CN102307893A - 用于疫苗的草肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包括用于预防或治疗房尘螨过敏症的肽的组合物，并且特别涉及用于预防或治疗所述过敏症的肽的最佳组合。

Description

用于疫苗的草肽

通过引用并入

以下优先权申请的内容在此通过引用并入：于2009年2月5日提交的英国专利申请第0901928.2号，于2009年2月5日提交的英国专利申请第0901927.4号，于2009年7月20日提交的英国专利申请第0912578.2号，于2009年8月14日提交的国际专利申请第PCT/GB09/01995号和于2009年10月12日提交的英国专利申请第0917871.6号。

发明领域

本发明涉及用于预防或治疗草过敏症的组合物。

发明背景

T细胞抗原识别需要抗原呈递细胞(APC)在其细胞表面上呈递与主要组织相容性复合物(MHC)的分子缔合的抗原片段(肽)。T细胞使用其抗原特异性T细胞受体(TCR)来识别由APC呈递的抗原片段。这样的识别作为免疫系统的触发器起作用来产生一系列应答以根除已被识别的抗原。

生物体如人类的免疫系统对外部抗原的识别可在某些情况下造成疾病，其被称作特应性疾患。后者的实例是过敏性疾病，包括哮喘、特应性皮炎和过敏性鼻炎。在这一组疾病中，B淋巴细胞产生对外源产生的抗原结合的IgE类抗体(在人类中)，所述抗原在本文称为过敏原，因为这些分子引发过敏响应。过敏原特异性IgE的产生依赖于也被过敏原活化(并对其有特异性)的T淋巴细胞。借助于诸如嗜碱性粒细胞和肥大细胞等细胞对IgE表面受体的表达，过敏原特异性的IgE抗体结合到这些细胞表面。

过敏原对结合在表面的IgE分子的交联造成这些效应细胞脱粒，导致炎症介质诸如组胺、5-羟色胺和脂质介质如硫桥白三烯(sulphidoleukotriene)的释放。除了IgE依赖性事件，某些过敏性疾病诸如哮喘的特征为IgE独立性事件。

目前用提供症状缓解或预防的剂来治疗IgE介导的过敏性疾病。这种剂的实例是抗组胺剂、β2激动剂和糖皮质类固醇。此外，通过包括过敏原成分或提取物的定期注射的去敏化程序来治疗一些IgE介导的疾病。去敏化治疗可诱导与IgE竞争过敏原的IgG响应，或可诱导阻断针对过敏原的IgE的合成的特定抑制性T细胞。这种形式的治疗不是总有效，并且具有激起严重副作用特别是一般过敏性休克的风险。这可以是致命的，除非立即意识到并用肾上腺素治疗。将减少或消除针对特定过敏原的不想要的过敏-免疫应答而不改变对其它外来抗原的免疫反应性或触发本身过敏响应的治疗性处理将对过敏个体大有益处。

普遍认为，草过敏原是包括哮喘、过敏性鼻炎和过敏性皮炎在内的人类和动物过敏性疾病的主要原因。存在于草花粉中的蛋白是尤其重要的。例如，约90％的干草热患者对草花粉过敏。干草热是一种形式的季节性过敏症的统称，其特征是打喷嚏、流鼻涕和眼睛发痒。术语“干草热”源于该形式的变应性疾病在“割干草季节”中最为流行，该季节与许多草的花期相应，此时禾本植物释放最大量的花粉。其在夏季尤其流行，通常从5月末到8月末(在北半球)。

在美国，据计算干草热对于成人是第五位的主要慢性病并是缺勤的主要原因，这导致每年失去或减少近4百万个工作日，导致总生产力损失方面超过$7亿的总损失。过敏症还是儿童中最常报道的慢性病症，对于40％以上的儿童，限制了其活动。每年，过敏症在美国导致了17,000,000次以上的门诊就诊；这些过敏症就诊的一半以上是因诸如干草热的季节性过敏症导致的。

因此治疗性或预防性治疗将对患有草过敏症的人或处于患草过敏症的风险的人具有极大益处。

发明概述

通常将草花粉过敏原分组，在每一组中绝大多数物种表达至少一种花粉过敏原。组的例子包括：

-组1草花粉过敏原，其包括，例如，来自黑麦草(Lolium perenne)的蛋白Lol p 1和来自猫尾草(Phleum pratense)的蛋白Phl p 1；和

-组5草花粉过敏原，其包括，例如，来自黑麦草的蛋白Lol p 5a和蛋白Lol p 5b，来自猫尾草的蛋白Phl p 5，和来自狗牙根(Cynodon dactylon)的蛋白Cyn d 5。

本发明人已发现，来源于草物种的花粉中的主要过敏原的某些肽片段在使得个体对这些过敏原的去敏化中尤其有用。已筛选了本发明的多肽组合结合许多MHCⅡ类分子的能力，和以极小的组胺释放引起T细胞增殖的能力。因此可将本发明的组合物、产物、载体和制剂提供给个体以通过免疫耐受作用(tolerisation)来预防或治疗过敏症。

通过使用预测肽-MHC相互作用的计算机模拟分析和MHCⅡ类结合分析，选择作为MHCⅡ类-结合T细胞表位的本发明的肽。通过同源性来鉴定另外的表位。在体外T细胞响应分析的基础上对本发明的肽和肽组合进行进一步选择。

然而，本发明的肽组合通过靶向多种不同MHC分子而提供对人类人群覆盖面广泛的效力。因此，以本发明的肽配制的疫苗将具有广泛的应用。

本发明人的工作产生了具有以下特征的肽组合：

-该组合结合许多不同MHCⅡ类分子

-该组合在草过敏个体中显著刺激细胞因子释放

-该组合的肽不引起显著的组胺释放。

从广泛分析的草表位序列中选择肽组合物以鉴定在草过敏个体中具有特别良好的MHC结合性质和细胞因子响应特征的核心肽。该组合可包括三个这样的肽的核心，其中每一个选自最普遍的草，猫尾草、黑麦草和狗牙根。该组合可包括四种这样的肽的核心，这些肽中的每一种选自在肽的相互组合中表现为特别有效的肽。

以这种方式提供肽的核心组，其包括代表三种最普遍的草的多肽的核心组，优选同一组合中的四种或多种不同的单独的多肽提供各种MHC结合表位，并从而构建冗余性以允许MHC的多态性性质。提供本发明的核心组，优选具有特别良好的MHC结合性质和细胞因子响应特征的四种或多种不同的单独的多肽提供了多种T细胞表位，允许为了诱导免疫耐受性而募集宽泛范围的T细胞特异性。因此，本发明的组合物具有超越使用单独多肽的有利额外作用。本发明人也已证明：通过细胞因子响应测量，本发明的组合物能够提供对多态性研究群体的极高覆盖。

因此，本发明提供了适用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的组合物，该组合物包括：

(a)多肽Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)、Tim 10B(KYTVFETALKKAITAMSE)、Tim 04A(WGAIWRIDTPDKL)、Tim 07G(FKVAATAANAAPANDK)、或其任何一种的变体中的至少一种；

(b)多肽Ber01(SGKAFGAMAKKGQED)、Ber02(FIPMKSSWGA)、Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber 02B(KDSDEFIPMKSSWGAIWR)、或其任何一种的变体中的至少一种；和

(c)多肽Bio04A(LKKAVTAMSEAEK)、Rye09B(PEVKYAVFEAALTKAIT)、Bio02A(KYDAYVATLTEALR)、Bio03A(KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)、Rye 08A(ETYKFIPSLEAAVKQAY)、Rye05C(NAGFKAAVAAAANAPPK)、或其任何一种的变体中的至少一种，

其中所述变体是：

I)长度为最多30个氨基酸的较长的多肽，其包括(a)、(b)或(c)中指定的相应多肽的序列，或

II)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括与(a)、(b)或(c)中指定的相应多肽的序列具有至少65％同源性的序列，该序列能够使得免疫耐受所述相应多肽；或

III)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括(a)、(b)或(c)中指定的相应多肽的序列中至少9个连续氨基酸的序列，或与所述至少9个连续氨基酸具有至少65％同源性的序列，所述至少9个连续氨基酸的序列或同源性序列能够使得免疫耐受所述相应的多肽。

本发明还包括适用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的组合物，该组合物包括至少四种不同的选自以下的多肽：

(a)Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)或其变体；

(b)Ber01(SGKAFGAMAKKGQED)或其变体；

(c)Bio04A(LKKAVTAMSEAEK)或其变体；

(d)Rye09B(PEVKYAVFEAALTKAIT)或其变体；

(e)Ber02(FIPMKSSWGA)或其变体；

(f)Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)或其变体；

(g)Bio03A(KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)或其变体；和

(h)Bio02A(KYDAYVATLTEALR)或其变体；

其中所述变体是：

I)长度为最多30个氨基酸的较长的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相应多肽的序列，或

II)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括与(a)至(h)中指定的相应多肽的序列具有至少65％同源性的序列，该序列能够使得免疫耐受所述相应多肽；或

III)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相应多肽的序列中至少9个连续氨基酸的序列，或与所述至少9个连续氨基酸具有至少65％同源性的序列，所述至少9个连续氨基酸的序列或同源性序列能够使得免疫耐受所述相应的多肽。

本发明的组合物通常能够使得群体中一组草花粉过敏性个体的至少50％或至少60％免疫耐受，和/或包括至少一种另外的多肽，最多总共14种多肽，其中所述另外的多肽：(a)包括与以下所描述的SEQ ID NO：1至73的任何一种中的至少9个或更多个连续氨基酸具有至少65％序列同一性的序列；和(b)长度为9至30个氨基酸。

本文提及的序列的描述

SEQ ID NO：1至73提供如表2至4列出的本发明的多肽序列。SEQID NO.1至27对应于来自组1草过敏原的肽。SEQ ID NO.28至73对应于来自组5过敏原的肽。

发明详述

本发明涉及可用于免疫耐受作用的肽。这样的肽可来源于本文所描述的任何草过敏原或是如以下所描述的其变体。与基于肽免疫作用的去敏化方法相关的困难是：如何选择过敏原的适当的大小和区域以作为用于免疫作用的肽的基础。选择的肽的大小是关键的。如果肽过小，疫苗可能不会有效诱导免疫应答。如果肽过大，或如果将全抗原导入到个体中，存在诱导有害反应的风险，比如过敏性反应，这可能是致命的。

已经选择本发明的肽以保留T细胞特异性，而同时尺寸足够小以不具有显著的三级结构，这将使其能够保留完整分子的IgE结合表位的构象。因此本发明的多肽不会引起细胞上邻近特异性IgE分子的显著性交联且因此不会导致显著的组胺释放，所述细胞比如肥大细胞和嗜碱性粒细胞。

本发明的优势是肽能够宽泛地靶向主要组织相容性复合物(MHC)分子的能力。T细胞受体(TCR)的特异性是高度可变的。如抗体分子一样，通过细胞内的基因重组事件产生了可变性。TCR识别与由主要组织相容性复合物(MHC)的基因编码的分子结合的短肽形式的抗原。这些基因产物是同样的分子，产生用于移植的“组织类型”，且还被称为人类白细胞抗原分子(HLA)，这些术语可被互换地使用。单独的MHC分子具备肽结合沟，由于它们的形状和电荷其只能够结合有限的一组肽。被一个MHC分子结合的肽可能不一定被其它MHC分子结合。

当蛋白分子诸如抗原或过敏原被抗原呈递细胞诸如B淋巴细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞吸收时，该分子在细胞中被酶促降解。降解过程产生所述分子的肽片段，如果它们具有合适的大小、电荷和形状，则可能结合到某些MHC分子的肽结合沟之内，并随后展示在抗原呈递细胞表面上。如果肽/MHC复合物以足够数量呈递在抗原呈递细胞表面上，则它们可能活化带有合适的肽/MHC特异性T细胞受体的T细胞。

由于MHC的多态性质，远系繁殖群体诸如人类中的个体将在其细胞表面上表达不同组合的MHC分子。由于不同MHC分子可基于肽的大小、电荷和形状而结合来自同一分子的不同肽，不同个体将展示与其MHC分子结合的不同库的肽。鉴定远系繁殖群体诸如人类中的通用MHC-结合肽表位比在近亲繁殖的动物(诸如实验小鼠的某些品系)中更困难。基于个体之间MHC的差异表达以及其带来的肽结合与呈递的固有差异，不太可能鉴定可用于人类去敏化治疗的单种肽。

如以下所讨论的，本发明通过提供基于一种以上的肽的组合物，即肽组合，而解决该问题。这些组合以肽的核心组为基础，这些肽当被单独检验时，实验上鉴定为在草过敏性患者中表现出令人惊奇地强的响应，且当以组合来提供时，响应尤其强。当肽的这些核心亚组被包括在草肽疫苗中时具有有利的性质。

核心组可包括至少一种来源于猫尾草的肽，至少一种来源于黑麦草的肽和至少一种来源于狗牙根的肽，每种肽显示了特别良好的单独的响应特性。将这些肽包括在组合中允许覆盖三种最普遍的草，并且如以下所进一步讨论地，通过同源性另外扩及覆盖其它的草。

另外，核心组可包括至少四种肽，该肽选自在检验的组中具有高等级的单独响应特性且被进一步证明当一起组合来提供时为草疫苗提供最优响应特性的肽。

这样的肽组合优选地包括至少一种来源于组Ⅰ草过敏原的肽或其变体和至少一种来源于组Ⅴ草过敏原的肽或其变体。草过敏原分类为组Ⅰ草过敏原和组Ⅴ草过敏原是技术人员所熟知的，且在本文中被进一步讨论。优选的组Ⅰ草过敏原是狗牙根过敏原，Cyn d 1。优选的组Ⅴ过敏原是黑麦草过敏原，Lol p 5。在一些实施方案中，本发明涉及包括至少一种来源于Cyn d1的肽或其变体和至少一种来源于Lol p 5的肽或其变体。基于Cyn d1肽和Lol p 5肽或它们的变体的组合的组合物在以下被进一步讨论。

本发明的优选的肽可包括SEQ ID NO：1至73的任何一个中所示的序列，可由SEQ ID NO：1至73的任何一个中所示的序列组成，或可基本上由SEQ ID NO：1至73的任何一个中所示的序列组成。这些特定肽的变体也可被使用。变体可包括作为SEQ ID NO：1至73的任何一个的片段或SEQID NO：1至73的任何一个的同源物的序列，可由作为SEQ ID NO：1至73的任何一个的片段或SEQ ID NO：1至73的任何一个的同源物的序列组成，或可基本上由作为SEQ ID NO：1至73的任何一个的片段或SEQ ID NO：1至73的任何一个的同源物的序列组成。

这样本发明提供了适用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的组合物，该组合物包括：

(a)多肽Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)、Tim 10B(KYTVFETALKKAITAMSE)、Tim 04A(WGAIWRIDTPDKL)、Tim 07G(FKVAATAANAAPANDK)、或其任何一种的变体中的至少一种；

(b)多肽Ber01(SGKAFGAMAKKGQED)、Ber02(FIPMKSSWGA)、Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber 02BKDSDEFIPMKSSWGAIWR、或其任何一种的变体中的至少一种；

(c)多肽Bio04A(LKKAVTAMSEAEK)、Rye09B(PEVKYAVFEAALTKAIT)、Bio02A(KYDAYVATLTEALR)、Bio03A(KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)、Rye 08A(ETYKFIPSLEAAVKQAY)、Rye05C(NAGFKAAVAAAANAPPK)、或其任何一种的变体中的至少一种，

其中所述变体是：

I)长度为最多30个氨基酸的较长的多肽，其包括(a)、(b)或(c)中指定的相应多肽的序列，或

II)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括与(a)、(b)或(c)中指定的相应多肽的序列具有至少65％同源性的序列，该序列能够使得免疫耐受所述相应多肽；或

