CN101318017A - 一种预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗。本发明所提供的预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗，它的活性成分是下述混合物：由造成过敏性哮喘的蛋白抗原或其表位多肽和在多克隆位点插入所述造成过敏性哮喘的蛋白抗原或其表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物。该疫苗可诱导免疫调节性T细胞的产生，抑制免疫动物的过敏性T细胞活性，从而能够有效地预防和/或治疗过敏性哮喘的发生。

Description

一种预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗
技术领域
本发明涉及一种预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗。
背景技术
哮喘(asthma)是由肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞等多种细胞参与的慢性气道炎症。哮喘的发病机制主要是I型超敏反应(过敏性)。
过敏性哮喘多于幼年发病，患者常具有对某些物质过敏的特应性体质，如吸入冷空气、花粉、尘螨等；进食鱼虾、牛奶等；或接触某些药物，如青霉素。当这些过敏原进入患者体内，便通过一系列反应，使肥大细胞或嗜碱粒细胞释放致敏活性物质，作用于支气管上，造成广泛小气道狭窄，发生喘憋症状，如不及时治疗，哮喘可以致命。
当变应原进入体内后，被树突状细胞等抗原提呈细胞加工并递呈给T细胞，在T细胞上的CD28与树突状细胞上的B7分子及其分泌的IL-1、IL-12等的相互作用下，T细胞分化为Th2细胞，Th2细胞分泌的IL-3、IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α、GM-CSF，其中IL-3、IL-5和GM-CSF影响嗜酸性粒细胞分化、成熟及存活，而IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α则对上调粘附分子VCAM-1，后者可使中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞黏附于血管内皮或向血管内皮迁移。IL-4、IL-13则促进B细胞向IgE合成细胞分化，此过程需B细胞上的CD40及T细胞上的CD40配体相互作用的有效信号。Th1细胞分泌IL-2、IL-12、IFN-γ，能抑制IgE合成及其介导的I型超敏反应。因此，Th1/Th2细胞比例和功能失衡，在哮喘发病机制中起重要作用。IgE合成后经激活肥大细胞和嗜酸性粒细胞，使其脱颗粒并释放炎性介质而引发气道炎症，进而引发哮喘。气道中的嗜酸性粒细胞被激活后，产生IL-8及RANTS，使更多的嗜酸性粒细胞向炎症部位渗透。
临床上治疗过敏性哮喘除嘱咐病人远离过敏原外，主要使用激素，以控制哮喘发作的频率与周期。然而长期口服激素，可能造成肥胖、骨质疏松、高血压等副作用；吸入激素喷雾可能出现口腔和咽喉的白色念珠菌感染。
早在1920年左右，即有研究发现室内灰尘的多寡与发生气喘疾病之间的相关性，直到1965年时才证实室尘螨是室内灰尘中过敏原的最主要来源之一。室尘螨是一种八只脚的节肢微小昆虫；温暖且潮湿的环境有利于其生长与繁衍，人类剥落的皮屑更是其主要的食物来源。室尘螨的排泄物是人类过敏原的重要成分，其次是虫体本身，而死亡的尘螨仍然具有导致过敏的能力。有人做过这样的实验，将尘螨的浸出液稀释到1/10万的浓度，给对尘螨过敏的病人进行皮内实验，结果仍能出现阳性反应。其发病率之高是相当惊人的，据报道，德国60％以上的支气管哮喘病人的皮试结果，其中对螨的反应阳性率高达89.4％；北京某医院统计120例常年性过敏性鼻炎，螨的皮试阳性者为94例，占总数的78.3％。在北方，每年春秋两季是尘螨的繁殖高峰，此时室内及粮食内含螨量最高；南方空气潮湿，更利于尘螨的生长繁殖。对尘螨过敏的病人常常是全年都发病，在尘螨繁殖季节，可使症状加重。因此，室内尘螨过敏原是室内最主要的致敏因素，可引起哮喘、过敏性鼻炎、变应性球结膜炎等过敏性疾病。而Der p1是尘螨过敏原重要的蛋白组分。Der p1是蛋白酶，其与如组织蛋白酶H等其他半胱氨酸酶的序列具有同源性，它可以切割CD25以及人IgE低亲和力受体CD23。它可以诱导机体产生较强的过敏反应(ABC of allergies：Avoiding exposure to indoor allergens.BMJ 1998；316：1075.Is allergenexposure the major primary cause of asthma.Thorax 2000；55：424)。
吸入花和草粉而引起的哮喘，称之为“花粉性哮喘”，这是有过敏素质的人在一定的地区和季节中因为吸入某些致敏花粉和草，而引起哮喘的季节性发作或季节性加重。还有常见一些霉菌产生的孢子也是过敏源，如点青、芽枝、交链孢、烟曲霉菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗。
本发明所提供的预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗，它的活性成分是下述混合物：由造成过敏性哮喘的蛋白抗原或其表位多肽和在多克隆位点插入所述造成过敏性哮喘的蛋白抗原或其表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物。所述造成过敏性哮喘的蛋白抗原可选自下述抗原中的任意一种：氨基酸序列如GenBank Accession Number X56279所示的三裂叶豚草(Ambrosia trifida)过敏原Amb t V；2、氨基酸序列如GenBank Accession Number AMBPV2A所示的多年生豚草(Ambrosia psilostachya)过敏原Amb p V；3、氨基酸序列如GenBank AccessionNumber AMBPV3A所示的多年生豚草过敏原Amb p V；4、氨基酸序列如GenBankAccession Number AMBPV1B所示的多年生豚草过敏原Amb p V；5、氨基酸序列如GenBank Accession Number AMBPV2B所示的多年生豚草过敏原Amb p V；6、氨基酸序列如GenBank Accession Number AMBPV3B所示的多年生豚草过敏原Amb p V；7、氨基酸序列如GenBank Accession Number S39330所示的烟曲霉(Aspergillusfumigatus)过敏原I/a＝IgE-binding ribotoxin；8、氨基酸序列如GenBankAccession Number AJ002026所示的烟曲霉过敏原rAsp f 13；9、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ001732所示的烟曲霉过敏原rAsp f 4；10、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ001732所示的烟曲霉过敏原rAsp f 7；11、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ224333所示的烟曲霉过敏原rAsp f 8；12、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ223327所示的烟曲霉过敏原rAsp f9；13、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ006689所示的烟曲霉过敏原rAspf 11；14、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ937743所示的烟曲霉过敏原cyclophilin(asp f 27)；15、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ937744所示的烟曲霉过敏原thioredoxin(asp f 28)；16、氨基酸序列如GenBank AccessionNumber AJ937745所示的烟曲霉过敏原thioredoxin(asp f 29)；17、氨基酸序列如GenBank Accession Number AF282850所示的欧洲白桦黄酮素还原酶(Betulapendula isoflavone reductase)-like protein Bet v 6.0102(BETV6.0102)；18、氨基酸序列如GenBank Accession Number AF135127所示的欧洲白桦异黄酮素还原酶-homolog Bet v 6.0101(BETV6)；19、氨基酸序列如GenBank Accession NumberBGU40767所示的德国小蠊(Blattella germanica)过敏原Bla g 4；20、氨基酸序列如GenBank Accession Number BGU92412所示的德国小蠊过敏原Bla g 5；21、氨基酸序列如GenBank Accession Number BGU28863所示的德国小蠊半胱氨酸蛋白酶前体(aspartic protease precursor)过敏原；22、氨基酸序列如GenBank AccessionNumber AF072219所示的德国小蠊主要过敏原(Bla g 1.0101)；23、氨基酸序列如GenBank Accession Number AF072221所示的德国小蠊主要过敏原(Bla g 1.0101)。；24、氨基酸序列如GenBank Accession Number号AF072220所示的德国小蠊主要过敏原Bla g 1.02；25、氨基酸序列如GenBank Accession Number AY283288所示的粉尘螨(Dermatophagoides farinae)Der f 2过敏原；26、氨基酸序列如GenBankAccession Number AY947536的户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)DerDer-p1过敏原；27、氨基酸序列如GenBank Accession Number X63517所示的大麦(H.vulgare)Iam1-单体a-淀粉酶抑制物(monomeric alpha-amylase inhibitor)；28、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ243504所示的黑麦草(Loliumperenne)花粉过敏原(5C)；29、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ937746所示的合轴马拉色菌(Malassezia sympodialis)硫氧还蛋白(thioredoxin，malas 13 gene)；30、氨基酸序列如GenBank Accession Number AF072222所示的美洲大蠊(Periplaneta americana)主要过敏原(Per a 1.0101)；31、氨基酸序列如GenBank Accession Number AF106961所示的美洲大蠊(Periplaneta americana)原肌球蛋白(tropomyosin)；32、氨基酸序列如GenBank Accession Number AF082515所示的红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)过敏原(Tri r 2)；33、氨基酸序列如GenBank Accession Number AF082514所示的红色毛癣菌过敏原(Tri r 4)；34、氨基酸序列如GenBank Accession Number AF082514所示的红色毛癣菌(Trichophrubrum)过敏原Tri r 4；35、氨基酸序列如序列表中序列1所示的尘螨Der p1；36、氨基酸序列是KISQAVHAAHAEINEAG的pep323。
