JP3868480B2 - ライグラス花粉アレルゲンのｔ細胞エピトープ - Google Patents
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Description
発明の背景
アレルゲンはグラス(grass)花粉の極めて多種類のタンパク質からなり、温帯性気候での主なアレルギー性疾患の原因である。(Marsh(1975年)アレルゲンおよびアレルギー遺伝学(Allergens and genetics of allergy)M.Sela(編集)、抗原、第3巻、第271-359頁、アカデミックプレス社(Academic Press Inc.)ロンドン、ニューヨーク)。Hillら(1979)Medical Journal of Australia 1,426-429)。ライグラスにおけるアレルゲンタンパク質の最初の記載では、それらは免疫的に識別されることが示され、I、II、IIIおよびIV群として知られている(JohnsonおよびMarsh(1965)Nature,206,935-942：およびJohnsonおよびMarsh(1966)Immunochemistry 3,91-100)。国際免疫学会(International Union of Immunological Society:IUIS)の命名法を使用すると、これらのアレルゲンはLol pＩ、Lol pII、Lol pIIIおよびLol pIVと命名される。さらに文献ですでに同定された別の重要なロリウム プレンネ エル(Lolium prenne L)アレルゲンはLol p Vであり、これはLol pIXまたはLol pIbとして知られている(Singhら、(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1384-1388。Suphiogluら、1992.Lancet.339:569-572)。
これら5つのタンパク質がライグラス(Lolium perenne L.)花粉中に確認され、そして感受性のヒトにおいて過敏症を直接引き起こす(１型)アレルゲンとして作用する。
Lol pＶはライグラス−感受性患者の血清IgEに特異的に結合し、IgG応答において抗原として作用し、そしてＴ−細胞応答を引き起こす能力によりアレルゲンであると定義されている。アレルゲン的特性はライグラス花粉感受性疾患の80％がLol pＶイソフォームに結合する特異的IgE抗体を保有することを表すイムノブロッティング法により実証された(国際公開第93/04174号明細書、第65頁)。これらの結果はLol pＶが主要ライグラスアレルゲンであることを示している。
グラス花粉間の実質的なアレルゲンの交差反応は、例えばMarshら、(1970)J.Allergy,46,107-121およびLowenstein(1978)Prog.Allergy.25,1-62(Karger,Basel)に記載されているようなIgE−結合アッセイ、ラスト法(radioallergo-sorbent test:RAST)を使用して実証された。
Lol p Ｖと他のグラス花粉抗原との免疫化学的関係はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方(Zhangら、Int Arch Allergy Appl Immunol.96:28-34(1991)：Robertsら、Int Arch Allergy Appl Immunol.98:178-180(1992)：ならびにMattheisenおよびLowenstein.Clinical and Experimental Allergy.21:309-320(1991))を使用して実証された。抗体はIgE成分に結合するタンパク質を精製するために調製された。これらのデータにより親密に関連したグラス花粉中に存在する主要アレルゲンは免疫化学的にLol p Ｖと類似しており、そして一般的にＶ群アレルゲンと特徴付けられることが証明された。
発明の要約
本発明はLol p Ｖの単離されたペプチドを提供する。本発明の範囲内で治療的に使用されるペプチドはLol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、好ましくは少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含んで成る。本発明はさらに少なくとも２つの領域(各領域はLol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成る)を含んで成るペプチドを提供する。診断を目的として使用するための本発明のペプチドは、IgEに結合でき、かつ少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含んで成る。
本発明は、天然に存在するアレルゲンまたはその部分に対応するような同等な、または増強された治療的特性を有するが、副作用が減少した修飾ペプチド、ならびに溶解性および安定性が向上した特性を有する修飾ペプチドを提供する。本発明の治療用ペプチドは、ペプチドをが投与されるLol p Ｖ−感受性個体において、Lol p ＶまたはLol p Ｖに免疫的に交差−反応性の抗原に対する個体のアレルギー反応を調節することができる。
個体のグラスアレルゲンに対する感受性を治療または診断するための方法、ならびに少なくとも１つ以上の本発明のペプチドを含んで成る治療用組成物も提供する。
本発明はLol p Ｖペプチドの誘導体または同族体、ならびにLol p Ｖ抗体に免疫的に交差−反応性のペプチド、あるいはLol p ＶのＴ細胞と免疫的に交差反応性のペプチドあるいはそれらの誘導体または同族体も提供する。
本発明のさらなる特徴は、以下の本発明の好適な態様の詳細な記述および添付図面からよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
第１図はcDNAクローン12R(配列番号１)のヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列(配列番号２)を表す。クローン12RはLol p Ｖの全鎖長クローンである。
第２図はLol p Ｖ由来の種々の長さの本発明の種々のペプチドを表す。
第３図は誘導アレルゲンLol p Ｖ、粗ライグラス花粉抽出物または粗バミューダグラス花粉抽出物の存在中で、自己の照射PBMCで培養した34日目のＴ細胞系からのＴ細胞の刺激指数をグラフで表したものであり、増殖は[3H]TdRの取り込みによりアッセイし、結果はアレルゲンと一緒の細胞の平均CPMを培地のみの細胞の平均CPMで除算することにより決定し、各アレルゲン濃度は3回試験した。
第４図は健康なライグラス花粉アレルギー性成人由来のＴ細胞系の、Lol p Ｖ合成ペプチドに対する49日目の増殖応答をグラフに表したものであり、結果は２連の培養物の１分間あたりの平均計数(CPM)で表し、アレルゲンが無い場合の細胞のバックグラウンド応答は4849 CPMであった。
第５図はLol p Ｖ合成ペプチドに対するＴ細胞クローンA12の増殖応答をグラフに表したものであり、結果は２連の培養物に関して１分間あたりの平均計数(CPM)で表し、アレルゲンが無い場合の細胞のバックグラウンド応答は358 CPMであり、そしてＹ軸は対数スケールで表す。
第６図は健康なライグラス花粉アレルギー性成人由来の第二Ｔ細胞の、Lol p Ｖ合成ペプチドに対する増殖応答をグラフに表したものであり、結果は１分間あたりの平均計数(CPM)で表し、アレルゲンが無い場合の細胞のバックグラウンド応答は2500 CPMであり、ペプチド濃度は0.1μg/mlであった。
第７図はLol p Ｖ由来の35個の重複ペプチドのドットブロットイムノアッセイを表し、(クローン12R)ニトロセルロース(NC)フィルター上に固定化し、そしてヒトIgE結合を示す個体血清、mAbsFMC-A7およびポリクローナル抗−Lol p Ｖウサギ抗体でスクリーニングした。Ｃは陽性対照として使用した粗ライグラス花粉抽出物(１μg/ドット)を表す。
第８図はクローン12R由来の重複連続合成ペプチドのドットイムノアッセイに基づくLol p ＶのＢ細胞エピトープの同定を表す；図８ａは総数50名のライグラス花粉アレルギー患者由来の16種の陽性血清のIgE結合を表す(Rast≧４)；図８ｂはモノクローナルまたはポリクローナル抗体結合を表し、値はファルマシアＬＫＢ社(Pharmacia LKB)のUltraScan XL(スウェーデン)で測定したドットブロットの強度を示す任意のデンシトメトリー的単位であり、バックグラウンドと比較してデンシトメトリー値≧２を陽性結合と考えた；各ペプチドに関して血清および抗体値を加え(得点／ペプチド)、そして陽性血清または抗体数で除算して最終値を平均(得点／血清または抗体)として表し、血清Ｃ１およびＣ２を陰性対照として使用した(Ｃは陽性対照としての粗ライグラス花粉抽出物(１μｇ／ドット)を言う)。
第９図はペプチド３４(配列番号３６)での阻害ペプチドドット−ブロットを表し、ペプチド６(配列番号８)、２４(配列番号２６)および３１(配列番号３３)は陰性対照として使用した；FPLCで精製したLol p Ｖは“IX”と命名し、そして“Ｃ”と命名した粗ライグラス花粉抽出物は陽性対照として使用した。
第１０図はペプチド３４(配列番号３６)での阻害ELISAをグラフで表したものであり、ペプチド６(配列番号８)、２４(配列番号２６)および３１(配列番号３３)を陰性対照として使用した；そして粗ライグラス花粉抽出物を陽性対照として使用した。
発明の詳細な記述
本発明はLol p Ｖ由来の単離されたペプチドを提供する。本明細書で使用する、ペプチドまたはタンパク質の断片とはタンパク質の全アミノ酸配列よりも少ないアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を言う。本明細書において“単離された”および“精製された”という用語は、組換えDNA法で生成されたとき、細胞物質または培養培地が実質的に存在しない本発明のペプチドを言うか、あるいは化学的に合成されたときに化学的前駆体または他の薬剤が実質的に存在しない本発明のペプチドを言う。本明細書で使用する本発明の“ペプチド”という用語は、アレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成るLol p Ｖ由来のペプチド、あるいは少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成るそのようなペプチドの部分および／またはIgEに結合し、かつ少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含んで成るLol p Ｖ由来のペプチドを含む。
少なくとも２つの領域(各領域はLol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープをを含んで成る)を含むペプチドも本発明の範囲内にある。単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの領域(各領域はLol p Ｖタンパク質アレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成る)は、増強された治療効果のために特に望ましい。本発明のペプチドに免疫学的に関連したペプチド(例えば抗体またはＴ細胞交差−反応性により)も、本発明の範囲内にある。抗体交差−反応で免疫学的に関連するペプチドは、Lol p Ｖのペプチドに特異的な抗体に結合する。Ｔ細胞交差−反応で免疫学的に関連するペプチドは本発明のペプチドと同一のＴ細胞と反応できる。
本発明の単離されたペプチドは、そのようなペプチドをコードする配列を有する核酸で宿主細胞を形質転換させることにより、組換えDNA法で生産することもできる。本発明の単離されたペプチドは化学合成により生成することもできる。ペプチドを組換え法で生産する場合には、宿主細胞を本発明のペプチドをコードする配列を有する核酸で形質転換し、その核酸配列の機能的均等体は細胞に適する培地中で培養され、そしてペプチドは細胞培養培地、宿主細胞または双方からペプチドおよびタンパク質精製のための当該技術分野の周知技術(イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動またはペプチド、ペプチドが誘導されたタンパク質アレルゲン、またはそれらの部分に特異的な抗体での免疫精製法を含む)を使用して精製できる。
