JPH06509941A - ほそ麦花粉アレルゲン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 はそ麦花粉アレルゲン 発明の分野 本発明はほそ麦（ｒｙｅｇｒａｓｓ）　（ｏリウム　ペレンネ（Ｌｏｌｉｕｍ　 ｐｅｒｅｎｎｅＬ、）〕の花粉に由来するアレルギー性タンパク質、並びにその フラグメント、誘導体及び同族体、更にはそれに免疫学的に関連しているアレル ギー性タンパク質に関する。より詳しくは、本発明はほそ麦の花粉に由来する主 要アレルギー性タンパク質料Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ及びこのＬｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパ ク質料の近縁タンパク質に関連する。

関連出願との関連性 本出願は１９９１年８月１６日提出の米国出願第７４６．７０２号の一部係属出 願であり、換言すれば１９９０年３月２４日提出の米国出願第５８５．０８６の 一部係属出願であり、その両者の開示内容は本明細書に組込まれる。

発明の背景 人口の約ｌθ％を構成する遺伝的に罹患し易い個体は、彼らか暴露される様々な 環境的起源に由来する抗原に対して過剰感作（アレルギー）となる。即時型及び ／又は遅延型の過敏症を誘発せしめうろこのような抗原はアレルゲンとして知ら れている（Ｋｉｎｇ、　Ｔ、　Ｐ、　、　Ａｄｖ。

Ｉｍｍｕｎｏ１．２３　７７−１０５（＋９７６））。枯草熱、ぜん息及びじん ま疹の症状を含むアナフィラキシ−又はアトピーは即時型アレルギーの一形態で ある。これは様々なアトピー性アレルゲン、例えば草、木、雑草、動物鱗屑、昆 虫、食物、薬剤及び化学品の産物により生じつる。

アトピー性アレルギーに関与する抗体はイムノグロブリンのＩｇＥクラスに主に 属する。ＩｇＥはマスト細胞及び好塩基性細胞に結合する。特定のアレルゲンと 、マスト細胞又は好塩基性細胞に結合したＩｇＥとの組合せにより、　ＩｇＢは その細胞表層上に架橋して、　ＩｇＥ−抗原相互作用の生理学的作用をもたらし てしまう。これらの生理学的作用にはいろいろな物質の中でとりわけヒスタミン 、セロトニン、ヘパリン、好酸性白血球及び／又はリューコトリエンにとっての 化学走性因子、Ｃ４、Ｄ４並びにＥ４の放出を含み、これらは気管支性平滑筋細 胞の長期にわたる収縮を引き起こす（Ｈｏｏｄ、　Ｌ、　Ｅ、ら、Ｉｍｍｕ−ｎ ｏｌｏｇｙ、第２版、Ｔｈｅ　Ｂｅｎｊａｍｉｎ／ＣＣｕｍｍ１ｎ　Ｐｕｂｌｉ ｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｉｎｃ、。

（１９８４））。このように放出された物質は仲介剤であり、これらはＩｇＥと 特定のアレルゲンとの組合せにより引き起こされるアレルギー症状をもたらして しまう。これらを通じてアレルゲンの作用は表われる。かかる作用は身体に侵入 する抗原のルート及びマスト細胞又は好塩基性細胞上のＩｇＨの付着パターに依 存してその性質が全身性又は局所性でありうる。局所的な発現は一般にアレルゲ ンの身体に侵入した箇所での上皮細胞表層で生ずる。全身性作用にはアナフィラ キシ−（アナフィラキシ−ショック）が含まれることがあり、これは循環してい る（脈管内）抗原に対するＩｇＢ−好塩基性細胞応答の結果である。

アレルゲンは草の花粉の最も豊富なタンパク質を構成し、これは第３巻、頁２７ １−３５９　、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、　Ｌｏｎｄｏｎ、Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ　；Ｈｉｌｌら（１９７９）　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ 　ｏｆ　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ　１　、　４２６−４２９）。はそ麦におけるアレ ルギータンパク質の最初の解説は、それらが免疫化学的に異なるものであること を示しており、そしてグループＩ。

Ｉｌ、　Ｉ［及び■として知られている（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｍａｒｃｈ （１９６５）、Ｎ０１ｕｒ６゜９１−１００）。免疫学協会の国際統合（Ｉｎｔ ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｕｎｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏ−１ｏｇｉｃａｌ　５ ｏｃｉｅｔｉｅｓ’（ＩＵＩＳ）命名法を利用して、これらのアレルゲンはＬｏ ｌ　ｐｒｂ　、　Ｌｏｌ　ｐ　ＴＬ、　Ｌｏｌ　ｐＭ及びＬｏｌ　ｐ　ＩＶと呼 ばれている。

しかしながら、はそ麦花粉のアレルギー性スペクトルはもっと複雑であることが 知られている。はそ麦に関する国際対照標本（ｉｎｔｅｒｎａ−ｔｉｏｎａｌ　 ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）は１２〜８９ｋＤの分子量に範 囲する１７種のアレルゲンを含んでいる（Ｓｔｅｗａｒｔら（１９８９）、Ｉｎ ｔ、　Ａｒｃｈ、　ＡｌｌｅｒｇｙＡｐｐｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　８６　＋　 ９−１８）　ｏ花粉中のこれらのアレルギー性タンパク質はそれらのＩｇＥに対 する結合能力、即ちアレルギー性個体に存在しているイムノグロブリン特異性に より検定される。

これらのアレルゲンのうちで、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉ、Ｉ［、ｍ及び■ががなり研究さ れている。Ｌｏｌ　ｐ　ＩＩ及び■の全アミノ酸配列が報告されている。このこ とは、花粉中のアレルギー性タンパク質の量の多さ及びそのタンパク質の比較的 小さい分子量に基づいて、標準の生化学的技術を利用して可能となった。Ｌｏｌ 　ｐ　Ｉ及び■のタンパク質は花粉の中で豊富にあるにもかかわらず、同じ技術 を利用して一部のアミノ酸配列しか報告されていない。それはこれらのタンパク 質の比較的大きい分子量に原因する。更に、アレルゲンを夾雑なして精製するこ とは難しく、そして労力がかかる。−次配列がないこと及び十分な量における高 純化アレルゲンがないことは、■型アレルギーの処置及び診断にとっての治療的 及び診断的製品の両者の開発における律速要因である。

Ｌｏｌ　ｐ　Ｉはアレルゲンと定義されており、その理由はほそ麦感受性患者の 血清中の特定のＩｇＨに対する結合能力、　ＩｇＧ応答において抗原として作用 する能力及びＴ細胞応答を誘発する能力にある。アレルギー的な性質はほそ麦花 粉−感受性患者の直接的な皮膚検査に１１９０−１２０１）　、主要アレルゲン としてのこのタンパク質の主たる重要性が示唆されている。更に、はそ麦花粉− 感受性であると示された患者の９５９６がイムノブロッティングにより実証され る通りＬｏｌＰＩに結合する特定のＩｇＢ抗体を保存していた（Ｆｏｒｄ　ａｎ ｄ　Ｂｏｌｄ。

（１９８６］ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒ ｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８１：　１９３−２０３ ）。

はそ麦花粉類間の実質的なアレルギー交差反応がＩｇＢ−結合アッセイ、即ち、 例えばＭａｒｓｈら（１９７０）Ｊ、　Ａｌｌｅｒｇｙ、　４６．１０７−１２ １及びＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎ（１９７８）Ｐｒｏｇ、　ＡＩｌｅｒｇｙ、　２５ ．１−６２（Ｋａｒｇｅｒ、Ｂａ５ｅｌ）に記載されているようなラジオアレル ゴー収着試験（ＲＡＳＴ）を利用して実証されている。

Ｌｏｌ　ｐ　Ｉとその他の草花粉との免疫化学的関係はポリクローナル及びモノ クローナル抗体の両者を利用して実証されている（例えばＳｍａｒｔ　とＫｎｏ ｘ（１９７９）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｌ ｅｒｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ抗体が精製タンパク質及びＩｇＢ−結合性成 分の両者に対して作られている。これらのデーターは、近縁の草類の花粉間に存 在している主要アレルゲンがＬｏｌ　ｐ　Ｉに免疫化学的に類似することを示し ている（Ｓｉｎｇｈ　ａｎｄ　Ｋｎｏｘ、前掲）。

発明の概要 本発明に従い、はそ麦花粉アレルゲンＬｏｌ　ｐ　Ｉが、本明細書でＬｏｌ　ｐ 　Ｉａ及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂと呼んでいる２種類のタンパク質を含んで成ること を発見した。このｌ、ｏｆ　ｐ　Ｉｂはそ麦花粉アレルゲンはし、ベレンネの中 にタンパク質の科として存在している。Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、１及びＬｏｌｐＩｂ 、２と呼んでいるＬｏｔ　ｐ　Ｉｂの２種類の科料成員（ｆａｍ−目ｙ　ｍｅｍ ｂｅｒ）をコードする遺伝子がこの度同定された。科料成員Ｌｏｌ　ｐ　［ｂ、 Ｉは従来がＬｏｌ　ｐ　Ｉｂと呼ばれているものであり、そしてこの度Ｌｏｌ　 ｐ　Ｉｂ、ｌ　と呼ぶようになった。従って、本明細書で用いているｌ、ｏｆ　 ｐ　Ｉｂは、実際には類似の構造及び機能を有すが、しかし別々の遺伝子により コードされる近縁のタンパク質の科である主要はそ麦花粉タンパク質アレルゲン を意味する。従って、Ｌｏｔ　ｐ　Ｉｂ及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ科構成員なる開は 同義語として用いている。

本発明は少なくとも１種のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂはそ麦花粉アレルゲン、あるいはそ の少なくとも１種の抗原性フラグメント、又は誘導体もしくは同族体をコードす る精製核酸配列、又は前記核酸配列の機能的同等物を提供する。本発明はまた少 なくとも１種のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂはそ麦花粉アレルゲン、あるいはその少なくと も１種の抗原性フラグメント、又は誘発体もしくは同族体をコードする精製核酸 配列、又は前記核酸配列の機能的同等物を含んで成る発現ベクターを提供する。

本発明は更に、本発明の核酸配列によりコードされるタンパク質又はペプチドを 発現するように形質転換された宿主細胞を提供する。

本発明の別の観点は、少なくとも１種の精製されたＬｏｌ　ｐ　ｌｂはそ麦花粉 アレルゲン、あるいはその少なくとも１種の抗原性フラグメント、又は誘導性も しくは同族体を提供する。本発明の更なる観点は、はそ麦花粉に由来するアレル ゲン、好ましくはＬｏｌ　ｐ　Ｉｂはそ麦花粉アレルゲンの単離された抗原性フ ラグメントを提供する。

より好ましくは、このほそ麦花粉アレルゲンはＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、Ｉ又はＬｏｌ 　ｐ　ｌｂ、２である。

本発明の更なる別の観点は、改良はそ麦花粉タンパク質アレルゲンてあって、は そ麦花粉−惑受性個体に投与したときに、はそ麦花粉に対する個体のアレルギー 性応答を低下させるものを提供する。

好ましくは、このほそ麦花粉アレルゲンは改良Ｌｏｌ　ｐ　［ｂタンパク質又は その誘導体もしくは同族体である。より好ましくは、このほそ麦花粉アレルゲン は改良Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、Ｉ又はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２タンパク質、又はそれら の誘導体もしくは同族体である。本発明はまた、はそ麦花粉−感受性個体に投与 したときにほそ麦花粉に対する個体のアレルギー性応答を低下させるほそ麦花粉 タンパク質の少なくとも１種の改良フラグメントを提供する。このほそ麦花粉ア レルゲンは好ましくはＬｏｌ　ｐ　Ｉｂはそ麦花粉アレルゲン、より好ましくは Ｌｏｌｐｌｂ、Ｉ又はＬｏｌ　ｐ　ｌｂ、２である。Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、１又は Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２、あるいはＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、１又はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、 ２のフラグメントもしくは誘導体もしくは同族体に免疫学的に関連している単離 されたタンパク質アレルゲン又は抗原性フラグメントも本発明により提供される 。

本発明の更に別の観点において、非天然（即ち組換え又は化学合成された）Ｌｏ ｌｌｌｌｂ科構成員又は科料成員誘導体もしくは同族体あるいは、ｌ又は複数種 のＬｏｌ　ｐ　ｒｂ科構成員又はその誘導体もしくは同族体に対する抗体に免疫 学的に交差反応性な非天然アレルギー性タンパク質が提供される。本発明はまた 、精製天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質、又は少なくとも一種のそのフラグメン トもしくは誘導体もしくは同族体を提供する。

非天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質、及びそれに由来するフラグメント又は領域 （ペプチド）はほそ麦花粉に対するアレルギー反応を診断、処置及び予防する方 法に利用できる。精製天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質、そのフラグメント、及 びその同族体又は誘導体もほそ麦花粉に対するアレルギー反応を診断、処置及び 予防する方法に利用できる。

本発明の更なる別の観点は、非天然Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂ又はその誘導体もしくは同 族体に対する抗体、並びに精製天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ又はその誘導体もしくは同 族体に対して発生させた抗体に関する。

本発明の更なる特徴は添付した図面に関連する本発明の好適な態様の下記の詳細 な説明によってより良く理解されるであろう。

図面の簡単な説明 図１はイネ科グループＩｂアレルゲンに特異的なｃＤＮＡクローンのル離を示す 。図１ａは３種のＭＡｂ　、　ＦＭＣＡｌ（４０，１）、ＦＭＣＡ７（１２，３ ）、３．２（Ｋａｈｎ　＆　Ｍａｒｓｈ（＋９８６）Ｍｏｌｅｃ、Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、２３　：　１２８１−１２８８　：　Ｓｉｎｇｈ　＆Ｋｎｏｘ（１９８５） Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎ ｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　１ｍｍｕ−患者血清由来のＩｇＨによる陽性クローン（＋ ２Ｒ）の認識を示している。図１ｂはほそ麦花粉に由来のグループ■抗体へのＭ ａｂ及びＩｇＥの結合性のイムノプロット分析を示す。レーンｌは全タンパク質 プロフィール（クマジーブルー染色）を示し；レーン２　：　ＭＡｂ　２１．３ 　：レーン３・ＭＡｂ　４０．　Ｉ　；レーン４　：　ＭＡｂ　３．２　、レー ン５　１２．３−；レーン６：ＩｇＥ抗体。

図２はグループＩｂアレルゲン転写体の組換型及び細胞型特異性発現を示す。図 ２８はＲＮＡプロットハイブリダイゼーションを示す。

ポリ（Ａ）　＋　ＲＮＡは種々の植物組織、即ち、種子、葉、根及び花粉から単 離した。図２ｂはグループｌｂ抗原の組織型及び細胞型特異性分布のイムノプロ ット分析を示す。可溶性タンパク質は種々の植物組織、即ち、花、葉、根及び花 粉から抽出し、そしてＭＡＩ）　４０．　＋　（パネル１）、１２．３（パネル ２）及び＋ｇＥ抗体（パネル３）を用いてイ図３はＬｏｌ　ｐ　ｌｂ、Ｉ　と命 名したほそ麦花粉クローン１２ＲのｃＤＮＡ配列、推定アミノ酸配列及び疎水性 プロフィールを示す。図３ａはラムダ−１２ＲｃＤＮＡの図式制限地図を示す。

ハツチボックスは推定の翻訳オーブン解読枠を示す。図３ｂ及び３ｃは１２２９ ヌクレオチドのＥｃｏＲＩ　ｃＤＮＡインサートラムダ−＋２Ｒのヌクレオチド 及び推定アミノ酸配列を示す。−文字コードにより示している推定アミノ酸配列 をこのＤＮＡ配列の下に示し、そしてヌクレオチド４０での第１替在クレーム内 開始コドンにて始まる。第１未介在オーブン解読枠は３０１個のアミノ酸にわた ってつながり（ＤＮＡ配列の下に番号を付した）、そして星印で示すＴＧＡ停止 コドンて終っている。推定シグナルペプチドは負の番号で示している。アミノ酸 残基１〜９．１２〜１７及び１９はＮ−末端シーケンシングにより同定されてい る。図３ｄはＨｏｐｐ　ａｎｄＷｏｏｄｓ（１９８１）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７８　：　３８２４−３８２８の方法に基づく推 定アミノ酸配列の疎水性プロフィールを示し、７個のアミノ酸を枠に入れである 。

図４はＬｏｔ　ｐ　Ｉｂ、Ｉ（クローン＋２Ｒ）におけるＩｇＥ及びＭＡｂ反応 性エピトープの、イムノブロッティングを利用する描写である；図４ａ：１ｇＥ 抗体１図４　ｂ、　ＭＡｂ　４０．１、そして図４　ｃ、　ＭＡｂ　１２．３゜ 図４ａ−ｃのコントロールは非組換プラスミドで形質転換させた細菌により供さ れている。

図５は特異的ＭＡｂ及びイムノゴールドプローブを利用するほそ麦の成熟花粉に おける１、ｏｌ　ｐ　Ｉａ及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂの検出を示す。図５８は胚胎孔 を示す、走査電子顕微鏡により見た完全孔粉粒を示している。図５ｂはイムノ− ゴールド局在−二重ラベリングによるＬｏｔ　ｐ　Ｉａ及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂの 細胞部位の検出を示す。図５０は水に３０ｓ暴露した際の新鮮な生育花粉の出現 を示す（ダークフィールドイルミネーション）。

図６は２０種の草類由来の非変性花粉タンパク質への抗体結合性を示す。レーン Ａ−Ｅは記載の草類種における花粉タンパク質に対する様々な抗体の結合性を示 す。レーンＡ）　ＩｇＥ、レーンＢ　）ＦＭＣ−ＡＩ抗体、レ−：／　Ｃ）ＦＭ Ｃ−Ａ？抗体、レ−：／Ｄ）　ＬｐｌＸ−３Ａ抗体、及ヒレーンＥ）　ＬｐｌＸ −３Ａ抗体。

図７は勾配ＳＤＳ　−ＰＡＧＥにより分け、そしてクマジーブリリアントブルー 染色（図７ａ）により、並びに血清１ｇＢ　（図７ｂ）、モノクローナル抗体Ｆ ＭＣ−ＡＩ　（図７０）、モノクローナル抗体ＦＭＣ−Ａ７（図７ｄ）、抗体Ｌ ｐｌＸ−３Ａ　（図７Ｅ）及び抗体ＬｐｌＸ−４Ａ　（図７Ｆ）の結合性により 識別化させた２０種の草類の可溶性花粉タンパク質を示す。個々のレーンは図６ に示す草類に対応している。

図８は（ａ）アレルギー患者及び（ｂ）非アレルギー患者に由来のプール血液を 利用した、ベクターラムダｇｔｌｌにおけるクローン＋９Ｒのイムノスクリーニ ングの写真である。

図９はＬｏｌ　ｐ　ｌｂ、２（クローン＋９Ｒ）、　Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、＋（ク ローン＋２Ｒ）及び１、ｏｆ　ｐ　Ｉａの部分的制限エンドヌクレアーゼ地図を 示す図である。

図１０ａ及びｌＯｂはＬｏｌ　１１　ｌｂ、２（クローン１９Ｒ）のｃＤＮＡ配 列及び推定アミノ酸配列を示す。

図ＩＩはＫｙｔｅ　ａｎｄ　Ｄｏｏｌ　ｉ　ｔｔ　ｌｅ（＋９８２）Ｊ、　Ｍｄ 、　Ｂｉｏｌ、　、　１５７：１０５−１３２の方法に基づく、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉ ｂ、２についての推定アミノ酸配列の疎水性プロフィールのグラフ図であり、９ 個のアミノ酸の枠がある。

図１２ａ及び＋２ｂはＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２（クローン１９Ｒ）とＬｏｌ　１１ １ｂ、１（クローン１２Ｒ）とのｃＤＮＡ配列の比較を示す図である。バーはＤ ＮＡ配列の同一性を示すために用いている。最大類似性を示すために翻訳領域内 にギャップを挿入した。クローン＋９Ｒの中に挿入したギャップ数は１４である 。クローン＋２Ｈの中に挿入したギャップ数は３５である。

全体の配列同一性は８８７塩基であった（７２．２％）。

図１３はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２（クローン＋９Ｒ）とＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、Ｉ（ク ローン１２Ｒ）とのアミノ酸配列を比較した図である。最大類似性を示すために 翻訳領域内にギャップを挿入した。アミノ酸配列間の同一性を示すためにバーを 用い、そしてｒＳＪはアミノ酸配列間の類似性を示す。

「類似」であるといわれているアミノ酸はＡ、ＳとＴ；ＤとＥ、ＮとＱ、ＲとＫ 　；　Ｉ、Ｌ、　Ｍ、！：Ｖ　；及びＦ、Ｙとｗである。クローン１９Ｒの中に 挿入したギャップ数はｌである。クローン１２Ｒに挿入したギャップ数は４であ る。この２配列は２０１個の同一アミノ酸（６６、８％）及び３５個の「類似Ｊ アミノ酸（１２，６％）を含んでいた。

図１４はクローン＋９Ｒの組織特異性発現を示す。図１４（ａ）はほそ麦花粉、 葉、根及び種子由来のクローン１９Ｒに特異的な８２塩基のフラグメントてプロ ーブした全ＲＮＡのノーザンプロット分析である。

図１４（ｂ）はエントウ（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）由来のリポソームＤＮ Ａでプローブした、はそ麦花粉、葉、根及び種子由来の全ＲＮＡのノーザンドッ トプロット分析である。全ての組織に関して、図１４（ａ）及び（ｂ）に２０μ ｇの全ＲＮＡを添加した。

図１５は二次元ウェスタンプロット分析における、アレルギー個体の血清により プローブされた花粉タンパク質を示す。グループＩａは成分１〜４ニゲループＩ ｂは成分５〜Ｉ２；グループ■は成分１３〜１５ニゲループ■は成分１６〜１７ ；そしてグループ■は？である。

図１６はほそ麦花粉タンパク質の二次元ウェスタンプロット分析を示す。全ての ケースにおいて、はそ麦花粉タンパク質を等電点電気泳動（左から右へ）に付し 、次いて５Ｏ３−ＰＡＧＥ　（上から下へ）に付した。（ａ）全タンパク質を銀 染色した二次元ゲル電気泳動分離。

二次元ウェスタンプロットを（ｂ）はそ麦花粉アレルギー患者のプール血清由来 の全１ｇＢ抗体、（ｃ　）　ＭＡｂ　ＦＭＣ−Ａ７、（ｄ）　Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂ 、１からアフィニティー精製したＩｇＥ抗体、及び（ｅ）　Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、 ２からアフィニティー精製したＩｇＥ抗体でプローブした。

図１７はＥ、コリＹ１０９０上てのラムダｇｔｌｌ　Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、Ｉ（ク ローン１２Ｒ）、Ｌｏｌ　ｐ　ｌａ（クローン１３Ｒ）及びＬｏｌ　ｐ　ｌｂ、 ２（クローン１９Ｒ）のドツトプロットスクリーニングを示す。クローン１２Ｒ ，＋３Ｒ及び＋９Ｒ並びに非絹換ラムダ［１ｔｌｌの２μｍのファージストック を、１０ｍＭのＩ　ＰＴＧで飽和に付したニトロセルロースフィルターで誘発せ しめたＥ、コリＹ１０９０の菌叢の上にスポットした。このタンパク質プロット を次に３０人の草類アレルギー患者由来の個々の血清でプローブした。ａ＝Ｌｏ ｌ　Ｉ）　Ｉｂ、Ｉ　、　ｂ＝　Ｌｏｌ　ｐ　ｌａ　、　ｃ　＝　Ｌｏｌ　ｐ　 Ｉｂ、２及びｄ＝非組換ラうダｇｔｌ１０（＜）　＝　Ｌｏｔ　ｐ　Ｉａ及びＬ ｏｌ　ｐ　Ｉｂ、ｌよりＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２に対してより高レベルで結合した ＩｇＥを有する個体。（］）＝Ｌｏｌｐ　Ｉａに特異的なＩｇＥを有する個体。

（２：ｌ　＝　Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、ｌ及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２に特異的なＩｇ Ｅを有する個体。

