直接对目标过敏原进行鉴定，还可以同时分析不同亚型和修饰状况，方法的选择性、准确度和通量均有很大提高。同时，以同位素内标来跟踪和校正样品分析过程中目标化合物的损失，确保结果的准确性。
附图说明
图1为尘螨过敏原蛋白Der f1和Der p1特征多肽的选择；其中，(a)为Der f1，(b)为Der p1。
图2为4种特征多肽及其同位素多肽标准品总离子流色谱图。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式和附图对本发明做进一步说明。
本实施方式中选取特征多肽(AR-8，SR-12和NO2-AR-8，NO2-SR-12)及其同位素多肽(13C6 14N4-AR-8和13C6 14N4-SR-12，但不限于此)作为待测指标，使用超高效液相色谱-电喷雾电离-三重四级杆串联质谱仪实现定量分析，通过对特征多肽进行定量分析，从而反算目标蛋白质的含量。该方法不仅能直接对目标过敏原进行鉴定，还可以同时分析不同亚型和修饰状况并且方法的选择性好、准确度高和通量高。
实施例1样品分析过程
1.1尘螨过敏原蛋白特征多肽的选择
取10μg尘螨过敏原标准蛋白(Der f1和Der p1)溶液于1.5mL低蛋白吸附管中，加入20μL乙腈、20μL 50mmol·L-1NH4HCO3缓冲溶液，37℃下放置15min；加入5μL还原溶液(45mmol·L-1DTT和20mmol·L-1TCEP溶于50mmol·L-1NH4HCO3缓冲液)，37℃下放置30min；加入5μL 100mmol·L-1IAA溶液，暗处37℃下混匀放置30min；加入5.5μL 90mmol·L-1DTT储备液猝灭残留的IAA；加入134.5μL的超纯水；加入5μL胰酶(20ng·μL-1，HCl稀释)使得酶/底物为1:100(w/w)。在37℃下孵育24h后加入2μL 10％甲酸/水(v/v)，涡旋混匀后室温下放置10min；用真空离心浓缩仪使溶剂蒸发，并用200μL 5％乙腈/水(v/v)溶液重新溶解。随后4℃下14000r·min-1离心30min，上清液过0.22μm水系滤膜，滤液转移至含衬管的进样瓶中，-20℃下保存待分析。
使用UPLC/ESI-MS/MS对尘螨过敏原标准蛋白的酶解液进行分析。采用全扫描模式在m/z 200.0—2000.0的范围内进行扫描(如图1所示)，标准蛋白酶解液中丰度最高的多肽离子峰与尘螨过敏原蛋白Der f1和Der p1胰酶消化的理论肽段对比，我们最终确定Der f1的特征多肽AFQHYDGR(AR-8)和Der p1的特征多肽SYATFEDEEAAR(SR-12)，两条特征多肽中均含有酪氨酸残基。本实施例中选取结果如下表1所示。
表1 尘螨过敏原蛋白的特征多肽
蛋白质 特征多肽的氨基酸序列 简称
Der f1 AFQHYDGR(SEQ ID NO.3) AR-8
Der p1 SYATFEDEEAAR(SEQ ID NO.4) SR-12
Nitrated Der f1 AFQHY-NO<sub>2</sub>DGR NO<sub>2</sub>-AR-8
Nitrated Der p1 SY-NO<sub>2</sub>ATFEDEEAAR NO<sub>2</sub>-SR-12
两条特征多肽在重组蛋白Der f1和Der p1的氨基酸序列中的具体位置如下所示：
Der f1(SEQ ID NO.1)
Figure BDA0002504394000000051
Der p1(SEQ ID NO.2)
Figure BDA0002504394000000052
注：加粗带下划线的字母代表本实验中所鉴定出的目标多肽，目标多肽中倾斜的字母代表酪氨酸
确定尘螨过敏原蛋白的特征多肽后，商业合成4种特征多肽AR-8，SR-12和NO2-AR-8和NO2-SR-12以及2种同位素标记特征多肽13C6 14N4-AR-8和13C6 14N4-SR-12。4种特征多肽及其同位素多肽标准品总离子流色谱图如图2所示。
1.2样品采集与前处理
采集灰尘样本，由于灰尘分布不均匀，用硬纸板和毛刷小心收拢后用锡箔纸包好装入自封袋带回实验室，用普通筛子先粗略筛去肉眼可见的较大颗粒后，用镊子小心夹取纸屑和毛发等物后弃掉，处理后的灰尘样本在-20℃保存。取0.7g左右灰尘样品，按照1:100(w/v)的比例加入含1％牛血清白蛋白(BSA)和0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(1％BSA-PBST)。室温下超声粉碎(200V)2h，然后在恒温振荡器中(4℃，100r·min-1)振荡过夜，取上清液在4℃，3000×g条件下离心15min，离心后取上清液过0.22μm水系滤膜，-20℃下保存备用。
使用Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit(BCA蛋白定量试剂盒)测定灰尘样品提取液中的总蛋白含量，根据实际测得的灰尘样品中所含的总蛋白质含量，取含400μg总蛋白的灰尘样品提取液于1.5mL低蛋白吸附管中，加入100μL 20ng·mL-1的同位素内标，加入200μL乙腈、200μL 50mmol·L-1NH4HCO3缓冲溶液，37℃下放置15min；加入200μL还原溶液(45mmol·L-1DTT和20mmol·L-1TCEP溶于50mmol·L-1NH4HCO3缓冲液)，37℃下放置30min；加入200μL 100mmol·L-1IAA溶液，暗处37℃下混匀放置30min；加入220μL 90mmol·L-1DTT储备液猝灭残留的IAA；加入100μL胰酶(40ng·μL-1，HCl稀释)使得酶/底物为1:100(w/w)。在37℃下孵育24h后加入13μL 10％甲酸/水(v/v)，涡旋混匀后室温下放置10min；用真空离心浓缩仪使溶剂蒸发，并用200μL 5％乙腈/水(v/v)溶液重新溶解。随后4℃下14000r·min-1离心30min，上清液过0.22μm水系滤膜，滤液转移至含衬管的进样瓶中，-20℃下保存待分析。
