KR100263393B1 - 라이그라스 화분 알레르겐 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 2종의 라이그라스 화분 알레르겐 Lol p Ib족 멤버, 즉 정제한 Lol p Ib.1 및 Lol p Ib.2 단백질, 및 이들의 단편을 암호화하는 핵산 서열과, 재조합 Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2 또는 이들의 하나 이상의 단편, 또는 이들의 유도체나 동족체를 생산하는 방법, 및 본 발명의 핵산 서열, 단백질 및 펩티드를 사용하는 방법을 제공한다.
Description
[발명의 명칭]
라이그라스 화분 알레르겐
[도면의 간단한 설명]
제1도는 포아세아(Poaceae)군 Ib 알레르겐에 특이성이 있는 cDNA 클론의 분리를 나타낸다. 제1a도는 알레르기 환자의 혈청으로부터 3가지 상이한 MAb FMC A1(40.1), FMC A7(12.3), 3.2(칸 및 마아쉬(1986) Molec. Immunol. 23 : 1281-1288 ; 싱그 및 녹스(1985) 알레르기 및 응용 미생물학의 국제 문서 78, 300-304 ; 스마트 등(1983) 알레르기 및 응용 미생물학의 국제 문서 72 243-248) 및 IgE에 의한 양성 클론(12R)의 인지를 예시한 것이다. C는 1차 MAb를 생략한 대조용이다. 제1b도는 라이그라스 화분으로부터 I군 항원에 결합하는 IgE 및 MAb의 면역 블롯 분석을 나타낸다. 레인1은 전체 단백질의 프로필(쿠마시 블루 염색)을; 레인2는 MAb 21.3을, 레인3은 MAb 40.1을; 레인4는 MAb 3.2를; 레인5는 12.3를; 레인6은 IgE 항체를 나타낸다.
제2도는 Ib군 알레르겐 전사체의 조직형 및 세포형 특이적인 발현을 나타낸다. 제2a도는 RNA 블롯 혼성화를 나타낸다. 폴리(A) + RNA를 상이한 식물 조직, 즉 종자, 잎, 뿌리 및 화분으로부터 분리하였다. 제2b도는 Ib군 항원의 조직형 및 세포형 특이적인 분포에 관한 면역 블롯 분석을 나타낸다. 가용성 단백질을 상이한 식물 조직, 즉 꽃, 잎, 뿌리 및 화분으로부터 추출하고 MAb 40.1(패널 1), 12.3(패널 2) 및 IgE 항체(패널 3)를 사용하여 면역 블로팅하였다.
제3도는 Lol p Ib.1으로 명명된 라이그라스 회분 클론 12R의 cDNA 서열, 예측 아미노산 서열 및 친수성 프로필을 나타낸다. 제3a도는 람다-12R cDNA의 개략적 제한 지도를 나타낸다. 평행선 박스는 예측 해독 개방 해독틀을 나타낸다. 제3b도 및 제3c도는 1229 누클레오티드 EcoRI cDNA 삽입체 람다-12R의 누클레오티드 서열 및 추론된 아미노산 서열을 나타낸다. 단일 문자 코드로 나타낸 추론된 아미노산 서열은 DNA 서열 아래에 나타내었고, 누클레오티드 40의 최초의 잠재적 틀내 개시 코돈에서 시작된다. 하나의 해독되지 않는 개방 해독틀은 301개 아미노산(DNA 서열 아래에 숫자로 표시)에 걸쳐 연속되며, 별표로 나타낸 TGA 정지 코돈으로 끝난다. 추정 신호 펩티드는 음수로 나타내었다. 아미노산 잔기 1-9, 12-17 및 19는 N-말단 서열 분석에 의해 확인하였다. 제3d도는 홉 및 우즈(1981)의 문헌(Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 78 : 3824-3828)의 방법에 근거하여 예측된 아미노산 서열의 친수성 프로필을 7개 아미노산의 윈도우로 나타낸다.
제4도는 면역 블로팅을 사용하여 Lol p Ib.1(클론 12R)내 IgE 및 MAb-반응성 에피토프를 도시한 것이다. 제4a도는 IgE 항체를 ; 제4b도는 MAb 40.1을; 제4c도는 MAb 12.3을 나타낸다. 제4a-c도에 대한 대조예는 비-재조합 플라스미드로 형질전환시킨 박테리아에 의해 제공된다.
제5도는 특이적 MAb 및 임뮤노골드 탐침을 사용하여 라이그라스의 성숙한 화분의 Lol p Ia 및 Lol p Ib 를 검출한 결과를 나타낸다. 제5a도는 스캐닝 전자 현미경으로 시각화한 전체 화분 알갱이를 나타내는데, 하나의 배공(germinalpore)을 보여주고 있다. 스케일 바는 30㎛. 제5b도는 임뮤노-골드 위치 탐지-이중 표지법에 의해 Lol p Ia 및 Lol p Ib의 세포 부위를 검출한 결과를 나타낸다. 제5c도는 물에 30초간 노출시킨 후 새로운 생존성 화분의 모양을 어두운 배경의 조명으로 나타낸 것이다.
제6도는 20가지 상이한 그라스로부터 유래한 변성되지 않은 화분 단백질에 결합하는 항체를 나타낸다. 레인 A-E 는 기재된 그라스 종들의 화분 단백질에 대한 다양한 항체들의 결합을 보여준다. - 레인 A) IgE, 레인 B) FMC-A1 항체, 레인 C) FMC-A-7 항체, 레인 D) LpIX-3A 항체, 및 레인 E) LpIX-4A 항체.
제7도는 SDS-PAGE 구배에 의해 분리하고, 쿠마시 브릴리언트 블루 R250 염색, 및 혈청 IgE(제7b도), 단일 클론 항체 FMC-A1(제7c도), 단일 클론 항체 FMC-A-7 제7d도), 항체 LpIX-3A(제7e도) 및 항체 LpIX-4A(제7f도)의 결합에 의해 시각화하였다. 각각의 레인들은 제6도에 나타낸 그라스에 상응한다.
제8도는 (a) 알레르기 환자 및 (b) 비-알레르기 환자로부터 수집한 혈청을 사용하여 벡터 람다 gt11에서 클론 19R의 면역 검색한 결과를 나타낸 것이다.
제9도는 Lol p Ib.2 (클론 19R), Lol p Ib.1(클론 12R) 및 Lol p Ia의 부분 제한 엔도누클레아제지도를 나타내는 개략도이다.
제10a도 및 제10b도는 Lol p Ib.2(클론 19R)의 cDNA 서열 및 예측 아미노산 서열을 나타낸다.
제11도는 카이트 및 둘리틀의 문헌(1982. J. Mol. Biol.157:105-132)의 방법에 근거하여 Lol p Ib.2에 대한 예측 아미노산 서열의 가소성 프로필을 9개 아미노산의 윈도우로 나타낸 그래프이다.
제12a도 및 제12b도는 Lol p Ib.2(클론 19R) 및 Lol p Ib.1(클른 12R)의 cDNA 서열을 비교하여 나타낸 것이다. 막대는 DNA 서열 사이의 동일성을 나타낸다. 갭은 최대 유사도를 보이는 해독된 영역내에 삽입되어 있다. 클론 19R내에 삽입된 갭의 숫자는 14이다. 클론 12R에 삽입된 갭의 숫자는 35이다. 전체 서열 동일성은 887 염기(72.2%)이다.
제13도는 Lol p Ib.2(클론 19R) 및 Lol p Ib.1(클론 12R)의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이다. 갭은 최대 유사성을 나타내는 해독 영역내에 삽입되어 있다. 막대는 아미노산 서열 사이의 동일성을 나타내며, "s" 는 아미노산 서열사이의 유사성을 나타낸다. "유사한" 것으로 말해지는 아미노산은 A, S와 T ; D 와 E ; N 과 Q ; R 과 K ; I, L, M과 V ; 및 F, Y 와 W이다. 클론 19R내에 삽입된 갭의 숫자는 4이다. 두 서열들은 201개 동일한 아미노산(66.8%)과 38개의 "유사한" 아미노산(12.6%)을 포함하고 있다.
제14도는 클론 19R의 조직-특이적 발현을 나타낸다. 제14(a)도는 클론19R 에 특이적인 82염기 단편을 탐침으로 사용한 라이그라스 화분, 잎, 뿌리 및 종자의 전체 RNA의 노오던 블롯 분석을 나타낸다. 제14(b)도는 피숨 사티붐(Pisum sativum)의 리보좀 DNA를 탐침으로 사용한 라이그라스 화분, 잎, 뿌리 및 종자의 전체 RNA의 노오던 도트 블롯 분석을 나타낸다. 제14(a)도 및 제14(b)도에서 모든 조직에 대해 20㎍의 전체 RNA를 적재하였다.
제15도는 2차원 웨스턴 블롯 분석에서 알레르기 환자의 혈청을 탐침으로 사용한 화분 단백질을 나타낸다. 군 Ia는 성분 1-4 ; 군 Ib는 성분 5-12 ; 군 IV는 성분 13-15 ; 군 II는 성분 16-17이며, 군 III은 미지의 것이다.
제16도는 라이그라스 화분 단백질의 2차원 웨스턴 분석을 나타낸다. 모든 경우에, 라이그라스 화분 단백질은 등전위 포커싱(좌측에서 우측으로)과 이어서 SDS-PAGE(상부에서 하부로)에 적용시켰다.
(a) 은 염색된 전체 단백질의 2차원 겔 전기 영동 분리 결과, (b) 그라스 화분 알레르기 환자에게서 수집한 혈청의 전체 IgE 항체를 탐침으로 사용한 2차원 웨스턴 블롯, (c) MAb FMC-A7을 탐침으로 사용한 2차원 웨스턴 블롯, (d) Lol p Ib.1 에서 친화도에 의해 정제한 IgE 항체를 탐침으로 사용한 2차원 웨스턴 블롯, 및 (e) Lol p Ib.2에서 친화도에 의해 정제한 IgE 항체를 탐침으로 사용한 2차원 웨스턴 블롯.
제17도는 이.콜리 Y1090 에서 람다 gt11 Lol p Ib.1(클론 12R), Lol P Ia(클론 13R) 및 Lol p Ib.2(클론 19R)의도트 블롯 검색 걸과를 나타낸다. 클론 12R, 13R 및 19R 과 비재조합 람다 gt11의 파아지 종균 2㎕를 10mM IPTG로 포화된 니트로셀룰로즈 필터로 유도시킨 이.콜리 Y1090의 로온상에 스폿팅하였다. 그후 단백질 블롯은 30 명의 그라스 알레르기 환자의 혈청을 탐침으로 사용하였다.
a=Lol p Ib.1, b=Lol p Ia, c=Lol p Ib.2 및 d=비재조합 람다 gtl1. [〈]=Lol p Ia 및 Lol p Ib.1 보다 Lol p Ib.2 에 결합된 IgE 의 보다 높은 레벨을 가진 개인. [1]=Lol p Ia 에 특이적인 IgE 를 가진 개인. [2]=Lol p Ib.1 및 Lol p Ib.2 에 특이적인 IgE 를 가진 개인.
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 라이그라스(ryegrass)인 롤리움 페레네(Lolium perenne L.)의 화분에서 유래한 알레르겐성 단백질 및 이들의 단편, 유도체 및 동족체에 관한 것이며, 그들과 면역학적 연관 관계가 있는 알레르겐성 단백질에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 라이그라스의 화분에서 유래한 주요 알레르겐성 단백질족 Lo1 p Ib 및 Lol p Ib 단백질족의 관련 단백질에 관한 것이다.
관련 출원에 관한 언급
본 출원인은 1991년 8월 16일 출원된 미국출원 일련번호 제746,702호의 일부 계속 출원이며, 후자의 출원은 1990년 3월 24일 출원된 미국출원 일련번호 제585,086호의 일부 계속 출원이며, 상기 두 출원의 명세서를 본원에 참고로 인용하였다.
[발명의 배경]
인구의 약 10%를 구성하는 유전적 소인성 개인은 그들이 노출되는 다양한 환경적 근원에서 유래한 항원에 과민 반응(알레르기)을 일으키게 된다. 즉시 즉시 형 및/또는 지연형 과민 반응을 유도할 수 있는 상기 항원들은 알레르겐으로 알려져 있다(킹, T.P., Adv. Immunol. 23 77-105(1976)). 건초열, 천식 및 두드러기의 증후를 포함하는 아나필락시 또는 아토피가 즉시형 알레르기일 형태이다. 그것은 풀, 나무, 잡초, 동물의 인설(dander), 곤충, 식품, 약제 및 케미칼의 생성물과 같은 다양한 아토피성 알레르겐에 의해 유발될 수 있다.
아토피성 알레르기에 관여하는 항체는 주로 IgE류의 면역글로불린에 속한다. IgE는 비만 세포 및 호염기구에 결합한다. 비만 세포 또는 호염 기구에 결합된 IgE와 특이 알레르겐의 결합시 IgE는 세포 표면에 교차 결합하여 IgE-항원 상호 작용의 생리학적 효과를 초래한다. 이러한 생리학적 효과로는 예를 들어 히스타민, 세로토닌, 헤파린, 호산성 백혈구에 대한 주화성 인자 및/또는 류코트리엔 C4,D4 및 E4의 방출을 들 수 있으며, 그것은 기관지 평활근 세포의 지속 협착을 야기한다(후드, L.E. 등. 면역학, 제2판, 더 벤자민/커명 퍼블리싱 컴퍼니 인코오 포레이티드(1984)). 이들 방출된 물질은 IgE와 특이적 알레르겐과의 결합에 의해 야기된 알레르기 증후를 초래하는 매개 물질이다. 그들을 통해 알레르겐의 효과가 표명된다. 그러한 효과는 항원이 체내로 들어가는 경로, 및 비만 세포 또는 호염기구상에 IgE의 침착 유형에 따라 성질상 전신적이거나 국부적일 수 있다. 국부적 징후는 일반적으로 알레르겐이 체내로 들어가는 위치의 상피 표면에서 일어난다. 전신적 효과로는 아나필락시(아나필락시성 쇼크)가 있는데, 그것은 순환성(혈관내) 항원에 대한 IgE-호염기구 반응의 결과이다.
알레르겐이 그라스 화분의 가장 많은 단백질을 구성하는데, 그것은 온대 기후에서 알레르기 질병의 주원인이다(마아쉬(1975), 알레르겐 및 알레르기의 유전학 ; M, 셀라(편집), 항원들, 제3권, 271-359면, 아카데믹 프레스 인코오포레이트, 런던, 뉴욕, 힐 등(1979)의 메디칼 저널 오브 오스트레일리아 1, 426-429). 라이그라스의 알레르겐성 단백질에 관한 최초의 설명은 그들이 면역화학적으로 구별되며 I, II, III 및 IV군으로 알려져 있음을 보여주었다(존슨 및 마아쉬(1965) 네이쳐, 206, 935-; 및 존슨 및 마아쉬(1966) 면역화학 3, 91-100). 면역학 협회의 국제 연합(IUIS)의 명명법을 사용하여, 이들 알레르겐은 Lol p Ib , Lol p II, Lol p III 및 Lol p IV로 명명되었다. 그러나, 라이그라스 화분의 알레르겐의 범위는 현재 더 복잡한 것으로 알려져 있다. 라이그라스에 대한 국제적 참조 제제에는 12 내지 89KD의 분자량 범위의 17개 알레르겐이 포함된다(스튜어트등(1988), Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 86 : 9-18). 화분내 이들 알레르겐성 단백질은 그들이 알레르기를 가진 개인에 특이적으로 존재하는 면역글로불린인 IgE에 결합하는 능력에 의해 검출하였다.
이들 알레르겐중에서, Lol p I, II, III 및 IV가 광범위하게 연구되었다. Lol p II 및 III 의 전체 아미노산 서열이 보고되었다. 이것은 화분내 알레르겐성 단백질의 높은 함량 및 상기 단백질들의 상대적으로 작은 분자량에 기인하여 표준 생화학적 기술을 사용하여 가능해진다. Lol p I 및 IV 단백질이 화분내에 풍부하지만, 일부 아미노산 서열만이 동일한 기술을 사용하여 보고되었다. 이것은 상대적으로 고분자량의 단백질에 기인한다. 게다가, 어떠한 교차-감염도 없이 알레르겐을 정제하기는 어려우며, 그것은 노동 집약적인 일이다. 1차 서열의 결핍과 충분한 양으로 다량 정제된 알레르겐이 I형 알레르기의 치료 및 진단을 위한 치료 제품 및 진단 제품의 개발에 제한 요소가 되어 왔다.
Lol p I은 그것이 라이그라스-민감성 환자의 혈청내 특이 IgE에 결합하는 능력, IgG 반응에서 항원으로 작용하는 능력 및 T-세포 반응을 유발하는 능력 때문에 알레르겐으로 규정된다. 이 알레르겐성은 그라스 화분-민감성 환자의 직접 피부 테스트에 의해 평가하였다. 결과는 84% 가 Lol p I에 대한 피부 민감도를 가짐을 나타내었으며(프라이도프 등(1986) J. Allergy Clin. Immunol. 78 : 1190-1201), 이것은 주요 알레르겐으로서 상기 단백질의 주요 중요성을 입증하는 것이다. 게다가, 95% 의 환자가 그라스 화분-민감성인 것으로 입증되었으며, Ld p I에 결합된 특이 IgE 항체를 보유하였다(포드 및 발도(1986), 알레르기 및 응용 미생물학에 관한 국제 문서 81 : 193-203).
그라스 화분 사이의 실질적인 알레르겐 교차 반응성은 IgE-결합 분석법인 방사선 알레르겐 흡수 테스트(RAST)를 사용하여 입증되었다. 상기 테스트는 예를들면 마아쉬 등의 문헌[1970, J. Allergy, 46, 107-201] 및 로벤스타인의 문헌[1978, Prog. Allergy, 25, 1-62(카아거, 바젤)]에 기술되어 있다.
Lol p I과 기타 그라스 화분 항원의 면역화학직 관계는 복수 클론 항체 및 단일 클론 항체를 사용하여 입증되었다(참고 문헌 예 : 스마트 및 녹스(1979) 알레르기 및 응용 면역학의 국제 문서, 62 : 173-187 ; 싱그 및 녹스(1985), 알레르기 및 응용 면역학의 국제 문서 78, 300-304). 정제된 단백질 및 IgE-결합 성분에 대한 항체가 제조되었다. 이들 데이타는 밀접하게 관련된 그라스의 화분에 존재하는 주요 알레르겐이 Lol p I와 면역 화학적으로 유사함을 입증한다(싱그 및 녹스, 상기 참조).
[발명의 요약]
본 발명에 따라, 라이그라스 화분 알레르겐 Lol p I은 본 명세서에서 Lol p Ia 및 Lol p Ib로 명시한 두개의 단백질로 구성됨을 발견하였다. Lol p Ib 라이그라스 화분 알레르겐은 단백질족으로서 엘. 페레네에 존재한다. Lol p Ib.1 및 Lol p Ib.2로 명명된 Lol p Ib족의 두 멤버를 암호화하는 유전자가 현재 동정되어 있다. 족의 멤버인 Lol p Ib.1은 앞에서는 Lol p Ib로 명시되었고 이 제 Lol p Ib.1로 언급한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, Lol p Ib는 실제로는 유사한 구조와 기능을 가지지만 별개의 유전자가 암호화하는 밀접하게 연관된 단백질족인 주요 라이그라스 화분 단백질 알레르겐을 말한다. 그러므로, 용어 Lol p Ib 및 Lol p Ib.1 족의 멤버들은 본원에서 호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 Lol p Ib 라이그라스 화분 알레르겐, 또는 이들의 하나 이상의 항원성 단편, 또는 이들의 유도체 또는 동족체를 암호화하는 정제된 핵산 서열, 또는 이 핵산 서열의 기능적 동등체를 제공한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 Lol p Ib 라이그라스 화분 알레르겐, 또는 이들의 하나 이상의 항원성 단편, 또는 이들의 유도체 또는 동족체를 암호화하는 핵산 서열, 또는 이 핵산 서열의 기능적 동등체를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 서열이 암호화하는 펩티드 또는 단백질을 발현시키도록 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 정제된 Lol p Ib 라이그라스 화분 알레르겐, 또는 이들의 하나 이상의 항원성 단편, 또는 유도체 또는 동족체를 제공한다. 본 발명의 추가 양태는 라이그라스 화분으로부터, 바람직하게는 Lol p Ib 라이그라스 화분 알레르겐으로부터 유래된 알레르겐의 분리된 항원성 단편을 제공한다. 보다 바람직하게는 라이그라스 화분 알레르겐은 Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2이다.
본 발명의 또 다른 양태는 라이그라스 화분-민감성 개인에게 투여될 경우 라이그라스 화분에 대한 개인의 알레르기 반응을 감소시키는 변형된 라이그라스 화분단백질 알레르겐을 제공한다. 바람직한 라이그라스 화분 알레르겐은 변형된 Lol p Ib 단백질, 또는 이것의 유도체 또는 동족체이다. 보다 바람직한 라이그라스 화분 알레르겐은 변형된 Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2 단백질, 또는 이들의 유도체 또는 동족체이다. 본 발명은 또한 라이그라스 화분 민감성 개인에 투여될 경우 라이그라스 화분에 대한 개인의 알레르기 반응을 감소시키는 라이그라스 화분 단백질 알레르겐의 하나 이상의 변형된 단편을 제공한다. 바람직한 라이그라스 화분 알레르겐은 Lol p Ib 라이그라스 화분 알레르겐이며, 보다 바람직한 것은 Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2이다. Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2에 면역학적으로 연관된 분리된 단백질 알레르겐 또는 이들의 항원성 단편, 또는 Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2의 단편 또는 유도체 또는 동족체 역시 본 발명에 의해 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태로는 비천연적(즉, 재조합 또는 화학 합성된) Lol p Ib족 멤버 또는 그들의 유도체 또는 동족체, 또는 하나 이상의 Lol p Ib족 멤버 또는 그들의 유도체 또는 동족체에 대한 항체와 면역학적으로 교차 반응성이 있는 비천연적 알레르겐성 단백질이 제공된다. 본 발명은 또한 정제된 천연 Lol p Ib 단백질, 또는 이들의 하나 이상의 단편 또는 유도체 또는 동족체를 제공한다.