III)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括(a)、(b)或(c)中指定的相应多肽的序列中至少9个连续氨基酸的序列，或与所述至少9个连续氨基酸具有至少65％同源性的序列，所述至少9个连续氨基酸的序列或同源性序列能够使得免疫耐受所述相应的多肽。

a)至c)的其它优选的变体是：

i)具有9至30个氨基酸的长度且包括由以下组成的区域的多肽：

-a)至c)的对应序列中的任何一种，或

-与a)至c)的对应序列中的任何一种具有至少65％同源性的序列，该序列能够使个体免疫耐受a)至c)的序列中的任何一种，或

ii)具有9至30个氨基酸的长度且包括由代表以下任何一种的序列组成的区域的多肽：

-a)至c)的序列中的任何一种的片段，或

-a)至c)的序列中的任何一种的片段的同源物，

所述序列能够使个体免疫耐受a)至c)的序列中的任何一种，且具有至少9个氨基酸的长度，且其中所述同源物与a)至c)的序列中的任何一种中的任何9个连续氨基酸具有至少65％的同源性；其中任选地，四个多肽中无一是由a)至c)的任何一个所定义的同一原始序列的变体。

因而组合物至少包括三种多肽，第一多肽是a)的多肽或其变体，第二多肽是b)的多肽或其变体，第三多肽是c)的多肽或其变体。这样，例如组合物可包括Tim07B的变体、Ber01、和Rye09B的变体。优选地，以上组合物除核心三种多肽之外包括a)、b)或c)或其任何一个的变体的第四多肽。组合物可包括a)、b)或c)或其变体的四种、五种、六种、七种、八种或以上的多肽。

在一些方面，组合物可包括a)或其变体的两种、三种、四种或更多种多肽。在另外的方面，组合物可包括b)或其变体的两种、三种、四种或更多种多肽。在其它的方面，组合物可包括c)或其变体的两种、三种、四种、五种、六种或更多种多肽。这些选择以组合物包括a)或其变体的至少一种多肽、b)或其变体的至少一种多肽为条件。选自组a)、b)和c)的三种多肽的优选的组合是多肽Tim07B或其变体、多肽Ber01或其变体、和多肽Bio04A或其变体。

组合物可包括至少两种选自组a)或其变体的多肽，至少两种选自组b)或其变体的多肽和至少两种选自组c)或其变体的多肽。

优选的组合物可包括多肽Tim07B或其变体、和至少两种、三种或四种选自组b)或其变体的多肽。该优选的组合物可包括两种或三种选自组c)或其变体的多肽，优选地包括Bio04A或其变体。另一个优选的组合物可包括多肽Tim07B或其变体、和至少两种、三种或四种选自组c)或其变体的多肽。该优选的组合物可包括两种或三种选自组b)或其变体的多肽，优选地包括Ber01或其变体。

基于a)至c)的以上所有组合物可包括选自SEQ ID NO 1至74的任何一个或其变体、且先前根据a)至c)未选择的另外的多肽。

本发明还提供了适宜于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的组合物，该组合物包括至少四种不同的选自以下的多肽：

(a)Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)或其变体；

(b)Ber01(SGKAFGAMAKKGQED)或其变体；

(c)Bio04A(LKKAVTAMSEAEK)或其变体；

(d)Rye09B(PEVKYAVFEAALTKAIT)或其变体；

(e)Ber02(FIPMKSSWGA)或其变体；

(f)Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)或其变体；

(g)Bio03A(KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)或其变体；和

(h)Bio02A(KYDAYVATLTEALR)或其变体；

其中所述变体是：

I)长度为最多30个氨基酸的较长的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相应多肽的序列，或

II)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括与(a)至(h)中指定的相应多肽的序列具有至少65％同源性的序列，该序列能够使得免疫耐受所述相应多肽；或

III)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相应多肽的序列中的至少9个连续氨基酸的序列，或与所述至少9个连续氨基酸具有至少65％同源性的序列，所述至少9个连续氨基酸的序列或同源性序列能够使得免疫耐受所述相应的多肽。

a)至h)的其它优选的变体是：

i)具有9至30个氨基酸的长度且包括由以下组成的区域的多肽：

-a)至h)的对应序列中的任何一种，或

-与a)至h)的对应序列中的任何一种具有至少65％同源性的序列，该序列能够使个体免疫耐受a)至h)的序列中的任何一种，或

ii)具有9至30个氨基酸的长度且包括由代表以下任何一种的序列组成的区域的多肽：

-a)至h)的序列中的任何一种的片段，或

-a)至h)的序列中的任何一种的片段的同源物，

所述序列能够使个体免疫耐受a)至h)的序列中的任何一种，且具有至少9个氨基酸的长度，且其中所述同源物与a)至h)的序列中的任何一种中的任何9个连续氨基酸具有至少65％的同源性；其中任选地，四种多肽中无一是由a)至h)的任何一种所定义的同一原始序列的变体。

因而组合物至少包括四种多肽，所述四种多肽中的每一种选自a)至h)的多肽或其变体。以上组合物可包括a)至h)或其任何一种的变体的另外的多肽，比如a)至h)或其变体的五种、六种、七种、八种或更多种多肽。

在一些方面，组合物可包括a)或其变体的多肽，至少一种选自b)、e)或f)或其任何一种的变体的多肽，和至少一种选自c)、d)、g)或h)或其变体的多肽。可选地，组合物可优选地包括a)或其变体的多肽、和至少两种或三种选自b)、e)或f)或其任何一种的变体的多肽。该组合物可优选地包括多肽Ber01或其变体。在另一个实施方案中，组合物可包括a)或其变体的多肽和至少两种、三种或四种选自c)、d)、g)或h)或其任何一种的变体的多肽。该组合物可优选地包括多肽Bio04A或其变体。

所有这些组合物可优选地包括多肽Tim07B或其变体，多肽Ber01或其变体，和多肽Bio04A或其变体。

以上选自a)至h)的组合物优选地包括a)至h)的至少四种不同的多肽或包括至少四种变体，所述变体的每一种对应于a)至h)的不同的原始或基线序列。这样，该组合物通常以起源的四种不同的表位序列为基础来选择。优选地，该组合物包括狗牙根起源的至少一种表位序列，黑麦草起源的至少一种表位序列和猫尾草起源的至少一种表位序列。相关表位序列可选自SEQ ID NO 1至74中的任何一种或其变体。

基于a)至h)的以上所有组合物可因而包括选自SEQ ID NO 1至74的任何一种或其变体、且先前根据a)至h)未选择的另外的多肽。所有选择以该组合物包括至少四种选自a)至h)或其变体的多肽为条件。

任选地，本文所描述的特定多肽的任何组合物可包括另外的多肽而最多总共14种独特的多肽。另外的多肽通常与不在已选择的多肽中的其它序列，即SEQ ID NO：1至73相关(即，通常为其同源物和/或其片段)。另外的肽通常是SEQ ID NO：1至73的肽中其一的功能性变体。另外的肽可以与SEQ ID NO：1至73中的任何一种相同。因此该组合物可包括最多十四种不同的多肽，所述多肽如SEQ ID NO：1至73中任何一种所提供的，以至少一种多肽选自如上所定义的(a)和(b)的每种为条件。然而，任选的另外的多肽不需要与SEQ ID NO：1至73的任何一种100％相同。它们优选地与SEQ ID NO：1至73的任何一种中的至少9个(例如至少10、11、12或13个)或更多个连续氨基酸至少65％相同，而非在选自(a)和(b)的每一种的至少一种多肽中已选择的。这些连续氨基酸可包括MHCⅡ类表位，例如其与本文所述的MHC分子中的任何一种相结合。

本发明还提供了用于通过免疫耐受来预防或治疗草过敏症、包括本发明的多肽的产物和制剂，和包括能够表达本发明的多肽的多核苷酸的组合物、产物和载体。所述免疫耐受通常将针对SEQ ID NO：1至74中任何一种中存在的表位(例如MHCⅡ类-结合的T细胞表位)。

草物种

草物种黑麦草(Lolium perenne)、猫尾草(Phleum pratense)和狗牙根(Cynodon dactylon)在世界范围造成高比例的草过敏症，尤其是与草花粉相关的过敏症，比如干草热。其它重要的草物种包括绒毛草(Holcuslanatus)、鸭茅(Dactylis glomerata)、加那利草(Phalaris canariensis)和草地早熟禾/肯塔基蓝草(草地早熟禾(Poa pratensis))。

黑麦草是世界上最常见的草之一，并广泛用作动物饲料的来源。其原产于欧洲，但已被引进到世界所有大陆上，并且在所有温带都是常见的。其花期可贯穿整个夏季，但在北半球通常在5月到7月之间。黑麦草良好适应于温和、湿润的温带气候，并且在相对粘重、肥沃、滋润的土地上生长得最好。其在充分施肥的具有足够水分的轻质土壤上也生长良好。其不喜阴且需要排水良好的土壤。黑麦草通常生长于土壤pH在从约6到约7的范围内的位置处，但其可耐受从约4.5到约8.5的范围，优选地年降水量在约21到约180cm的范围。

猫尾草是世界上另一种最常见的草，并且是动物饲料的首要来源。其原产和分布于欧洲、北非和亚洲北部的大部分。其已被引进到北美和南美、南非和澳洲并在那里广泛分布。猫尾草通常生长于年降水量在约35到约180cm的范围、年平均温度在约4到约22℃的范围和土壤pH为约4.5到约8的位置。其良好适应于凉的、湿润的温带气候，在粘重的、深层的和湿润的土壤或甚至湿地上生长得最好。生长的最佳温度在18-21℃间变化，且昼/夜温度为15/10℃和21/15℃。猫尾草花期通常限于初夏且猫尾草花粉是这个季节中草过敏症的主要原因。在研究中，已发现达21％的患有过敏性鼻炎或其它症状的患者对猫尾草花粉响应。

狗牙根通常生长于年降水量为约9至约429cm、年平均温度范围为约5到约28℃和土壤pH在约4到约8.5，优选地约6到约7的范围的位置。狗牙根花期通常在夏末(北半球的8月到10月)。狗牙根植物产生大量的花粉且因此是干草热的主要原因。还已报道狗牙根植物导致接触性皮炎。狗牙根在世界范围广泛生长，主要在温暖的气候中，且通常发现于约北纬30°到约南纬30°的纬度之间。

组1和组5草花粉过敏原的肽片段

主要的草过敏原包括组1草花粉过敏原和组5草花粉过敏原。将来自不同物种的蛋白根据氨基酸序列同源性分组。例如，组1主要草花粉过敏原包括猫尾草蛋白Phl p 1和黑麦草蛋白Lol p 1，组5主要草花粉过敏原包括猫尾草蛋白Phl p 5和黑麦草蛋白Lol p 5。

本发明人已鉴定了某些草花粉过敏原蛋白中包括MHCⅡ类结合T细胞表位的区域。本发明人也已证明，主要草花粉过敏原中对应于MHCⅡ类结合T细胞表位的区域在给定的组中的代表之间是高度保守的，参见，例如，实施例2。基于该信息，来源于给定的组中的蛋白的相关区域的肽适宜于通过免疫耐受该组中的草过敏原而预防或治疗草过敏症。例如，来自，例如猫尾草的Phl p 1或黑麦草的Lol p 1的相关区域适用于通过免疫耐受组1草过敏原而预防或治疗草过敏症。

本发明的肽来源于组1(SEQ ID NO：1至27)和组5(SEQ ID NO：28至73)草过敏原。术语“肽”和“多肽”在本文中可互换使用。以上的蛋白在本文中还被称作“过敏原”。

表2至4列出了本发明的肽的序列，指明了每种肽所来源的母体蛋白质。

当本发明的组合物包括四种或更多种选自a)至h)的多肽或其变体的多肽时，该组合物通常包括选自a)SEQ ID NO：1至27；和b)SEQ ID NO：28至73的每一种的至少一种多肽或其变体(例如功能性变体)。该组合物可包括选自a)SEQ ID NO：1至27；和b)SEQ ID NO：28至73的每一种的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或至少七种多肽或其变体(例如功能性变体)。在一些实施方案中，该组合物可包括选自a)SEQ ID NO：1至10；和b)SEQ ID NO：28至52的每一种的至少一种多肽或其变体(例如功能性变体)。该组合物可包括选自a)SEQ ID NO：1至10；和b)SEQ ID NO：28至52的每一种的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或至少七种多肽或其变体(例如功能性变体)。

如以上概述，因此，基于a)至h)的多肽或其变体的优选的组合物包括组合物中包括至少一种来源于Cyn d 1或其变体的肽和至少一种来源于Lol p5或其变体的肽的那些组合物。特别优选的组合物是包括至少一种来源于Cyn d 1或其变体的肽、至少一种来源于Lol p5或其变体的肽和至少一种来源于Phl p 5的肽的那些组合物。在一些实施方案中，a)至h)的组合物可包括来源于Cyn d 1或其变体的两种、三种、四种或更多种肽和/或来源于Lol p 5或其变体的两种、三种、四种或更多种肽。在一些实施方案中，该组合物可由来源于Cyn d 1和Lol p 5或其变体的肽组成，或基本上由来源于Cyn d 1和Lol p 5或其变体的肽组成。在另一些实施方案中，该组合物任选地不包括来源于Lol p1或其变体的肽。

如上所讨论的，基于Cyn d 1和Lol p 5肽的组合物在草过敏症的治疗中特别有用。

本发明的特别优选的组合物包括：包括以下、由以下组成或基本上由以下组成的那些组合物：

a)如本文所定义的SEQ ID NO：1、2和5的多肽或其变体中的至少一种；

b)如本文所定义的SEQ ID NO：28、29、31和46的多肽或其变体中的至少一种；和任选地

c)如本文所定义的SEQ ID NO：69的多肽或其变体。

这些组合物提供了特别优选的Cyn d 1肽、特别优选的Lol p5肽、和任选地，特别优选的Phl p5肽。更优选地，该组合物包括如a)中所定义的至少两种或所有三种多肽，和如b)中所定义的至少两种或至少三种多肽。仍为优选地，该组合物包括如c)中所定义的多肽。特别优选地，组合物包括i)SEQ ID NO：1，ii)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5中的一种；和iii)SEQ ID NO：46。

具体的优选的组合物包括组合1至10，如表7中所列。在所述组合物中，SEQ ID NO：1、2、5、28、29、31、46和69的单独的多肽的一种或多种可任选地替代其变体。在一些实施方案中，存在于组合1至10的SEQID NO：1、2、5、28、29、31、46和69的多肽中的两种、三种、四种、五种或更多种可被其变体替代。被其变体替代的多肽的数目通常取决于该组合物中所包括的多肽的总数目。例如，在基于四种多肽的组合(即，组合6、8、10)中，优选地仅有一种或两种多肽被其变体替代。可选地，包括选自SEQ ID NO：1、69、31、46、2、5、29、28、43、53、35、27、4和70的任何一种或其变体的四种或更多种多肽的任何组合物也是优选的。

更优选的组合物包括SEQ ID NO：1、2、5、28、31、91和93或其变体的多肽，由SEQ ID NO：1、2、5、28、31、91和93或其变体的多肽组成，或基本上由SEQ ID NO：1、2、5、28、31、91和93或其变体的多肽组成。其它优选的组合物包括SEQ ID NO：1、2、5、28、31、91和93、或替代这些多肽的一种、两种或三种、四种或更多种的它们的变体。在一些实施方案中，以上7种肽组合物不包括任何其它的多肽或不包括任何其它的来源于草过敏原的多肽。在优选的实施方案中，组合物包括SEQ IDNO：1、2、5、28、31、91和93或其变体，且不包含与本文所述的任何草物种的蛋白具有超过20％的同源性的任何另外的蛋白。以上组合物可包括另外的非肽组分，比如载体或佐剂。

本发明还提供了产物，所述产物包括以下：

(a)多肽Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)、Tim10B(KYTVFETALKKAITAMSE)、Tim 04A(WGAIWRIDTPDKL)、Tim 07G(FKVAATAANAAPANDK)、或如本文所描述的其任何一种的变体；