本発明は発現ベクターおよび本発明の核酸配列を発現するために形質転換された宿主細胞を提供する。本発明のLol p Ｖペプチドまたはその少なくとも１つの断片をコードする核酸を、大腸菌(E.coli)のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)のような哺乳類細胞中で発現させることができる。適当な発現ベクター、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素は、Sambrookら、モレキュラークローニング(Molecular Cloning)：ア ラボラトリーマニュアル(A Laboratory Manual)、第二版、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールド スプリング ハーバー、ニューヨーク、1989に見い出すことができる。他の適当な発現ベクター、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現要素は当業者に周知である。酵母での発現に適当なベクターは、YepSec1(Baldariら(1987)Embo J.6:229-234);pMFa(KurjanおよびHerskowitz(1982)Cell 30:933-943)：JRY88(Schultzら、(1987)Gene 54:113-123)およびpYES2(インビトロジェン コーポレーション：Invitrogen Corporation、サンジエゴ、カリフォルニア州)。これらのベクターは自由に入手可能である。バキュロウイルスおよび哺乳類発現系も入手しうる。例えばバキュロウイルス(baculovirus)系は、例えば昆虫細胞中での発現用として市販されており(ファーノンゲン：PharMingen、サンジエゴ、カリフォルニア州)、一方pMSGベクターは哺乳類細胞中での発現用として市販されている(ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)。
E.coli中での発現の中でも適当なベクターは、pTRC(Amannら，(1988)Gene 69:301-315);pGEX(アマラッド コーポレーション:Amrad Corp.、メルボルン、オーストラリア)；pMAL(エヌ.イー.バイオラボズ:N.E.Biolabs.、ベバリー、マサチューセッツ州)；pRIT5(ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)；pET-11d(ノバジェン;Novagen.、マジソン、ウィスコンシン州)、Jameelら、(1990)J.Virol. 64:3962-3966；およびpSEM(Knappら、(1990)BioTechniques 8:280-281)である。例えばpTRCおよびpET-11dを使用すると、非融合タンパク質の発現を導くだろう。pMAL、pRIT5、pSEMおよびpGEXの使用するとマルトースＥ結合タンパク質(pMAL)、プロテインＡ(pRIT5)、切断されたβ−ガラクトシダーゼ(PSEM)またはグルタチオンS-トランスフェラーゼ(pGEX)に融合したアレルゲンの発現を導くだろう。本発明のLol p Ｖペプチドを融合タンパク質として発現するとき、キャリアータンパク質とLol p Ｖペプチドの間の融合連結部に酵素的開裂部位を導入することは特に有利である。このLol p Ｖペプチドは融合タンパク質から酵素的部位で酵素的に開裂し、そしてタンパク質およびペプチド精製のための従来技術を使用する生化学的精製を通して回収できる。適当な酵素的開裂部位には、血液凝固因子Ｘａまたはトロンビンがあり、開裂のための適当な酵素および方法は、例えばモンタナ州、セントルイスのシグマ ケミカル社(Sigma Chemical Company,)およびマサチューセッツ州、ベバーリーのエヌ．イー．バイオラボズから入手できる。様々なベクターも種々のプロモーター領域を有し、構造的な、あるいは例えばIPTG誘導(PRTC、Amannら、(1988)同上；pET-11dノバジェン、マジソン、ウィスコンシン州)での、または温度誘導(pRIT5、ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)での誘導可能な発現を可能にする。組換え的に発現したタンパク質を分解する改変能力を有する種々のE.coli宿主中で組換えLol p Ｖペプチドを発現させることも適当かもしれない(例えば米国特許第4,758,512号明細書)。あるいはE.coliに優先的に使用されるコドンを使用するために核酸配列を変更すること(その核酸配列の変更部分は発現タンパク質のアミノ酸配列に影響しない)が有利かもしれない。
本発明の核酸配列を発現するために、例えばリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共−沈殿、DEAE-デキストラン-媒介トランスフェクションまたは電気穿孔法のような従来技術を使用して宿主細胞を形質転換させることができる。宿主細胞を形質転換させる適当な方法は、Sambrookら(同上)および他の研究参考書に見いだすことができる。本発明の核酸配列は標準的技法(すなわち固相合成法)を使用して化学的に合成することもできる。Lol p Ｖをコードするクローン12(Lol p Ib.1として記載されている)の単離およびクローニングの詳細は、国際公開第93/04174号明細書に与えられている。
本発明は本発明のペプチドをコードする核酸配列も提供する。本発明の任意の態様に使用する核酸配列は第７図に表されるような対応するペプチド配列をコードするcDNA、あるいは本明細書に表される配列の全部または部分を有する任意のオリゴヌクレオチド配列、あるいはそれらの機能的均等物であることができる。そのようなオリゴヌクレオチド配列は周知技法を使用して化学的または機械的に作成できる。オリゴヌクレオチド配列の機能的均等物は、１)第１図に表されるようなLol p Ｖの配列(または対応する配列部分)に対して相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできる配列、またはハイブリダイズするそれらの断片、あるいは２)(表１および第２図(配列番号１)に示されるLol p Ｖ由来のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列に相補的な対応する配列部分)および／または第３図)第１図(配列番号１)に示されるようなLol p Ｖの配列(または対応する配列部分)によりコードされる生成物と同一の機能的特性を有する生成物(例えばポリペプチドまたはペプチド)をコードする配列である。機能的均等物が１つまたは両方の基準を満たさなければならないかどうかは、その使用に依存し(例えばオリゴプローブとして使用するだけであれば第１または第２基準のひとつを満たすことが必要であり、そして本発明のLol p Ｖペプチドを作成するために使用するならば第３基準だけを満たすことが必要である)。本発明は、本発明のLol p Ｖペプチドをコードする核酸配列で形質転換させた宿主細胞を適当な培地中で培養し、Lol p Ｖペプチドを含有する細胞および該培地の混合物を生産させ；そして混合物を精製して実質的に純粋なLol p Ｖペプチドを生成する工程を含んで成る本発明の単離Lol p Ｖペプチドまたはそれらの部分の製造法も提供する。本発明のLol p Ｖペプチドまたはそれらの部分をコードするDNAを含有する発現ベクターで形質転換させた宿主細胞を、宿主細胞に適する培地中で培養する。本発明のLol p Ｖペプチドを細胞培養培地、宿主細胞または両方から、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動および本発明のLol p Ｖペプチドまたはそれらの部分に特異的な抗体での免疫的精製を含むペプチドおよびタンパク質精製のための当該技術分野での周知技法を使用して精製できる。
本発明の別の態様は、Lol p Ｖペプチドに特異的に反応する抗体に属する。そのような抗体はアレルゲン抽出物を標準化するために、または天然に存在するLol p Ｖを単離するために使用できる。また本発明のLol p Ｖペプチドをアレルゲン抽出物を標準化するために“精製された”アレルゲンとして使用することもできる。例えばマウスまたはウサギのような動物を、抗体反応を誘発できる本発明の単離されたLol p Ｖペプチドの免疫原性型で免疫することができる。ペプチドに免疫原性を付与する技術にはキャリアーへの連結、または他の当該技術分野の周知技術がある。Lol p Ｖペプチドをアジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行状態は血漿または血清標準ELISAでの抗体価の検出により監視することができ、あるいは抗体レベルを評価するために抗原として免疫原を用いる他のイムノアッセイを使用できる。
免疫化の後、抗−Lol p Ｖペプチド抗血清を得ることができ、所望により血清からポリクローナル抗−Lol p Ｖペプチド抗体を得ることができる。モノクローナル抗体を作成するために、抗体産生細胞(リンパ球)を免疫した動物から回収し、そしてミエローマ細胞のような不滅化細胞と標準的な体細胞融合法により融合して、ハイブリドーマ細胞を作成することができる。ハイブリドーマ細胞は本発明のLol p Ｖペプチドと反応性の抗体の生産について免疫化学的にスクリーニングすることができる。これらの血清またはモノクローナル抗体はアレルゲン抽出物を標準化するために使用できる。
本発明のペプチドおよび抗体の使用を通じて、組成および生物活性が一定で、よく明らかにされている調製物を作成でき、そして治療を目的として投与することができる(例えばライグラス花粉感受性個体の、そのようなグラスの花粉または免疫的に関連しているグラスの花粉に対するアレルギー応答を調節するために)。そのようなペプチドの投与は、例えばLol p Ｖアレルゲンに対するＢ-細胞応答、Lol p Ｖアレルゲンに対するＴ−細胞反応または両方の応答を調節することができる。単離されたペプチドはライグラス花粉アレルギーの免疫治療のメカニズムを研究し、そして免疫治療に有用な改良された誘導体および同族体の設計にも使用できる。
本発明は本発明のLol p Ｖペプチドを特異的に認識するＴ細胞クローンにも関する。これらＴ細胞クローンは本発明のペプチドと特異的に反応するＴ細胞レセプターのための遺伝子を単離およびモレキュラークローニングするために適しているかもしれない。Ｔ細胞クローンは実施例２に記載されているように生成でき、あるいはCellular Molecular Immunology,AbulK.Abbasら、ダブリュー．ビー．サンダース社(W.B.Saunders Co.)(1991)第139頁に記載されているように作成できる。本発明は可溶性Ｔ細胞レセプターにも関する。これらのレセプターはLol p Ｖに感受性個体中の関連するＴ細胞サブポピュレーション(T cell subpopulation)抗原−依存性活性化を阻害できる。そのようなＴ細胞レセプターと特異的に反応する抗体も作成できる。そのような抗体はまた、個体でのＴ-細胞−MHC相互作用を遮断するために有用でありうる。可溶性Ｔ−細胞レセプターの作成法はマサチューセッツ州サンダーランドのシンナー アソシエイツ(Sinaur Assoc)の、Immunology；合成(A Synthesis)、第２版、Edward S. Golubら、(1991)第366-369頁に記載されている。
溶解性を増大させ、治療的または予防的効力を増強し、あるいは安定性を増すために(例えばex vivoでの使用期限およびin vivoでのタンパク質溶解分解に対する耐性)、本発明のペプチド構造を修飾することも可能である。修飾されたペプチドは、免疫原性を改変し、そして／またはアレルゲン性を減少するためにアミノ酸置換、削除または付加によりアミノ酸配列が変更するように製造することができ、あるいは同じ目的のために成分を付加したものも製造できる。
例えばペプチドを免疫原の形態で投与した時に強い増殖性反応を誘導する能力を持たずに、あるいはいかなる増殖性応答の可能性を伴うことなく、Ｔ細胞アネルギーを誘導し、かつMHCタンパク質に結合するする能力を維持するようにペプチドを修飾することができる。この場合には、Ｔ細胞レセプターに対する主要な結合残基を周知技術により決定することができる(例えば、各残基を置換し、そしてＴ細胞反応性の有無を測定する)。Ｔ細胞レセプターとの相互作用に必須であると判明した残基を必須アミノ酸を別のものと置換し、好ましくはその存在がＴ細胞反応性を排除せずに強化、減少するか、または影響しないと示されている同様のアミノ酸と置換すること(保存的置換)により修飾できる。加えてこのようなＴ細胞レセプターの相互作用に必須ではないアミノ酸残基を、アミノ酸の導入によりＴ細胞反応性が増大、減少でき、または影響しないが関連のMHCへの結合を排除しない別のアミノ酸に置換して修飾することもできる。
さらに本発明のペプチドは、MHCタンパク質複合体との相互作用に必須であると示されているアミノ酸を別のものと置換し、好ましくはその存在かＴ細胞活性を排除せずに強化、減少するか、または影響しないと示されている同様のアミノ酸と置換すること(保存的置換)により修飾できる。加えてMHCタンパク質複合体との相互作用に必須ではないがMHCタンパク質複合体と結合するアミノ酸残基を、アミノ酸の導入によりＴ細胞反応性が影響を受けずに増大でき、または排除することなく減少する別のアミノ酸に置換して修飾することもできる。非必須アミノ酸に関して好ましいアミノ酸置換には、限定されるものでないが、アラニン、グルタミン酸またはメチルアミノ酸での置換がある。