비천연 Lol p Ib 단백질, 및 이들에서 유도된 단편 또는 부분(펩티드)은 라이그라스 화분에 대한 알레르기 반응의 진단, 치료 및 예방 방법에 사용할 수 있다. 정제된 천연 Lol p Ib 단백질, 이들의 단편 및 이들의 동족체 또는 유도체 역시 라이그라스 화분에 대한 알레르기 반응의 진단, 치료 및 예방 방법에 있어 유용하다.
본 발명의 또 다른 양태는 정제된 천연 Lol p Ib, 또는 그것의 유도체 또는 동족체에 대해 생성된 항체 뿐만 아니라 비천연 Lol p Ib 또는 이것의 유도체 또는 동족체에 대한 항체에 관한 것이다.
본 발명에 관한 추가 특징은 첨부된 도면과 함께 본 발명의 바람직한 양태에 관한 하기의 상세한 설명으로부터 보다 잘 이해될 것이다.
본원의 데이타는 라이그라스 화분의 주요 알레르겐으로 생각되는 Lol p I이 실제로 다음과 같은 2이상의 상이한 알레르겐성 단백질을 포함함을 나타낸다 : 약 5.5-7.0 범위의 pI와 함께 35kD 범위의 4개의 상이한 유사형을 포함하는 Lol p Ia, 및 6.0-10.6 범위의 pI와 31/33kD 단백질의 5이상의 상이한 유사형을 포함하는 Lol p Ib. Lol p Ib는 NH2-말단 아미노산 서열 및 알레르겐 교차 반응성의 부재로부터 추론되는 바와 같이, Lol p Ia와 상이한 1차 구조 및 조성을 가진다. Lol p Ib.1(클론 12R) 및 Lol p Ib.2(클론 19R)를 암호화하는 cDNA 클론을 분리하고 특성화하였다. 클론 12R 및 19R이 암호화하는 Lol p Ib 단백질은 cDNA 클로닝과 알레르겐 교차 반응성의 부재로부터 추론되는 바와 같이, Lol p Ia와 상이한 1차 구조 및 조성을 가진다. 재조합 Lol p Ib.1 NH2-말단 서열은 정제된 천연 Lol p Ib에 대해 결정된 것과 동일하다. 그러나, Lol p Ib.1 및 Lol p Ib.2는 외관상 각각 5.16과 5.9의 예측 pI 를 가지는 산성 단백질이다. 정제된 천연 Lol p Ib, Lol p Ib.1 및 Lol p Ib.2는 유사한 분자량(31/33kD) 및 유사한 NH2-말단 서열을 가진 당부가되지 않은 단백질이다. 이러한 유사성은 천연 Lol p Ib 및 재조합 Lol p Ib 단백질을 암호화하는 유전자가 동일한 유전자 족의 상이한 멤버일 가능성을 암시한다. Lol p Ib족 멤버는 알레르겐을 플라스티드로 유도하는 25개 아미노산의 신호 펩티드를 가진 프리알레르겐으로서 화분에서 합성된다. 이어서 펩티드의 절단이 뒤따르고, 성숙한 화분에서는 알레르겐이 전분 알갱이중에 주로 나타난다.
따라서, 본 발명의 일양태는 하나 이상의 Lol p Ib 라이그라스 화분 알레르겐, 또는 이들의 하나 이상의 항원성 단편, 또는 이들의 유도체 또는 동족체를 암호화하는 정제된 핵산 서열, 또는 그러한 핵산 서열의 기능적 동등체를 제공한다. Lol p Ib 족 멤버를 암호화하는 바람직한 핵산 서열로는 제3b도 및 제3c도에 나타낸 바와 같이 Lol p Ib.1의 아미노산-25에서 276을 암호화하는 핵산 서열, 및 제10a 및 10b도에 나타낸 바와 같이 Lol p Ib.2의 아미노산-25에서 314를 암호화하는 핵산 서열이 있다. 이들 서열을 25개 아미노산의 신호 펩티드를 포함하는 전체 Lol p Ib.1 단백질 및 Lol p Ib.2 단백질을 암호화한다. 기타 바람직한 핵산 서열로는 제3b도 및 제3c도에 나타낸 Lol p Ib.1의 아미노산 1-276을 암호화하는 핵산 서열, 및 제10a도 및 10b도에 나타낸 Lol p Ib.2의 아미노산 1-314를 암호화하는 핵산 서열이 있다. 이들 핵산 서열들은 성숙한 Lol p Ib.1 및 Lol p Ib.2 단백질은 암호화한다. 본 발명의 또 다른 핵산 서열로는 제3b도 내지 제3c도에 나타낸 Lol p Ib.1의 핵산 서열의 암호 부분의 하나 이상의 단편, 또는 제10a도 및 제10b도에 나타낸 Lol p Ib.2의 핵산 서열의 암호 부분의 하나이상의 단편을 암호화하는 핵산 서열, 또는 그러한 핵산 서열들의 기능적 동등체가있다.
유전 물질의 원래 공급원은 오스트레일리아 멜버른 근교의 들에서 수확된 롤리움 페레네 엘의 신선한 라이그라스 화분, 및 공급처(노오쓰 캐롤라이나 르느와르 그리어 실험실) 및 두상화로부터 대량 수확된 화분이다. 이들은 단지 화분의 일개 편의적 공급처를 나타내기 때문에 이들 화분 공급원이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 본 발명은 어떠한 지역의 화분을 사용하여서도 실시할 수 있다.
본 발명에 대하여서 "유전자" 는 그 최광의로 사용되며, 그것이 전사되어 mRNA를 만들고 mRNA 분자는 단백질로 해독될 수 있는 누클레오티드의 어떠한 인접 서열도 지칭하는 것이다. Lol p Ib족 멤버를 암호화하는 유전자는 그 단백질을 암호화하거나, 또는 단일 또는 다수의 아미노산 치환. 결실 또는 부가를 포함할 수 있는 그 단백질의 유도체나 동족체를 암호화하는 누클레오티드 서열을 의미한다. Lo1 p Ib 유전자는 또한 Lol p Ib 단백질의 전체 길이 또는 부분 길이에 상응하는 mRNA와 상보적인 cDNA를 지칭하기도 한다.
각각의 Lol p Ib족 멤버를 암호화하는 핵산 서열에는 서열 다형태성이 있을 것으로 예측되며, 당업자는 Lol p Ib족 멤버를 암호화하는 핵산 서열내 하나이상의 누클레오티드가 자연적 대립 유전자 변이로 인해 각각 엘.페레네 식물 사이에서 다양성이 있을 수 있음을 인식할 수 있다. 그러한 어떤 누클레오티드 변이 및 결과적 아미노산 다형태성도 본 발명의 범위내에 속한다. 당업자는 또한 Lol p Ib가 매우 연관 관계가 있는 유전자족이며 그 단백질이 엘. 페레네 화분에 존재함을 이해할 것이다(예 : 라프나 등.(1991) J. Biol. Chem. 266 : 1229-1236 ; 실로바노비치 등.(1991) J. Biol. Chem. 266 : 1204-1210). Lol p Ib.1 및 Lo1 p Ib.2를 포함하여 상기 어떠한 유전자 족 멤버들의 핵산 서열 및 상응하는 추론된 아미노산 서열도 본 발명의 범위에 속한다.
따라서, Lol p Ib족에 속하는 모든 단백질, Lol p Ib 단백질족의 멤버의 하나 이상의 단편(펩티드), 및 이들의 아미노산 유도체는 본 발명의 범위내에 속하며, DNA, cDNA 와 mRNA, 및 Lol p Ib족 멤버 또는 이들의 단편 또는 이들의 유도체를 암호화하는 상기 DNA, cDNA 및 mRNA의 동족체 또는 변성형을 포함하는 핵산 서열은 본 발명의 범위내에 속한다. 정제된 천연 Lol p Ib, 이들의 하나 이상의 단편(펩티드), 및 이들의 유도체나 동족체 역시 본 발명의 범위내에 속한다. 본 발명은 추가로 Lol p Ib 단백질, 또는 이들의 하나 이상의 단편, 또는 이들의 유도체에 융합된, 또는 상기 단편에 인접한 핵산 서열 및/또는 유도체를 암호화하는 누클레오티드 서열에 융합된 폴리펩티드와 같은 분자를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 일부 양태로는, Lol p Ib족 멤버 또는 이들의 하나 이상의 단편 또는 그들의 유도체, 및 또 다른 펩티드나 단백질(예: 베타-갈락토시다제, 포스파타제, 우레아제등과 같은 효소)에서 유도된 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 제조할 수 있다. 대부분의 융합 단백질은 해독틀이 동일상에 있도록 함께 연결된 두 암호 서열을 가진 재조합 유전자의 발현을 통해 생성된다. 한편, 단백질 또는 펩티드는 화학적 방법으로 시험관내에서 연결시킬 수 있다. 그러한 모든 융합 단백질 또는 Lol p Ib 단백질의 혼성 유전자 유도체 또는 그 암호화 누클레오티드 서열들은 본 발명의 범위에 속한다. 게다가, Lol p Ib 단백질의 동족체 및 유도체는 이들의 합성 유도체를 포함하는 것을 뜻한다. 본원에서 규명된 핵산 서열을 사용하여 널리 공지된 방법(예 : 고체상 합성)에 의한 화학적 합성에 의해 전체 단백질을 화학 합성하거나 또는 임의 숫자의 단편(펩티드)을 생성시킬 수 있다. 그러한 모든 화학적 합성 펩티드는 본 발명의 범위내에 속한다. 따라서, 본 발명의 범위는 분리된 Lol p Ib 단백질족 멤버, 이들의 단편, 및 재조합 방법에 의해 또는 화학 합성에 의해 만들어진 그들의 유도체, 동족체 및 면역학적 연관체에 미친다.
"분리된(isolated)" 및 "정제된(purified)"란 용어는 본원에서 호환적으로 사용하며, 재조합 DNA 기술에 생산할 경우 세포 물질 또는 배양 배지, 또는 화합 합성할 경우 화학적 전구 물질 또는 기타 케미칼이 실질적으로 없는 펩티드, 단백질, 단백질 단편, 및 핵산 서열에 관해 언급된다. 본원에서 사용하는 "천연정제된" 이란 용어는 엘. 페레네 화분 또는 기타 식물 부분에서 정제한 단백질 또는 그들의 단편에 관해 언급된다. 게다가, 본 발명의 범위는 제3b도 및 제3c도와 제10a도 및 제10b도에 제시한 누클레오티드 암호 서열에, 또는 그들의 변성형 또는 동족체에 전체적 또는 부분적으로 상응하는 단백질 또는 단편(펩티드)에 미친다.
본 발명의 범위내의 핵산 단편으로는 포유류, 바람직하게는 인간에서 면역 반응, 예를 들면, IgE의 최소량의 자극; IgE의 결합: IgG 및 IgM항체의 생산 유도; 또는 증식 및/또는 림포카인 분비 및/또는 T세포 아네르기(무반응)과 같은 T세포 반응의 유도를 야기하는 Lol p Ib의 부분을 암호화하는 단편이 있다. Lol p Ib의 상기 단편들은 본원에서 항원성 단편으로 언급된다. 본 발명의 범위내의 단편으로는 Lol p Ib 단백질과 교차 반응성이 있는 알레르겐을 검출하는 프로토콜을 검색하는데 사용하는 기타 식물종에서 유래한 핵산과 혼성화할 수 있는 단편이 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, Lol p Ib를 암호화하는 핵산 서열의 단편은 Lol p Ib 및/또는 성숙한 Lol p Ib족 멤버의 전체 아미노산 서열을 암호화하는 누클레오티드 서열보다 더 적은 수의 염기를 가진 누클레오티드 서열을 말한다. 일반적으로, Lol p Ib족 멤버의 단편(들)을 암호화하는 핵산 서열은 성숙한 Lol p Ib 단백질족 멤버를 암호화하는 염기들로부터 선택되지만, 일부 경우에는 본 발명의 핵산 서열의 리더 서열 부분으로부터 단편(들)의 전부 또는 일부를 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 Lol p Ib 단백질 또는 이것의 단편의 클로닝, 발현 또는 정제에 유용한 링커 서열, 제한 엔도누클레아제부위 및 기타 서열을 포함할 수 있다.
라이그라스 화분에서 유래된 알레르겐의 단편들, 바람직하게는 Lol p Ib.1, Lol p Ib.2 또는 정제된 천연 Lol p Ib는 예를들면 당해 기술분야에 공지된 화학 합성법을 사용해 합성된 이들 펩티드를 암호하는 본 발명의 핵산서열로 이루어진 상응하는 단편으로부터 재조합 방법에 의해 제조된 펩티드를 선별하거나, 상기 정의된 알레르겐을 분해시킴으로써 얻을 수 있다. 상기 단백질 알레르겐의 펩티드 단편들은 상기 알레르겐을 화학적으로 절단하거나 펩티드가 중복되지 않도록 바람직한 길이의 단편들로 상기 알레르겐을 임의 분할하거나, 바람직하케는 상기 알레르겐을 바람직한 길이를 갖는 중복상태의 단편들로 분할하는 당해 기술분야의 임의의 방법을 사용해 얻을 수 있다. 얻어진 단편들을 항원성 및 알레르겐성에 대해 시험했다. T세포에 대해 자극(이를테면 증식 또는 림포카인 분비반응)같은 반응을 유도해내거나 및/또는 T 세포 무감증을 유도해 낼 수 있는, 재조합 또는 합성 방법으로 제조된 Lol p Ib 또는 정제된 천연 Lol p Ib의 단편들이 특히 바람직하다. 면역글로불린 E(IgE)에 결합하지 않거나, 및/또는 IgE 자극 활성이 최소인 재조합 또는 합성 Lol p Ib 또는 정제된 천연 Lol p Ib의 단편들 역시 바람직하다. 재조합 또는 합성 Lol p Ib 단백질족 멤버 또는 정제된 천연 Lol p Ib의 단편(들)이 IgE와 결합하는 경우, 이러한 결합으로 인해 히스타민 방출현상이 발생하지 않는 것이 바람직한데, 이를테면 이와 같은 결합에 의해 비만세포 또는 호염기구상에 IgE가 가교 결합하는 현상이 발생하지 않는 것이 바람직하다. 최소의 IgE 자극 활성이란 완전한 재조합 또는 합성 Lol p Ib 단백질 또는 완전한 정제 천연 Lol p Ib 단백질에 의해 자극된 IgE 생산량보다 그 양이 적은 IgE 자극 활성을 의미한다. 바람직한 단편들로는 또한 라이그라스 화분-민감성 개체 또는 라이그라스 화분 알레르겐과 교차반응성이 있는 알레르겐에 알레르기 반응을 나타내는 개체에 투여했을때 해당 개체의 라이그라스 화분 알레르겐에 대한 알레르기 반응 양태를 변형시킬 수 있는 항원 단편 및 라이그라스 화분-민감성 개체에 투여했을때 이 개체의 라이그라스 화분 알레르겐에 대한 B-세포반응, T-세포반응 또는 T세포와 B-세포반응 모두를 변형시킬 수 있는 항원단편들을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 라이그라스 화분 알레르겐에 대해 민감한 개체의 알레르기 반응을 변형시킨다는 의미는 표준임상절차(바아니 등에 의한 British Medical Journal(1990) 302:265-269 참고)에 의해 측정시 해당 알레르겐에 대해 무반응성화 되거나 해당 항원에 대한 증세가 경감되거나 그라스 화분으로 인한 천식증세가 경감되는 것(수피오글루 등의 (1992) Lancet 339:569-572)을 의미한다.
T세포 자극 활성을 가지며 적어도 한개의 T세포 에피토프를 포함하는 본 발명의 항원 단편들이 특히 바람직하다. T세포 에피토프들은 임상학적인 알레르기 증세에 관련된 단백질 알레르겐에 대한 면역 반응을 개시하고 영구화시키는데 관여하고 있는 것으로 사료된다. 이런 현상은 T세포 증식, 림포카인 분비, 국소 염증 반응, 상기 부위에 대한 추가 면역 세포의 보충, 및 항체 생성반응을 유도하는 B세포의 연속적인 활성화를 유발시킨다. 이들 항체의 한가지 이소타입인 IgE는 기본적으로 알레르기 증세의 진행단계에서 중요한데, 그의 생산단계는 초기에 T헬퍼 세포 농도에 대한 상기의 연속현상에서 분비된 림포카인의 특성에 의해 영향을 받는다. T세포에피토프는 T세포 수용체에 의해 인식되는 기본적인 요소 또는 가장 작은 유니트로서, 여기에서 상기 에피토프는 수용체 인지에 필수적인 아미노산으로 이루어진 것이다. T세포 에피토프의 아미노산 서열과 유사하고 단백질 알레르겐에 대한 알레르기 반응을 변형시키는 아미노산 서열이 본 발명의 범위내에 있는 것이다.
본 발명의 정제된 단백질 알레르겐 또는 적어도 한개의 T세포 에피토프를 포함하며 단백질 알레르겐에서 유래된 본 발명의 항원단편들에 환자를 노출시키면 적절한 T세포 이군들이 내성화되거나 무감화되므로써 이들이 상기항원에 노출되어도 상기 단백질 알레르겐에 비반응 상태가 되거나, 면역반응의 자극단계에 관여하지 않게 된다. 또한 본 발명의 단백질 알레르겐 또는 적어도 한개의 T세포 에피토프를 포함하는 본 발명의 항원 단편을 투여하면, 림포카인 분비특성을 천연 발생 단백질 알레르겐 또는 그의 일부에 노출시켰을때의 특성과 비교해 변화시킬 수 있다(이를테면, IL-4 감소 및/또는 IL-2의 증가를 초래함). 또한, 상기의 항원 단편 또는 단백질 알레르겐에 노출시키면 상기 알레르겐에 대한 반응에 통상 관여하는 T세포 아군들이 영향을 받아 이 T세포들이 상기 알레르겐에 대한 통상의 노출부위(들)(이를테면 코점막, 피부 및 폐)로부터 상기 단편 또는 단백질 알레르겐의 치료투여 부위를 향해 이동한다. 이와같은 T세포 아군의 재분포 현상은 알레르겐에 대한 통상의 노출 부위에서 통상의 면역 반응을 자극하는 개체의 면역계의 능력을 개선 또는 감소시켜 알레르기 증세를 감소시킬 수 있다.
상기 단백질 또는 그의 단편에 대한 IgE 결합능의 검색은 실험용 동물 또는 자원자에 대해 피내피부 시험 또는 스크래치 시험으로 실시하거나 RAST(radioallergosorbent test), RAST 억제시험, ELISA 분석 법 또는 방사능 면역분석법(RIA) 같은 생체의 시스탬에서 실시하였다.
본 발명은 본 발명의 핵산 서열을 형질발현하도록 형질전환시킨 발현 벡터와 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 발현 벡터는 적어도 일종의 Lol p Ib 라이그라스 화분 알레르겐을 암호하는 핵산 서열 또는 적어도 일종의 그의 항원 단편 또는 그의 유도체 또는 동족체 또는 상기 핵산서열의 기능적 동등체를 포함한다. Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2 또는 적어도 일종의 그의 단편을 포함하는 Lol p Ib 핵산서열은 진핵 또는 원핵 숙주세포내에서 발현시킬 수 있다. 적절한 숙주 세포들로는 E.coli 같은 박테리아세포, 곤충세포, 효모 또는 중국 햄스터 난소세포(CHO)같은 포유동물세포를 포함한다. 적합한 형질발현 벡터, 포로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절서열은 샘 브룩 등에 의한 분자 클로닝 : 실험실 매뉴얼 2 판(콜드 스프링 하버 래버러토리 프레스, (1989) 뉴욕, 콜드스프링하버소재)에서 확인할 수 있다. 효모내에서의 형질 발현에 적합한 벡터로는 Yep Secl(발다리 등 (1987) Embo J.6: 229-234) ; pMF (커어얀 및 허어스코비츠(1982) Cell 30 : 933-943) ; 과 JRY 88(슐츠 등 (1987) 유전자 54:113-123) 등이 있다.
E. coli 내에서의 발현용으로 적절한 발현 벡터들은 pTRC(아만 등, (1988) 유전자 69: 301-315) ; pET-lld(노바겐, 위스콘신, 마디슨 소재) ; pGEX(Amrad Corp., 오스트레일리아 멜버른 소재) ; pMAL(N.E. Biolabs, 매사츄세츠, 비버리 소재) ; pRIT5(Pharmacra, 뉴저지, 피스 카타웨이소재) ; 및 pSEM(Knapp 등, (1980) BioTechniques 8 : 280-281) 등이 있다. pTRC와 pET-lld 를 사용하면 비융합 단백질이 발현될 것이다. pGEX, pMAL, pRIT5 및 pSEM을 사용하면 글루타치온 S-트랜스페라제(pGEX), 말토즈 E 결합단백질(pMAL), 단백질 A (RIT5) 또는 절단형 β-갈락토시다제(pSEM)에 융합된 알레르겐이 발현된다. Lol p Ib 단백질족 멤버, 단편, 또는 그의 단편들이 융합 단백질 상태로 발현되면 특히 담체 단백질과 Lol p Ib 단백질족 멤버 또는 그의 단편사이에 있는 융합 연결부에 효소 절단 부위를 도입시키는데 특히 바람직하다. Lolp Ib족 멤버 또는 그의 단편은 상기 효소부위에서 효소절단하고, 단백질 및 펩티드를 정제하는 통상의 기술을 사용하여 생화학적으로 정제하므로써 상기 융합 단백질로부터 회수할 수 있다. 적절한 효소 절단 부위로는 혈액응고 인자 Xa 또는 트롬빈에 대한 부위를 포함할 수 있으며 이는 절단에 적합한 상기 효소 및 방법이 예를들면 시그마케미칼 컴패니(미국 미조리 세인트루이스 소재)와 엔. 이. 바이오랩스(미국 매사츄세츠, 비버리소재)로 부터 시판되고 있다.