(b)多肽Ber01(SGKAFGAMAKKGQED)、Ber02(FIPMKSSWGA)、Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber02B KDSDEFIPMKSSWGAIWR中的至少一种、或如本文所描述的其任何一种的变体；和

(c)多肽Bio04A(LKKAVTAMSEAEK)、Rye09B(PEVKYAVFEAALTKAIT)和Bio02A(KYDAYVATLTEALR)、Bio03A(KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)、Rye 08A(ETYKFIPSLEAAVKQAY)、Rye05C(NAGFKAAVAAAANAPPK)中的至少一种、或如本文所描述的其任何一种的变体，其中每种不同的多肽是供同时地、分别地或顺序地用于通过免疫耐受预防或治疗草花粉过敏症。

本发明的产物中的四种或更多种多肽可按照与通过免疫耐受作用而用于草过敏症的预防或治疗的本发明的组合物有关的以上所述的相同标准来选择。

变体

因此，本发明的组合物或产物可包括SEQ ID NO：1至73的任何一种的变体。变体通常包括存在于SEQ ID NO：1至73的相应的肽中的MHCⅡ类表位的1个、2个、3个或更多个。

本文提到了功能性变体。该变体可能能够使个体免疫耐受存在于SEQID NO：1至59的相应的肽中的MHCⅡ类表位，并因而其将通常包括与同样的MHCⅡ类分子结合和/或被识别SEQ ID NO：1至73的多肽中相应的表位的T细胞所识别的序列。该序列因此能够使得免疫耐受天然多肽中相应的序列。因此变体多肽可使得免疫耐受相应的天然多肽。

SEQ ID NO：1至73的变体可以是通过截短衍生的片段，例如，通过从多肽的N末端和/或C末端去除一个或多个氨基酸。片段还可以通过一个或多个内部缺失来生成，条件是组成T细胞表位的核心9个氨基酸基本上不被破坏。

例如，SEQ ID NO：1的变体可包括SEQ ID NO：1的片段，即，较短序列。这可包括从SEQ ID NO：1的N-末端或从SEQ ID NO：1的C-末端缺失一个、两个、三个或四个氨基酸。这样的缺失可从SEQ ID NO：1的两端进行。SEQ ID NO：1的变体可包括延伸超出SEQ ID NO：1的末端的另外的氨基酸(例如来自衍生肽的亲本蛋白的序列)。变体可包括以上讨论的缺失和添加的组合。例如，可从SEQ ID NO：1的一端缺失氨基酸，但可在SEQ ID NO：1的另一端添加来自全长亲本蛋白序列的另外的氨基酸。以上变体的相同讨论还适用于SEQ ID NO：2至73。

变体肽可包括SEQ ID NO：1至73任一种或其片段的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代。变体肽可包括与SEQ ID NO：1至73任一种中至少9个或更多个连续氨基酸具有至少65％序列同一性的序列。更优选地，合适的变体可包括与SEQ ID NO：1至73任一种的至少9个连续氨基酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的氨基酸同一性。这一水平的氨基酸同一性可见于肽的任何区段，尽管它优选地是核心区域。氨基酸同一性的水平是超出至少9个连续氨基酸，但它可以是至少10、11、12、13、14、15或至少16或17个氨基酸，这取决于比较的肽的大小。因此，任何以上指明的同一性水平可跨越序列的完整长度。

以与本发明的特别优选的肽的序列同一性为基础选择的优选变体的例子是：

Ber01(SEQ ID NO：1)的变体：SGKAFGAMAKKGEED(SEQ IDNO：74)，绒毛草Hol l 1；草地早熟禾Poa p 1；SGHAFGSMAKKGEED(SEQID NO：75)，鸭茅Dac g 1；黑麦草Lol p 1；SGIAFGSMAKKGDED(SEQID NO：76)，猫尾草Phl p 1，SGTAFGAMAKKGEEE(SEQ ID NO：77)，玉米(Zea mays)Zea m 1。

Bio02A(SEQ ID NO：28)的变体：KYDAYVATLTESLR(SEQ ID NO：78)，大麦(Hordeum vulgare)Hor v 5；KYDAYVATLSEALR(SEQ ID NO：79)，猫尾草Phl p 5；草地早熟禾Poa p 9；KYDAFVAALTEALR(SEQ IDNO：80)，鸭茅Dac g 5；KYDAFVTTLTEALR(SEQ ID NO：81)，绒毛草Hol l 5。

Bio03A(SEQ ID NO：29)的变体：KFIPTLEAAVKQAYAA(SEQ ID NO：82)，鸭茅Dac g 5；虉草(Phalarus aquatica)Pha a 5；KFIPALEAAVKQAYAA(SEQ ID NO：83)，猫尾草Phl p 5。

Tim07B(SEQ ID NO：69)的变体：KIPAGELQIVDKIDA(SEQ ID NO：84)，鸭茅Dac g 5；虉草Pha a 5；KIPTGELQIVDKIDA(SEQ ID NO：85)，黑麦草Lol p 5；KIPAGEQQIIDKIDA(SEQ ID NO：86)，草地早熟禾Poa p5。Tim07B在绒毛草Hol l5b中也是保守的。

Bio04A(SEQ ID NO：31)的变体：LKKAITAMSEAQK(SEQ ID NO：87)，猫尾草Phl p5；绒毛草Hol l 5b；LKKAITAMSQAQK(SEQ ID NO：88)，草地早熟禾Poa p 5。

Ber02C(SEQ ID NO：5)的变体：KESWGAIWRIDTPDK(SEQ ID NO：89)，虉草Pha a 1；猫尾草Phl p 1。

Rye09B(SEQ ID NO：46)的变体：PQVKYAVFEAALTKAIT(SEQ IDNO：90)，猫尾草Phl p 5。

这样，SEQ ID NO：74至90是可作为以上天然肽的替代物用于本发明的组合物中的优选的变体。用于本发明的天然肽的其它优选变体来源于玉米过敏原。玉米过敏原与草花粉过敏原具有很近的同源性，且因此来源于玉米的序列可包含用于免疫耐受草花粉过敏原的交叉反应性表位。

关于氨基酸序列，“序列同一性”是指当使用ClustalW(Thompson等人，1994，同前)用以下参数评价时具有指定值的序列：成对的比对参数-方法：准确，矩阵：PAM，缺口开放罚分：10.00，缺口延伸罚分：0.10；多比对参数-矩阵：PAM，缺口开放罚分：10.00，％延迟同一性：30，处罚末端缺口：开，缺口间距：0，负矩阵：不，缺口延伸罚分：0.20，残基特异性缺口罚分：开，亲水缺口罚分：开，亲水残基：GPSNDQEKR。在特定残基的序列同一性意在包括仅仅被衍生化的相同残基。

变体肽可包括SEQ ID NO：1至73任一种中的1、2、3、4、5或更多个或者多达10个氨基酸取代。取代变体优选地包括用相同数目的氨基酸代替一个或多个氨基酸并进行保守的氨基酸取代。例如，可用具有相似特征的替代性氨基酸例如，另一碱性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一带电荷氨基酸、另一亲水氨基酸、另一疏水氨基酸、另一极性氨基酸、另一芳香族氨基酸或另一脂肪族氨基酸来取代氨基酸。可用于选择合适的取代基的20种主要氨基酸的一些特征如下：

Ala	脂肪族、疏水、中性	Met	疏水、中性
				Cys	极性、疏水、中性	Asn	极性、亲水、中性
Asp	极性、亲水、带电荷(-)	Pro	疏水、中性
				Glu	极性、亲水、带电荷(-)	Gln	极性、亲水、中性
Phe	芳香族、疏水、中性	Arg	极性、亲水、带电荷(+)
				Gly	脂肪族、中性	Ser	极性、亲水、中性
His	芳香族、极性、亲水、带电荷(+)	Thr	极性、亲水、中性
				Ile	脂肪族、疏水、中性	Val	脂肪族、疏水、中性
Lys	极性、亲水、带电荷(+)	Trp	芳香族、疏水、中性
				Leu	脂肪族、疏水、中性	Tyr	芳香族、极性、疏水

另外的变体包括在其中出现在序列中的氨基酸而非天然存在的氨基酸是其结构类似物的那些。用于序列中的氨基酸还可被修饰例如被标记，条件是肽的功能未显著地受到不利影响。当肽具有与SEQ ID NO：1至73任一种或其片段的序列不同的序列时，取代可沿着序列的全长发生，其在SEQ ID NO：1至73的任何序列之内或SEQ ID NO：1至73的任何序列之外。例如，本文所述的变化诸如添加、缺失、取代和修饰可发生在SEQID NO：1至73的任何序列之内。变体肽可包括在其中已经进行了一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代的SEQ ID NO：1至73的任何氨基酸序列，或者基本上由其组成。变体肽可包括比SEQ ID NO：1至73任一个大的亲本蛋白片段。在该实施方案中，本文所述的变化诸如取代和修饰可发生在SEQ ID NO：1至73的任何序列之内和/或之外。

本发明的变体肽长度是9至30个(含)氨基酸。优选地，它们的长度可以是9至20个氨基酸或更优选地13至17个氨基酸。所述肽可与SEQID NO：1至73的任何一种中的肽序列具有相同的长度。

所述肽可化学地例如通过蛋白水解裂解衍生自多肽过敏原，或者可以有意方式从多肽过敏原衍生，例如通过利用多肽过敏原的氨基酸序列并基于该序列合成肽。可使用本领域公知方法合成肽。

术语“肽”不仅包括在其中氨基酸残基被肽(-CO-NH-)键连接的分子，还包括在其中肽键被倒转的分子。这样的逆反(retro-inverso)模拟肽可使用本领域已知的方法制备，例如诸如Meziere等人(1997)J.Immunol.159，3230-3237中描述的那些。该方法包括制备包含骨架变化而非侧链定向的拟肽。Meziere等人(1997)显示，至少对于II类MHC和T辅助细胞响应，这些拟肽是有用的。包含NH-CO键而非CO-NH肽键的逆反肽对蛋白水解的抵抗要多得多。

类似地，可完全不需要肽键，条件是使用保持氨基酸残基的碳原子之间间距的合适的连接部分；如果所述连接部分具有与肽键大致上相同的电荷分布和大致上相同的平面性，它是特别优选的。还应理解的是，可方便地在其N-或C-末端封闭所述肽，以帮助减少对外蛋白水解消化的敏感性。例如，可通过与羧酸反应而保护肽的N-末端氨基，而且可通过与胺反应而保护肽的C-末端羧基。修饰的其它实例包括糖基化和磷酸化。另外的潜在修饰是R或K侧链胺上的氢可被亚甲基代替(-NH₂→-NH(Me)或-N(Me)₂)。

根据本发明的肽的类似物还可包括增加或减少肽的体内半衰期的肽变体。能够增长按照本发明使用的肽的半衰期的类似物的实例包括肽的类肽类似物、肽的D-氨基酸衍生物和肽-类肽杂合体。按照本发明使用的变体多肽的另外的实施方案包括多肽的D-氨基酸形式。使用D-氨基酸而非L-氨基酸制备多肽大大减少正常代谢过程对这种药剂的任何不想要的破坏，减少待施用的药剂的量以及施用频率。

本发明提供的肽可衍生自由编码亲本蛋白链的原始转录子的可变剪接产生的mRNA所编码的亲本蛋白的剪接变体。肽还可衍生自亲本蛋白的保持过敏原的至少MHC结合性质的氨基酸突变体、糖基化变体和其它共价衍生物。示例性衍生物包括这样的分子，其中本发明的肽通过取代、化学、酶促或其它合适手段被除了天然存在的氨基酸以外的部分共价修饰。还包括不同螨中发现的亲本蛋白的天然存在的变体。这样的变体可被等位变体编码或代表可变剪接变体。

可在肽的合成期间或通过生产后修饰，或当肽是重组形式时，使用定点诱变、随机诱变或酶促裂解和/或核酸连接的已知技术来制备如上所述的变体。

根据本发明，组合物可包括的另外的一种或多种肽优选地是SEQ IDNO：1至73任一种的功能变体。也就是说，肽优选地能够引起免疫应答。特别地，它们能够在具有草过敏原的个体中诱导晚期响应。这可通过肽在T细胞样品中诱导T细胞增殖的能力来检验。检验诱导T细胞增殖的方法是本领域中熟知的，且实施例4中示出了一个此类的方法。优选地，一种或多种另外的肽能够在至少20％的T细胞样品中导致T细胞增殖，其中每个样品获自群体中不同的草过敏性个体。本发明的组合物优选地能够在30％或以上获自一组草过敏性个体的T细胞样品中诱导T细胞增殖。更优选地，组合物能够在35％或以上、40％或以上、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％或以上获自一组中敏化个体的样品中诱导T细胞增殖。

组合物还可以能够诱导获自一组中敏化个体的T细胞样品中一种或多种细胞因子的显著释放，所述细胞因子优选地包括干扰素γ、白介素-10和白介素-13中的一种或多种。“显著”释放可通过与以下实施例5中所描述的相似的标准来确定。这样，组合物可能能够在35％或以上、40％或以上、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％或以上获自一组中敏化个体的样品中诱导一种或多种细胞因子的释放。一组草过敏性个体中的个体的数目可以是大于一的任何数目，例如至少2个、3个、5个、10个、15个、20个、30个、50个、80个或至少100个个体。

如果肽引起T细胞增殖，但不导致组胺从来自敏化个体的嗜碱性粒细胞和肥大细胞制备物中释放是优选的。可能存在一些组胺释放，但优选地，组合物不引起大量组胺释放。当利用组合物对来自个体的白细胞样品进行体外刺激时，显著的组胺释放可认为是释放总可获得的白细胞组胺的20％或以上。正常个体通常具有约150ng/10⁷个细胞的白细胞组胺含量。

能够结合TCR的适宜的变体可根据经验衍生或根据已知标准选择。在单个肽中，存在有助于MHC抗原结合沟中的结合的某些残基，以及与T细胞受体的高变区相互作用的其它残基(Allen等人(1987)Nature 327：713-5)。

在有助于T细胞受体相互作用的残基中，已经证明了与取代指定肽残基时T细胞活化的依赖性的相关的层次(hierarchy)。使用已经含有用不同氨基酸取代的一个或多个T细胞受体接触残基的肽，多个研究组已经证明了对T细胞活化过程的深远作用。Evavold & Allen(1991)Nature252：1308-10证明了T细胞增殖和细胞因子产生之间不相关。在该体外模型中，用其中已经进行了天冬氨酸保守取代谷氨酸的肽类似物来攻击对血红蛋白的残基64-76(在I-E^k环境中)有特异性的T细胞克隆。该取代不显著影响类似物结合I-E^k的能力。

用该类似物体外攻击T细胞克隆后，未检测到增殖，尽管保持了IL-4分泌，也保持了该克隆辅助B细胞响应的能力。在随后的研究中，同一组证明了T细胞介导的细胞溶解与细胞因子产生之间的分离。该情况中，前者保持不变而后者受损。McDevitt和同事最初在EAE(实验性过敏性脑脊髓炎)的鼠模型中证明了改变的肽配体在体内的效力(Smilek等人(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88：9633-9637)。在这一模型中通过用MBP(髓磷脂碱性蛋白)的致脑炎的肽Ac1-11免疫来诱发EAE。在位置四(赖氨酸)用丙氨酸残基的取代产生了与其限制性元件(Aα^uAβ^u)结合良好的肽，但其在易感的PL/JxSJLF1品系中是非免疫原性的，而且其在用致脑炎的肽免疫之前或之后施用时还阻止EAE发作。因此，可鉴定肽中影响该肽诱发T细胞各种功能的能力的残基。

有利地，可设计肽以利于T细胞增殖和诱发去敏化。Metzler和Wraith已经证明了在其中已经进行了增加肽-MHC亲和力的取代的肽的致耐受能力提高(Metzler & Wraith(1993)Int Immunol～：1159-65)。Sloan-Lancaster等人(1993)Nature 363：156-9证明，改变的肽配体可在克隆的T细胞导致长期和深远的无反应性。