其中，1、GenBank Accession Number X56279，289bp mRNA，三裂叶豚草(Ambrosiatrifida)过敏原基因Amb t V.，编码区27..248；2、GenBank Accession NumberAMBPV2A，234bp mRNA多年生豚草(Ambrosia psilostachya)过敏原基因Amb p V(A2克隆)，编码区1..234；3、GenBank Accession Number AMBPV3A，234bp mRNA多年生豚草过敏原基因Amb p V(A3克隆)，编码区1..234；4、GenBank AccessionNumber AMBPV1B，234bp mRNA多年生豚草过敏原基因Amb p V(B1克隆)，编码区1..234；5、GenBank Accession Number AMBPV2B，234bp mRNA多年生豚草过敏原基因Amb p V(B2克隆)，编码区1..234；6、GenBank Accession Number AMBPV3B，234bp mRNA多年生豚草过敏原基因Amb p V(B3克隆)，编码区1..234；7、GenBankAccession Number S39330，450bp mRNA烟曲霉(Aspergillus fumigatus)过敏原I/a＝IgE-binding ribotoxin基因，编码区1..450；8、GenBank Accession NumberAJ002026，721bp mRNA烟曲霉过敏原rAsp f 13基因，编码区1..721；9、GenBankAccession Number AJ001732，861bp mRNA烟曲霉过敏原rAsp f 4基因，编码区1..861；10、GenBank Accession Number AJ001732，855bp mRNA烟曲霉过敏原rAspf 7基因，编码区1..339；11、GenBank Accession Number AJ224333，336bp mRNA烟曲霉过敏原rAsp f 8基因，编码区1..336；12、GenBank Accession NumberAJ223327，906bp mRNA烟曲霉过敏原rAsp f 9基因，编码区1..906；13、GenBankAccession Number AJ006689，675bp mRNA烟曲霉过敏原rAsp f 11基因，编码区1..537；14、GenBank Accession Number AJ937743，492bp mRNA烟曲霉过敏原cyclophilin基因(asp f 27)，编码区1..492；15、GenBank Accession NumberAJ937744，600bp mRNA烟曲霉过敏原thioredoxin基因(asp f 28)，编码区78..404；16、GenBank Accession Number AJ937745，582bp mRNA烟曲霉过敏原thioredoxin基因(asp f 29)，编码区116..448；17、GenBank Accession Number AF282850，927bp mRNA欧洲白桦黄酮素还原酶(Betula pendula isoflavone reductase)-likeprotein Bet v 6.0102基因(BETV6.0102)，编码区1..927；18、GenBank AccessionNumber AF135127，900bp mRNA欧洲白桦异黄酮素还原酶-homolog Bet v 6.0101基因(BETV6)，编码区1..900；19、GenBank Accession Number BGU40767，601bp mRNA德国小蠊(Blattella germanica)过敏原基因Bla g 4，编码区1..550；20、GenBankAccession Number BGU92412，1140bp mRNA德国小蠊过敏原基因Bla g 5，编码区1..605；21、GenBank Accession Number BGU28863，1317bp mRNA德国小蠊半胱氨酸蛋白酶前体(aspartic protease precursor)过敏原基因，编码区3..1061；22、GenBank Accession Number AF072219，1429bp mRNA德国小蠊主要过敏原基因，克隆1(Bla g 1.0101)，编码区1..1239；23、GenBank Accession Number AF072221，715bp mRNA德国小蠊主要过敏原基因，克隆2(Bla g 1.0101)，编码区1..569；24、GenBank Accession Number AF072220，1791bp mRNA德国小蠊主要过敏原基因Bla g1.02，编码区1..1479；25、GenBank Accession Number AY283288，423bp mRNA粉尘螨(Dermatophagoides farinae)Der f 2过敏原基因，编码区1..423；26、GenBankAccession Number AY947536，650bp mRNA户尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)Der Der-p1过敏原基因，编码区1..650；27、GenBank AccessionNumber X63517，579bp mRNA大麦(H.vulgare)Iam1-单体a-淀粉酶抑制物(monomeric alpha-amylase inhibitor)基因，编码区1..441；28、GenBankAccession Number AJ243504，1215bp mRNA黑麦草(Lolium perenne)花粉过敏原(5C)基因，编码区1..906；29、GenBank Accession Number AJ937746，318bp mRNA合轴马拉色菌(Malassezia sympodialis)硫氧还蛋白(thioredoxin，mala s 13 gene)基因，编码区1..318；30、GenBank Accession Number AF072222，870bp mRNA美洲大蠊(Periplaneta americana)主要过敏原(Per a l.0101)基因，编码区1..698；31、GenBank Accession Number AF106961，1325bp mRNA美洲大蠊(Periplanetaamericana)原肌球蛋白基因(tropomyosin)，编码区70..924；32、GenBank AccessionNumber AF082515，1505bp mRNA红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)过敏原基因(Trir 2)，编码区41..1279；33、GenBank Accession Number AF082514，2325bp mRNA红色毛癣菌过敏原基因(Tri r 4)，编码区77..2257；34、GenBank Accession NumberAF082514，2325bp mRNA红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)过敏原基因(Tri r 4)，编码区77..2257；35、核苷酸序列如序列表中序列2所示的尘螨Der p1基因。
序列表中序列2所示的尘螨Der p1基因，其编码序列是自序列2的5′端第1至963位脱氧核糖核苷酸。
所述预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗，优选为由造成过敏性哮喘的蛋白抗原和在多克隆位点插入所述造成过敏性哮喘的蛋白抗原编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物。
在共免疫组合物中，也可以采用过敏性哮喘自身蛋白抗原和在多克隆位点插入所述过敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物。此混合物同样可以产生调节性T细胞而抑制过敏性哮喘发生。
同样，也可以采用过敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位点插入所述过敏性哮喘自身蛋白抗原编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物。此混合物同样可以产生调节性T细胞而抑制过敏性哮喘发生。
采用以上两种混合物免疫产生的效果与过敏性哮喘自身蛋白抗原和在多克隆位点插入所述过敏性哮喘自身蛋白抗原编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物产生的效果相同。
所述造成过敏性哮喘的蛋白抗原优选为氨基酸序列如序列表中序列1所示的尘螨Der p1。所述造成过敏性哮喘的蛋白抗原编码基因优选为核苷酸序列如序列表中序列2所示的尘螨Der p1基因。
用于插入所述过敏性哮喘自身蛋白抗原编码基因或所述过敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽编码基因的真核细胞表达载体可为哺乳动物细胞表达载体，如pcDNA3.0或pVAX1或provax(涂亦娴，金华利，张馨玉，杨若耶，杨富，张富春，王宾。猪瘟病毒E2基因真核表达载体表达效率和免疫效果的比较。中国农业大学学报，2005，10(6)：37-41)。
所述预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗的活性成分具体可为氨基酸序列如序列表中序列1所示的尘螨Der p1和pVAX-Der p1。