숙주세포들은 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 동시 침전법, pEAE-덱스트란-매개 형질감염 또는 전기적 주입법과 같은 통상의 방법을 사용하여 본 발명의 핵산서열을 발현하도록 형질전환 시킬 수 있다. 상기 숙주 세포들을 형질 전환하는데 적합한 방법은 상기 언급한 샘브룩 등 및 기타 실험용 참고서적을 참고할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 표준 기술을 사용하여 합성할 수도 있다.
따라서, 본 발명의 다른 목적은 Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2 또는 그의 적어도 하나의 단편 또는 그의 유도체 또는 동족체 또는 그들의 면역학적 관련체(전술한 바와 같은)를 제조하는 방법을 제공하는 것으로써, 이 방법은 유기체 내에서 발현할 수 있는 프로모터 ; 이 프로모터 하부에 위치하고 이 프로모터로부터 전사되는 Lol p Ib족 멤버, 적어도 일종의 단편 또는 그의 동족체 또는 유도체, 또는 그의 면역학적 유사체를 암호하는 유전자 ; 선별 마아커 ; 및 진핵 또는 원핵 복제기점을 함유하는 DNA 운반체를 포함하는 복제 가능한 재조합 DNA 분자를 함유하는 유기체를 상기 재조합 DNA 분자가 안정하게 유지되어 Lol p Ib 단백질, 적어도 일종의 그의 단편 또는 유도체, 그의 동족체 또는 면역학적 관련체를 합성할 수 있는 조건 및 그에 충분한 시간동안 배양하고 임의로 이들을 분리하는 단계를 포함한다.
Lol p Ib.1 단백질, Lol p Ib.2 단백질 및 그의 단편(펩티드)을 세포 배양 배지, 숙주세포 또는 이들 둘 모두로부터, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외 여과법, 전기영동법, 및 Lol p Ib.1, Lol p Ib.2 또는 Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2의 단편에 대해 특이적인 항체를 사용해 면역 정제하는 방법을 비롯해 단백질 및 펩티드의 정제에 관해 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용해 정제할 수 있다. 분리 및 정제라는 용어는 본 명세서에서 상호 혼용하여 사용하고 있으며, 재조합 DNA 방법으로 펩티드, 단백질, 단백질 단편 및 핵산서열을 제조하는 경우 상기 물질을 세포 물질 또는 배양배지가 거의 없는 상태로 만드는 것을 의미하며, 화학적으로 합성하는 경우 상기 물질을 케미칼 전구체 또는 기타 케미칼이 전혀 없는 상태로 만드는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 목적은 Lol p Ib, Lol p Ib.1, Lol p Ib.2 또는 Lol p Ib, Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2의 적어도 하나의 단편을 포함하는 단백질 제제를 제공한다. 본 발명의 바람직한 구체예로써 Lol p Ib 또는 Lol p Ib.2 단백질 또는 Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2의 적어도 일종의 단편을 이 단백질 또는 단편을 암호하는 핵산 서열로 형질전환시킨 숙주 세포내에서 생산한다.
현재 입수가능한 구조정보를 사용하여, 라이그라스 화분에 민감한 개체에 총분량을 투여시 상기 화분에 대한 개체의 알레르기 반응을 변형시키는 Lol p Ib 유래의 펩티드를 제작할 수 있다. 이는 예를들면 Lol p Ib의 구조를 조사하고, 라이그라스 화분에 민감한 개체에서 B-세포 및/또는 T-세포 반응에 영향을 주는 능력을 연구할 필요가 있는 펩티드를 발현계를 경유하거나, 합성 또는 기타의 방법으로 제조하고 상기 세포에 의해 인식된 적절한 에피토프를 선택하므로써 실시할 수 있다. 에피토프와 관련하여, 이 에피토프는 수용체, 특히 면역 글로불린, 조직적합성 항원 및 T세포 수용체에 의해 인식되는 가장 적은 유니트 또는 기본 요소르써, 여기에서 상기 수용체에 필수적인 아미노산들은 상기 아미노산 서열에 인접해 위치 하거나 및/또는 인접하지 않은 상태로 위치할 수 있다. 또한 에피토프의 아미노산 서열과 유사하고 라이그라스 화분에 대한 알레르기 반응을 감소조절할 수 있는 아미노산 서열을 사용할 수 있다.
또한, 라이그라스 화분 민감성 개체에서 라이그라스 화분 알레르겐이 알레르기 반응을 유도하는 능력을 차단 또는 억제할 수 있는 시약 또는 약제를 제작할 수 있다. 이러한 시약은, 예를들면 관련 항-Lol p Ib-IgE에 결합하여 IgE-알레르겐 결합 반응 및 이후의 비만세포 또는 호염기구의 탈과립화를 방지하는 방법으로 제작할 수 있다. 대안적으로, 상기 약제들은 면역계의 세포성분에 결합하여 옐. 페레네 화분 알레르겐에 대한 알레르기 반응의 탈감작화 또는 억제현상을 유발시킬 수 있다. 비제한 예로써 라이그라스 화분에 대한 알레르기 반응을 억제하는 본 발명의 cDNA/단백질 구조체를 기초로 적절한 B- 및 T-세포 에피토프 펩티드 또는 그의 변형체를 사용한다. 이는 라이그라스 화분 민감성 개체로 부터 얻은 혈액성분을 사용해 생체의 적으로 연구한 결과 B-세포 및 T-세포 기능에 영향을 주는 B- 및 T-세포 에피토프 펩티드의 구조를 확인하므로써 실시할 수 있다.
본 발명의 단백질, 펩티드 또는 항체는 라이그라스 화분증을 검출 및 진단하는데 사용할 수 있다. 예를들면 이는 라이그라스 화분에 대한 민감성여부에 대한 평가를 요하는 개체로부터 얻은 혈액 또는 혈액 생성물을 재조합 또는 합성 방법으로 제조한 Lol p Ib 또는 천연 정제된 Lol p Ib 또는 분리된 Lol p Ib 단백질 또는 분리된 천연 정제형 Lol p Ib 단백질과, 상기 혈액내의 성분(이를테면, 항체, T-세포, B-세포등)이 상기 펩티드(들) 또는 단백질과 결합하는데 적절한 조건하에서 혼합하므르써, 발생한 결합 정도를 측정하므로써 실시할 수 있다. 발생한 결합 정도는 예를들면, T세포 기능, T세포 증식, B세포기능 또는 상기 단백질 또는 그의 단편 또는 그의 단편 또는 그의 유도체 또는 동족체가 상기 혈액 또는 그의 조합물내에 존재하는 항체와의 결합정도를 평가하므로써 측정할 수 있다.
추가적으로, Lol p Ib족에 속하는 하나 이상의 라이그라스 화분 알레르겐, 또는 이들의 하나 이상의 항원성 단편, 또는 이들의 유도체나 동족체를 포유류에게 투여하어 포유류에서 알레르기 반응을 자극하고, 라이그라스 화분 알레르겐에 대한 알레르기 반응의 발생을 측정하므로써 라이그라스 화분에 대한 포유류의 민감증을 측정할 수 있다. 본 발명의 이 양태에서 사용된 라이그라스 화분 알레르겐(들), 이들의 단편(들), 또는 유도체나 동족체는 재조합에 의해 또는 합성에 의해 생산할 수 있다. 정제한 천연 Lol p Ib 단백질 또는 이것의 단편들은 재조합으로 또는 합성으로 생산한 Lol p Ib 또는 이것의 단편으로 대체할 수 있으며, 라이그라스에 대한 포유류의 민감증을 측정하는 상기 방법에 사용할 수 있다.
본 발명의 임의의 양태에 사용되는 DNA는 본원에서 기술하는 바와 같이 얻어진 cDNA일 수 있으며, 아니면 본원에 나타낸 서열의 전부 또는 일부, 또는 그들의 기능적 동등체를 가진 임의의 올리고데옥시누클레오티드 서열일 수 있다. 그러한 올리고데옥시누클레오티드 서열은 공지된 기술을 사용하여 화학적으로 또는 기계적으로 제조할 수 있다. 올리고누클레오티드 서열의 기능적 동등체는 1) 제3b도 및 제3c도(Lol p Ib.1)의 서열(또는 상응하는 서열 부분) 또는 이것의 단편들과 혼성화하거나, 제10a도 및 제10b도(Lol p Ib.2)의 서열(또는 상응하는 서열 부분) 또는 이것의 단편들과 혼성화하는 상보적 올리고누클레오티드에 혼성화할 수 있는 서열, 또는 2) 제3b도 및 제3c도 또는 제10a도 및 제10b도의 핵산 서열과 상보적인 서열(또는 상응하는 서열 부분, 및/또는 3) 제3b도 및 제3c도 또는 제10a도 및 제10b도의 핵산 서열(또는 상응하는 서열 부분)이 암호화하는 생성물의 동일한 기능적 특성을 가진 생성물(예 : 폴리펩티드 또는 펩티드)을 암호화하는 서열이다. 기능적 동등체가 하나 이상의 기준을 충족시켜야 하는지 여부는 그 용도(예 : 올리고 탐침으로서만 사용하려고 하는 경우는 첫번째 또는 두번째 기준만을 충족시킬 필요가 있으며, Lol p Ib를 생산하는데 사용하려고 할 경우는 세번째 기준만을 충족시킬 필요가 있다).
Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2를 포함하는 Lol p Ib cDNA(또는 이것이 전사되었던 mRNA) 또는 이것의 부분을 사용하여 식물의 임의의 변종 또는 유형에 있어 유사한 서열을 동정하고, 따라서 Lol p Ib cDNA 또는 mRNA 또는 이것의 부분, 예를 들면 포아세아(Poaceae)과 식물의 알레르겐 유래 DNA와 혼성화하기에 충분한 상동성을 가진 서열을 결핍도가 낮은 조건하에서 동정, 즉 "찾아낼" 수 있다. 충분한 상동성(일반적으로 40% 이상)을 가진 상기 서열들을 본원에 기술한 방법을 사용하여 추가적 평가를 위해 선별할 수 있다. 한편 결핍도가 높은 조건을 사용할 수 있다. 이런 식으로, 본 발명의 DNA를 사용하여 기타 유형의 식물에서 바람직하게는 연관된 과, 속 또는 종에서 Lol p Ib와 유사한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 동정하고, 따라서 기타 종들에서 알레르겐을 동정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 Lol p Ib 뿐만 아니라, 본 발명의 DNA와 혼성화하는 DNA가 암호화하는 기타 알레르겐을 포함한다.
본 발명은 또한 예를 들어 분리된 알레르겐성 단백질 또는 이들의 단편들이 본 발명의 단백질 및 펩티드에 특이성이 있는 항체에 결합할 수 있는 항체 교차 반응성에 의해, 또는 분리된 알레르겐성 단백질 또는 이들의 단편들이 본 발명의 단백질 및 펩티드에 특이성이 있는 T세포를 자극할 수 있는 T세포 교차 반응성에 의해, Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2를 포함하는 Lol p Ib, 이들의 유도체나 동족체와 면역학적으로 연관된 분리한 알레르겐성 단백질 또는 이들의 단편들을 포함한다.
기타 연구자들의 연구는 알레르겐의 고 투여량이 일반적으로 양호한 결과(즉, 양호한 증상 구제)를 산출함을 보여주었다. 그러나, 많은 사람들이 알레르겐에 대한 알레르기 반응 때문에 알레르겐의 고투여량을 허용할 수 없다. 상응하는 자연 존재형 알레르겐과 동일하거나 향상된 치료학적 성질을 가지지만 부작용(특히 아나필락시 반응)은 감소된 변형된 펩티드 또는 변형된 알레르겐이 생산될 수 있도록 하는 방식으로 자연 존재형 알레르겐의 변형을 생각할 수 있다. 이들로는 예를들면, 본 발명의 단백질 또는 펩티드(예 : Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2를 포함하여 Lol p Ib, 또는 정제된 천연 Lol p Ib의 아미노산의 전부 또는 일부를 가진 것), 또는 변형된 단백질 또는 펩티드, 또는 단백질이나 펩티드 유사체가 있을 수 있다. 용해도 증가, 치료적 또는 예방적 효능이나 안정성(예 : 생체외 보존 수명 및 생체내에서의 단백질 분해에 대한 내성)과 같은 목적으로 본 발명의 단백질 또는 펩티드의 구조를 변형시키는 것이 가능하다. 아미노산 치환, 결실 또는 부가와 같은 것에 의해 아미노산 서열을 변경시켜 면역 유발성을 변화시키고/시키거나 알레르기 유발성을 감소시키거나, 동일한 목적으로 성분을 첨가시긴 변형된 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있다.
따라서, 본 발명은 라이그라스 화분-민감성 개인에게 투여할 경우 라이그라스 화분에 대한 개인의 알레르기 반응을 감소시키는 변형된 라이그라스 화분 단백질 알레르겐을 제공한다. 바람직한 변형된 라이그라스 화분 단백질 알레르겐으로는 변형된 Lol p Ib.1 단백질, 또는 이들의 유도체나 동족체, 및 변형된 Lol p Ib.2 단백질, 또는 이들의 유도체나 동족체가 있다. 본 발명은 또한 라이그라스 화분-민감성 개인에게 투여할 경우 라이그라스 화분에 대한 개인의 알레르기 반응을 감소시키는 라이그라스 화분 단백질 알레르겐의 하나 이상의 변형된 단편을 제공한다. 바람직한 상기 변형된 단편은 Lol p Ib.1 단백질, 또는 이들의 유도체나 동족체, 또는 Lol p Ib.2 단백질 또는 이들의 유도체나 동족체의 하나 이상의 변형된 단편이다.
Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2 또는 정제된 천연 Lol p Ib 단백질 또는 펩티드는 예를 들면, A, 세혼 및 공동 연구자의 폴리에틸렌 글리콜 방법(위등 (1981), Int. Arch. Allergy Appl. Immunology, 64 : 84-99)을 사용하여 변형시킬 수 있다.
Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2, 또는 정제된 천연 Lol p Ib 단백질 또는 폡티드의 변형은 또한 환원/알킬화(타르 [1986] : 단백질의 미세 특성 분석 방법, J.E. 실버 편집, 휴마나 프레스, 클리프턴, 뉴저지, 155-194 면) ; 아실화 (타르, 상기 문헌) ; 에스테르화(타르, 상기 문헌) ; 적당한 담체에 화학적 결합(미셸 및 샤이기, 편집 [1980] 세포 면역학에 있어서 선택된 방법. WH 프리면, 샌프랜시스코, 캘리포니아 : 미국특허 제4,939,239호) ; 또는 완만한 포르말린 처리(마아쉬[1971] Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 41 : 199-215)를 포함한다.
단백질 또는 펩티드의 또다른 변형예는 이황화 결합에 의한 이합체를 최소화하기 위하여 시스테인 잔기를 바람직하게 알라닌, 세린, 트레오닌, 루이신 또는 글루타민 산으로 치환하는 것이다. 본 발명 펩티드의 다른 변형예는 펩티드의 아미노산 측쇄를 화학적으로 변형시키거나 고리화하는 것이다.
안정성 및/또는 반응성을 향상시키기 위하여, 본 발명의 단백질 또는 펩티드를 자연적 대립 유전자 변이로 부터 산출되는 단백질 알레르겐의 아미노산 서열에 있어 하나 이상의 다형태성을 포함하도록 변형될 수도 있다. 부가적으로, D-아미노산, 비-자연 아미노산 또는 비-아미노산 유사체가 치환되거나 부가되어 본 발명 범위내에 포함되는 변형된 단백질 또는 펩티드를 산출한다.
자연 Lol p Ib는 스코프 등에 의해 공지된 통상의 방법을 사용하여 정제될 수 있다(스코프, R.K.(1987), 단백질 정제, 원리와 실례, 제2판, 스프링거-벌락, 뉴욕, 뉴욕). 적당한 방법으로는 이온 교환 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피, 전기영동, 한외여과, 등전점 포커싱 및 자연 Lol p Ib에 특이적인 항체를 사용한 면역 흡착 크로마토그래피를 포함한다. 등전점-포커싱 및 SDS-PAGE에 의한 자연 Lol p Ib의 정제법은 실시예 2에 기재되어 있다.
Lol p Ib.1 및 Lol p Ib.2를 암호화하는 cDNA의 클로닝은 그라스 화분-특이성 환자로 부터 수득된 특이적인 단일 클론 항체와 특이적인 혈청 IgE 둘다를 사용하여, 람다 -gt11 파지로 형질 전환시킨 대장균(E.Coli)에 의해 형질 발현된 단백질을 인지하는데 근거한다. 상기 두 클론은 12R과 19R로 명명하며, 또한 사용되는 단일 클론 항체로 MAbs 3.2, FMC A7(12.3), 21.3 및 FMC A1(40.1)을 들 수 있다(카안 및 마아쉬 (1986) Molec. Immunol. 23 : 1281-1288 ; 싱그 및 녹스(1985) 알레르기와 응용 면역학에 관한 국제 문서 78, 300-304 : 스마트 등 (1983) 알레르기와 응용 면역학에 관한 국제 문서 72, 243-248). Lol p Ib.1과 Lol p Ib.2의 클로닝에 대한 내용은 이하 실시예에 상세히 제시되어 있다.
본 발명 단백질의 알레르겐 성질은 알레르기 환자의 혈청중에 고 농도로 존재하는 반응체 IgE 항체의 결합에 의해 부분적으로 특성이 규명된다. 알레르기 단백질상의 에피토프에 대한 IgE 결합은 발색성 분석법으로 시험할 수 있으며, 이 분석법에서는 고형 지지체에 고착된 알레르겐은 (1) 알레르기 환자 혈청; (2) 효소-표지된 항-IgE 항체에 단계적으로 배양함으로써 가시화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 면은 그라스 종의 화분에서 유래한 알레르겐 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함한 재조합 벡터에 관한 것이다. 더 구체적으로 상기 그라스 종은 포아세아(그라미네아)과에 속하며, 더 구체적으로 리움 속에 속한다. 가장 구체적으로, 상기 알레르겐성 단백질은 이하 제시한 롤리움 페레네 화분의 Lol p Ib 단백질에 대한 항체와 면역학적으로 교차-반응성을 갖는 특징으로 한다.
푸이드(페스투코이드) 그라스. 1군 : 트리티카네아 : 브로무스 이너미스(Bromus inermis), 스무스 브룸 ; 아그로피론 레펜스(Agropyron repens), 잉글리쉬 코우치 ; 에이, 크리스타튬(A. cristatum) ; 시케일 시리얼(Secale cereale), 라이 ; 트리티쿰 에스티붐(Triticum aesticum), 밀.
2군 ; 포안; 댁틸리스 글로메라타(Dactylis glomerata), 콕스풀의 오카드 그라스 ; 페스투카 엘라티어(Festuca elatior), 메도우 페스큐 ; 롤리움 페레네, 페레니알 라이그라스 ; 엘. 멜티플로럼(L. multiflorum), 이탈리안 라이그라스 ; 포아 프라텐시스(Poa pratensis), 켄터키 블루그라스 ; 피. 콤프레사(P. compressa), 플래튼드 메도우 그라스 ; 아베나 사티바(Avena sative), 오우트 ; 홀커스 라나투스(Holcus lanatus), 벨벳 그라스 또는 요크셔 포그; 안토크산툼 오더라툼(Anthoxanthum odoratum) ; 스위트 베르날 그라스 ; 아레나테룸 엘라티우스(Arrhenatherum elatius), 오우트 그라스; 아그로스티스 알바(Agrosti salba), 레드 탑 ; 플레움 프라텐스(Phleum pratense), 티모시 ; 팔라리스 아룬디나세아(Phalaris arundinacea), 리드 카나리 그라스, 페니코이드 그라스, 파스팔룸 노테이툼(Paspalum notatum), 바히아 그라스, 안드로포고노이드 그라스 ; 소르굼 할레펜시스(Sorghum halepensis), 존슨 그라스.
각종의 발현 벡터는 Lol p Ib, 그것의 하나이상의 단편 또는 그것의 유도체의 형성을 위해 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 면은 라이그라스, 롤리움 페레네, L. 화분, 또는 그것의 유도체 또는 동족체의 알레르겐 단백질 Lol p Ib를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 더 구체적으로, 본 발명은 진핵세포 또는 원핵세포의 복제기점 ; 검출용 마아커 ; Lol p Ib족 멤버 또는 그들의 유도체 또는 유사체, 또는 Lol p Ib족 멤버 또는 그들의 유도체 또는 유사체에 대한 항체와 교차 반응성이 있는 알레르겐 단백질을 암호화하는 DNA 서열 ; 및 임의로 Lol p Ib족 멤버의 전사를 유도할 수 있는 프로모터 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다.
본 발명의 범위는 또한 라이그라스 화분 단백질의 프로모터, 구체적으로 Lol p Ib.1 및 Lol p Ib.2를 암호화하는 유전자와 같은 Lol p Ib 유전자의 프로모터에 미친다. 이 프로모터는 Lol p Ib 유전자 발현을 점진적으로 조절하며, 기관, 즉 화분 특이적이다. 본원에서 사용되는 진행적 조절은 식물 생존 사이클의 특정 단계 진행중 화분내의 알레르겐성 단백질의 특정 형질발현 및 다른 단계중의 비-발현에 관한 것이다. 따라서, Lol p Ib 프로모터는 특히 화분의 성장과정중에만 Lol p Ib, 또는 다른 유전자, 또는 그들과 관계있는 뉴클레오티드 서열을 발현시키는데 유용하다. 당업자들은 화분 형성 과정에서 특정 형질을 선택적으로 발현시키는데 있어 상기 프로모터의 중요성을 곧 인지하게 될 것이다.