発明の詳細な説明 本明細書のデーターは、はそ麦花粉の主要アレルゲンがなにであるかというと、 事実上少なくとも２種類の異なるアレルギー性タンパク質、即ちＬｏｌ　ｐ　ｌ ａ（これは３５ｋＤ（７）範囲における、約５．５〜７．０に範囲するＩｌｌを 有する４種類のアイソフオームを含んで成る）及びＬｏｔ　ｐＩｂ（これは３１ ／３３ｋＤタンパク質であり、そして６．０〜ｌ０１６に範囲するｐｌの少なく とも５種類のアイソフオームを含んで成る）を含んて成るＬｏｌ　ｐ　Ｉである と考えられることを示している。Ｌｏｌ　ｐｌｂはＬｏｌ　ｐ　ｌａとは異なる 一次構造及び組成を有しており、これはＮＨ，−末端アミノ酸配列より、及びア レルギー性交差反応のなさより推定される。　Ｌｏｌ　ｐ　１１１．１をコード するｃＤＮＡ　（クローン１２Ｒ）及びＬｏｔ　ｐ　ｌｂ、２をコートするｃＤ ＮＡ　（クローン１９Ｒ）が単離され、そして特性化された。クローン＋２Ｒ及 び＋９ＲによりコードされるＬｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質はＬｏｌ　ｐ　Ｉａと は異なる一次構造及び組成を存しており、これはｃＤＮＡクローニングにより及 びアレルギー性交差反応のなさにより推定された。組換Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、１の ＮＨ，末端配列は精製天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂに関して決定されたそれと同一であ る。しかしながら、Ｌｏｌ　ｐ　［ｂ、１及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２は見かけ上 階性タンパク質であり、それぞれ５．１６及び５．９の推定ｐｌを有する。精製 天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、Ｌｏｔ　ｐ　Ｉｂ、ｌ及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２は類似 の分子量（３１／３３ｋＤ）及び類似のＮＨ，−末端配列を有する非グリコジル 化タンパク質である。これらの類似性は天然Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂ及び組換Ｌｏｔ　 ｐ　Ｉｂタンパク質をコードする遺伝子が同一の遺伝予科のうちの異なる構成員 であろうことを示唆する。Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ科構成員は、アレルゲンがプラスチ ットを標的とするようにする２５個のアミノ酸のシグナルペプチドを有するプレ アレルゲンとして花粉の中で合成される。これに続いてペプチドの分解が起き、 そして成熟花粉の中でアレルゲンはデンプン顆粒の中で主として認められる。

従って、本発明の一観点は少なくとも１種のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂはそ麦花粉アレル ゲン、又は少なくともＩｔ種のその抗原性フラグメント、又はその誘導体もしく は同族体をコードする精製核酸配列、又はかかる核酸配列の機能的同等物を提供 する。Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ科構成員をコードする好ましい核酸配列には、図３ｂ及 び３Ｃに示すＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、１のアミノ酸−２５〜２７６をコードする核酸 配列、並びに図１０ａ及び１０ｂに示すＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２のアミノ酸−２５ 〜３１４をコードする核酸配列が含まれる。これらの配列は２５個のアミノ酸の シグナル配列を含むＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、Ｉタンパク質及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２ タンパク質全体をコードする。その他の好ましい核酸配列には、図３ｂ及び３Ｃ に示すＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、ｌのアミノ酸１〜２７６をコードする核酸配列、並び に図１０ａ及び］Ｏｂに示すＬｏｌ　ｐ　ｌｂ、２のアミノ酸１〜３１４をコー ドする核酸配列が含まれる。これらの核酸配列は成熟Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂ、１及び Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２タンパク質をコードする。本発明の更に別の核酸配列には 、図３ｂ〜３ｃに示すＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、Ｉの核酸配列のコード領域のうちの少 なくとも１フラグメント、もしくは図Ｉｏａ及び１ｏｂに示すＬｏｔ　ｐ　Ｉｂ 、２の核酸配列のコード領域の少なくともｌフラグメントをコートする核酸配列 、又はかかる核酸配列の機能的同等物が含まれる。

遺伝子材料の起源は、オーストラリア国メルボルン市の近くの野外起源から集め たロリウム　ペレンネンし、由来の新鮮なほそ麦花粉、並びに供給者（Ｇｒｅｅ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅｎｏｉｒ、ＮＣ）及び頭状花由来のバルク 回収花粉である。これらの花粉の起源は本発明の範囲を限定することは意図して おらず、なぜならこれらは花粉の通常の起源の一例にすぎないからである。本発 明はあらゆる場所由来の花粉を利用して実施できる。

本発明に関連して［遺伝子」はその最も広い意味で利用しており、そしてヌクレ オチドの任意の連続配列を意味しており、その転写はｍＲＮＡ分子をもたらし、 このｍＲＮＡ分子はタンパク質へと翻訳されることか可能である。Ｌｏｌ　ｐ　 Ｉｂ科構成員をコードする遺伝子とはタンパク質、又は単一のもしくは複数のア ミノ酸置換、欠損又は付加を含みうろこのタンパク質の誘導体もしくは同族体を コートするヌクレオチド配列を意味する。Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂ遺伝子はＬｏｔ　ｐ 　Ｉｂタンパク質の全長又は部分的な長さに相当するｍＲＮＡに相補性のｃＤＮ Ａも意味する。

各Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ科構成員をコードする核酸配列において配列冬型性かあるこ とか予測され、そしてＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ科構成員をコードする核酸配列中の１又 は複数のヌクレオチドが天然対立遺伝子バリエーションに基づいて個々の１１． ペレンネ植物にわたって変わりうろことか当業者に明らかであろう。かかるヌク レオチドバリエーションの全て及びその結果としてのアミノ酸多型性は本発明の 範囲に属する。

Ｌｏｌ　ｐ　ｉｂは非常に近縁な遺伝子の科であり、そのタンパク質はり、ベレ ンネ花粉の中に存在していることが当業者に明らかでありう及びＬｏｌ　ｐ　Ｉ ｂ、２を含むかかる近縁の斜横成員の全てのヌクレオチド配列及び対応の推定ア ミノ酸配列は本発明の範囲に属する。

従って、Ｌｏｌ　ｐ　ｉｂ科に属する全てのタンパク質、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタン パク質料構成員の少なくともｌフラグメント（ペプチド）及びそのアミノ酸誘導 体、並びにＬｏｔ　ｐ　Ｉｂ科構成員又はそのフラグメント、又はその誘導体を コートする、ＤＮＡ　、　ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列及びそ の同族体又は縮重形態は本発明の範囲の中に包括される。また、精製天然Ｌｏｌ 　ｐ　ｉｂ　、少なくとも１種のそのフラグメント（ペプチド）及びその誘導体 又は同族体も本発明の範囲に包括される。更に、Ｌｏｔ　ｐ　Ｉｂタンパク質又 は少なくともそのｌフラグメントもしくはその誘導体に、あるいはかかるフラグ メント及び／又は誘導体をコートするヌクレオチド配列に近接しているヌクレオ チド配列に融合しているポリペプチドのような分子を含むことが本発明にかかわ る。例えば、本発明のいくつかの観点に関して、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ科構成員又は 少なくともその１フラグメントもしくはその誘導体と、別のペプチド又はタンパ ク質に由来するアミノ酸配列（その後者の例は例えばベーターガラクトシダーゼ 、ホスファターゼ、ウレアーゼ等である）とを含んで成る融合タンパク質を生成 することが所望される。はとんどの融合タンパク質は組換遺伝子の発現により生 成され、これにおいては２本のコード配列はその解読枠か相となって互いに連結 し合っている。Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質のかかる融合タンパク質又はバイブ リド遺伝子誘導体、又はそのコートヌクレオチド配列の全てか本発明に包括され る。更に、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質の同族体及び誘導体とは、その合成誘導 体を含むことを意味する。ここで明らかにされるヌクレオチド配列は、よく知ら れた方法（例えば固相合成）による化学合成によって、全タンパク質を化学合成 する、又は任意の数のフラグメント（ペプチド）を作るために利用できる。この ようにて化学的に合成したペプチドの全てか本発明に包括される。従って、本発 明は組換手段又は化学合成によって作られた単離Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質料 構成員、そのフラグメント、並びにその誘導体、同族体及び免疫学的関連物に及 ぶ。

［単離Ｊ及び「精製Ｊなる語は本明細書で同義語として利用されており、そして 組換ＤＮＡ技術によって生成されたときに細胞性物質もしくは培養培地を実質に 含まない、又は化学的に合成されたときに化学前駆体もしくはその他の化学品を 実質的に含まないペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント及び核酸配列 に関連する。本明細書で用いている「天然精製」なる語は、し、ペレンネ花粉又 はその他の植物部分から精製したタンパク質又はフラグメントに関連する。更に 、本発明は図３ｂ及び３Ｃ１並びに１ｍ１Ｏａ及び１０ｂに示すヌクレオチドコ ード配列全体又はその一部に対応するタンパク質又はそのフラグメンｈ　（ペプ チド）、又はその縮重もしくは同族体に及ぶ。

本発明の範囲に属する核酸のフラグメントには、哺乳動物、好ましくはヒトにお ける免疫応答１例えば最少のＩｇＢの刺激：　ＩｇＨの結合１　１ｇＧ及びＩｇ Ｍ抗体の生産の誘発、又はＴ細胞応答の誘発、例えば増殖及び／もしくはリンホ カイン分泌及び／もしくはＴ細胞アネルギーの誘発、を引き出すＬｏｌ　ｐ　Ｉ ｂの部分をコートするものか含まれる。１、ｏｆ　ｐ　ｔｂの上記のフラグメン トは本明細書では抗原性フラグメントと呼んでいる。本発明の範囲に属するフラ グメントには、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質と交差反応性であるアレルゲンを検 出するためのスクリーニングプロトコールにおいて利用するためのその他の植物 種に由来する核酸とハイブリダイズできるものも含まれる。本明細書で利用して いるＬｏｌ　ｐ　Ｔｂをコードする核酸配列のフラグメントは、Ｌｏｌ　ｐ　ｌ ｂ及び／又は成熟Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂ科構成員の全アミノ酸配列をコートするヌク レオチド配列より少ない塩基数を存するヌクレオチド配列を意味している。一般 に、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ科構成員のフラグメントをコードする核酸配列は成熟Ｌｏ ｌ　ｐ　Ｉｂタンノくり質料構成員をコートする塩基から選ばれるであろうが、 しかしながら一定の状況において、本発明の核酸配列のリーダー配列部分に由来 するフラグメントの全て又は一部を選別することか所望されることがある。本発 明の核酸配列はリンカ−配列、制限エンドヌクレアーゼ部位及びＬｏｌ　ｐ　Ｉ ｂタンパク質又はそのフラグメントのクローニング、発現する精製にとって有用 なその他の配列も含んでよい。

はそ麦花粉に由来するアレルゲン、好ましくはＬｏｌ　ｐｌｂ、ｌ　。

Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２又は精製天然Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂの抗原性フラグメントは例 えば、かかるペプチドをコードする本発明の核酸整列の対応のフラグメントから 組換法により生成したペプチドをスクリーニングすることにより、当業者に知ら れる技術を利用して化学合成することにより、又は精製アレルゲンを分解するこ とにより獲得できつる。タンパク質アレルゲンのペプチドフラグメントは当業界 に公知の任意の方法、例えばアレルゲンの化学切断、アレルゲンをペプチドを重 複のない所望の長さのフラグメントへと任意に分割すること、又は好適にはアレ ルゲンの所望の長さの重複フラグメントへの分割により獲得てきうる。これらの フラグメントはその抗原性及びアレルギー性を決定するために試験される。組換 又は合成的に生成されたしｏｆ、　ｌ）　［ｂのフラグメント又は精製天然Ｌｏ ｌ　ｐ　ｌｂのフラグメントてあって、Ｔ細胞応答、例えば刺激（即ち、増殖又 はリンホカイン分泌）を誘発することか可能な、及び／又はＴ細胞アネルギーを 誘発することが可能なフラグメントが特に所望される。組換又は合成的に生成さ れたＬｏｔ　ｐ　Ｉｂ又は精製天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂのフラグメントであ−って イムノグロブリン）Ｅ　（ＩｇＥ）に結合しない及び／又は最少の１ｇε刺激活 性を有するフラグメントも所望される。組換又は合成的に生成されたＬｏｌ　ｐ 　ｌｂタ゛ノバク質料構成員又は精製天然Ｌｏｔ　ｐ　ＩｂのフラグメントがＩ ｇＥと結合するなら、その結合はヒスタミン放出をもたらさないこと、例えばか かる結合がマスト細胞又は塩基性細胞上でのＩｇＥの架橋を引き起こさないこと が好ましい。最少１ｇε刺激活性とは、全体か組換又は合成的に生成されたＬｏ ｌ、　ｐ　Ｉｂタンパク質又は全体か天然であるＬｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質に より刺激されるＩｇＥ生産量より低い１ｇε刺激活性を意味する。好ましいフラ グメントには、抗原性フラグメントてあって、はそ麦花粉感受性個体又はほそ麦 花粉アレルゲンと交差反応性のアレルゲンに対してアレルギーを有する個体に投 与したときに、その個体のほそ麦花粉アレルゲンに対するアレルギー性応答を改 善せしめることの可能なフラグメント］・、及び抗原性フラグメントであ−って 、はそ麦花粉感受性個体に投与したときに、はそ麦花粉アレルゲンに対するその 個体のＢ細胞応答、Ｔ細胞応答又はＢ細胞とＴ細胞応答の両者を改善せしめるこ との可能なフラグメントも含まれる。本明細書で用いているほそ麦花粉アレルゲ ンに対して感受性な個体のアレルギ一応答の改善どは、アレルゲンに対する反応 性をなくす又は草花粉誘発性ぜん息症状の軽減（Ｓｕｐｈｉｏｇｌｕら（＋９９ ２）Ｌａｎｃｅ！　３３９：　５６９−５７２）を含む症状の軽減と定義され、 これは標準の臨床順によって決定される（例えばＶａｒｎｅｙら、Ｂｒ１ｔｉｓ ｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９０）３０２：　２６５−２６９を 参照のこと）。

Ｔ細胞刺激活性を有し、それ散歩なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成る ような本発明の抗原性フラグメントが特に所望される。Ｔ細胞エピトープは、ア レルギーの臨床的症状の原因であるタンパク質アレルゲンに対する免疫応答の開 始及び不朽化に関与するものと信じられている。これらのＴ細胞エピトープは、 抗原表示細胞の表層上の適切な１（ＬＡ分子への結合及び関連のＴ細胞サブ集団 の刺激により、Ｔヘルパー細胞のレベルでの初期現象の引金となっていると考え られる。これらの現象はＴ細胞増殖、リンホカイン分泌、局所的な炎症反応、付 加免疫細胞のその部位への補給、及びＢ細胞カスケードの活性化をもたらし、抗 体の生産に導く。これらの抗体の１アイソタイプＩｇＥはアレルギー症状の発症 に基本的に重要であり、そしてその生産は分泌されたリンホカインの種類により 、Ｔｌ＼ルバー細胞のレベルで、現象のカスケードにおいて初期に生ずる。

Ｔ細胞エピトープはＴ細胞レセプターにより認識される基本要素又は最小単位で あり、このエピトープはレセプター認識にとって必須なアミノ酸を含んで成る。

Ｔ細胞エピトープを擬態し、且つタンパク質アレルゲンに対するアレルギー性応 答を改善せしめるアミノ酸配列は本発明の範囲に属する。

本発明の精製タンパク質ア１ノルゲン、又は少なくともＩＴ細胞エピトープを含 んで成り、且つタンパク質アレルゲンに由来する抗原性フラグメントに対する患 者の暴露は、適当なＴ細胞サブ集団がタンパク質アレルゲンに対して無反応性と なり、従ってかがる暴露による免疫応答の刺激に関与しないように寛容化又はア レルギー症せしめる。更に、本発明のタンパク質アレルゲン、又は少なくともＩ Ｔ細胞エピトープを含んで成る本発明の抗原性フラグメントの投与はリンホカイ ン分泌プロフィールを、天然のタンパク質アレルゲン又はその領域に対する暴露 に比して改善せしめつる（例えばＩＬ−４の低下及び／又は］Ｌ−２の上昇がも たらされる）。更に、かがる抗原性フラグメント又はタンパク質アレルゲンに対 する暴露は、アレルゲンに対する応答に通常関与するＴ細胞サブ集団に影響を及 ぼし、これらのＴ細胞がアレルゲンに対して通常暴露される箇所（例えば鼻腔粘 膜、皮膚及び肺）からフラグメント又はタンパク質アレルゲンの治療投与箇所に 向って引き離されるようにすることができる。

Ｔ細胞サブ集団のこのような移動はアレルゲンに対して通常暴露される箇所での 通常の免疫応答を刺激する個体の免疫系能力を緩和又は低下することができ、ア レルギー症状の軽減がもたらされる。

タンパク質又はそのフラグメントに対するＩｇＥ結合性のスクリーニングは実験 動物もしくはヒトボランティアに基づくスクラッチ検査もしくは皮肉検査、又は インビトロ系、例えばＲＡＳＴ　（ラジオアレルゴ収着試験）、ＲＡＳＴ阻害、 ＥＬＩＳＡアッセイもしくはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により実施されう る。

本発明は本発明の核酸配列を発現するための発現ベクター及び形質転換宿主細胞 を提供する。本発明の発現ベクターは少なくとも１種のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂはそ麦 花粉アレルゲン、又は少なくとも１種のその抗原性フラグメント、又はその誘導 体もしくは同族体をコードする核酸配列、又はかかる核酸配列の機能的同等物を 含んで成る。Ｌｏｌｐｌｂ、Ｉ又はｍｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２を含む１、ｏｌ　ｐ　 Ｉｂ科構成員又はその少なくとも１種のフラグメントをコードする核酸配列は原 核又は真核宿主細胞の中に発現されうる。適切な宿主細胞には細菌細胞、例えば Ｅ、コ１　（Ｅ、ｃｏｌｉ）　、昆虫細胞、酵母、哺乳動物細胞、例えばチャイ ニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が含まれる。適切な発現ベクター、プロモ ーター、エンハンサ−１及びその他の発現コントロール要素はＳａｍｂｒｏｏｋ ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ ａｎｕａｌ　、第２版、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ％１９８９に見い出すことができる。酵母における発現にとっ Ｅ、コリにおける発現に関して、適当な発現ベクターにはＰＴＲＣ（Ａｍａｎｎ ら（１９８８）Ｇｅｎｅ　６９：　３０１−３１５）　；　ｐＥＴ−１ｉｄ　（ Ｎｏｖａｇｅｎ、　Ｍａｄｉ−ｓｏｎ、　ＷＤ；　ｐＧＥＸ　（Ａｍｒａｄ　Ｃ ｏｒｐ、、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕ５ｌｒａｌｉａ）　；　ｐＭＡＬ（Ｎ、ε 。

Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）　；　ｐＲＩＴ５　（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＹ）　；及びｐＳＥＭ（Ｋｎａｌｌｐら（ １９９０）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉＱｕｅｓ　８　：　２８０−２８１）が含まれる 。

ｐＴＲＣ及びｐＥＴ−ｈｄの利用は未融合タンパク質の発現をもたらすであろう 。ｐＧＥＸ、　ｐＭＡＬ、　ｐＲＩＴ５及びｌ）ＳＥＭノ利用は、グルタチオン Ｓ　−トランスフェラーゼ（ｐＧＥＸ）、マルト−スＥ結合タンパク質（ｐＭＡ Ｌ）、プロティンＡ　（ｐＲＩＴ５）又は省略型β−ガラクトシダーゼ（ＰＳＥ Ｍ）に融合したアレルゲンの発現をもたらすであろう。Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパ ク質料構成員、又はそのフラグメントが融合タンパク質として発現されるとき、 担体タンパク質とＬｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質料構成員又はそのフラグメントと の間の融合連結部に酵素的切断部位を導入することか極めて好都合である。Ｌｏ ｌ　ｌｌ　Ｉｂ科構成員又はそのフラグメントはこれにより、酵素的部位での酵 素的切断並びにタンパク質及びペプチドの精製にとっての常用の技術を利用する 生化学的精製を通して回収されつる。適切な酵素的切断部位には、凝血因子Ｘａ 又はトロンビンにとってのそれらであり、これらにとっての適当な酵素及び宿主 細胞は常用の技術、例えばリン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿、Ｄ ＥＡＥ−デキストラン−仲介壓トランスフェクション、又はエレクトロポレーシ ョンを利用して本発明の核酸配列を発現さぜるために形質転換されうる。宿主細 胞を形質転換させるための適切な方法はＳａｍｂｒｏｏｋら、前掲、及びその他 の研究室のテキストブックにおいて見い出すことかできる。本発明の核酸配列は 標準白りな技術によっても合成されうる。

従って、本発明の別の観点は組換Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、Ｉ又はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、 ２、又は少なくとも１種のそのフラグメント、又はそれらの誘導体もしくは同族 体、又はそれらの免疫学的関連物（前記に定義しｔこ通り）を製造する方法を提 供し１．この方法は複製可能な組換ＤＮＡ分子を含む生物を（ここでこの分子は 前記生物の中で発現可能なプロモーター：このプロモーターの下流に位置し、そ してそれより転写されるＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ科構成員、少なくとも１種のそのフラ グメント、又はその同族体もしくは誘導体、又はその免疫学的関連物をコート′ する遺伝子：選択マーカー及び原核又は真核系複製起点を含むＤＮＡ媒体。

を含んで成る）、前記組換ＤＮＡ分子が安定維持され、且つＬｏｌ　ｐ　Ｉｂタ ンパク質、少なくとも１種のそのフラグメント又１よその誘導体、同族体もしく は免疫学的関連物の合成がもたらされるの（二十分なる条件及び時間のもとて培 養し、次いでそれらを任意的Ｉこ単離することを含んで成る。

Ｌｏｌ　１１　ｌｂ、Ｉタンパク質、Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂ、２タンノくり質及びそ のフラグメント（ペプチド）は、ペプチド及びタン１くり質を精製する当業界に 公知である、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限 外濾過、電気泳動、及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、１　、　Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２又は Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂ、１　もしくは１、ｏｆ　ｐ　Ｉｂ、２のフラグメント（＝特 異０りな抗体による免疫精製を含む技術により、細胞培養培地、宿主細胞、又は その両者から精製できる。単離及び精製なる語：よ本明細書で（よ同義語として 用いられ、モして組換ＤＮＡ技術により生成されｔこときは細胞性質物もしくは 培養培地を、又は化学合成されたとき１よ（ヒ学前駆体もしくはその他の化学品 を実質的台まないペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント及び核酸配列 を意味する。

本発明の別の観点は、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ　、Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂ、ｌ　、Ｌｏｌ　 Ｉ）　［ｂ、２又はＬｏｔ　ｐ　ｆｂ　、Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂ、Ｉ　もしくはＬｏ ｌ　ｐ　ｌｂ、２の少なくとも１フラグメントを含んて成るタンパク質調製物を 提供する。本発明のこの観点の好ましい態様において、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、ｌ　 もしくはＬｏｌ　ｐｌｂ、２タンパク質、又はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、Ｉ　もしくは Ｌｏｔ　ｐ　Ｉｂ、２の少なくとも１フラグメントはこのタンパク質又はフラグ メントをコードする核酸配列で形質転換された宿主細胞の中で生成される。

現状有用な構造情報を利用して、はそ麦花粉感受性個体に十分な量で投与でした ときにほそ麦花粉に対するその個体のアレルギ一応答を改善せしめるであろうＬ ｏｌ　ｐ　ｌｂ由来のペプチドをデザインすることが可能である。これは例えば Ｌｏｌ　ｐ　Ｔｂの構造を調べ、はそ麦花粉感受性個体におけるＢ細胞及び／又 はＴ−細胞応答に影響を及ぼす能力について調べるべきペプチドを作り（発現系 、合成又は他の手段を介して）、次いてこれらの細胞により認識される適当なエ ピトープを選別することにより成し遂げられうる。エピトープに関して、このエ ピトープはレセプター、特にイムノグロブリン、組織適合性抗原及びＴ細胞によ り認識の基礎要素又は最小単位であることができ、ここでレセプター認識にとっ て必須のアミノ酸はそのアミノ酸配列において連続でも非連続的でもよい。これ らのエピトープを擬態し、且つほそ麦花粉アレルゲンに対するアレルギ一応答を 下降調節可能なアミノ酸配列も利用できつる。

はそ麦花粉感受性個体におけるアレルギー反応を誘発せしめるほそ麦花粉アレル ゲンの能力をブロック又は阻害することの可能な因子又は薬剤をデザインするこ とも現状可能となった。かかる因子は例えばそれらが対応の抗−Ｌｏｔ　ｐ　Ｉ ｂ　−１ｇＥに結合し、それ故１ｇε−アレルゲン結合及びそれに続くマスト細 胞又は好塩基性細胞の脱顆粒を阻止するようにデザインすることができる。他方 、かかる因子は免疫系の細胞性成分に結合して、Ｌ、ベレンネ花粉アレルゲンに 対するアレルギ一応答の抑制又は脱感作をもたらすことができる。その限定でな い例は、はそ麦花粉に対するアレルギ一応答を抑制せしめる本発明のｃＤＮＡ／ タンパク質構造に基づく、適当なり一及びＴ−細胞エピトープベブチド又はその 改質体の利用にある。これはほそ麦花粉感受性個体由来の血液成分を存するイン ビトロ研究において、Ｂ−及びＴ−細胞機能に影響を及ぼすＢ−及びＴ−細胞エ ピトープペプチドの構造を定義付けることによって実施できる。