所述预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗的活性成分具体还可为pep323和pD323。
所述预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗的活性成分中，1)过敏性哮喘自身蛋白抗原和在多克隆位点插入所述过敏性哮喘自身蛋白抗原编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶5-5∶1；优选为1∶1-1∶2；
2)过敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位点插入所述过敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶5-5∶1；优选为1∶1-1∶2；
3)过敏性哮喘自身蛋白抗原和在多克隆位点插入所述过敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶5-5∶1；优选为1∶1-1∶2；
4)过敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位点插入所述过敏性哮喘自身蛋白抗原编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶5-5∶1；优选为1∶1-1∶2。
所述预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
所述预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗的用量一般为200ug-10mg活性成分/kg体重/次，每7-30天给药一次，一般共需2-5次。
实验证明OVA抗原表位多肽pep323和在多克隆位点插入pep323编码基因的重组真核细胞表达载pD323组成的混合物可抑制免疫小鼠的T细胞增殖，诱导免疫抑制的产生，并能够有效地预防和/或治疗由OVA蛋白诱导产生的过敏性哮喘的发生。由于外界过敏原多是蛋白质，而导致哮喘的过敏原多数为吸入性，所以支气管哮喘动物模型的制作多采用过敏原致敏后，再经气道给予变应原诱发哮喘发生。制作过敏性哮喘动物模型的过敏原主要有卵蛋白(ovalbumin，OVA)、蛔虫卵、尘螨、豚草花粉、真菌孢子、蟑螂以及某些职业性致喘物质。所以国际上利用OVA(鸡卵蛋白，gradeV，Sigma公司)在小鼠体内进行致敏和激发，再在气管处诱导哮喘发生作为代表性可重复的哮喘动物模型用于评价哮喘的预防和治疗效果(Current Protocols inImmunology；支气管哮喘动物模型的研究状况http://www.biantaifanying.cn/News/news_detail.asp？id＝83)。本发明利用OVA过敏原中的抗原表位的pep323和pD323联合免疫抑制OVA过敏源诱发的哮喘，同样也能得出由其它过敏源蛋白造成过敏性哮喘的蛋白抗原或其表位多肽和在多克隆位点插入所述造成过敏性哮喘的蛋白抗原或其表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物也可抑制哮喘。
附图说明
图1a为各组小鼠肺组织灌洗液中细胞总数、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞的计数结果
图1b为各组小鼠肺组织灌洗液中细胞总数、嗜酸性粒细胞的计数结果
图2a为各组小鼠肺组织HE-20×染色照片
图2b为各组小鼠肺组织HE-40×染色照片
图2c为各组小鼠肺组织PAS-40×染色照片
图3a为各组小鼠血清中抗体的检测结果
图3b为各组小鼠血清中细胞因子的检测结果
图4a为各组小鼠的CD4+CD25+的T调节细胞数量
图4b为抗体注射后各组小鼠肺组织灌洗液中细胞总数、嗜酸性粒细胞的计数结果
图5a为流式细胞分析各免疫组小鼠的脾细胞、非T细胞、T细胞、CD4+、CD8+、CD4+CD25-T细胞对靶细胞扩增的抑制
图5b为pep323和pD323共免疫组以及pep323和pcDNA3.0共免疫组小鼠的嗜酸性粒细胞数比较
图6为pep323和pD323共免疫组以及pep323和pcDNA3.0共免疫组的CD4+CD25T调节细胞抑制OVA或BSA抗原免疫的T细胞增殖情况
图7a为流式细胞分析pep323和pD323共免疫组以及pep323和pcDNA3.0共免疫组的IL-10的表达情况
图7b为流式细胞分析pep323和pD323共免疫组以及pep323和pcDNA3.0共免疫组的IFN-γ的表达情况
图7c为流式细胞分析pep323和pD323共免疫组以及pep323和pcDNA3.0共免疫组的Foxp3的表达情况
图7d为流式细胞分析pep323和pD323共免疫组以及pep323和pcDNA3.0共免疫组的IL-4的表达情况
图7e为RT-PCR检测pep323和pD323共免疫组以及pep323和pcDNA3.0共免疫组小鼠免疫后7天的TGF-β的表达情况
图8为流式细胞分析IL-10和TGF-β两种细胞因子体外参与CD4+CD25-T调节细胞的调解功能情况的结果
图9为流式细胞分析IL-10和TGF-β两种细胞因子体内参与CD4+CD25-T调节细胞的调解功能情况的结果
具体实施方式
实施例1、pep323和pD323联合免疫抑制哮喘
实验方法
实验动物：雌性BALB/c小鼠(8-10周龄)购自中国医学科学院实验动物研究所。D011.10小鼠(8-10周龄)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(SLAC)。
中和抗体：实验中所用的各种中和抗体，包括anti-CD25，anti-CD4，anti-IL-10，anti-IFN-γ，anti-TGF-β及anti-IL-4，anti-IL-2均由购自ATCC(Manassas，VA，USA)的杂交瘤细胞培养获得。
一、实验方法
1、哮喘模型诱导：将OVA(Sigma，USA；1mg/ml溶于PBS)作为过敏抗原与等体积的10％的铝盐(Sigma，USA)混合，室温条件下震荡混合2小时。经过750×g5min的离心，弃上清并用去离子水将OVA/铝的复合物重新悬浮使其浓度为1mg/ml。第0天时，每只雌性BALB/c小鼠(8-10周龄)腹腔注射100μl OVA/铝复合物，第8，14，16和18天，分别利用100μg/100μl OVA(溶于PBS)经过气管注入小鼠的肺组织，进行哮喘模型的诱导。
2、疫苗的制备：合成肽疫苗是将OVA抗原的323-339位肽段(氨基酸序列是KISQAVHAAHAEINEAG)在体外合成并与不完全弗氏佐剂乳化而得到，命名为pep323；核酸疫苗是将表达此肽段的cDNA克隆至真核表达载体并命名为pD323；最后是载体对照pcDNA3.0(Invitrogen公司)。
其中，pD323的构建方法如下：将编码OVA抗原的323-339位肽段的DNA序列(AAGATATCTCAAGCTGTCCATGCAGCACATGCAGAAATCAATGAAGCAGGC)由北京奥科公司体外合成，其上下游序列分别加入HindII和BamHI的酶切位点，然后将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0的HindIII和BamHI多克隆位点内，得到的重组载体命名为pD323。
3、疫苗免疫：在诱导小鼠哮喘前，小鼠被分组并分别肌肉注射pep323(100μl/100μg/只)，pD323(100μl/100μg/只)，pep323+pD323，pep323+pcDNA3，每组6只小鼠，在-15天(诱导前15天)和-5天(诱导前5天)分别注射两次；在剂量实验中，不同剂量的核酸疫苗pD323将会与固定剂量的pep323混合后免疫，具体剂量在结果图中显示。具体免疫方法如下：
将72只雌性BALB/c小鼠(8-10周龄)，均分为12组，每组6只小鼠，第1组为对照组，只在第0天时，每只小鼠腹腔注射100μl OVA/铝复合物。第2组为模型组，按照步骤1的方法进行哮喘模型诱导。第3组为pD323免疫组，共肌肉注射免疫两次，第一次免疫后10天，再加强一次，每次每只分别免疫含100微克pD323的0.9％NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步骤1的方法进行哮喘模型诱导。第4组为pep323免疫组，共肌肉注射免疫两次，第一次免疫后10天，再加强一次，每次每只分别免疫含100微克pep323的0.9％NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步骤1的方法进行哮喘模型诱导。第5组为pcDNA3.0和pep323共免疫组(V+P或V+Pep)，共肌肉注射免疫两次，第一次免疫后10天，再加强一次，每次每只分别免疫含100微克pep323和100微克pcDNA3.0的0.9％NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步骤1的方法进行哮喘模型诱导。第6组为pep323和pD323共免疫组(pD323+pep323、D+P或D+Pep)，共肌肉注射免疫两次，第一次免疫后10天，再加强一次，每次每只分别免疫含100微克pep323和100微克pD323的0.9％NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步骤1的方法进行哮喘模型诱导。第7组为pep323和pD323(4∶1)共免疫组，共肌肉注射免疫两次，第一次免疫后10天，再加强一次，每次每只分别免疫含100微克pep323和25微克pD323的0.9％NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步骤1的方法进行哮喘模型诱导。第8组为pep323和pD323(2∶1)共免疫组，共肌肉注射免疫两次，第一次免疫后10天，再加强一次，每次每只分别免疫含100微克pep323和50微克pD323的0.9％NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步骤1的方法进行哮喘模型诱导。第9组为pep323和pD323(1∶1)共免疫组，共肌肉注射免疫两次，第一次免疫后10天，再加强一次，每次每只分别免疫含100微克pep323和100微克pD323的0.9％NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步骤1的方法进行哮喘模型诱导。第10组为pep323和pD323(1∶2)共免疫组，共肌肉注射免疫两次，第一次免疫后10天，再加强一次，每次每只分别免疫含100微克pep323和200微克pD323的0.9％NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步骤1的方法进行哮喘模型诱导。第11组为pep323和pD323(1∶4)共免疫组，共肌肉注射免疫两次，第一次免疫后10天，再加强一次，每次每只分别免疫含100微克pep323和400微克pD323的0.9％NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步骤1的方法进行哮喘模型诱导。第12组为pcDNA3.0和pep323(1∶2)共免疫组，共肌肉注射免疫两次，第一次免疫后10天，再加强一次，每次每只分别免疫含100微克pep323和200微克pcDNA3.0的0.9％NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步骤1的方法进行哮喘模型诱导。