따라서, 본 발명은 화분 발육 또는 기능을 억제하고, 그로써 포아세아과의 식물, 특히 롤리움 페레네 엘., 식물에 있어 핵 웅성 불임을 유발하는 방법을 제공하는데 이 방법은 이하 a) 및 b) 단계를 포함한다.
a) 그 분자상에 위치하고 있는 라이그라스 화분 프로모터 서열 또는 그것의 동족체 또는 변성형 및 포아세아 과로 부터 유도되는 세포내에 유해 기능을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 보유하는 식물을 발육시키는 단계(상기 누클레오티드는 상기 프로모터로 부터 전사될 수 있으며, 상기 재조합 DNA 분자는 화분 생성 세포내에 안정하게 포함됨), b) 상기 식물의 발육 단계가 상기 프로모터로 부터, 상기 뉴클레오티드 서열을 발현시키고 그로써 화분 형성이 억제되거나 상기 화분이 비활성화 될 수 있도록 상기 화분 생성 세포에 있어서 유해 기능을 갖는 폴리펩티드를 생성하기에 충분한 시간 및 조건하에 상기 식물을 성장시키는 단계.
기존의 공지된 방법은 아그로박테리아 플라스미드의 사용 및 전기적 주입(electroporation)과 같이 재조합 DNA 분자를 식물세포로 도입시키는 것이다. 폴리펩티드에 있어서 "유해한 기능"이란 세포 성장을 억제하고, 세포의 분해를 일으키고 또는 세포의 여러가지 기능을 억제함으로써 세포의 정상적인 기능을 저해하게 되는 폴리펩티드의 특징을 의미한다. 이 경우, 유해 기능을 갖는 치명적인 유전자 구조물은 화분 형성을 억제하거나 방지하며 그로써 웅성의 멸균 식물을 제공하는 것으로 이해된다. 상기 "치명적인 유전자"는 다른 분자와 함께, 효소, 효소억제 인자 및/또는 독성 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 또한 치명적인 유전자는 특정한 종의 mRNA의 해독을 억제할 수 있는 안티센스 RNA, 그것의 해독 생성물(화분 발육에 중요함)을 암호화할 수 있다.
웅성의 불임 식물은 특히 혼성체 농작물 변종을 발육시키는데 특히 유용하다.
Lol p Ib 프로모터는 전사 개시 부위의 DNA 상류부로서 프로모터 탐침 벡터의 사용, "염색체 워킹" 및 S1 뉴클레아제 지도화 및 서열 분석을 비롯하여 수많은 방법에 의해 라이그라스 게놈 DNA로 부터 분리할 수 있다.
따라서, 본 발명은 라이그라스 화분 프로모터 서열, 및 특히 Lol p Ib족 멤버를 암호화하는 유전자 또는 그 분자상에 배치되어 있으며 추가로 상기 프로모터의 하류에 하나이상의 제한 엔도누클레아제 부위를 가짐으로써 하나이상의 뉴클레오티드 서열이 정확한 해독틀로 전사 가능하고 그로써 발육 조절이 가능한, 화분-특이성 발현 벡터가 되는 상기 유전자의 동족체 또는 변성형을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다.
본 명세서에서 "정확한 해독틀"은 "상(phase)"과 같은 의미를 갖는다. 전술한 DNA 분자는 선별 마아커를 갖는데, 예를들어, 암피실린, 카르베니실린, 테트라사이클린, 스트렙토마이신 등에 대한 내성을 암호화하는 유전자와 같은 항생제 또는 기타 약물 내성 유전자를 갖는다. 추가로 재조합 분자는 원핵 세포 및/또는 진핵세포에 있어 안정한 유전 수단을 포함한다. 이는 발현 벡터에 대해 전술한 바와같이 원핵세포 및/또는 진핵세포의 복제 기점을 포함하는 재조합 분자에 의해 수행될 수 있다.
또한, 상기 재조합 분자는 숙주 세포 게놈으로 통합시키기 위한 수단을 포함하며 그로써 상기 숙주 세포 게놈의 복제와 동시에 상기 재조합 분자의 복제가 허용된다. 바람직한 원핵 숙주세포의 예는 이.콜리, 바실러스 및 슈도모나스 등을 포함한다. 바람직한 원핵 숙주세포는 효모 및 곰팡이 세포, 곤충, 포유류 및 식물세포를 포함한다. 더 바람직한 숙주 세포는 포아세아과의 식물 및 특히 롤리움 페레네와 같은 롤리움속의 식물이다. 따라서 바람직한 구체예에 있어서, 그와 관련하여 배치된 유전자를 암호화하는 유해한 기능을 지닌 Lol p Ib 유전자 프로모터는 포아세아 또는 L. 페레네과의 식물 세포 게놈으로 통합될 수 있는 재조합 DNA분자에 의해 보유된다. 상기 재조합 DNA 분자는, 예를들어 전기적 주입에 의해 전술한 세포로 전이된다. 이상적으로 상기 세포는 캘러스(callus)에서 유도된 세포이다. 상기 재조합 DNA 분자로 형질전환된 캘러스에서 유도된 세포는 이후 완전한 식물로 재생된다. 식물의 생활 주기의 화분 발육 단계로 들어가는 완전한 식물은 Lol p Ib 유전자 프로모터를 작용하게 하며 따라서 유해한 기능을 암호화하는 유전자를 발현시킨다. 결과적으로, 화분 발육은 억제되거나 방지되며 핵 웅성의 불임 식물이 제공된다.
또한, Lol p Ib 프로모터는 시토키닌과 같은 유익한 기능을 갖는 유전자를 직접 발현시킨다. 모든 상기 재조합 DNA 분자는 본 발명에 포함된다.
본 발명은 Lol p Ib, 또는 재조합되거나 합성된 Lol p Ib의 적어도 한 단편 또는 정제된 자연 Lol p Ib(국제특허출원번호 제PCT/AU89/00123호에 기재된 방법으로 생성됨)에 대한 단일 클론 및 복수 클론 항체 및 면역 분석법에서의 용도 및 시험 키트를 포함한다.
Lol p Ib 클론에 대한 cDNA 라이브러리를 검색하기 위한 연구에 사용되는 단일클론 항체는 각종 그라스 종의 화분에서 유래된 알레르겐성 단백질과 교차 반응성을 나타낸다. 이는 상기 화분에 의해 생성되는 알레르겐성 단백질과 모든 관련 그라스 종에 대한 본 발명의 적용성을 지지하는 Lol p Ib 단백질 알레르겐 사이에 상동성이 있음을 나타낸다. 본 발명은 또한 재조합 Lol p Ib 단백질 알레르겐 및 유도체에 대한 항체, 그것의 화학적 합성 유도체를 비롯한 그것의 동족체 및 면역학적 연관체에 관한 것이다. 하기에서, Lol p Ib 단백질 알레르겐에 관한 언급은 그것의 유도체, 동족체 및 면역학적 연관체, 및 이들의 화학 합성 유도체를 포함한다. 또한 정제된 Lol p Ib 및 단편, 그것의 유도체 및 동족체에 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 특히 치료 또는 진단 처방을 모니터하는 과정에서 Lol p Ib 단백질 알레르겐에 대한 검출 분석법(면역 분석법)개발 및 재조합 또는 합성으로 생성된 Lol p Ib족 멤버의 정제에 있어서 또는 정제된 자연 Lol p Ib에 유용하다. 상기 항체는 단일 클론이거나 복수 클론일 수 있다. 또한, 전술한 제1항체에 대한 임의의 제2항체(단일 클론 또는 복수 클론)도 본 발명의 영역에 포함된다. 본 발명은 또한 검출 분석법, 예를 들어 진단이나 투여 약제에 대한 효능을 모니터하는데 있어 상기 제1 또는 제2항체를 사용하는 방법도 포함한다. 또한, Lol p Ib 단백질 알레르겐과 복합된 임의의 분자에 대한 항체도 포함된다. 따라서, Lol p Ib 단백질 알레르겐에 대한 항체는 상기 Lol p Ib 단백질 알레르겐 또는 그것의 항원성 일부, 및 임의의 관련 분자(예, 지질 영역, 담체 분자, 융합 분자등)에 대한 항체를 포함한다.
본원에서 논하고 있는 Lol p Ib과 또는 그의 단편은 정제된 후 항체 제조 방법에 사용된다. 복수 클론과 단일 클론 항체 둘다는 재조합, 합성 또는 자연 Lol p Ib 단백질족 멤버로 면역화 됨으로써 수득가능하여, 어느 것이든 면역 분석법에 유용하다. 두 종류의 혈청을 수득하는 방법은 당 분야에서 잘 공지되어 있다. 복수 클론 혈청은 덜 바람직하지만 유효량의 정제된 Lol p Ib족 멤버, 또는그것의 항원성 일부를 적당한 실험 동물에 주사하고 동물로 부터 혈청을 수거하며 공지된 면역 흡착법으르 특정의 혈청을 분리함으로써 상당히 용이하게 제조된다. 이 방법으로 생성되는 항체가 모든 면역 분석법에 실질적으로 유용하지만, 일반적으로 생성물의 잠재적인 이중성 때문에 덜 선호된다.
면역분석법에 단일 클론 항체를 사용하는 것은 다량 생성 가능성 및 생성물의 동종성 때문에 특히 바람직하다. 면역원성 제제에 대해 민감한 임파구와 불사의 세포주를 융합시킴으로써 유도되는 단일클론 항체 생성을 위해 하이브리도마 세포주의 제조는 당업자들에게 공지된 기법으로 실시될 수 있다(참고. 쾰러 및 밀스타인(1975) Nature 256 : 495-499 및 쾰러 및 밀스타인(1986) Eur, J. Immunol. 6 : 511-519).
복수 클론 혈청의 제조와는 달리, 동물의 선택은 임파구와 융합할 수 있는 적당한 불사의 세포주의 이용성에 따라 결정된다. 생쥐 및 쥐가 하이브리도마 기법에서 선택되는 동물이며 바람직하게 사용된다. 인간은 적당한 불사의 인체(또는 비 인체) 세포주가 이용가능한 경우 민감화된 임파구의 공급원으로서 유용하다. 본 발명의 목적을 위하여, 선택된 동물은 정제된 재조합 또는 자연 Lol p Ib 또는 그것의 일부를 약 0.1mg 내지 약 20mg 주사한다. 일반적으로 주사 물질은 프로인트 완전 보조제내에 유화시킨다. 항원 투여(Boosting) 주사도 요구된다. 항체 생성의 검출은 적당한 표지 항원으로 항혈청을 시험함으로써 실시될 수 있다. 임파구는 불임 상태의 민감화된 동물의 임파절이나 비장을 제거하고 융합시킴으로써 실시될 수 있다. 또한 임파구는, 예를들어 Reading(1982) J.Immunol. Methods 53 : 261-291 에 기재된 바대로 시험관내에서 자극되거나 면역화될 수 있다.
융합에 적당한 다수의 세포주를 발육시키고 혼성화 프로토콜을 위한 임의의 특정한 세포주를 성장 속도 및 균질성과 같은 다수의 요건에 따라 선택한다.
동종내의 혼성체, 특히 유사 균주간의 혼성체는 종간의 혼성체보다 더 용이하다. 골수종 면역글로블린을 방출하는 능력 상실의 변이주를 비롯하여 몇몇 세포주가 이용가능하다.
세포 융합은 엡스타인-바르 또는 센다이 바이러스와 같은 바이러스나 폴리에틸렌 글리콜에 의해 유도될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)는 포유류 체세포 접합에 가장 효과적인 제제이다. PEG 자체는 세포에 유독하며 융합 이전에 여러 농도로 생존성에 대한 영향을 시험해야 한다. PEG의 분자량 범위는 1000 내지 6000이다. 가장 우수한 결과는 식염수나 무-혈청 배지중에 약 20% 내지 약 70%(w/w)로 희석하였을때 수득된다. 쥐의 세포를 사용하는 경우, PEG를 37℃에서 약 30초동안 노출시키는 것이 바람직하다. 고온(즉, 약 45℃)은 피하며, 융합 이전에 37℃에서 상기 융합 시스템의 각 성분을 예비 항온처리하는 것이 유용하다. 임파구와 악성 세포간의 비율은 비장 세포내에서의 세포 융합을 피하도록 하는 것이 최적이며 일반적으로 약 1 : 1 내지 약 1 : 10으로 사용된다.
성공적으로 융합된 세포는 당분야의 공지된 기법에 의해 골수종 세포주로 부터 분리될 수 있다. 가장 일반적이며 바람직한 방법은 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT) 결핍의 악성 세포주를 선택하는 것으로, 이 세포는 혼성체만 성장케하는데 사용되는 아미노프테린-함유 배지에서는 성장하지 않으며, 일반적으로 하이포크산틴 1× 10-4M, 아미노프테린 1×10-5M, 및 티미딘 3×10-5M(HAT 배지로 공지됨)을 포함한다. 융합 혼합물은 융합 직후 또는 24시간 경과후 HAT-함유 배양 배지내에서 성장할 수 있다. 공급 스케줄은 대개 HAT배지내에서 2주동안 유지시키고 나서 규정된 배양 배지나 하이포크산틴, 티미딘-함유 배지를 공급한다.
그후 성장 콜로니를 항원성 제제를 인지하는 항체의 존재에 대해 시험한다. 하이브리도마 항체의 검출은, 항원을 고형 지지체에 결합시키고 예상 항체를 함유하는 혼성체마 상청액과 반응케 하는 분석법으로 수행할 수 있다. 항체의 존재는 여러가지 지시제를 사용하는 "샌드위치"법으로 검출할 수 있다. 대부분의 일반적인 방법은 혼성체 성장 과정중 방출되는 항체 농도 범위에서 사용할 수 있도록 충분히 민감하다.
혼성체의 클로닝은 선택 배지 중에서 21내지 23일 동안 세포 증식을 한 후에 수행할 수 있다. 클로닝은 액체상에 세포를 제한 희석하거나 반-고형 아가로즈내에서 성장한 단일 세포를 직접 선별함으로써 수행할 수 있다. 제한 희석의 경우, 세포 현탁액을 단계적으로 희석하여 웰당 단 하나의 세포를 갖는 통계적 가능성을 제공하기 위해 단계적으로 희석한다. 아가로즈법의 경우, 혼성체를 공급 세포함유의 하층상에 있는 반고형 상층에 접종한다. 상층에 나타난 콜로니를 찝어내어 웰로 옮긴다.
항체-분비 혼성체는 여러가지 조직 배양 플라스크내에서 성장할 수 있으며, 따라서 여러 농도의 항체를 갖는 상청액을 산출한다. 고농도를 수득하기 위하여, 동물에 상기 혼성체를 전이시켜 염증성 복수종을 얻을 수 있다. 항체-함유 복수종을 복강내 주사 이후 8-12일동안 배양할 수 있다. 이 복수종은 고농도의 항체를 포함할 수 있으나 염증성 복수종으로부터 단일 클론과 면역글로블린 둘다를 수득할 수 있다. 그 후, 친화성 크로마토그래피 방법 등에 의해 항체를 정제할 수 있다.
본원에서 고려하고 있는, 환자의 혈청, 식물 또는 포유류 조직 또는 조직 추출물에의 Lol p Ib 단백질 알레르겐 또는 그에 특이적인 항체의 존재는, 임의의 면역 분석법으로 전술한 항체(단일클론 또는 복수클론)을 사용하여 검출할 수 있다. 광범위한 면역분석법이 사용될 수 있으며, 미국특허 제4,015,043호, 제4,424,279호 및 제4,018,653호에 참고로 기재되어 있다. 당연히, 단일-부위 및 두-부위 분석법이나 비-경쟁적 유형의 "샌드위치" 분석법 뿐만 아니라 일반적인 경쟁적 결합 분석법을 사용할 수 있다. 샌드위치 분석법은 가장 일반적이며 유용한 방법으로서 본 발명에 사용하기에 양호하다. 수많은 샌드위치 분석법이 있으며, 이들 모두는 본 발명에 의해 포함된다. 간략하게 대표적인 분석법에 있어서, 비표지화된 항체를 고형 기질에 고착시키고 시험할 시료를 상기 결합 분자와 접촉하게 한다. 적당한 항온 배양시간 경과후, 항체-항원 2차 복합체가 형성될 수 있는 충분한 시간동안 검출 가능 신호를 생성할 수 있는 리포더(reporter) 분자로 표지화된 제2항체를 첨가하고나서 항체-항원-표지화된 항체(예, 항체- Lol p Ib 단백질-항체)의 3차 복합체를 형성하기에 충분한 시간동안 항온처리 한다. 임의의 미반응 물질을 세척 제거하고 항원 존재 여부를 리포터 분자에 의해 생성된 신호를 관찰함으로써 결정한다. 결과는 간단히 신호를 육안 관찰함으로써 정량하거나 공지된 양의 헵탄을 함유하는 대조 샘플과 비교함으로써 정량할 수 있다. 전술한 분석법상의 변이는 동시적인 분석법을 포함하며, 샘플과 표지화된 항체 둘다를 동시에 첨가하여 항체에 결합시키거나, 시험될 시료와 표지된 항체를 먼저 결합시키고, 항온 처리한 후 동시에 첨가하어 항체에 결합시킨다. 이러한 기법은 당분야에서 공지된 방법으로 실시하며 최소의 변형 방법으로 쉽게 수행될 수 있다.
이하에는 Lol p Ib를 검출하는 것에 관해 논의되어 있으나, 마찬가지로 Lol p Ib에 대한 항체를 검출하는데에도 적용가능하며, 이에 대한 충분한 설명을 하고자 한다. 대표적인 전방(forward) 샌드위치 분석에 있어, 본 발명에서 예상되는 Lol p Ib 또는 그것의 항원성 부분에 대해 특이성을 가진 제1항체는 고체 표면에 공유 결합하커나 비활성적으로 결합한다. 고체 표면은 통상 유리 또는 중합체이며, 가장 보편적으로 사용된 중합체는 셀룰로오즈, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체의 형태로는 튜브, 비이드, 미소판의 디스크 또는 면역검정 실시에 적합한 기타의 형태가 가능하다. 결합 과정은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 일반적으로 가교 공유 결합이나 물리적 흡착으로 이루어지고, 중합체-항체 복합체는 시험 샘플의 제조시 세척된다. 그 후, 시험할 샘플의 분취량을 고체상 복합체에 첨가하고, 항체내에 존재하는 임의의 서브 유니트의 결합을 가능하게 하기에 충분한 시간동안 25℃에서 항온처리한다. 항온처리 시간은 변화시킬 수 있지만, 일반적으로 약 2-40분 범위이다. 항온처리 기간후, 항체 서브유니트 고체상을 세척해내고 건조시킨후, 합텐의 일부분에 특이적인 제2항체와 함께 항온처리한다. 제2항체는 합텐에 제2항체가 결합함을 나타내는데 사용되는 리포터 분자에 결합된다.
본 명세서에 사용된 "리포터 분자"는 화학적 특성상 항원-결합된 항체의 검출을 가능하게 하는, 분석에 의해 판명 가능한 신호를 제공하는 분자를 의미한다. 이러한 검출은 정성적 또는 정량적일 수 있다. 이러한 류의 분석에 가장 보편적으로 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단 또는 래디오뉴클리드 함유 분자(즉, 방사성 동위원소)이다. 효소 면역검정의 경우, 효소는 일반적으로 글루타르알데히드 또는 퍼요오데이트에 의해 제2항체에 접합된다. 그러나, 쉽게 알 수 있는 바와 같이, 광범위한 각종의 다른 접합 기술이 존재하며, 당업자에 의해 용이하게 시행될 수 있다. 보편적으로 사용된 효소에는 호오스래디쉬 퍼옥시다아제, 글루코오즈 옥시다아제, 베타-갈락토시다아제 및 알칼리성 포스파타제가 포함된다. 특이적 효소와 함께 사용되는 기질은 일반적으로 해당 효소에 의한 가수분해시 검출 가능한 색변화 산출에 대해 선택된다. 예를 들어, p-니트로페닐 포스페이트는 알칼리 포스파타제 접합체에 사용하기 적합하며 ; 퍼옥시다아제 접합체의 경우는 보편적으로 1,2-페닐렌디아민, 5-아미노살리실산 또는 톨루이딘이 사용된다. 또한 형광발광성 기질을 사용하는 것도 가능한데, 이는 전술한 발색성 기질보다는 형광성 생성물을 산출한다. 모든 경우에 있어, 효소-표지시킨 항체를 제1항체 합텐 복합체에 첨가하고 결합시킨 후, 과량의 시약은 세척해버린다. 그 후, 적합한 기질을 함유하는 용액을 항체-항원-항체의 3종 복합체에 첨가한다. 기질은 제2항체에 결합된 효소와 반응하여 정량적인 시각적 신호를 산출하는데 이는 통상 분광적으로 더욱 정량하면 샘플내에 존재하는 합텐의 양을 나타낸다. "리포터 분자"는 또한, 적혈구 또는 라텍스 비이드 등과 같은 세포의 응집 또는 응집 방지에까지 사용 용도를 확장시켜 준다.
대안적으로, 플루오레세인 및 로다민 같은 형광성 화합물은 그 결합 능력을 변화시키지 않고서도 항체에 화학적으로 결합할 수 있다. 특정 파장의 광선으로 조사시킴으로써 활성화시켰을 때, 형광단-표지시킨 항체는 분자의 여기 상태를 유발시키는 광 에너지를 흡수한 후, 광학 현미경에 의해 시각적으로 검출가능한 특징적인 색상을 가진 광을 발광한다. EIA에서와 같이, 형광 표지시킨 항체는 제1항체-합텐 복합체에 결합한다. 미결합 시약을 세척해낸 후, 잔여 3종 복합체를 적절한 파장의 광선에 노출시키는데, 이 때 관찰된 플루오레세인은 관심 합텐의 존재를 나타낸다. 면역 형광 및 EIA 기술은 양자 모두 당해 기술 분야에 매우 잘 정립되어 있으며 본원 발명의 방법에 특히 바람직하다. 그러나, 방사성 동위원소, 화학 발광성 또는 생물발광성 분자와 같은 다른 리포터 분자가 또한 사용될 수도 있다. 요구 목적에 적합하도록 절차를 변형시키는 방법은 당업자라면 용이하게 알 수 있을 것이다. 또한, 전술한 바를 이용하면 본원 발명의 Lol p Ib 단백질을 직접 또는 간접적으로(즉, 항체를 통해) 검출할 수 있다는 것도 알 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 한 양태는 시험할 혈청, 추출물 또는 유체를 알레르겐성 단백질-항체 복합체가 형성되기에 충분한 시간 및 조건하에서 Lol p Ib 단백질에 대한 항체와 접촉시키고 상기 복합체를 검출 수단에 적용시키는 단계를 포함하는, 혈청, 조직 추출물, 식물 추출물 또는 기타 생체액내에 존재하는 상기 Lol p Ib 또는 유도체 또는 동족체와 면역적으로 반응성인 알레르겐성 단백질, Lol p Ib 또는 그 유도체 또는 동족체를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 혈청 또는 유체를 항체-Lol p Ib 복합체가 형성되기에 충분한 조건 및 시간하에 Lol p Ib 단백질 또는 그 유도체 또는 동족체, 또는 그 항원성 유도체와 접족시키고 상기 복합체를 검출 수단에 적용시키는 것을 포함하는, 혈청 또는 기타 생체액내에서 포아세아과(그라미네아)의 화분으로부터의 알레르겐성 단백질에 대한 항체를 검출하는 방법을 제공한다. 후자의 복합체는 이에 부착되어 있는 Lol p Ib 단백질에 의해, 또는 리포터 분자로 표지시킨 제2항체를 첨가함으로써 검출할 수도 있다.