其中，根据1.1的选取结果，采用13C6 14N4-AR-8和13C6 14N4-SR-12同位素多肽配置同位素内标，具体配置如下：
(1)用20％乙腈/水(v/v)溶液配置浓度为1mg·mL-1的同位素多肽母液，100μL1mg·mL-1的同位素多肽母液用20％乙腈/水(v/v)溶液逐步稀释至100μg·mL-1，10μg·mL-1，1μg·mL-1；100μL 1μg·mL-1的同位素单标用5％乙腈/水(v/v)溶液稀释至100ng·mL-1；
(2)同位素内标：各取200μL 100ng·mL-1的同位素单标于低蛋白吸附管中，用5％乙腈/水(v/v)溶液配置成1mL浓度为20ng·mL-1的同位素内标。
1.3UPLC/ESI-MS/MS分析
标准品通过调谐优化的反应离子对、保留时间、锥孔电压、碰撞能量和对应内标物等质谱参数见表2。
表2 4种特征多肽及其同位素多肽的仪器参数
Figure BDA0002504394000000061
Figure BDA0002504394000000071
其中，*表示定量离子对。
离子对确定后，用UPLC/ESI-MS/MS进行定量分析。选取Waters BEH C18柱(2.1mm×50mm×1.7μm)的色谱柱，前段串联了一根VanGuardTM保护柱(C18柱，2.1mm×5mm×1.7μm)，柱温设置为40℃，进样体积为10μL，色谱分离的流动相A为0.1％甲酸/乙腈(v/v)，B为0.1％甲酸/水(v/v)；流速为0.2mL·min-1，梯度洗脱的条件为：0min，5％A-95％B；4min，25％A-75％B；5min，95％A-5％B；5.5min，95％A-5％B；6min，5％A-95％B；7min，5％A-95％B。质谱运行模式为正电离和MRM模式，毛细管电压为1.07kV。脱溶剂气采用氮气，气体的温度和流速分别为350℃和800L/h。碰撞气采用氩气。利用特征多肽(AR-8，SR-12和NO2-AR-8，NO2-SR-12)及其同位素多肽(13C6 14N4-AR-8和13C6 14N4-SR-12)的最佳质谱参数对样品中的尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的特征多肽进行定性定量分析。
1.4尘螨过敏原蛋白及其硝化产物含量的计算
通过UPLC/ESI-MS/MS定性定量分析得尘螨过敏原蛋白及其硝化产物特征多肽的含量，尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的定性由特征多肽指示，尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的含量通过特征多肽的含量除以酶解效率换算可得。
实施例2方法可靠性评价
2.1溶液配制
多肽混合标液配置如下：
(1)用11％乙腈/水(v/v)溶液配置浓度为1mg·mL-1的AR-8母液，将单标分步稀释至100μg·mL-1、10μg·mL-1，1μg·mL-1；用15％乙腈/水(v/v)溶液配置1mg·mL-1的SR-12母液和NO2-SR-12母液，将单标分步稀释至100μg·mL-1、10μg·mL-1，1μg·mL-1；用25％乙腈/水(v/v)溶液配置浓度为1mg·mL-1的NO2-AR-8母液，将单标分步稀释至100μg·mL-1、10μg·mL-1，1μg·mL-1；
(2)高浓度多肽混合标液：分别取100μL 1μg·mL-1的AR-8，SR-12，NO2-AR-8和NO2-SR-12这4种多肽单标于低蛋白吸附管中，用5％乙腈/水(v/v)溶液稀释为100ng·mL-1的多肽混合标液；然后取500μL 100ng·mL-1的多肽混合标液于低蛋白吸附管中，用5％乙腈/水(v/v)溶液稀释为50ng·mL-1的多肽混合标液。
(3)低浓度多肽混合标液：取100μL 50ng·mL-1的多肽混合标液于低蛋白吸附管中，用5％乙腈/水(v/v)溶液稀释为5ng·mL-1的多肽混合标液。
2.2方法评价实验
仪器检测限(instrument detection limit,IDL)：采用EPA推荐的方法计算：浓度为0.1、1、10、100ng·mL-1的特征多肽标准混合溶液按照每个浓度连续进样5针的规则，计算仪器响应的平均值(mean peak area，M)和相对标准偏差(standard deviation，SD)，代入公式(1)计算。
方法检测限(method detection limit，MDL)(AR-8，NO2-AR-8，SR-12，NO2-SR-12)：将仪器检测限IDL和相对回收率Rr代入公式(2)计算获得。