4、抗体中和：有些实验中，为了在体内中和细胞因子的功能，在小鼠前两次气管注入OVA的同时，将被静脉注射50μg的中和抗体(包括抗IL-10和TGF-β)。
5、肺组织灌洗液中细胞数的测定：在最后一次OVA抗原灌肺后24h，小鼠被麻醉致死。由喉部手术剥离其气管，用0.8ml生理盐水经气管注入并反复灌洗肺组织3-5次。收集灌洗液，离心并重悬于100ml含有0.1％BSA的生理盐水中。细胞经瑞士-吉木萨染液染色后分别进行细胞总数、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞的计数。
6、组织学检测：在最后一次OVA抗原灌肺后24h，小鼠被麻醉致死。取小鼠的肺组织进行固定、包埋和切片。分别进行H&E(hematoxylin for evaluation)染色和PAS(periodic acid-Schiff)染色。
7、抗体检测：在最后一次OVA抗原灌肺后5天，分离小鼠抗血清。利用ELISA方法检测血清中OVA抗原特异性的IgG1、IgG2a和IgE抗体水平。其中，用于包被的抗原为OVA(Sigma，USA)，1mg/ml溶于PBS；一抗为分离的血清，二抗分别为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG1、IgG2a和IgE(这些二抗均购自Sigma公司)。
8、RT-PCR：在最后一次OVA抗原灌肺后24小时，收集小鼠肺组织灌洗液并离心得到总细胞，利用TRIzol reagent(Promega，USA)提取细胞总RNA，经反转录，并利用特异性异物PCR扩增HPRT，以及IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13和TGF-β等细胞因子。其中，用持家基因次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)为内源表达标准，将各组cDNA浓度调为一致。凝胶电泳检测各种细胞因子的变化。
PCR反应条件和引物序列见表1。
表1.PCR引物
  靶基因   引物   PCR反应参数
HPRT   5’-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG，3’-GAGGGTAGGCTGGCCTATGGCT   94℃30s，60℃30s和72℃40s，共30个循环
IL-2   5’-TCCACTTCAAGCTCTACAG，3’-GAGTCAAATCCAGAACATGCC   94℃30s，55℃30s和72℃40s，共30个循环
IFN-γ   5’-CATTGAAAGCCTAGAAAGTCTG，3’-CTCATGGAATGCATCCTTTTTCG   94℃30s，58℃30s和72℃40s，共30个循环
IL-4   5’-GAAAGAGACCTTGACACAGCTG，3’-GAACTCTTGCAGGTAATCCAGG   94℃30s，54℃30s和72℃40s，共30个循环
IL-5   5’-GACAAGCAATGAGACACGATGAGG3’-GAACTCTGCAGGTAATCCAGG   94℃30s，52℃30s和72℃40s，共30个循环
IL-13   5’-CTCCCTCTGACCCTTAAGGAG3’-GAAGGGGCCGTGGCGAAA   94℃30s，55℃30s和72℃40s，共30个循环
TGF-β   5’-CCTCCCCCATGCCGCCCTCG3’-CCAGGAATTGTTGCTATATTTCTG   94℃30s，52℃30s和72℃40s，共30个循环
二、实验结果
(一)pep323和pD323联合免疫抑制哮喘的发生
根据参考文献的方法，BALB/c小鼠被OVA抗原免疫和肺刺激后能诱导小鼠的哮喘模型。而哮喘发生的症状之一就是肺部会有大量炎症细胞的浸润。如图1a中第2组(模型组)和2a、2b和2c中的模型组所示，模型组的小鼠肺组织灌洗液中存在大量的炎症细胞，包括嗜酸性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。同时与哮喘相关的其它指标也进行了检测，如血清中IgE和IgG1的水平与对照相比在模型组也有了显著的提高(图3a)，及浸润细胞表达较高水平的Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13(图3b)。这些结果都说明成功的诱导了小鼠哮喘模型。图1a、1b、3a、3b、4b、5b、6和9中，“+”表示添加了该物质或进行了该项处理或，“-”表示未添加该物质或未进行该项处理；OVA sensitized表示第0天时，每只小鼠腹腔注射100μlOVA/铝复合物；OVA challenge表示第8，14，16和18天，分别利用100μg/100μlOVA(溶于PBS)经过气管注入小鼠的肺组织。
为了用联合免疫的方法对哮喘疾病进行免疫治疗，将表达OVA抗原表位323-339的核酸疫苗pD323与其对应的体外合成的肽pep323进行共免疫，而单独免疫作为对照。结果证明，第6组即pep323和pD323共免疫组(D+P)的肺组织炎症细胞浸润与模型组(第2组)相比有了显著的降低(图1a和图2a至c)，血清中IgE和IgG1的水平与模型组相比，也有了显著的降低(图3a)，侵润细胞表达较低水平的Th2型细胞因子(图3b)。然而，单独免疫pD323(第3组)或者pep323(第4组)的两组不能抑制哮喘的这些疾病指标。说明只有共免疫才能抑制哮喘的发生。此外，将载体pcDNA3与pep323共免疫(第5组)后也不能抑制哮喘的发生。说明混合免疫的效果并不是由于载体上的CpG序列造成的。
(二)pep323和pD323联合免疫的剂量
在证明了pD323与pep323共免疫能抑制哮喘的发生后，比较了共免疫的剂量变化对抑制效果的影响。核酸疫苗pD323的剂量分为25、50、100、200和400μg/只，而肽疫苗pep323的剂量固定为100μg/只。结果证明当pD323的剂量达到或超过100μg/只时，才能显著抑制肺组织炎症细胞浸润(图1b)。而pD323的剂量为25μg/只和50μg/只时不能抑制炎症细胞侵润。说明pep323和pD323联合免疫的抑制效果有明显的剂量依赖性。
(三)CD4+CD25+T调节细胞不参与联合免疫的抑制
为了证明调节性T细胞是否参与联合免疫的抑制现象，首先分析CD4+CD25+的天然T调节细胞。
将30只雌性BALB/c小鼠(8-10周龄)，均分为5组，即第13组至17组，每组6只小鼠，第13组为正常组，共肌肉注射免疫两次，第一次免疫后10天，再加强一次，每次每只分别免疫0.9％NaCl水溶液100微升；第14组为pD323免疫对照组，共肌肉注射免疫两次，第一次免疫后10天，再加强一次，每次每只分别免疫含100微克pD323的0.9％NaCl水溶液100微升。第15组为pep323免疫对照组，共肌肉注射免疫两次，第一次免疫后10天，再加强一次，每次每只分别免疫含100微克pep323的0.9％NaCl水溶液100微升。第16组为pep323和pcDNA3.0共免疫对照组，共肌肉注射免疫两次，第一次免疫后10天，再加强一次，每次每只分别免疫含100微克pep323和100微克pcDNA3.0的0.9％NaCl水溶液100微升。第17组为pep323和pep323共免疫对照组，共肌肉注射免疫两次，第一次免疫后10天，再加强一次，每次每只分别免疫含100微克pep323和100微克pep323的0.9％NaCl水溶液100微升。
小鼠被联合免疫和单独免疫处理后，取其脾脏细胞进行CD4+CD25+的荧光抗体染色及流式细胞检测，小鼠在免疫后21天处死，制备脾脏单细胞悬液，加入2ml红细胞裂解液溶解红细胞，细胞进行计数；根据细胞数量加入适量的OVA抗原和CD28抗体，刺激过夜；第二天加蛋白质转运抑制剂monensin(2μmol/L)，以阻止细胞因子分泌至细胞外。混匀后，37℃、5％CO2培养2h。然后抗Fc抗体封闭(用量见试剂说明书，eBioscience公司)，封闭30分钟；加入2-3ml洗液，充分混匀，2000rpm离心5分钟，弃去上清，各管加入适量的抗CD4和CD25的荧光标记单克隆抗体(用量见试剂说明书，eBioscience公司)，室温避光反应30分钟；加入2-3mL洗液，充分混匀，2000rpm离心5分钟，弃去上清，各管加入300μL洗液重悬细胞；上流式细胞仪分析。结果证明pep323和pD323联合免疫的小鼠与其他对照组相比，其CD4+CD25+的T细胞数量无显著差异(图4a)。
为了进一步的分析CD4+CD25+的T调节细胞是否参与共免疫的抑制现象，小鼠被共免疫处理和模型诱导的同时，anti-CD25的抗体被静脉注射至第2、5和6组小鼠的体内清除体内的CD4+CD25+的T调节细胞，注射剂量为20μg/只。同时一同型对照抗体IgG1作为对照，注射剂量为20μg/只。按照步骤一中5的方法进行肺组织灌洗液中细胞数的测定。结果证明，CD4+CD25+的T调节细胞被清除的情况下，pep323和pD323共免疫的抑制现象仍然存在(图4b)。说明共免疫的抑制显现并不是依靠CD4+CD25+的T调节细胞来实现的。
(四)CD4+CD25-T细胞参与联合免疫的抑制
为了进一步的分析调节T细胞是否参与共免疫的抑制现象及其细胞类型。利用体外的T细胞增殖实验。
1、DC细胞培养：DC细胞是由小鼠的骨髓细胞体外培养而得到。雌性BALB/c小鼠(8-10周龄)被麻醉致死，无菌条件下由其腿骨中分离出骨髓细胞，以RPMI-1640培养基(Gibco，Eggenstein，Germany)调整细胞浓度至5×106个/ml，同时加入10％(体积比)胎牛血清和20ng/ml鼠源GM-CSF体外培养6-8天。之后，用CD11c+磁珠进行分选从而得到纯化的DC细胞。
2、T细胞、CD4+、CD8+、CD4+CD25-T细胞的分离
根据调节T细胞分离试剂盒(美国R&D公司)说明书，利用阴性选择并得到纯化的CD4+，CD4+CD25-T细胞。总T细胞的纯化方法如下：取小鼠脾脏细胞去除红细胞后制成单细胞悬液，尼龙柱过滤后得到T细胞。CD8+T细胞的纯化如下：得到总T细胞后，调整细胞浓度为1×107cells/ml；加入适量的抗小鼠的CD4抗体(eBioscience公司)，在2-8℃冰箱孵育30分钟；加入适量的兔补体(Sigma公司)，轻轻混匀，在37℃冰箱孵育30分钟；加入PBS，轻轻混匀，2000rpm 5分钟，重选细胞；重复步骤2-4，最后重选细胞即为CD8+细胞流式细胞仪分析纯度＞85％。