따라서, 본 발명은 또한 포유동물 체액(예, 혈청, 조직 추출액, 조직액), 생체의 세포 배양 상층액 및 세포 용균물중에 Lol p Ib 또는 그것의 유도체, 동족체또는 면역학적 관련체에 대한 항체의 급속 및 용이한 분석을 위한 킷트에 관한 것이다. 이 킷트는 항원성 성분에 적합하게된 제1 용기 및 전술한 바와 같은 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 리포터 분자로 표지시킨, Lol p Ib에 대한 항체를 포함하기에 적합하게된 제2용기를 수용하게 구획화되어 있다. 리포터 분자가 효소인 경우는, 상기 효소에 대한 기질을 포함하도록 적합하게된 제3용기가 제공된다. 개별 킷트를 사용하는데 있어, 시험할 샘플은, 샘플내에 존재시 항체가 상기 제1용기내 Lol p Ib 단백질에 결합하는 조건 및 시간동안 제1용기의 내용물과 접촉시킨다. 제1용기의 Lol p Ib 단백질이 시험액내 항체에 결합하는 경우, 제2용기의 항체는 2차 복합체에 결합하여 3차 복합체를 형성하며 이들 항체는 리포터 분자로 표지시켰기 때문에, 검출 수단에 적용시, 3차 복합체가 검출된다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 알레르겐성 특성을 가진, 포아세아과(Gramineae)의 화분으로부터의 단백질에 대한 항체의 검출을 위한 킷트이며, 이때 이 킷트는 재조합 Lol p Ib 단백질 또는 그 항원성 유도체 또는 동족체, 또는 정제된 천연 Lol p Ib 단백질 또는 그 항원성 유도체 또는 동족체를 포함하기에 적합하게된 제1용기, 및 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 리포터 분자로 표지시킨 Lol p Ib 또는 그 유도체나 동족체에 대한 항체를 포함하기에 적합하게된 제2용기를 수용하도록 구획화되어 있다. "리포터 분자" 는 라텍스 비이드상에 적혈구(RBC)의 응집에 관여할 수도 있다. 이러한 킷트에 있어, 리포터 분자는 방사성 동위원소, 효소, 형광성 분자, 화학발광성 분자, 생물발광성 분자 또는 RBC이다. 이 킷트는 대안적으로는, 검출 가능한 신호를 제공할 수 있는 리포터 분자로 표지시킨 재조합 Lol p Ib 또는 그 항원성 유도체나 동족체를 포함하기에 적합하게된 용기를 포함한다.
환경에서 알레르겐의 존재 때문에, 건초열 및 계절성 천식은 그 약리학 및 면역학적 측면에서의 진전에도 불구하고 서구 사회에서 지속적으로 상당한 환자수 가 발견되고 사회-경제학적으로 타격을 주고 있다. 항-히스타민 및 스테로이드를 비롯한 이용가능한 약물 범위의 증가로 알레르기성 질환의 치료가 개선되었저만, 장기간 사용에 따른 부작용이 따른다. 이러한 문제 때문에, 알레르기 질환의 면역 치료에 새로운 관심이 제시되었다. 면역치료법은 알레르기성 반응을 없애기 위해 강력한 알레르겐 추출물을 주사하는 과정을 포함한다(부스켓 및 미셸 (1989) Allergy Clin. Immunol. News 1 : 7-10). 불행히도, 알레르겐으로 사용된 화분 제제는 다가로서 품질이 낮다. 결과적으로, IgG 응답 반응을 유도하기 위해 사용된 농도는 높으며, 아나필락시를 비롯한 전신 반응을 유도함으로써 치명적일 수도 있다. 알레르겐 서열에 의거하여 클로닝된 유전자 생성물 또는 합성 펩티드는 품질 조절되고 특징 규명되며 표준화될 수 있으므로 치료용으로 보아 안전한 배지를 제공한다.
징후 경감을 위한 정확한 메카니즘은 가설로 남아 있다. 그러나, 라이그라스 감수성 개체에게 본 발명의 재조합, 합성 또는 정제된 천연 Lol p Ib 또는 그것의 적어도 하나의 항원성 단편을 포함하는 제제를 투여하면, 예컨대 Lol p Ib에 대한 B-세포 응답반응, Lol p Ib에 대한 T-세포 응답반응 또는 Lol p Ib에 대한 B 세포 및 T세포 응답반응 양자 모두를 변경시킴으로써 라이그라스 화분 알레르겐에 대한 라이그라스 감수성 개체의 알레르기 반응이 변형될 것이다.
현행 면역치료법은 알레르기학에 있어 가장 빈번하게 처치되는 치료법중 하나로, USA에서는 첫번째 방도로 선택 고려된다. 화분 비염 치료시 이러한 치료방법의 이점은 치료에 3년 이하가 소요되는 반면 약물치표법은 환자의 전 생애동안 수행되어야 한다. 환자에게 면역치료용 화분 추출물 투어 결과 치료 종결후 4년간 임상적 효과가 지속되었다(그래머 등 (1984) J. Allergy Clin. Immunol 73 : 484-489).
인체에 있어 라이그라스 화분 알레르겐 Lol p II 및 Lol p III에 대한 면역 반응성은 조직적합성 백혈구 항원 HLA-DR3과 밀접한 관련이 있다(프라이도프 등 (1988) 조직 항원 31 : 211-219:안사리 등 (1989) Human Immunol. 25 : 59-71 ; 안사리 등(1989) Int. Arch. Allergy Appl.Immunol. 88 : 164-189). 이는 항원-제시 세포의 II류 Ia분자를 암호하는 HLA-DR3이 다른 알레르겐상에 존재하는 유사한 면역우성적 T세포/Ia인지 부위를 인식할 수 있다. Lol p Ia는 Lol p II 및 Lol p III(프라이도프 등, 상기 참조)와 면역우성적 T세포/Ia 인지 부위(YTTEGGTKS EVEDV IP)를 공유하는 것으로 공지되어 있다. Lol p II 및 III에 대해 반응하는 대부분의 알레르기성 개체는 Lol p Ia에 대해 응답반응하나, 상호적인 관계는 아니다. 따라서 Lol p Ia는 Lol p II 또는 III내에 존재하지 않는 독특한 T세포/Ia 인지 부위를 가지는 것으로 보인다. 또한, Lol p Ia,II 또는 III 간에 공유하고 있는 공통의 T세포/Ia 인지 부위는 Lol p Ib.1 또는 Lol p Ib.2의 추론 서열에서는 제시되지 않는다.
따라서, 본 발명은 라이그라스 화분으로 인한 알레르기에 대해 인체를 둔감시키는 백신을 개발하는데 유용한, Lol p Ia와 Lol p Ib.1간의 공통 항원성 에피토프를 포함하는 유도체를 포함한 면역 관련체, 단백질 알레르겐, 그 유도체 또는 동족체의 Lol p Ib족에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 라이그라스 화분에 대한 인체의 알레르기를 경감시키는데 충분한 시간 및 조건하에 Lol p Ib 또는 그것의 적어도 하나의 단편 또는 유도체, 동족체 또는 면역 관련체를 알레르기 경감-유효량을 인체에게 투여하는 것을 포함하는, 그라스 화분에 대한 인체 알레르기를 경감시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 포유동물에게, 치료 유효량의 본 발명의 치료 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 화분에 대해 감수성인 포유동물에게 있어 라이그라스 화분에 대한 감수성을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 포유동물에게 치료 유효량의 상기 본 발명의 단백질 제제를 투여하는 것을 포함하여, 라이그라스 화분 알레르겐과 면역학적으로 교차-반응하는 라이그라스 화분 알레르겐 또는 알레르겐에 대한 민감증을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 펩티드 및 단백질을 사용함으로써, 일관성 있고 잘-규정된 조성물 및 생체 활성의 제제를 제조하여 치료 목적으로(예를 들면, 이러한 식물의 화분에 대한 L페레네 감수성 개체의 알레르기 반응을 변형하기 위해) 투여할 수 있다. 이러한 폡티드 또는 단백질의 투여는 예를 들면 Lol p Ib 알레르겐에 대한 B-세포 응답반응, Lol p Ib 알레르겐에 대한 T-세포 응답반응 또는 양자의 반응 모두가 변형된다. 정제된 펩티드는 L.페레네 알레르기의 면역치료 메카니즘을 연구하고 면역치료에 유용한 변형된 유도체 또는 유사체를 고안하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 알레르기 경감 또는 치료유효량의 Lol p Ib 또는 그 유도체, 동족체 또는 이들의 면역학적 관련체와 1종 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 함유하는 약제 조성물을 제공한다. Lol p Ib를 함유하는 약제 조성물의 활성 성분은 예컨대 특정 경우에 따른 양으로 투여시 그라스 화분에 대한 인체 알레르기를 경감시키는데 있어 탁월한 치료 활성을 나타낸다. 예를 들면, 1일 체중 1kg 당 약 0.5㎍ 내지 약 20mg이 투여될 수도 있다. 투여량은 최상의 치료 반응을 제공하도록 조절될 수 있다. 예컨대, 수회 분할 용량을 매일 투여하거나 또는 용량은 치료 상태의 절박성에 따라 비례적으로 감소될 수 있다. 활성 화합물의 경우, 정맥(수용성인 경우), 근육내, 피하, 비강내, 피내 또는 좌약 또는 이식(예, 서방성 제제 이용)에 의해 편리한 방식으로 투여할 수 있다. 투여경로에 따라, 본 발명의 약제 조성물을 함유하는 활성 성분은 상기 성분을 비활성화시킬 수 있는 효소, 산 및 기타 천연 조건의 작용으로부터 성분을 보호하는 물질로 피복할 필요가 있다. 예컨대, Lol p Ib는 보조제중에 넣어 투여하거나 효소 억제제와 공통-투여하거나 리포좀에 넣어 투여할 수 있다. 보조제는 광범위한 의미로 사용되며 인터페론과 같은 면역 자극성 화합물을 포함한다. 본원에서 보조제로는 레소르시놀, 비-이온성 계면활성제 예컨대 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실 폴리에틸렌 에테르가 포함된다. 효소 억제제에는 췌장성 트럼신이 포함된다. 리포좀에는 통상의 리포좀뿐아니라 수중유중수형 CGF 유탁액이 포함된다. T세포 아네르기를 유도하기 위해서는, 약제 조성물을 비면역원성 형태로 투여하는 것이 바람직하다(예, 보조제는 함유하지 않음).
활성 화합물은 또한 비경구 또는 복강내 투여할 수도 있다. 또한 분산액은 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜 및 그 혼합물 및 오일중에 제조할 수 있다. 통상의 보관 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 방부제를 함유한다.
주사용으로 적합한 약제 형태에는 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 즉석 분산액 멸균 분말이 있다. 모든 경우에서, 약형은 멸균 상태이어야 하며, 용이하게 주사기 투약가능한 정도로 액체이어야 한다. 제조 및 보관 상태에서 안정해야 하며 박테리아 멎 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 용매 또는 예를들면, 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 그것의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 포함하는 분산액일 수 있다. 적절한 유동성은 레시틴과 같은 피복제를 사용함으로써, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기를 유지시킴으로써 그리고 계면활성제를 사용함으로써 유지할 수 있다. 미생물 작용의 억제는 각종 항박테리아제 및 항진균제 예컨대, 파라벤, 클로로부탄올, 폐놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 수행될 수 있다. 많은 경우에 있어, 등장제, 예컨대 당 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 흡수 연장은 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 암모늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물중에 사용함으로써 수행할 수 있다.
멸균 주사액은 상기 나열한 각종 기타 성분과 함꼐 필요량의 활성 화합물을 적절한 용매중에 혼입한 후, 필요에 따라 여과 멸균시킴으로써 제조한다. 일반적으로, 분산액은 기본적인 분산매와 전술한 것들중 필요한 기타 성분을 포함하는 멸균운반체내로 각종 멸균 활성 성분을 혼입함으로써 제조한다. 멸균 주사액 제조용 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조 기법인데 이는 상기 멸균 여과 용액으로부터 활성 성분과 그의 목적하는 성분의 분말을 산출한다.
적어도 하나의 Lol p Ib족 멤버 또는 적어도 하나의 그 단편이 전술한 바와 같이 적절히 보호될 때, 활성 화합물은 에를 들면 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구 투여되거나 경질 또는 연질 외피 젤라틴 캅셀중에 봉입되거나 정제로 압착되거나 또는 음식물과 직접 혼입할 수 있다. 경구 치료적 투여의 경우, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입하여 섭취 정제, 구강 정제, 트로키, 캅셀, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 적어도 1중량% 의 활성 화합물을 포함해야 한다. 조성물 및 제제의 백분율은 편리하게는 유니트 중량의 약 5내지 80%이다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물중 활성 화합물의 양은 적합한 투여 용량이 얻어지는 양이다. 본 발명에 따른 바람직한 조성물 또는 제제는 경구 투여 단위형이 약 10㎍ 내지 2000mg의 활성화합물을 함유하도록 제조된다.
정제, 트로키, 환제, 캅셀 등은 다음을 포함할 수도 있다: 껌 트라가칸트, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스폐이트와 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 분해제 ; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 및 수크로오즈, 락토오즈 또는 사카린과 같은 감미제. 또는 페파민트, 윈터그린 오일 또는 체리 향료와 같은 향미제를 첨가할 수도 있다. 투여 단위 형태가 캅셀일 경우 상기 종류의 물질들외에 액상 담체를 함유할 수도 있다. 기타 각종 물질들이 피복제로서 또는 투여 단위 형태의 물리적 형태를 변형시킬 목적으로 제공될 수 있다. 예를 들면 정제, 환제 또는 캅셀은 셀락, 당 또는 양자 모두로 피복할 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 활성 화합물, 감미제로서 슈크로오즈, 방부제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 체리나 오렌지 향과 같은 향료를 함유할 수도 있다. 물론, 투여 단위 형태 제조시 사용된 물질은 사용량이 약제학적으로 순수해야 하며 거의 비-독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방성 제제 및 배합물내로 혼입될 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제"는 용매, 분산매, 피복제, 항박테리아제, 항진균제, 등장제, 흡수 지연제 등을 임의로 및 모두 포함한다. 이러한 약제학적 활성 물질에 대한 매질 및 제제를 사용하는 것은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 비상용성인 경우를 제외하고, 이들은 치료 조성물중에 사용할 수 있는 것으로 간주된다. 보층 활성 성분을 조성물중에 혼입할 수도 있다. 용이한 투여와 균일한 투여량을 위해, 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 사용된 투여 단위 형태는 치료할 포유동물 개체에 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분할된 단위를 이르며 ; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 산출하도록 계산된 소정량의 활성 물질을 포함한다. 본 발명의 신규 투여 단위 형태에 대한 구체적인 사항을 (1) 활성 물질의 독특한 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과 및 (b) 신체 건강이 손상되지 않는 질환 조건을 가진 생존체에게 있어 질환 치료를 위한 활성 물질과 같은 화합물의 당해 기술 분야에서의 한계성에 따라 직접적으로 좌우된다.
주요 활성 성분은 편리하고 효과적인 투여를 위해 유효량, 적합한 약제학적 허용 담체와 투여단위 형태로 혼합한다. 단위투여형태는 예를들면 주요 활성 화합물을 약 10㎍내지 약 200㎎ 범위의 양으로 포함할 수 있다. 비율로 표시하면, 활성 화합물은 일반적으로 약 10㎍/㎖내지 약 2000mg/㎖의 담체중에 존재한다. 보층 활성 성분을 함유하는 조성물의 경우, 투여량은 일반 용량과 상기 성분의 투여 방식에 따라 결정된다.
본 발명은 이하 비-제한적인 도면 및 실시예에 의해 더욱 예시된다.
[실시예]
[실시예 1]
cDNA 클론의 분리
벡터 람다-gt11 의 cDNA 발현 라이브러리를 성숙한 라이그라스화분의 폴리아데닐화된 mRNA로부터 제조하였다[참조 : 비올 및 미첼(1986) J. Immunol. Methods 86 : 217-223]. 이라이브러리를 초기에 단일클론항체(MAb) FMC-Al(40.1)로 검색하였다(제1a도).
페놀법(헤린 및 마이클(1984) Plant Mol. Bio1. Rep., 2 : 24-28)에 의해 성숙한 라이그라스화분으로부터 분리해낸 폴리(A+)mRNA를 사용하여 벡터람다-gt11 내의 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 이어서 라이브러리를 항체 탐침으로 검색하여 그룹 I의 단백질을 발현하는 서열을 검출하였다. 3×104재조합 파아지로 형질감염시긴 E. coli Y 1090을 플레이팅하여 42℃에서 3시간동안 항온처리하였다. 플레이트를 10mm IPTG에 미리 함침시킨 132mm 건조 니트로 셀로로스(NC)펄터로 덮고 37℃로 옮겼다. 3시간동안 항온처리한 후, 필터를 조심스럽게 박리 제거하고 실온에서 30분동안 필터당 20㎖의 MTBS(10%w/v 탈지유 분말, 50mm Tris-HCl, PH 7.6, 150mM NaCl) 중에서 항온처리 하였다. 두번째 NC 필터 세트를 파아지 플레이트상에 놓고 3시간동안 항온처리한후 상기한 바와 같이 처리하였다. 두 세트의 NC 필터에 대해 문헌[후인 등(1985) In : DNA 클로닝, 실제적 연구, 글로버, D. M. 편집. 제1권, 49-78면, IRL 프레스, 옥스포드, 영국]에 기술되어 있는 방법에 따라 플라크에 MAb 40.1을 결합시키는 시험을 수행하였다. 항체 양성 플라크를 수집하고, 정제한 후, 재플레이팅하여 탐침에 대한 결합 시험을 수행하였다. 양성 클론을 플라크-정제하고 라이그라스 화분-알레르기성 검체로부터의 혈청을 사용하여 IgE 결합 시험을 수행하였다. Lol p I- 특이성 MAbs 및 IgE 항체에 의해 인식된 단백질을 암호화하는 것으로서 18개의 클론을 선택하였다(표 1). 크기가 1.2kb이고, 라이그라스 알레르기성 단백질의 cDNA 클론중 가장 큰것은 부가의 형질 분석 및 서열 분석을 위해 초기에 선택하였다(제1a도).
[표 1]
IgE 및 MAbs의 특이성은 라이그라스 화분 단백질 추출물의 면역 블롯팅 분석법에 의해 시험하였다(제1b도).
가용성 단백질은 얼음상의 PBS(10mM의 인산 나트륨중의 150mM의 NaCl, PH 7.2)중에서 3시간동안 강교반하여 라이그라스화분으로부터 추출하였다. 화분을 용액으로부터 스피닝처리하고 추출된 단백질을 바이오라드 분석법을 이용하여 표준화시켰다. 10-15% w/v SDS-폴리아크릴아미드 겔상의 환원조건 하에서 레인당 120㎍의 단백질을 전기영동시켰다. 단백질을 NC필터상에 전기블로팅시키고 블롯을 10% w/v 탈지유분말을 함유하는 TBS(10mM Tris, 150mM NaCl, PH 7.9)로 차단시켰다. 블롯을 스트립형태로 절단하고 각종 탐침으로 처리하였으며, MAbs는 1% BSA를 함유하는 TBS에 1:1000으로 희석하였다. 라이그라스화분의 RAST 스코어가 높은, 적어도 4명의 환자로부터 채집한 혈청을 혼합하고, IgE 결합을 위해 TBS/1%w/v BSA에 1:5 희석하여 사용하였다. 호오스래디쥐 페록시다제-접합된 2차 항체(다코패츠, 글로스트럽, 덴마크)를 사용하고, 세정후 4-클로로 1-나프톨(바이오래드, 리치몬드, 캘리포니아)와 H2O2로 결합을 가시화하였다.
면역 블롯을 라이그라스 화분-알레르기성 개체로부터 채집한 혈청중에서 항온 처리할때, 28-35kD 영역 전반에 걸쳐 강한 IgE 결합이 관찰되었다. 이 연구에서 사용한 MAbs 3.2, 12.3, 21.3 및 40.1은 이미 부분적으로 특성 규명된 것이다[카안 및 마아쉬 (1986) Molec. Immunol 23 : 1281-1288 ; 싱그 및 녹스(1985) Intl. Arch. Allergy ＆ Applied. Immunol. 78 ; 300-304 : 스마트등(1983) Intl. Arch. Allergy ＆ Applied Immunol. 72 : 243-248)]. MAbs 3.2, 21.3 및 40.1은 28-35kD 영역에서 단백질과 강한 반응성을 나타내었다. MAb 12.3은 35kD 밴드에 대해서는 결합을 나타내지 않았으나, 낮은 밴드에 대해서는 강하게 결합하였다. 이러한 상호작용은 IgE 및 MAbs가 변성 알레르겐을 인식할 수 있으며, E. coli에서 발현된 재조합 단백질을 검출하는데 적합한 탐침임을 나타내는 것이다. MAb FMC-A1은 Lol p Ib에 대한 결합 강도보다는 작지만 Lol p Ia에 대해 우선적으로 강하게 결합한다는 것은 이미 알려져 있다. 새로운 데이타는 본래의 FMC-Al 제제는 단일 클론 보다는 복수 클론임을 제시하고 있다. FMC-Al 제제중의 한 항체는 Lol p Ia에 대해 특이성이 있는 것으로 나타났으며 또 다른 하나는 Lol p Ib에 대해 특이성이 있는 것으로 나타났다. 따라서 FMC-Al에 의해 정의된 Lol p Ia 및 Lol p Ib의 명확한 교차-반응은 이 항체제조시에 복수클론성을 반영할 수 있다.