本発明のタンパク質、ペプチド又は抗体はほそ麦花粉症を検査及び診断するため にも用いることができる。例えば、これはほそ麦花粉に対する感受性について評 価すべき個体から獲得した血液又は血液産物を、単離せしめた組換もしくは合成 的に生成したＩ、ｏｌ　ｐ　ｌｂ又は天然精製Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質の抗 原性ペプチド、あるいは単離せしめたＬｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質又は単離せし めた天然精製Ｌｏｌ　ｐｌｂＩｂタンパク質血液における成分（例えば抗体、Ｔ 細胞、Ｂ細胞）がこれらのペプチド又はタンパク質と結合するのに適切な条件の もとて組合わせ、次いでかかる結合の生した度合いを決定することにより行うこ とができる。結合の生じた度合いは例えばＴ細胞機能、Ｔ細胞増殖、Ｂ細胞機能 、又は血液中に存在している抗体に対するタンパク質又はそのフラグメント、あ るいはその誘導体もしくは同族体の結合性あるいはそれらの組合を評価すること によって決定できる。

更ニ、はそ麦花粉に対する哺乳動物の感受性は、哺乳動物におけるアレルギ一応 答を刺激するようにＬｏｔ　ｐ　Ｉｂ科に属する少なくとも１種のほそ麦花粉ア レルゲンを十分な量て哺乳動物に投与し、次いでほそ麦花粉アレルゲンに対する この哺乳動物におけるアレルギ一応答の発生を決定することによって決定できつ る。本発明のこの観点において用いられるほそ麦花粉アレルゲン、そのフラグメ ント又は誘導体もしくは同族体は組換又は合成的に生成できうる。精製天然Ｌｏ ｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質又はそのフラグメントが組換又は合成的に生成されたＬ ｏｌ　ｐ　ｌｂもしくはそのフラグメントに代わってほそ麦に対する哺乳動物の 感受性を決定する上記の方法に用いられることができる。

本発明の任意の態様において用いられるＤＮＡは本明細書に記載の通りに獲得さ れ、又はそうでなければ本明細書に示している配列全体又は一部を有する任意の オリゴデオキシヌクレオチド配列又はその機能的同等物であってよい。かかるオ リゴデオキシヌクレオチド配列は公知の技術を利用して化学的又は機械的に生成 されうる。オリゴヌクレオチド配列の機能的同等物はｌ）図３ｂ及び３　ｃ　（ Ｌｏｌ　Ｉ）Ｉｂ、Ｉ）の配列（又は対応の配列領域）もしくはそのフラグメン トがハイブリダイズする又は図１０ａ及び１Ｏｂ（Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２　）の 配列（又は対応の配列領域）もしくはそのフラグメントがハイブリダイズする相 補性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列、あるいは２）図３ｂ及び ３Ｃ又は図１０ａ及びｌＯｂの核酸配列に相補性を配列（又は対応の配列領域） 、並びに／あるいは図３ｂ及び３Ｃ又は図１０ａ及び１０ｂの核酸配列の配列（ 又は対応の配列領域）によりコードされる生成物と同一の機能特性を有する生成 物（例えばポリペプチド又はペプチド）をコードする配列、であるものである。

機能的同等物かｌ又は複数の基準に合うものでなくてはならないかとうかは、そ の利用に依存するであろう（例えば、もしそれがオリゴプローブとしてのみ利用 されるなら、それは第１又は第２基準に合うだけてよく、そしてもしそれがＬｏ ｔ　ｐ　ｌｂを生成するために利用されるなら、そｔ］は第３基準に合うだけで よい）。

１．、ｏｌ　ｐ　ｌｂ、ｌ又は［、ｏｌ、　ｐ　Ｉｂ、２を含むＬｏｌ　ｐＩｂ 　ｃＤＮＡ　（又はそれが転写されるｍＲＮＡ）又はその領域を、任意の種類又 はタイプの植物における類似の配列を同定するために、それ故、Ｌｏｌ、　ｐ　 Ｉｂ　ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡ又はその領域、例えばイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）の 植物のア［／ルゲンに由来するＤＮＡに低緊縮条件のもとてハイブリダイズする ほど十分な相同性を存する配列を同定又は「鈎り出す」のに利用できる。」−分 なる相同性（一般に４０％以上）を有する配列は本明細書に記載の方法を利用し て更なる評価のために選択できつる。他方、高緊縮条件を利用することができる 。この状況においては、本発明のＤＮＡはその他のタイプの植物、好ましくは近 縁の科、属する種における、Ｌｏｌ　ｐ　ｔｂのアミノ酸配列と類似のそれを存 するポリペプチドをコードする配列を同定するために、それ故その他の種におけ るアレルゲンを同定するのに利用できうる。従って、本発明のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ だけでなく、本発明のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるそ の他のアレルゲンも含む。

本発明は更に、１、ｏｆ　ｐ　Ｉｂ、Ｉ又はＬｏｌ　ｐ　ｌｂ、２又はフラグメ ント、又はその誘導体もしくは同族体を含むＬｏｌ　ｐ　Ｉｂに免疫学的に関連 する単離せしめたアレルゲン性タンパク質又はそのフラグメントを含み、それら の単離は例えば抗体交差反応性（ここで単離されたアレルゲン性タンパク質又は そのフラグメントは本発明のタンパク質及びペプチドに対して特異的な抗体に結 合可能である）又はＴ細胞交差反応性（ここで単離されたアレルゲン性タンパク 質又はそのフラグメントは本発明のタンパク質及びペプチドに対して特異的なＴ 細胞を刺激可能である）による。

他の者による研究は、高投与量のアレルゲンが一般に良好な結果（即ち、最良の 症状軽減）をもたらすことを示している。しかしながら、多くの人は大量のアレ ルゲン投与に耐えることができず、その理由はアレルゲンに対するアレルギー反 応にある。天然アレルゲンの改良は、対応の天然アレルゲンと同−又はそれより 高い治療的性質を存するがしかし低い副作用（特にアナフィラキンー反応）を有 する改良ペプチドは改良アレルゲンが生成されつるようにデザインされうる。こ れらは例えば、本発明のタンパク質もしくはペプチド（例えば、Ｌｏｌ　ｐ　ｌ ｂ、１又はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２又は精製天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂを含むＬｏｌ　 ｐ　Ｉｂのアミノ酸配列全体又はその一部を有するもの）、又は改良タンパク質 もしくはペプチド、又はタンパク質もしくはペプチド類似体でありうる。本発明 のタンパク質又はペプチドの構造は、例えば可溶性の上昇、治療的もしくは予防 的効果の上昇、又は安定性（例えば生体外での棚寿命及びインビボでのタンパク 質分解）の目的のために改良されうる。改良タンパク質又はペプチドは、免疫原 性を改質するために、及び／又はアレルゲン性を下げるために例えばアミノ酸の 置換、欠失又は付加によりアミノ酸が変更されて、又は同一の目的のために成分 が加えられて生成されていてよい。

従って、本発明は、はそ麦花粉感受性個体に投与したときにほそ麦花粉に対する 個体のアレルギ一応答を引き下げる、改良はそ麦花粉タンパク質アレルゲンを提 供する。好ましい改良はそ麦花粉タンパク質アレルゲンには、改良Ｌｏｌ　ｐ　 ｌｂ、１タンパク質又はその誘導体もしくは同族体、及び改良Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ 、２タンパク質又はその誘導体もしくは同族体が含まれる。本発明はまたほそ麦 花粉感受性個体に投与したときに、はそ麦花粉に対する個体のアレルギ一応答を 引き下げるほそ麦花粉タンパク質アレルゲンの少なくともｌ改良フラグメントを 提供する。好ましくは、かかる改良フラグメントはＬｏｌｐＩｂ、Ｉタンパク質 又はその誘導体もしくは同族体の又はＬｏｌ　ｐ　ｌｂ、２タンパク質又はその 誘導体もしくは同族体の少なくとも１改質フラグメントである。

Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂ、！　もしくはＬｏｔ　ｐ　ｌｂ、２又は精製天然Ｌｏｌ　ｐ 　ｌｂのタンパク質又はペプチドは、例えばＡ、　５ｅｈｏｎとその共同研究者 のポリエチレングリコール法を利用して改良できつる。Ｗｉｅら、（１９８１） Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、　ＡＩｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ、　Ｉｎ＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ 、　６４　：　８４−９９゜Ｌｏｌ　ｐ　Ｉ！１．１もしくは］、ｏｌ　ｐ　［ ｂ、２又は精製天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂのタンパク質又はペプチドの改良には、還 元／アルキル化（Ｔａｒｒ　（１９８６）　：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆＰｒｏｔ ｅｉｎ　Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｊ、Ｅ、５ｉｌｖｅｒ編 、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｃ１１ｆｔｏｎ、　ＮＪ、頁１５５−１９４）　；アシル化（Ｔａｒｒ、前掲） ；エステル化（Ｔａ、ｒｒ、前掲）：適当な担体への化学カップリング（Ｍｉｓ ｈｅｌｌ　ａｎｄＳｈｉ　ｉｇｉ編、５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　ｃｅｌｌｕａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＷＩ（Ｆｒｅｅｍａｎ。

Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃ＾：米国特許第４．９３９．２３９号）；又は 温和ホルマリン処理（Ｍａｒｓｈ（＋９７１）Ｉｎｔ、Ａｒｃｈ、　ＡＩｌｅｒ ｇｙ　Ａｐｐｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　４１　：　１９９−２１５）も含まれうる 。

タンパク質又はペプチドの改良のその他の例はジスルフィド結合を介する脱鉱化 を最少限とするため好ましくはアラニン、セリン、スレオニン、ロイシン又はグ ルタミン酸によるシスティン残基の置換である。本発明のペプチドの改良の他の 例はアミノ酸側鎖の化学的改良又はペプチドの環化による。

安定性及び／又は反応性を高めるために、本発明のタンパク質又はペプチドは天 然対立形質バリエーションに由来して、タンパク質アレルゲンのアミノ酸配列の 中に１又は複数の冬型性を含ませるように改質されることもてきうる。更に、本 発明の範囲に属する改良タンパク質又はペプチドを生成するためにＤ−アミノ酸 、非天然アミノ酸又は非アミノ酸類似体を置換又は付加してよい。

天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂは当業界に公知の貫用の方法、例えば５ｃｏｐｅｓ、　Ｒ ，Ｋ。

（１９８７）Ｐｒｏｊｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅ ｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　”Ｉｃ　２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌ ａｇ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋにおける方法を利用して精製できる 。適切な方法にはイオン交換クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー 、電気泳動、限外濾過、等電点電気泳動及び天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂに特異的な抗 体を利用する免疫収着クロマトグラフィーが含まれる。等電点電気泳動及びＳＤ Ｓ　−ＰＡＧＥによる天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂの精製が実施例２の中に記載しであ る。

Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、Ｉ及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２をコードするｃＤＮＡのクロー ニングは、はそ麦花粉感受性患者に由来する特異的なモノクローナル抗体及び特 異的な血清１ｇＨの両方を利用する、ラムダ−ｇｔｌ＋ファージで形質転換せし めたエッシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　１．ニーよ り発現されたタレバク質の認識を基礎とする。かかる２種類のクローンを＋２Ｒ 及び１９Ｒと命名した。また、利用したモノクローナル抗体はＭＡｂｓ３．２　 、ＦＭＣＡ７（１２゜３）、２１．３及びＦＭＣＡｌ（４０，Ｉ）とした（Ｋａ ｈｎ＆　Ｍａｒｓｈ（１９８６）Ｍｏｌｅｃ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、２３　：　１２ ８１−１２８８　；　Ｓｉｎｇｈ　＆　Ｋｎｏｘ（１９８５）Ｉｎｔｅｒｎａｔ ｉｏｎａｌ　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅ ｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　７８゜３００−３０４　；　Ｓｍａｒｔ　ら（＋９ ８３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ７２２４３−２４８）。Ｌｏｌ 　ｐ　ｌｂ、Ｉ及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２のクローニングの詳細を実施例の中に 示す。

課題のタンパク質のアレルゲン性質は、アレルギー患者の血清の中で高レベルで 存在しているレアギン性１ｇＥ抗体へのその結合性によっである程度特性化しで ある。アレルギータンパク賃上のエピトープへのＩｇＥ結合は色素形成アッセイ において試験でき、それにおいて固相支持体上に固定化されたアレルゲンは（１ ）アレルギー患者血清：　（２）酵素ラベル化抗−ＩｇＥ抗体の中での順々のイ ンキュベーションによって識別化されうる。

本発明の別の観点は草の種の花粉に由来するアレルギー活性を示すタンパク質を コードするＤＮＡ配列を含んで成る組換ベクターに関する。より詳しくは、この 草の種はイネ科（グラミネア（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）　）に属し、そしてもっと 詳しくは、ドクムギ（Ｌｏｌｉｕｍ）Ｅｌに属する。更により詳しくは、このア レルゲン性タンパク質はボッムギ花粉のＬｏｌ　ｐ　ｌｂタンパク質に対する抗 体と免疫交差反応性であるとに特徴付けられている。

ウシノケグサ（Ｐｏｏｉｄ；ｆｅｓｔｕｃｏｉｄ）草類、グループ１０コムギ属 ：スズメノチャヒキ（Ｂｒ＆　ｉｎｅｒｍｉｓ、ｓｍｏｏｔｈ　ｂｒｏｏｍ）； 　シバムギ（Ａｇｒｏｐ−ｙｒｏｎ　ｒｅｐｅｎｓ、Ｅｎｇｌｉｓｈ　ｃｏｕｃ ｈ）　；カモジグザ（Ａ、ｃｒｉｓｔａｔｕｍ）　；ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ　 ｃｅｒｅａｌｅ、ｒｙｅ）；パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｍ） 麦。グループ２．イチゴシナギ属ニオーチャードグラス（Ｄａｃｔｙｌｉｓ　ｇ ｌｏｍｅｒａｔａ。

ｏｒｃｈａｒｄ　ｇｒａｓｓ　ｏｆ　ｃｏｃｋｓｆｏｏｔ）；ヒロハノウシノケ グサ（Ｆｅｓｔｕｃａ　ｃｌａ−ｔｉｏｒ、ｍｅａｄｏｗ　ｆｅｓｕｃｅ）；ボ ッムギ（Ｌｏｌｉｕｍ　ｐｅｒｅｎｎｅ、ｐｅｒｅｎｎｉａｌ　ｒｙｅｇｒａ− ｓｓ）　；ネズミムギ（Ｌ、ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ、　Ｉｔａｌｉａｎ　ｒｙ ｅｇｒａｓｓ）；ナガハグサ（Ｐｏａｐｒａｔｅｎｓｉｓ、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ　 ｂｌｕｅｇｒａｓｓ）；イチゴツナギ（Ｐ、　ｃｏｍｐｒｅｓｓａ。

ｆｌａｔｔｅｎｅｄ　ｍｅａｄｏｗ　ｇｒａｓｓ）；エンバク（Ａｖｅｎａ　５ ａｔｉｖａ、ｏａｔ）；シラゲガヤ（Ｈｏｌｃｕｓ　１ａｎａｔｕｓ、ｖｅｌｖ ｅｔ　ｇｒａｓｓ又はＹｏｒｋｓｈｉｒｅ　ｆｏｇ）；　ハルガヤ（Ａｎｔｈｏ ｘａｎｔｈｕｍ　ｏｄｏｒａｔｕｍ、ｓｗｅｅｔ　ｖｅｒｎａｌ　ｇｒａｓｓ） ；オオカニツリ（Ａｒｒ−ｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ　ｅｌａｔｉｕｓ、ｏａｔ　ｇ ｒａｓｓ）；コヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ　ａｌｂａ、　ｒｅｄｔｏｐ）　； オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ　ｐｒａｔｅｎｓｅ、　ｔｉｍｏｔｈｙ）；フサ ヨシ（Ｐｈａｌａ−ｒｉｓ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ、　ｒｅｅｄ　ｃａｎａｒ ｙ　ｇｒａｓｓ）　ｅキビ属草類（Ｐａｎｉｃｏｉｄｇｒａｓｓ）　；バヒアグ ラス（Ｐａｓｐａｌｕｍ　ｎｏｔａｔｕｍ、Ｂａｈｉａ　ｇｒａｓｓ）；メリケ ンカルカヤ属草類（Ａｎｄｒｏｐｏｑｏｎｏｉｄ　ｇｒａｓｓｅｓ）　：セイバ ンモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ、Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｇｒａ ｓｓ）。

Ｌｏｌ　ｐ　［ｂ　、その少なくともｌフラグメント又はその誘導体の製造のた めに様々な発現ベクターを構築することができる。従って、本発明の更なる観点 はほそ麦（Ｌｏｌｉｕｍ　ｐｅｒｎｎｅ、　Ｌ、　）の花粉のアレルギー性タン パク質Ｌｏｔ　ｐＩｂ　、又はその誘導体もしくは同族体をコードするＤＮＡ配 列を含んで成る組換ベクターを提供する。より詳しくは、本発明は真核又は原核 系の複製起点、検出マーカー、ＬｏＩ　ｐ　［ｂ斜横成員又はその誘導体もしく は同族体、あるいはＬｏｌ　ｐ　ｒｂ科構成員又はその誘導体もしくは同族体に 対する抗体と交差反応性のアレルギー性タンパク質をコードするＤＮＡ配列、及 び任意的にＬｏｌ　ｐ　ｒｂ科構成員の転写を誘発させることの可能なプロモー ター配列を含んで成る組換ＤＮＡ分子に関する。

本発明はまたほそ麦花粉タンパク質のプロモーター、特にＬｏｌ　ｐ　［ｂ遺伝 子、例えばＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、１及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２をコードする遺伝子 のプロモーターにまで及ぶ。このプロモーターはＬｏｔ　ｐ　Ｉｂ遺伝子発現を 発展的に調節し、そしてこれは器官、即ち、花粉特異性である。本明細書で使用 している発展的調節とは、特定の形質、この場合においては植物のライフサイク ル中の一定の段階中での花粉におけるアレルゲン性タンパク質の発現及び他の段 階中での非発現を意味する。従って、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂプロモーターは、Ｌｏｔ 　ｐ　Ｉｂ又は任意のその他の遺伝子又はそれに関連するヌクレオチド配列の発 現を、花粉の発育中のみに可能とするのに極めて有用である。当業者は花粉形成 中の特定の形質の選択的な発現におけるかかるプロモーターの重要性を直ちに認 識するであろう。

従って、本発明は花粉の発育又は機能を阻害し、それ故イネ科の植物、そして特 にボッムギにおいて核雄不稔性（ｎｕｃｌｅａｒ　ｍａｌｅ　５ｔｅｒ−ｉｌｉ ｔｙ）を誘発せしめる方法を提供し、この方法は下記の段階：ａ）組換ＤＮＡ分 子であってその上に載っているほそ麦プロモーター配列又はその同族体もしくは 縮重体及びイネ科に由来する細胞の中で有害な機能を有するポリペプチドをコー ドするヌクレオチド配列を含んで成る分子を保有する植物を発育させ（前記ヌク レオチド配列は前記プロモーターより転写可能であり、そして前記組換ＤＮＡ分 子は花粉生産細胞の中に安定的に含まれている）、次いでｂ）前記植物を、前記 プロモーターから前記ヌクレオチド配列の発現を引き起こさせるよう、その発育 段階にとって十分な条件及び時間にわたって成長させ、これにより花粉形成が阻 害されるか又は前記花粉が不活性されるように前記花粉生産細胞の中で有害な機 能を有するポリペプチドを生産させること：を含んで成る。

組換ＤＮＡ分子を植物細胞の中に導入するためよく樹立された方法が存在し、例 えばアゲロバクチリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）プラスミド及びエレクト ロポレーションかとりわけ利用される。ポリペプチドに関する「有害な機能」と は、細胞増殖を阻害する、細胞の溶解を引き起こす、又は細胞における様々な機 能を阻害して、細胞の正常な機能を阻止するであろう前記ポリペプチドの特徴を 意味する。この場合、有害な機能を有する致死的遺伝子構築体が考慮され、これ は花粉形成を阻害又は阻止し、それ故雄不稔性植物をもたらす。かかる［致死的 遺伝子Ｊはいろいろな分子のなかでとりわけ酵素、酵素インヒビター及び／又は 毒性ポリペプチドをコードしつる。他方、この致死遺伝子はｍＲＮＡの特定の種 であってその翻訳生成物が花粉の発育にとって不可決であるものの翻訳を阻害す ることの可能なアンチセンスＲＮＡをコードしつる。

雄不稔性植物はバイブリド穀類変種を開発するうえで特に有用である。

Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂプロモーターはプロモータープローブベクター、　「染色体歩 行」及びＳｌヌクレアーゼ地図化、並びに転写開始部位の上流のＤＮＡのンーケ ンシングの利用を含む任意の数の手順によってほそ麦ゲノムＤＮＡから単離可能 である。

従って、本発明は組換ＤＮＡ分子であって、この分子の上に載っているほそ麦花 粉プロモーター配列、そして特にＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ科構成員、又はその同族体も しくは縮重体をコードする遺伝子にとってのプロモーターを含んで成り、そして 前記プロモーターの下流に１又は複数の制限エンドヌクレアーゼを有しており、 これによりｌ又は複数のこれらの部位の中に挿入されたヌクレオチド配列が正し い解読枠において転写可能であり、それ故発育的に調節された花粉特異性発現ベ クターである組換ＤＮＡ分子を提供する。本明細書で使用する「正しい解読枠ｊ とは「相中（ｉｎ　ｐｈａｓｅ）　Ｊと同じ意味を存する。

上述のＤＮＡ分子がその上に選別マーカー、例えば抗生物質又はその他の薬剤耐 性遺伝子、例えばアンピシリン、カーペニシリン、テトラサイクリン、ストレプ トマイシンに対する耐性をコードする遺伝子を含むことも好ましい。この組換分 子は更に原核及び／又は真核細胞における安定な遺伝のための手段を更に含んで 成るであろう。

これは発現ベクターについて以降で説明するように前記組換分子が真核及び／又 は原核系複製起点を保有することによって達成されつる。

他方、この組換分子は宿主細胞ゲノムへの組込みのための手段を保育することが あり、これにより前記組換分子の複製が前記宿主細胞ゲノムの複製と同時進行す ることが可能となる。好ましい原核宿主の例にはε、ココリバチルス（Ｂａｃｊ 　１ｌｕｓ）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄ−ｏｍｏｎａｓ）がとりわけ含ま れる。好ましい原核宿主には酵母及び菌類、昆虫、哺乳動物及び植物に由来する 細胞が含まれる。更により好ましい宿主細胞はイネ科の植物、そして特にドクム ギ属の植物、例えばボッムギの植物である。好ましい態様に従い、Ｌｏｌ　ｐ　 ｌｂ遺伝子プロモーターとそれに対応して位置する有害な機能をコードする遺伝 子は、イネ科又はボッムギに由来の植物の細胞のゲノムの中に組込まれることの 可能な組換ＤＮＡ分子により保存されるであろう。がかる組換ＤＮＡ分子は前述 の細胞に例えばエレクトロポレーシヨンによって移入される。実際には、前記細 胞はカルス由来細胞である。

前記組換ＤＮＡ分子で形質転換された前記カルス由来細胞はこれにより完全植物 の中へと再生されることが可能となる。全体植物のライフサイクルの花粉発育段 階に入ったそれは、１．、ｏｌ　ｐ　Ｉｂ遺伝子プロモーターの機能化、ぞれ故 有害機能をコードする遺伝子の発現を可能とする。従って、花粉発育は阻害又は 阻止され、そしてそれより核緩不稔性植物が得られる。

他方、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂプロモーターは好都合な機能、例えばサイト力仁二ンを 有する遺伝子の発現をもたらすであろう。かかる組換ＤＮＡ分子の全てが本発明 に包括される。

本発明は、国際特許用！ｉ　ＰＣＴ／ＡＵ８９１００１２３号に記載の方法に従 って生成された、Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂ又は組換もしくは合成的に生成されたＬｏｌ 　ｐ　Ｉｂもしくは精製天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂの少なくとも１フラグメントに対 するモノクローナル及びポリクローナル抗体、並びにその中に説明しであるイム ノアッセイ及びテストキットにおけるそれらの利用に及ぶ。

Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂクローンに関するｅＤＮＡライブラリーをスクリーンする本研 究において利用したモノクローナル抗体は様々な近縁草種の花粉由来のアレルゲ ン性タンパク質と交差反応性を示した。このことは、これらの花粉により生成さ れたアレルゲン性タンパク質と、１、ｏｆ　ｐ　Ｉｂタンパク質アレルゲンとの 間での相同性を示唆し、全ての近緑草類への本発明の応用性を裏付けている。本 発明はまた、組換Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質アレルゲン、並びにその化学合成 誘導体を含むその誘導体、同族体及び免疫学的関連物に関する。下記の説明にお いて、Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂタンパク質アレルゲンについての言及はその誘導体、同 族体及び免疫学的関連物、並びにそれらの化学合成誘導体を含んでいる。下記の 説明は精製Ｌｏｌ　ｐ　ｆｂ並びにそのフラグメント、誘導体及び同族体に対し て特異的な抗体も含む。かかる抗体は特に治療的又は診断的手法のモニターの際 の、及び組換又は合成的に生成したＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ科構成員又は天然Ｌｏｌ　 ｐ　Ｉｂの精製におけるＬｏｌ　ｐＩｂタンパク質アレルゲンについての検出ア ッセイ（イムノアッセイ）の開発において有用であると考えられる。これらの抗 体はモノクローナル又はポリクローナルであってよい。更に、本発明の範囲にお いて」二連の第１の抗体に対する任意の第２抗体（モノクローナル又はポリクロ ーナル）か含まれる。本発明は更に、検出アッセイにおける、及び例えば診断用 の又は投与した薬品製剤の効果をモニターするうえでのこれらの第１又は第２抗 体の使用を更に考慮している。更に、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質アレルゲンに 複合した任意の分子に対する抗体か本発明の範囲に含まれる。従って、ｌ、ｏｆ 　ｐ　Ｉｂタンパク質アレルゲンに対する抗体は、かかるＬｏｌ　ｐ　Ｉｂタン パク質アレルゲン、又はそのアレルゲン部分、並びに任意の会合分子（例えば脂 質領域、キャリヤー分子、融合タンパク質等）に対する抗体を包括する。

本明細書で考慮しているＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ科構成員又はそのフラグメントは精製 して抗体製造において利用される。ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両 者は組換、合成又は天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質料構成員による免疫によっ て獲得でき、モしてぃづれのタイプもイムノアッセイに有用である。両タイプの 血清を獲得する方法は当業界に公知である。ポリクローナル血清はあまり好まし くないが、適当な実験動物に有効量の精製Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ科構成員又はその抗 原性部分を注射し、この動物から血清を集め、次いで任意の公知の免疫収着技術 によって特異的な血清を単離することにより比較的簡単に調製できる。この方法 により生成した抗体は事実上あらゆるタイプのイムノアッセイに有用であるが、 それらは生成物の潜在的な不均質性のため一般にあまり好ましくない。

イムノアッセイにおけるモノクローナル抗体の利用はそれらを大量に、且つ均質 な生成物で製造できる能力のために極めて好ましい。

不死細胞系と免疫原調製品に対して感作せしめたリンパ球との融合に由来するモ ノクローナル抗体の生産のためのハイブリドーマ細胞系の製造は当業者に公知の 技術によって成し遂げられうる（例えばポリクローナル血清の調製とは異なり、 動物の選択はリンパ球と融合できる適切な不死細胞系の入手性に依存する。マウ ス及びラットがハイブリドーマ技術における選り抜きの動物であり、そして好適 に利用されている。ヒトも、適当な不死化ヒト（又は非ヒト）細胞系が入手でき るなら感作リンパ球にとっての起源として利用できる。本発明の目的のため、選 ばれた動物に約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇの精製組換又は天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ又 はその一部分を注射することができる。

通常、注射物質はフロイントの完全アジュバントの中に乳化させておく。ブース ティング注射も必要でありうる。抗体生産の検定は適当なラベル化抗体による抗 血液の検査によって実施されつる。リンパ球は感作動物の牌謙又はリンパ腺を無 菌状態で取出すことにより獲得でき、次いて融合を実施する。他方、リンパ球は 例えばＲｅａｄｉｎｇ（１９８２）Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ５３ ：　２６１−２９１に記載の通りインビトロで刺激又は免疫することかできる。

融合に適切な数多くの細胞系が開発されており、そしてハイブリダイゼーショ〉 プロトコールにとっての任意の特定の細胞系の選択は数多くの基準、例えば増殖 特性の速さ、均質性、増殖培地の成分のためのその代謝欠陥、及び良好な融合頻 度についての能力により誘導される。

種内バイブリド、特に類似の株間でのバイブリドは種間融合より優れている。い くつかの細胞系が有用であり、それにはミエローマイムノグロブリンを分泌する 能力の損失について選ばれた突然変異体が含まれる。

細胞融合はウィルス、例えばニブスティン−バーもしくはセンダイウィルス、又 はポリエチレングリコールのいづれかにより誘発されうる。ポリエチレングリコ ール（ＰＥＧ）は哺乳類体細胞の融合にとって最も効果的な試薬である。ＰＥＧ 自体は細胞にとって毒性であり、従って融合を試み前にその生存性に及ぼす影響 について様々な濃度で検査すべきである。ＰＥＧの分子量域は１．０００〜６． ０００に変動しうる。それは食塩水又は無血清培地の中に約２０％〜約７０％（ Ｗ／Ｗ）に希釈したときに最良の結果を供する。３７”Ｃで約３０秒間ＰＥＧに 暴露することが、ネズミ細胞を利用する本ケースにおいて好ましい。極端な温度 （即ち、約４５°Ｃ）は回避し、そして融合系の各成分を融合前に３７℃でブレ インキュベーションに付すことが有用でありうる。

リンパ球、対、悪性細胞の比は牌臓細胞間の細胞融合を回避するように最適化し 、そして約１．１〜約１：１０が通常利用される。

有効に融合した細胞は当業界に公知の方法によってミエローマ細胞系から分離で きる。最も一般的、且つ好ましい方法は、ピポキサンチングアニンホスホリボシ ルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＰＴ）欠陥であり、バイブリドの増殖のみを可能 とするのに用いられるアミノプテリン−含有培地（これはＩ　Ｘｌ０−’Ｍのヒ ボキサンチン、ｌＸｌ０−’Ｍのアミノプテリン及び３　Ｘ　１０−’Ｍのチミ ジンより一般的に成り、そしてＨＡＴ培地として一般に知られている）の中で増 殖しない悪性細胞系を選択することである。融合混合物は融合の直径又は２４時 間経てＨＡＴ含有培養培地の中で増殖させてよい。供給スケジュールは通常１（ ＡＴ培地の中で２週間維持し、次いでレギュラー培養培地又はヒボキサンチン、 チミジン含存培地を供給することを包括する。

増殖するコロニーを次に抗原調製品を認識する抗体の存在について検査する。ハ イブリドーマ抗体の検定は、抗原を固相支持体に結合させ、次いで推定抗体を含 むハイブリドーマ上溝液と反応させるアッセイを利用して実施できる。抗体の存 在は様々な・インジケーターを利用するｒサンドイッチＪ技術により検出されつ る。はとんどの一般的な方法がバイブリド増殖中に分泌される抗体の濃度の範囲 において、使用するのに十分に高感度である。

バイブリドのクローニングは選択培地の中での増殖の２１〜２３日目以降に実施 できる。クローニングは液相中での細胞限界希釈により、又は半固形アガロース の中で増殖する単一細胞を直接選別することにより実施できる。限界希釈に関し て、細胞懸濁物をｌウェル当り１個のみの細胞を統計学的確率で存するように系 列的に希釈する。

アガロース技術に関して、バイブリドを供給細胞を含む下層の上の半固形上層の 中に植え込む。この上層からコロニーを拾い、そして事実上ウェルにまで移動さ せる。

抗体分泌性バイブリドは様々な組織培養フラスコの中で増殖でき、様々な抗体濃 度を有する上溝液をもたらす。より高めの濃度を得るために、バイブリドを動物 の中に移入して炎症腹水を獲得することができる。抗体含有腹水は腹膜腔内注射 の８〜１２日後に回収できる。

この腹水は高めの濃度の抗体を含むが、しかし炎症腹水に由来するモノクローナ ル及びイムノグロブリンの両方を含む。従って抗体精製を例えばアフィニティー クロマトグラフィーにより実施してよい。

患者血清、植物又は哩乳類組織もしくは組織抽出物中の本明細書で考慮している Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質又はそれに特異的な抗体の存在は上記の通りに調製 したモノクローナル又はポリクローナルのいづれかの抗体を利用して、事実上あ らゆるタイプのイムノアッセイにおいて検定できる。広範囲にわたるイムノアッ セイ技術が有用であり、これは米国特許第４．０１５．０４３号、第４．４２４ ．２７９号及び第４、０１８．６５３号を参照することで理解できる。むろんこ れは一部位及び二部位又は「サンドイッチ」、非競合型のアッセイ、並びに伝統 的な競合結合アッセイを含む。サンドイッチアッセイはとりわけ最も有用であり 、且つ一般的に利用されているアッセイであり、そして本発明における利用に好 適である。数多くのバリエーションのサンドイッチアッセイ技術が存在し、そし て本発明に包括されることを意図している。簡潔すると典型的な前進アッセイに おいて、未ラベルの抗体を固相支持体に固定化し、次いで試験すべきサンプルを この結合分子と接触させる。抗体−抗原二次複合体の形成を可能とする十分なる 時間にわたる適当なインキュベーション時間の後、検出可能なソゲナルを供する ことの可能なリポータ−分子でラベル化された二次抗体を次に加えて、そして抗 体−抗原−ラベル化抗体（例えば抗体−Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質−抗体）の 三次複合体の形成にとって十分な時間インキュベートする。任意の未反応物質は 洗い出し、そして抗原の存在をこのリポータ−分子により生ずるシグナルの観察 により決定する。この結果は識別可能なシグナルの簡単な観察により定性的とす るか、又は既知量のハブテンを含むコントロールサンプルとの比較により定量と するかのいづれでよい。前進アッセイにおけるバリエーションには、サンプルと ラベル化抗体を同時に結合抗体に加える同時アッセイ、又はラベル化抗体と試験 すべきサンプルをまず組合せ、インキュベートし、次いで結合抗体に同時に加え る逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）アッセイが含まれる。これらの技術は当業者に公知であ り、あらゆるわずかなバリエーションは容易に理解されるであろう。

下記の説明はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂを検出することを考慮しているが、これはＬｏｌ 　ｐ　Ｉｂに対する抗体を検出するのにも同様に利用でき、従ってその十分なる 説明であることを意図している。典型的な前進サンドイッチアッセイにおいて、 本発明で考慮しているＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ又はその抗原性部分に対する特異性を有 する第一抗体を固相表層に共有的に又は不動的（ｐａｓｓｉｖｅｌｙ）のいづれ かで結合させる。この固相表層は典型的にはガラス又はポリマーであり、最も一 般的に利用されているポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、 ポリスチレン、ポリビニルクロリド又はポリプロピレンである。この固相支持体 はチューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスクの形状、又はイムノアッセイ を実施するのに適切なその他の表層の形状であってよい。その結合工程は当業界 に公知であり、そして一般には架橋性共有結合又は物理的吸着より成り、ポリマ ー−抗体複合体は試験サンプルのための調製品の中で洗われる。次に試験すべき サンプルのアリコートを固相複合体に加え、そして抗体の中に存在している任意 のサブユニットの結合を可能とする十分な時間にわたって２５°Ｃでインキュベ ートする。このインキュベーション時間は一般に約２〜・１０分の範囲において 変えられるであろう。このインキュベーション時間の後、抗体サブユニット固相 を洗い、乾かし、そしてハブテンの部分に特異的な第二抗体とインキュベートす る。この第二抗体は、ハブテンへの第二抗体の結合を指標するのに用し）るリポ ータ−分子に結合されている。

本明細書に使用している「リポータ−分子Ｊとは、分子であってその化学的性質 により、抗原−結合抗体の検出を可能とする分析的に同定可能なシグナルを提供 する。検出は定性的又は定量的であってよい。このタイプのアッセイにおける最 も一般的に利用されているリポータ−分子は酵素、蛍光団又は放射性核種含存分 子（即ちラジオアイソトープ）である。酵素イムノアッセイの場合、酵素を第二 抗体に、一般にはグルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸を介してコンジュゲートさ せる。しかしながら、既に周知の通り、当業者に既に有用である広範囲にわたる 様々なコンジュゲーション技術が存在している。一般的に使用されている酵素に はとりわけ西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベーターガ ラクトシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼが含まれる。特定の酵素と一緒に 利用すべき基質は対応の酵素による加水分解による検出可能な色調変化の発生に 関して一般的に選ばれる。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフヱートはアルカリ 性ホスファターゼコンジュゲートと一緒に利用するのに適する。ペルオキシダー ゼコンジュゲートに関しては、１，２−フェニレンジアミン、５−アミノサルチ ル酸又はトルイジンが一般に利用されている。上述の発色性基質ではなく、蛍光 生成物をもたらす蛍光性基質を利用することも可能である。全てのケースにおい て、酵素ラベル化抗体を第一抗体ノ１ブテン複合体に加え、結合させ、次いで過 剰の試薬を洗い出す。次に適当な基質を含む溶液を抗体−抗原−抗体の三次複合 体に加える。この基質は第゛二抗体に結合している酵素と反応し、定性的に識別 できるシグナルを供し、これは通常光学的に更に定量することができ、サンプル 中に存在しているハブテンの量の表示を供する。「リポータ−分子Ｊは例えば赤 血球細胞又はラテックスビーズ等の細胞凝集又は凝集阻害の利用にも及ぶ。

他方、蛍光化合物、例えばフルオロセイン及びローダミンを、その結合能力を変 えることなく抗体に化学結合させることができる。

特定の波長の光によるイルミネーションによって活性化させたとき、蛍光団−ラ ベル化抗体は光エネルギーを吸収し、分子における励起状態を誘発し、光学穎微 鏡で目視検可能な特徴的な色調での光の放射が続く。ＥＩＡの場合、蛍光ラベル 化抗体を第−抗体−ハブテン複合体に結合させる。未結合の試薬を洗い出した後 、残っている三次複合体を適当な波長の光に暴露させ、観察されるフルオロセイ ンは課題のハブテンの存在を示唆する。イムノフルオロセンス及びＥＩＡ技術は 共に当業界において非常によく樹立されており、そして本方法にとって特に好ま しい。しかしながら、その他のリポータ−分子、例えばラジオアイソトープ、ケ ミルミネッセト又はバイオルミネッセント分子も利用できうる。熟練技術者にと って、その手順か必要な目的に合うのにとのようにすればよいかは容易に明らか となるであろう。以上は本発明の１．ｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質を直接的又は間 接的（即ぢ、抗体を介して）に検出するのに利用できることも明らかであろう。

従って、本発明の一観点は、血清、組織抽出物、植物抽出物又はその他の生物流 体の中に存在している１、ｏｌ　ｐ　ｉｂ又はその誘導体もしくは同族体、又は 前記１．ｏｌ　ｐ　ｌｂと免疫学的に反応性なアレルゲンタンパク質又はその誘 導体もしくは同族体を検出する方法を提供し、この方法は試験すべき前記血清、 抽出物又は流体を、前記Ｉ、０１ｐ　Ｉｂタンパク質と、アレルゲン性タンパク 質−抗体複合体が形成されるのに１分なる時間及び条件のもとで接触させ、次い で前記複合体を検出手段に付する段階を含んで成る。本発明はまた、血清又はそ の他の生物流体中の、イネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）の花粉に由来するアレルゲ ン性タンパク質に対する抗体を検出する方法を提供し、この方法は前記血清又は 流体をＬｏｉ　ｐ　Ｉｂタンパク質又はその誘導体もしくは同族体、又はその抗 原性誘導体と、抗体−Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ複合体が形成されるのに十分なる時間及 び条件のもとで接触させ、次いて前記複合体を検出手段にけすることを含んで成 る。この後者の複合体はリポータ−分子の付加されているＬｏｌ　ｐ　Ｉｂタン パク質により、又はリポータ−分子でラベル化された第二抗体の添加により検出 されつる。

従って、本発明は哺乳動物体液（例えば血清、組織抽出物、組織流体）、インビ トロ細胞培養上清液及び細胞リゼート中の、Ｌｏｌ　ｐ　［ｂ又はその誘導体、 同族体もしくは免疫学関連物に対する抗体についての迅速、且つ簡単なアッセイ のためのキットにも向けられる。このキットは抗原性成分に適合する第１容器、 及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂに対する抗体を含むように適合された第２容器を受容する ように区画化されており、前記抗体は上述した検出可能シグナルを供することの 可能なリポータ−分子でラベル化されている。もしこのリポータ−分子が酵素な ら、前記酵素にとっての基質を含むように適用された第３容器が施されている。

課題のキットの典型的な用途において、試験すべきサンプルを第１容器の内容物 と、サンプルの中に存在しているならば抗体が前記第１容器の中のＬｏｌ　ｐ　 Ｉｂタンパク質に結合する時間及び条件のもとで接触させる。もし第１容器のＬ ｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質か試験流体中の抗体と結合したら、第２容器の抗体は 第二次複合体に結合して三次複合体を形成し、そしてこれらの抗体はリポータ− 分子でラベル化されているため、検出手段に付されたとき、この三次複合体は検 出される。従って、本発明の一観点はアレルゲン性質を存するタンパク質に対す る抗体の検出のためのキットであり、前記タンパク質はイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅ ａｅ）の花粉に由来しており、このキットは組換Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質又 はその抗原性誘導体もしくは同族体又は精製天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂタンパク質又 はその抗原性誘導体もしくは同族体を含むように適合された第１容器、及びＬｏ ｌ　ｐ　［ｂ又はその誘導体もしくは同族体に対する抗体を含むように適合され た第２容器を受容するように区画化されており、前記抗体は検出可能シグナルを 供することの可能なリポータ−分子でラベル化されている。「リポータ−分子」 はラテックスビーズ上での赤血球細胞（ＲＢＣ）の凝集を包括する。このキット において、リポータ−分子はラジオアイソトープ、酵素、蛍光分子、ケミルミネ ッセント分子、バイオルミネッセント分子又はＲＢＣである。他方、このキット は検出可能なシグナルを供することの可能なリポータ−分子でラベルされた組換 Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ又はその抗原性誘導体もしくは同族体を含むように適合された 容器を含んで成る。

環境の中でのアレルゲンの存在のため、枯草熱及び季節性ぜん息は、薬理学及び 免疫学における進歩にもかかわらず、西洋諸国に顕著な罹病率及び社会経済の影 響を及ぼし続けている。抗ヒスタミン及びステロイドを含む有効な薬剤スペクト ルがアレルギー疾患の処置における向上をもたらしているが、それらは長期使用 にかかわる望ましくない副作用を有する。これらの問題のため、アレルギー疾患 の免疫療法において新たな課題が示されている。免疫療法はアレルギー反応に対 する患者の脱感作のための花粉アレルゲン抽出物の注射を包括する（Ｂｏｕｓｑ ｕｅｔ、　＆　Ｍｉｃｈｅｌ（＋９８９）Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃ１１ｎ、　Ｉｍｍ ｕｎｏｌ。

Ｎｅｗｓｌ　：　７〜１０）。残念ながら、アレルゲンとして利用される花粉調 製品は多価であり、そして品質が良くない。従って、　ＩｇＧ応答を誘発させる ための使用濃度はしばしば高いが、しかしアナルフイラキシーを含む全身系反応 の誘発を通じて致死的となりうる。アレルゲンの配列に基づくクローン遺伝子生 成物又は合成ペプチドは治療にとってのより安全な媒体を供し、なぜならこれは 品質管理でき、特性化さねており、そして標準化されているからである。

症状の軽減に関する正確なメカニズムは仮説のままであり続けている。しかしな がら、本発明の組換、合成又は精製天然Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂ、又はその少なくとも ｌフラグメントを含んで成る調製品の、はそ受感受性個体への投与は、例えばＬ ｏｌ　ｐ　ｌｂに対するＢ細胞応答、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂに対するＴ細胞応答、又 はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂに対するＢ細胞及びＴ細胞の両者の応答を改善せしめること により、はそ麦花粉アレルゲンに対するほそ麦花粉感受性個体のアレルギ一応答 を改善せしめるであろう。

現状、免疫療法はアレルギー学における最も頻繁に利用される処ことであり、一 方薬理療法は患者の一生にわたって実施されねばならない。免疫療法のために花 粉抽出物の付与された患者は処置の終了後４年間続く臨床的恩恵を受けた（Ｇｒ ａｍｍｅｒら（＋９８４）　Ｊ、ＡｌｌｅｒｇＹＣｌ　ｉｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ 、　７３　：　４８４−４８９）。

ヒトの集団におけるほそ麦花粉アレルゲンＬｏｌ　ｐ　■及びＬｏｔ　Ｉｌ　ｍ に対する免疫応答性は、組織適合性白血球抗原ＨＬＡ　−ＤＲ３と顕著に抗原表 示細胞のＨＬＡ−ＤＲ３コード化クラりＩＦ　ｌａ分子が他のアレルゲン上に存 在している類似のイムノドミナントＴ細胞／ｒａ認識部位を認識しうることを意 味している。Ｌｏｔ　ｐ　ｌａはＬｏｌ　ｐＩ［及びＬｏｌｐ■の両者と、イム ノドミナントＴ細胞／Ｉａ認識部位（ＹＴＴＥＧＧＴＫＳＥＶＥＤＶ　ＩＰ）を 共有することで知られている（Ｆｒｉｅｄｈｏｆｆら、前掲）。

Ｌｏｔ　ｐ　ＩＩ及び■に応答するほとんどのアレルギー個体がＬｏｌ　ｐ　Ｉ ａにも応答するか、その逆はない。従って、ｌ、ｏｌ　ｐ　ＩａはＬｏｌ　ｐ　 ＩＩ又は■に存在しない固有のＴ細胞／Ｉａ認識部位を有することが明らかであ る。更に、Ｌｏｌｐｌａ、ＩＦ及び■で共有されている共通のＴ細胞／Ｉａ認識 部位はＬｏｔ　ｐ　Ｉｂ、Ｉ又はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２の推定配列の中には示さ れていない。

従って、本発明は草類花粉に基づくアレルギーに対してヒトを脱感作せしめるた めのワクチンを開発するうえで有用な、　Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ科のタンパク質アレ ルゲン、　Ｌｏｌ、　ｐ　ＩａとＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、ｌ　との間での共通の抗原 性エピトープを含む誘導体を含むその誘導体、その同族体又は免疫学的関連物に 向けられている。

従って、本発明は草類花粉に対するヒトのアレルギーを脱感作させるための方法 を提供し、この方法は脱感作有効量のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ又は少なくとも１フラグ メント、又はその誘導体、同族体もしくは免疫学的関連物を前記ヒトに、草類花 粉に対するこのヒトの脱感作を及ぼすのに十分な時間及び条件のもとで投与する ことを含んで成る。

本発明は更に、はそ麦花粉に感受性な哺乳動物中のかかる花粉に対する感受性を 処置する方法を提供し、この方法はこの哺乳動物に治療的に有効な量の本発明の 治療組成物を投与することを含んで成る。本発明は更にほそ麦花粉アレルゲン又 はほそ麦花粉アレルゲンと免疫学的に交差反応性なアレルゲンに対する感受性を 処置する方法を提供し、この方法は哺乳動物に治療的に有効な量の本発明の前記 タンパク質調製品を投与することを含んで成る。

本発明のペプチド及びタンパク質の利用を通じて、両立された、よく規定された 組成及び生物活性の調製品を作ることができ、そして治療目的のために投与され うる（例えば、はそ麦植物の花粉に対するほそ麦感受性個体のアレルギ一応答を 改善せしめる）。かかるペプチド又はタンパク質の投与は、例えばＬｏｌ　ｐ　 Ｉｂアレルゲンに対するＢ細胞応答、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂに対するＴ細胞応答、又 はその両者の改善せしめうる。精製ペプチドは、はそ麦アレルギーの免疫療法の メカニズムを研究するため、及び免疫療法において有用な改良誘導体又は類似体 をデザインするためにも利用されつる。

従って、本発明は、治療的に有効な量のＬｏｌ　ｐ　ｒｂ又はその誘導体、同族 体もしくは免疫学的関連物、並びに１又は数種の薬理学的に許容されている担体 及び／又は希釈剤を含んで成る薬理学組成物を提供する。Ｌｏｌ　ｐ　Ｔｂを含 んで成る薬理学組成物の活性成分は例えば特定ケースに依存する量で投与したと きのほそ麦花粉に対するヒトアレルギーの脱感作において、優れた治療活性を示 すと考えられる。例えば、日当り、体重キログラム当り約０．５μｇ〜約２０ｍ ｇを投与することができる。投与量は最適な治療応答が供されるように調節され つる。例えば、毎日数回に分けて投与してよく、又はその投与は治療亭状により 比率幻滅じられうる。該活性化合物は常用の方法、例えば経口、静脈内（この場 合水溶性）、筋肉内、皮下、鼻口内、皮肉もしくは半割ルート又は移植（例えば 遅延放出性分子を利用して）により投与されつる。投与のルートに依存して、本 発明の薬理学組成物を構成する活性成分はこの成分を酵素、酸及びこの成分を不 活性化せしめうるその他の自然の条件の作用から守皐るための材料の中でコート されている必要がありうる。例えば、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂは酵素インヒビターと一 緒に投与されるアジュバントにおいて、又はリポソームにおいて投与されうる。

アジュバントは広域な意味において使用され、そして任意の免疫刺激性化合物、 例えばインターフェロンが含まれる。本明細書で考慮しているアジュバントには レソルシノール、非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエ ーテル及びｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルが含まれる。酵素インヒビタ ーには膵臓トリプシンが含まれる。リポソームには水中油中水ＣＧＦエマルショ ン及び常用のリポソームが含まれる。Ｔ細胞アネルギーを誘発せしめる目的のた め、該薬理学組成物は非免疫原状態（例えばアジュバントを含まない状態）で投 与されるのが好ましい。