本发明的组合物可能够在对过敏原敏感的个体中诱发晚期响应。术语“晚期响应”包括列在Allergy and Allergic Disease(过敏症和过敏性疾病)(1997)A.B.Kay(编辑)，Blackwell Science，第1113-1130页中的含义。晚期响应可以是任何晚期响应(LPR)。优选地，肽可能够引起晚期哮喘性响应(LAR)或晚期鼻炎性响应或晚期皮肤响应或晚期眼部响应。可使用本领域公知方法确定特定的肽是否能够产生LPR；特别优选的方法被描述于Cromwell O，Durham SR，Shaw RJ，Mackay J和Kay AB.Provocationtests and measurements of mediators from mast cells and basophils in asthmaand allergic rhinitis(哮喘和过敏性鼻炎中来自肥大细胞和嗜碱性粒细胞的介质的激发测试和测量).于Handbook of Experimental Immunology(实验免疫学手册)(4)第127章，编辑：Weir DM，Blackwell ScientificPublications，1986。

因此，优选地，本发明的单独肽能够在已经对过敏原敏感的个体中诱发LPR。可通过公知程序确定个体是否已经对过敏原敏感，诸如使用过敏原提取物的溶液的皮肤穿刺测试、皮肤LPR的诱发、临床史、过敏原攻击和用于测量过敏原特异性的IgE的放射性过敏原吸附测试(RAST)。可由医师基于例如这样的测试来确定特定个体是否被预期得益于治疗。

使得个体去敏化或免疫耐受过敏原表示在适当地敏化的个体中抑制或阻挠由过敏原诱发的过敏组织反应。已显示，可选择性地活化T细胞，并随后使之无响应性。此外，使这些T细胞无应答或将其消除导致患者对特定的过敏原去敏化。去敏化表现为在第二次或进一步施用该过敏原或过敏原衍生的肽时减少或优选地消除对过敏原或过敏原衍生的肽的响应。第二次施用可在经过允许去敏化发生的合适时间段后进行；这优选地为一天到数周之间的任何期间。大约两周的间隔是优选的。

尽管本发明的组合物可能够在草过敏个体中诱发LPR，应理解的是，当组合物被用于治疗患者时，优选地使用足够低浓度的组合物以致不发生可观察到的LPR，但响应将足以部分地将T细胞去敏化以致可给予下一(优选地更高的)剂量，如此继续。以这种方式，建立剂量以提供完全的去敏化但通常从来不在患者中诱发LPR。然而，该组合物或肽能够在比所施用的较高的浓度下这样做。

本发明的组合物可能够在群体的一组草过敏个体的50％或更多中诱发晚期响应。更优选地，组合物能够在一组敏化的个体的55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多或者90％或更多中诱发LPR。可通过本领域公知方法确定组合物是否能够在一组受试者的某一百分比中诱发LPR。

将理解的是，本发明的肽包括由作为MHCⅡ类结合所需要的最少必需序列的核心的9个氨基酸所组成的T细胞表位。然而，该肽还可包括在核心的9个氨基酸侧翼的另外残基。因此该肽可包括包含T细胞表位的区域，其中一些残基可被修饰而不影响表位的功能。因此，如上定义的肽的功能变体包括被改进以相对于肽的天然序列提高溶解度的肽。提高的溶解度对于受试者对衍生本发明的肽的过敏原的免疫耐受作用是有益的，因为对受试者施用难溶剂导致不期望的、非免疫耐受的炎性响应。通过改变在包含T细胞表位的区域侧翼的残基，可提高肽的溶解度。可改造本发明的肽以使其可溶性更高，以致其包括：

i)T细胞表位侧翼的肽的残基的N末端：与刚好在衍生所述肽的蛋白序列中所述残基的N末端的两个至六个连续氨基酸相对应的一个至六个连续氨基酸；和/或

ii)T细胞表位侧翼的肽的残基的C末端：与刚好在衍生所述肽的蛋白序列中所述残基的C末端的一个至六个连续氨基酸相对应的一个至六个连续氨基酸；或

iii)T细胞表位侧翼的肽的残基的N末端和C末端，选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少一个氨基酸。

任选地，可另外地改造该肽为可溶性更高的，以使：

i)所述肽天然序列中的任何半胱氨酸残基被丝氨酸或2-氨基丁酸代替；和/或

ii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的至多三个氨基酸中的、不包含在T细胞表位中的任何疏水性残基；和/或

iii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的最多四个氨基酸中包含序列Asp-Gly的、不包含在T细胞表位中的任何两个连续氨基酸；和/或

iv)在N末端和/或C末端添加了一个或多个带正电荷的残基。

经改造以提高溶解度的肽的例子是如实施例8中所描述的Rye 09B和Tim07B。具有提高的溶解度的变体显示于表8。这样，肽Rye 09B1(SEQID NO：91)，KPEVKYAVFEAALTKAIT；Rye 09B2(SEQ ID NO：92)，KKPEVKYAVFEAALTKAIT，Tim 07B1(SEQ ID NO：93)，KKIPAGELQIIDKIDA，Tim 07B2(SEQ ID NO：94)，KKIPAGELQIIDKIDAK是具有提高的溶解度的变体的优选的例子。SEQID NO：91至94可因此优先地作为以上天然肽的替代物用于本发明的组合物中。

核酸和载体

组成本发明的组合物和产物的单独肽可被直接施用，或可通过从编码序列来表达而被间接施用。例如，可提供编码本发明的肽组合，诸如上述任何肽的组合的多核苷酸。因此本发明的肽的组合可从编码并能够表达它的多核苷酸产生或以该形式递送。本文对使用、递送或施用本发明的肽的组合的任何提及意在包括经由从编码它的多核苷酸表达而间接使用、递送或施用这样的肽组合。

因此，本发明提供了用于通过免疫耐受作用预防或治疗对草的过敏症的组合物，该组合物包括至少一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列在表达时导致如上所述适用于通过免疫耐受作用预防或治疗对草的过敏症的组合物的产生。

本发明还提供了产物，该产物包括编码如上所述的a)至h)的多肽或其变体的四种或更多种不同的多核苷酸；且其中每种不同编码的多肽用于同时地、分别地或顺序地预防或治疗人类对草的过敏症。

术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文可互换使用，并且指的是任何长度的核苷酸即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物的聚合形式。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸可以以分离的或纯化的形式被提供。

“编码”所选择的多肽的核酸序列是当被置于合适的调节序列控制下时，在体内被转录(在DNA的情形下)和翻译(在mRNA的情形下)为多肽的核酸分子。编码序列的边界是由在5’(氨基)末端的起始密码子和在3’(羧基)末端的翻译终止密码子所决定的。为了本发明的目的，这样的核酸序列可包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，来自病毒或原核DNA或RNA的基因组序列，和甚至合成的DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3’。

可根据本领域公知的方法合成本发明的多核苷酸，如例如在Sambrook等人(1989，Molecular Cloning-a laboratory manual(分子克隆实验手册)；Cold Spring Harbor Press)中描述的方法。

可以以表达盒的形式提供本发明的多核苷酸分子，其包括可操作地连接于插入序列的控制序列，从而允许本发明的肽在目标受试者中体内表达。反过来，这些表达盒通常在适于用作核酸免疫的试剂的载体(例如，质粒或重组病毒载体)中被提供。这样的表达盒可被直接施用于宿主受试者。可选地，包含本发明的多核苷酸的载体可被施用于宿主受试者。优选地，使用遗传载体制备和/或施用该多核苷酸。合适的载体可以是能够携带足够量的遗传信息并允许本发明的肽的表达的任何载体。

因此，本发明包括包含这样的多核苷酸序列的表达载体。因此，本发明提供用于通过免疫耐受作用预防或治疗草过敏症的载体，其包含编码本发明的不同多肽的四种或更多种多核苷酸序列以及任选地编码本文定义的不同多肽的一种或多种另外的多核苷酸序列。载体可包含编码本发明的不同多肽的4、5、6或7种多核苷酸序列。载体优选地包括编码选自如上所述的SEQ ID NO：1至27或其变体的多肽的第一多核苷酸序列，和编码选自如上所述的SEQ ID NO：28至73或其变体的多肽的第二多核苷酸序列。该(第一)载体可与一种或多种其它的载体联合使用，所述其它载体提供非由第一载体编码的、本发明的不同的多肽的编码序列。

此外，将理解的是，本发明的组合物和产物可包括多肽和多核苷酸的混合物。因此，本发明提供本文所定义的组合物或产物，其中代替任何一种多肽的是能够表达所述多肽的多核苷酸。

以分子生物学技术常规地构建表达载体，而且其可例如包括使用质粒DNA和可能是必要的并以正确方向放置的合适的起始因子、启动子、增强子和其它元件，诸如例如多聚腺苷酸化信号，以允许表达本发明的肽。其它合适的载体对于本领域技术人员是明显的。在这一方面作为另外的实例，我们参考Sambrook等人。

因此，通过将这样的载体递送到细胞并允许发生从载体的转录，可提供本发明的多肽。优选地，载体中本发明的或用于本发明的多核苷酸被可操作地连接于能够提供宿主细胞对编码序列的表达的控制序列，即，该载体是表达载体。

“可操作地连接”是指元件的排列，其中如此描述的组分被设置以进行其通常的功能。因此，当存在适当的酶时，可操作地连接于核酸序列的指定的调节序列诸如启动子能够实现该序列的表达。启动子不必与序列连续，只要它起作用来指导序列表达。因此，例如，未翻译但被转录的干预序列可存在于启动子序列和核酸序列之间，并且仍可认为该启动子序列被“可操作地连接”于编码序列。

本领域中已描述了若干表达系统，其中每一种通常由包含可操作地连接于表达控制序列的目标基因或核苷酸序列的载体所组成。这些控制序列包括转录启动子序列以及转录起始和终止序列。本发明的载体可以是例如拥有复制起点即任选地用于表达所述多核苷酸的启动子和任选地启动子的调节子的质粒、病毒或噬菌体载体。“质粒”是染色体外遗传元件形式的载体。载体可包含一种或多种可选择的标记基因，例如在细菌质粒情况下的氨苄西林抗性基因或用于真菌载体的抗性基因。载体可被用于体外例如产生DNA或RNA，或者用于转染或转化宿主细胞例如哺乳动物宿主细胞。载体还可适于体内使用，例如以允许多肽的体内表达。

“启动子”是起始并调节编码多肽的多核苷酸的转录的核苷酸序列。启动子可包括诱导型启动子(其中可操作地连接于启动子的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等所诱发)、阻抑型启动子(其中可操作地连接于启动子的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等所阻抑)和组成型启动子。术语“启动子”或“控制元件”预期包括全长启动子区域和这些区域的功能(如，控制转录或翻译的)区段。

根据本发明的多核苷酸、表达盒或载体可另外地包括信号肽序列。信号肽序列通常被插入到与启动子可操作地连接以使信号肽被表达并促进还与启动子可操作地连接的编码序列所编码的多肽的分泌。

通常，信号肽序列编码10至30个氨基酸例如15至20个氨基酸的肽。通常这些氨基酸主要是疏水的。在典型情况下，信号肽将带有信号肽的生长中的多肽链靶向于表达细胞的内质网。信号肽在内质网中被切除，允许经高尔基体分泌多肽。因此，通过从个体中的细胞表达并从这些细胞分泌，可向个体提供本发明的肽。

可选地，本发明的多核苷酸可以以合适的方式表达以允许本发明的肽被II类MHC分子呈递在抗原呈递细胞表面。例如，本发明的多核苷酸、表达盒或载体可靶向于抗原呈递细胞，或在这样的细胞中可优先刺激或诱发被编码的肽的表达。

在一些实施方案中，多核苷酸、表达盒或载体将编码佐剂，或以其它方式提供佐剂。如本文所用的，术语“佐剂”指能够特异性地或非特异性地改变、提高、定向、重定向、增强或起始抗原特异性免疫反应的任何材料或组合物。

目标多核苷酸可用于在体外、活体外或体内产生本发明的肽。可施用这样的多核苷酸或通过免疫耐受作用将其用于过敏症的预防或治疗。

用于基因递送的方法是本领域已知的。参见例如美国专利第5,399,346、5,580,859和5,589,466号。核酸分子可直接引入接受的受试者，诸如通过标准的肌内或皮内注射；经皮的颗粒递送；吸入；局部，或通过口服、鼻内或粘膜施用方式。可选地，分子可活体外引入已从受试者取出的细胞。例如，本发明的多核苷酸、表达盒或载体可活体外引入个体的APC。将包含目标核酸分子的细胞再次引入受试者以致可针对核酸分子编码的肽建立免疫应答。用于这种免疫的核酸分子在本文通常称为“核酸疫苗”。

本发明的多肽、多核苷酸、载体或细胞可以以基本上分离的形式存在。它们可以与不干扰其预期用途的运载体或稀释剂混合，并仍被认为是基本上分离的。它们还可以是基本上纯化的形式，在该情况下它们通常将占制剂的蛋白、多核苷酸、细胞或干物质的至少90％，如至少95％、98％或99％。

抗原呈递细胞(APC)

本发明包括产生在其表面上呈递本发明的肽的APC群体的方法的体外使用，该APC群体随后可用于治疗。可对从患者获得的细胞样品在活体外进行这样的方法。因此以这种方式产生的APC形成可用于通过免疫耐受作用治疗或预防草过敏症的药剂。细胞应被个体的免疫系统接受，因为它们衍生于该个体。将以这种方式产生的细胞递送到最初获得细胞的个体，从而形成本发明的治疗性实施方案。

制剂和组合物

本发明的肽、多核苷酸、载体和细胞可单独或组合地提供给个体。本发明的每种分子或细胞可以以分离的、基本上分离的、纯化的或基本上纯化的形式提供给个体。例如，可对个体提供基本上不含其它肽的本发明的肽。可选地，可利用标准肽偶联试剂将组合物中的四种或多种肽偶联在一起，以提供含有优选的表位的单一的肽。将按照单独的肽来筛选这样的肽的嗜碱性粒细胞组胺释放以确定其没有组胺释放。在另一个实施方案中，组合物中的四种或更多种肽可作为单一多肽链的部分来提供，即，通过从编码多核苷酸进行的重组方式。四种或多种肽可邻接地融合，或可替代地被适当的接头分隔。

尽管根据本发明的肽、多核苷酸或组合物可能以原料形式被呈现，但优选地作为药物制剂将它们呈现。因此，根据本发明的另一方面，本发明提供用于通过免疫耐受作用预防或治疗草过敏症的药物制剂，其包含根据本发明的组合物、载体或产物连同一种或多种药学上可接受的运载体或稀释剂和任选地一种或多种其它治疗成分。运载体必须在与制剂的其它成分相容且不危害其接受者的意义上是“可接受的”。通常，用于注射和最终制剂的运载体是无菌和无热原的。优选地，运载体或稀释剂是硫代甘油。

配制包含本发明的肽、多核苷酸或细胞的组合物可使用标准的药物配制化学和方法学进行，所有这些对于普通技术人员都易于获得。

例如，包含本发明的一种或多种分子或细胞的组合物可与一种或多种药学上可接受的赋形剂或媒介物合并。辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和诸如此类可在赋形剂或媒介物中存在。这些赋形剂、媒介物和辅助物质通常是在接受组合物的个体中不诱发免疫应答的药剂，而且其可被施用而没有不当毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体诸如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油、硫代甘油和乙醇。其中还可包括药学上可接受的盐，例如，无机酸盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐和诸如此类；以及有机酸盐诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐和诸如此类。关于药学上可接受的赋形剂、媒介物和辅助物质的完全讨论可在Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷氏药学原理)(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中获得。