安定性および／または反応性を増強するために、本発明のペプチドを修飾して天然対立遺伝子変異から生じるタンパク質アレルゲンのアミノ酸配列中に１つ以上の多型性を導入することもできる。加えて、非天然アミノ酸であるＤ−アミノ酸または非アミノ酸同族体に置換するか、または付加して本発明の範囲の修飾ペプチドを製造することもできる。さらに、本発明のペプチドをA.Sehonおよび共同研究者(Wieら、同上)のポリエチレングリコール(PEG)法を使用して修飾し、PEGと連結したタンパク質またはペプチドを生成することもできる。さらに、PEGは本発明のタンパク質またはペプチドの化学合成中に付加することができる。ペプチドまたはそれらの部分の修飾には還元／アルキル化(TarrのMethod of Protein Microcharacterization；J.E.Silvere編集、フマナ出版(Humana Press)、コルフトン、ニュージャージー州)第155-194頁(1986)；アシル化(Tarr、(同上))；適当なキャリアーへの化学的カップリング(MishellおよびShiigi編集、細胞免疫での選択された方法：Selected Methods in Cellular Immunology、WH Freeman、サンフランシスコ、カリフォルニア州(1980)；米国特許第4,939,239号明細書；または緩和なホルマリン処理(Marsh International Archives of Allergy and Applied Immunoly,41:199-215(1971)がある。
本発明のペプチドの精製を容易にし、場合により、そして可溶性を増加するために、ペプチド骨格にレポーター群(reporter groups：１つまたは複数)を加えることができる。例えばペプチドを金属アフィニティークロマトグラフィーで精製するためにポリ−ヒスチジンをペプチドに加えることができる(Hochuli,Eら、Bio/Technology, 6:1321-1325(1988))。さらに不適切な配列を含まないペプチドを単離するために、所望により特異的エンドプロテアーゼ開裂部位をレポーター群とペプチドのアミノ酸配列の間に導入することができる。個体をタンパク質抗原に対してうまく減感作するために、ペプチドに官能基を付加するか、あるいはペプチド中に疎水性Ｔ細胞エピトープまたは疎水性エピトープを含有する領域を含ませないか、あるいはタンパク質またはペプチドの疎水性領域を含ませなくすることにより溶解性を増す必要があるかもしれない。また疎水性残基をより疎水性が低い残基と交換することが必要かもしれないが、そのような交換は上記のようにMHC複合体またはＴ細胞レセプターに対する結合に影響する。
ペプチド中のＴ細胞エピトープの適性抗原プロセッシングに潜在的に役立たせるために、カノニカル(canonical)プロテアーゼ感受性部位を組換え的、または合成的に２つの領域中に操作することができ、この各領域は少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成る。例えばペプチド構築中にKKまたはRRのような荷電したアミノ酸対をペプチド中の領域間に導入できる。生成したペプチドをカテプシンおよび／または他のトリプシン−様酵素による開裂に対して感受性とし、１つ以上のＴ細胞エピトープを含むペプチドの部分を生成することができる。さらにそのような荷電したアミノ酸残基はペプチドの溶解性の増大をもたらす。
本発明のペプチドをコードするDNAの部位特異的突然変異誘発は、当該技術分野で周知である方法によりペプチドの構造を改変するために使用することができる。中でもそのような方法には縮重オリゴヌクレオチドでのPCR(Hoら、Gene,77:51-59(1989))または変異遺伝子の全合成(Hostomsky,Z.ら、Biochem.Biophys,Res.Comm.,161:1056-1063(1989))がある。細菌での発現を増大させるために、前記の方法を他の手順と組み合わせて使用し、本発明のタンパク質またはペプチドをコードするDNA構築物中の真核コドンをE.coli、酵母、哺乳類細胞または他の有核細胞中で優先的に使用されるコドンに変更することができる。
本発明のペプチドまたは抗体はライグラス花粉症を検出しそして診断するためにも使用できる。例えばそれは、ライグラス花粉に対する感受性を測定する個体から得た血液または血液産物と、Lol p Ｖの単離したペプチドとを血液成分(例えば抗体、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞)がペプチド(１つまたは複数)と結合する適当な条件下で混合して、そしてそのような結合が起こる程度を測定することにより行うことができる。
本発明の単離ペプチドをLol p Ｖ−感受性個体、またはLol p Ｖと交差−反応性のアレルゲンに対してアレルギー性の個体に治療的処方として投与するとき、本発明の単離ペプチドはLol p Ｖライグラス花粉アレルゲンまたはそのような交差−反応性アレルゲンに対する個体の応答を調節することができ、そして好ましくはアレルゲンに対する個体のＢ−細胞、Ｔ−細胞応答、あるいはＢ−細胞応答およびＴ−細胞応答を調節することができる。本明細書において、ライグラス花粉アレルゲンまたは交差−反応性アレルゲンに対する個体のアレルギー応答の調節とは、標準的な臨床方法(例えばVarneyら、British Medical Journal,302:265-269(1990)を参照のこと)により測定されるようなアレルゲンに対する症状が非−応答性であるか、または降下と定義できる(ライグラス花粉誘発喘息症状の降下を含む)。本明細書で述べるように、症状の降下には、個体が本発明のペプチドまたはタンパク質で治療処方を完了した後の個体のアレルゲンに対するアレルギー応答のすべての減少をも含む。この降下は主観的(すなわち患者はアレルゲンが存在してもより快適であると感じる)であってよい。症状の降下は当該技術分野で周知の標準的な皮膚試験により臨床的に測定することもできる。
Ｔ細胞刺激活性を持ち、かつこのように少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成る本発明のLol p Ｖペプチドは、特に治療目的のために望まれるものである。IgEに結合し、かつ少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含んで成る本発明のLol p Ｖペプチドは特に治療目的のために望まれるものである。エピトープについて言えば、エピトープがレセプター認識に必須のアミノ酸を含んで成るところで、エピトープはレセプター、特に免疫グロブリン、組織適合性抗原およびＴ細胞レセプターにより認識される基本的要素または最小単位となるだろう。これらのエピトープを模し、かつLol p Ｖに対するアレルギー性反応を下方制御するか、または減少できるアミノ酸配列も使用できる。Ｔ細胞エピトープは臨床的アレルギー症状の原因であるタンパク質アレルゲンに対する免疫反応の開始および永続化に関与すると考えられている。これらのＴ細胞エピトープは、抗原提示細胞の表面上の適切なHLA分子に結合し、そして関連するＴ細胞サブポピュレーションを刺激することによりＴヘルパー細胞のレベルで初期事象の引き金を引くものと考えられている。これらの事象はＴ細胞の増殖、リンホカインの分泌、局所炎症反応、その部位へのさらなる免疫細胞の補充、およびＢ細胞カスケードを活性化し抗体生産を導く。これら抗体のイソタイプのひとつであるIgEはアレルギー症状の発生に根本的に重要なものであり、その生産は分泌されたリンホカイン類の性質によりＴヘルパー細胞のレベルで、カスケード中でも初期に影響される。
ライグラス花粉アレルギー性患者を、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成り、かつLol p Ｖタンパク質アレルゲンに由来する本発明の単離Lol p Ｖペプチドにさらすと、Ｔ細胞サブポピュレーションがタンパク質アレルゲンに対して非応答性になり、そしてそのようにさらされたた際でも免疫反応の刺激に参加しないように、適切なＴ細胞サブポピュレーションを寛容にし、あるいは免疫性を減少させることができる。さらに少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成る本発明のペプチドまたはその部分を投与することにより、天然に存在するLol p Ｖタンパク質アレルゲンまたはその部分にさらしたものと比較して、リンホカイン分泌プロフィールを調節(モディファイ)することができる(例えばIL-4の減少かつ／またはIL-2の増加)。さらにそのような本発明のペプチドに対してさらすと、通常は天然に存在するアレルゲンに対する応答に参加するＴ細胞サブポピュレーションに影響を及ぼし、これらのＴ細胞をアレルゲンに対して通常さらされる部位(１つまたは複数の例えば鼻腔粘膜、皮膚および肺)から、断片またはタンパク質アレルゲンの治療投与部位(１つまたは複数)へ向かわせる。このＴ細胞サブポピュレーションの再分布により、個体の免疫系が通常の免疫応答をアレルゲンの正常被爆部位で刺激する能力を改善または減少させ、アレルギー症状の降下を生じることができる。
本発明の単離したLol p Ｖペプチドは、Lol p Ｖアレルゲンまたは交差反応性タンパク質アレルゲンに対するアレルギー反応を診断、処置および予防する方法に使用できる。したがって本発明はLol p Ｖアレルゲンまたは交差反応性タンパク質アレルゲンに対するアレルギーを診断するための診断用組成物を提供する。そのような組成物は合成的、または組換え的に生成したLol p Ｖ由来のペプチドおよび医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤を含んで成ることができる。そのような本発明の診断用組成物はラスト法(RAST)、放射性免疫吸着紙試験(paper radioimmunosorbent test：PRIST)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射性免疫アッセイ(RAD)、イムノラジオメトリックアッセイ(immunoradiometric assey:IRMA)、発光免疫アッセイ(LIA)、ヒスタミン放出アッセイおよびIgEイムノブロットのようなアレルギーに関する診断試験に使用できる。本発明はそのようなLol p Ｖペプチドまたはそれらの部分を発現させるために形質転換した宿主細胞中で生産された単離したLol p Ｖペプチドまたはそれらの部分、ならびに医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤を含んで成る治療用組成物も提供する。本発明の治療用組成物は、合成的に製造したLol p Ｖペプチドおよび医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤を含んで成ることもできる。本発明の治療用組成物を減感作させる個体に投与することは周知技術を用いて行うことができる。Lol p Ｖペプチドまたはそれらの部分は、例えば適当な希釈剤、キャリアーおよび／またはアジュバントと混合して個体への投与してもよい。医薬的に許容できる希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝液がある。医薬的に許容できるキャリアーにはポリエチレングリコール(Wieら、(1981)Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.64:84-99)およびリポソーム(Strejanら、(1984)J.Neuroimmunol 7:27)がある。Ｔ細胞アネルギーを誘発するために、治療用組成物は好ましくは非免疫原の形態(例えばアジュバントを含有しない)で投与される。本発明の治療用組成物はライグラス花粉感受性個体または免疫的にライグラス花粉アレルゲンと交差反応性であるアレルゲンに感受性の個体に投与される。
減感作すべき個体への本発明の治療用組成物の投与は、周知方法を使用してアレルゲンに対する個体の感受性を減少するために十分な(すなわちアレルギー性反応を減少する)投与量および期間で行なわれることができる。治療用組成物の効果的量は、個体のライグラス花粉に対する感受性の程度、年齢、性別および個体の体重、ならびにタンパク質またはそれらの断片が個体中でアレルギー反応を誘発する能力、というよう因子により変化するであろう。
活性化合物(すなわちタンパク質またはそれらの断片)は注射(皮下または静脈中等)、経口投与、吸入法、経皮的投与または直腸内投与のような便利な様式により投与できる。投与経路に応じて、活性化合物をを不活性化する可能性のある酵素、酸および他の自然状態から化合物を保護するために活性化合物を一定の物質で被覆することができる。
例えば単位投与量当たり好ましくは約1μg-3mg、そしてより好ましくは約20-500μgの活性化合物(すなわちタンパク質またはそれらの断片)を注射により投与できる。投薬は至適な治療反応を与えるために調整することができる。例えば幾つかに分割された投与量を日、週、月、1/4年または年単位で必要に応じて投与することができ、あるいは投与量を治療状況の緊急性に指示されるように比例的に減少または増加してもよい。