該活性化合物は腸管外的又は非腸管外的に投与もされうる。分散体はグリセロー ル、液状ポリエチレングリコール及びその混合物、及び油中の中で調製もされつ る。保管及び使用の通常の条件のもとで、これらの調製品は微生物の増殖を防ぐ ために防腐剤を含む。

注射使用に適切な薬理形態には無菌水性溶液（この場合水溶性）又は分散体、及 び即度分散体の無菌粉末が含まれる。全てのケースにおいて、この形態は無菌で なくてはならず、そして容易な注入性があるほどに流動性でなくてはならない。

それは製造及び保管の条件のもとて安定でなくてはならず、そして微生物、例え ば細菌及び菌類の汚染作用に対して保護されていなくてはならない。その担体は 溶媒であるか、又は分散媒体であって例えば水、エタノール、ポリオール（例え ばグリセロール、ポリプロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコール等 ）、適当なそれらの混合物及び植物油を含むものであってよい。適度な流動性は 例えばレシチンのようなコーティングの利用により、分散体の場合は所望の粒径 の維持により、及び界面活性剤の使用により維持できうる。微生物の作用の保護 は様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、 ソルビン酸、チメロザール（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）等によってもたらされうる 。数多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含ませることが好まし いであろう。注射用組成物の長期吸収は吸収を遅らせる試薬の組成物、例えばモ ノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物の利用によりもたらされつる 。

滅菌注射用溶液は必要量の活性化合物を、適当な溶媒の中に、上記した必要な様 々なその他の成分と一緒に含ませ、次いて滅菌濾過することによって調製される 。一般に、分散体は様々な滅菌活性成分を、塩基性分散媒質及びその他の必要な 」１記の成分を含む滅菌媒体の中に含ませることによって調製される。滅菌注射 用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好適な調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥 技術であり、これは予め滅菌濾過した溶液に由来する活性成分と任意の追加の所 望成分の粉末をもたらす。

少なくとも１種のＬｏｔ　ｐ　Ｉｂ科構成員又はその少なくとも１フラグメント が上記の通りに適当に保護されているとき、この活性成分は例えば不活性希釈剤 と一緒に、もしくは同化性食用担体と一緒に経口投与されるか、又はそれはハー ドもしくはソフトシェルゼラチンカプセルの中に密閉されているか、又はそれは 錠剤へと圧搾されているか、又は栄養食品に直接一体化されて投与されつる。経 口治療投与に関して、この活性化合物には賦形剤が一体化されてよく、そして消 化性錠剤、糖衣錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁物、シロップ、ウェ ーハー等の形態で使用されつる。かかる組成物及び調製品は少なくとも１重量％ の活性化合物を含むべきである。

この組成物及び調製品のパーセンテーゼはむろん約５〜８０重量％単位を含んで よく、そしてそれは好都合でありうる。かかる治療的に有効な組成物中の活性化 合物の量は適切な投与量が獲得されるであろう量である。本発明にかかわる好ま しい組成物又は調製品は経口投与単位形態が約１０μｇ〜２０００ｍｇの活性成 分を含むように調製される。

錠剤、トローチ、ビル、カプセル等は下記のものも含みうる：バインダー、例え ばガムトラガカンス、アカシア、コーンスターチ又はゼラヂン；賦形剤、例えば リン酸二カルシウム；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ポテトスターチ、アルギ ン酸等、潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；及び甘味料、例えばスクロ ース、ラクトースもしくはサッカリンを加えてよく、又は風味料、例えばペパー ミント、ウィンターグリーン油又はチェリー風味料を加えてよい。

その投与単位形態がカプセルのとき、それは上記のタイプの材料の他に、液状担 体を含んでよい。様々なその他の材料がコーティングどして、又はそうでなけれ ばこの投与単位の物理形態を変えるように存在していてよい。例えば、錠剤、ビ ル又はカプセルにシェラツク、糖又はその両者をコートしてよい。シロップ又は エリキシルは該活性化合物、甘味料としてのスクロース、防腐剤としてのメチル 及びプロピルパラベン、着色料及び風味料、例えばチェリー又はオレンジフレー バーを含んでよい。むろん、任意の投与単位形態を調製するうえで使用される任 意の材料は薬理学的に純粋であり、且つ使用量において実質的に無毒であるべき である。更に、該活性化合物は持続放出型調製品及び製剤の中に含ませてよい。

本明細書で用いる［薬理学的に許容されている担体及び／又は希釈剤］には、あ らゆる溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延 剤等が含まれる。薬理活性物質のためのかかる媒質及び試薬の利用は当業界に公 知である。任意の常用の媒質又は試薬が該活性成分と非適合性でない限り、治療 的組成物におけるその利用は考慮される。補助活性成分も本組成物の中に含ませ てよい。

投与し易い及び均一な投与量のための投与単位形態において非経口組成物を配合 することが特に好都合である。本明細書で用いている投与単位形態とは処置すべ き哺乳動物対象体にとっての単位的な投与に適合した物理的に独立した単位を意 味する。各単位は、必要とされる薬理担体と一緒に所望の治療効果を供するよう に計算された予め決定された量の活性物質を含む。本発明の新規な投与単位形態 についての仕様は、（１）活性物質の固有の特徴及び達成すべき特定の治療効果 、並びに（ｂ）身体の健康が本明細に詳しく開示されている通りに損われている 疾患症状を有する生体対象体における疾患の処置のためにかかる活性物質を配合 する当業界における固有の拘束により指定され、且つ直接依存する。

該主要活性成分は前記に開示した投与単位形態において適当な薬理学的に許容さ れている担体と共に有効な量で好適、且つ有効な投与のために配合される。投与 単位形態は例えば、約ｌｏμｇ〜約２．０００ｍｇの範囲する量の主要活性化合 物を含みつる。比率で表わすと、この活性化合物は約１０μｇ〜約２．０００　 ｍｇ／担体ｍ１で一般に存在している。補助活性成分を含む組成物の場合、その 投与量は前記成分の投与の用量及び方法を参考にして決定される。

本発明を下記の限定でない図面及び実施例により更に説明する。

実施例 粉のポリアデニル化ｍＲＮＡより調製した（Ｂｅａｌｌ　＆　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ （１９８６）Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　８６：　２１７−２２３ ）。このライブラリーをまずモノクローナル抗体（ＭＡｂ）ＦＭＣ−＾１（４０ ，１）でスクリーンした（図１ａ）。

フェノール法（Ｈｅｒｒｉｎ　ａｎｄ　Ｍｉｃｈａｅｌｓ（１９８４）Ｐｌａｎ ｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐ、。

２：２４−２８）によって成熟はそ麦花粉から単離したポリ（Ａ“）　ｍＲＮＡ をベクターラムダ−ｇｔｌｌ中のｃＤＮＡライブラリーを構築するために用いた 。次にこのライブラリーを抗体プローブでスクリーンし、グループＩタンパク質 を発現する配列を検定した。３Ｘ１０’の組換ファージのトランスフェクトされ たε、ココリ１０９０をプレートし、そして４２°Ｃで３ｈインキユベートした 。このプレートに１０ｍｍのＩＰＴＧに予め浸しておいたドライ１３２　ｍｍニ トロセルロース（ＮＣ）をかぶせ、そして３７°Ｃに移した。３ｈのインキュベ ーション後、これらのフィルターを慎重に剥し、そしてフィルター当り２０ｍ１ のＭＴＢＳ　（１０％Ｗ／Ｖの脱脂粉乳、５０ｍｍのトリス−ＨＣｌ　、　ｐＨ ７，６，１５０ｍＭのＮａＣ１）中で室温で３０ｍ１ｎインキユベートした。第 ２セツトのＮＣフィルターをファージプレートの上に置き、モして３ｈのインキ ュベーションの後、上記の通りに処理した。両セットのＮＣフィルターを、プラ ークに対するＭＡｂの結合性について、Ｈｕｙｎｈら（１９８５）ＤＮＡ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ、　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ、Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ 、Ｍ、（編）第１巻、頁４９〜７８、ＩＲＩ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ。

Ｅｎｇｌａｎｄに記載の方法によって試験した。抗体陽性プラークを拾い、精製 し、次いて再プレートに付し、そしてプローブに対する結合性について試験した 。陽性クローンをプラーク精製し、そしてほそ麦花粉アレルギ一対象体に由来す る血清を用いてＩｇＥ結合性について試験した。１日クローンが、Ｌｏｌ　ｐＩ 特異的Ｍａｂ及び＋ｇＥ抗体により認識されるタンパク質をコードするものとし て選ばれた（表１）。

最大のｃＤＮＡクローンであってサイズが１．２ｋｂであり、はそ麦アレルゲン タンパク質を発現するものを、更なる特性化及びシーケンシングのためにまず選 び、そしてクローンラムダ−１２Ｒと命名した（図はそ麦のグループ■アレルゲ ンを発現するｃＤＮＡクローンの特徴３　＋　＋　＋　６００ ４　＋　＋　＋　８００ １Ｏ−− 十十　最大結合 −二結合なし Ｍａｂ　１２．３はクローン１．２ＲによりコードされるＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、ｌ に対して高い親和力を示した。

［ｇＥ及びＭＡｂの特異性をほそ麦花粉タンパク質抽出物のイムノプロット分析 により試験した（図１ｂ）。

可溶性タンパク質を氷上のＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸ナトリウム中１５０　ｍＭ のＮａＣｌ、ｐＨ７，２）の中で３ｈ強く撹拌することによりほそ麦花粉がら抽 出した。花粉を溶液から遠心分離し、そして抽出タンパク質をバイオラッドアッ セイを利用して標準化せしめた。レーン当り１２０μｇのタンパク質を、１０− １５％Ｗ／Ｖの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの上で還元条件のもとて電気泳 動させた。タンパク質をＮＣフィルターにエレクトロプロットし、そしてそのプ ロットを１Ｏ％Ｗ／Ｖの脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭのトリス、１５０　ｍ ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７，９）でブロックした。そのプロットをストリップに切り 、そしてそれぞれを様々なプローブで処理した：　ＭＡりは１％のＢＳＡを含む ＴＢＳの中で１゜１０００に希釈しておいた。はそ麦花粉に対して高いＲＡＳＴ 評点を有する少なくとも４人の患者から集めた血清をプールし、そしてＩｇＥ結 合のためにＴＢＳ／　１％ｗ／ｖ　ＢＳＡの中で１．５に希釈して用いた。西洋 のワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化第二抗体を利用しくＤａｋｏｐａｔ ｔｓ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｍａｒｋ）　、そして洗浄後、結合を４−クロａ −１−ナフトール（Ｂｉｏｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）及びＨ８０，で 識別化させた。

イムノプロットをほそ麦花粉アレルギー個体由来のプール血清の中でインキュベ ーションすると、２８〜３５ｋＤの領域にわたって強いＩｇＥ結合が観察された 。この研究において用いたＭＡｂ　、３．２　、　＋２．３゜２１．３及び４０ ．１は既に部分的に特性化されている（Ｋａｈｎ　ａｎｄ　Ｍａｒｓｈ（１９８ ６）Ｍｏｌｅｃ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、２３　：　１２８１−２８８　；　Ｓｉｎ ｇｈ　ａｎｄ　Ｋｎｏｘ（＋９８５）Ｉｎｔｌ、　Ａｒｃｈ、　Ａｌｌｅｒｇｙ 　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　７８：　３００−３０４　； Ｓｍａｒｔ　ら（＋９８３）Ｉｎｔｌ、Ａｒｃｈ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　 Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、７２　：２４３−２４８）。ＭＡｂ３ ．２．２１．３及び４０．１は２８〜３５ｋＤ領域におけるタンパク質と強い反 応を示した。Ｍａｂ　１２゜３は３５ｋＤバンドとは結合性を示さなかったが、 それより低めのバンドと強く結合した。これらの相互作用はＩｇＥ及びＭＡｂの 両者が変性アレルゲンを認識することができることを示唆し、このことはそれら がＥ、コリの中で発現された組換タンパク質の検出にとってのプローブに適切で あるものとする。

ＭＡ［ｌ　ＦＭＣ−ＡｌはＬｏｌ　ｐ　Ｉａに対して優先的に強いことが考えら れていたが、それはＬｏｌ　ｐ　Ｉｂとも弱い度合いで結合した。新しいデータ ーは、オリジナルのＦＭＣ−ＡＩ調製品がモノクローナルではなくポリクローナ ルでありうることを示唆した。ＦＭＣ−Ａｌ調製品中の一抗体はしｏｆ　ｐ　！ ａに特異的であり、一方、あるものはＬｏｌ　ｐ　ｌｂに特異的であることが認 められた。従って、ＦＭＣ−ＡＩにより規定されるＬｏｌ　ｐ　ＩａとＬｏｌ　 ｐ　Ｉｂとの見かけ上の交差反応はこの抗体調製品におけるポリクローナル性を 反映しつる。

＋２Ｒインサートを含むラムダクローンの湿原培養物の誘発により生成されたア レルゲン−ベクターガラクトシダーゼ融合タンパク質をＭＡｂ４０．Ｉを用いる イムノプロット分析により特性化した。約１４６ｋＤのこの融合タンパク質は、 １１６　ｋＤのベーターガラクトシダーゼ及び３０ｋＤのアレルゲン−コード化 配列を含んで成ると考えられる。この融合タンパク質は低収量で生成された。従 って、更なる分析のためにクローン化アレルゲンの収量を高めるため、我々は別 の発現系を利用した。１．２ｋｂのインサートをｐＧＥＸ　１−３シリーズのプ ラスミド発現ベクターの中にサブクローンした。これらのプラスミドはシストツ マ　ジ士ボニカム（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）グルタチオ ンＳ−トランスフェラーゼタンパク質（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ、 　（１９８８）Ｇｅｎｅ、　６７　：　３１−４０）のカルボキシル末端を有す る融合ポリペプチドを供した。強力なＩｇＥ結合はｐＧＥＸ−１２Ｒにより形質 転換された細菌においてのみ検出され、そして親ｐＧＥＸプラスミドを有するも のにおいては検出されなかった（データーは示していないが、図４において類似 の結合性を示している）。はそ麦花粉に対する陰性ラジオアレルゴ収着（ＲＡＳ Ｔ）評点を有するコントロール血清によるウェスタンプロットのブロービングは ＩｇＥ結合を示さなかった。

実施例２−クローン化アレルゲン１２Ｒの同定この研究において用いた４種のＭ Ａｂは全てクローン化アレルゲン＋２Ｒを認識した（図１ａ）。

ＭＡｂは全て天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉタンパク質と同一の特異性を示さなかった（図 １６）　Ｉ、特に、ＭＡｂ　１２．３は３５ｋＤバンドを認識しなかった。クロ ーン化アレルゲンは全てのＭＡｂと結合するため、及びＭＡｂ　１２．３に対す る高い度合いで結合するため、クローン化アレルゲン低Ｍｒのタンパク質に対応 し、３５ｋＤタンパク質には対応しないものと予測される。この同定を確認する ため、パラ部位（ｐａｒａｓｉｔｅ）抗原に関して開発された免疫手法（例えば Ｂｅａｌｌ　＆　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ（１９８６）　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

アレルゲン１２Ｒをニトロセルロース膜上に固定化し、そして血清由来の特異的 なｒｇＥ抗体を結合せしめるために用いた。結合抗体を溶離させ、そしてほそ麦 花粉タンパク質のウェスタンプロットをプローブするために用いた。特異性及び 再現性の高い結合パターンが分子量３１及び３３ｋＤの２種のタンパク質成分に ついて複数の実験で常に獲得された。３５ｋＤのバンドはＬｏｌ　ｐ　ｌａと命 名し、そして３１及び３３ｋＤのバンドはＬｏｌ　ｐ　Ｉｂと命名した。これら の実験は、クローン１２Ｒに結合するＩｇＥ抗体が若干具なる分子量、３１及び ３３ｋＤの２つの成分を認識することを示した。非特異的結合は、非はそ麦花粉 アレルギー個体に由来するＩｇＥ抗体を用いたときも、又ＩｇＥ抗体を選別する ために非組換ｐＧＥＸプラスミドで形質転換されたＥ、コリの抽出物を用いたと きも観察されなかった。

Ｌｏｔ　ｐ　Ｉｂタンパク質を、−次方向において調製品を等電点電気泳動させ 、続いて集めた個々の両分を５ＤＳ−ＰＡＧＥに付することを包括する二次元分 析により精製した。この手順はＮ−末端配列を決定するのに十分な量てＬｏｔ　 ｐ　Ｉｂを分離させた（表２）。

表２ 報告されている配列と比較した、本研究において獲得側々のタンパク質成分を口 １−フｔ−（ＲｏｔｏｆｏｒＸＢｉｏｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ。

ＣＡ）上ての調製等電点電気泳動を利用して単離させた。これらのタンパク質を ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ上で分け、モしてＰＶＤＦ膜（Ｍｉ　１ｌｉｐｏｒｅ、　Ｂ ｅｄｆｏｒｄ。

ＭＡ）に移した。Ｎ−末端シーケンシングをＭａｔｓｕｄａｉｒａ（１９８７） 　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６２　：１００３５−１００３８及びＳｉｍｐｓｏｎら（＋９８ ９）Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇａｒ、４７６　：３４５−３６１に従って実施した 。

３１／３３ｋＤタンパク質のＬｏｌ　ｐ　［ｂはＬｏｌ　ｐ　Ｉａとしても本明 細書で記述のＬｏｌ　ｐ　Ｉとは異なるＮ−末端アミノ酸配列を有していた（Ｃ ｏｔｔａｍら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、　２３４：　３０５−３１０　 ；表２）。クローン１２Ｒによりコードされるアレルゲンは主要の新たに同定さ れたアレルゲンＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、Ｉを示すことが考えられた。クローン１２Ｒ のヌクレオチド配列を図３ｂ及び３ｃに示す。

実施例３−アレルゲンの花粉特異性発現ポリＡ”　ＲＮＡを種々の植物組織、即 ち、種子、葉、根及び花粉から単離した。これらの種々の組織に由来する２０Ｒ ｇの全ＲＮＡをホルムアミド及びホルムアルデヒドの存在下において１．２％Ｗ ／Ｗのアガロースゲル上で電気泳動させ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲）、ハイボ ンド−Ｃエキスラ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ 、　ＩＬ）に移し、モして８０°Ｃで２ｈフイルターベータに付した。その１． ２ｋｂの１２ＲｃＤＮＡを３宜ＰＣラジオラベルし、そして５０９６ｖ／ｖのホ ルムアルデヒドの存在下で６５°ＣでＮＣフィルターとインキュベートした。こ の膜を０．１％Ｗ／ＶのＳＤＳを含む２Ｘの５ＳＣ（０，３ＭのＮａＣ１，０， ３Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０＞で６５℃で洗った。タンパク質は種々 の組織（花、葉、根及び花粉）をＩｍＭのＰＭＳＦを含む１０ｍＭのＰＢＳの中 で粉砕し、次いで標識抗体でイムノプロット（レーン当り１０Ｒｇのタンパク質 ）に付することにより単離した。結合性はＭＡｂに対する１２ｊ［−ヤギ抗マウ スＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　）Ｉｅｉｇｈｔｓ、　Ｉ Ｉ、）及びポリクローナル１２ｓＩ−ヤギ抗−ヒト　ＩｇＥ（Ｋａｌｌｅｓｔａ ｄ、Ｃｈａｓｋａ、ＭＮ。）を用い、次いでオートラジオグラフィーを行うこと により識別化させた。

花粉から調製したＲＮＡのノーザンプロット分析は花粉におけるクローン化アレ ルゲン遺伝子の高レベルの発現を示したが、生長組織においてはいづれも示され なかった。花粉ＲＮＡの中で観察される長さ約１．３ｋｂの主要バンドは生長組 織由来のＲＮＡにおいては検出できなかった（図２ａ）、花粉−特異的ＲＮＡ発 現は、ＭＡｂ　４０．１．１２．３及びＩ［ｉＥ抗体により認識される抗原の花 粉−特異性発現に対応する（図２ｂ）。特異的な結合は花粉及び花びら組織（花 粉を含む）をタンパク質起源として用いたときにのみ認められた。

実施例４−一次構造分析 ｃＤＮＡクローン！２Ｒを単離し、モしてｐＧＥＭ−３２ベクター（Ｐｒｏｍｅ ｇａ。

Ｍａｄｉｓｏ口、Ｗｌ）の中にサブクローンし、次に制限地図化に付した。様々 なサイズの制限フラグメントをｐＧＥＭベクターの中にサブクローンした。

単離したｃＤＮ＾クローン＋２Ｒをｐブルースクリプト■ベクター（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ、　ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の中にもサブクローンし、モしてＸＬ Ｉ　−ブルー細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）を形 質転換させるために用いた。ＤＮＡ配列はＩ７　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＹ）を用いるジデオキシ連鎖停止法 （Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７４　：　５４６３−５４６８）により実施される二本鎖シーケンシン グによって決定した。入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）欠損をＥｘｏ　ｍ及びｓ１ヌクレ アーゼを用いてＩ７及びＴ３末端の両方から作り上げた。プラスミドＤＮＡを改 良アルカリ分解手順を利用して調製した。欠損クローンをアガロースゲル上での 電気泳動により、ＤＮＡシーケンシングのためにサイズ選別した。ＤＮＡシーケ ンシングはＩ７　ＤＮＡポリメラーゼ又はジデオキシヌクレオチド停止反応を利 用して実施した。（”Ｓ）　ｄＡＴＰをラベルとして用いた。シーケンシング反 応は８Ｍのウレアを含む６％のポリアクリルアミドウェッジゲル上で分析した。

必要に応じて内部シーケンシングブライマーを合成した。解読枠はｐＧＥＭベク ター中の２つの発現サブクローンを図４に詳細する通りにシーケンシングするこ とにより確認した。ＤＮＡ配列データーをＰＣＧＥＮＥシステム（Ｉｎｔｅｌｌ ｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　ＣＡ）を用いて分析した。

ｃＤＮＡクローン１２Ｒのヌクレオチド配列はＧＣに富んでいた（６１％のＧＣ ，図３ｂ及び３ｃ）、図３ｂ及び３ｃに示す通り、ヌクレオチド４０でのＡＴＧ 開始フドンで出発し、そしてヌクレオチド９４３で始まるＴＧＡコドンで終止す る９０３ｂｐのオーブン解読枠がある。提唱の翻訳開始部位及びそのフランキン グ配列は共通配列＾ＡＣＡＡ　ＴＧＧＣ（ヌクレオチド３６−４４）と８９％の 相同性を共有し、そしてメチオニンコドンから位置−３（ヌクレオチド３７）に おいてプリンの存在があることか最適な状況と考えられる。（Ｃａｖｅｎｅｒ　 ａｎｄ　Ｒａｙ（１９９１）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ、　、　１９　 ：　３１８５−３１９２）　、このオーブン解読枠は推定Ｍｒ２９．８ｋＤのタ ンパク質をコードする。

アラニンに富むこの推定タンパク質配列は２５アミノ酸の推定シグナル又はター ゲットペプチド配列を有する（図３ｂにおけるアミノ酸−２５〜−１）。これは 推定Ｍｒ　２７．３　ｋＤの切断タンパク質を示唆する。Ｌｏｌ　ｐ　ＩｂのＮ −末端タンパク質配列は、シグナルペプチドの推定切断部位の直後のクローン１ ２Ｒの推定アミノ酸配列と同じである。このことは、ｃＤＮＡ−１２ＲがＬｏｔ 　ｐ　Ｉｂアレルゲン性タンパク質をコードし、そしてこのタンパク質が切断に 付されたシグナルペプチド配列を有していることを裏付けする。＋２Ｒクローン によりコードされるタンパク質をＬｏｌρｉｂ、　Ｉ　と命名した。Ｌｏｌ　ｐ 　Ｉｂ、Ｉの推定アミノ酸配列も図３ｂ及び３ｃに示している。

このシグナル配列はその他の真核系配列に典型的な特徴を有する二〇末端での５ アミノ酸の比較的親水性な配列、Ｎ末端にてより親水性となっていくシグナル配 列のほぼ全体にわたる比較的疎水性な配列（図３ｄ）。Ｃ末端のアミノ酸は切断 部位にアラニン、−２において芳香族残基チロシン、及び−６においてへリック スプレーカーブロリンを有し、その全てはシグナル配列のＣ−末端領域の一般的 な特徴である。

推定アミノ酸配列における共通グリコジル化配列（Ａｓｎ−Ｘ　−３ｅｒ／Ｔｈ ｒ）についての探索はかかる配列を検出せしめなかった。アレルゲン上のＮ−結 合型炭水化物鎖の無さは、酵素Ｎ−グリカナーゼ及びエンド−Ｆグリコシダーゼ での処理による脱グリコジル化のなさによって！認された。化学説グリコジル化 、それに続＜　５ＤＳ−ＰＡＧＥはタンパク質の分子量の低下を示さなかった。