调节T细胞抑制功能：为了检测调节细胞的抑制功能，选择DO11.10小鼠的CD4+T(5×105个)细胞经绿色荧光染料CFSE染色后作为靶细胞；选择免疫小鼠的CD4+CD25T细胞(1×105个)作为调节性T细胞；选择体外培养的DC细胞(1×105个)作为抗原递呈细胞。将3种细胞置于48孔培养板共培养，并用OVA抗原(20μg/ml)体外刺激48小时，利用流式细胞仪对靶细胞的增殖情况进行检测，从而判断调节性T细胞的抑制功能。
DO11.10小鼠的CD4+T细胞被分离出来并以荧光染料CFSE染色作为靶细胞，在体外被抗原递呈细胞(DC)和OVA抗原刺激下会发生抗原专一性的扩增现象。其扩增情况被流式细胞分析后表现为CFSE荧光强度的降低，如图5a所示。在该培养液中同时加入来自对照组(第1组)、模型组(第2组)、pD323免疫组(第3组)、pep323免疫组(第4组)，pep323和pcDNA3.0共免疫组(第5组，V+P)，或pep323和pD323共免疫组(第6组)小鼠的脾脏细胞(1×105个)，结果如图5a所示，当在培养液中同时加入来pep323和pD323共免疫组(第6组)小鼠的脾脏细胞时，这种扩增被显著的抑制了，说明pep323和pD323共免疫组(第6组，D+P)小鼠的脾脏细胞中有调节功能的细胞。其他组均未出现抑制现象(图5a)。为了进一步的分析调节细胞的分型情况，将脾脏细胞中的T细胞、CD4+、CD8+、CD4+CD25-T细胞分别分离出来加入培养液中与靶细胞共同培养，结果发现pep323和pD323共免疫组(第6组，D+P)的CD4+CD25-T细胞能显著的抑制靶细胞的扩增，说明pep323和pD323共免疫组(第6组，D+P)诱导的抑制现象是由CD4+CD25-T细胞参与的。图5a中的百分数为DO11.10小鼠CD4T细胞增殖的比例。图5a中，Non-T Cell为非T细胞，百分数为增殖细胞占总细胞的百分比。
为了进一步在体内证明CD4+CD25-T细胞参与共免疫的抑制功能，将pep323和pD323共免疫组(第6组，D+P)和pep323和pcDNA3.0共免疫组(第5组，V+P)小鼠脾脏中CD4+CD25-T细胞分离出，并过继转移到OVA抗原处理的小鼠体内。其中，CD4+CD25-T细胞分离和过继转移方法如下：小鼠经麻醉致死，无菌制备其脾脏单细胞悬液，利用调节T细胞分离试剂盒(R&D Systems，Inc.，USA)纯化其中的CD4+CD25-T细胞，纯度达到96-98％。得到的CD4+CD25-T细胞经静脉注射的方式过继转移至同系的小鼠雌性BALB/c小鼠(8-10周龄)体内，转移的数量分别为2×105、1×106、5×106个细胞/只。结果证明CD4+CD25-T细胞的过继转移显著的抑制了小鼠的哮喘发病(图5b)。说明pep323和pD323共免疫抑制哮喘的现象是由于诱导产生了有调节功能的CD4+CD25-T细胞造成的。
3、CD4+CD25-T调节细胞具有抗原专一性抑制功能
为了分析共免疫诱导产生的CD4+CD25-T调节细胞抑制功能是否具有抗原专一性特点。将CD4+CD25-T调节细胞由pep323和pD323共免疫组(第6组，D+P)或pep323和pcDNA3.0共免疫组(第5组，V+P)的小鼠中分离后过继转移至被OVA抗原(100μg/只)或BSA抗原(100μg/只)免疫的同系小鼠雌性BALB/c小鼠(8-10周龄)体内，然后分离后者的脾脏T细胞进行体外扩增实验，具体方法为：在无菌条件下，取脾制成单个细胞悬液，用红细胞裂解液去除红细胞，然后用PBS液洗三次，离心并进行细胞计数，调整细胞浓度到1×106个/ml，将每组细胞悬液分4份加入96孔培养板中。其中一份加入100μl Con A(有丝分裂原)至终浓度为5μg/ml，一份加入相应的特异性抗原(OVA抗原)作为刺激物至终浓度为5μg/ml，一份不加刺激物，一份加入100μl BSA至终浓度为2μg/ml作为无关抗原，37℃，CO2培养箱孵育48h后，每孔加入100μl MTS至终浓度为5mg/ml，孵育4h后，在酶标仪上读取492nm处的OD值，计算刺激指数(SI＝实验OD÷非刺激OD)。结果如图6所示，证明过继转移pep323和pD323共免疫组(第6组，D+P)的CD4+CD25-T调节细胞只能专一性的抑制OVA抗原免疫的T细胞增殖，而不能抑制BSA抗原免疫的T细胞增殖反应(图6)。
4、CD4+CD25-T调节细胞细胞因子表达分析
为了分析pep323和pD323共免疫组(第6组，D+Pep)诱导产生的CD4+CD25-T调节细胞是否表达与调节功能相关的细胞因子。pep323和pD323共免疫组(第6组，D+Pep)以及pep323和pcDNA3.0共免疫组(第5组，V+Pep)小鼠被共免疫处理后不同时间(1、3、7、14天)分离其脾脏中CD4+CD25-T细胞，并进行胞内细胞因子染色和流式检测。具体方法如下：为了检测细胞表面分子及胞内细胞因子水平的变化，采用流式细胞结合荧光抗体技术。首先制备脾脏细胞的单细胞悬液，anti-Fc抗体对细胞表面的Fc受体进行封闭；其次，PBS洗涤后直接进行细胞表面分子如CD4和CD25的染色；再次，当需胞内细胞因子的染色时，脾脏细胞经ConA和anti-CD28单抗共同刺激过夜，再经4％多聚甲醛固定及0.1％的皂素处理破膜，用荧光标记抗体对细胞进行染色。最后，染色后的细胞进行流式细胞检测及软件分析数据。(美国eBioscience公司)
结果发现与pep323和pcDNA3.0共免疫组(第5组，V+Pep)相比，pep323和pD323共免疫组(第6组，D+Pep)表达较高水平的IL-10(图7a)、IFN-γ(图7b)、FoxP3(图7c)、和TGF-β(图7e)。IL-10、TGF-β、和FoxP3已被之前的研究证明与调节功能相关。说明共免疫诱导产生的CD4+CD25-T调节细胞能够表达高水平的调解功能相关的细胞因子。图7a-7d中的百分数为各种细胞因子表达的比例。图7e中，1、2、3分别表示第1、5、6各组分离得到的CD4+CD25-T细胞中TGF-β的RT-PCR结果。
5、IL-10和TGF-β在体外参与CD4+CD25-T调节细胞的抑制功能
为了进一步的分析在调解性T细胞中表达的IL-10和TGF-β是否与影响或参与其调解功能。还是选择体外的T细胞增殖实验。
为了检测调节细胞的抑制功能，选择DO11.10小鼠的CD4+T(5×105个)细胞经绿色荧光染料CFSE染色后作为靶细胞；选择pep323和pcDNA3.0共免疫组(第5组，V+P)，pep323和pD323共免疫组(第6组，D+P)免疫小鼠的CD4+CD25-T细胞(1×105个)作为调节性T细胞；选择体外培养的DC细胞(1×105个)作为抗原递呈细胞。将3种细胞置于48孔培养板共培养，并用OVA抗原(20μg/ml)体外刺激48小时，在刺激的同时，在培养体系中加入anti-IL-10(终浓度为5μg/ml)、或anti-IFN-γ(终浓度为5μg/ml)、或anti-TGF-β(终浓度为5μg/ml)的抗体或anti-IL-10(终浓度为5μg/ml)和anti-TGF-β(终浓度为5μg/ml)抗体。同时设未加入抗体的对照，同型对照IgG1抗体对照。利用流式细胞仪对靶细胞的增殖情况进行检测，从而判断调节性T细胞的抑制功能。结果表明，加入IL-10或TGF-β的抗体能显著的打破CD4+CD25-T调节细胞的抑制功能(图8)。说明IL-10和TGF-β两种细胞因子确参与CD4+CD25-T调节细胞的调解功能。图8中的百分数为DO11.10小鼠CD4T细胞增殖的比例。
6、IL-10和TGF-β在体内参与CD4+CD25-T调节细胞的抑制功能
为了进一步的在体内证明IL-10和TGF-β是否CD4+CD25-T调节细胞的抑制功能，将pep323和pcDNA3.0共免疫组(第5组，V+P)，pep323和pD323共免疫组(第6组，D+P)的小鼠脾脏中CD4+CD25-T细胞分离出，并以5×106个/只过继转移到OVA抗原处理的雌性BALB/c小鼠(8-10周龄)体内，同时将anti-IL-10(5μg/ml/只)、或anti-TGF-β(5μg/ml/只)的抗体或anti-IL-10(5μg/ml/只)和anti-TGF-β(5μg/ml/只)抗体注射入小鼠的体内。同时设同型对照IgG1抗体对照。结果表明anti-IL-10和anti-TGF-β抗体的注射能打破调解性T细胞的抑制作用(图9)。进一步的肯定了IL-10和TGF-β两种细胞因子确参与CD4+CD25-T调节细胞的调解功能。
实施例2、Der p1蛋白和pVAX-Der p1联合免疫抑制哮喘
一、Der p1的分子克隆
(1)Der p1的cDNA序列的获得
设计用重叠片段PCR的方法获得全序列。Der p1的cDNA如序列表中序列1所示。Der p1的全长cDNA为963bp，其中只有一个EcoR I和两个HindIII酶切位点，前者位于221位，后两者分别处于252位和681位，因此根据HindIII位点，先用重叠片段PCR得到Der p1的三个片段。
片段一：为序列1的自5′端第1-260位，引物如下，每条引物为50bp，之间重叠的部分为20bp。
FDerp1：atgaaaattgttttggccatcgcctcattgttggcattgagcgctgttta
FDerp2：TCAAAAGTTTTGATCGATGATGGACGAGCATAAACAGCGCTCAATGCCAA
FDerp3：tcatcgatcaaaacttttgaagaatacaaaaaagccttcaacaaaagtta
FDerp4：CGGGCAGCTTCTTCATCTTCGAAGGTAGCATAACTTTTGTTGAAGGCTTT
FDerp5：gaagatgaagaagctgcccgtaaaaactttttggaatcagtaaaatatgt
FDerp6：AAATGGTTGATGGCACCTCCATTTGATTGAACATATTTTACTGATTCCAA
FDerp7：ggaggtgccatcaaccatttgtccgatttgtcgttggatgaattcaaaaa
FDerp8：TCAAAAGCTTCTGCACTCATCAAAAATCGGTTTTTGAATTCATCCAACGA
PCR体系：FDerp1，FDerp2，FDerp3，FDerp4，FDerp5，FDerp6，FDerp7，FDerp8这8个引物各取2μl(每个引物的浓度均为25uM)，在EP管中混合均匀，取2μl作为模板；加FDerp1和FDerp8各0.5μl(FDerp1和FDerp8的浓度均为25uM)作为上下游引物；在PCR体系中加入2.5ul的10×PCRbuffer(购于科昊泽公司)；加入dNTP(2mM)2.5ul；最后加ddH2O补齐体系至25ul。
重叠序列PCR条件：94℃3min；94℃40s，50℃40s，72℃40s进行30个循环；72℃10min.