可以以适于弹丸施用或连续施用的形式制备、包装或销售这样的组合物。可以以单位剂量形式制备、包装或销售注射组合物，诸如在安瓿或含有防腐剂的多剂量容器中。组合物包括但不限于悬液、溶液、油性或水性媒介物中的乳剂、糊剂和可植入的缓释或可生物降解的制剂。这样的组合物还可包括一种或多种另外的成分，其包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的组合物的一个实施方案中，以干燥(如粉末或颗粒)形式提供活性成分以便在肠胃外施用重构的组合物之前用合适的媒介物(如无菌无热原的水)进行重构。可以以无菌可注射的水性或油性悬液或溶液形式制备、包装或销售药物组合物。这种悬液或溶液可根据已知技术配制，并且除了活性成分以外，可包括另外的成分诸如本文所述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。例如，可使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂诸如水或1，3-丁二醇来制备这样的无菌注射制剂。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和不挥发油诸如合成的单或二甘油酯。有用的其它的可肠胃外施用的组合物包括包含微晶形式的、在脂质体制品中的或作为可生物降解的聚合物系统的组成部分的活性成分的那些。用于缓释或植入的组合物可包括药学上可接受的聚合或疏水物质诸如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。

可选地，可将本发明的肽或多核苷酸包被，吸附或与连接到微粒运载体。合适的微粒运载体包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些，以及衍生自聚(丙交酯)和丙交酯-乙交酯共聚物的PLG微粒。参见例如，Jeffery等人(1993)Pharm.Res.10：362-368。还可使用其它颗粒系统和聚合物，例如聚合物诸如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺以及这些分子的轭合物。

本文提到的任何肽、多核苷酸或细胞的制剂将取决于诸如物质的性质和递送方法等因素。可以以多种剂型施用任何这样的物质。可以以口服(如，作为片剂、糖锭剂、锭剂、水性或油性悬液、可分散的粉末或颗粒)、局部、肠胃外、皮下、吸入、静脉内、肌内、胸骨内、经皮、皮内、舌下、鼻内、含服或输注技术进行施用。物质还可作为栓剂被施用。医师将能够确定每个特定个体需要的施用途径。

本发明的制剂或组合物将包括有效而不导致副作用的合适浓度的每种肽/多核苷酸/细胞。通常，组合物中每种肽的浓度将在0.03至200nmol/ml的范围中。更优选地在0.3至200nmol/ml、3至180nmol/ml、10至150nmol/ml、5至200nmol/ml或30至120nmol/ml的范围中。组合物或制剂应具有大于95％或98％的纯度或至少99％的纯度。

在本发明的一个方面，佐剂可与本发明的多肽/多核苷酸/细胞联合使用。佐剂优选地以足够增加本发明的多肽/多核苷酸/细胞的作用的量来施用，或反之亦然。佐剂或其它治疗剂可以是增强本发明分子的作用的剂。例如，其它剂可以是增强对本发明的肽或细胞的响应的免疫调节分子或佐剂。

因此在一个实施方案中，本发明的肽、多核苷酸、细胞或组合物与一种或多种其它治疗剂一起用于治疗。这些剂可被分别、同时或顺序地施用。它们可以在相同或不同组合物中被施用。因此，在本发明的方法中，还可用另外的治疗剂来治疗受试者。

因此，可配制一种组合物，其包括本发明的分子和/或细胞以及一种或多种其它治疗分子。可选地，本发明的组合物可与作为组合治疗的一部分的一种或多种其它治疗组合物同时地、顺序地或分别地使用。

佐剂的非限制性例子包括维生素D、雷帕霉素和糖皮质激素类固醇，比如地塞米松、氟地松、布的松、莫米松、倍氯米松、氢化可的松、醋酸可的松、强的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、倍他米松和曲安西龙。优选的糖皮质激素是地塞米松。

治疗方法和待治疗的个体

本发明涉及能够使得人类个体去敏化或免疫耐受上述过敏原并因此可用于预防或治疗草过敏症的肽、多核苷酸、载体和细胞。本发明提供用于通过免疫耐受作用预防或治疗草过敏症的组合物、产物、载体和制剂。本发明的组合物可用来减少过敏性症状或改善过敏性个体的状况。本发明还提供使得草过敏个体免疫耐受或去敏化的方法，其包括单独或组合地施用上述本发明的多肽/多核苷酸/细胞。

将用本发明的组合物或制剂治疗或提供的个体优选地是人类。应理解的是，待治疗的个体可以是已知对过敏原敏感的个体，即处于被敏化或怀疑被敏化的风险中。可使用本领域公知和本文所述的技术来测试个体的敏化作用。可选地，个体可具有草过敏症的家族史。可能不必测试个体对草的敏化作用，因为当暴露于草时个体可展现过敏症的症状。暴露表示接近例如禾本科植物，或来源于禾本科植物的物质或产物，或包含或包括以上任一种的物质或产物。来源于禾本科植物的物质或产物典型地是草花粉。接近表示距离上述物品10米或更少、5米或更少、2米或更少、1米或更少或者0米。过敏症的症状可包括眼睛痒、流鼻涕、呼吸困难、皮肤红痒或皮疹。

待治疗的个体可以是任何年龄。然而，优选地，该个体可处于1至90、5至60、10至40或更优选地18至35的年龄组。

优选地，待治疗的个体来自具有在白种人人群中有代表性的频率范围内的MHC等位基因频率的人群。11个常见DRB1等位基因家族的参考人群等位基因频率被显示在表A中(数据来自HLA Facts Book(HLA事件簿)，Parham和Barber)。

表A

通过分析报告频率的多个研究来获得参照频率，而所示附图是平均值。因此优选地，待治疗的个体来自具有与表A所指的等位基因(诸如至少1、2、3、4、5种或所有等位基因)的参照人群相等的MHC等位基因频率的人群，例如在图中范围加或减1、2、3、5、10、15或20％的范围内。

优选地，个体来自这样的人群，其中如下DRB1等位基因的等位基因频率是：

4-至少9％

7-至少10％

11-至少8％。

个体可能已具有草过敏症达至少2周、1月、6月、1年或5年。个体可患有过敏症导致的皮疹、鼻充血、流鼻涕和/或咳嗽。个体可能已被或未被施用治疗草过敏症的其它组合物/化合物。个体可能生活在具有以下的地理区域中：

-温带气候，和/或：

-典型土壤pH在约3.5、4或4.5至约5.5、6、7或8的范围内；和/或

-平均年降水量不少于每年约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20cm，且不大于每年约180cm、250cm、300cm、400cm或500cm；和/或

-年最低温度不小于约-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃、1℃、2℃、3℃、4℃或5℃；和/或

-年最高温度不大于约35℃、约30℃、约29℃、约28℃、约27℃、约26℃、约25℃、约24℃、约23℃或约22℃；和/或

-纬度介于约北纬30°到约南纬30°之间。

个体通常在特定的季节患有对草的过敏症。该季节通常对应于草的花期，其典型地为夏季，优选地初夏(例如在北半球从5月到6月)或夏末(例如在北半球从8月到10月)。草过敏性个体通常对草花粉过敏。

组合免疫疗法

因为许多个体对多种多肽抗原过敏或可能需要对多种多肽抗原去敏化，本发明还提供为对多种抗原过敏的个体去敏化的手段。在个体中诱发的对第一多肽抗原或过敏原的“耐受”可在个体中产生“致耐受环境”，其中可下调对其它抗原不适当的免疫应答以提供对其它抗原的耐受。

该发现是指，对多种过敏原过敏的个体可以在大大减少的时间段中被治疗，而且对一些过敏原(如花生)严重过敏但对其它过敏原(如猫皮屑)中度过敏的个体可从这样的治疗受益，在所述治疗中建立对较温和的过敏原的耐受，并随后将这种致耐受环境用于提供对其它更极端过敏原的耐受。此外，患有自身免疫性疾病且另外地对无关抗原或过敏原过敏(或以其他方式免疫)的个体可从这样的治疗方案受益，在所述治疗方案中首先建立对无关抗原或过敏原的耐受，并随后将这种致耐受环境用于提供对与自身免疫性疾病相关的自身抗原的耐受。

因此提供了用于使草过敏个体对上述草过敏原和一种或多种另外的不同多肽抗原去敏化的方法。该方法要求，在第一步中向个体施用上述的根据本发明的组合物/产物/制剂(主要组合物)，其中所述施用是以足以产生针对草过敏原的低响应状态的方式进行。一旦建立了针对草过敏原的低响应状态，或至少发生朝向去敏化的转变，该方法要求施用包含个体将对其敏化的第二不同的多肽抗原的第二组合物。以这样的方式进行第二组合物的施用以利用通过使用主要组合物建立的致耐受环境，其中现在可能建立对第二不同多肽抗原的耐受性。将第二组合物与第一主要组合物或草过敏原的较大片段共施用。“共施用”是指同时或共同施用，例如，当两种物质存在于同一组合物中，或在不同组合物中以几乎相同时间但在不同部位施用，以及在不同时间不同组合物中的多肽抗原递送。例如，可在递送第一组合物之前或之后在相同或不同部位递送第二组合物。递送之间的时间安排可以从间隔约数秒变化到间隔约数分钟、间隔数小时或甚至间隔数天。此外，可采用不同的递送方法。

适宜的过敏原的类别包括但不限于，尘螨过敏原、花粉、动物皮屑(尤其是猫皮屑)、草、霉菌、灰尘、抗生素、针昆虫毒液和多种环境(包括化学品和金属)、药物和食物过敏原。常见的树过敏原包括来自三角叶杨、杨树、白蜡树、桦树、枫树、橡树、榆树、山核桃树和美国山核桃树的花粉；常见的植物过敏原包括来自艾蒿、豕草、英国车前草、酸模和藜的那些；植物接触性过敏原包括来自毒栎、毒叶藤和荨麻的那些；常见的草过敏原包括黑麦草、梯牧草、约翰逊草、百慕大草、羊茅草和蓝草过敏原；常见的过敏原还可从霉菌或真菌获得，诸如链格孢属(Alternaria)、镰孢菌属(Fusarium)、着色芽生菌属(Hormodendrum)、曲霉属(Aspergillus)、小多孢菌属(Micropolyspora)、毛霉属(Mucor)和嗜热放线菌(thermophilicactinomycetes)；表皮过敏原可从房屋或有机灰尘(通常来源于真菌)获得或从动物来源诸如羽毛和狗皮屑获得；常见的食品过敏原包括牛奶和奶酪(乳制品)、鸡蛋、小麦、果仁(如花生)、海产品(如贝壳)、豌豆、大豆和麸质过敏原；常见的环境过敏原包括金属(镍和金)、化学品(甲醛、三硝基苯酚和松节油)、乳胶、橡胶、纤维(棉或羊毛)、粗麻布、染发剂、化妆品、去垢剂和香料过敏原；常见的药物过敏原包括局部麻醉和水杨酸盐过敏原；抗生素过敏原包括青霉素、四环素和磺胺过敏原；而常见的昆虫过敏原包括蜜蜂、黄蜂和蚂蚁毒液以及蟑螂萼器过敏原。特别充分表征的过敏原包括但不限于主要的猫过敏原Fel d 1、蜜蜂毒液磷脂酶A2(PLA)(Akdis等人(1996)J.Clin.Invest.98：1676-1683)、桦树花粉过敏原Bet v 1(Bauer等人(1997)Clin.Exp.Immunol.107：536-541)和多表位的重组的草过敏原rKBG8.3(Cao等人(1997)Immunology 90：46-51)。

特别优选的T细胞表位来源于以下过敏原：猫皮屑蛋白Fel d 1；屋尘螨蛋白Der p 1、Der p 2和Der p 7；豚草蛋白amb a 1.1、a 1.2、a 1.3或a 1.4；黑麦草蛋白Lol p 1和Lol p 5；猫尾草蛋白Phl p 1和Phl p 5；狗牙根蛋白Cyn d 1；细交链孢菌(Alternaria alternate)蛋白Alt a 1、Alt a 2和烯醇酶(Alt a 6)；桦木蛋白Bet v 1和P14；德国小蠊蛋白Bla g 1、Bla g 2、Bla g3、Bla g 4、Bla g 5和Bla g 6；艾蒿蛋白Art v 1；俄国蓟蛋白Sal k 1和Salk 2；花生Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 4、Ara h 5、Ara h 6，植物抑制蛋白或脂质转移蛋白或人白细胞抗原。

这些和其它合适的过敏原是商业上可获得的和/或可按照已知技术容易地制备为提取物。

优选地，第二多肽过敏原是草过敏原或草过敏原片段，更具体地是选自通过以下数据库登录号(NCBI Entrez登录号)来索引的草过敏原序列的列表的草过敏原或草过敏原片段。NCBI是美国国家生物技术信息中心并且是美国国家卫生研究院的分支机构。可获取进入数据库的NCBI网址是www.ncbi.nlm.nih.gov/。过敏原序列由数据库登录号来索引。75232277 Dac g 1、75139988 Dac g 1、75232276 Dac g 1、33149335 Dac g 1、33149333 Dac g 1、75163303 Dac g 5、75163399 Dac g 5、75163400 Dac g 5、14423124 Dac g 5、14423122 Dac g 5、14423120 Dac g 5、1171005 Hol l 1、3860384 Hol l 1、414703 Hol l 1、1167836 Hol l 1、1085628 Hol l 1、2266625Hol l 5、2266623 Hol l 5、75172041 Hol l 5、75098038 Hol l 5、75098037 Holl 5、11991229 Hol l 5、2266623 Hol l 5、2506771 Hor v 1、282991 Hor v 1、75219009 Hor v 5、126385 Lol p 1、168314 Lol p 1、6599300 Lol p 1、75274600 Lol p 1、168316 Lol p 1、3210053 Lol p 1、3210049 Lol p 1、3210047 Lol p 1、3210050 Lol p 1、3210044 Lol p 1、3210043 Lol p 1、3210041 Lol p 1、3210039 Lol p 1、3210037 Lol p 1、3210036 Lol p 1、3210035 Lol p 1、3210034 Lol p 1、3210033 Lol p 1、3210032 Lol p 1、3210030 Lol p 1、100636 Lol p 1、320616 Lol p 1、320614 Lol p 1、100638Lol p 1、100636 Lol p 1、320614 Lol p 1、100637 Lol p 1、126386 Lol p 2a、126387 Lol p 3、2498581 Lol p 5a、4416516 Lol p 5a、485371 Lol p 5a、100639 Lol p 5a、3409495 Lol p 5a、3409494 Lol p 5a、3409493 Lol p 5a、3409489 Lol p 5a、3409488 Lol p 5a、3409487 Lol p 5a、3409486 Lol p 5a、3409484 Lol p 5a、3409483 Lol p 5a、3409481 Lol p 5a、3409479 Lol p 5a、3409478 Lol p 5a、3409477 Lol p 5a、3409476 Lol p 5a、3409475 Lol p 5a、3409474 Lol p 5a、3409473 Lol p 5a、3409472 Lol p 5a、3409471 Lol p 5a、3409470 Lol p 5a、3409469 Lol p 5a、3409468 Lol p 5a、3409467 Lol p 5a、3409466 Lol p 5a、3409456 Lol p 5a、3209999 Lol p 5a、3210002 Lol p 5a.3210003 Lol p 5a、3210004 Lol p 5a、3210005 Lol p 5a、3210006 Lol p 5a、3210007 Lol p 5a、3210008 Lol p 5a、3210009 Lol p 5a、3210010 Lol p 5a、3210011 Lol p 5a、3210012 Lol p 5a、3210013 Lol p 5a、3210014 Lol p 5a、3210015 Lol p 5a、3210017 Lol p 5a、3210018 Lol p 5a、3210019 Lol p 5a、3210020 Lol p 5a、3210021 Lol p 5a、3210022 Lol p 5a、3210023 Lol p 5a、3210024 Lol p 5a、3210025 Lol p 5a、3210026 Lol p 5a、542129 Lol p 5a、2498582 Lol p 5b、3409457 Lol p 5b、626028 Lol p 5b、542131 Lol p 5b、455288 Lol p 5b、6634467 Lol p 5c、455288 Lol p同种型9、1582249 Lol p11，另外的黑麦草属序列：135480；417103；687261；687259；1771355；2388662；631955；542131；542130；542129；100636；626029；542132；320616；320615；320614；100638；100634；82450；626028；100639；283345；542133；1771353；1763163；1040877；1040875；250525；551047；515377；510911；939932；439950；2718；168316；168314；485371；2388664；2832717；2828273；548867；3409458 Pha a 1、3210038 Pha a 1、2498576 Phaa 1、1246116 Pha a 1、3210031 Pha a 1、3210027 Pha a 1、3210028 Pha a 1、3210029 Pha a 1、82450 Pha a 1、409328 Pha a 1、2498580 Pha a 5、2498579Pha a 5、2498578 Pha a 5、2498577 Pha a 5、1246120 Pha p 5、1246119 Phap 5、1246118 Pha p 5、1246117 Pha p 5、3409480 Pha p 5、3409482 Pha p 5、3409490 Pha p 5、1171008 Phl p 1、28373838 Phl p 1、28373839 Phl p 1、473360 Phl p 1、3901094 Phl p 1、1582250 Phl p 1、75221090 Phl p 1、3210052Phl p 1、3210046 Phl p 1、3210040 Phl p 1、629812 Phl p 1、481432 Phl p 1、1684718 Phl p 5、13430402 Phl p 5、3135501 Phl p 5、3135499 Phl p 5、3135497 Phl p 5、1684720 Phl p 5、40644796 Phl p 5、3309039 Phl p 5、3309041 Phl p 5、739542 Phl p 5、3309047 Phl p 5、3309045 Phl p 5、3309043Phl p 5、3135503 Phl p 5、626037 Phl p 5、2851456 Phl p 5a、2398757 Phl p5a、1092249 Phl p 5a、29500897 Phl p 5a、422005 Phl p 5a、3409492 Phl p 5a、2851457 Phl p 5b、481397 Phl p 5b、1096197 Phl p 5b、2398759 Phl p 5b、3409491 Phl p 5b；另外的猫尾草属序列：458878；548863；2529314；2529308；2415702；2415700；2415698；542168；542167；626037；542169；541814；542171；253337；253336；453976；439960；75267691 Poa p 1、4090265 Poa p 1、280414 Poa p 1、320620 Poa p 1、250525 Poa p 5、75172042Poa p 5、113562 Poa p 9、113561 Poa p 9、113560 Poa p 9、729944 Zea m 1、115502168 Zea m 1b、11550238 Zea m 1d、115502167 Zea m 1c、122238295Zea m 1、75272187 Zea m 1、115502389 Zea m 1、162459584 Zea m 1、89892723 Zea m 1、293902 Zea m 1、89892721 Zea m 1、114794319 Zea m 1、478272 Zea m 1。