３１／３３ｋＤ成分は二重であり続け、分子量における相違はグリコジル化によ るものでないことか示唆された。脱グリコリル化処理は３１／３３ｋＤ成分への ＩｇＨの結合性に影響を及ぼさなかった。５％の炭水化物を有するｌ、ｏｌ　ｐ 　Ｉａに比へ、　Ｃａｌ　ｐ　Ｉｂには炭水化物はなかった。

ｍｏｌ　ｐ　Ｉｂに関するアミノ酸配列及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、Ｉの推定アミノ 酸配列は、直接タンパク質ンーケンシングに由来するＰｈｉ　ｐν（Ｍａｔｔ− ｈｉｅｓｅｎ　ａｎｄ　Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｃ１ｉｒ＋、Ｅｘｐ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ、２１　：　２９７−３０７）及びＤａｃ　ｇ　Ｖ（Ｗａ、Ｉ ｓｈら（＋９８９）Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、　ＡｌｌｅｒｇＹ　Ａ１１ｐ１．　Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、９１　：４１９−４２５）に関して決定された、並びにＰｏａ　 ｐ　［Ｘ　ｃＤＮＡクローンより推定された（Ｓｉ　Ｉｖａｎｏｖｉｃｈら（１ ９９１）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６６　：　１２０４−１２１０）公開アミ ノ酸配列とタンパク質配列相同性を示した。これらの配列相同性を表２に示す。

実施例５−ＩｇＥ−及びＭａｂ−反応性エピトープの描写ＭＡｂ及びＩｇＥ決定 基の位置決めをするため、Ｅ、コリ組換発現系を利用した（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ 　Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ　６７　：　３ｌ−４０）　ｏこの系を 利用し、いくつかの制限フラグメントを発現プラスミドｐＧＥＸ＋−３の中にサ ブクローンした。ｐＧＥＸの中への全長ｃＤＮＡのｒフレーム内」サブクローニ ングは、　ＩｇＥ並びにＭＡ！＋　４０．１及びＩ２．３の両者により認識され る６１ｋＤの融合タンパク質を発現せしめた。

全長ＣＤＮＡ　Ｊ２Ｒ又は２本の制限フラグメントＩＨ及び２Ｐ（図４に示す） をプラスミド発現ベクターｐＧＥＸの中にサブクローンした。

融合タンパク質を誘発及び細菌リゼートの調製のための手順は既に述べられてい る（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ、前掲）。獲得したリゼートを還元Ｓ ＤＳ　−ＰＡＧＥに付し、続いてＮＣ膜に移した。これらのプロットを図１ｂに 関して説明した通りに＋ｇＥ抗体、並びにＭＡｂ　４０．　Ｉ及び１２．３でプ ローブし、ただしＪｇＥ結合を検出するため（コ■Ｙ−抗一ヒトＩｇＥ（Ｋａｌ ｌｅｓｔａｄ、　Ｃｈａｓｋａ、、　ＭＮ、　）を用いた。

イムノブロワ１〜分析は、生成されたほとんどの融合タンパク質が細菌プロテア ーゼにより、グルタチオン−ｓトランスフェラーゼとの融合部位付近で切断され 、ＩｇＥ抗体により認識される切断生成物をもたらすことが示された（図４）。

フラグメント２Ｐにより発現される組換融合タンパク質（ＧＳＴ−２Ｐ）は両Ｍ Ａｂと強く反応したが、プールしたアレルギー血清中のＩｇＥ抗体により認識さ れなかった。

しかしながら、フラグメントＩＨにより生成されたＮ末端の削除されたタンパク 質（ＧＳＴ−ＩＨ）はどのＭＡｂによっても認識されなかったか、　ＩｇＢ抗体 とは反応性が高かった。

これにより、アレルゲン分子の２つの異なるドメインが描写された　ＭＡｂ　１ ２．３及び４０．１に対する認識部位を存するフラグメント２Ｐを有するＮ−末 端：並びに強り叫ｇＥ結合性を示し、それ故アレルギー決定基を有するフラグメ ントＩ　Ｈを含むＣ末端。２種のＭＡｂは異なる結合特異性を存するため（図１ ｂ）、この２種のＭＡｂについての認識部位は異なるようであり、しかしながら 同一のフラグメントの中にある。小さなフラグメントによる良好な地図化が１２ ．３及び４０．１の結合部位の描写にとって必要であるが、これらの結果がＩｇ Ｅ決定基が異なることを示すのに十分である。

実施例６−はそ支孔粉中のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂの細胞内標的化はそ麦の成熟花粉を 樹立された方法（Ｓｔａｆｆら（１９９０）　ＨｉｓｔｏｅｈｅｍＪ、２２＋　 ２７６−２９０）に従って走査電子顕微鏡のために調製した。免疫細胞化学のた め、成熟朽を無水条件のもとで２，２−ジメトキシプロパン中の０．１％のグル タルアルデヒド、１％のバラホルムアルデヒドの中で４°Ｃで２ｈ固定し、次い で透過型電子顕微鏡のために処理した（Ｓｔａｆｆら、前掲）。この方法は水性 媒質の中でのアＩノルゲンのその細胞部位からの拡散を抑えるために開発されて いる。ブロックを１％のベンジルを有するＬＰ金樹脂の中で、−２５°ＣでＵ■ イルミネーソヨンのもとて重合し、そして８０ｎｍの薄切片を金グリッド上で拾 い上げた。イムノラベリングはまず第一抗体ＭＡｂ　１２．３　（Ｌｏｌ　ｐＩ ｂに特異的）、次いで金−ヤギー抗−マウスＩｇＧプローブ（＋５ｎｍの粒径） による。このラベルを４０ｎｍの粒径にまで銀増強させた（Ｄａｎｓｃｈｅｒ　 ＆Ｎｏｒｇａａｒｄ（＋９８３）Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅ ｍ、　３１　：　１３９４−１３９８の改良法）。　゛第２ラベリングは同じ切 片上で、３種のＭＡｂ、　３．２．２１．３及び４０．１の混合物、それに続＜ 　１５ｎｍの粒径の金−ヤギー抗マウスＩｇＧプローブにより行った。前述した 通りに実施した抗体特異性及び方法のコントロール（Ｓｔａｆｆら、前掲）はこ れらの部位での全粒子を示さなかった。

Ｌｏｌ　ｐ　Ｉａは細胞質の中に存在し、そして細胞小器官の中には存在してい ない。この発見はイムノ−金プローブをＬｏｔ　ｐ　Ｉａに特異的なＭＡｂと一 緒に用いることで獲得された。ここで示す通り、Ｌｏｌｐｌｂに特異的なＭＡｂ １２．３はデンプン顆粒に優先的に結合する（図５ａ、ｂ）。はそ支孔粉はＩＸ ２．５μｍのサイズのデンプン顆粒で消されており、そしてアミノブラストの内 腔に由来する。

図５ｂに示す通り、デンプン顆粒にわたって優先的に位置する大きな金粒子（大 きな電子−光空間）は、Ｉ、ｏｆ　ｐ　ｌｂへのＭＡｂ　１２．３の結合を示し 、一方、細胞質にわたる小さい粒子はＬｏｌ　ｐ　Ｉａへの結合の典型である。

スケールバーは１μｍである。図５０は水に３０ｓ暴露した後の新鮮な生育花粉 の出現を示す（ダークフィールドイルミネーション）。はとんどの花粉粒が破裂 し、デンプン顆粒（白色粒）を含むその細胞質内容物が胚胞孔を通じて漏出して いた。スケールパー３０μｍ０ ブラスチドにおけるＬｏｔ　ｐ　［ｂの存在は、このタンパク質が細胞質ゾルか らブラスチドの内腔へと発育中に輸送されるであろうことを意味している。クロ ロプラストへの輸送のため、細胞質ゾルの中で合成されるこのタンパク質は細胞 小器官へと輸送された後に切断される標的ペプチドを含む大きな前駆体として合 成される。これらの細胞内プロセス工程、細胞質ゾルの中での第１のプレーアレ ルゲンとしてのＬｏｌ　ｐ　ｌｂの合成、及び後翻訳修飾のためのブラスチド・ 　への輸送がイムノブロッティングにより見い出せる二重３１／３３ｋＤの出現 を説明しつる。プロセスされていないプレーアレルゲンは３３ｋＤてあり、そし てブラスチドの中でのプロセスを経た成熟タンパク質か３１ｋＤである。これら の形態は成熟花粉の中で共存している。他方、この二重体は１、ｏｆ　ｐ　Ｉｂ の別のイソフオーム又は斜横成員にも存在しうる。

実施例７−免疫系に対するＬｏｌ　ｐ　Ｉｂの提供はそ支孔が開花するとき、そ の朽は広がり、そしてこの花粉は各駒の基底において開いている孔を通じて大気 中に放出される。はそ麦はあらゆる草類のうちで最大の花粉生産を示し、ヘクタ ール当り約９６０　ｋｇの抗原を刈り入れ又は放牧されていない牧草地における 大気中へと放出させる。この花粉の９９％がその起源のＩｋｍ内に蓄積（及び再 蓄積）する。草類の花粉は寿命が短いが、しかしそれは大気中て数日間残ってい ることがある、花粉は放出後数時間しか生存していないことが実験で示されてい る。

生存しているとき、この穀粒は柱頭の上で又は高レベルの浸透圧を有する人工培 地の中で発芽できる。生存活性はそ麦穀粒は水に暴露されたとき、単胚胞開口部 で破裂し、細胞質内容物を放出する（図５ｃ）。放出含存物のうちで顕著なのは デンプン顆粒である。

高浸透圧を有する培地、例えば３０％Ｗ／Ｖのスクロースが穀粒の等張性を維持 するのに必要である。他方、浸透性バリヤーを存さない死滅した花粉穀粒のスポ ンジのようにふるまうことがよく知られている。アレルゲンを含む細胞性タンパ ク質は湿潤によって放出される。

草類花粉が口内及び目の粘膜に接触した後にどのようにして枯草熱を誘引するか はアレルゲンの直接的な放出によって簡単に調べられる。花粉穀粒自体は粘膜の 上に居続けるが、しかし放出アレルゲン性タンパク質は粘膜及び上皮下層を通過 し、そこでそれらは好塩基性細胞及びマスト細胞と相互作用する。直径３０〜５ ０μｍぐらいの大きさの花粉穀粒が、肺の気道におけるアレルゲンの存在により 誘引される疾患、アレルギー性ぜん息をとのようにて誘発せしめるかを調へるこ とはあまり簡単ではない。

最近の証拠は、草類花粉アレルギーが大気中に見い出されている小さなミクロン 粒に会合していることが示唆されている。かかる粒子の起源は不明である。アレ ルゲンの位置に基づく本結果が水の中での花粉の挙動の観察より、草類花粉がど のようにて感受性なヒトの肺においてアレルギー性ぜん息を誘発せしめるかを説 明する新たな仮説が提唱される。生存花粉穀粒が水蒸気又は葉もしくはその他の 基体の表層上の水と遭遇するとき、大気中にデンプン顆粒がミクロン粒子として 放出される。アレルゲンで覆われ、且つ充填されているこれらの粒子は上部及び 下部呼吸管へのアレルゲンの提供のための媒体として働く。ミクロン粒子はむろ ん草類花粉由来のアレルゲンの到達及び大気のその他の成分の蓄積にも由来しつ る。

実施例８−　Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、１に対するモノクローナル抗体実施例５由来の 融合タンパク質ＧＳＴ−ＩＨに対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を、当業者 に公知の技術（例えばＫｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　。

前掲及びＫｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　、前掲を参照ノコと）を利 用して調製した。フラグメントＩＨ（図４）によりコードされ、　ＩｇＢ結合性 ユバント（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、　Ｒｅｓ、　、　Ｈａｍｉ　Ｉ　ｔｏｎ、　 ＭＴ）中の１００　ｍｇのＦＰＬＣ精製ＧＳＴ−ＩＨ融合タンパク質を腹腔膜内 用（ｉ、ｐ、）注射した。１４日間、同じ物質のブースター１．ｐを付与した。

１０日後、そのマウスを血抜きした。

その血清を全はそ支孔粉タンパク質のウェスタンプロットに対する結合性につい てスクリーンし、そしてプロットへのこの血清の結合性に基づいてマウスを選択 した。１４日後、融合体に関して選択したマウスに１００　ｍｇの融合タンパク 質のみを含む０．２ｍｌの１．ｐブースターを付与した。４日後、このマウスを 殺し、そしてミエローマ細胞（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ ５ｔｉｔｕｒｅ　、　Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、ＶｉｃｔｏｒｉａＳＡｕｓｔｒａｌ ｉａから贈呈）との融合のための牌臓を取り出した。融合及び培養に用いる方法 は、Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　ｌａｎｅ（１９９０）Ａｍｉｂｏｄｉｅｓ、　Ａ　 ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＮ Ｙ）のものを基礎とし、ＲＲＭＩ及びバイブリド血清（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔ ｈＳｅｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、　Ｖｉｃｔｏ ｒｉａ、　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ）を用いる０アミノプテリン選別を利用した（５ ０Ｘ　ＨＡＴ及びｌ（Ｔ溶液、Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒ−ａｔｏｒｉｅｓ、　５ｃ ｏｔｌａｎｄ、Ｕ、に、）　ａ　クローニングは限界希釈による。

モノクローナル細胞系をマウスモノクローナル抗体アイソタイビングキット（Ａ ｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｕ、　Ｋ、　）を利用してア イソタイプに付した。草類花粉季節中に季節性枯草熱の典型的な症状を示し、且 つ皮膚移植検査で陽性の応答を示した患者から、同意を得た後にヒトアレルギー 血清を採取した。その血清をウェスタンプロ・ントでほそ支孔粉の全タンパク質 との１ｇ８反応性についてアッセイした。

花粉サンプルはＧｒｅｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｅｎｏｉｒ、ＮＣ） より購入した。可溶性タンパク質を、ＩｍＭのフェニルーメチルスルホニルフル オリドを含むＰＢＳの中で氷上で３時間強く撹拌することにより草類花粉から抽 出した。各サンプルについてのタンパク質濃度はＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｉ　ｃｈｍ ｏｎｄ、　ＣＡ）タンパク質アッセイを用いて決定した。

各草類の抗体結合性はスロットイムノブロッティングによりまず検定した。２ｍ ｇの全タンパク質花粉を含む１００μｍのサンプルをマニホールド■スロットブ ロッティング装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ。

Ｄａｓｓｅｌ、　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてニトロセルロース膜に適用した。こ れをＰＢＳで洗い、そして１０％の粉乳を含む同じバッファーの中でブロックし た。

５ＯＳ−ＰＡＧＥをＢｉｏ　−Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）プロティン ■スラブゲル装置及びラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）バッファー系（Ｌａｅｍｍｌ 　ｉ、　ｕ、　Ｋ、　（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ２２７゜６８０）を利用して 、１０〜１５％のアクリルアミド勾配ゲルで実施した。これらのタンパク質をク マジーブルーＲ２５０（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕ ｉｓ、ＭＯ）染色によって識別化させた。勾配ＳＯ３−ＰＡＧＥにより分けたタ ンパク質をＴｏｗｂ　ｉ　ｎら（＋９７０）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、ＵＳＡ７６　：　４３５０−４３５４の手順に従って、Ｂｉｏ　−Ｒａ ｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）　トランスプロットセルの中のニトロセルロー ス膜上べとこのゲルから電気泳動的に移した。このニトロセルロース上のタンノ （り質を、スロ・ノドプロットに関して記載した通りに、粉乳中でこの膜をイン キュベートすることによって非特異的部位をブロッキングすることにより検出し た。次にこの膜をＰＢＳの中で洗い、そして０．５％のＢＳＡ及び０．１％のア ジ化ナトリウムを含むＰＢＳの中で１：５に希釈しておいたＭＡｂ溶液の中に２ 時間又はヒト血清（１０人の草類アレルギー患者より獲得したプール血清）の中 に一夜浸した。ＭＡｂ溶液の中でインキュベートした膜をＰＢＳで洗い、次いで ＰＢＳ　−ＢＳＡに１：５００で希釈したヒツジ抗マウスＩｇＧ＝西洋ワサビペ ルオキシダーゼ（Ｓｉｌｅｎｕｓ。

Ａｕ５ｔｒａｌｉａ）とインキュベートした。洗浄後、この血清プロットをまず ＰＢＳ　−ＢＳＡの中で１：２００に希釈したウサギ抗−ヒトＩｇ［！（Ｄａｋ ｏｌ）−ａｔｔｓ、　Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、　Ｄｅｒ＋ｍａｒｋ）の溶液の中で２ 時間インキュベートし、次いてＰＢＳ　−ＢＳＡで１：２５００に希釈したヤギ 抗−ウサギＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａｌ、　Ｍａｄ ｉｓｏｎ、　Ｗｌ）の溶液の中で１時間インキュベートした。洗浄後、プロット に結合している抗体を、４−クロロ−１−ナフトール及び過酸化水素を含むペル オキシダーゼ基質の中でインキュベートすることにより識別化させた。

ＦＰＬｃカラムより溶離させたＧＳＴ−ＩＨ融合タンパク質を含む両分は画分９ 及びＩＯであった。これらの画分は、ＳＤＳ　−ＰＡＧＥにより分析したとき、 ２６ｋｌ）のＧＳＴ及びフラグメント１Ｈによりコードされる１５ｋＤのタンパ ク質に対応する４１ｋＤ（ＧＳＴ−ＩＨ）の一本のバンドを示した。

ＭＡｂ製造の際、−触合体は７５の細胞コロニー含有ウェルをもたらし、そのう ちの７つが天然Ｌｏｌ　ｐ　［ｂ花粉タンパク質に対して陽性であった。３つの 強く増殖するコロニーをＭＡｂ細胞系を生成するためにクローンした。アイソタ イプしたとき、ＬｐＩＸ−３Ａ及びＬｐｌＸ−４Ａと命名した２細胞系がＩｇＧ カッパー抗体を生成し、そして１つがＩｇＭカッパー抗体を生成した。同じ方法 で、ＭＡｂ　Ｌｐｌ−７８（７Ｂ）を抗原として可溶性花粉抽出物を用いて作っ た。ＭＡｂ　Ｌｐｌ−７Ｅｌ；！　Ｌｏｌ　ｐ　Ｉａに特異的である。

これらのＭＡｂはオーチャードグラス、ヒロハノウシノチグサ、はそ麦、ネズミ ムギ及びナガハグサの花粉中の非変性抗原に結合した（図６）。ＳＤＳ　−ＰＡ ＧＥで分けた可溶性花粉タンパク質のウェスタンプロット上で、ＭＡｂ　Ｌｐｌ Ｘ−３Ａ及びＬｐｌＸ−４Ａｌ；ｌ日ノ１／ウシ／チグサ、はそ麦、ネズミムギ 及びナガハグサ中の抗原と結合した（図７）。

これらの草類は全て分類学上近縁している。これらはボエア（Ｐｏｅａｅ）族、 ボアダ（Ｐｏａｄａｅ）超族、ブーイデア（Ｐｏｏｉｄｅａｅ）亜科の構成員で ある。

実施例９−　Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂ、２をコートするｃＤＮ八クワクローン１９Ｒ離 免疫学スクリーニング 実施例目二おけるｃＤＮＡ発現ライブラリーのデユープリケードフィルターをプ ールしたヒトアレルギー血清由来の特異的１ｇεでスクリーンした。結合１ｇＥ はｌ１ｌ−ラベル化抗−ヒト　ＩｇＥ（Ｋａｌｌｅｓｔａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ、Ｃｈａｓｋａ、ＭＮ）を用いて検定した。両デュブリケートフィルタ ー上の抗体陽性プラークを拾い、精製し、次いて再ブレートに付、し、そしてＭ Ａｂへの結合性について試験した。

プラーク精製クローンは非アレルギー血清で試験したときは陽性でなかった（図 ８）。このことは、クローン＋９Ｒが、はそ麦感受性宇、者の血清中の特異的な ＩｇＥ−＼の結合能力によりアレルゲンであることを示している。

クローン＋９ＲをＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＧＥＭプラスミド（Ｐｒｏｍｅ ｇａ。

Ｍａｄ　ｉ　ｓｏｎ、　Ｗｌ　）にリケードした。図９はＬｏｌ　ｐＩｂ、１及 びＬｏｌ　ｐ　Ｉａコート遺伝子の制限地図と比較した、クローン！９Ｒに由来 するサブクローンＥｃｏＲｌインサー１〜の部分制限地図である。図９で示す通 り、このインサートはＬｏｌ　ｐ　ｔａ及びＬｏｌ　ｐ　ｌｂ、］をコードする ものとは異なる。ＥｃｏＲＩインサートのサイズは約１２９５ｂｐである。

ＤＮＡのサブクロー二ンゲ及びクーデ〉タンプＭｅｓｓｅ、　Ｅ、ら（１９９０ ）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、第１８春用９２３に記載の液体リゼ ート法を利用してＤＮＡをプラーク精製相から調製した。ＥｃｏＲＩ消化より回 収したインサートをｐＧＥＭ　４−Ｚ（Ｐｒｏｍ＋４ａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　 Ｗｌ）へとリケードし、そしてｐＧＢＭベクター（ｐＧＥＭ４−２）の中に様々 なサイズの制限フラグメントとしてサブクローンした。全てのソーケンタンプは 二本鎖プラスミド鋳型を用いて行った。これらの鋳型はＱｕｉａｇｅｎ。

Ｉｎｃｌ、　Ｃｈａｔｓ＊ｏｒｔｈ、　ＣＡ、　ＵＳＡに記載の通りに調製した 。ジデオキシシーケンノング（Ｓａｎｇｅｒら（＋９７７）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７４　：　５４６０−５４６３＞を実施例 ４に記載の通りに実施した。クーデアザｄｌＴＰを強いＧＣバンド圧縮を解くた めに用いた。シーケンシングはＥＸＯｍ及びＳ１ヌクレアーゼによってインサー トの両端から入れ子欠損を作り上げることにより助長した。必要に応して内部ソ ーケンタンププライマーを合成した。

配列分析 配列分析はメルボルンデーターベースシステム（ＭＥＬＢＤＢＳＹＳ）　、即ち 、オーストラリア、メルボルン大学のＷａｎｅｒとＥｌｉｚａ　１−ｔａｌｌ、 ＬｕｄｕｉｇとＨｏｗａｒｄ　Ｆｌｏｒｅｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ及びＰＣＧ ｅｎｅ　Ｃｌｎｔｊｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｊ−ａｉｎ　Ｖｉｅｗ 、ＣＡ）で開発された分析プログラムコレクションを用いて実施した。このシス テムは下記の起源由来のデーターベースを含んでいる　ＧｅｎＢａｎｋ、　ＥＭ ＢＬ、及びＢＰＲＦｌ’５酸ライブラリー；　ＮＢＲＦ　ＰＲＩタンパ７ｗ、Ｐ ＳＤ−１−ヨード（オオイ）、ＧＢトランス、スイスプロット及びＩ’）ｏｏｌ ｉｔｔｌｅタンパク質ライブラリーウライブラリ−ＢＬ及びＧｅｎＢａｎｋデー ターベースはそれぞれ２８，０及び６８．０リリースした。

グロー＞１９ＲのＣ閂Ａ配列を図１０ａ及びｌＯｂに示し、モしてＩ２９５ヌク し・オチトを含んでいた。ヌクレオチド位ｆ１２５−２７でのＡＴＧ開始開始コ シて始まり、そしてヌクレオチド位置１０４１で始まるＴＧＡ停止コドシて終結 するｌ０１７ｂｐのオーブシ解読枠がある。クローン＋９ＲのｃＤＮ＾は以下の 特徴を有し、それか全長コード領域を含むことが示唆されｉ）提唱の翻訳開始部 位とそのフランキング配列（ヌクレオチド２１−２９）とが単子葉植物の共通配 列と８９％の相同性を共有した。最も重要なヌクレオチド、即ちＡＴＧ出発コド ン（図１０ａにおけるヌクレオチド２１）に対して−３の位置のプリンが保存さ れていた（Ｃａｖｅｎｅｒ。

Ｄ、Ｒ１，ａｎｄ　Ｒａｙ、Ｓ、Ｃ，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　＋９：３１８５−３１９２）；１ｉ）ｃＤＮＡは完全な ３′−未翻訳領域である標準ＡＡＴＴＡＡポリアデニル化シグナル（Ｂｉｒｎｓ ｔｅｉｌら（１，９８５）Ｃｅ１１．４１：　３４９−３５９）、それに続くポ リ（Ａ）テールを有する；及び １ｉ）３’未翻訳領域はｍＲＮＡ安定性にかかわるＡＴＴＴＡも含む。