非経口的投与以外でペプチドを投与するために、不活性化を防止するための物質でタンパク質を被覆するか、またはタンパク質をそのような物質と一緒に投与する必要があるかもしれない。例えばペプチドまたはそれらの部分を酵素阻害剤と共に、またはリポソーム中で投与することができる。酵素阻害剤には膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロフォスフェート(DEP)およびトラジロールがある。リポソームは水中−油−水中CGF乳剤(water-in-oil-in-water CGF emulsion)および従来のリポソームを含む(Strejanら、(1984)J.Neuroimmunol 7：27)。
活性化合物を非経口的、または腹腔内に投与することもできる。分散剤をグリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物、ならびに油中に調製することもできる。通常の使用および保存条件下で、これら調製物は微生物の増殖を防止するために保存剤を含有してもよい。
注入可能な使用に適する医薬組成物には、分散剤の滅菌された注入可能溶液を即座に調製するための、滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散剤および滅菌粉末がある。すべての場合において、組成物は滅菌されなければならず、かつ容易に注射能力(syringability)が存在する程度に流体でなければならない。組成物は製造および保存の条件下で安定でなければならないし、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保護されなければならない。キャリアーは例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセラール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等)、それらの適当な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒質であることができる。例えばリシチン(licithin)のようなコーティング剤を使用することにより適切な流動性を維持することができ、分散剤の場合には必要な粒子サイズを維持することにより、そして表面活性剤を使用することにより維持することができる。微生物作用からの保護は、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チロメロサール等のような種々の抗菌および抗真菌剤により達成できる。多くの場合において、組成物中に例えばマンニトールおよびソルビトールのような糖類、ポリアルコール類、または塩化ナトリウムのような等張剤を含有することが好ましいだろう。注入可能な組成物の長時間に及ぶ吸収作用は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収作用を遅らせる薬剤を組成物中に加えることができる。
滅菌された注入可能溶液は、活性化合物(すなわちタンパク質またはペプチド)を必要な量で、必要に応じて上記に列挙した有効成分の１つまたは混合物と共に適当な溶媒中に包含し、次に濾過滅菌して調製することができる。一般的に分散剤は活性化合物を、基本的な分散媒質および上記に列挙した必要な他の成分を含有する滅菌賦形剤中に包含して調製する。滅菌された注入可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製法は有効成分(すなわちタンパク質またはペプチド)の粉末を産する真空乾燥または凍結乾燥法であり、それに予め滅菌濾過された所望の成分の溶液からの任意に付加される成分を加える。
本発明のペプチドが上記のように適切に保護されるとき、そのペプチドは例えば不活性希釈剤または同化しうる食用キャリアーと一緒に経口的に投与できる。このペプチドおよび他の成分を硬質または軟質殻ゼラチンカプセル中に包含するか、錠剤に圧縮するか、あるいは個人の食事に直接的に含ませることができる。経口治療用投与に関しては活性化合物は賦形剤とともに包含され、そして消化しうる錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、カシュ剤等の状態で使用できる。そのような組成物および調製物は少なくとも１重量％の活性化合物を含有すべきである。組成物および調製物の割合は、もちろん様々であってよく、好都合にも単位重量の5-80％の間でありうる。そのような治療に有効な組成物中の活性化合物量は、適切な投薬が得られるものである。本発明の好適な組成物または調製物は、経口投与量単位で約10μgから約200mgの間の活性化合物を含有するように調製されている。
錠剤、トローチ、ピル、カプセル等は以下のものも含有してよい：ガラガカントガム、アカシア、トウモロコシ澱粉またはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、アルギニン酸等のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑剤；およびシュクロース、ラクトースまたはサッカリンのような甘味剤、あるいはペパーミント、サリチル酸メチル油またはサクランボの香のような芳香剤。単位製剤形がカプセルである場合には上記種類の物質に加えて、液体キャリアーを含有してもよい。様々な他の物質が被覆剤として、または単位製剤の物理的形態を種々に改良するために存在してよい。例えば錠剤、ピルまたはカプセルを、セラック、糖またはその両方で被覆できる。シロップまたはエリキシルは活性化合物、甘味剤としてシュクロース、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素ならびにサクランボまたはオレンジのような香を含むことができる。もちろん任意の単位投与製剤を調製するにあたり使用するいかなる材料も、使用する量で医薬的に純粋かつ実質的に非毒性であるべきである。さらに、活性化合物を徐放性調製物および組成物中に包含することができる。
本明細書で使用する“医薬的に許容できるキャリアー”には任意の、そしてすべての溶媒、分散媒質、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等がある。医薬的な活性物質のための、そのような媒質および薬剤の使用は当該技術分野で周知である。活性化合物と配合禁忌である従来の媒質および薬剤を除くかぎり、治療用組成物にそのような媒質および薬剤を使用することは意図するところである。補助的な活性化合物も組成物中に含有できる。
非経口組成物を単位投与剤形に製剤することは、投与の容易性および投薬の均一性から特に有利である。本明細書で使用する投与単位は、治療すべき哺乳動物個体に単位投薬として適するように物理的に別個の単位を言う；各単位は必要な医薬的キャリアーに関連して所望の治療効果を得るために計算し製造された活性化合物を予め定めた量で含有する。本発明の新規投与単位剤形の仕様は、(ａ)活性化合物の独自の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに(ｂ)個体の感受性を処置するためのそのような活性化合物の配合技術に固有の限界により指定され、そして直接的に依存する。
ライグラス花粉タンパク質Lol p Ｖ由来の本発明の種々の単離ペプチドを、第２図および表１に表す。各領域がLol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなる少なくとも２つの領域を含んで成るペプチドも本発明の範囲内である。本明細書で使用するように、領域は第２図に示されるような本発明のペプチドのアミノ酸配列またはそのようなペプチドの部分のアミノ酸配列を含むことができる。
本発明の単離ペプチドを得るために、Lol p Ｖを所望の長さの非−重複ペプチドに分割するか、あるいは組換え的または合成的に製造できる実施例１に述べるような所望の長さの重複ペプチドに分割する。少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含んで成るペプチドはIgEに結合できる。少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成るペプチドは、Ｔ細胞増殖またはリンホカイン分泌のようなＴ細胞反応を誘発でき、かつ／またはＴ細胞アネルギーを誘導できる(すなわち寛容化)。少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成るペプチドを決定するために、単離したペプチドを例えばＴ細胞生物学的法により試験して、ペプチドがＴ細胞反応またはＴ細胞アネルギーを誘発するかどうか測定する。Ｔ細胞反応を誘発するか、またはＴ細胞アネルギーを誘導すると判明したこれらのペプチドは、Ｔ細胞刺激活性を有すると定義する。
実施例２に述べるように、ヒトＴ細胞刺激活性はLol p Ｖアレルゲンに感受性の個体(すなわちLol p Ｖアレルゲンに対するIgE媒介免疫反応を有する個体)から得たＴ細胞をアレルゲン由来のペプチドと培養し、そしてペプチドに反応してＴ細胞の増殖が起こるかどうかを測定することにより(例えばトリチウム標識チミジンの細胞内取り込みによる)試験することができる。ペプチドに関するＴ細胞の刺激指数は、ペプチドに反応した最大CPMを対照CPMで除算して算出できる。バックグラウンドの水準の２倍以上の刺激指数(S.I.)を“陽性”と考える。被験者の陽性結果を各ペプチドの刺激指数を算出するために使用する。本発明の好ましいペプチドは少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成り、かつ2.0以上のＴ細胞刺激指数を有する。ライグラス花粉感受性患者を対象として2.0以上のＴ細胞刺激指数を有するペプチドは治療薬として有用であると考える。好適なペプチドは少なくとも2.2のＴ細胞刺激指数を有し、より好ましくは少なくとも2.5、さらに好ましくは少なくとも3.0、よりいっそう好ましくは少なくとも3.4のＴ細胞刺激指数を有する。例えば第４、５または６図に表すような少なくとも2.5のＴ細胞刺激指数を有する本発明のペプチドには、ペプチド１４(配列番号１６)、２５(配列番号２７)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、および３４(配列番号３６)がある。
例えば詳細なマッピング技術により正確なＴ細胞エピトープを決定するために、Ｔ細胞刺激活性を有し、Ｔ細胞生物学的方法によりこのように少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成ると決定されたペプチドを、ペプチドのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかでアミノ酸残基を付加または削除することにより修飾し、そしてその修飾ペプチドに対するＴ細胞活性の変化を測定するために試験する。この方法の後、ペプチドを選択し、そして組換え的または合成的に製造する。好ましい治療用ペプチドは種々の因子(ペプチドに対するＴ細胞反応の強さ(例えば刺激指数)、ライグラス花粉に感受性個体の一群中でのそのペプチドに対するＴ細胞応答の頻度、および前記の他の種のグラス由来の別のアレルゲンとペプチドとの交差−反応の可能性)に基づき選択する。これら選択したペプチドの物理的および化学的特性(例えば溶解性および安定性)を試験してペプチドが治療用組成物として適当であるかどうか、あるいはペプチドに本明細書に記載したような修飾が必要であるかどうかを決定する。選択したペプチドまたは選択した修飾ペプチドのヒトＴ細胞を刺激する能力(例えば増殖の誘導、リンホカイン分泌)を測定する。
さらに、本発明の好適なＴ細胞エピトープ−含有治療用ペプチドは、免疫グロブリンＥ(IgE)に結合しないか、またはペプチドが誘導されたタンパク質アレルゲンよりもIgEに結合する程度が低い。標準的な免疫治療の主な困難は、アナフィラキシーのようなIgEが媒介する反応である。免疫グロブリンＥは抗原が肥満細胞または好塩基球上のIgEに結合および架橋結合し、そして媒介物(例えばヒスタミン、セロトニン、好酸球遊走因子)を放出することにより生じるアナフィラキシー反応のメディエーター(mediator)である。したがってLol p Ｖに感受性である個体群中に実質的な割合で生じるアナフィラキシーは、IgEと結合しないペプチド(１つまたは複数)の免疫療法的使用により、Lol p Ｖアレルゲンに感受性である個体群中において実質的割合(少なくとも約75％)で回避できる。あるいはもしペプチドがIgEに結合しても、そのような結合は肥満細胞または好塩基球から媒介物の放出を生じない。アナフィラキシーの危険性を、IgEとの結合性が減少したペプチド(１つまたは複数)を免疫療法に使用することにより減少できる。さらに、最少のIgE刺激活性を有するペプチドは治療効力に関しても望まれるものである。最少のIgE刺激活性とは、天然のLol p Ｖタンパク質アレルゲンにより刺激されたIgE生産よりも少ないIgE生産および／またはIL-4生産量を言う。