递送方法

配制之后，可使用多种已知途径和技术将本发明的组合物在体内递送到受试者。例如，可作为注射溶液、悬液或乳液提供组合物，并使用常规针头和注射器或使用液体喷射注射系统通过肠胃外、皮下、表皮、皮内、肌内、动脉内、腹膜内、静脉内注射施用。组合物还可局部施用于皮肤或粘膜组织，诸如鼻内、气管内、肠内、直肠或阴道，或作为适于呼吸道或肺部施用的细碎的喷雾而被提供。其它施用方式包括口服施用、栓剂、舌下施用、主动或被动的经皮递送技术。

当将施用本发明的肽时，优选地将肽施用到身体中的部位，在那里该肽将具有接触合适的抗原呈递细胞的能力，并且在那里该肽将具有接触个体的T细胞的能力。当将施用APC时，优选地将APC施用到身体中的部位，在那里APC将具有接触并活化个体的适宜的T细胞的能力。

递送方案

可通过上述任何合适的方法施用肽/多核苷酸/细胞(诸如包含多种肽的组合物)。可由经验确定肽的合适量，但其通常是在以下提供的范围中。单次施用每种肽可足以对患者产生有益的作用，但将理解的是，如果肽施用多于一次那么它可能是有益的，在这种情况下典型的施用方案可以是，例如，每6个月中每周一次或两次持续2-4周，或每四到六个月中每天一次持续一周。将被理解的是，每种肽或多核苷酸或者肽和/或多核苷酸的组合可被单独或组合地施用于患者。

用于施用的剂量将取决于若干因素，包括组合物的性质、施用途径和施用方案的时间表和时间安排。本发明的分子的合适剂量可以在每次施用中多达15μg、多达20μg、多达25μg、多达30μg、多达50μg、多达100μg、多达500μg或更多的量级。合适的剂量可少于15μg，但至少1ng、或至少2ng、或至少5ng、或至少50ng、或至少100ng、或至少500ng、或至少1μg、或至少10μg。对于本发明的一些分子，使用的剂量可更高，例如，多达1mg、多达2mg、多达3mg、多达4mg、多达5mg或更高。这样的剂量可以以液态制剂提供，其浓度适于允许由所选途径施用适当体积。

药盒

本发明还涉及本文所述的适于用于本发明的治疗的成分的组合，其以药盒的形式被包装在容器中。这样的药盒可包括允许本发明的治疗的一系列成分。例如，药盒可包括本发明的一种或多种不同肽、多核苷酸和/或细胞，或本发明的一种或多种肽、多核苷酸或细胞和适于同时施用或者用于顺序或分别施用的一种或多种另外的治疗剂。药盒可任选地包含其它合适的试剂或说明书和类似物。

本发明由以下实施例阐释：

实施例1

II类MHC结合搜索

本研究的目的是为了鉴定对八种最常见的人类MHCⅡ类HLA-DRB1*同种异型具有强亲和力的一组独特的肽。为了鉴定主要草过敏原Rye Lol p 1、Rye Lol p Va、p Vb、p 5a和p 5b、狗牙根Cyn d 1和猫尾草Phl p 5中的结合肽，利用商业上可获得的EpiMatrix算法(EpiVaxInc.)应用了称作“肽穿线(peptide threading)”的计算机模拟方法。这是对来自一条序列的肽被II类MHC HLA-DR分子的结合沟容纳的潜力的生物信息学分析。EpiMatrix是一种基于矩阵的算法，其将长为9个氨基酸的区段进行排序，通过结合于所选择的每种MHC分子的估计概率而将来自任何多肽序列的8个氨基酸进行重叠。(De Groot等人，AIDS Researchand Human Retroviruses 13：539-41(1997))。建立矩阵基序的程序被发表在Schafer等人，16 Vaccine(疫苗)1998(1998)中。在该实施例中，评价了对HLA DR1、DR3、DR4、DR7、DR8、DR11、DR13和DR15的结合潜力。通过对蛋白序列中每个9聚体框架评分来选择推定的MHC配体。通过将9聚体的序列与已知结合每种MHC等位基因的氨基酸序列的矩阵进行比较来得出这一分数。回顾性研究已证明，EpiMatrix准确地预测了所发表的MHC配体(Jesdale等人，在Vaccines(疫苗)’97中(Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1997))。还已证实对结合多种MHC分子的肽的成功预测。

由EpiMatrix如下计算对所选的MHC分子结合的估计概率。通过对与指定MHC等位基因的已知MHC结合物相比之下每个氨基酸对结合的相对促进或抑制进行估计来对肽评分。将横跨该肽的该信息加和，并将汇总分数(EMX分数)指定给整个肽。在比较EMX分数与已知MHC配体的分数后，EpiMatrix得到“估计结合概率”(缩写为EBP，但并不严格地是概率)。EBP描述具有与将结合指定MHC分子的肽一样高或更高的EpiMatrix分数的肽的比例。EBP从100％(非常可能结合)变化到少于1％(非常不可能结合)。

通过EpiMatrix分析的多肽序列显示于表1中：

表1

Ber01 ori	SGKAFGAMAKKGQEDKLRKA
		Ber02 ori	PKDSDEFIPMKSSWGAIWRIDPKKPLKGP
Ber03 ori	RLTSEGGAHLVQDDVIPANWKPDTVYTSK
		Bio01 ori	QKLIEKINAGFKAAVAA
Bio02 ori	AYVATLTEALRVIAGTL
		Bio03 ori	KFIPTLVAAVKQAYAAKQAT
Bio04 ori	TALKKAVTAMSEAEKEA
		Bio05 ori	NDKFTVFESAFNKALNE
Rye01 ori	LDAKSTWYGKPTGAGPKDNG
		Rye02 ori	GHAFGSMAKKGEEQNVRSAG
Rye03 ori	GSNPNYLAILVKYVDGDGDV
		Rye04 ori	KESWGAVWRIDTPDKLTGPF
Rye05 ori	DVNAGFKAAVAAAANAPPAD
		Rye06 ori	GATPEAKYDAFVTALTEALR
Rye07 ori	GELQIVDKIDAAFKIAATAANAAPTNDKF
		Rye08 ori	GAYETYKFIPSLEAAVKQAY
Rye09 ori	PEVKYAVFEAALTKAITAMTQAQKAGKPA
		Tim10 ori	PEVKYTVFETALKKAITAMSEAQ

基于这些序列的EpiMatrix分析的结果，鉴定出预测具有良好的MHC结合性质的核心肽。所选择的肽显示于表2中。肽以灰色突出显示，且标记*的为未被选择的肽。这些对应于EpiMatrix中分析的原始序列，随后选择的肽来源于所述原始序列。例如，Ber01来源于Ber01 ori。

表2

组1肽

组5肽

Tim＝猫尾草；Rye＝黑麦草；Cyn＝狗牙根

以上所表示的具有N末端谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)残基的任何肽，例如Rye 08A，可将该残基代替为焦谷氨酸以改进制造过程中的稳定性而不影响肽的功能。通常使用其中已发生这样的替换的肽来获得对这些肽的进一步测试的数据。

对三种已知的猫尾草序列的完整序列进行进一步的EpiMatrix分析：猫尾草Phl p 1(NCBI登录号1N10A)、猫尾草Phl p Va(NCBI登录号Q40962)和猫尾草Phl p Vb(登录号Q40963)。该分析鉴定了预测具有良好的MHCⅡ类结合的另外的核心肽(和其侧翼序列)。这些序列显示于以下的表3A-C中。在每个表中：

“主序列中的残基”提供被分析的序列中肽的位置。核心肽(加下划线的中间的粗体氨基酸)界定分析中所鉴定的实际结合序列。包括了稳定化侧翼(N-末端和C-末端，非粗体)以与核心序列一起使用，而且通常需要所述稳定化侧翼来帮助制造肽。“击中数(number of hits)”是指序列中对被测试的所有MHC类型的高预测结合亲和力的数目。“EpiMatrix串分数(EpiMatrix Clúster Score)”衍生自对串长度标准化的击中数。因此串分数是预测的总MHC结合性质相对于随机肽标准物的过量或不足。认为高于10的分数表示宽的MHC结合性质。

表3

A)1N10A-Phl p 1

B)Q40962-Phl p Va

C)Q40963-Phl p Vb

实施例2

同源性搜索

如上鉴定为MHCⅡ类-结合的肽的每种的序列被用来探测草过敏原组中衍生亲本序列的可选蛋白的序列。例如，肽Rye01来自Lol p 1，因此Rye01的序列被用来探测组1中来自其它草物种(尤其是猫尾草)的保守序列。Rye Lol p 1的残基的分析结果显示于以下，并与来自猫尾草Phl p 1和狗牙根Cyn d 1的相应序列相比较：

Rye 19-38：                           LDAKSTWYGKPTGAGPKDNG(RYE01 ori)

猫尾草                                LDAKSTWYGKPTGAGPKDNG

Rye 109-128：                         GHAFGSMAKKGEEQNVRSAG(Rye02 ori)

猫尾草                                GHAFGAMAKKGDEQKLRSAG

Cyn d 1 109-128：                     SGKAFGAMAKKGQEDKLRKA

Rye 154-173：                         GSNPNYLAILVKYVDGDGDV(Rye03ori)

猫尾草                                GSNPNYLALLVKYVNGDGDV

Rye 190-209：                         KESWGAVWRIDTPDKLTGPF(Rye04ori)

猫尾草                                GKDKWIELKESWGAIWRIDTPDKLTGPF

Cyn d 1 181-209.                      PKDSDEFIPMKSSWGAIWRIDPKKPLK

Cyn d 1 217-241

EGGAHLVQDDVIPANWKPDTVYTSK

猫尾草                                EGGTKTEAEDVIPEGWKADTSYESK

相似地，以下所显示的为如所示的Rye Lol p 5的残基的结果，与来自如所示的猫尾草phl p5变体的相应序列相比较：

Rye 37-56：         DVNAGFKAAVAAAANAPPAD(Rye 05 ori)

Phl p 5a            KINAGFKAALAGAGVQPAD

Phl p Va            KINAGFKAALAGAGVQPAD

Phl p 5             KINDGFKAALAAAAGVPPAD

Phl p Vb            DINVGFKAAVAAAASVPAAD

Phl p Vb            DINVGFAAVAAAASVPAAD

Rye 100-119：       GATPEAKYDAFVTALTEALR(Rye 06 ori)

Phl p 5a            GATPEAKYDAYVATLSEALR

Phl p Va            GATPEAKYDAYVATLSEALR

Phl o 5             GATPEAKYDAYVATLSEALR

Phl p Vb            GATPEAKFDSFVASLTEALR

Phl p Vb            GATPEAKFDSFVASLTEALR

Rye 145-164：       GELQIVDKIDAAFKIAATAA(来自Rye 07ori)

Phl p 5a            GELQVIEKDAAFKVAATAA

Phl p Va            GELQVIEKVDAAFKVAATAA

Phl p 5             GELQFIEKVDSALKVAATAA

Phl p Vb            GELQIIDKIDAAFKVAATAA

Phl p Vb            GELQIIDKIDAAFKVAATAA

Rye 154-173：       DAAFKIAATAANAAPTNDKF(来自Rye 07ori)

Phl p 5a            DAAFKVAATAANAAPANDKF

Phl p Va            DAAFKVAATAANAAPANDKF

Phl p 5             DSALKVAATAANAAAANDKF

Phl p Vb            DAAFKVAATAAATAPADDKF

Phl p Vb            DAAFKVAATAAATAPADDKF

Rye 190-209：       GAYETYKFIPSLEAAVKQAY(Rye 08 ori)

Phl p 5a            GAYESYKFIPALEAAVKQAY

Phl p Va            GAYESYKFIPALEAAVKQAY

Phl p 5             GAYESYKFIPALEAAVKQAY

Phl p Vb            GAYDTYKCIPSLEAAVKQAY

Phl p Vb            GAYDTYKCIPSLEAAVKQAY

Rye 217-236：       PEVKYAVFEAALTKAITAMT(来自Rye 09ori)

Phl p 5a            PEVKYTVFETALKKAITAMS

Phl p Va            PEVKYTVFETALKKAITAMS

Phl p 5             PEVKYTVFETALKKAITAMS

Phl p Vb            PEVKYTVFETALKKAITAMS

Phl p Vb            AEVKYAVFEAALTKAITAMS

Rye 226-245：       AALTKAITAMTQAQKAGKPA(来自Rye 09ori)

Phl p 5a            TALKKAITAMSEAQKAAKPA

Phl p Va            TALKKAITAMSEAQKAAKPA

Phl p 5T            ALKKAITAMSEAQKAAKPA

Phl p Vb            AALTKAITAMSEVQKVSQPA

Phl p Vb            AALTKAITAMSEVQKVSQPA

来自猫尾草蛋白的序列与实施例1中所选择的Rye序列是高度保守的，基于猫尾草蛋白的序列，预测衍生自这些序列的另外的肽具有良好的MHC结合性质。这些另外的肽显示于表4中。