方法定量限(method quantification limit,MQL)：多肽(AR-8，NO2-AR-8，SR-12，NO2-SR-12)的方法定量限等于3×MDL。过敏原蛋白(Der f1，Nitrated Der f1，Der p1，Nitrated Der p1)的方法定量限由仪器检测限IDL，酶解效率η、回收率Rr以及相对分子质量之比Mr代入公式(3)计算获得。
相对回收率(Rr)的测定：20μL灰尘样品提取液中加入200μL浓度为5和50ng·mL-1的特征多肽标准混合溶液，按照前文所述酶解步骤进行前处理，真空离心浓缩至近干后，用200μL 5％乙腈溶液复溶，仪器响应值记为S2；20μL的灰尘样品提取液按照前文所述酶解步骤进行前处理，真空离心浓缩至近干后，用200μL 5％乙腈溶液复溶，仪器响应值(峰面积)记为S1；S2-S1的数值代入基质匹配标准曲线得到浓度C1后代入公式(4)计算获得。
基质效应(ME)的测定：20μL的灰尘样品提取液按照前文所述酶解步骤进行前处理，真空离心浓缩至近干后，加入200μL浓度为5、50ng·mL-1的标准多肽混合溶液进行复溶，仪器响应值记为S3；不加样品且不加入胰酶情况下按照前文所述酶解剩余步骤进行前处理，真空离心浓缩至近干后，加入200μL浓度为5、50ng·mL-1的标准多肽混合溶液进行复溶，仪器响应值记为S4，代入公式(5)计算获得。
基质匹配标准曲线：20μL的灰尘样品提取液按照前文所述酶解步骤进行前处理，真空离心浓缩至近干后，加入200μL浓度为0.1，0.5，1，5，10，50，100ng·mL-1的标准多肽混合溶液进行复溶，仪器响应值记为S5；以横坐标为浓度值，纵坐标为仪器响应值(S5-S1)作标准曲线。
Figure BDA0002504394000000081
Figure BDA0002504394000000082
Figure BDA0002504394000000083
Figure BDA0002504394000000084
Figure BDA0002504394000000091
其中，C表示相对应的标准溶液浓度，此实验中为5ng·mL-1和50ng·mL-1；a1-a5为连续测定5次同一浓度标准溶液的5个峰面积值；0.2mL为定容体积，0.7g为样品量。
2.3方法评价结果
计算得尘螨过敏原蛋白特征多肽的各方法参数数据如表3所示。
表3 4种特征多肽的分析方法参数
Figure BDA0002504394000000092
多肽的基质效应为17.3％—45.5％，相对回收率为43％—80％，方法检测限为<0.005-0.053ng·g-1，过敏原蛋白的方法定量限为3.05-167ng·g-1。由此可以判断该前处理方法具有可靠性。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种灰尘中尘螨过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物的检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 307
<212> PRT
<213> 尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)
<400> 1
Met Ala Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Phe Lys Lys Ala Phe Asn Lys
1 5 10 15
Asn Tyr Ala Thr Val Glu Glu Glu Glu Val Ala Arg Lys Asn Phe Leu
20 25 30
Glu Ser Leu Lys Tyr Val Glu Ala Asn Lys Gly Ala Ile Asn His Leu
35 40 45
Ser Asp Leu Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn Arg Tyr Leu Met Ser Ala
50 55 60
Glu Ala Phe Glu Gln Leu Lys Thr Gln Phe Asp Leu Asn Ala Glu Thr
65 70 75 80
Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp Leu
85 90 95
Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly
100 105 110
Ser Ala Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu
115 120 125
Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp
130 135 140
Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile
145 150 155 160
Glu Tyr Ile Gln Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr
165 170 175
Val Ala Arg Glu Gln Arg Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly
180 185 190
Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gln Ile Arg
195 200 205
Glu Ala Leu Thr Gln Thr His Thr Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly Ile
210 215 220
Lys Asp Leu Arg Ala Phe Gln His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gln
225 230 235 240
His Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val Gly
245 250 255
Tyr Gly Ser Thr Gln Gly Asp Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp
260 265 270
Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gln Ala Gly Asn
275 280 285
Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val Val Ile His His His
290 295 300
His His His
305
<210> 2
<211> 306
<212> PRT
<213> 尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)
<400> 2
Met Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Tyr Lys Lys Ala Phe Asn Lys Ser
1 5 10 15
Tyr Ala Thr Phe Glu Asp Glu Glu Ala Ala Arg Lys Asn Phe Leu Glu
20 25 30
Ser Val Lys Tyr Val Gln Ser Asn Gly Gly Ala Ile Asn His Leu Ser
35 40 45
Asp Leu Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn Arg Phe Leu Met Ser Ala Glu
50 55 60
Ala Phe Glu His Leu Lys Thr Gln Phe Asp Leu Asn Ala Glu Thr Asn
65 70 75 80
Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg Gln
85 90 95
Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly Ser Ala
100 105 110
Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr
115 120 125
Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala
130 135 140
Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr
145 150 155 160
Ile Gln His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala
165 170 175
Arg Glu Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser
180 185 190
Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Val Asn Lys Ile Arg Glu Ala
195 200 205
Leu Ala Gln Thr His Ser Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly Ile Lys Asp
210 215 220
Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gln Arg Asp
225 230 235 240
Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val Gly Tyr Ser
245 250 255
Asn Ala Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr
260 265 270
Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu
275 280 285
Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val Val Ile Leu His His His His
290 295 300
His His
305