12R 삽입물을 함유하는 람다 클론의 용원성 배양물의 유도에 의해 제조된 알레르겐-베타-갈락토시다제융합 단백질은 MAb 40.1을 사용하는 면역블록 분석법에 의해 특성 규명하였다. 약 146kD의 융합 단백질은 116kD의 베타-갈락토시다제와 30kD의 알레르겐 암호화서열로 구성되는 것으로 추정된다. 이 융합단백질은 저수율로 제조되었다. 추가의 분석을 위한 클로닝된 알레르겐의 수율을 증가시키기 위해서, 본 발명자들을 대안적인 발현 체계를 사용하였다. 1.2Kb 삽입물을 플라스미드 발현 벡터의 pGEX1-3류에 서브클로닝시켰다. 이러한 플라스미드는 쉬스토소마 자포니컴(Schistosoma japonicum) 글루타티온 S-트랜스퍼라 제 단백질의 카르복실 말단을 가진 융합 폴리펩티드를 제공한다(스미쓰 및 존슨(1988), Gene, 67 ; 31-40). 강한 IgE 결합은 pGEX-12R에 의해 형질전환된 박테리아에서만 검출되었고 모체 pGEX 플라스미드에 의해 형질전환된 것들에서는 검출되지 않았다(데이타는 제시되지 않았으나, 제4도에 나타난 결합과 유사함). 라이그라스 화분에 대해 음성 방사성 알레르겐 흡착(RAST) 스코어를 가진 대조용 혈청에 의한 웨스턴 블롯을 조사한 결과는 IgE 결합을 나타내지 않았다.
[실시예 2]
클로닝된 알레르겐 12R의 동일성
이 연구에 사용된 4종의 MAbs는 모두 클로닝된 알레르겐 12R을 인식하였다(제1a도).
MAbs 모두가 천연 Lol p I 단백질에 대해 동일한 특이성을 나타내지는 않는다(제1b도). 특히, MAb 12.3은 35kD 밴드를 인식하지 않는다. 클로닝된 알레르겐은 모든 MAbs와 결합하며, 특히 MAb 12.3에 대한 강도가 높기 때문에, 클로닝된 알레르겐은 낮은 Mr의 단백질에는 대응하나 35kD의 단백질에는 대응하지 않을 것으로 예상된다. 이것의 동일성을 확인하기 위해서, 기생충 항원을 위해 개발된 면역학적 방법을 이용하였다(예 : 비올 및 미첼(1986)J. Immunol. Methods 86 : 217-223). 이 방법에서, 클로닝된 알레르겐 12R를 니트로셀룰로스막에 고정시키고 혈청으로부터의 특정 IgE 항체를 결합시키는데 사용하였다. 결합된 항체를 용출시키고 라이그라스 화분 단백질의 웨스턴 블롯을 조사하는데 사용하였다. 고도의 결합 특이성 및 결합 패턴의 재현성은 분자량 31 및 33kD의 두 단백질 성분에 대해 수회의 실험을 통해 일관되게 얻어진 것이다. 35kD밴드는 Lol p Ia로 지졍하였고 31 및 33kD 밴드는 Lol p Ib로 지정하였다. 이러한 실험들은 클론12R에 결합하는 IgE 항체가 약간 다른 분자량, 31 및 33kD를 가진 두 성분을 인식함을 입증하는 것이다. IgE 항체를 선별함에 있어 비-라이그라스 화분 알레르기성 개체로 부터의 IgE 항체를 사용하거나 비-재조합 pGEX 플라스미드에 의해 변형된 E.coli의 추출물을 사용하는 경우에는 비특이성 결합이 관찰되지 않았다.
Lol p Ib 단백질은 제1차원에서 예비적인 등전기적 포커싱을 수행한 후, 채집된 개별 분획들을 SDS-PAGE에 의해 분석하는 2차원적 분석법에 의해 정제하였다. 이 방법에 의해 결정하고자 하는 N-말단 서열을 가진 충분량의 Lol p Ib를 성공적으로 분리해냈다(표 2).
[표 2]
개별 단백질 성분들을 로토퍼(바이오래드, 리치몬드, 캘리포니아)상에 예비적인 등전기적 포커싱을 수행하여 분리하였다. 단백질을 SDS-PAGE상에서 분리하고 PVDF막(밀리포어, 베드포드, 매사츄세츠)으로 옮겼다. N-말단 서열화를 마쯔다이라(1987)[J. Biol. Chem. 262 : 10035-10038] 및 심프슨 등(1989) [J. Chromatogr. 476 : 345-361]에 따라 수행하였다.
31/33kD 단백질, Lol p Ib는 본 명세서에서는 Lol p Ia로 기재된 Lolp I(콧탐 등 (1986) Biochem J. 234 : 305-310 : 표 2)와는 다른 N-말단 아미노산 서열을 갖는다. 결론적으로, 클론 12R에 의해 암호화된 알레르겐은 새로 동정된 알레르겐, Lol p Ib.1을 나타내는 것이다. 클론 12R의 뉴클레오티드 서열은 제3b도 및 제3c도에 나타낸다.
[실시예 3]
알레르겐의 화분 특이성 발현
폴리 A+ RNAs를 식물의 다른 조직 즉, 종자, 잎, 뿌리 및 화분으로부터 분리해냈다. 다른 조직으로부터의 총 RNA 20㎍을 포름아미드 및 포름알데히드(샘브룩 등, 상기 참조)의 존재하에 1.2% w/v 아가로스 겔상에 전기 영동시키고, Hybond-C 엑스트라(아메르샴, 알링톤 하이츠, 일리노이)로 옮긴후, 필터를 80℃에서 2시간동안 베이킹하였다. 1.2kb 12R cDNA를32P로 방사선 표지화시키고 50% v/v 포름아미드의 존재하에 65℃에서 NC 필터와 함께 배양하였다. 막을 0.1% w/v SDS를 함유하는 2×SSC(0.3M NaCl, 0.3M 구연산 나트륨, pH 7.0)로 65℃에서 세정하였다. 1mM PMSF를 함유하는 10mM PBS 중에서 분쇄하여 단백질을 다른 조직(꽃, 잎, 뿌리 및 화분)으로부터 분리해내고, 표시된 항체로 면역 블롯팅(레인당 단백질 10㎍)하였다. MAbs용125I-고우트 항-마우스 Ig(아메르샴, 알링톤 하이츠, 일리노이) 및 폴리클로날125I-고우트 항-인체 IgE(칼스태드, 체스카, 미네소타)를 사용하여 가시화한 후 방사선 사진 촬영하였다.
화분으로부터 제조된 RNA의 노오던 블롯팅 분석 결과, 화분의 클로닝된 알레르겐 유전자의 발현 정도는 높은 것으로 나타났으나 다른 식물성 조직에서는 나타나지 않았다. 화분 RNA에서 관찰된 약 1.3kb 길이의 돌출 영역은 식물성조직으로부터의 RNA에서는 검출할 수 없다(제2a도). 화분-특이성 RNA 발현은 MAbs 40.1, 12.3 및 IgE 항체에 의해 인식된 항원의 화분-특이성 발현에 대응하였다(제2b도). 화분 및 꽃조직(화분 포함)을 단백질원으로 사용하였을 때에만 특이성 결합이 나타났다.
[실시예 4]
1차 구조 분석
cDNA 클론 12R을 분리하여 pGEM-3Z 벡터(프로메가, 매디슨, 위스콘신)에 서브 클로닝시키고 제한 지도화하였다. 각종 크기의 제한 단편을 pGEM 벡터에 서브 클로닝시켰다.
분리된 cDNA 클른 12R을 또한 pBluescript II 벡터(스트라타젠, 라 졸라, 캘리포니아)에 서브 클로닝시키고 XL1-블루세포(스트라타젠, 라 졸라, 캘리포니아)를 형질 전환시키는데 사용하였다. DNA 서열은 T7 DNA 폴리머라제(파르마시아, 피스카타웨이, 뉴저지)를 사용하여 디데옥시 사슬 말단화 방법(생거 등(1977) Proc. Natl Acad. Sci. USA 74 : 5463-5468)을 수행하는 이중 가닥 서열 분석 방법에 의해 결정하였다. 네스트형 결실은 Exo III 및 S1 누클레아제를 사용하여 T7 및 T3 말단으로부터 발생시켰다. 플라스미드 DNA는 변형된 알칼리성 용해 방법을 이용하여 제조하였다. 결실 클론은 아가로스겔상의 전기 영동에 의해 DNA 서열 분석을 위해 선택된 크기를 가졌다. DNA 서열화는 T7 DNA 폴리머라제 및 디데옥시 누클레오티드 말단화 반응을 이용하여 수행하였다.[35S]dATP를 라벨로서 사용하였다. 서열 분석 반응은 8M 우레아를 함유하는 6% 폴리아크릴아미드 웨지 겔상에서 분석하였다. 내부 서열 분석 프라이머는 필요에 따라 합성하였다. 해독틀은 제4도에 상세히 설명되어 있는 바와 같이 pGEM 벡터에서 2개의 발현 서브 클론을 서열 분석함으로써 확인하였다. DNA 서열 데이타는 PC 유전자 시스템 (인델리제네틱스, 마운틴 뷰, 캘리포니아)을 사용하여 분석하였다.
cDNA 클론 12R의 누클레오티드 서열은 GC가 농후하였다(61% GC, 제3b도 및 제3c도). 제3b도 및 제3c도에 도시된 바와 같이, 누클레오티드 40에서 ATG 개시코돈에 의해 개시되고 누클레오티드 943에서 개시하는 TGA 코돈에 의해 종단되는 개방 해독틀이 있다. 제안된 해독 개시 부위와 그것의 측면 서열은 일치된 식물 서열 AACAATGGC 누클레오티드 36-44)를 갖고 89% 상동성을 가지며, 메티오닌 코돈으로부터 위치-3(누클레오티드 37)에 푸린이 존재하는 것이 최적조건인 것으로 간주할 수 있다.(참고 : 카베너 및 레이(1991), 핵산연구, 19 : 3185-3192). 개방 해독틀은 예상된 Mr 29.8kD의 단백질을 암호화한다.
알카리성이 농후한(32%), 예상된 단백질 서열은 25개의 아미노산(제3b도의 아미노산-25 내지 -1)으로 이루어진 추정 신호 또는 표적 펩티드 서열을 갖는다. 이것은 예상된 Mr 27.3kD의 분해 단백질을 나타낸다. Lol p Ib의 N-말단 단백질 서열은 신호 펩티드 서열의 추정 분해 부위 직후에 존재하는 클론 12R의 추정 아미노산 서일과 동일하다. 이것은 cDNA-12R이 Lol p Ib 알레르기성 단백질을 암호화한다는 사실과 단백질이 분해되는 신호 펩티드 서열을 갖는다는 사실을 확인해주는 것이다. 12R 클론에 의해 암호화된 단백질을 Lol p Ib.1로 지정하였다. Lol p Ib.1의 추정 아미노산 서열은 제3b도 및 제3c도에 도시되어 있다.
신호 서열은 다른 진핵 생물 서열의 전형적인 특징을 갖는 바, 즉 C-말단에 5개의 아미노산을 가진 비교적 친수성의 서열이며, N-말단에서 보다 친수성이 되는 신호 영역 거의 전반에 걸쳐 연장되어 있는 비교적 소수성의 서열이다(제3d도). C-말단의 아미노산은 분해 부위에 알라닌을, -2에 방향족 잔기 티로신을 그리고 -6에 나선형 브레이커 프롤린을 포함하며, 이들 모두는 신호 서열의 C-말단 영역이라는 공통된 특징이 있다.
추정 아미노산 서열의 일치된 글리코실화 서열(Asn-X-Ser/Thr)의 연구 결과 그러한 서열은 검출되지 않았다. 알레르겐상의 N-결합 카보히드-레이트쇄의 부재는 효소 N-글리카나제 및 엔도-F 글리코시다제에 의한 디글리코실화 후처리의 결핍에 의해 확인하였다. 화학적 디글리코실화에 이어 SDS-PAGE 처리를 수행한 결과 단백질의 분자량 감소가 나타나지 않았다. 31/33kD 성분은 더블릿으로 남아 있었는바, 이것은 분자량의 차이는 글리코실화에 기인하는 것이 아님을 나타내는것이다. 디글리코실화 처리는 31/33kD 성분에 대한 IgE 결합에 영향을 미치지 않았다. 5% 카르보히드레이트를 갖는 Lol p Ia와 비교할 때, Lol p Ib에는 카르보히드레이트가 존재하지 않는다.
Lol p Ib의 아미노산 서열과 Lol p Ib.1의 추정 아미노산 서열은 Poa p IX cDNA 클론(실바노비치 등 (1991) J. Biol. Chem. 266 : 1204-1210)으로부터 직접 단백질 서열 분석을 통해 추정된 Phl p V(매트슨 및 로웬스타인(1991) Clin. Exp. Immunol. 21 : 297-307) 및 Dac g V(월쉬 등 (1989) Int. Arch. Allergy Appl. Immuno1. 91 : 419-425)에 대해 결정된 공지의 아미노산 서열과 단백질 서열 상동성을 나타낸다. 이러한 서열 상동성은 표2에 나타낸다.
[실시예 5]
IgE- 및 MAb- 반응 에피토프의 분석
MAb 및 IgE 결정 인자를 집중시키기 위해서, 이. 콜리 재조합 발현 시스템을 사용하였다(스미쓰 및 존슨(1988) Gene 67 : 31-40). 이 시스템을 사용하여 다수의 제한 단편들을 발현 플라스미드 pGEX 1-3으로 서브 클로닝 시켰다. 전 길이의 cDNA를 pGEX로 "인 프레임" 서브-클로닝한 결과 IgE 및 MAbs 40.1 및 12.3에 의해 인식된 61kD 융합 단백질을 발현시켰다.
전 길이의 cDNA 12R 또는 2개의 제한 단편 1H 및 2P(제4도에 도시)를 플라스미드 발현 벡터 pGEX에 서브클로닝시켰다. 융합 단백질의 유도 방법과 박테리아 융균물의 제조 방법은 이미 설명한 바 있다(스미쓰 및 존슨, 상기 참조). 수득된 융균물을 SDS-PAGE 환원 처리한 후 NC막으로 옮겼다. IGE 결합을 검출하는데125I-항인체 IgE(칼스타드, 샤스카, 미네소타)를 사용한 것을 제외하고는, 제1b도와 관련하여 설명한 바와 같이 블롯을 IgE 항체, 및 MAbs 40.1 및 12.3으로 프로빙하였다.
면역 블롯팅 분석 결과, 제조된 대부분의 융합 단백질은 글루티티온-S 트랜스 퍼라제를 가진 융합 부위 부근에 있는 박테리아성 프로테아제에 의해 분해되어 IgE 항체에 의해 인식되는 분해 생성물을 생성하는 것으로 나타났다(제4도). 단편 2P(GST-2P)에 의해 발현된 재조합 융합 단백질은, MAbs와 반응성이 강하지만 혼합된 알레르기성 혈청중에서 IgE 항체에 의해 인식되지 않았다. 그러나, 단편 1H(GST-1H)에 의해 제조된 N-말단 절두형 단백질은 MAbs중 어느 것에 의해 서도 인식되지 않았으나, IgE 항체와는 반응성이 강력하였다.
이러한 방법으로, 알레르겐 분자의 두 별개의 도메인을 분석한 결과, 단편 2P 를 함유하는 N-말단은 MAbs 12.3 및 40.1의 인식 부위를 가졌으며, 단편 1H 를 함유하는 C-말단은 강한 IgE 결합을 나타내며 알레르겐 결정 인자(들)를 갖는다. 두 MAbs는 다른 결합 특이성(제1b도)을 갖기 때문에, 두 MAbs의 인식 부위는 동일한 단편내에서도 다른 것처럼 보인다. 12.3 및 40.1 결합 부위를 분석하기 위해서는 보다 작은 단편에 의한 미세지도화가 필요하나, 이러한 결과들은 IgE 결정 인자가 다름을 입증하기에 충분하다.
[실시예 6]
라이그라스 화분내 Lol p Ib의 세포내 타겟팅
롤리움 페레네의 성숙한 화분을 확립된 방법(스태프 등. (1990) Histochem J.22 : 276-290)에 따라 주사 전자 현미경을 위해 준비했다. 면역 세포 화학에 있어서, 성숙한 꽃밥을 무수 조건하에 고정시켰다: 41℃에서 2시간동안 0.1% 글루타르알데히드, 2,2-디메톡시프로판내의 1% 파라포름알데히드하에 고정시켰고 투광 전자 현미경으로 처리했다(스태프 등, 상기 참조). 상기 방법은 액체 배지내의 그들의 세포 부위로부터 알레르겐의 확산을 감소시킨다. 블록들을 -25℃, UV 조사하에서 1% 벤질로 LR 골드 수지내에서 중합하였고 80nm의 얇은 부분을 골드 격자에서 떼어냈다. 면역-표지화는 처음에 제1항체, MAb 12.3(Lol p Ib에 특이성을 가짐)로 이어서 골드-염소-항-마우스 IgG 탐침(15nm입자 크기)으로 하였다. 상기 레벨은 40nm 입자 크기에 실버-보강된 것이다(단스체르와 노르가드의 문헌[(1983) J. Histochem. Cytochem. 31 : 1394-1398]을 수정함). 두번째 라벨링은 같은 부위에 세개의 MAbs, 3.2, 21.3 및 40.1의 혼합물로 수행한 후 15nm 입자 크기를 갖는 골드-염소-항-마우스 IgG 탐침에 의해 수행되었다. 전술한 바와 같이 작업 조절된(스태프 등의 문헌 참조) 항체 특이성 및 방법은 상기 부위에서 골드 입자들이 발견되지 않았다.
Lol p Ia는 사이토졸(cytosol)에 위치하며 기능질에 위치하지 않는다. 이러한 발견은 Lol p Ia에 특이성이 있는 MAbs를 갖는 면역-골드 탐침을 사용하여 밝혀내었다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, Lol p Ib에 특이성이 있는 MAb 12.3는 전분 낟알에 주로 결합된다(제5a도, 제5b도). 그라스 화분을 아밀로프라스트의 관강에서 생긴 1× 2.5㎛크기의 전분 낟알로 충전하였다. 제5b도에서 나타낸 바와 같이, 주로 전분 낟알에 위치한 큰 골드 입자(큰 전자-광휘 종)가 MAb 12.3에 Lol p Ib가 결합된 것을 보여주는 반면 사이토졸에 위치한 보다 작은 입자는 통상적으로 Lol p Ia에 결합된다. 스케일 바아는 1㎛이다. 제5c도는 어두운 조도에서 30초동안 물에 노출시킨 후 신선하고 생존성있는 화분의 모습을 보여준다. 대부분의 화분 낟알은 싹이트고, 전분 낟알(백색 입자들)을 비롯한 세포질 내용물을 씨방 기공을 통해 밀어낸다. 스케일 바아는 30㎛이다.
성형 원질내의 Lol p Ib의 위치 측정은 상기 단백질이 발육중 사이토졸로부터 성형 원질의 관강까지 수송되어야 함을 의미한다. 엽록체의 수송에 있어서, 사이토졸에서 합성된 단백질은 목적하는 펩티드 연쇄를 포함하는 큰 전구 물질로써 합성되었고 기능질로 수송된 후 분열되었다. 사이토졸내 전-알레르겐으로써 처음 Lol p Ib의 합성과 후-병진 개질을 위한 성형 원질로의 수송과 같은 이러한 세포내 처리 단계는 면역 블로팅에 의해 발견된 이중선 31/33kD의 외관을 설명할 것이다. 미처리된 프리알레르겐은 33kD이고 성형 원질에 후 처리된 성숙한 단백질은 31kD이다. 상기 둘다는 성숙한 화분에 공존한다. 또한, 상기 더블렛은 Lol p Ib의 다른 이소포옴 또는 동종 부분을 대표할 수 있다.
[실시예 7]
면역계에서 Lol p Ib의 표현
라이-그라스 꽃이 개화되면, 꽃밥이 영향을 미치고 화분은 각각의 꽃밥의 저부에 개방된 기공을 통해 공기로 방출된다. 라이-그라스는 임의의 그라스의 가장 많은 화분을 생성하는데, 대략 1헥타당 460kg의 화분을 베어내거나 풀을 뜯어내지 않은 방목장 대기하에 방출한다. 상기 화분의 99%는 그들의 제공원의 1km이내에 퇴적(및 재-퇴적)된다. 그라스 화분은 생명이 짧지만 대기하에서 수일동안 남아 있을 수 있다. 실험은 화분이 방출후 단 몇시간 동안만 생존성이 있는 것을 보여주었다.
생존성 있는 낟알이 주두 또는 고수준의 삼투성을 지닌 인공 배지에서 발아될 수 있다. 살아있는 생존성 라이-그라스 화분 낟알이 물에 노출되는 경우, 세포질 내용물을 방출하는 단일의 씨방 틈에서 싹이 튼다(제5c도). 방출된 내용물중 눈에 띄는 것은 전분 낟알이다. 높은 삼투성 배지(예를 들면, 30% w/v 자당)가 낟알의 강장을 유지하는데 필요하다. 이에 반해, 장벽 침투성이 없는 죽은 화분 낟알은 스폰지처럼 작용하는 것으로 공지되어 있다. 알레르겐을 비롯한 세포 단백질은 습윤시에 표면으로부터 방출된다.