表4

组1肽

组5肽

实施例3

体外结合分析

在含水的酸性环境中预筛选被鉴定为潜在的MHCⅡ类结合的肽的溶解度，并在体外MHCⅡ类结合分析中检验所述肽。

方法

采用的分析是竞争性MHCⅡ类结合分析，其中分析每种肽代替来自所研究的每种人类MHCⅡ类同种异型的已知对照结合物的能力。本研究中使用的同种异型和对照肽为以下显示的那些：

同种异型	对照肽	序列
			DRB1*0301	结核分枝杆菌/麻风分枝杆菌hsp 65 2-16	AKTIAYDEEARRGLE
DRB1*1101	流感血凝素307-319	PKYVKQNTLKLAT
			DRB1*1501	人类髓磷脂碱性蛋白85-99	ENPVVHFFKNIVTPR

体外结合分析中所用的对照肽

在竞争分析中分析了来自表2-4的每种肽(标记*的那些除外)，并筛选了与对照肽相比的相对结合。由于竞争性分析的性质，每种肽的数据以其自身的IC50与对照肽的IC50的比值来确定。因此，具有与对照肽相等的IC50值的肽具有相同的结合亲和力，而具有小于1的比值的肽具有较高亲和力，而具有大于1的比值的肽具有较低亲和力。

水溶液中的溶解度是肽作为有效治疗剂的基本标准。因此，作为溶解度筛选的结果，将排除在多个结合记录中具有高频率的大型疏水氨基酸残基的非常疏水的肽。这是非种系选择性(promiscuous)HLA-DRB1*结合物的特征。鉴定了与一种或多种MHCⅡ类同种异型结合的肽。预期这样的肽将具有与未经由MHC结构的同源性进行测试的相似同种异型结合的能力。

实施例4

以下的方法应用于与实施例3中相同的肽。

细胞增殖分析

对PBMC进行细胞增殖分析(对于待检验的所有参数需要140×10⁶个细胞)。通过掺入放射性标记的化合物3H-胸苷来测量增殖。更具体地，将100μl适当的抗原或肽浓度分配到96孔培养板的适当的孔中。然后将培养板置于设置为37℃的潮湿的5％CO2培养箱中，持续最多4个小时。室温下在完全培养基中将如上所述分离的PBMC制备为2×10⁶个细胞/ml的浓度。然后将100μl细胞溶液分配到含有抗原/肽的96孔培养板中的每个孔中。然后孵育培养板6至8天。通过向每个孔添加10μl的氚化的胸苷母液(无血清的RPMI培养基中1.85MBq/ml)而利用氚化的胸苷溶液对培养物进行脉冲处理。然后将培养板返回到培养箱中培养8和16小时之间。然后利用Canberra Packard FilterMate 196细胞收获器来收获细胞。利用适当的β闪烁计数器来计数干燥的过滤垫。

将来自含有肽的孔的计数与仅含有培养基的孔的计数在统计学上进行比较(每组12个孔)。使用非参数曼-怀二氏检验。对所有对象使用相同的统计学检验。仅有培养基的孔和肽刺激的孔之间的统计学上显著的差异被认为是肽对PBMC的阳性刺激。

实施例5

选择实施例1的EpiMatrix分析所鉴定的、包括预测与至少5/8的MHCⅡ类等位基因(HLA DR01、03、04、07、08、11、13、15)结合的一个或多个表位的59种肽，用于进一步的研究。在许多情况下预测所述表位与这些等位基因中的所有8个相结合。一些序列具有与相同或不同的MHCⅡ类等位基因结合的两个或更多个重叠表位或不重叠但邻近的表位。所选择的肽示于以下的表5A和5B中。

使用来自48个草过敏性个体的外周血单核细胞(PBMC)来检验44种肽在所描述的体外T细胞细胞因子释放分析中的活性。利用Ficoll密度梯度离心从肝素化的血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。结果显示于表5A中。在28个草过敏性的受试者中检验了另一组的15种肽。结果显示于表5B中。受试者来自Hamilton和周边地区，Ontario，Canada。在PBMC培养物的上清液中检验了肽对干扰素γ(IFN-γ)、白介素-10(IL-10)和白介素-13(IL-13)的产生的刺激。

细胞因子释放分析

分析了PBMC响应于肽刺激的细胞因子分泌概况。利用ELISA分析检验了来自细胞因子释放分析的上清液的3种细胞因子——IFN-γ、IL-10和IL-13的存在。利用多重微珠阵列(Luminex Corporation)分析了所有3种细胞因子的存在。细胞因子释放分析通常需要每个受试者的40×10⁶个PBMC。更具体地，将250μl的具有适当抗原或肽浓度的200μg/ml溶液分配到48孔培养板的适当的孔中。然后将板在37℃下在潮湿的5％CO₂培养箱中孵育最多4个小时。随后向每个孔添加250μl的5×10⁶个细胞/ml的PBMC悬液，并将板返回培养箱孵育5天。刺激后，收集培养上清液的样品以根据标准实验方案通过多重微珠分析来进行检验。通常，将样品收获到3等份中并冷冻直到进行ELISA分析。

当读数比没有加入肽的对照孔中的读数高四倍时取得细胞因子分泌的刺激的阳性结果。在第一组48个受试者中的18个以上或在第二组的28个受试者中的9个以上对一种或多种细胞因子得到阳性结果的肽被认为是在草过敏症治疗中特别有用的。在第一组的48个受试者中所检验的44种肽中的20种，在第二组的28个受试者中所检验的15种肽中的8种满足以上标准。

表5A显示了在48个的组中对三种细胞因子为阳性的数目，表5B显示了在28个的组中对三种细胞因子为阳性的数目。满足以上所定义的标准的优选的肽以粗体突出显示。

表5A

表5B

实施例6

单独的草肽的排序标准

对以实施例5中所用的标准为基础选择为在草过敏症的治疗中特别有用的28种肽进行进一步的评价以比较它们的特征。这包括计算所观察到的每种肽对所有3种细胞因子的累积响应，即，总评分(对三种细胞因子响应子(responder)的数目的总和)。还以物理和化学性质为基础，尤其是溶解度、pI和疏水性指数(GRAVY)，考虑了每种肽的药物开发方面。还利用Epimatrix软件预测了对MHCⅡ类HLA DR等位基因的结合强度，值显示为对于所示的每个特定MHCⅡ类HLA DR等位基因的高(1％)、中(5％)和低(10％)亲和性。

对于14种特别优选的肽的该分析的结果如表6所示。对这些特别优选的肽分配了1至14的内部排序顺序，该排序顺序对应于发明人对其治疗草过敏症的相对功用的评价。主要根据总评分(对三种细胞因子的响应子数目的总数)对14种肽进行排序，并将一些加权置于IFN-γ响应上。还考虑了如上所述的药物开发方面和MHC覆盖。

表6

对特别优选的草肽的排序的顺序如下：1，Ber01(SEQ ID NO：1)，Cynd 1；2，Tim07B(SEQ ID NO：69)，Phl p 5；3，Bio04A(SEQ ID NO：31)，Lol p 5；4，Rye09B(SEQ ID NO：46)，Lol p 5；5，Ber02(SEQ ID NO：2)，Cyn d 1；6.Ber02C(SEQ ID NO：5)，Cyn d 1；7，Bio03A(SEQ ID NO：29)，Lol p 5；8，Bio02A(SEQ ID NO：28)，Lol p 5；9，Rye08A(SEQ ID NO：43)，Lol p 5；10，Tim10B(SEQ ID NO：53)，Phl p 5；11，Rye05C(SEQID NO：35)，Lol p 5；12，Tim04A(SEQ ID NO：27)，Phl p 1；13，Ber02B(SEQ ID NO：4)，Cyn d 1；14，Tim07G(SEQ ID NO：70)，Phl p 5。

令人惊奇地，排序最前的肽Ber01和前14中的其它三种肽(Ber02、Ber02C和Ber02B)来源于狗牙根过敏原Cyn d 1。狗牙根是温季多年生物种，适应于热带和亚热带气候。其在高温的持续期、暖冬和中度到高度降水量生长得最好。温度是限制其对世界的热带和亚热带区域的适应性的主要环境因素。狗牙根的北部限制延伸到美国的过渡区，在那里低温很少降低到10℉以下。基于此原因，将预期狗牙根过敏原不是加拿大受试者所识别的主要过敏原。并且，多年生黑麦草虽然存在但不是加拿大最常见的草，且前14种肽中的6种(Bio02A、Bio03A、Bio04A、Rye05C、Rye08A、Rye09B)来源于多年生黑麦草过敏原。

以下是在加拿大普遍的草类型的总结。加拿大几乎所有的饲草都是欧洲物种的改良品种。取决于土壤和气候条件，不同的草适应于在加拿大的不同区域中生长。猫尾草(Phleum pratense)是区域的干燥部分外面最广泛生长的草，并且是加拿大东部主要的饲草。麦穗草(Agropyron cristatum)是加拿大西部主要的饲草。鸭茅(Dactylis glomerata)和俄国野生黑麦草(Elymus iunceus)是不列颠哥伦比亚省主要的饲草。雀麦草(Bromusinermis)生长于加拿大东部和大草原。肯塔基蓝草(草地早熟禾(Poapratensis))通常在许多区域生长。关于草原草，3-芒草(Aristida longiseta)发现于不列颠哥伦比亚省的干旱地区，菰(Zizania aquatica)发现于加拿大东部的湖。某些属(例如，剪股颖属(Arctagrostis)和喜极禾属(Arctophila))是加拿大北极地区原产的。草皮草从表现出期望特性的物种发展而来，所述特性例如，生长密度、播种后快速生长、保持绿色的能力等。在加拿大，耐寒力和抗频繁干旱能力也是重要的。常见的加拿大草坪草混合物通常包括早熟禾属(例如，肯塔基蓝草、糙茎蓝草(roughstalkbluegrass))和羊茅属(尤其是匍匐紫羊茅、丘氏羊茅(chewing fescue))，虽然也已开发了其它有用的物种。

根据加拿大草类型的普遍性，非预期地观察到：加拿大来源的草过敏性个体高度响应于来自狗牙根和多年生黑麦草的肽。因此，这样的肽具有在世界范围的草过敏性个体的治疗中广泛应用的潜力。并且，发现引起高水平响应(即，高的总评分)的肽通常来源于习惯上被描述为“次要过敏原”的过敏原蛋白，例如Lol p 5和Phl p 5。为草过敏性受试者中IgE抗体所识别的主要猫尾草过敏原和多年生黑麦草过敏原分别是Phl p 1和Lol p1。在过敏性个体中诱导针对这些主要过敏原的抗体是T细胞依赖性的过程，因此预期诱导高水平T细胞响应的肽将主要来自Phl p 1和Lol p 1。

从实施例5中所检验的59种肽的组确定前14种T细胞刺激性的肽，尤其是鉴定可最佳地组合用于狭窄和特异性选择的前8种肽。从肽的大量初步可能组合中鉴定了组合的狭窄亚组。从前14种排序的肽中选择8种肽的可能性组合的总数为3003。该组合数目(3003)代表着73种肽的原始组中的8种肽的可能的组合(13,442,126,049)的非常小的比例。因此偶然鉴定前8种排序的肽的可能性是极小的。

实施例7

草肽的组合

对以从表6中前8种排序的肽进行的选择为基础的肽组合进行研究以鉴定用于草过敏症治疗的最佳疫苗。对每个组合进行如实施例5中的细胞因子分析。10个最佳组合的结果列于表7中。组1是最佳的组合，且包括所有前8种排序的肽。应注意的是，这些特定组合代表实施例1和2中初步筛选的肽的可能性组合的数目的极小比例。

在48个过敏性个体的研究组的很大比例中以表现出IFN-γ、IL-10和IL-13的显著释放为依据选择最佳的草疫苗混合物。这样，以组合形式提供优选的单独的草肽提高了MHC覆盖并提供了作为草疫苗的通用的优化产物。还基于生产的考虑因素选择了最佳草疫苗混合物，所述生产的考虑因素包括组合中每种肽的物理特征和化学特征。

表7

组合：

1：Ber01；Ber02；Ber02C；Bio02A；Bio03A；Rye09B；Tim07B；Bio04A

2：Ber01；Ber02；Ber02C；Bio02A；Bio03A；Rye09B；Tim07B

3：Ber01；Ber02；Ber02C；Rye09B；Tim07B；Bio04A

4：Ber01；Ber02；Ber02C；Rye09B；Tim07B

5：Ber01；Ber02；Ber02C；Rye09B；Bio04A

6：Ber01；Ber02；Ber02C；Rye09B

7：Ber01；Ber02C；Bio03A；Rye09B；Tim07B；Bio04A

8：Ber01；Ber02C；Rye09B；Tim07B

9：Ber01；Ber02C；Bio03A；Rye09B；Bio04A

10：Ber01；Ber02C；Bio03A；Rye09B

组合1是基于细胞因子释放特征的最佳组合并包括所有前8种排序的肽。该组合提供来源于三种草过敏原的肽，Cyn d1(Ber01；Ber02；Ber02C)、Lol p 5(Bio03A；Rye09B、Bio04A)和Phl p 5(Tim07B)。因此该组合是暴露于特定过敏原时区域差别的原因，虽然来自加拿大研究组的数据表明这可能不是重要的因素。

应注意的是，每个特定最佳组合代表着实施例中初步筛选的肽的可能组合的数目中的极小比例。如上所述，例如，组合1的8种肽混合代表着实施例1和2中筛选的73种肽的13,442,126,049种可能组合中的一种。每个最佳组合在≥39/48的个体中提供了IFN-γ、IL-10和IL-13的显著释放。

值得注意的是，组合2至组合10中保持了高的MHC覆盖，尽管肽的数目和包括实施例6中所鉴定的前8种肽中的哪些特定肽具有显著差异。可发现，即使选择4种肽的组合(组合10)仍得到IFN-γ响应的100％覆盖和IL-10/IL-13响应的83％覆盖。组合10基于来自狗牙根的2种肽和来自多年生黑麦草的2种肽。考虑到这些草在加拿大都不普遍，和来自由草过敏性个体中IgE抗体所识别的主要过敏原——Lol p 1的肽未被包括的事实，利用这样的组合获得的覆盖是令人惊奇的。

实施例8

提高溶解度

鉴定了前8种肽中的两种，Rye09B和Tim07B，具有可被提高的溶解度特征(参见表6)。为提高溶解度，利用肽的N-末端或C-末端处的一个或多个赖氨酸残基设计了多种类似物。在Epimatrix软件中评估了所述肽以确保修饰不影响肽中的T细胞表位，且不产生新生表位。选择了Rye09B(Rye09B1 & Rye09B2)的两种变体肽和Tim07B1 & Tim07B2)。表8中显示了序列和溶解度值。Rye09B的变体的溶解度是天然肽的两倍。Tim07B的变体的溶解度是天然肽的20倍以上。除提高的溶解度外，当在10个受试者的组中检验时，两种变体还保持了它们诱导T细胞细胞因子释放的能力。因此在例如用于治疗性疫苗用途的草肽的任何混合中，Rye09B和Tim07B的这些变体是天然肽的优选的替代物。

表8

肽	序列	溶解度(mg/ml)	SEQ ID NO：
				Rye09B1	KPEVKYAVFEAALTKAIT	10	91
Rye09B2	KKPEVKYAVFEAALTKAIT	10	92
				Tim07B1	KKIPAGELQIIDKIDA	20	93
Tim07B2	KKIPAGELQIIDKIDAK	20	94

实施例9

优选的草疫苗的选择

在试验性生产过程中，发现来自以上组合1中存在的排序靠前的肽的一种肽(Bio03A)由于其具有一串5个连续的疏水性氨基酸而难以生产。当评估草疫苗中不包括Bio03A的影响时，对于48个受试者分析了组合1中存在的其余前7种排序的肽的总的覆盖。在这7个肽混合(Ber01、Ber02、Ber02C、Bio02A、Rye09B、Tim07B和Bio04A)中，Tim07B和Rye07B任选地为具有提高的溶解度的变体Tim07B1和Rye07B1所替代。