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Phe Gln His Tyr Asp Gly Arg
1 5
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Tyr Ala Thr Phe Glu Asp Glu Glu Ala Ala Arg
1 5 10

Claims (3)

1.一种灰尘中尘螨过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物的检测方法，其特征在于，该方法为：利用特征多肽AR-8、SR-12，特征多肽的硝化物NO2-AR-8，NO2-SR-12以及特征多肽的同位素标记物的最佳质谱参数对灰尘中的尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的特征多肽进行UPLC/ESI-MS/MS分析，进而实现灰尘中的尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的定性与定量；其中，特征多肽AR-8的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，特征多肽SR-12的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
该方法具体包括以下步骤：
(1)样品采集与前处理
采集人们主要活动场所地面上的灰尘样本，筛去肉眼可见的较大颗粒及纸屑和毛发等物，处理后的灰尘样本在-20℃保存；取0.7g左右灰尘样品，按照质量体积比1:100的比例加入含1％牛血清白蛋白和0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液；室温下超声粉碎2h，然后在4℃，100r·min-1振荡过夜，取上清液在4℃，3000×g条件下离心15min，离心后取上清液过0.22μm水系滤膜，-20℃下保存备用；
使用BCA蛋白定量试剂盒测定灰尘样品提取液中的总蛋白含量，根据实际测得的灰尘样品中所含的总蛋白质含量，取含400μg总蛋白的灰尘样品提取液于1.5mL低蛋白吸附管中，加入100μL 20ng·mL-1的同位素内标，加入200μL乙腈、200μL 50mmol·L-1NH4HCO3缓冲溶液，37℃下放置15min；加入200μL含45mmol·L-1DTT、20mmol·L-1TCEP和50mmol·L- 1NH4HCO3缓冲液的还原溶液，37℃下放置30min；加入200μL 100mmol·L-1IAA溶液，暗处37℃下混匀放置30min；加入220μL 90mmol·L-1DTT储备液猝灭残留的IAA；加入100μL HCl稀释的40ng·μL-1胰酶，使得酶/底物质量比为1:100；在37℃下孵育24h后加入13μL 10v/v％甲酸/水，涡旋混匀后室温下放置10min；用真空离心浓缩仪使溶剂蒸发，并用200μL 5v/v％乙腈/水溶液重新溶解；随后4℃下14000r·min-1离心30min，上清液过0.22μm水系滤膜，滤液转移至含衬管的进样瓶中，-20℃下保存待分析；
(2)UPLC/ESI-MS/MS分析
选择Waters BEH C18柱的色谱柱，前段串联了一根VanGuardTM保护柱，柱温设置为40℃，进样体积为10μL，色谱分离的流动相A为0.1v/v％甲酸/乙腈，B为0.1v/v％甲酸/水；流速为0.2mL·min-1，梯度洗脱的条件为：0min，5％A；4min，25％A；5min，95％A；5.5min，95％A；6min，5％A；7min，5％A；质谱运行模式为正电离和MRM模式，毛细管电压为1.07kV；脱溶剂气采用氮气，气体的温度和流速分别为350℃和800L/h；碰撞气采用氩气；
(3)尘螨过敏原蛋白及其硝化产物含量的计算
通过UPLC/ESI-MS/MS定性定量分析得尘螨过敏原蛋白及其硝化产物特征多肽的含量，尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的定性由特征多肽指示，尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的含量通过特征多肽的含量除以酶解效率换算可得。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述同位素内标配置如下：
(a)用20％乙腈/水(v/v)溶液配置浓度为1mg·mL-1的同位素多肽母液，100μL 1mg·mL-1的同位素多肽母液用20v/v％乙腈/水溶液逐步稀释至100μg·mL-1，10μg·mL-1，1μg·mL-1；100μL 1μg·mL-1的同位素单标用5v/v％乙腈/水溶液稀释至100ng·mL-1；
(b)同位素内标：各取200μL 100ng·mL-1的同位素单标于低蛋白吸附管中，用5％v/v乙腈/水溶液配置成1mL浓度为20ng·mL-1的同位素内标。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，同位素多肽包括13C6 14N4-AR-8和13C6 14N4-SR-12。
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