クローン＋９ＲｃＤＮＡのヌクレオチド配列はＧ十Ｃに富んでいる（６３−１） 。そのオーブン解読枠は推定Ｍｒ　３５．３　ｋＤを有する３１４個のアミノ酸 のＬｏｔ　ｐ　Ｉｂ、２と命名したタンパク質をコードする。この推定タンパク 質は図１１に示すＮ−末端配列の水性プロフィールに基づいて２５個のアミノ酸 のリーダーペプチドを有することが認められた。

この図はＫｙｔｅ　ａｎｄ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（＋９８２）Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ ｏｌ、、　＋５７：　１０５−１３２の方法に基づく推定アミノ酸配列の疎水性 プロフィールを示し、９個のアミノ酸の枠がある。このことは、成熟プロセスタ ンパク質の分子量か３２．８ｋＤであることを示唆する。Ｎ−グリコジル化に必 要なＡｓｎ−Ｘ−３ｅｒ　／　Ｔｈｒ配列はなく、そして成熟タンパク質の推定 ｐｌ値は５．９であった。

現存のデーターペースのヌクレオチド及びアミノ酸配列探索は、クローン＋９Ｒ がＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、１及びＰｏａ、　ｐ　ＩＸアレルゲンとだけ類似性を有す ることを示した。図１２ａ及び＋２ｂに示す通り、クローン１９Ｒとクローン！ ２Ｒのヌクレオチドコード領域間に７２，３％の相同性があった。アミノ酸対比 は、図１３に示す通りクローン１９Ｒの推定アミノ酸配列とＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、 Ｉ　との間での６６．８％の同一性を示した。両アレルゲンとも非常に類似した ２５個のアミノ酸のリーダーペプチドを有していた。クローン１９Ｒのアミノ酸 配列とＰｏａ　ｐ　ＩＸ　（Ｓｉｌａｎｏｖｉｃｈら（１９９１）Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２６６　：　１２０４−１２１０）の３つのイソアレル ゲンとの間で６４〜６９％の同一性があった。

花粉タンパク質の単離及びイムノブロッティング可溶性タンパク質をほそ支孔粉 から、ＰＢＳ及び１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリドの中で氷りで３ 時間強く撹拌することにより抽出した。５ＤＳ−ＰＡＧＥのための条件は本質的 にＯｎｇら（＋９９０）Ｉｎｔ、Ａｒｃｈ、Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｌ１１ｐ１．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、、　９３：　３３８−３４３に記載の通りである。電気泳動の直 後、分離させたタンパク質を銀染色するか（Ａｎｇｏｒｇｅ、Ｗ、（１９８２） 　Ｉ［１ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ’８２：ＡｄｖａｎｃｅｄＭｅｔｈｏｄｓ 、Ｂｉｏｃ−ｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ａｌ１ｒｌｌｉＣａ ｔｉｏｎｓ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａ−ｔｉｏ ｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、Ａｔ ｈｅｎｓ、Ｇｒｅｅｃｅ、１９８２年４ＪＪ　２＋、　−２４日、編集者：　Ｄ 、　５ｔａｔｈａｋｏｓ、Ｗａｌｔｅｒ　ｄｅ　Ｇｒｕｙｅｅｒ、　Ｂｅｒｌｉ ｎとＮｅｗＹｏｒｋ、　１９８３年、頁２３５−２４２）、又はニトロセルロー スに４”Ｃで移した（Ｔｏｗｂｉｎ　ら（１９７９）Ｐｒｏｃ、、Ｎａｔｌ、＾ ｅａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、７６　：４３５０−４３５４）。

１［Ｅ抗体結合のため、プロットを０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を 含むＰＢＳ中のプールアレルギー血清又はアフィニティー精製ｔｇＥ中でインキ ュベートした。結合１ｇＥをＯｎｇ　Ｅ、ら（１９９０）　Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ 、Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、９３　：　３３８−３４３ の方法に従って、ｌｔＪ−ラベル化抗ヒト　ＩｇＥ（Ｋａｌｌｅｓｊａｄ　ｌａ ｄ、Ｃｈａｓｋａ、ＭＮ）を用いて検出した。ＭＡｂ結合に関して、結合ＩｇＧ を西洋ワサビペルオキシダーゼラベル化ヒツジ抗−マウスＩｇ（Ｓｉｌｅｎｕｓ 、　Ｈａｗｔｈｏｒｎ、　Ｖｉｃｔｏｒｉａ、　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ）を用いて 検出した。プロットは増強ケミルミネッセンス系（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔ、　 、　Ｕ、　Ｋ、　）を用いて現像した。

Ｉｇε抗体のアフィニティー精製 アレルゲンをコードするラムダｇｔｌｌファージ中のｃＤＮＡクローンをエッソ エリヒアコリの中で融合タンパク質として発現させた。組換融合タンパク質（ｒ ｆρ）を含むプラークリフトを次にプール血清の中でインキュベートした。結合 ＩｇＥ抗体を０．２ＭのグリシンＨＣ１，ｐＨ２，６１０，５％のＢＳＡ　１０ ．１％のアジ化ナトリウムで溶離させ、そしてウェスタンプロットをプローブす るために用いた。　＋ｇＥ結合は＋！Ｊ−ラベル化抗化上−ヒトｇＥ（にａｌｌ ｅｓｔａｄ、　Ｃｈａｓｋａ、ＭＮ）、次いてオートラジオグラフィーを用いて 識別させた（Ｏｎｇら、Ｉｎｔ、　Ａｒｅｈ、　ＡｌｌｅｒｇｙＡｐｐ！、　Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、、９３　：　３３８−３４３）。

ＲＮＡプロットハイブリダイゼーションＲＮ、Ａゲルプロット分析のため、全Ｒ ＮＡを２０ｍＭの３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルポン酸、５０％の脱イ オンホルムアミド及び２．２Ｍのホルムアミドの中で６５℃で５分間変性させ、 ２．２Ｍのホルムアルデヒドを含む１，２％のアガロースゲルで電気泳動させ、 そしてニトロセルロースにエレクトロプロットさせた。ＲＮＡスロットプロット 分析は、全ＲＮＡを２０ｍＭの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、５ ｍＭの酢酸ナトリウム及び１ｍＭのＥＤＴＡの中で６５°Ｃで１０分間変性させ 、そのサンプルを２０ＸのＳＳＣ（ＳＳＣ−３Ｍの塩化ナトリウム、１．０Ｍの クエン酸ナトリウムで飽和せしめたミニホールド１１濾通用マニホールド（Ｓｃ ｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅ１１．Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の中 に納めたニトロセルロース上に適用することで実施した。両フィルターは５０％ の脱イオン化ホルムアミド、２Ｘの５ＳＰＥ　（ＳＳＰＥ−３Ｍの塩化ナトリウ ム、０．２Ｍのリン酸ナトリウム、０．０２ＭのＥＤＴＡ）、１％のドデンル硫 酸ナトリウム（ＳＤＳ）　、０．５％のＢｌｏｔｔｏ　（リン酸バッファー食塩 水中の１０％の脱脂乳）、１０％の硫酸デキストラン、及びオリゴラベリングキ ット（Ｂｒｅｓａｔｅｃ、　Ａｄｅｌａｉｄｅ、　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ）を用い てランダムオリゴヌクレオチドブライミングにより調製した。′！Ｐ−ラベル化 ＣＤＮＡプローブを含む溶液の中で４２°Ｃて２〜６時間にわたり予備ハイブリ ダイズさせておいた。これらのフィルターを２ＸのＳＳＣ，０，１％のＳＯ３で ４２℃で２時間で４回洗い、次いでＸ線フィルムに暴露させｔこ。

クローン１９Ｒ遺伝子発現の組織特異性を決定するため、様々なほそ麦組織から 調製したＲＮＡのノーザンプロット分析を調べた。ノーザンプロットをクローン １９Ｒ由来の８４ｂｐのＳｓｐ　Ｉ／ＥｃｏＲＩ制限フラグメントでプローブし た。クローン１９に結合するがクローン＋２Ｒには結合しないクローン＋９Ｒの ヌクレオチド１２０７〜＋２９１　（図１０ｂ）に対応するこのｃＤＮＡプロー ブは花粉中の１７８０塩基の単独転写物に１１イブリダイズした。はそ麦の種子 、根及び葉におけるどの転写物ともハイブリダイゼーシヨンは認められなかった 。プローブとしてエントウ由来の完全ルボソームＤＮＡを用いる陽性コントロー ル／％イブリダイゼーションは、利用したＲＮＡの量が全てのサンプルにおける 検出のために十分であることを示した。これは図１４ａ及び１４ｂに示している 。

実施例１Ｏ〜Ｌｏｌ　ｐＩアレルゲンの特性化材料及び方法 花粉をＧｒｅｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅｎｏｉｒ、ＮＣより入手し た。可溶液タンパク質をＧｒｉｆｆｉｔｈら（＋９９１）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅ ｒｓ、　２７９＋　２１０−２１５に記載の通りに抽出した。粗花粉抽出物を獲 得し、そしてそのタンパク質濃度をＯｎｇら（１９９０）Ｉｎｔ、Ａｒｃｈ、Ａ ＩＩｅｒｇ＞’　Ａｐｐｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、９３：　３３８−３４３に記載 の通りに決定した。ＭＡｂ　ＬｐｌＸ３Ａ及びＬｐｌＸ４Ａを実施例８に記載の 通りに、クローン＋２ＲのＩｇＥ結合部分によりコードされる組換タンパク質に 対して発生せしめた。ＭＡｂ　７Ｂは実施例８に記載の通りＬｏｌ　ｐ　Ｉａ及 び実施例１に記載の通りＦＭＣ−ＡＩに特異的であった。

Ｌｏｌ　ｐ　Ｉａ及びＬｏｌ　ｐ　Ｔｂのアレルゲン領域を同定する実験で用い た血清は叶、　Ｒ，Ｒｈｏｍｅ　ｌｅｙにより、Ｅｐｗｏｒｔｈ病院（Ｒｉｃｈ ｍｏｎｄ、　Ａｕ５ｔｒａｌ　ｉａ）で、はそ支孔粉に対するアレルギーの履歴 を存し、且つほそ支孔粉抽出物に対する皮膚検査で陽性な患者から集めた。Ｉｇ Ｅは既に述べられた通りに（Ｓｉｎｇｈら（１９９１）Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　２１　：３０９；ＥｘａＩＩｌ−ｐｌｅ２） 組換アレルゲンからアフィニティー精製したが、ただし組換タンパク質はｐＧＥ Ｘ培養由来ではなく、ラムダ−ｇｔｌｌ培養物に由来しＩこ。

ＩｇＥ結合性ポリペプチドをコードするクローン１２Ｒ及びクローン！９Ｈのフ ラグメントを同定する実験で用いた血清は、春の枯草熱症状の事前の臨床記録及 びほそ支孔粉に対するＲＡＳＴ（Ｒｈａｄｅｚｙｍｃ　ＲＡＳＴ。

Ｒｌｌａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｓｗｅｄｅｎ）を基礎として選んだ５０人の対 象者から獲得した。全ての血清に関するＲＡＳＦ評点は４であった。ＲＡＳＴに よりアトピーでないと示された２人の対象者からも血清を獲得し、そして陰性コ ントロールとして用いた。血清は小アリコートで一４０°Ｃで保存しｌこ。

二次元ゲル電気泳動及びイムノプロット分析２次元（２Ｄ）−ＰＡＧＥをミニ− プロチアン［２−Ｄセル（Ｂｉｏｒａｄ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）において、その製造者の仕様書に従って実施した。

タンパク質を９％のＣＨＡＰＳの中で１：１に希釈した。ゲル当り１３ｍｇのタ ンパク質のアリコートを適用し、そしてサンプルの上に一次方向サンプルオーバ ーレイバッファーを載せた。−次元ゲルを３．５時間泳動させた。二次元ゲルは ４５分泳動させた。２Ｄ−ＰＡＧＥゲル上のタンパク質を銀染色してタンパク質 プロフィールを表示させた。

電気泳動及びウェスタンプロット並びにＭＡｂ及びＩｇＥによるウェスタンプロ ットの処理のための条件はＳｉｎｇｈら（＋９８５）Ｉｎｔ、Ａｒｃｈ、ＡＩＩ −ｅｒｇｙ　Ａｌ１ｐ１．　Ｉｍｍｕｎ、　、　７８　：　３００に記載の通り とした。

花粉抽出物中のアレルギーアイソフオームの同定アレルギー個体の血清による、 ＳＤＳ　−ＰＡＧＥにより分けた花粉タンパク質のウェスタンプロットのブロー ビングはＩｇＥに結合する２８〜３５ｋＤのＭＷ範囲にある４種の分子量でのタ ンパク質バンドを示した。

２Ｄ−ゲルのウェスタンプロットの類似の処理はこれら４本のバンドを、図１５ に示す通り１２のアレルゲンスポットへと分解した。多数のＭＡｂ及びＩｇＥ調 製品を利用することにより、これらのアレルゲン間の抗原性の関係を研究した。

二次元ウェスタン分析を図１６及び表３に示す。プロットはＬｏｌ　ｐｌｂ、１ ．　Ｌｏｌ、　ｐ　Ｉｂ、２　、　ｒｆｐ　Ｌｏｌ　ｐ　Ｉａ　１全プール血清 及びＭＡｂ　ＦＭＣＡ７由来のアフィニティー精製＋ｇＥ抗体でプローブした。

全プール血清は、３２ｋＤ成分の２つの酸性アイソフオーム（階１　、　２）　 、３０ｋＤ成分の５つのアイソフオームであって５−１１の範囲におけるｐｉ値 を有するもの（バンド３−７）、及び２８ｋＤ分子の塩基性バンド（魚８）を認 識する抗体を有していた（図１６、パネルｂ）。Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ、１及びＬｏ ｔ　ｐ　Ｔｂ、２に由来するアフィニティー精製１８Ｂ抗体はアイソフオームＮ Ｑ５を除＜　２８／３０／３２ｋＤ分子のアイソフオーム全てに結合した（図１ ６、パネルｄ及びｅ）ｏ他方、ＭＡｂ　ＦＭＣ−Ａ７は３２ｋＤのアイソフオー ム（バンドｌ及び２）、２つの酸性アイソフオーム（バンド３゜４）及び塩基性 バンド階７の３０ｋＤ成分を認識した（図１６、パネルＣ）。

Ｌｏｌ　ｐ　Ｉａ、　Ｌｏｔ　ｐ　Ｉｂ、１及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２の相対ア レルゲン性を３０人の個体のアレルギー血清を用いて試験した。図１７は２７人 の患者（９０％）がＬｏｌ　ｐ　Ｌａに反応性のＩｇＥ抗体を有し、そしてその うちの６人（２０％）（図１７）はＬｏｌ　ｐ　Ｉａに特異的な＋ｇＥ抗体を有 していることを示した（どのＬｏｔ　ｐ　Ｉｂアイソフオームにも結合しなかっ た）。２４人の患者（８０％）がＬｏｌ　ｐ　ｌｂ、１及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、 ２組換アイソフオームの両方を認識するＩｇＢ抗体を有していた。Ｌｏｌ　ｐ　 Ｉｂアイソフオームのみを認識する（Ｌｏｌ　ｐ　Ｔａには結合しない）　Ｉｇ Ｅ抗体を有する患者が３人いた。

表３ 二次元ゲル上でのアレルゲンの特徴 アレルゲン　ＭＷ　Ｍａｂ　ＩｇＥ Ｎｏ、　（ｋＤ）　ｐｉ　結合６　結合５　グループ実施例１１−はそ麦頭状花 からのＲＮＡの抽並び（こボ１ツメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＬｏｌ　ｐ 　Ｉｂ、ｌ及びＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ、２をコードする遺伝子の冬型性分析 新鮮な頭状花をオーストラリアのほそ変革から集め、凍結し、そして米国に輸送 した。５００　ｍｇの頭状花をドライアイス上のｆＬ鉢及び乳棒によりつぶし、 モしてｏ、ｉ％のＤＥＰＣでＰｒａｎｋｉｓ　ａｎｄ　Ｍａｓｃａｒｈｅｎａｓ （１９８０）Ａｎｎ、　４５：５９５−５９９に記載の通りに一夜処理した０、 　２ＭのＮａＣ１，１ｍＭのＥＤＴＡ、　０．１％のＳＯ３を有する５０ｍＭの トリスｐＨ９，０５ｍｌの中に懸濁した。フェノール／クロロホルム／イソアミ ルアルコール（２５：２４：ｌで混合）で１回の抽出の後、この材料をフェノー ル／クロロホルム／イソアミルアルコール中で６０秒間音波処理し、そして再抽 出した。音波処理を３回目の抽出において３０秒間繰り返した。最後の２回の抽 出は音波処理抜きで行った。ＲＮＡが０．１容量の２Ｍの酢酸すｌ・リウム及び ２容量のエタノールを有する水性相から沈殿した。

そのベレットを遠心により回収し、ｄＨ２０の中に再懸濁し、そして６５℃で５ 分間熱した。２ｍｌの４Ｍの塩化リチウムをＲＮＡ調製品に加え、そして０°Ｃ で一夜沈殿させた。このＲＮＡベレットを遠心により回収し、１ｍｌのｄＨ，ｏ の中に再懸濁し、そして再び３Ｍの酢酸及びエタノールにより氷上で３時間かけ て沈殿させた。最終ペレットを７０％のエタノールで洗い、風乾し、そして１０ ０μｌのＤＥＰＣ処理Ｈ，０の中に再懸濁し、次いで一８０°Ｃで保存した。

一本！ｌ　ｃＤＮＡ及び二本１ｃＤＮＡをそれぞれ市販のキット（ｃＤＮＡ合成 システムとキラｈ、ＢＲＬ、　Ｇａｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）を用いて７． ５μｇの頭状花ＲＮＡにより合成した。第２鎖ｃＤＮＡ反応混合物をフェノール 抽出し、エタノール抽出し、次いでＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ 、　Ｍａｄｉｓｏｎ。

Ｗｌ）でプラント化せしめた。この二本鎖ｃＤＮ＾をエタノール沈殿させた、自 でアニールに付したオリゴヌクレオチドＡＴ及びＡＬにリゲートさせ、Ｒａｆｎ ｅｒら（１９９０）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６６：　１２２９−＋２３６； Ｆｒｏｈｍａｎら（１９９０）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳ八へ５　：　８９９８−９００２　、及びＲＯＩＪＸら（１９９０）Ｂｉ ｏＴｅｃｈ　８　：　４８−５７の方法に従う改良アンカーＰＣＲ反応において 利用した。オリゴヌクレオチドＡＴは配列５’　−ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡ ＣＣＧＴＣＣＧ学＾ＴＣ，ＧＡＴＣＡＴＴ−３’　（Ｒａｆｎｅｒら、前掲）を 有す。オリゴヌクレオチドＡしは配列５’　−ＡＡＴＧＡＴＣＧＡＴＧＣＴ−３ ’　（Ｒａｆｎｅｒら、前掲）を有す。

クローン１．２Ｒ及びクローン＋９Ｒのアミノ末端をリーカー化ｃＤＮＡから増 幅された（２Ｒ１反応）　。ＰＣＲを市販のキット（ＧｅｎｅＡｍｐ　ＤＮＡＡ ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌ＋ｎｅｒ　Ｃｅｔｕｓ 、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を用いて実施し、ここでは、ｄＮＴＰを含むｌｏμｌ のｉｏｘのバッファーを１００　ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドＡＰ−２及び ＬＰ５−８プライマー（ＥＤ：ＥＤＴは３ＲＭの比）　、ｃＤＮＡ　（２μＩの リンカ−化ｃＤＮＡ反応混合物）、０．５μｍのＡｍｐｌｉｔａｑ　ＤＮＡポリ メラーゼ及び１００μｍにする蒸留水と混合した。、二のサンプルをプログラム されたサーマルコントローラー（ＭＪ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ．ＭＡ）で増幅させた。温度サイクルプログラムは下記を利用した 鋳型の変性ＤＮＡ、９４゛Ｃ、１分，オリゴヌクレオチドのアニール、６５”Ｃ ，１分３０秒；伸長、７２°Ｃ、２分：２４サイクル反復：４°Ｃに保持。

ＬＰ５−８は配列５’　−ＧＣＣＴＴＧＡＡＧＣＣ（Ａ／　Ｇ）ＧＣＧＴＴＧＡ −３　’を有し、ここで位１１２はＡ又はＧのいづれかである。ＬＰ５−８はＬ ｏｉ　ｐ　Ｉｂ．　１のヌクレオチド２２７　〜２４４（図３ｂ及び３ｃ）及び しｏｌ　ｐ　［ｂ．２のヌクレオチド２４８〜２６５（図１０ａ及びｊｏｂ）に 相補性の非コード鎖配列に相当する。ＡＰ−２は配列５’−ＧＧＧＴＣＴＡＧＡ ＧＧＴＡＣＣＧＴＣＣ−３’を有する。

−次反応は本明細書に記載の通りに実施した。この初期増幅物の２％（　２　μ Ｉ　）を次に１００　ｐｍｏｌの各ＡＰ−２及びＬＰ５−９、即ち内部入れモヤ Ｌｏｌ　ｐ　ｌｂ．Ｉ　／Ｉｂ．２オリゴヌクレオチドブライマーによる二次増 幅において用いた。ＬＰ５−９は配列５’　−ＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＧＧＴＣＧ ＴＣＧＣＣＴＴＣＣＣＴ−３　’を有し、ここでヌクレオチド５’　−ＴＴＧＧ ＡＴＣＣ−３　’　（ＬＰ５−９の塩基１〜８）はＢａｍＨ　Ｉ制限部位を作り 」二げるために付加され、そしてヌクレオチド９〜２６はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．Ｉ のヌクレオチド１８６〜２０３（図３ｂ及び３ｃ）並びにＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２ のヌクレオチド２０７〜２２４（図１０ａ及び１０ｂ）に相補性の非コード鎖配 列に相当する。主要増幅生成物は臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）染色した３％のＧ ＴＧアガロースゲル上の約１００〜２５０塩基対に由来するＤＮＡスミア（塗抹 ）であった。

増幅ＤＮＡを順にクロロホルム、次いでクロロホルム抽出、続いて氷上での０． ５容量の７．５Ｍの酢酸アンモニウム及び１．５容量のイソプロパツールによる 沈殿によって回収した。沈殿及び７０％のエタノールによる洗浄後、ＤＮＡを５ ０１ｚｌの反応においてＸｂａ　Ｉ及びＢａｍ　Ｈｌて同時消化し、容量を２０ μｍに減らすように沈殿させ、次いで調製２％ＧＴＧ　ＮｕＳｅｉｖｅ　ｒ：ｊ −メルトゲル（ＦＭＣ．　Ｒｏｃｋｐｏｒｔ，　ＭＥ）に電気泳動させた。適当 なサイズのＤＮＡがＥｔＢｒ染色により識別化され、切り出し、そして適当に消 化したｐＵｃＩ９　”−とりゲートし、市販のシーケンシングキット（Ｓｅｑｕ ｅｎａｓｅキット、Ｔａｑｕｅｎｃｅキット、両者ともＵ．　Ｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ．　Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，　ＯＨ由来）を用いてＳａ ｎｇｅｒら（　＋９７７）Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４　：５４６３−５４７６）のジデオキ シ連鎖停止法によりシーケンシングした。

全てのクローンは＊−ＰＣＲ反応に由来し、そしてアミノ酸の相違は潜在的な多 型性のみを示した。このようなアミノ酸相違はＴａｑポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ ら（１９８８）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９　＋　４８７　−４９１）における固 有のエラー率に基づき、独立のＰＣＲにおいて確認する必要がある。

■クローンがクローン１２Ｒに相同性な配列を含むことが見い出された。２クロ ーンはクローン１９Ｒと相同性であることが見い出された。Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ． Ｉにおけるアミノ酸相違をもたらすクローン１２Ｒにおける潜在的なヌクレオチ ド多型性を表６に示している。

表　６ アミノ酸の位置　アミノ酸の変化 Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２におけるアミノ酸変化をもたらすクローン１９Ｒにおける 潜在的な多型性が１クローンの中で見い出され、ここで位置３０のアミノ酸はＴ →Ｓと変っていた。

クローン１２Ｒの内部領域をコードするｃＤＮＡを上記の温度サイクルプログラ ムを利用するＰＣＲ反応において、オリゴヌクレオチドＬＰ５−５及びＬＰ５− ６を用いて一本＃Ａ　ｃＤＮＡからクローンした。ＬＰ５−５は配列５’　−Ｇ ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧ−３　’を有し、ここで ＬＰ５−５の塩基１〜８　（５’　−ＧＧＧＡＡＴＴＣ−３　”）はクローニン グ目的のためのＥｃｏＲ　Ｉ制限部位を作り上げるために付加され、そして塩基 ９〜２６はクローン１２Ｒのヌクレオチド１９９〜２１６及びクローン１９Ｒの ヌクレオチド２２０〜２３７に相当する。ＬＰ５−６は配列５’　−ＧＧＧＧＡ ＴＣＣＣＴＧＧＧＴＣＡＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴ−３　’を有し、ここで塩基１〜 ７　（５’　−ＧＧＧＧＡＴＣ−３’　）（ＬＰ５−６の塩基１〜７）はクロー ニング目的のためにＢａｍ）Ｉ　Ｉ制限部位を作りあげるために付加され、そし て塩基８〜２６はクローン１２Ｒのヌクレオチド８０８〜８２６に相補性である 。主要増幅生成物は約６２０塩基対のＤＮＡバンドであった。増幅ＤＮＡ生成物 を前記の通りに精製及び沈殿し、続いてＥｃｏＲ　Ｉ及びＢａｍＨ　Ｉで消化し 、そして調製２％ローメルトゲルに電気泳動させた。主要ＤＮＡバンドを切り出 し、そしてシーケンシングのために適当に消化したｐＵｃ１９にリゲートさせた 。クローン１２Ｒ内部配列を含むいくつかのクローンが獲得された。