本発明のＴ細胞エピトープを含有するペプチドは、ライグラス花粉−感受性個体に治療的処置の処方で投与したときに、個体のアレルゲンに対するアレルギー応答を調節することができる。特にLol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープの含んで成るか、または少なくとも２つのLol p Ｖ由来領域(各領域は少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成る)を含んで成る本発明のLol p Ｖペプチドは、ライグラス花粉−感受性個体に治療的処置の処方で投与したときに、個体のアレルゲンに対するＴ細胞応答を調節することができる。
本発明の単離されたLol p Ｖ治療用ペプチドは、Lol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成るので、ペプチドは少なくとも約７個のアミノ酸残基を含んで成る。治療的効力を目的として、本発明の好適な治療用組成物は好ましくはLol p Ｖの少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含んで成るので、ペプチドは少なくとも約８個のアミノ酸残基、そして好ましくは少なくとも１５アミノ酸の酸残基を含んで成る。さらに好適な単離ペプチドを含んで成る本発明の治療用組成物は、好ましくはライグラス花粉感受性個体への組成物の治療的投与処方により個体のＴ細胞がタンパク質アレルゲンに対して寛容となるように、全アレルゲンタンパク質中のＴ細胞エピトープを十分な割合で含んで成る。ペプチド合成は長さが増加すると困難になるので、長さが最高約４５アミノ酸の残基、最も好ましくは長さが最高約３０アミノの残基含んで成る本発明の合成的に製造したペプチドが特に好ましい。本発明のペプチドは上記のように組換え的に生産することもでき、４５アミノ酸以上の長さのペプチドは組換え的に生産するのが好ましい。
治療目的に使用することができるLol p Ｖタンパク質アレルゲン由来のペプチドは、Lol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成り、そして以下のペプチドのアミノ酸配列全部または部分を含んで成る：６(配列番号８)、７(配列番号９)、１２(配列番号１４)、１４(配列番号１６)、１６(配列番号１８)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、２５(配列番号２７)、２８(配列番号３０)、３３(配列番号３５)、および３４(配列番号３６)(第２図に表すように)。好ましくは以下のペプチドのアミノ酸配列を含んで成るペプチドは、第４、５または６に表されるように誘導されたペプチドの平均Ｔ細胞刺激指数に等しいか、またはそれより大きい平均Ｔ細胞刺激指数を有する：６(配列番号８)、７(配列番号９)、１２(配列番号１４)、１４(配列番号１６)、１６(配列番号１８)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、２５(配列番号２７)、２８(配列番号３０)、３３(配列番号３５)および３４(配列番号３６)(第２に表す)。治療目的に使用できる、さらにいっそう好ましいLol p Ｖタンパク質アレルゲン由来のペプチドは、第２図に表すように以下のペプチドのアミノ酸配列全部または部分を含んで成る：１４(配列番号１６)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、２５(配列番号２７)、および３４(配列番号３６)。
本発明の１つの観点では、少なくとも２つのペプチド(例えば少なくとも２つのペプチドの物理的混合物)を含んで成る組成物が提供され、それぞれがLol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成る。そのような組成物を治療用組成物の状態で、医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤とともに投与できる。さらに１つ以上の治療用組成物の治療的に効果的な量、およびＴ細胞エピトープを有する少なくとも１つのペプチドを含んで成る治療用組成物をライグラス花粉に感受性の個体に同時に、または連続的に投与できる。
同時に、または連続的に投与できるLol p Ｖペプチドの好適な組成物および好適な組み合わせ(第２図に表されるアミノ酸配列を含んで成るペプチドを含んで成る)には、以下の組み合わせがある：
１４(配列番号１６)および２２(配列番号２４)；
１４(配列番号１６)および２５(配列番号２７)；
１９(配列番号２１)および２２(配列番号２４)；
１９(配列番号２１)および２５(配列番号２７)；
１４(配列番号１６)、２２(配列番号２４)および２５(配列番号２７)；
１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)および２５(配列番号２７)；
１４(配列番号１６)、２２(配列番号２４)、２５(配列番号２７)および３４(配列番号３６)；
１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、２５(配列番号２７)および３４(配列番号３６)；
１４(配列番号１６)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)および２５(配列番号２７)；
１４(配列番号１６)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、２５(配列番号２７)および３４(配列番号３６)；
６(配列番号８)、７(配列番号９)、９(配列番号１１)、１２(配列番号１４)、１４(配列番号１６)、１６(配列番号１８)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、２５(配列番号２７)、３３(配列番号３５)および３４(配列番号３６)；
６(配列番号８)、９(配列番号１１)、１６(配列番号１８)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、および３４(配列番号３６)；ならびに
６(配列番号８)、９(配列番号１１)、１４(配列番号１６)、１６(配列番号１８)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、２５(配列番号２７)および３４(配列番号３６)；
本発明をさらに以下の限定を意図するものではない図面および実施例で説明する。
実施例
実施例１
Lol p Ｖペプチド
Lol p Ｖ(配列番号２)のアミノ酸配列は、第１図に表すATCC番号 のクローン12R(配列番号１)のcDNA配列由来のものであった。Lol p Ｖ(Lol p Ib.1として説明されている)をコードするクローン12Rのクローニングおよびシークエンシングは、国際公開第93/04174号パンフレットに記載されている。30個の12-merおよび４個の13-mer固相ペプチドをBT7400手動ペプチド合成ブロック(manual peptide synthesising block)(バイオテック機器株式会社：Biotech Instruments Ltd、英国)で合成した。これらのペプチドは４個(または５個)のアミノ酸が重複している全Lol p Ｖ配列に対応した。このペプチドをC-末端Fmoc保護アミノ酸樹脂(25mMアウスペップ；auspep、オーストラリア)で合成した。樹脂は連続的に3×1mlのジメチルホルムアミド(DMF：アウスペップ、オーストラリア)で洗浄および排水し、そして次に1mlの脱保護溶液(DP、DMF中の25重量／容量％ピペリジン、アウスペップ、オーストラリア)で10分間処理し、最初のC-末端アミノ酸からFmoc基を除去した。ウェル(well)を次に洗浄し、そして3×1ml DMF、2×1mlジクロロメタン(DCM；アウスペップ、オーストラリア)、そして最後に2×1mlDMFで連続的に洗浄および排水した。選択した10倍過剰のアミノ酸を活性化試薬と混合した(BOP:HOBYT1:1；アウスペップ、オーストラリア)、1mlの活性化溶液(アウスペップ、オーストラリア)に溶解し、そしてカップリングのために適当なウェルに加えた。この手順を所望のペプチド長が得られるまで繰り返した。
ペプチドを次に開裂溶液(90容量／容量％ トリフルオロ酢酸、4容量／容量％ フェノール、１容量／容量％ エタンジチオール；アウスペップ、オーストラリア)で６時間処理し、ウェルからペプチドが開裂しやすくした。回収したペプチドを次に50mlの冷ジエチルエーテル(DEE：アウスペップ、オーストラリア)で沈殿させ、そしてワットマン濾紙１(ワットマン：Whatman、英国)で単離した。これらの濾紙を50mlの凍結乾燥溶液(アウスペップ、オーストラリア)で洗浄し、そして凍結乾燥した。ペプチドをアウスペップラボラトリーのHPLCおよび質量スペクトロメトリーの分析に供し、配列およびペプチド純度を検査した。
ペプチドドットブロットイムノアッセイ
ペプチドを水に溶解し、1.6mMの保存溶液を調製した。不溶性ペプチドを１分間の超音波(ブロンソン ソフハファイヤー450：Branson Sofifier 450、米国)により溶解した。
ペプチドをニトロセルロース(NC)フィルターに、他に報告されている変法(Sithigonglu(1991)J.Immunol.Methods,141:23-32)を使用して固定化した。2μlのペプチド保存溶液をNCフィルター(シュライヒャー アンド シウェル：Schliecher & Schuell、西独国)上に約1cmの間をあけて、スポット状に適用した。切片を乾燥し、そして80℃で１時間焼いた後、気密に密閉したプラスチックの箱の中で0.2％グルタルアルデヒド(PBS中)蒸気に室温(18℃)で１時間暴露することにより固定した。蒸留水で徹底的に洗浄した後、NCフィルターをBlotto(PBS中の10％脱脂粉乳)で２時間ブロックし、そして1XTween-PBS(PBS中の0.1％Tween20)および2XPBSでそれぞれ５分間洗浄した。
ペプチドを次にヒトIgEおよびマウス／ウサギIgGエピトープに関して、個体血清(0.5％BSAを含むPBSで1:4に希釈)、MAbs FMC A7(Smartら、(1983)Int.Arch.Allergy Clin.Immunol.72:243)およびポリクローナルウサギ抗−Lol p Ｖ(Lol p Ib)抗体を用いて調査した。
我々の50名の高感度なライグラス花粉アレルギー性個体の中の23名が少なくとも１つのペプチドに結合するIgEを持っていた。個体の大部分が弱から中程度のIgE反応性を有するが、数名は高い反応性を表した。IgE結合に関するドットブロット分析を第７図に表す。
各ドットブロットの強度は、デンシトメータ(ファルマシアLKB Ultra Scan XL、スウェーデン)で測定した。値は任意のデンシトメトリーの単位であり、図８に表す。バックグラウンドと比べて２より大きいデンシトメータの値を、陽性結合と考えた。バックグラウンドと比較してそれぞれ陽性結合。各ペプチドに関して血清および抗体値が加えられ(得点／ペプチド)、そして陽性血清数により除算し最終的な値を平均値(得点／血清)として算出した。血清Ｃ１およびＣ２はグラスアレルギー性ではなく、よって陰性対照として使用した。Ｃは陽性対照として粗ライグラス花粉抽出物(１μｇ／ドット)を言う(実施例３を参照のこと)。
血清１、１４、３６、４２および４８は、選択した特異的ペプチド(例えばペプチド１９(配列番号２１)、３４(配列番号３６)および７(配列番号９)に対して実質的な親和性を示し、これらはLol p Ｖの主要抗原線状アレルゲン性Ｂ−細胞エピトープ(immunodominant linear allergenic B-cell epitopes)(第７および８図)に分類された。
ペプチド番号７(配列番号９)、１６(配列番号１８)、１９(配列番号２１)、２１(配列番号２３)、２３(配列番号２５)、３０(配列番号３２)および３４(配列番号３６)は最高のヒトIgE−反応性を示し、したがってLol p Ｖの主線状アレルゲン性Ｂ−細胞エピトープ(major linear allergenic B-cell epitopes)に分類された。MAb、FMC-A7およびウサギポリクローナル抗−Lol p Ib抗血清をペプチドに対するIgG結合に関して分析した。このデータを第７図に表す。MAbおよびウサギ抗血清は、一般的にペプチドに対して低い結合性を表した。ペプチド番号１(配列番号３)、７(配列番号９)、１９(配列番号２１)、２３(配列番号２５)、２４(配列番号２６)および２８(配列番号３０)は最高のマウス／ウサギIgG−反応性を示した。
実施例２
１．材料および方法
粗ライおよびバミューダグラス花粉抽出物
ライグラス(Lolium perenne)およびバミューダグラス(Cyndon dactylon)花粉をグリアーラボラトリーズ(Greer Laboratorwies、米国)から乾燥した非−脱脂抽出物として得た。花粉アレルゲンを0.001M NH4HCO3(10重量／容量％)中で抽出し、遠心そして上清をリン酸塩溶液(PBS)で一晩透析した。上清は0.20μmフィルターを通し、タンパク質濃度はバイオラッドのマイクロアッセイ(BioRad Microassay)(バイオラッド、米国)を使用して、製造元の仕様に従い測定した。