그라스 화분이 알레르겐의 방출에 의해 구강 및 눈 점막에 접착된 후 건초열을 야기할 수 있는 방식은 쉽게 알 수 있다. 화분 낟알 그 자체는 점막 표면에 남아 있지만, 방출된 알레르겐성 단백질은 점막 및 흐염기구 및 비만 세포로 교차된 진피층을 통과한다. 30-50㎛의 큰 직경의 화분 낟알이 어떻게 폐의 기도에 알레르겐의 존재에 의해 야기되는 질병인 알레르기성 천식을 유발할 수 있는지를 보여주는 것은 쉽지 않다.
최근에 주장되는 것으로는 그라스 화분 알레르겐이 대기의 에어로졸중에서 발견된 보다 작은 미세 입자와 관계가 있다는 것이다. 이러한 입자의 기원은 불분명하다. 알레르겐 위치 측정 및 수중에서의 화분 거동 관찰 결과 어떻게 그라스 화분이 민감한 인간의 폐에 알레르기성 천식을 유발할 수 있는지를 설명하기 위한 새로운 가설이 제안되었다. 살아있는 화분 낟알이 잎 또는 그밖의 기질의 표면에 수증기 또는 물과 만날때 전분 낟알이 대기중의 에어로졸로 미세 입자로써 방출된다. 알레르겐으로 피복되거나 충전된 이러한 입자들은 호흡 계통 상하로 알레르겐을 표현하기 위한 매개체로써 작용한다. 물론, 미세 입자 역시 그라스 화분에서 유리한 알레르겐을 걸러내고 대기중의 에어로졸의 그밖의 성분에 부착된다.
[실시예 8]
Lol p Ib.1에 대한 단일 클론 항체
단일 클론 항체(MAbs)를 당분야에서 공지된 기술을 사용하여 실시예 5의 용해 단백질 GST-1H에 대해 제조되었다(상기 콜러와 멀스타인의 문헌 참조). IgE 결합 영역에 해당하는 단편 1H(제4도)로 나타낸 용해 단백질은 항원이다.
4마리의 암컷 BALB/c 생쥐에 0.1㎖ PBS 및 0.1㎖ RIBI 보조제 중의 100 mg의 FPLC로 정제된 GST-1H 용해 단백질을 복강내(i.p.) 투여하였다(Immunochem. Res., 해밀톤, 몬타나). 14일후 같은 물질의 효능 촉진제를 복강내 제공하였다. 10일후 쥐들은 피를 흘렸다. 혈청을 총 라이그라스 화분 단백질의 웨스턴 블롯에 결합시키기 위해 검색하고 쥐들을 블롯에 결합된 상기 혈청을 기준으로 선택하였다. 14일후 접합을 위해 선택된 쥐들에게 100mg의 접합 단백질만을 포함하는 0.2㎖의 효능 촉진제를 복강내로 제공했다. 4일후 쥐들은 희생되었고 골수종 세포로 접합하기 위해 비장을 제거했다(오스트레일리아, 빅토리아, 파크빌레에 소재한 베터리너리 리서치 인스티튜트에서 제공). 접합 및 배양 사용 방법은 RPMI 및 히브리드세라(커몬웰쓰 세럼 레보러토리즈, 멜보른, 빅토리아, 오스트레일리아)를 사용한 문헌[할로우 및 레인(1990) 항체, 실험용 매뉴얼(콜드 스프링 하버 레보러토리즈 프레스, 콜드 스프링 하버, 뉴욕)를 기준으로 하였다. 아미노프테린 선별이 사용되었다(영국, 스코트랜드에 소재한 플로우 레보러토리즈의 50X HAT 및 HT 용액). 클로닝은 희석을 제한함으로써 수행했다.
단일 클론계는 고양이와 동형상인 생쥐 단일 클론 항체를 사용하여 동형상화 하였다(영국, 애머샴 인터내셔널). 그라스 화분 시즌 동안 전형적인 주기적 건초열 증상을 나타내고 피부 찌름 테스트에 양성 반응을 나타내는 환자로부터 허락을 받은후 인간의 알레르기성 혈청을 수집하였다. 웨스턴 블롯상의 라이그라스 화분의 총 단백질에 대한 IgE 반응성을 위해 혈청을 분석하였다. 화분 샘플은 그리어 레보러토리즈(르느와르, 노쓰 캐롤라이나)로부터 구입하였다. PBS 함유 1mM 페닐-메틸설포닐 플루오라이드에서 3시간동안 얼음상에서 격렬하게 교반함으로써 그라스 화분에서 용해성 단백질을 검출했다. 샘플 각각의 단백질 농도는 바이오-라드(리치몬드, 캘리포니아) 단백질 분석을 사용하여 측정하였다.
그라스 각각에 결합하는 항체는 초기에 슬롯 면역 블로팅에 의해 측정하였다. 2mg의 총 화분 단백질을 함유하는 100㎕ 샘플을 미니폴드 II 슬롯 블로팅 장치(독일, 다셀 소재의 슈라이처 앤드 슈엘)를 사용하여 니트로셀룰로오즈 막에 부가하였다. 이것을 PBS로 세척하였고 10%의 우유 분말을 함유한 같은 완충액으로 차단하였다.
SDS-PAGE는 바이오-라드(리치몬드, 캘리포니아) 단백질 II 슬라브 겔 장치 및 라에밀리 완충 시스템(라에밀리, 영국(1970) Nature 227:680)을 사용하여 10-15% 아크릴아미드 그라시엔트 겔로 수행하였다. 단백질을 코마시에 블루 R250(미주리주, 스트리트 루이스 소재, 시그마 케미칼 컴패니)로 착색함으로써 가시화하였다. 구배 SDS-PAGE에 의해 분리된 단백질을 토우빈 등의 문헌[(1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 4350-4354]에 기재된 방법에 따라 라이오-라드(리치몬드, 캘리포니아) 트랜스블롯 세포에서 겔로부터 니트로셀룰로오즈 막상으로 전기 이동학적으로 이동시켰다. 니트로셀룰로오즈상의 단백질을 비-특이적 부위를 슬롯 블롯에 대해 기재된 바와 같이 우유 분말중의 막을 배양함으로써 차단하여 검출하였다. 이어서 상기 막을 PBS로 세척하였고 MAb 용액에서 2시간 또는 0.5% BSA 및 0.1% 소듐 아지드를 함유한 PBS에서 1:5로 희석된 인간 혈청(10 그라스-알레르기성 환자로부터 수득한 혈청의 저장소)에 하룻밤 침지하였다. MAb 용액에서 배양된 막을 PBS로 세척한 후 PBS-BSA로 1:500 희석된 양 항-생쥐 IgG-호르세라디시 페록시다제(오스트렐리아, 실레누스)로 배양하였다. 세척후, 혈청 블롯을 PBS-BSA로 1:200 희석된 토끼 항-인간 IgE(덴마크, 글로스트림, 다코파트) 용액으로 2시간동안 1차 배양한 후 PBS-BSA로 1:2500 희석된 염소 항-토끼 IgG-호르세라디시 페록시다제(위스콘주, 매디슨, 프로메갈)용액에서 배양하였다. 블롯에 결합된 항체를 세척한 후 4-클로로-1-나프톨 및 과산화 수소를 함유한 페록시다제 기질 용액에 블롯을 배양함으로써 가시화하였다.
GST-1H 접합 단백질을 함유하는 분획은 FPLC 컬럼으로부터 용출시켰을 때 분획9 및 10이었다. 상기 분획들을 SDS-PAGE로 분석한 경우 단편 1H로 나타낸 26kD GST 및 15kD 단백질에 상응하는 41kD(GST-1H)의 단일 밴드가 나타났다.
MAb 생성 과정중 세포 집락을 포함하는 75개의 웰에서 하나의 결합물이 생성되는데 75개의 웰중 7개는 자연의 Lol p Ib 화분 단백질에 양성을 나타내었다. 세개의 강하게 성장한 집락을 클로닝하여 MAb 계통을 생성하였다. 동형상화된 두개의 계통은 LpIX-3A 및 LpIX-4A로 나타낸 IgG 카파 항체를 산출하였고, 하나는 IgM 카파 항체를 산출하였다. 유사한 방식으로, MAb LpI-7E(7E)를 항원으로써 추출한 용해성 화분을 사용하여 생성하였다. MAb LpI-7E는 Lol p Ia에 대해 특이성이 있다.
이러한 MAbs는 댁틸리스 글로메라타, 페스투카 엘라티어, 롤리움 페레네, 롤리움 멀티플로룸 및 포아 프라텐시스의 화분중의 비-변성된 항원에 결합한다(제6도). SDS-PAGE에 의해 분리된 용해성 화분 단백질의 웨스턴 블롯상에서, MAbs LpIX-3A 및 LpIX-4A는 페스투카 엘라티어, 롤리움 페레네, 롤리움 멀티플로룸 및 포아 프라텐시스중의 항원에 결합한다(제7도). 이러한 그라스들 모두는 계통학적으로 연관되어 있다. 그들은 포에아에족, 포아다에 과족, 포이데아에 아과에 일원이다.
[실시예 9]
Lol p Ib.2 면역 선별을 암호화한 cDNA 클론 19R의 유리
실시예1에서 cDNA로 표현한 라이브러리의 이중 필터를 혼주한 인간 알레르기성 혈청에서 특이성 IgE 로 선별하였다. 결합된 IgE 를125I-표지된 항-인간 IgE(미네소타, 카스카의 칼레스타드 레보러토리즈)를 사용하여 측정하였다. 이중 필터 둘다에 항체-양성인 혈소판을 뽑아서 정제한 다음 재평판하였고 MAbs에 결합시키기 위해 테스트하였다.
정제된 혈소판 클론 19R은 비-알레르기성 혈청으로 테스트한 결과 양성이 아니었다(제8도). 이것은 클론 19R이 라이그라스 민감성 환자의 혈청중의 특이성 IgE 에 결합하는 성능에 의해 클론 19R이 알레르겐이라는 것을 보여준다.
클론 19R를 EcoRI 로 처리하고 pGEM 플라스미드(위스콘신 주, 매디슨의 프로메가)에 연결시켰다. 제9도는 클론 19R으로부터 서브클론 EcoRI 삽입물의 부분 제한 지도를 Lol p Ib.1 및 Lol p Ia로 암호화한 유전자의 제한 지도에 비유한 것을 나타내었다. 상기 삽입물은 제9도에 나타낸 바와 같은 암호화한 Lol p Ia 및 Lol p Ib.1과는 다르다. EcoRI 삽입물의 크기는 약 1295bp 이다.
DNA 의 재클로닝 및 서열 분석 DNA를 미세, 이. 등의 문헌[(1990) Nucleic Acids Res., 제18권 : 1923]에 기재된 바와 같은 액체 용해질을 사용한 혈소판-정제된 상으로부터 제조하였다. EcoRI 처리로부터 회수된 삽입물을 pGEM4-Z(위스콘신주, 매디슨, 프로메가)에 연결하였고 pGEM 벡터(pGEM4-Z)로 각종-크기의 제한 단편들로서 재클로닝하였다. 모든 서열 분석은 이중 가닥의 플라스미드 주형을 사용하여 수행하였다. 상기 주형들은 미국, 캘리포니아, 캐스트워드의 퀴아겐 인코오포레이티드에서 설명한 바와 같이 제조하였다. 디데옥시 서열 분석(상거 등, (1977) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 74:5460-5463)은 실시예4 에서 기술한 바와 같이 수행하였다. 7-데아자 dITP를 GC 밴드 압착을 끊어 용해시키기 위해 사용하였다. 서열 분석은 Exo III 및 SI 누클레아제로 삽입물의 양 말단으로부터 포개진 것을 삭제함으로써 촉진된다. 내부 서열 분석의 프라이머는 필요에 따라 합성되었다.
서열 분석
서열 분석은 오스트레일리아, 멜보른 대학의 왈터 및 엘리자 홀, 루딩 및 호와드 플로레니 협회에서 개발된 분석 프로그램의 수집인 멜보른 데이타베이스를 시스템(MELBDBSYS) 및 PC 유전자(캘리포오니아, 마운틴뷰 소재의 인텔리제너틱스)를 사용하여 수행하였다. 상기 시스템은 하기 제공원으로부터 데이타볘이스를 통합하였다 : GenBank, EMBL. 및 BPRF 핵산 라이브러리 ; NBRF PRI 단백질, PSD-Kyoto(Ooi), GB 트랜스, Swiss-Prot, 및 Doolittle 단백질 라이브러리. 검시 기간 동안 EMBL 및 GenBank 데이타베이스는 각각 28.0 및 68.0 방출되었다.
클론 19R의 cDNA 서열은 제10a도 및 제10b 에 나타내었고 1295 누클레오티드를 포함한다. 클론 19R의 cDNA 서열은 누클레오티드 25-27 위치에의 ATG 개시 코돈에서 시작하여 누클레오티드 104 위치의 TGA 정지 코돈에서 종결하여 1017bp의 개방 해독틀이다. 클론 19R의 cDNA 는 전-길이 암호 영역을 포함하는 것을 제공하는 하기 특성들을 가진다:
i) 제안된 해독 개시 좌석 및 그것의 측면 서열(누클레오티드 21-29)는 89% 상동성을 단자엽 식물의 일치하는 서열과 공유한다. 가장 중요한 누클레오티드인 ATG 개시 코돈(제10a도에서 누클레오티드 21)에 관하여 -3 위치의 퓨린은 카베너, 디.알. 및 라이, 에스. 씨.의 문헌 [(1991) Nucleic Acids Research, 19:3185-3192] 에 보유되어 있다;
ii) cDNA는 완전한 3'-미해독된 영역 표준 AATTAA 폴리아데닐화 신호[비른 스테일 등, (1985) Cell. 41:349-359]에 이어서 폴리(A) 단부를 가진다; 및
iii) 상기의 3'-비해독된 영역 또한 mRNA 안정성과 관련이 있는 ATTTA를 포함한다.
클론 19R cDNA의 누클레오티드 서열은 G +C가 많다(63%). 개방 해독틀은 35.3kD의 Mr로 예측된 314 아미노산의 Lol p Ib.2로 규정된 단백질로 잠정적으로 암호화한다. 예측된 단백질은 9개의 아미노산 윈도우를 갖는 키테 및 돌리트레의 문헌[(1982) J. Mol. Biol., 157:105-132]의 방법을 기준으로 예측된 아미노산 서열의 소수성 양상을 나타낸 제11도에 나타낸 바와 같은 N-말단 서열의 수치료법 양상을 기초로한 25아미노산의 주 펩티드를 갖는 것을 보여준다. 이렇게 제안된 성숙한 단백질의 분자량은 32.8kD이다. N-글리코실화에 필요한 Asn-X-Ser/Thr 서열은 발견되지 않았으며 성숙한 단백질에 대한 예측된 PI 값은 5.9이다.
누클레오티드 및 아미노산 서열 연구의 데이타 베이스는 클론 19R만이 Lol p Ib.1 및 Poa p IX 알레르겐과 유사하다는 것을 보여준다. 클론 19R과 클론 12R의 누클레오티드 암호 영역간에는 제12a도 및 제12b도에 나타낸 바와 같이 72.3% 상동성을 가진다. 아미노산 비교는 제13도는 나타낸 바와 같이 클론 19R 및 Lol p Ib.1 의 예측 아미노산 서열간의 66.8% 유사성을 나타내었다. 알레르겐 둘다는 매우 유사한 25 아미노산 주펩티드를 가진다. 클론 19R의 아미노산서열과 Poa p IX의 3개의 이소알레르겐 간에는 64-69%의 유사성이 있다(실라노비치 등, (1991) J. Biol. Chem., 266:1204-1210).
화분 단백질 및 면역 블로팅의 분리
PBS 및 1mM의 페닐메틸설포닐 플루오리드에서 3시간동안 얼음상에서 격렬하게 교반함으로써 라이그라스 화분에서 용해성 단백질을 추출하였다. SDS-PAGE에 대한 조건은 온그 등의 문헌[(1990) Int. Arch. Allergy App1. Immuno1., 93 : 338-343]에 기재된 것과 같다. 전기 영동한 직후 분리된 단백질을 실버 착색시키거나(안고르지, 더블유.(1982), "Electrophoresis ′82 : Advanced Methods. Biochemical and Clinical Applications, 그리스, 아테네에서 1982년 4월21-24일 개최된 Proceedings of the International Conference on Electrophores", 편집자 : 디. 스타타코스, 왈터 드 그루이르, 베를린 및 뉴욕, 1983, 페이지 235-242) 니트로셀룰로오즈에 4℃로 이동시켰다(토우번 등., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 : 4350-4354).
IgE항체 결합을 위하여, 블롯을 혼주된 알레르기성 혈청 또는 0.5%의 소혈청 알부민(BSA)를 포함하는 PBS중의 친화성 정제된 IgE에서 배양하였다. 결합된 IgE는 온그, 이. 등의 문헌[(1990) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol, 93:338-343]의 방법에 따라125I-표지된 항-인간 IgE(미네소타, 카스카, 칼레스타드)를 사용하여 측정하였다. MAb 결합에 있어서, 결합된 IgG는 양고추냉이 페록시다제로 표지된 양 항-생쥐 Ig(오스트레일리아, 빅토리아, 호톤 소재의 실레누스)를 사용하여 측정하였다. 블롯은 강화된 케미루미네스센스 시스템(영국, 아메르삼 인터내쇼날)을 사용하여 발육하였다.
IgE 항체의 친화성 정제
람다 gt11 파지로 암호화한 알레르겐내의 cDNA 클론은 대장균내의 접합 단백질로써 나타낸다. 그다음 재결합 접합 단백질(rfp)을 포함하는 혈소판 리프트를 혼주된 혈청에서 배양시켰다. 결합된 IgE 항체를 0.2M 글리신 HCL, pH2.6/0.5% BSA/0.1% 소듐 아지드로 용출하였고 웨스턴 블롯을 조사하는데 사용하였다. IgE의 결합은125I-표지된 항-인간 IgE(미네소타, 챠스카의 칼레스타드)에 이어서 방사선 사진(온그 등, Int. Arch Allergy Appl. Immunol., 93:338-343)을 사용하여 가시 화하였다.
RNA 블롯 혼성화
RNA 겔 블롯 분석에 있어서, 총 RNA를 20mM 3-(N-모노폴리노)-프로판 설폰산, 50%의 탈이온화된 포름아미드, 및 2.2M 포름알데히드로 65℃에서 5분동안 처리하여 변성시켰고, 2.2M 포름알데히드를 포함하는 1.2%의 아가로즈 겔에서 전기 영동시켰고 니트로셀룰로오즈상에 전기 분배시켰다. RNA 슬롯-블롯 분석은 총 RNA를 20mM 3-(N-모노폴리노)-프로판설폰산, 5mM 소듐 아세테이트, 및 1mM EDTA로 65℃에서 10분동안 처리하여 변성시키고 미니폴드 11여과 다기관)(독일, 다셀 소재의 슈라이처 앤드 슈엘)에 적합한 20× SSC(SSC-3M 소듐 클로라이드, 1.0M 소튬 시트레이트)로 포화된 니트로셀룰로오즈상에 샘플을 적용함으로써 수행하였다. 필터 둘다를 2내지 6시간동안 42℃에서 50% 탈이온화된 포름아미드, 2×SSPE(SSPE-3M 소듐 클로라이드, 0.2M 소듐 포스페이트, 0.02M EDTA), 1% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 0.5% 블로토(염수로 완충된 포스페이트중의 10% 비-지방 우유), 10% 덱스트란 설페이트, 및 올리고라벨링 키트(오스트레일리아, 아델라이드 소재의 브레사테크)를 사용하여 랜덤 올리고누클레오티드 프라이밍에 의해 제조된 0.5mg/㎖32P-표지된 cDNA프로브를 포함하는 용액에서 사전 혼성화시켰다. 필터를 42℃에서 2시간동안 2×SSC 0.1% SDS로 네번 바꿔가며 세척한 다음, X-레이 필름에 노출시켰다.
클론 19R 유전자 표현형의 조직 특이성을 결정하기 위하여, 각종 L. 페레네 조직에서 준비된 RNA의 노오던 블롯 분석이 조사되었다. 노오던 블롯은 클론 19R 로부터 84bp Ssp I/ EcoRI 제한 분획으로 관찰되었다. 클론 12R이 아니라 클론 19R에 결합된 클론 19R의 누클레오티드 1207 내지 1291에 상응하는(제10b도) 이러한 cDNA 탐침은 화분중의 1780 염기의 단일 전사체에 혼성화된다. 라이그라스의 종자, 뿌리 및 잎에 임의의 전사체에 혼성화가 관찰되지 않았다. 탐침으로써 피숨 사티붐에서 취한 완전한 리보좀 DNA를 사용한 양성 조절 혼성화는 사용된 RNA의 양이 모든 샘플들의 검출에 충분하다는 것을 보여준다. 이것을 제14a도 및 제14b도에 나타내었다.
[실시예 10]
Lol p Ib 알레르겐의 특성 규명
물질 및 방법
그리어 래버러토리즈(르느와르, 노오쓰 캐롤라이나 소재)로부터 화분을 수득했다. 가용성 화분 단백질을 문헌 "그리피쓰 등(1991) FEBS Letters, 279 : 210-215"에 기술된 바와 같이 추출하였다. 미정제 화분 추출물을 수득하고 그 단백질 농도를 문헌 "옹 등(1990)Int. Arch, Allergy Appl. Immunol., 93:338-343" 에 기술된 바와 같이 측정하였다. MAb LpIX3A 및 LpIX4A가 실시예 8에 기술된 바와 같이 클른 12R의 IgE 결합부에 의해 암호화된 재조합 단백질에 대해 생성되었다. MAb 7E는 실시예 8에 기술된 바와 같이 Lol p Ia에 특이적이며 FMC-Al은 실시예 1에 기술된 바와 같다.