全てのクローンは単一ＰＣＲ反応に由来し、そしてアミノ酸の相違は潜在的な多 型性のみを示した。このようなアミノ酸相違はＴｇｑポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ ら（１９８８）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：　４８７−４９１）において固有の エラー率に基づき、独立のＰＣＲにおいて確認する必要がある。

Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１の内部配列の潜在的な多型性を表７に示す。

表７ アミノ酸の位置　アミノ酸の変化 ８０　Ａ→Ｒ　ｏｒ　Ｇ ８４　１→Ｖ ９３　Ｖ→Ｉ　ｏｒ　Ｒ １８５Ｎ→に ２３２Ｉ→Ｍ 当業者は、本明細書記載の発明をここで記述されているもの以外に変更及び改良 できることを理解しているであろう。本発明は、本明細書に記載の全ての工程、 特徴、組成物及び化合物を個別に集約的に包括し、そして任意の２以上の前記の 工程又は特徴の全ての組合せを包括している。

Ｔ　２１１ｏ４３・２１２＜ｌ　ｔｇεＦＩＧＵＲＥ　３ａ 】７・ギョウギシバ　１．−・、、。

２０．スーダングラス　。

ヒロバｎ　Ｉ、）ｗｏ　−υツ　０− ＜Ｉｌｌφ　Ｉ−＋Φ　〇−トΦ　Ｑ−Ｃ：）＜　Ｕ−０＜　Ｏ，、−３０＋＜ ○１ＩＩＯ＋／＋０１ｉ−＋α　〇−〇トｕ　−＜ｔｈ−−＜ｔｎ　（Ｊｇ　Ｌ ｌ　−ａ＜　＜、−ａ　−ｏ＜＜ｔ−ａａ Ｏ−＜り　〇−噂　υｈ−Ｑ　− １１Ｃ＞−）１ａ）　ｍ：　卜〜　〇−←−ト←　←−←ト−〇ｒ＋Ｉ　０＞ ○ｉｘ　Ｑ＋ｔ＋　Ｃ）瞬　ＯｍＱ　ｌ、：ｌ　ψ０−Ｕ−＜＞　ロー−＜〉〜 ００　０＜　鴫−０＜−＜、−３ ｕＭ　Ｃａｍ　（ｊｒ＋＋　ＩＪΦ　〇−のωΦ　（Ｊ　−Ｏ−１−−ｆ−１ｎ ｒｔｒ＞トリ　Ｏく　ｏベ　ベ一　〇〉− 〇コ　Ｕｌ＋ｃｐｍｅ＋　−噂　Ｏ田 ＜−０Φ　（Ｊ−ｏ　＋＋ｃ”ｓＵ　−ロ０　トψ　Ｑく　ｏ鴫−Ｑく ？　−Ｕｌ−ＱＴｈ−＋　Ｌ）り　Ｏロロ）−１１１（Ｊぶ　０−　（−〇−の Ｃ）＞　＜？　Ｃ：）ｔＤ　（）（ｊ　ＣＪｏ＠−（）ａ＋ｔｒ＞　ｔＪｑ　Ｃ ：）ＨＣＪ　−Ｏｍ←４ａ５　トΦ　ｗ：　−Ｑ　ｘ３　−ｂ−。

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Claims (89)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも一種のＬｏｌ　ｐＩｂほそ麦花粉アレルゲン、又はその少なくと も一種の抗原性フラグメント、又はその誘導体もしくは同族体をコードする精製 核酸配列、又は前記核酸配列の機能的同等物。
2. ２．前記核酸配列が図３ｂ及び３ｃに示しているＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１のアミノ 酸−２５〜２７６をコードする核酸配列より本質的に成る、請求項１に記載の核 酸配列。
3. ３．前記核酸配列が図３ｂ及び３ｃに示しているＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１をコード する核酸配列のコード領域の少なくとも一種のフラグメントより本質的に成る、 請求項１に記載の核酸配列、又は前記核酸配列の機能的同等物。
4. ４．前記核酸配列が図１０ａ及び１０ｂに示しているＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２のア ミノ酸−２５〜３１４をコードする核酸配列より実質的に成る、請求項１に記載 の核酸配列。
5. ５．前記核酸配列が図１０ａ及び１０ｃに示しているＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２をコ ードする核酸配列のコード領域の少なくとも一種のフラグメントより本質的に成 る、請求項１に記載の核酸配列、又は前記核酸配列の機能的同等物。
6. ６．前記核酸配列が図３ｂ及び３ｃに示しているＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１のアミノ 酸１〜２７６をコードする核酸配列より本質的に成る、請求項１に記載の核酸配 列。
7. ７．前記核酸配列が図１０ａ及び１０ｃに示しているＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２のア ミノ酸１〜３１４をコードする核酸配列より本質的に成る、請求項１に記載の核 酸配列。
8. ８．少なくとも一種のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲン、又はその少なく とも一種の抗原性フラグメント、又はその誘導体もしくは同族体をコードする核 酸配列、又は前記核酸配列の機能的同等物を含んで成る発現ベクター。
9. ９．前記核酸配列が、図３ｂ及び３ｃに示しているＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１に関す る核酸配列のコード領域のヌクレオチド配列より本質的に成る、請求項８に記載 の発現ベクター。
10. １０．前記核酸配列が、図３ｂ及び３ｃに示しているＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１に関 する核酸配列のコード領域の少なくとも一種のフラグメントより本質的に成る、 請求項８に記載の発現ベクター。
11. １１．前記核酸配列が、図１０ａ及び１０ｂに示しているＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２ に関する核酸配列のコード領域のヌクレオチド配列より本質的に成る、請求項８ に記載の発現ベクター。
12. １２．前記核酸配列が、図１０ａ及び１０ｂに示しているＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２ に関する核酸配列のコードの領域の少なくとも一種のフラグメントより本質的に 成る、請求項８に記載の発現ベクター。
13. １３．前記核酸配列が図３ｂ及び３ｃに示しているＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１のアミ ノ酸１−２７６をコードする核酸配列より本質的に成る、請求項８に記載の発現 ベクター。
14. １４．前記核酸配列が図１０ａ及び１０ｂに示しているＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２の アミノ酸１−３１４をコードする核酸配列より本質的に成る、請求項８に記載の 発現ベクター。
15. １５．請求項１に記載の核酸配列によりコードされるタンパク質又はペプチドを 発現するように形質転換された宿主細胞。
16. １６．請求項２の核酸配列によりコードされるタンパク質を発現するように形質 転換された宿主細胞。
17. １７．請求項３の核酸配列によりコードされるペプチドを発現するように形質転 換された宿主細胞。
18. １８．請求項４の核酸配列によりコードされるタンパク質を発現するように形質 転換された宿主細胞。
19. １９．請求項５の核酸配列によりコードされるペプチドを発現するように形質転 換された宿主細胞。
20. ２０．請求項６の核酸配列によりコードされるタンパク質を発現するように形質 転換された宿主細胞。
21. ２１．請求項７の核酸配列によりコードされるタンパク質を発現するように形質 転換された宿主細胞。
22. ２２．請求項１の核酸配列により形質転換された宿主細胞において生成された少 なくとも一種の精製ほそ麦花粉アレルゲンＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ科構成員又はその少 なくとも一種の抗原性フラグメント、又はその誘導体もしくは同族体。
23. ２３．請求項２の核酸配列により形質転換された宿主細胞において生成された精 製ほそ麦花粉アレルゲンＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１。
24. ２４．請求項３の核酸配列により形質転換された宿主細胞において生成された精 製ほそ麦花粉アレルゲンＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１、又はその誘導体もしくは同族体 の少なくとも一種のフラグメント。
25. ２５．請求項４の核酸配列により形質転換された宿主細胞において生成された精 製ほそ麦花粉アレルゲンＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２。
26. ２６．請求項５の核酸配列により形質転換された宿主細胞において生成された精 製ほそ麦花粉アレルゲンＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２、又はその誘導体もしくは同族体 の少なくとも一種のフラグメント。
27. ２７．請求項６の核酸配列により形質転換された宿主細胞において生成された精 製ほそ麦花粉アレルゲンＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１。
28. ２８．請求項７の核酸配列により形質転換された宿主細胞において生成された精 製ほそ麦花粉アレルゲンＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２。
29. ２９．少なくとも一種のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲン又はその少なく とも一種のフラグメント、又はその誘導体もしくは同族体を製造する方法であっ て、前記の少なくとも一種のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲン、又はその フラグメント、又はその誘導体もしくは同族体をコードするＤＮＡ配列により形 質転換された宿主細胞を、適当な培地の中で培養して、細胞と、前記の少なくと も一種のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲン、又はその少なくとも一種のフ ラグメント、又はその誘導体もしくは同族体を含む培地との混合物を作り；次に 任意的に前記混合物を精製して精製Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲン又は その少なくとも一種のフラグメント、又はその誘導体もしくは同族体を提供する ことを含んで成る方法。
30. ３０．前記少なくとも一種のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲンがＬｏｌｐ 　Ｉｂ．１又はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２である、請求項２９に記載の方法。
31. ３１．少なくとも一種のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲン、又はその少な くとも一種のフラグメント、又はその誘導体もしくは同族体をコードするＤＮＡ 配列により形質転換された宿主細胞において合成された前記の少なくとも一種の Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲン、又はその少なくとも一種のフラグメン ト、又はその誘導体もしくは同族体を含んで成るタンパク質調製物。
32. ３２．前記の少なくとも一種のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲンがＬｏｌ 　ｐ　Ｉｂ．１又はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２である、請求項３１に記載のタンパク 質調製物。
33. ３３．前記のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲンの前記の少なくとも一種の フラグメントが抗原性フラグメントである、請求項３１に記載のタンパク質調製 物。
34. ３４．少なくとも一種の化学的に合成したＬｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲ ン、又はその少なくとも一種のフラグメント、又はその誘導体もしくは同族体を 含んで成るタンパク質調製物。
35. ３５．前記Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲンが、図３ｂ及び３ｃに示すア ミノ酸配列を有するＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１である、請求項３１に記載のタンパク 質調製物。
36. ３６．前記Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲンが、図３ｂ及び３ｃに示すア ミノ酸配列を有するＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１である、請求項３４に記載のタンパク 質調製物。
37. ３７．前記Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲンが、図１０ａ及び１０ｂに示 すアミノ酸配列を有するＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２である、請求項３１に記載のタン パク質調製物。
38. ３８．前記Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲンが、図１０ａ及び１０ｂに示 すアミノ酸配列を有するＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２である、請求項３４に記載のタン パク質調製物。
39. ３９．Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲンの単離抗原性フラグメント。
40. ４０．ほそ麦花粉由来の前記アレルゲンがＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１である請求項３ ９に記載の抗原性フラグメント。
41. ４１．ほそ麦花粉由来の前記アレルゲンがＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２である請求項３ ９に記載の抗原性フラグメント。
42. ４２．前記抗原性フラグメントが前記アレルゲンの少なくとも−Ｔ細胞エピトー プを含んで成る、請求項３９に記載の抗原性フラグメント。
43. ４３．前記抗原性フラグメントがＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１の少なくとも−Ｔ細胞エ ピトープを含んで成る、請求項４０に記載の抗原性フラグメント。
44. ４４．前記抗原性フラグメントがＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２の少なくとも−Ｔ細胞エ ピトープを含んで成る、請求項４１に記載の抗原性フラグメント。
45. ４５．前記抗原性フラグメントが最少限イムノグロブリンＥ刺激活性を更に有す る、請求項４２に記載の抗原性フラグメント。
46. ４６．前記抗原性フラグメントが、ほそ麦花粉アレルゲンに特異的なイムノグロ ブリンＥに結合しない、請求項４２に記載の抗原性フラグメント。
47. ４７．前記抗原性フラグメントがほそ麦花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブ リンＥに結合しないか、又はもし前記イムノグロブリンＥに対するこのフラグメ ントの結合が生ずるにしても、かかる結合はマスト細胞又は好塩基性細胞からの ヒスタミンの放出をもたらさない、請求項４３に記載の抗原性フラグメント。
48. ４８．前記抗原性フラグメントがほそ麦花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブ リンＥに結合しない、請求項４３に記載の抗原性フラグメント。
49. ４９．前記抗原性フラグメントが最少限イムノグロブリンＥ刺激活性を更に有す る、請求項４４に記載の抗原性フラグメント。
50. ５０．前記抗原性フラグメントがほそ麦花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブ リンＥに結合しない、請求項４４に記載の抗原性フラグメント。
51. ５１．前記抗原性フラグメントがイムノグロブリンＥに対して、精製天然ほそ麦 花粉アレルゲンの前記イムノグロブリンＥに対する結合性よりも実質的に低い度 合いで結合する、請求項３９に記載の抗原性フラグメント。
52. ５２．前記抗原性フラグメントが、それが投与されたほそ麦花粉感受性個体にお けるほそ麦花粉に対するアレルギー応答を改善せしめることが可能である、請求 項３９に記載の抗原性フラグメント。
53. ５３．前記抗原性フラグメントが、それが投与されたほそ麦花粉感受性個体にお けるほそ麦花粉に対するアレルギー応答を改善せしめることが可能である、請求 項４０に記載の抗原性フラグメント。
54. ５４．前記抗原性フラグメントが、それが投与されたほそ麦花粉感受性個体にお けるほそ麦花粉に対するアレルギー応答を改善せしめることが可能である、請求 項４１に記載の抗原性フラグメント。
55. ５５．前記抗原性フラグメントが、ほそ麦花粉アレルゲンに対する個体のＢ細胞 応答、ほそ麦花粉アレルゲンに対する個体のＴ細胞応答、又はほそ麦花粉アレル ゲンに対するＢ細胞応答及びＴ細胞応答の両方を改善せしめることが可能である 、請求項５２に記載の抗原性フラグメント。
56. ５６．前記抗原性フラグメントが、ほそ麦花粉アレルゲンに対する個体のＢ細胞 応答、ほそ麦花粉アレルゲンに対する個体のＴ細胞応答、又はその両者を改善せ しめることが可能である、請求項５３に記載の抗原性フラグメント。
57. ５７．前記抗原性フラグメントが、ほそ麦花粉アレルゲンに対する個体のＢ細胞 応答、ほそ麦花粉アレルゲンに対する個体のＴ細胞応答、又はその両者を改善せ しめることが可能である、請求項５４に記載の抗原性フラグメント。
58. ５８．請求項４０のほそ麦花粉アレルゲンの単離抗原性フラグメントをコードす る核酸配列。
59. ５９．ほそ麦花粉感受性個体に投与したときに、ほそ麦花粉に対する個体のアレ ルギー応答を低める、改良ほそ麦花粉タンパク質アレルゲン。
60. ６０．前記改良ほそ麦花粉タンパク質アレルゲンが改良Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１タ ンパク質、又はその誘導体もしくは同族体である、請求項５９に記載の改良ほそ 麦花粉タンパク質アレルゲン。
61. ６１．前記改良ほそ麦花粉タンパク質アレルゲンが改良Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２タ ンパク質、又はその誘導体もしくは同族体である、請求項６０に記載の改良ほそ 麦花粉タンパク質アレルゲン。
62. ６２．ほそ麦花粉感受性個体に投与したときに、ほそ麦花粉に対する個体のアレ ルギー応答を低める、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲンの少なくとも一改 良フラグメント。
63. ６３．前記改良フラグメントがＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１タンパク質又はその誘導体 もしくは同族体である、請求項６２に記載の少なくとも一改良フラグメント。
64. ６４．前記改良フラグメントがＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２タンパク質又はその誘導体 もしくは同族体である、請求項６２に記載の少なくとも一改良フラグメント。
65. ６５．Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１又はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２、あるいはＬｏｌ　ｐ　 Ｉｂ．１又はＬｏｌ　ｐＩｂ．２のフラグメント又は誘導体もしくは同族体に免 疫学的に関連している、単離タンパク質アレルゲン又はその抗原性フラグメント 。
66. ６６．前記タンパク質アレルゲン又はその抗原性フラグメントが、Ｌｏｌ　ｐ　 Ｉｂ．１又はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２、あるいはＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１又はＬｏｌ 　ｐ　Ｉｂ．２のフラグメント又は誘導体もしくは同族体に特異的な抗体と免疫 学的に交差反応性である、請求項６５に記載の単離タンパク質アレルゲン又はそ のフラグメント。
67. ６７．精製ほそ麦花粉アレルゲンＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１又はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ． ２、あるいはＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１又はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２の少なくとも一フ ラグメント又は誘導体もしくは同族体、及び薬理学的に許容される担体又は希釈 剤を含んで成る、薬理組成物。
68. ６８．Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１が図３ｂ及び３ｃに示しているアミノ酸１〜２７６ の配列を有す、請求項６７に記載の薬理組成物。
69. ６９．Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２が図１０ａ及び１０ｂに示しているアミノ酸１〜３ １４の配列を有す、請求項６７に記載の薬理組成物。
70. ７０．ほそ麦花粉アレルゲン又はほそ麦花粉アレルゲンと免疫交差反応性なアレ ルゲンに対して感受性な哺乳動物におけるほそ麦花粉アレルゲンに対する感受性 を処置する方法であって、前記哺乳動物に、治療的に有効な量の請求項３１のタ ンパク質調製物を投与することを含んで成る方法。
71. ７１．ほそ麦花粉アレルゲン又はほそ麦花粉アレルゲンと免疫交差反応性なアレ ルゲンに対して感受性な哺乳動物におけるほそ麦花粉アレルゲンに対する感受性 を処置する方法であって、前記哺乳動物に、治療的に有効な量の請求項３４のタ ンパク質調製物を投与することを含んで成る方法。
72. ７２．ほそ麦花粉アレルゲン又はほそ麦花粉アレルゲンと免疫交差反応性なアレ ルゲンに対して感受性な哺乳動物におけるほそ麦花粉アレルゲンに対する感受性 を処置する方法であって、前記哺乳動物に、治療的に有効な量の請求項３２のタ ンパク質調製物を投与することを含んで成る方法。
73. ７３．ほそ麦花粉アレルゲン又はほそ麦花粉アレルゲンと免疫交差反応性なアレ ルゲンに対して感受性な哺乳動物におけるほそ麦花粉アレルゲンに対する感受性 を処置する方法であって、前記哺乳動物に、治療的に有効な量の請求項６８の治 療用組成物を投与することを含んで成る方法。
74. ７４．Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂほそ麦花粉アレルゲンに感受性な哺乳動物を検査する方 法であって、前記哺乳動物から獲得した血液サンプルを、請求項１の核酸配列も しくはそのフラグメントにより形質転換された宿主細胞において生成されたもの であるか又は化学的に合成されたものである、単離ほそ麦花粉タンパク質アレル ゲンもしくはその抗原性フラグメント、あるいは前記ほそ麦花粉タンパク質の誘 導体もしくは同族体と、血液成分がこのタンパク質又はそのフラグメント、又は その誘導体もしくは同族体に結合するのに適当な条件のもとで組合せ、次いでか かる結合の生じた度合いを決定することを含んで成る方法。
75. ７５．前記の結合の生じた度合いを、Ｔ細胞機能；Ｔ細胞増殖；Ｂ細胞機能；タ ンパク質又はそのフラグメント、又はその誘導体もしくは同族体の血液中に存在 している抗体との結合；の評価により、あるいはそれらの組合せによって決定す る、請求項７４に記載の方法。
76. ７６．ほそ麦花粉アレルゲンに対する哺乳動物の感受性を検査する方法であって 、前記動物においてアレルギー応答を誘引せしめるのに十分な量の少なくとも一 種のほそ麦花粉アレルゲンＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ科構成員又はその少なくとも一抗原 性フラグメントを前記動物に投与し、次いで前記ほそ麦花粉アレルゲンに対する その個体におけるアレルギー応答の発生を決定することを含んで成る方法。
77. ７７．天然精製ほそ麦花粉アレルゲンＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ又はその少なくとも一種 の抗原性フラグメント、又はその誘導体もしくは同族体。
78. ７８．真核系又は原核系複製起点；検出マーカー；Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１又はＬ ｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２アレルゲンタンパク質、又はその少なくとも一種のフラグメ ント、又はその誘導体もしくは同族体、又は前記Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１又はＬｏ ｌ　ｐ　Ｉｂ．２タンパク質文はその誘導体もしくは同族体と交差反応性なアレ ルゲンタンパク質をコードするＤＮＡ配列；及び任意的に前記ＤＮＡ配列の転写 を誘発することのできるプロモーター配列；を含んで成る組換ＤＮＡ分子。
79. ７９．前記プロモーターがＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１遺伝子プロモーター又はＬｏｌ ｐ　Ｉｂ．２遺伝子プロモーターである、請求項７９に記載の組換ＤＮＡ。
80. ８０．組換Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１，Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２、又はＬｏｌ　ｐ　Ｉ ｂ．１もしくはＬｏｌｐＩｂ．２の少なくとも一種のフラグメント、又はそれら の誘導体もしくは同族体、あるいはＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１もしくはＬｏｌ　ｐ　 Ｉｂ．２、又はＬｏｌ　ｐＩｂ．１もしくはＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２の少なくとも 一種のフラグメント、又はそれらの誘導体もしくは同族体に対する抗体に免疫学 的に反応性なアレルゲンタンパク質を製造する方法であって、複製可能な組換Ｄ ＮＡ分子を含む生物（この分子は、前記先物において発現可能なプロモーター； このプロモーターの下流に位置し、且つそれより転写されるＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ． １，Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２、又はその少なくとも一種のフラグメント、又はその 誘導体もしくは同族体、あるいはＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１又はＬｏｌｐＩｂ．２の 免疫学的関連タンパク質をコードする遺伝子；選択マーカー；及び原核系又は真 核系複製起点を含んで成る）を、前記組換ＤＮＡ分子が安定的に維持され、且つ 、Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１，Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２、又はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１も しくはＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２の少なくとも一種のフラグメント、又はその誘導体 もしくは同族体、又はその免疫学的関連物の合成が誘発される条件のもとで及び 時間にわたって培養し、次いで任意的にそれらを単離することを含んで成る方法 。
81. ８１．前記プロモーターがＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１プロモーター又はその同族体も しくは縮重体であり、そして宿主生物が、前記プロモーターがその中で機能する であろうものである、請求項８０に記載の方法。
82. ８２．前記プロモーターがＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２プロモーター又はその同族体も しくは縮重体であり、そして宿主生物が、前記プロモーターがその中で機能する であろうものである、請求項８０に記載の方法。
83. ８３．組換ＤＮＡ分子であって、その上に位置しているほそ麦花粉プロモーター 配列又はその同族体もしくは縮重体を含んで成り、そして更には前記プロモータ ーの下流にある１又は複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を有しており、ここで それらの中に挿入されているほそ麦花粉アレルゲンＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１もしく はＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２、又はＬｏｌ　ｐＩｂ．１もしくはＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ． ２の少なくとも一種の抗原性フラグメント、又はそれらの誘導体もしくは同族体 をコードする核酸配列が適切な解読枠の中で転写可能となっている、組換ＤＮＡ 分子。
84. ８４．請求項２３のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１に対して発生せしめた、Ｌｏｌ　ｐ　 Ｉｂ．１に特異的なモノクローナル抗体。
85. ８５．請求項２５のＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１に対して発生せしめた、Ｌｏｌ　ｐ　 Ｉｂ．１に特異的なモノクローナル抗体。
86. ８６．前記抗体がＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．１とＬｏｌ　ｐ　Ｉｂ．２に交差反応性で ある、請求項８４に記載のモノクローナル抗体。
87. ８７．前記抗原性フラグメントがほそ麦花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブ リンＥに結合しないか、又は前記イムノグロブリンＥに対するフラグメントの結 合が生ずるにしても、かかる結合はマスト細胞又は好塩基性細胞からのヒスタミ ンの放出をもたらさない、請求項４４に記載の抗原性フラグメント。
88. ８８．精製天然Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂの少なくとも一種の抗原性フラグメント、又は 前記の少なくとも一種の抗原性フラグメントの誘導体もしくは同族体を含んで成 る薬理組成物。
89. ８９．Ｌｏｌ　ｐ　Ｉｂ又はそのフラグメントに特異的なＴ細胞を刺激すること のできる、請求項６６に記載の単離タンパク質アレルゲン又はそのフラグメント 。