取第一次的PCR产物2μl，再加FDerp1和FDerp8各0.5μl(FDerp1和FDerp8的浓度均为25uM)作为上下游引物，再进行一次以上条件的PCR。
取第二次的PCR产物2μl，再加FDerp1和FDerp8各0.5μl(FDerp1和FDerp8的浓度均为25uM)作为上下游引物，再进行一次以上条件的PCR，得到最终的产物。
片段二：为序列1的自5′端第240-690位，引物如下，重叠规则如上
FDerp9：atgagtgcagaagcttttgaacacctcaaaactcaattcgatttgaatgc
FDer p10：TTTCCATTGATACTGCAGGCGTTAGTTTCAGCATTCAAATCGAATTGAGT
FDer p11：gcctgcagtatcaatggaaatgctccagctgaaatcgatttgcgacaaat
FDer p12：CCTTGCATACGAATGGGAGTGACAGTTCGCATTTGTCGCAAATCGATTTC
FDer p13：actcccattcgtatgcaaggaggctgtggttcatgttgggctttctctgg
FDer p14：GCCAAATAAGCTGATTCAGTTGCGGCAACACCAGAGAAAGCCCAACATGA
FDer p15：actgaatcagcttatttggcttaccgtaatcaatcattggatcttgctga
FDer p16：TGTTGGGAAGCACAATCGACTAATTCTTGTTCAGCAAGATCCAATGATTG
FDer p17：gtcgattgtgcttcccaacacggttgtcatggtgataccattccacgtgg
FDer p18：ACGACACCATTATGTTGGATGTATTCAATACCACGTGGAATGGTATCACC
FDer p19：atccaacataatggtgtcgtccaagaaagctactatcgatacgttgcacg
FDerp20：TGTGCATTTGGTCGTCGGCATGATTGTTCTCGTGCAACGTATCGATAGTA
FDerp21：tgccgacgaccaaatgcacaacgtttcggtatctcaaactattgccaaat
FDerp22：AGCCAAAGCTTCACGAATTTTGTTTACATTTGGTGGGTAAATTTGGCAATAGTTTGAGAT
PCR体系：以上的引物FDerp9，FDerp10，FDerp11，FDerp12，FDerp13，FDerp14，FDerp15，FDerp16，FDerp17，FDerp18，FDerp19，FDerp20，FDerp21，FDerp22这14个引物各取2μl(每个引物的浓度均为25uM)，在EP管中混合均匀，取2μl作为模板，加FDerp9和FDerp22(浓度均为25uM)各0.5μl作为上下游引物，在PCR体系中加入2.5ul的10×PCR buffer(购于科昊泽公司)；加入dNTP(2mM)2.5ul；最后加ddH2O补齐体系至25ul。
Overlap PCR条件：94℃3min；94℃40s，50℃40s，72℃40s进行30个循环；72℃10min。
取第一次的PCR产物2μl，再加FDerp9和FDerp22(浓度均为25uM)各0.5μl作为上下游引物，再进行一次以上条件的PCR。
取第二次的PCR产物2μl，再加FDerp9和FDerp22(浓度均为25uM)各0.5μl作为上下游引物，再进行一次以上条件的PCR，得到最终的产物。
片段三：为序列1的自5′端第670-963位，引物如下
FDerp23：aaattcgtgaagctttggctcaaacccacagcgctattgccgtcattatt
FDerp24：ATGACGGAATGCGTCTAAATCTTTGATGCCAATAATGACGGCAATAGCGC
FDerp25：atttagacgcattccgtcattatgatggccgaacaatcattcaacgcgat
FDerp26：GACAGCGTGATAGTTTGGTTGGTAACCATTATCGCGTTGAATGATTGTTC
FDerp27：aaccaaactatcacgctgtcaacattgttggttacagtaacgcacaaggt
FDerp28：CCAACTGTTTCGTACGATCCAATAATCGACACCTTGTGCGTTACTGTAAC
FDerp29：ggatcgtacgaaacagttgggataccaattggggtgataatggttacggt
FDerp30：CATCATCAAATCGATGTTGGCAGCAAAATAACCGTAACCATTATCACCCC
FDerp31：ccaacatcgatttgatgatgattgaagaatatccatatgttgtcattctctaa
FDerp32：TTAGAGAATGACAACATATGGAT
PCR体系：FDerp23，FDerp24，FDerp25，FDerp26，FDerp27，FDerp28，FDerp29，FDerp30，FDerp31，FDerp32这10个引物各取2μl(每个引物的浓度均为25uM)，在EP管中混合均匀，取2μl作为模板，加FDerp23和FDerp32(浓度均为25uM)各0.5μl作为上下游引物，在PCR体系中加入2.5ul的10×PCR buffer(购于科昊泽公司)；加入dNTP(2mM)2.5ul；最后加ddH2O补齐体系至25ul。
Overlap PCR条件：94℃3min；94℃40s，50℃40s，72℃40s进行30个循环；7210min.
取第一次的PCR产物2μl，再加FDerp23和FDerp32(浓度均为25uM)各0.5μl作为上下游引物，再进行一次以上条件的PCR。
取第二次的PCR产物2μl，再加FDerp23和FDerp32(浓度均为25uM)各0.5μl作为上下游引物，再进行一次以上条件的PCR，得到最终的产物。
在得到三个片段的正确片段后，再用重叠片段PCR方法，把三段连接起来，首先用PCR方法得到这三个片段，酶用pfu酶，PCR条件相同。
PCR条件：94℃3min；94℃40s，55℃40s，72℃40s进行30个循环；72℃10min。
连接PCR体系：各取片段一和片段三各1μl，取片段二2μl，作为模板，加FDerp1和FDerp32(浓度均为25uM)各0.5μl作为上下游引物。
Overlap PCR条件：94℃3min；94℃40s，50℃40s，72℃65s进行30个循环；72℃10min，得到963的全长cDNA序列。经过DNA测序，证明该片段的核苷酸序列是序列表中的序列1。
二、Der p1基因的克隆及亚克隆
(一)克隆Der p1基因入T载体
利用Takara公司PCR Fragment Recovery Kit按其说明书进行PCR产物的回收。回收的cDNA片段与pMD 18-T载体(购自Takara公司)在T4DNA连接酶的作用下16℃过夜，使PCR得到的Der p1基因连接到pMD 18-T的载体上。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，感受态细胞的制备及转化和质粒的提取按参考文献(Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(2nd ed).New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.19-56)。提取后的质粒用酶切BamH I和Sal I鉴定得到963bp左右的产物，再用BamH I和EcoRI鉴定插入的方向正确，将克隆基因自身携带的ATG靠近载体M13R(-48)通用引物的质粒命名为T-Der p1。然后将鉴定正确的菌落利用质粒提取后保存。
(二)Der p1蛋白的原核表达
为了使用Der p1蛋白用于诱导asthma模型和疫苗制备，将Der p1亚克隆到pET-28a原核表达载体上，表达制备Der p1原核蛋白，具体方法如下：
选用BamH I和Sal I分别酶切pET28a(+)(Novagen产品)载体和T-Der p1质粒，将Der p1连接到pET28a(+)后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，感受态细胞的制备及转化按参考文献(Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(2nd ed).New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.19-56)。将鉴定得到963bp左右的重组质粒(命名为pET28a-Der p1)，保存菌种。在IPTG诱导下表达原核体系中的Der p1，其条件为：
①重组质粒pET28a-Der p1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，挑取单克隆菌，37℃恒温摇床，220rpm/min，培养至A600＝0.5。
②在300mL LB培养基中加入3mL预培养的pET28a-Der p1菌液和300μL 50mg/mL卡那霉素，37℃恒温摇床，220rpm/min，培养至A600＝0.5。
③在培养液中加入600μL 0.5M IPTG，37℃恒温摇床诱导表达4h。
④培养液4℃，12000rpm，5min离心收集菌体，倒出上清，沉淀用Binding Buffer重悬。
①4℃超声破碎细胞20min。再4℃，12000rpm，5min离心收集沉淀。SDS PAGE检测后。-20℃冻存。
利用SDS PAGE电泳和Western检测(抗体用购买丹麦ALK公司的“安脱达”尘螨成虫的提取液，免疫兔子制备的多抗)证明其表达产物为Der p1抗原。(三)Derp1的真核表达
1.真核表达载体的构建：
设计引物时把真核表达的Kozak序列加到ATG前，其序列为GCCACCATGAAAATTGTTTTGGCCA，选用BamH I和Sal I分别酶切pVAX(Invitrogen公司产品)载体和T-Der p1质粒，将Der p1连接到pVAX得到重组质粒pVAX-Derp1。pVAX-Derp1转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(方法同上)，小提质粒并测序正确后保存菌种。
2.真核表达的鉴定：将pVAX-Derp1转染BHK细胞，转染后检测Der p1在真核细胞中的表达情况。用Der p1专一性引物进行的RT-PCR可以检测出963bp左右的表达产物和及超声破碎细胞后用Der p1多抗(兔抗)进行Western的方法检测出大约为65kd的蛋白质，确定为pVAX-Derp1可在真核中表达。
三、诱导Der p1哮喘模型
哮喘患者80％对尘螨过敏，尘螨是哮喘的重要过敏原，使用尘螨诱发的哮喘模型应能更好地反映哮喘特征。过敏原使用原核细胞表达的Der p1蛋白(DerpI，10ug，A1(OH)31mg)将C57BL/6小鼠皮下注射致敏，第14天鼻内滴入尘螨提取液(购买丹麦ALK公司的“安脱达”，其中含有48％Der p1，49％Derp2)激发，3天后可见起大小气道、肺泡大量EOS浸润，粘液栓形成，并与剂量相关，和血清IgE存在与否亦无关。DerpI诱喘作用同样可以被动转移，并证明气道炎症AHR由抗原特异性淋巴细胞介导，速发相气道反应则由血清中因子介导[FL van der Heijden，RJ Joost vanNeerven，M van Katwijk，JD Bos，and ML Kapsenberg.Serum-IgE-facilitatedallergen presentation in atopic disease.J.Immunol.，Apr 1993；150：3643.]。
(一)诱导哮喘模型实验设计
设计共六组：每组5只C57小鼠，6-8周龄，每只小鼠的诱导免疫方法如表2所示：
表2
                                                   皮试
组别    第一次诱导(0天)    第二次诱导(7天)    (8、10、12、14
                                                   天)
        50μg提取液+4mg    50μg提取液+4mg铝
A                                              50μg提取液
        铝佐剂             佐剂
B       4mg铝佐剂          4mg铝佐剂           51μg提取液
        50μg融合蛋白+     50μg融合蛋白+4mg
C                                              50μg融合蛋白
        4mg铝佐剂          铝佐剂
    50μg Der p1原核蛋    50μg Der p1原核蛋    50μg Der p1原
D
     白+4mg铝佐剂          白+4mg铝佐剂          核蛋白
E    Saline                Saline                50μg提取液
F    Saline                Saline                Saline
表2中，提取液为尘螨提取液(购买丹麦ALK公司的“安脱达”，其中含有48％Derp1，49％Derp2)；融合蛋白为上述步骤二中原核表达的Der p1蛋白；Saline为生理盐水(0.9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升)；铝佐剂为10％的铝盐(Sigma，USA)溶液。
(二)检测的实验
①BAL收集
最后一次抗原致敏24h后，把小鼠放血处死。1ml Hank’s液，灌洗肺4次，收集液700g离心10min，4℃，用100ul Hank’s液悬浮，计数后进行分类统计。
②病理学分析
用4％多聚甲醛灌注肺，切下后浸泡在固定液里。
哮喘模型的诱导结果如表3。
表3.哮喘模型诱导结果：
                                                  组织学检
                                    皮肤试验
        第一次诱导    第二次诱导                  测
组别                                (8、10、12、
        (0天)         (7天)                       (淋巴细
                                    14天)
                                                  胞浸润)
        50μg提取液  50μg提取液+   50μg提取     +++
A
        +4mg铝佐剂   4mg铝佐剂      液
                                    51μg提取     ---
B       4mg铝佐剂    4mg铝佐剂
                                    液
        50μg融合蛋                               +++
                     50μg融合蛋白  50g融合
C       白+4mg铝佐
                    +4mg铝佐剂      蛋白
        剂
        50g天然蛋                                 +++
                    50g天然蛋白     50μg天然
D       白+4mg铝佐
                    +4mg铝佐剂      蛋白
        剂
                                    50μg提取     ---
E       Saline      Saline
                                    液
F       Saline      Saline          Saline        ---
表3中，+++代表发生严重的T细胞亲润，平均打分大于2；---代表没发生或轻微发生T细胞亲润，平均打分小于2。
切片后，染色检测T细胞浸润情况，用reproducible scoring system编码和分级。分两种标准：1：外周炎症；2：血管周炎症。
分级标准：没炎症，0：偶然存在的炎性细胞，1：支气管和血管周围被1-5层炎性细胞包围，2：被多于5层炎性细胞包围，3：每一张切片随即选取10-15个区域，计算这些区域的平均数。
另一张片子用甲苯氨蓝染肥大细胞。
③按照实施例1中的方法ELISA检测特异性的IgE、IgG2a、IgG1水平。
④RT-RCR方法检测细胞因子