Lol p Ia 및 Lol p Ib의 알레르겐 영역을 규명하는 실험에 사용된 혈청은 라이그라스 화분에 대한 알레르기 병력이 있고 라이그라스 화분 추출물에 대해 양성 피부 시험을 나타내는 환자로부터 웹워드 하스피탈(오스트레일리아 리치몬드 소재)의 R. 폼리 박사가 수집하였다. 재조합 단백질은 pGEX 배양액이 아닌 람다-gtll 배양액으로부터 유도해내는 점만 제외하고는 전술한 바(싱그 등 (1991)Proc. Nat'l Acad, Sci, USA, 21:309 ; 실시예 2)와 같은 방법으로 IgE를 재조합 알레르겐으로부터 친화성-정제하였다.
IgE 결합 폴리펩티드를 암호하는 클론 12R 및 클론 19R의 단편들을 규명하는 실험에 사용된 혈청을 라이그라스 화분에 대한 RAST(파데자임 RAST, 파마시아 LKB, 스웨덴) 및 건초열 증상의 사전 임상 기록을 기준으로 선별한 50명의 환자로부터 수득하였다. 모든 혈청의 RAST 등급은 4이었다. 혈청은 또한 RAST에 의해 비-아토피성인 것으로 밝혀진 두명의 환자로부터 수득하고 음성 대조군으로 사용했다. 혈청을 소분취량으로 -20℃에서 보관했다.
2차원 겔 전기 영동 및 면역 블롯 분석
제조업체의 설명서에 따라 미니-프로티안 II 2-D 셀(바이오래드, 캘리포니아 리치몬드 소재)에 2차원적(2D)-PAGE를 수행하였다. 단백질을 4% CHAPS중에서 1:1 희석하였다. 겔당 13mg의 단백질 분취액을 적용하고 샘플을 1차원 샘플 도말 완충액과 함께 도말하였다. 1차원 겔을 3.5시간동안 전개시켰다. 2차원 겔은 45분간 전개시켰다. 2D-PAGE 겔상의 단백질을 실버 염 단백질 프로필이 나타나도록 했다.
전기 영동 및 웨스턴 블로팅 및 MAb 및 IgE를 사용한 웨스턴 블롯의 공정 조건은 문헌 "싱그 등(1985) Int. Arch Allergy Appl. Immun., 78:300" 에 기술된 바와 같다.
화분 추출물중 알레르겐 이소형의 동정
알레르기를 나타내는 개체의 혈청을 SDS-PAGE에 의해 분리한 화분 단백질의 웨스턴 블롯의 조사 결과는 IgE를 결합하는 28-35kD의 MW 범주의 4종의 상이한 분자량에서 단백질 밴드를 나타낸다. 2D-겔의 웨스턴 블롯의 유사 처리 결과 이들 4밴드는 제15도에 제시된 바와 같이 12개의 알레르겐 스포트로 분할되었다. 다수의 MAb 및 IgE 제제를 사용하여 이들 알레르겐간의 항원 관계를 연구하였다.
2차원적 웨스턴 분석은 제16도 및 표3에 제시되어 있다. Lol p Ib.1, Lol p Ib.2, rfp Lol p Ia, 전체 수거한 혈청 및 MAb FMC A7으로부터 친화성 정제한 IgE 항체를 사용하여 블롯을 조사했다. 전체 수거된 혈청은 32kD 성분의 두 산성 이소형(no.1,2), 5-11 범위의 pI 값을 갗는 30kD 성분의 5이소형(밴드 3-7) 및 28kD 분자의 염기성 밴드(no. 8)를 인식하는 IgE 항체를 가지고 있다(제16도, 패널 b).
Lol p Ib.1 및 Lol p Ib.2로부터의 친화성-정제된 IgE 항체는 이소형 no.5를 제외하고는 모든 28/30/32kD 분자의 이소형에 결합하였다(제16도, 패널 d 및 e). 대조적으로, MAb FMC-A7은 32kD 이소형(밴드 1 및 2), 두 산성 이소형(밴드 3 및 4) 및 30kD 성분의 염기성 밴드 no.7(제16도, 패널 c)를 인식하였다.
Lol p Ia, Lol p Ib.1 및 Lol p Ib.2의 상대적인 알레르겐성을 30개의 개별적인 알레르기성 혈청을 사용하여 시험하였다. 제17도는 27명의 환자(90%)가 Lol p Ia에 반응성인 IgE 항체를 가지며, 2중 6명(20% (제17도))이 Lol p Ia에 특이적인 IgE 항체(Lol p Ib 이소형중 어느 것에도 결합하지 않음)를 가진다는 사실을 나타낸다. 24명의 환자(80%)는 Lol p Ib.1 및 Lol p Ib.2 재조합이소형 양자 모두를 인식하는 IgE 항체를 가지고 있다. 3명의 환자(10%)는 Lolp Ib 이소형을 인식하는 IgE 항체(Lol p Ia 에 결합하지 않음)를 보유하였다.
[표 3]
[실시예 11]
롤리움 페레네 두상화로부터 RNA의 추출 및 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 Lol p Ib.1 및 Lol p Ib.2를 암호하는 유전자의 다형태성 분석
오스트레일리아의 롤리움 페레네 그래스로부터 신선한 두상초를 수집하고, 동결시키며 미국으로 선적했다. 500mg의 두상초를 드라이 아이스상에서 모르타르 및 막자에 의해 분쇄하고 0.1% DEPC로 밤새 처리한 0.1% SDS. 1 Mm EDTA, 0.2M NaCl을 포함하는 50mM 트리스 pH 9.0 5㎖ 중에 현탁시켰는데, 이것은 프랭키스 및 매스카레나스의 문헌(1980, Ann. 45 : 595-599)에 기술되어 있다. 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25 : 24 : 1로 혼합)로 1차 추출한 후, 재료를 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올중에서 60초동안 음파 처리하고 재-추출하였다. 3차 추출에서는 음파 처리를 30초간 반복 실시하였다. 음파 처리 없이 2회 최종 추출을 수행하였다. 0.1용적의 2M 나트륨 아세테이트 및 2 용적의 에탄올을 사용해서 수성상으로부터 RNA를 침전시켰다. 원심분리에 의해 펠릿을 회수하고 dH2O중에 재현탁시키고 65℃로 5분동안 가열하였다. RNA 제제에 2㎖의 4M 염화 리튬을 첨가하고 0℃에서 밤새 교반하였다. 원심 분리에 의해 RNA 펠릿을 회수하고 1㎖ H2O중에 재현탁시키며 1시간동안 드라이아이스상에서 3M 나트륨 아세테이트 및 에탄올을 사용하여 재차 침전시켰다. 최종 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 대기 건조시키며 100㎕의 DEPC-처리한 H2O 중에 재현탁시키고 -80℃에서 보관하였다.
제1가닥 cDNA와 이중 가닥 cDNA를 각각 시판용 킷트를 사용하여 7.5㎍ 두상화 RNA(cDNA 합성 시스템 +킷트, BRL, 매랄랜드 게이더스버그 소재)로부터 각각 합성하였다. 제2가닥 cDNA 반응 혼합물을 페놀 추출하고 에탄올 침전시키며 T4 DNA 폴리머라제(프로메가, 위스콘신 매디슨 소재)를 사용해서 블런트 말단으로 만들었다. 문헌 "라프너 등(1990) J. Biol. Chem. 266 ; 1229-1236 : 프로만 등 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998-9002 ; 및 룩스 등 (1990) BioTech. 8 : 48-57"의 방법에 따라 변형된 고정 PCR 반응에 사용하기 위한 목적으로, 에탄올 침전시킨 자가 접합된 올리고 누클레오티드 AT 및 AL에 상기 이중 가닥 cDNA를 연결시켰다. 올리고 누클레오티드 AT는 서열 5'-GGGTCTAGAGGTACCGTCCGATCGATCATT-3' (라프너 등, 상기 참조)을 가진다. 올리고 누클레오티드 AL은 서열 5'-AATGATCGATGCT-3' (라프너 등, 상기 참조)를 가진다.
클론 12R 및 클론 19R의 아미노 말단은 링커 연결된 cDNA(2㎕ 반응)으로부터 증폭시켰다. 시판용 킷트(GeneAmp DNA 증폭 키트, 퍼어킨 엘머 세터스, 코네티컷 노르윅 소재)를 사용하여 PCR을 수행하고 dNTP를 포함하는 10× 완충액 10㎕를 각각 올리고 누클레오티드 AP-2 및 LP5-8 프라이머(ED:EDT, 3 : 1M 비율) 100pmo1, cDNA(링커 연결된 cDNA 반응 혼합물 2㎕). Amplitaq DNA 폴리머라제 0.5㎕ 및 100㎕가 되도록 하는 양의 증류수와 혼합하였다. 샘플을 프로그램 짜여진 열 조절기(MJ 리서치 매사츄세츠 캠브릿지 소재)를 사용하여 증폭시켰다. 사용된 온도 순환 프로그램은 다음과 같다. 변성 주형 DNA, 94℃, 1분 : 올리고누클레오티드 접합, 65℃, 1분, 30초 ; 신장, 72℃, 2분 : 24 주기 반복 : 4℃ 유지.
LP5-8은 서열 5'-GCCTTGAAGCC(A/G)GCGTTGA-3'을 가지며. 이때 위치 12는 A 또는 G이다. LP5-8은 Lol p Ib.1의 누클레오티드 227 내지 244(제3b도 및 제3c도) 및 Lol p Ib.2의 뉴클레오티드 248 내지 265(제10a도 및 제10b도)에 상보적인 비-암호 가닥 서열에 상응한다. AP-2는 서열 5'-GGGTCTAGAGGTACCGTCC-3'를 가진다. 1차 반응을 본 명세서에 기술된 바와 같이 수행하였다. 2%(2㎕)의 상기 초기 증폭 반응을 각각 내부적으로 삽입된 Lol p Ib.1/Ib.2 올리고 누클레오티드 프라이머인 AP-2 및 LP5-9 각 100pmol로 2차 증폭시키는데 사용하였다. LP5-9는 서열 5'-TTGGATCCTCGGTCGTCGCCTTCCCT-3'을 가지며, 여기서 누클레오티드 5'-TTGGATCC-3'(염기 1-8)를 첨가하여 BamHI 제한 부위를 생성하였으며, 누클레오티드 9-26은 Lol p Ib.1의 뉴클레오티드 186-203(제3b도 및 제3c도) 및 Lol p Ib.2의 뉴클레오티드 207-224(제10a도 및 제10b도)에 상보적인 비-암호가닥 서열에 상응한다. 주된 증폭 생성물은 에티디움 브로마이드(EtBr)-염색한 3% GTG 아가로오즈 겔상에 약 100-250 염기쌍으로부터의 DNA 반점이었다.
클로로포름, 페놀, 및 클로로포름 추출액으로 연속해서 증폭된 DNA 를 회수한 다음, 드라이 아이스상에서 0.5부피의 7.5 M아세트산 암모늄 및 1.5부피의 이소프로판올로 침전시켰다. 70% 에탄올로 침전 및 세척한 다음, 상기 DNA를 50㎕ 반응액중의 Xba I 및 Bam HI로 동시에 처리하여 상기 부피를 20㎕로 감소시키고 제조용 2% GTG Nuseive 저용융 겔(FMC, 메인주 록포트 소재)을 통하여 전기 영동시켰다. 시판되는 서열 분석 장치(Sequenase kit, Tequence kit, 미국, 오하이오, 클리브랜드, Biochemicals에서 시판)를 사용하여 디데옥시 연쇄 종결 방법(생거 등 (1977) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5476)으로 서열 분석하기 위해서 상기 DNA를 EtBr 착색제로 가시화하고, 적절한 크기로 절단하여, 적절히 처리된 pUC19로 연결하였다.
모든 클론은 PCR 단독 반응으로부터 유도되며 아미노산 차이는 단지 잠재적 다형태성을 나타낸다. 이들 아미노산차이는 Taq 폴리머라제(사이키 등(1988) Science 239:487-491)내에서의 고유의 착오율로 인해 독립 PCR 내에서 확인할 필요가 있다.
11개의 클론은 클론 12R과의 결합 서열 동족체를 포함하는 것으로 발견되었다. 2개의 클론은 클론 19R과 동족체인 것으로 발견되었다. Lol p Ib.1에서 아미노산차이를 산출하는 클론 12R에서의 잠재적 누클레오티드 다형태성을 표6 에 나타낸다.
[표 6]
Lol p Ib.2에서 아미노산차이를 산출하는 클론 19R에서의 잠재적 다형태성은 아미노산이 위치 30에서 T→S로 변화된 하나의 클론에서 발견되었다.
상기 기술한 온도 순환 프로그램을 사용하는 PCR 반응에서 올리고누클레오티드 LP5-5 및 LP5-6을 사용하여 제1가닥 cDNA로부터 클른 12R의 내부 단편을 암호화하는 cDNA를 클로닝시켰다. LP5-5는 LP5-5의 염기 1내지 8(5'-GGGAATTC-3')을 첨가하므로써 클로닝할 목적의 EcoRI 제한 부위를 생성시키며 염기 9내지 26은 클론 12R의 누클레오티드 199내지 216 및 클론 19R의 뉴클레오티드 220내지 237에 해당하는 5'-GGGAATTCACCGACGAGCAGAAGCTG-3'의 서열을 가진다. LP5-6은 염기 1내지 7(5'-GGGGATC-3')(LP5-6의 염기 1내지 7)을 첨가하므로써 클로닝할 목적의 Bam HI 제한 부위를 생성시키며 염기 8내지 26은 클론 12R의 뉴클레오티드 808 내지 826과 상보적인 5'-GGGGATCCCTGGGTCATGGCGGTGAT-3'의 서열을 가진다. 우세한 증폭 생성물은 약 620의 염기 쌍을 갖는 DNA 밴드였다. 상기 증폭 DNA 생성물을 상기와 같이 정제 및 침전시킨 다음, EcoRI 및 BamHI 로 처리하고 제조용 2% 저용융 겔을 통하여 전기 영동시켰다. 상기 우세 DNA 밴드를 서열 분석하기 위하여 절단하여 적절히 처리된 pUC19로 연결하였다. 클론 12R 내부 서열을 포함하는 여러가지의 클론을 수득하였다.
모든 클론은 PCR 단독 반응으로부터 유도되며 아미노산 차이는 단지 잠재적 다형태성을 나타낸다. 이들 아미노산차이는 Taq 폴리머라제(사이키 등(1988) Science 239:487-491)내에서의 고유의 착오율로 인해 독립 PCR내에서 확인할 필요가 있다.
Lol p Ib.1 내부 서열의 잠재적 다형태성을 표 7에 나타낸다.
[표 7]
당업계의 통상의 지식을 가진 사람들은 본원에 기술한 발명이 오히려 구체적으로 기술한 변화 및 수정에 영향을 받기 쉽다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 본 명세서에서 언급한 또는 나타낸 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물을 독립적으로 또는 전체적으로 포함하며, 둘 이상의 임의의 상기 단계 또는 특징의 임의 및 전체 결합체를 포함하는 것으로 이해하여야 한다.
Claims (21)
- 라이그라스(ryegrass) Lol pIb.2 단백질 알레르겐에 특이적인 T세포를 자극시킬 수 있는 단백질 알레르겐 , 또는 그것의 항원성 단편, 또는 그것의 유도체 또는 동족체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산, 또는 상기 핵산 서열의 기능적 동등체로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 하기 중 하나를 포함하는 분리된 핵산, 또는 상기 핵산 서열의 기능적 동등체 : (a) : 제10a도 및 제10b도에 나타낸 라이그라스 Lol pIb.2 단백질 알레르겐의 아미노산 -25에서 314까지를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, (b) 제10a도 및 제10b도에 나타낸 라이그라스 Lol pIb.2 단백질 알레르겐의 암호 부분(coding portion)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 (c) 제10a도 및 제10b도에 나타낸 라이그라스 Lol pIb.2 단백질 알레르겐의 아미노산 1-314를 암호화하는 뉴클레오티드 서열.
- 제1항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
- 제1항의 핵산에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드를 발현시키도록 형질전환시킨 비(非)-인간 숙주 세포.
- 분리된 라이그라스 Lol pIb.2 단백질 알레르겐, 또는 이들의 항원성 단편 또는 이들의 유도체나 동족체를 제조하는 방법으로서, 제1항의 핵산으로 형질전환시간 비-인간 숙주 세포를 적합한 배지내에서 배양하여 상기 라이그라스 Lol pIb.2 단백질 알레르겐 또는 이들의 항원성 단편, 또는 이들의 유도체나 동족체를 함유하는 배지와 세포들의 혼합물을 생성하고; 선택적으로 상기 혼합물을 정제하여 분리된 라이그라스 Lol pIb.2 단백질 알레르겐 또는 이들의 항원성 단편, 또는 이들의 유도체나 동촉체를 생성하는 것을 포함하는 방법.
- (정정) 제1항의 핵산으로 형질전환시킨 비-인간 숙주 세포내에서 생성된 분리된 라이그라스 Lol pIb.2 단백질 알레르겐 또는 이들의 단편, 선택적으로 항원성 단편, 또는 이들의 유도체나 동족체를 포함하는 제제.
- 화학 합성된 제10a도 및 제10b도에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 라이그라스 Lol pIb.2 단백질 알레르겐, 또는 이들의 단편, 선택적으로 항원성 단편, 또는 이들의 유사체나 동족쳬를 포함하는 제제.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 제3b도 및 제3c도에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 라이그라스 Lol pIb.1 단백질 알레르겐, 또는 이들의 단편, 선택적으로 항원성 단편. 또는 이들의 유사체나 동족체를 추가로 포함하는 제제.
- 제10a도 및 제10b도에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, Lol pIb.2 단백질 알레르겐의 분리된 항원성 단편.
- 제8항에 있어서, 상기 항원성 단편은 Lol pIb.2 단백질 알레르겐의 T세포 에피토프를 포함하고, 선택적으로 상기 항원성 단편은 라이그라스 화분 알레르겐에 특이적인 면역글로불린 E에 결합하지 않거나, 또는 최소의 면역글로불린 E자극 활성을 추가로 가지며, 또는 상기 단편과 상기 면역글로불린 E의 결합이 일어나는 경우, 이 결합이 비만 세포 또는 호염기구로부터 히스타민 방출을 야기하지 않는 항원성 단편.
- 제8항에 있어서, 정제된 천연 라이그라스 화분 알레르겐이 상기 면역글로불린 E에 결합하는 것보다 실질적으로 더 낮은 정도로 상기 항원성 단편이 면역글로불린 E에 결합하는 항원성 단편.
- 제8항에 있어서, 상기 항원성 단편이 그것을 투여받을 라이그라스 화분-민감성 개체에서 라이그라스 화분에 대한 알레르기 반응을 변화시킬 수 있는 항원성 단편.
- 제11항에 있어서, 상기 항원성 단편이 라이그라스 화분 알레르겐에 대한 개체의 B-세포 반응, 라이그라스 화분 항원에 대한 개체의 T-세포 반응, 또는 라이그라스 화분 알레르겐에 대한 B세포 반응 및 T세포 반응 둘다를 변화시킬 수 있는 항원성 단편.
- 제8항, 제9항, 제10항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성이 변화되거나 또는 알레르기성이 감소되도록 아미노산 삽입, 결실, 또는 첨가에 의해 변화시킨 항원성 단편.
- 제8항, 제9항, 제10항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 Lol pIb.2 라이그라스 화분 알레르겐의 분리된 항원성 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산.
- 제10a도 및 제10b도에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 라이그라스 Lol pIb.2 단백질 알레르겐 또는 이들의 항원성 단편, 또는 이들의 유도체나 동족체에 특이적인 T세포를 자극시킬 수 있는 분리된 단백질 알레르겐.
- 제15항에 있어서, 제10a도 및 제10b도에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질 알레르겐.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 면역원성이 변화되거나 또는 알레르기성이 감소되도록 아미노산 삽입, 결실, 또는 첨가에 의해 변화시킨 단백질 알레르겐.
- 분리된 라이그라스 화분 알레르겐 Lol pIb.2, 또는 Lol pIb.2의 단편 또는 유도체나 동족체, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하며, 선택적으로 상기 Lol pIb.2는 제10a도 및 제10b도에 나타낸 아미노산 1-314의 서열을 갖는 약학 조성물.
- 라이그라스 화분 알레르겐 또는 그것과 면역학적으로 교차 반응성이 있는 알레르겐에 대한 인간을 제외한 포유류의 민감증을 치료하기 위한 약제의 제조에, 제5항 또는 제6항의 제제, 제8항, 제9항, 제10항, 제11항, 제12항 및 제13항 중 어는 한 항의 항원성 단편, 제18항의 변화시킨 단백질 알레르겐을 사용하는 방법.
- 하기 단계를 포함하는, 인간을 제외한 포유류에서 라이그라스 화분 알레르겐에 대한 민감증을 검출하는 방법 : (i) 제1항의 핵산 또는 그것의 단편, 또는 그것의 유도체나 동족체, 또는 (ii) 제10a도 및 제10b도에 나타낸 Lol pIb.2 단백질 알레르겐의 아미노산 1 내지 314를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 또는 이것의 단편, 또는 이들의 유도체나 동족체로 형질전환시킨 비-인간 숙주 세포에서 생성되거나 또는 화학합성에 의해 생성된, 제10a도 및 제10b도에 나타낸 아미노산 서열을 포함한 분리된 라이그라스 화분 단백질 알레르겐, 또는 그것의 항원성 단편, 또는 그것의 유도체나 동족체와, 상기 인간을 제외한 포유류에서 수득된 혈액 샘플을 단백질 알레르겐 또는 그것의 단편, 또는 이들의 유도체나 동족체와 혈액 성분의 결합에 적합한 조건하에서 배합하는 단계 ; 그리고, 상기 결합이 일어나는 정도를 측정하는 단계 ; 선택적으로, T세포 기능, T세포 증식, B세포 기능, 혈액내에 존재하는 항체와 상기 단백질 알레르겐 또는 그것의 단편, 또는 이들의 유도체나 동족체의 결합 또는 이들의 조합을 평가하므로써 결합이 일어나는 정도를 측정하는 단계.
- 제5항의 Lol pIb.2에 대해 형성시킨 Lol pIb.2에 특이적인 단일 클론항체.
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