Lol p Ｖ
Lol p Ｖを粗ライグラス花粉抽出物から、流体相液体クロマトグラフィー(fluid phase liquid chromatography:FPLC)により精製した。簡単に述べると、粗ライグラス花粉抽出物をEcono-Pac 10DGカラム(バイオ−ラッド、米国)でPBSから20mM Tris pH12(緩衝液Ａ)への緩衝液交換に供した。この抽出物5mgを、予め連続的に緩衝液Ａで5分間、次に緩衝液Ｂ(20mM Tris、pH7)で10分間、そして最後に緩衝液Ａでさらに5分間平衡化したイオン交換FPLCカラム(MonoQ HR5/5；ファルマシア、スウェーデン)に注入した。カラムを緩衝液Ａで10分間洗浄し、Lol p Ｖを結合させ、同時にpI値が12以上の他のタンパク質を溶出させた。Lol p Ｖの溶出は緩衝液Ｂで1ml／分の一定流速で15分間、室温で行った。毎分１ｍｌの画分を回収し、そしてSDS-PAGEおよびイムノブロッティングで分析した。Lol p Ｖを含有する画分をプールし、そしてタンパク質濃度を測定した。
Lol p Ｖペプチド
同じLol p Ｖペプチドを実施例１に記載したように生成した。ペプチド１３(配列番号１５)は極めて少量でしか生成しなかったので、この実験では試験できなかった。
アレルゲン−反応性Ｔ細胞系およびクローンの生成
ライグラス花粉に対する皮膚試験が陽性である健康な成人から得られた末梢血液単核細胞(PBMC)を、ヘパリン化血液試料からFicoll-Paque(ファルマシア、スウェーデン)密度勾配で遠心することにより単離した。最初に1×106/ml PBMCを5μg/mlのLol p Ｖで、96ウェルのＵ型底マイクロタイタープレート(リンブロ：Linbro、米国)中で刺激した。すべての細胞を、１重量/容量％のL-グルタミン(ICN、オーストラリア)、0.125重量/容量％のゲントマイシン(デルタ ウエスト；Delta West、オーストラリア)および５容量/容量％の加熱不活化ヒトA+血清を補給したRPM1-1640(ICN、オーストラリア)組織培養培地中で培養した。培養は37℃で５容量/容量％のＣＯ2雰囲気中で行った。
培養開始７日後、10単位/mlのヒト組換えIL-2(rIL-2：シータス：Cetus、米国)をウェルに加えた。14日目にＴ細胞系を、細胞を24-ウェル組織培養プレート(コースター：Costar、米国)に移し、そして5×105/mlの照射(2000rads)自己PBMC、2.5μg/ml Lol p Ｖ、10-20単位/ml rIL-2、5-10単位/ml Lymphocult(バイオテスト：Biotest、独国)および0.1μg/ml PHA(ウェルカム：Wellcom、英国)を加えて拡張した。系を8-10日ごとに上記のように再刺激した。
Ｔ細胞を次に系を限定希釈してクローン化した。このためにＴ細胞を300、30、３、１および0.3細胞/ウェルで、96−ウェルのＵ型底マイクロタイタープレート中に、1×106/ml照射PBMC、2.5μg/ml Lol p Ｖ、20単位/ml rIL-2、10単位/ml lymphocultおよび0.1μg/ml PHAと一緒に接種した。クローンはrIL-2を4日ごとに供給し、照射PBMC、Lol p Ｖ、rIL-2およびLymphocultを8-10日ごとに加えた。
増殖アッセイに使用する前に、最後の供給細胞、アレルゲンおよびIL-2添加後に系およびクローンを7-8日間休止させた。
増殖アッセイ
5×105/mlのＴ細胞を、5×105/mlの照射自己PBMCおよびLol p Ｖ(0.019-2.5μg/mlまたは0.625-20μg/ml)、あるいはLol p Ｖペプチド(1および10μg/ml)と共に96ウェルのＵ型−底のマイクロタイタープレート中で88時間培養し、そして1μCi/ウェルのトリチウム標識 メチルチミジン([H]TdR；アマシャム：Amersham、米国)をガラス繊維フィルター上に回収する８時間前に適用した。対照カルチャーはアレルゲン無しの細胞、PHAとの細胞、Ｔ細胞のみ、および照射PBMC細胞のみであった。各フィルターに関する１分あたりの計数(CPM)を液体シンチレーションカウンター(LKBワラック：LKB Wallace、フィンランド)で測定した。
免疫表現型分析
Ｔ細胞を直接的に、あるいは以下のモノクローナル抗体を使用する蛍光抗体により間接的に染色した：CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11b、CD16、CD19、CD25、CD45RO、CD45RA、MHCクラスII TcRαβTcRγδ、ｋ軽鎖およびλ軽鎖。間接的蛍光抗体法には、FITC-結合ヤギ-抗-マウスIgF(ab)2(シレナス：Silenus、オーストラリア)を使用した。細胞を次にFACScanフローサイトメーター(ベクトン−デッキンソン：Becton-Dickinson、米国)を使用して分析した。
２．結果
Ｔ細胞系のアレルゲン反応性
培養34日目に、Ｔ細胞系のライおよびバミューダグラス花粉アレルゲンに対する反応性を試験した。一連の濃度範囲にわたって誘導アレルゲンLol p Ｖに対する強い増殖活性があり、そして粗ライグラス花粉抽出物に対しては反応は低かった(第３図)。粗バミューダグラス花粉抽出物に対する反応は無かった。
Lol p Ｖ合成ペプチドに対するＴ細胞系およびクローンの反応性
14日目に初めてＴ細胞系のLol p Ｖ合成ペプチドに対する反応性を試験したが有意な反応性は検出されなかった。しかし27日目に、ペプチド１４(配列番号１６)に対する強い反応性が観察された。49日までペプチド１４(配列番号１６)に対するこの強い反応性は維持されたが、さらにペプチド２５(配列番号２７)(第４図)に対する弱い反応があり、Ｔ細胞系のポリクローナル的特性と一致する。ペプチド１４(配列番号１６)および２５(配列番号２７)のアミノ酸配列を表２に表す。
Ｔ細胞クローンはＴ細胞系から17日目に生じた。得られた8個のＴ細胞クローンの１つをA12と命名したが、これはペプチド１４(配列番号１６)のみに強い反応を表した(第５図)。49日目のクローンA12のＴ細胞系に関する刺激指数が4.8であるの比べて、ペプチド１４(配列番号１６)に対する刺激指数は137であり、ペプチド１４−特異的Ｔ細胞の選択に相関する。
Ｔ細胞系の表現型分析
47日目のＴ細胞系の表現型をフローサイトメトリーにより、細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のパネルを使用して分析した。系はCD2、CD3、CD5、CD４、CD25、CD45RO、MHCクラスIIおよびTcRαβを発現し、活性化成熟ヘルパーＴ細胞の表現型と一致した。
実施例３
１．材料および方法
別のＴ細胞系を実施例２に記載した同じ患者から、実施例２に記載した方法で作成した。増殖アッセイを実施例１に記載したLol p Ｖ合成ペプチドを使用して実施例２に記載した方法で作成した。
２．結果
Lol p Ｖ合成ペプチドに対する反応性についてＴ細胞系を試験した。結果を第６図に表す。増殖はバックグラウンド増殖を引き算して得る。バックグラウンド増殖(培地のみに対する増殖)は2500cpmであった。刺激指数は2500cpmを第６図に示した値に加え、そして2500で除算することにより表された結果から算出した。ペプチド６(配列番号８)、７(配列番号９)、９(配列番号１１)、１２(配列番号１４)、１６(配列番号１８)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、２８(配列番号３０)、３３(配列番号３５)、および３４(配列番号３６)は第６図に表すように2.0以上の刺激指数を有した。最も反応性のペプチド１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)及び３４(配列番号３６)はＴ細胞刺激指数がそれぞれ2.9、3.4、および2.5である。
実施例４
阻害ペプチドドットブロットおよび阻害血清を使用するペプチド３４でのIgE結合実験
Ａ．阻害ペプチドドット−ブロット
簡潔な方法論
ペプチド３４(配列番号３６)、６(配列番号８)、２４(配列番号２６)および３１(配列番号３３)(最後の３つは陰性対照として使用した)、ならびにFPLCで精製したLol p Ｖおよび粗ライグラス花粉抽出物(第９図中それぞれIXおよびＣと呼び、そして陽性対照として使用した)をすでに記載したようにNCに固定化し、焼き、そしてグルタルアルデヒド固定を行った。２つの別ロットの血清(ペプチド34-特異的IgE抗体を有する個体Girgisから得た；１：４希釈)をRT(18℃)で、1mlの血清で希釈した50μgの粗ライグラス花粉抽出物(図中阻害血清と言う)か、または粗抽出物無し(対照血清という)のいずれかと一緒に一晩プレインキュベーションした。ペプチドブロットは次に別個に対照中および粗抽出物とプレインキュベーションした血清中で一晩インキュベーションを行い、その後125Ｉ標識抗−ヒトIgE抗体でインキュベーションし、そしてＸ−線フィルムに最高96時間暴露した。
結果：
対照血清はペプチド３４(配列番号３６)および陽性対照Lol p IXおよび粗ライグラス花粉抽出物に対して強いIgE-結合を与えた。別の対照ペプチド(例えばアラニンが豊富なペプチド３１(配列番号３３)、およびペプチド６(配列番号８)、２４(配列番号２６))はIgE-結合を与えなかった。
粗ライグラス花粉抽出物とプレインキュベーションした血清は、ペプチド３４(配列番号３６)に対してIgE-結合が減少し、陽性対照Lol p Ｖおよび粗ライグラス花粉抽出物に対しても同様であった。
結論：
これらの結果は個体が粗ライグラス花粉抽出物により抑制されることができるペプチド３４-特異的IgE抗体を有することを実証する。
Ｂ．阻害ELISA
簡潔な方法論
ペプチド３４(配列番号３６)、６(配列番号８)、２４(配列番号２６)および３１(配列番号３３)(最後の３つは陰性対照として使用した)ならびに粗ライグラス花粉抽出物(陽性対照として使用した)をマイクロタイタープレートに被覆した。個体血清(１：４に希釈)を種々の濃度の粗ライグラス花粉抽出物有り、または無しでRTで一晩プレインキュベーションした。ペプチド／粗抽出物を被覆したウェルを次に対照および粗抽出物とプレインキュベーションした血清(種々の粗抽出物濃度)とインキュベーションした。プレートを洗浄し、そしてウサギで生産した抗−ヒトIgEとインキュベーションし、そして次にHRP−結合抗−ウサギ抗体とインキュベーションした。プレートをパーオキシダーゼ基質1,2-フェニレンジアミンで発色させ、発色反応を492nmで読んだ。
結果：
第１０図に表すように、対照血清はペプチド３４(配列番号３６)および粗ライグラス花粉抽出物に対してIgE-結合を生じた。粗抽出物の濃度を段階的に上昇すると、ペプチド３４(配列番号３６)および粗抽出物に対するIgE-結合が段階的に減少した。対照ペプチドはすべて有意により低いIgE-結合性を表し、そして阻害剤濃度の増加に伴うIgE-結合性の段階的減少はなかった。対照ペプチドに示される結合は、バックグラウンドによるものであり、これはアッセイ条件によるペプチドまたはウェルに対する非−特異的IgE-結合である。しかし、ELISAでわずかなバックグラウンドが観察されても、ペプチド３４(配列番号３６)および粗抽出物に対するIgE-結合は対照ペプチドよりも高かった。
結論：
阻害ドットブロットの結果のように、阻害剤ELISAの結果はこの個体中においてペプチド３４(配列番号３６)に対する有意なIgE-結合を示した。
当業者は本明細書に記載した発明が特別に記載した以外の変形および改良にも応用できることを理解するであろう。本発明はそのような変形および改良も包含することが理解される。本発明は本明細書中で言及されるすべての方法、特徴、組成物および化合物も、独立して、あるいは集合的に包含し、そして２つ以上の該方法および特徴の任意のおよびすべての組み合わせも包含する。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人
（Ａ）氏名：メルボルン大学
（Ｂ）通り：グラッテン通り
（Ｃ）市：パークビル
（Ｄ）州：ビクトリア
（Ｅ）国：オーストラリア
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：３０５２
（Ｇ）電話番号：３−６１３−３４４−４０００
（Ｈ）ファックス：３−６１３−３４４−７６２８
（ii）発明の名称：ライグラス花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープ
（iii）配列数：３６
（iv）コンピューター読取り先：
（Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル
（Ｃ）実行システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：ＡＳＣＩＩ テキスト
（ｖ）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（vi）先願データ：
（Ａ）出願番号：米国特許出願第０７／８６６，６７９号
（Ｂ）出願日：１９９２年４月９日