提取脾细胞的mRNA反转录后，按照实施例1中的方法检测过敏相关的细胞因子，如IL-4、IL-9、IL-5、IL-13、IF-γ的表达情况。
⑤皮试实验
设计由组胺、尘螨提取液、Saline、BSA各50μl在侧腹部进行皮试。
四、预防/治疗性免疫方案
预防组设计共11组：A-H组5只C57小鼠，6-8周龄，I-K组3只C57小鼠。
治疗组设计也11组：A-H组5只C57小鼠，6-8周龄，I-K组3只C57小鼠，时间改为14天成功诱导哮喘之后，从16天开始免疫，30天二免，37天开始检测。
                                                             诱导哮喘模型
组别    第一次免疫(0d)            第二次免疫(14d)
                                                             (21天)
        Der p1蛋白(100μg)+       Der p1蛋白(100μg)+pVAX-Der
A                                                             +++
        pVAX-Der p1(100μg)       p1(100μg)
B       Der p1蛋白(100μg)        Der p1蛋白(100μg)          +++
C       pVAX-Der p1(100μg)       pVAX-Der p1(100μg)         +++
        OVA蛋白(100μg)+pVAX-Der  OVA蛋白(100μg)+pVAX-Der
D                                                             +++
        p1(100μg)                p1(100μg)
        Der p1蛋白(100μg)+       Der p1蛋白(100μg)+
E                                                             +++
        pVAX-OVA(100μg)          pVAX-OVA(100μg)
F       pVAX vector(100μg)       pVAX vector(100μg)         +++
G       Saline                    Saline                      +++
H       Saline                    Saline                      ---
        片段一peptide(100μ       片段一peptide(100μg)+pVAX-
I                                                             +++
        g)+pVAX-片段一(100μg)    片段一(100μg)
        片段二peptide(100μ       片段二peptide(100μg)+pVAX-
J                                                             +++
        g)+pVAX-片段二(100μg)    片段二(100μg)
    片段三peptide(100μ        片段三peptide(100μg)+pVAX-
K                                                            +++
    g)+pVAX-片段三(100μg)     片段三(100μg)
+++代表诱导哮喘模型；---代表不进行诱导哮喘模型
①BAL收集
最后一次抗原致敏24h后，把小鼠放血处死。1ml Hank’s液，灌洗肺4次，收集液700g离心10min，4℃，用100ulHank液悬起来，计数后拿兽医院去进行分类统计。
②病理学分析
用4％多聚甲醛灌注肺，切下后浸泡在固定液里。
切片后，染色检测T细胞侵润情况，用reproducible scoring system编码和分级。
另一张片子用甲苯氨蓝染肥大细胞活性。
①ELISA检测特异性的IgE、IgG2a、IgG1水平。
②RT-RCR方法检测细胞因子
提取spleen的mRNA反转录后，检测过敏相关的细胞因子，如IL-4、IL-9、IL-5、IL-13、IL-10、IF-γ、TGF-β。
⑤皮试实验
设计由组胺、尘螨提取液、Saline、BSA各50μl在侧腹部进行皮试。
③T细胞增殖实验
用两种方法MTT和CFSE检测，组别设计为Der p1、BSA、ConA来刺激，peptide组加一组peptide刺激。
④检测T细胞亚型
如CD4+CD25+细胞占全部脾脏细胞和CD4+细胞的比例。
⑦胞内染色实验
主要染以下几种细胞因子：IL-10、IF-γ、TGF-β、IL-13、IL-5
⑧混合淋巴细胞培养和抑制实验
抑制型T细胞：用联合免疫的小鼠的T细胞
活化型T细胞：正常C57小鼠的T细胞
DC：来源于Balb/c小鼠
⑨过继转移实验
从以上免疫的各组小鼠体内分离T细胞过继转移进正常小鼠体内，联合免疫组同时注射anti-CD25的抗体，然后诱导哮喘，检测以上各种指标。
五、结果
(一)预防免疫结果：
     诱导哮喘模                                                   组织学检测
组别
                第一次免疫(28天)     第二次免疫(42天)    T细胞活性
     型(21天)                                                     (淋巴细胞浸润)
                Der p1蛋白(100μ
                                     Der p1蛋白(100μg)+
A    +++        g)+pVAX-Der p1                           ---      ---
                                     pVAX-Der p1(100μg)
                (100μg)
B    +++        Der p1蛋白(100μg)   Der p1蛋白(100μg)  +++      +++
                pVAX-Der p1(100μ
C    +++                             pVAX Der pl(100μg)  +++      +++
                g)
                0VA蛋白(100μg)+
                                     0VA蛋白(100μg)+
D    +++        pVAX-Der p1(100μ                        +++      +++
                                     pVAX-Der p1(100μg)
                g)
                Der p1蛋白(100μ
                                     Der p1蛋白(100μg)+
E    +++        g)+pVAX-0VA                              +++      +++
                                     pVAX-0VA(100μg)
                (100μg)
                pVAX vector(100μ
F    +++                             pVAX vector(100μg) +++      +++
                g)
G    +++        Saline               Saline              +++      +++
H    ---        Saline               Saline              ---      ---
                片段一peptide(100    片段一peptide(100μ
I    +++        μg)+pVAX-片段一     g)+pVAX-片段一      ---      ---
                (100μg)            (100μg)
                片段二peptide(100   片段二peptide(100μ
J    +++        μg)+pVAX-片段二    g)+pVAX-片段二       ---      ---
                (100μg)            (100μg)
                片段三peptide(100   片段三peptide(100μ
K    +++        μg)+pVAX-片段三    g)+pVA-片段三        ---      ---
                (100μg)            (100μg)
+++代表组织学发生严重的T细胞亲润，平均打分大于2；---代表没发生或轻微发生T细胞亲润，平均打分小于2。
(二)治疗性免疫结果：
                                                                            组织学检测
                                                诱导哮喘模型
组别  第一次免疫(0天)      第二次免疫(14天)                     T细胞活性   (淋巴细胞浸
                                                (21天)
                                                                            润)
      Der p1蛋白(100μg)+  Der p1蛋白(100μg)+
A                                               ---             ---         ---
      pVAX-Der p1(100μg)  pVAX-Der p1(100μg)
B     Der p1蛋白(100μg)   Der p1蛋白(100μg)   +++             +++         +++
C     pVAX-Der p1(100μg)  pVAX-Der p1(100μg)  +++             +++         +++
      OVA蛋白(100μg)+     OVA蛋白(100μg)+
D                                               +++             +++         +++
      pVAX-Der p1(100μg)  pVAX-Der p1(100μg)
      Der p1蛋白(100μg)+  Der p1蛋白(100μg)+
E                                               +++             +++         +++
      pVAX-OVA(100μg)     pVAX-OVA(100μg)
F     pVAX vector(100μg)  pVAX vector(100μg)  +++             +++         +++
G     Saline               Saline               +++             +++         +++
H     Saline               Saline               ---             ---         ---
      片段一peptide(100    片段一peptide(100
I     μg)+pVAX-片段一     μg)+pVAX-片段一     ---             ---         ---
      (100μg)             (100μg)
      片段二peptide(100    片段二peptide(100
J     μg)+pVAX-片段二     μg)+pVAX-片段二     ---             ---         ---
      (100μg)             (100μg)
      片段三peptide(100    片段三peptide(100
K     μg)+pVAX-片段三     μg)+pVAX-片段三     ---             ---         ---
      (100μg)             (100μg)
      过继转移             过继转移
M     105X CD4+CD25-       105X CD4+CD25-       ---             ---         ---
      T细胞*               T细胞*
+++代表组织学检测发生严重的T细胞亲润，平均打分大于2；---代表没发生或轻微发生T细胞亲润，平均打分小于2
*：由小鼠免疫了Der p1蛋白(100μg)+pVAX-Der p1(100μg)后分离纯化得到。
结论：
1、联合免疫方式可以预防尘螨引起的哮喘(结果2)，其原因是降低了病理性的T细胞增值同时也降低患哮喘小鼠的组织病理细胞反应；
2、无论是免疫学指标还是病理学指标都反映这种免疫方式可以用于治疗I型超敏反应(结果3)，而这种治疗是通过诱导出抗原特异性的CD4+CD25-的调节性T细胞来产生作用的。
序列表
<160>2
<210>1
<211>963
<212>DNA
<213>屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)
<400>1
atgaaaattg ttttggccat cgcctcattg ttggcattga gcgctgttta tgctcgtcca     60
tcatcgatca aaacttttga agaatacaaa aaagccttca acaaaagtta tgctaccttc    120
gaagatgaag aagctgcccg taaaaacttt ttggaatcag taaaatatgt tcaatcaaat    180
ggaggtgcca tcaaccattt gtccgatttg tcgttggatg aattcaaaaa ccgatttttg    240
atgagtgcag aagcttttga acacctcaaa actcaattcg atttgaatgc tgaaactaac    300
gcctgcagta tcaatggaaa tgctccagct gaaatcgatt tgcgacaaat gcgaactgtc    360
actcccattc gtatgcaagg aggctgtggt tcatgttggg ctttctctgg tgttgccgca    420
actgaatcag cttatttggc ttaccgtaat caatcattgg atcttgctga acaagaatta    480
gtcgattgtg cttcccaaca cggttgtcat ggtgatacca ttccacgtgg tattgaatac    540
atccaacata atggtgtcgt ccaagaaagc tactatcgat acgttgcacg agaacaatca    600
tgccgacgac caaatgcaca acgtttcggt atctcaaact attgccaaat ttacccacca    660
aatgtaaaca aaattcgtga agctttggct caaacccaca gcgctattgc cgtcattatt    720
ggcatcaaag atttagacgc attccgtcat tatgatggcc gaacaatcat tcaacgcgat    780
aatggttacc aaccaaacta tcacgctgtc aacattgttg gttacagtaa cgcacaaggt    840