在包括Bio03A的8种肽存在下，47/48的受试者(IL-10)、41/48的受试者(IL-13)和48/48的受试者(IFN-γ)表现了阳性细胞因子响应。相比较地，在除Bio03A的7种肽存在下，47/48的受试者(IL-10)、40/48的受试者(IL-13)和48/48的受试者(IFN-γ)表现了阳性的细胞因子响应。因此推断在草疫苗生产中不包括Bio03A将具有很小影响。

将以上的肽组合的响应性质与含有猫尾草花粉、多年生黑麦草花粉和狗牙根花粉的全草花粉提取物(Greer Laboratories)和另外的阳性对照——促细胞分裂原SEB进行比较。全草花粉提取物在11/48(IL-10)、42/48(IL-13)和43/48(IFN-γ)中诱导了细胞因子响应，而另外的阳性对照促细胞分裂原SEB在47/48(IL-10)、48/48(IL-13)和48/48(IFN-γ)中诱导了响应。因此该7肽混合与全草过敏原相比在相似的百分比的人群中提供了强细胞因子响应。

对于优选的7肽草疫苗，肽Ber01、Ber02、Ber02C、Bio02A、Rye09B、Tim07B和Bio04A的选择也基于同源性考虑因素。当在不同的草间对比这些7肽序列时，在许多情况下具有相当大的同源性，这提高了草过敏性个体将响应于肽的可能性。这意味着，这些肽在主要对除狗牙根、猫尾草或多年生黑麦草之外的草发生过敏性响应的那些受试者中仍具有效用。对于以上7种肽同源的来自其它草的序列显示为以上的SEQ ID NO 74至90。例如，Ber01肽包含9聚体表位FGAMAKKGQ，其在其它许多常见草中具有近同源物。

并且，7种疫苗肽源于来自三种最普遍的草(猫尾草、多年生黑麦草和狗牙根)的组1和组5过敏原，并包括与其它常见草(鸭茅、绒毛草、肯塔基蓝草和加那利草)具有完全同源性或显著同源性的表位。因此7种肽的序列使对草花粉过敏性个体的覆盖范围最大化，使疫苗适宜于治疗所有草花粉过敏性个体。

实施例10

组胺释放分析

该分析的目的是为了鉴定实施例9的优选的7肽组合是否能够活化血液嗜碱性粒细胞(作为组织肥大细胞的代替物)而导致组胺释放，组胺释放可能导致治疗期间的过敏性反应。可认为常导致组胺释放的肽组合不适宜用作肽疫苗。

组胺释放要求在嗜碱性粒细胞的表面上与邻近的特异性IgE分子交联。所评价的肽是小的(长度为10-18个氨基酸)，且因此不应该具有显著的三级结构，显著的三级结构将使它们能够保持完整分子的IgE-结合表位的构象。并且，溶液中的肽单体，即使它们被IgE结合，应该不能够与邻近的IgE分子发生交联。评价了从获自草过敏性受试者的外周全血分离的外周血嗜碱性粒细胞的组胺释放。外周血嗜碱性粒细胞用作组织肥大细胞的代替物，后者对于分析是不实用的。分析需要每个受试者的3×10⁶个外周血单核细胞(PBMC)。利用来自实施例9的组合形式的7种草肽对PBMC进行体外孵育。包括对含猫尾草花粉、多年生黑麦草花粉和狗牙根花粉的全草花粉过敏原提取物(Greer Laboratories)响应的组胺释放作为对照。每个分析中还包括了代表总组胺释放的阳性对照，通过对细胞进行两次冷冻/解冻而产生。

通过ELISA测量了组胺浓度，结果表示为阳性对照的百分比(％阳性对照)。根据生产商的说明利用Immunotech组胺释放免疫分析试剂盒(Histamine Release Immunoassay kit)进行分析。利用微滴板孔中的肽、肽混合、全过敏原或缓冲液对PBMC进行体外攻击后，移去上清液，样品中的组胺转化为酰基组胺。通过竞争性酰基组胺ELISA来检验酰基化的样品。

在5个log10范围中(1至10,000ng/mL)分析肽诱导组胺释放的能力。以治疗中可能达到的肽的理论上的体内剂量为基础选择了所分析的浓度范围。基于通过皮内注射的肽的递送，可能存在达10μg/mL每肽的高局部肽浓度。虽然不太可能，存在将全剂量注射到血流中的风险。在该不太可能的事件中，20μg(12nmol)的最大临床剂量的每种肽进入5升的血液体积将导致4.0ng/mL的理论上最大的血液浓度。这处于组胺释放分析剂量范围的低端，并且比分析中所用的最高浓度低2000倍。

将从10到100,000ng/mL的5个log10范围的含有猫尾草花粉、多年生黑麦草花粉和狗牙根花粉的全草过敏原制备物(Greer Laboratories)用作组胺释放的对照。自发的组胺释放的阴性对照通过在仅缓冲液中孵育细胞而生成。

对每个稀释度进行单次测量。ELISA完成后，通过从ELISA分析中生成的标准曲线的内插法来确定单独的组胺水平。对来自样品的结果进行调整以允许稀释。当在冻融的阳性对照中发现肽/过敏原制备物的两个或以上连续稀释引起＞15％的总组胺释放(＞15％的阳性对照)，或在所检验的最高浓度处(对于肽为10μg/mL)获得＞15％的阳性对照的单个值时，认为是“阳性组胺释放”。

在研究中完成了总共45个组胺释放分析。由于培养基加缓冲液阴性对照孔中不可接受的高水平(＞15％)组胺释放或阳性对照孔中无任何响应，排除了这些中的3个分析。因此分析中包括总共42个受试者。研究发现总结于表9。

^*7肽组合：Ber01、Ber02、Ber02C、Bio02A、Rye09B1、Tim07B1和Bio04A。

全草过敏原制备物在100μg/mL时在32/42(76％)的受试者中诱导了15％或更高的组胺释放。即使在10ng/mL的最低浓度，全过敏原在21/42的个体(50％)中诱导了高水平的组胺释放。

相比之下，7肽组合即使在示出了数据的最高浓度处也不能在所检验的42个受试者的任何一个中引起显著的组胺释放，最高浓度时每种肽以10μg/mL存在。这是比仍在半数以上的受试者中引发非常高水平的组胺释放的全过敏原的浓度(10ng/mL)高1000倍的浓度。因此即使在高度敏感的个体中，7肽组合导致IgE介导的反应的潜力是可忽略的。

考虑到该分析中所检验的肽剂量与遵循草疫苗的临床给药的肽的可能浓度相比大量过量，预期施用7肽组合将不会通过IgE介导的或直接肽介导的嗜碱性粒细胞或肥大细胞活化和脱粒导致显著的组胺释放。组胺释放数据表明7肽组合不会引起嗜碱性粒细胞的活化，因此在草过敏性个体中引起IgE介导的急性过敏性反应(系统性的或皮肤局部的)的潜力非常低。

Claims (22)

1.一种适用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的组合物，所述组合物包括：

(a)多肽Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)、Tim10B(KYTVFETALKKAITAMSE)、Tim 04A(WGAIWRIDTPDKL)、Tim 07G(FKVAATAANAAPANDK)、或其任何一种的变体中的至少一种；

(b)多肽Ber01(SGKAFGAMAKKGQED)、Ber02(FIPMKSSWGA)、Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber 02BKDSDEFIPMKSSWGAIWR、或其任何一种的变体中的至少一种；和

(c)多肽Bio04A(LKKAVTAMSEAEK)、Rye09B(PEVKYAVFEAALTKAIT)、Bio02A(KYDAYVATLTEALR)、Bio03A(KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)、Rye 08A(ETYKFIPSLEAAVKQAY)、Rye05C(NAGFKAAVAAAANAPPK)、或其任何一种的变体中的至少一种，其中所述变体是：

I)长度为最多30个氨基酸的较长的多肽，其包括(a)、(b)或(c)中指定的相应多肽的序列，或

II)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括与(a)、(b)或(c)中指定的相应多肽的序列具有至少65％同源性，且能够使得免疫耐受所述相应多肽的序列；或

III)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括(a)、(b)或(c)中指定的相应多肽的序列中至少9个连续氨基酸的序列，或与所述至少9个连续氨基酸具有至少65％同源性的序列，所述至少9个连续氨基酸的序列或同源性序列能够使得免疫耐受所述相应多肽。

2.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物包括：

a)多肽Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)或其变体，

b)多肽Ber01(SGKAFGAMAKKGQED)或其变体，和

c)多肽Bio04A(LKKAVTAMSEAEK)或其变体。

3.一种适用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的组合物，所述组合物包括至少四种不同的选自以下的多肽：

(a)Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)或其变体；

(b)Ber01(SGKAFGAMAKKGQED)或其变体；

(c)Bio04A(LKKAVTAMSEAEK)或其变体；

(d)Rye09B(PEVKYAVFEAALTKAIT)或其变体；

(e)Ber02(FIPMKSSWGA)或其变体；

(f)Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)或其变体；

(g)Bio03A(KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)或其变体；和

(h)Bio02A(KYDAYVATLTEALR)或其变体；

其中所述变体是：

I)长度为最多30个氨基酸的较长的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相应多肽的序列，或

II)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括与(a)至(h)中指定的相应多肽的序列具有至少65％同源性，且能够使得免疫耐受所述相应多肽的序列；或

III)长度为9至30个氨基酸的多肽，其包括(a)至(h)中指定的相应多肽的序列中至少9个连续氨基酸的序列，或与所述至少9个连续氨基酸具有至少65％同源性的序列，所述至少9个连续氨基酸的序列或同源性序列能够使得免疫耐受所述相应多肽。

4.根据权利要求3所述的组合物，所述组合物包括：

(a)多肽Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)或其变体；

(b)多肽Ber01(SGKAFGAMAKKGQED)、Ber02(FIPMKSSWGA)和Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)、或其任何一种的变体中的至少一种；和

(c)多肽Bio04A(LKKAVTAMSEAEK)、ye09B(PEVKYAVFEAALTKAIT)、Bio02A(KYDAYVATLTEALR)和Bio03A(KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)、或其任何一种的变体中的至少一种；和

(a)以上未选择的b)或c)的至少一种另外的多肽。

5.根据权利要求4所述的组合物，所述组合物包括多肽Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)或其变体、多肽Ber01(SGKAFGAMAKKGQED)或其变体、多肽Bio04A(LKKAVTAMSEAEK)或其变体，和以上未选择的b)或c)的至少一种另外的多肽。

6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物还包括以上先前未选择的一种或多种多肽或其变体，所述多肽为如表2至4中所示的SEQ ID NO 1至73中的任何一种。

7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物：

-能够使得群体中的一组草花粉过敏性个体的至少50％或至少60％免疫耐受，和/或

-包括至少一种另外的多肽，最多总共14种不同的多肽，其中所述另外的多肽：

(a)包括与SEQ ID NO：1至73的任何一种中的至少9个或更多个连续氨基酸具有至少65％序列同一性、在以上未选择的序列；和

(b)长度为9至30个氨基酸。

8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物包括至少一种所述多肽，其长度为9-20个氨基酸或13-17个氨基酸。

9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物包括如表7中所列的组合1至10中的任何一个的多肽，其中任选地一种或多种所述多肽可被1(I)或(II)中所定义的其变体所替代。

10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物包括以下多肽：

(a)Tim07B1(KKIPAGELQIIDKIDA)；

(b)Ber01(SGKAFGAMAKKGQED)；

(c)Bio04A(LKKAVTAMSEAEK)；

(d)Rye09B1(KPEVKYAVFEAALTKAIT)；

(e)Ber02(FIPMKSSWGA)；

(f)Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)；和

(g)Bio02A(KYDAYVATLTEALR)。

11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述多肽的一种或多种具有选自以下的一种或多种修饰：

(i)N末端乙酰化；

(ii)C末端酰胺化；

(iii)精氨酸和/或赖氨酸的侧链胺上的一个或多个氢被亚甲基基团所取代；

(iv)糖基化；和

(v)磷酸化。

12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述肽的至少一种已被改造为可溶的，从而其包括：

(i)在T细胞表位侧翼的肽的残基的N末端：一个至六个连续氨基酸，它们与衍生所述肽的蛋白序列中所述残基的N末端紧接的两个至六个连续氨基酸相对应；和/或

(ii)在T细胞表位侧翼的肽的残基的C末端：一个至六个连续氨基酸，它们与衍生所述肽的蛋白序列中所述残基的C末端紧接的一个至六个连续氨基酸相对应；或

(iii)在T细胞表位侧翼的肽的残基的N末端和C末端，选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少一个氨基酸，

其中所述多肽具有至少3.5mg/ml的溶解度，所述T细胞表位具有小于3.5mg/ml的溶解度。

13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述肽的至少一种已被改造为可溶的，从而另外地：

(i)所述肽的天然序列中的任何半胱氨酸残基被丝氨酸或2-氨基丁酸替代；和/或

(ii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的至多三个氨基酸中的、不包含在T细胞表位中的疏水性残基；和/或

(iii)缺失了在所述肽的天然序列的N末端或C末端的最多四个氨基酸中包含序列Asp-Gly的、不包含在T细胞表位中的任何两个连续氨基酸，和/或

(iv)在N末端和/或C末端添加了一个或多个带正电荷的残基。

14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中每种多肽具有0.03至200nmol/ml、0.3至200nmol/ml、50至200nmol/ml或30至120nmol/ml的范围中的浓度。

15.一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的组合物，所述组合物包括至少一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列在表达时导致如权利要求1至13中任一项所定义的组合物的产生。

16.一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的载体，所述载体包括四种或多种多核苷酸序列，每种所述多核苷酸序列编码如权利要求1至13中任一项所定义的不同的多肽。

17.一种产物，所述产物包括：

(a)多肽Tim07B(KIPAGELQIIDKIDA)、Tim10B(KYTVFETALKKAITAMSE)、Tim 04A(WGAIWRIDTPDKL)、Tim 07G(FKVAATAANAAPANDK)、或其任何一种的如权利要求1(I)或(II)中所定义的变体；

(b)多肽Ber01(SGKAFGAMAKKGQED)、Ber02(FIPMKSSWGA)、Ber02C(KSSWGAIWRIDPKKPLK)和Ber02BKDSDEFIPMKSSWGAIWR、或其任何一种的如权利要求1(I)或(II)中所定义的变体中的至少一种；和

(c)多肽Bio04A(LKKAVTAMSEAEK)、Rye09B(PEVKYAVFEAALTKAIT)和Bio02A(KYDAYVATLTEALR)、Bio03A(KFIPTLVAAVKQAYAAKQ)、Rye 08A(ETYKFIPSLEAAVKQAY)、Rye05C(NAGFKAAVAAAANAPPK)、或其任何一种的如权利要求1(I)或(II)中所定义的变体中的至少一种，其中每种不同的多肽是供同时地、分别地或顺序地用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症。

18.一种用于通过免疫耐受作用预防或治疗草花粉过敏症的药物制剂，所述药物制剂包括根据权利要求1至15中任一项所述的组合物；根据权利要求16所述的载体；或根据权利要求17所述的产物；和药学上可接受的运载体或稀释剂。

19.根据权利要求18所述的组合物、载体或产物，所述组合物、载体或产物被配制为用于口服施用、局部施用、鼻内施用、皮下施用、舌下施用、皮内施用、口腔施用、表皮或贴剂施用、或用于通过吸入或通过注射施用。

20.如权利要求1-15中任一项所定义的组合物，或如权利要求17中所定义的产物，所述组合物或产物另外地包括另外的多肽过敏原，用于使个体免疫耐受所述另外的多肽过敏原。

21.一种确定T细胞是否识别如权利要求1至14中任一项所定义的组合物的体外方法，所述方法包括将所述T细胞与所述多肽接触并检测所述T细胞是否被所述多肽刺激。

22.根据权利要求21所述的方法，进行所述方法以确定个体是否患有草花粉过敏症或处于患草花粉过敏症的风险中。