（vii）弁理士／代理人に関する情報
（Ａ）氏名：ジョン エム．スラッタリー
デイビス コリジョン カーブ
オーストラリア、メルボルン３０００、リトルコリンズ
ストリート １、
（Ｂ）登録番号：
（Ｃ）参照／処理番号：ＩＰＣ−０１１Ｃ３ＰＣＴ
（ix）電話通信情報
（Ａ）電話：６１３−２５４−２７７７
（Ｂ）ファックス：６１３−２５４−２７００
（２）配列番号１に関する情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１３７６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：４２．．．４２
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ｍａｔ ペプチド
（Ｂ）位置：１１５．．．９４２
（xi）配列の記載：配列番号１：
（２）配列番号２に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：３０１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号２：
（２）配列番号３に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号３：
（２）配列番号４に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号４：
（２）配列番号５に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号５：
（２）配列番号６に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号６：
（２）配列番号７に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号７：
（２）配列番号８に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号８：
（２）配列番号９に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号９：
（２）配列番号１０に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１０：
（２）配列番号１１に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１１：
（２）配列番号１２に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１２：
（２）配列番号１３に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１３：
（２）配列番号１４に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１４：
（２）配列番号１５に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１５：
（２）配列番号１６に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１６：
（２）配列番号１７に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１７：
（２）配列番号１８に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１８：
（２）配列番号１９に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１９：
（２）配列番号２０に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２０：
（２）配列番号２１に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２１：
（２）配列番号２２に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２２：
（２）配列番号２３に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２３：
（２）配列番号２４に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２４：
（２）配列番号２５に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２５：
（２）配列番号２６に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２６：
（２）配列番号２７に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２７：
（２）配列番号２８に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２８：
（２）配列番号２９に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２９：
（２）配列番号３０に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号３０：
（２）配列番号３１に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号３１：
（２）配列番号３２に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号３２：
（２）配列番号３３に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号３３：
（２）配列番号３４に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号３４：
（２）配列番号３５に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号３５：
（２）配列番号３６に関する情報：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号３６：
アレルゲンはグラス(grass)花粉の極めて多種類のタンパク質からなり、温帯性気候での主なアレルギー性疾患の原因である。(Marsh(1975年)アレルゲンおよびアレルギー遺伝学(Allergens and genetics of allergy)M.Sela(編集)、抗原、第3巻、第271-359頁、アカデミックプレス社(Academic Press Inc.)ロンドン、ニューヨーク)。Hillら(1979)Medical Journal of Australia 1,426-429)。ライグラスにおけるアレルゲンタンパク質の最初の記載では、それらは免疫的に識別されることが示され、I、II、IIIおよびIV群として知られている(JohnsonおよびMarsh(1965)Nature,206,935-942：およびJohnsonおよびMarsh(1966)Immunochemistry 3,91-100)。国際免疫学会(International Union of Immunological Society:IUIS)の命名法を使用すると、これらのアレルゲンはLol pＩ、Lol pII、Lol pIIIおよびLol pIVと命名される。さらに文献ですでに同定された別の重要なロリウム プレンネ エル(Lolium prenne L)アレルゲンはLol p Vであり、これはLol pIXまたはLol pIbとして知られている(Singhら、(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1384-1388。Suphiogluら、1992.Lancet.339:569-572)。
これら5つのタンパク質がライグラス(Lolium perenne L.)花粉中に確認され、そして感受性のヒトにおいて過敏症を直接引き起こす(１型)アレルゲンとして作用する。
Lol pＶはライグラス−感受性患者の血清IgEに特異的に結合し、IgG応答において抗原として作用し、そしてＴ−細胞応答を引き起こす能力によりアレルゲンであると定義されている。アレルゲン的特性はライグラス花粉感受性疾患の80％がLol pＶイソフォームに結合する特異的IgE抗体を保有することを表すイムノブロッティング法により実証された(国際公開第93/04174号明細書、第65頁)。これらの結果はLol pＶが主要ライグラスアレルゲンであることを示している。
グラス花粉間の実質的なアレルゲンの交差反応は、例えばMarshら、(1970)J.Allergy,46,107-121およびLowenstein(1978)Prog.Allergy.25,1-62(Karger,Basel)に記載されているようなIgE−結合アッセイ、ラスト法(radioallergo-sorbent test:RAST)を使用して実証された。
Lol p Ｖと他のグラス花粉抗原との免疫化学的関係はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方(Zhangら、Int Arch Allergy Appl Immunol.96:28-34(1991)：Robertsら、Int Arch Allergy Appl Immunol.98:178-180(1992)：ならびにMattheisenおよびLowenstein.Clinical and Experimental Allergy.21:309-320(1991))を使用して実証された。抗体はIgE成分に結合するタンパク質を精製するために調製された。これらのデータにより親密に関連したグラス花粉中に存在する主要アレルゲンは免疫化学的にLol p Ｖと類似しており、そして一般的にＶ群アレルゲンと特徴付けられることが証明された。
発明の要約
本発明はLol p Ｖの単離されたペプチドを提供する。本発明の範囲内で治療的に使用されるペプチドはLol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、好ましくは少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含んで成る。本発明はさらに少なくとも２つの領域(各領域はLol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成る)を含んで成るペプチドを提供する。診断を目的として使用するための本発明のペプチドは、IgEに結合でき、かつ少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含んで成る。
本発明は、天然に存在するアレルゲンまたはその部分に対応するような同等な、または増強された治療的特性を有するが、副作用が減少した修飾ペプチド、ならびに溶解性および安定性が向上した特性を有する修飾ペプチドを提供する。本発明の治療用ペプチドは、ペプチドをが投与されるLol p Ｖ−感受性個体において、Lol p ＶまたはLol p Ｖに免疫的に交差−反応性の抗原に対する個体のアレルギー反応を調節することができる。
個体のグラスアレルゲンに対する感受性を治療または診断するための方法、ならびに少なくとも１つ以上の本発明のペプチドを含んで成る治療用組成物も提供する。
本発明はLol p Ｖペプチドの誘導体または同族体、ならびにLol p Ｖ抗体に免疫的に交差−反応性のペプチド、あるいはLol p ＶのＴ細胞と免疫的に交差反応性のペプチドあるいはそれらの誘導体または同族体も提供する。
本発明のさらなる特徴は、以下の本発明の好適な態様の詳細な記述および添付図面からよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
第１図はcDNAクローン12R(配列番号１)のヌクレオチド配列およびその推定アミノ酸配列(配列番号２)を表す。クローン12RはLol p Ｖの全鎖長クローンである。
第２図はLol p Ｖ由来の種々の長さの本発明の種々のペプチドを表す。
第３図は誘導アレルゲンLol p Ｖ、粗ライグラス花粉抽出物または粗バミューダグラス花粉抽出物の存在中で、自己の照射PBMCで培養した34日目のＴ細胞系からのＴ細胞の刺激指数をグラフで表したものであり、増殖は[3H]TdRの取り込みによりアッセイし、結果はアレルゲンと一緒の細胞の平均CPMを培地のみの細胞の平均CPMで除算することにより決定し、各アレルゲン濃度は3回試験した。
第４図は健康なライグラス花粉アレルギー性成人由来のＴ細胞系の、Lol p Ｖ合成ペプチドに対する49日目の増殖応答をグラフに表したものであり、結果は２連の培養物の１分間あたりの平均計数(CPM)で表し、アレルゲンが無い場合の細胞のバックグラウンド応答は4849 CPMであった。
第５図はLol p Ｖ合成ペプチドに対するＴ細胞クローンA12の増殖応答をグラフに表したものであり、結果は２連の培養物に関して１分間あたりの平均計数(CPM)で表し、アレルゲンが無い場合の細胞のバックグラウンド応答は358 CPMであり、そしてＹ軸は対数スケールで表す。