gtcgattatt ggatcgtacg aaacagttgg gataccaatt ggggtgataa tggttacggt    900
tattttgctg ccaacatcga tttgatgatg attgaagaat atccatatgt tgtcattctc    960
taa                                                                  963
<210>2
<211>320
<212>PRT
<213>屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)
<400>2
Met Lys Ile Val Leu Ala Ile Ala Ser Leu Leu Ala Leu Ser Ala Val
1               5                   10                  15
Tyr Ala Arg Pro Ser Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Tyr Lys Lys Ala
            20                  25                  30
Phe Asn Lys Ser Tyr Ala Thr Phe Glu Asp Glu Glu Ala Ala Arg Lys
        35                  40                  45
Asn Phe Leu Glu Ser Val Lys Tyr Val Gln Ser Asn Gly Gly Ala Ile
    50                  55                  60
Asn His Leu Ser Asp Leu Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn Arg Phe Leu
65                  70                  75                  80
Met Ser Ala Glu Ala Phe Glu His Leu Lys Thr Gln Phe Asp Leu Asn
                85                  90                  95
Ala Glu Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile
            100                 105                 110
Asp Leu Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly
        115                 120                 125
Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala
    130                 135                 140
Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu
145                 150                 155                 160
Val Asp Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg
                165                 170                 175
Gly Ile Glu Tyr Ile Gln His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr
            180                 185                 190
Arg Tyr Val Ala Arg Glu Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg
        195                 200                 205
Phe Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Val Asn Lys
    210                 215                 220
Ile Arg Glu Ala Leu Ala Gln Thr His Ser Ala Ile Ala Val Ile Ile
225                 230                 235                 240
Gly Ile Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile
                245                 250                 255
Ile Gln Arg Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile
            260                 265                 270
Val Gly Tyr Ser Asn Ala Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn
        275                 280                 285
Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Ala
    290                 295                 300
Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val Val Ile Leu
305                 310                 315                 320

Claims (11)

1、一种预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗，它的活性成分是下述混合物：由造成过敏性哮喘的蛋白抗原或其表位多肽和在多克隆位点插入所述造成过敏性哮喘的蛋白抗原或其表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物。
2、根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述造成过敏性哮喘的蛋白抗原选自下述抗原中的任意一种：氨基酸序列如GenBank Accession Number X56279所示的三裂叶豚草(Ambrosia trifida)过敏原Amb t V；2、氨基酸序列如GenBankAccession Number AMBPV2A所示的多年生豚草(Ambrosia psilostachya)过敏原Ambp V；3、氨基酸序列如GenBank Accession Number AMBPV3A所示的多年生豚草过敏原Amb p V；4、氨基酸序列如GenBank Accession Number AMBPV1B所示的多年生豚草过敏原Amb p V；5、氨基酸序列如GenBank Accession Number AMBPV2B所示的多年生豚草过敏原Amb p V；6、氨基酸序列如GenBank Accession Number AMBPV3B所示的多年生豚草过敏原Amb p V；7、氨基酸序列如GenBank Accession Number S39330所示的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)过敏原I/a＝IgE-binding ribotoxin；8、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ002026所示的烟曲霉过敏原rAsp f 13；9、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ001732所示的烟曲霉过敏原rAsp f 4；10、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ001732所示的烟曲霉过敏原rAsp f 7；11、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ224333所示的烟曲霉过敏原rAsp f 8；12、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ223327所示的烟曲霉过敏原rAsp f 9；13、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ006689所示的烟曲霉过敏原rAsp f 11；
14、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ937743所示的烟曲霉过敏原cyclophilin(asp f 27)；15、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ937744所示的烟曲霉过敏原thioredoxin(asp f 28)；16、氨基酸序列如GenBank AccessionNumber AJ937745所示的烟曲霉过敏原thioredoxin(asp f 29)；17、氨基酸序列如GenBank Accession Number AF282850所示的欧洲白桦黄酮素还原酶(Betula pendulaisoflavone reductase)-like protein Bet v 6.0102(BETV6.0102)；18、氨基酸序列如GenBank Accession Number AF135127所示的欧洲白桦异黄酮素还原酶-homologBet v 6.0101(BETV6)；19、氨基酸序列如GenBank Accession Number BGU40767所示的德国小蠊(Blattella germanica)过敏原Bla g 4；20、氨基酸序列如GenBankAccession Number BGU92412所示的德国小蠊过敏原Bla g 5；21、氨基酸序列如GenBank Accession Number BGU28863所示的德国小蠊半胱氨酸蛋白酶前体(asparticprotease precursor)过敏原；22、氨基酸序列如GenBank Accession Number AF072219所示的德国小蠊主要过敏原(Bla g 1.0101)；23、氨基酸序列如GenBank AccessionNumber AF072221所示的德国小蠊主要过敏原(Bla g 1.0101)；24、氨基酸序列如GenBank Accession Number号AF072220所示的德国小蠊主要过敏原Bla g 1.02；25、氨基酸序列如GenBank Accession Number AY283288所示的粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)Der f 2过敏原；26、氨基酸序列如GenBank Accession Number AY947536的户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)Der Der-p1过敏原；27、氨基酸序列如GenBank Accession Number X63517所示的大麦(H.vulgare)Iam1-单体a-淀粉酶抑制物(monomeric alpha-amylase inhibitor)；28、氨基酸序列如GenBankAccession Number AJ243504所示的黑麦草(Lolium perenne)花粉过敏原(5C)；29、氨基酸序列如GenBank Accession Number AJ937746所示的合轴马拉色菌(Malasseziasympodialis)硫氧还蛋白(thioredoxin，mala s 13gene)；30、氨基酸序列如GenBankAccession Number AF072222所示的美洲大蠊(Periplaneta americana)主要过敏原(Per a 1.0101)；31、氨基酸序列如GenBank Accession Number AF106961所示的美洲大蠊(Periplaneta americana)原肌球蛋白(tropomyosin)；32、氨基酸序列如GenBank Accession Number AF082515所示的红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)过敏原(Tri r 2)；33、氨基酸序列如GenBank Accession Number AF082514所示的红色毛癣菌过敏原(Tri r 4)；34、氨基酸序列如GenBank Accession Number AF082514所示的红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)过敏原Tri r 4；35、氨基酸序列如序列表中序列1所示的尘螨Der p1。
3、根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于：所述预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗，是由造成过敏性哮喘的蛋白抗原和在多克隆位点插入所述造成过敏性哮喘的蛋白抗原编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物。
4、根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于：所述预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗，是由造成过敏性哮喘的蛋白抗原表位多肽和在多克隆位点插入所述造成过敏性哮喘的蛋白抗原表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物。
5、根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于：所述造成过敏性哮喘的蛋白抗原为氨基酸序列如序列表中序列1所示的尘螨Der p1。
6、根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于：所述造成过敏性哮喘的蛋白抗原编码基因为核苷酸序列如序列表中序列2所示的尘螨Der p1基因。
7、根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于：所述预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗的活性成分为氨基酸序列如序列表中序列1所示的尘螨Der p1和pVAX-Der p1。
8、根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述过敏性哮喘自身蛋白抗原和在多克隆位点插入所述过敏性哮喘自身蛋白抗原编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶5-5∶1；优选为1∶1-1∶2。
9、根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述过敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位点插入所述过敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体的质量比为1∶5-5∶1；优选为1∶1-1∶2。
10、根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于：所述预防和/或治疗过敏性哮喘的疫苗，是由所述过敏性哮喘自身蛋白抗原和在多克隆位点插入所述过敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物；或是由所述过敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位点插入所述过敏性哮喘自身蛋白抗原编码基因的重组真核细胞表达载体组成的混合物。
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