第６図は健康なライグラス花粉アレルギー性成人由来の第二Ｔ細胞の、Lol p Ｖ合成ペプチドに対する増殖応答をグラフに表したものであり、結果は１分間あたりの平均計数(CPM)で表し、アレルゲンが無い場合の細胞のバックグラウンド応答は2500 CPMであり、ペプチド濃度は0.1μg/mlであった。
第７図はLol p Ｖ由来の35個の重複ペプチドのドットブロットイムノアッセイを表し、(クローン12R)ニトロセルロース(NC)フィルター上に固定化し、そしてヒトIgE結合を示す個体血清、mAbsFMC-A7およびポリクローナル抗−Lol p Ｖウサギ抗体でスクリーニングした。Ｃは陽性対照として使用した粗ライグラス花粉抽出物(１μg/ドット)を表す。
第８図はクローン12R由来の重複連続合成ペプチドのドットイムノアッセイに基づくLol p ＶのＢ細胞エピトープの同定を表す；図８ａは総数50名のライグラス花粉アレルギー患者由来の16種の陽性血清のIgE結合を表す(Rast≧４)；図８ｂはモノクローナルまたはポリクローナル抗体結合を表し、値はファルマシアＬＫＢ社(Pharmacia LKB)のUltraScan XL(スウェーデン)で測定したドットブロットの強度を示す任意のデンシトメトリー的単位であり、バックグラウンドと比較してデンシトメトリー値≧２を陽性結合と考えた；各ペプチドに関して血清および抗体値を加え(得点／ペプチド)、そして陽性血清または抗体数で除算して最終値を平均(得点／血清または抗体)として表し、血清Ｃ１およびＣ２を陰性対照として使用した(Ｃは陽性対照としての粗ライグラス花粉抽出物(１μｇ／ドット)を言う)。
第９図はペプチド３４(配列番号３６)での阻害ペプチドドット−ブロットを表し、ペプチド６(配列番号８)、２４(配列番号２６)および３１(配列番号３３)は陰性対照として使用した；FPLCで精製したLol p Ｖは“IX”と命名し、そして“Ｃ”と命名した粗ライグラス花粉抽出物は陽性対照として使用した。
第１０図はペプチド３４(配列番号３６)での阻害ELISAをグラフで表したものであり、ペプチド６(配列番号８)、２４(配列番号２６)および３１(配列番号３３)を陰性対照として使用した；そして粗ライグラス花粉抽出物を陽性対照として使用した。
発明の詳細な記述
本発明はLol p Ｖ由来の単離されたペプチドを提供する。本明細書で使用する、ペプチドまたはタンパク質の断片とはタンパク質の全アミノ酸配列よりも少ないアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を言う。本明細書において“単離された”および“精製された”という用語は、組換えDNA法で生成されたとき、細胞物質または培養培地が実質的に存在しない本発明のペプチドを言うか、あるいは化学的に合成されたときに化学的前駆体または他の薬剤が実質的に存在しない本発明のペプチドを言う。本明細書で使用する本発明の“ペプチド”という用語は、アレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成るLol p Ｖ由来のペプチド、あるいは少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成るそのようなペプチドの部分および／またはIgEに結合し、かつ少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含んで成るLol p Ｖ由来のペプチドを含む。
少なくとも２つの領域(各領域はLol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープをを含んで成る)を含むペプチドも本発明の範囲内にある。単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの領域(各領域はLol p Ｖタンパク質アレルゲンの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成る)は、増強された治療効果のために特に望ましい。本発明のペプチドに免疫学的に関連したペプチド(例えば抗体またはＴ細胞交差−反応性により)も、本発明の範囲内にある。抗体交差−反応で免疫学的に関連するペプチドは、Lol p Ｖのペプチドに特異的な抗体に結合する。Ｔ細胞交差−反応で免疫学的に関連するペプチドは本発明のペプチドと同一のＴ細胞と反応できる。
本発明の単離されたペプチドは、そのようなペプチドをコードする配列を有する核酸で宿主細胞を形質転換させることにより、組換えDNA法で生産することもできる。本発明の単離されたペプチドは化学合成により生成することもできる。ペプチドを組換え法で生産する場合には、宿主細胞を本発明のペプチドをコードする配列を有する核酸で形質転換し、その核酸配列の機能的均等体は細胞に適する培地中で培養され、そしてペプチドは細胞培養培地、宿主細胞または双方からペプチドおよびタンパク質精製のための当該技術分野の周知技術(イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動またはペプチド、ペプチドが誘導されたタンパク質アレルゲン、またはそれらの部分に特異的な抗体での免疫精製法を含む)を使用して精製できる。
本発明は発現ベクターおよび本発明の核酸配列を発現するために形質転換された宿主細胞を提供する。本発明のLol p Ｖペプチドまたはその少なくとも１つの断片をコードする核酸を、大腸菌(E.coli)のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)のような哺乳類細胞中で発現させることができる。適当な発現ベクター、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素は、Sambrookら、モレキュラークローニング(Molecular Cloning)：ア ラボラトリーマニュアル(A Laboratory Manual)、第二版、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールド スプリング ハーバー、ニューヨーク、1989に見い出すことができる。他の適当な発現ベクター、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現要素は当業者に周知である。酵母での発現に適当なベクターは、YepSec1(Baldariら(1987)Embo J.6:229-234);pMFa(KurjanおよびHerskowitz(1982)Cell 30:933-943)：JRY88(Schultzら、(1987)Gene 54:113-123)およびpYES2(インビトロジェン コーポレーション：Invitrogen Corporation、サンジエゴ、カリフォルニア州)。これらのベクターは自由に入手可能である。バキュロウイルスおよび哺乳類発現系も入手しうる。例えばバキュロウイルス(baculovirus)系は、例えば昆虫細胞中での発現用として市販されており(ファーノンゲン：PharMingen、サンジエゴ、カリフォルニア州)、一方pMSGベクターは哺乳類細胞中での発現用として市販されている(ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)。
E.coli中での発現の中でも適当なベクターは、pTRC(Amannら，(1988)Gene 69:301-315);pGEX(アマラッド コーポレーション:Amrad Corp.、メルボルン、オーストラリア)；pMAL(エヌ.イー.バイオラボズ:N.E.Biolabs.、ベバリー、マサチューセッツ州)；pRIT5(ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)；pET-11d(ノバジェン;Novagen.、マジソン、ウィスコンシン州)、Jameelら、(1990)J.Virol. 64:3962-3966；およびpSEM(Knappら、(1990)BioTechniques 8:280-281)である。例えばpTRCおよびpET-11dを使用すると、非融合タンパク質の発現を導くだろう。pMAL、pRIT5、pSEMおよびpGEXの使用するとマルトースＥ結合タンパク質(pMAL)、プロテインＡ(pRIT5)、切断されたβ−ガラクトシダーゼ(PSEM)またはグルタチオンS-トランスフェラーゼ(pGEX)に融合したアレルゲンの発現を導くだろう。本発明のLol p Ｖペプチドを融合タンパク質として発現するとき、キャリアータンパク質とLol p Ｖペプチドの間の融合連結部に酵素的開裂部位を導入することは特に有利である。このLol p Ｖペプチドは融合タンパク質から酵素的部位で酵素的に開裂し、そしてタンパク質およびペプチド精製のための従来技術を使用する生化学的精製を通して回収できる。適当な酵素的開裂部位には、血液凝固因子Ｘａまたはトロンビンがあり、開裂のための適当な酵素および方法は、例えばモンタナ州、セントルイスのシグマ ケミカル社(Sigma Chemical Company,)およびマサチューセッツ州、ベバーリーのエヌ．イー．バイオラボズから入手できる。様々なベクターも種々のプロモーター領域を有し、構造的な、あるいは例えばIPTG誘導(PRTC、Amannら、(1988)同上；pET-11dノバジェン、マジソン、ウィスコンシン州)での、または温度誘導(pRIT5、ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)での誘導可能な発現を可能にする。組換え的に発現したタンパク質を分解する改変能力を有する種々のE.coli宿主中で組換えLol p Ｖペプチドを発現させることも適当かもしれない(例えば米国特許第4,758,512号明細書)。あるいはE.coliに優先的に使用されるコドンを使用するために核酸配列を変更すること(その核酸配列の変更部分は発現タンパク質のアミノ酸配列に影響しない)が有利かもしれない。
本発明の核酸配列を発現するために、例えばリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共−沈殿、DEAE-デキストラン-媒介トランスフェクションまたは電気穿孔法のような従来技術を使用して宿主細胞を形質転換させることができる。宿主細胞を形質転換させる適当な方法は、Sambrookら(同上)および他の研究参考書に見いだすことができる。本発明の核酸配列は標準的技法(すなわち固相合成法)を使用して化学的に合成することもできる。Lol p Ｖをコードするクローン12(Lol p Ib.1として記載されている)の単離およびクローニングの詳細は、国際公開第93/04174号明細書に与えられている。
本発明は本発明のペプチドをコードする核酸配列も提供する。本発明の任意の態様に使用する核酸配列は第７図に表されるような対応するペプチド配列をコードするcDNA、あるいは本明細書に表される配列の全部または部分を有する任意のオリゴヌクレオチド配列、あるいはそれらの機能的均等物であることができる。そのようなオリゴヌクレオチド配列は周知技法を使用して化学的または機械的に作成できる。オリゴヌクレオチド配列の機能的均等物は、１)第１図に表されるようなLol p Ｖの配列(または対応する配列部分)に対して相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできる配列、またはハイブリダイズするそれらの断片、あるいは２)(表１および第２図(配列番号１)に示されるLol p Ｖ由来のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列に相補的な対応する配列部分)および／または第３図)第１図(配列番号１)に示されるようなLol p Ｖの配列(または対応する配列部分)によりコードされる生成物と同一の機能的特性を有する生成物(例えばポリペプチドまたはペプチド)をコードする配列である。機能的均等物が１つまたは両方の基準を満たさなければならないかどうかは、その使用に依存し(例えばオリゴプローブとして使用するだけであれば第１または第２基準のひとつを満たすことが必要であり、そして本発明のLol p Ｖペプチドを作成するために使用するならば第３基準だけを満たすことが必要である)。本発明は、本発明のLol p Ｖペプチドをコードする核酸配列で形質転換させた宿主細胞を適当な培地中で培養し、Lol p Ｖペプチドを含有する細胞および該培地の混合物を生産させ；そして混合物を精製して実質的に純粋なLol p Ｖペプチドを生成する工程を含んで成る本発明の単離Lol p Ｖペプチドまたはそれらの部分の製造法も提供する。本発明のLol p Ｖペプチドまたはそれらの部分をコードするDNAを含有する発現ベクターで形質転換させた宿主細胞を、宿主細胞に適する培地中で培養する。本発明のLol p Ｖペプチドを細胞培養培地、宿主細胞または両方から、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動および本発明のLol p Ｖペプチドまたはそれらの部分に特異的な抗体での免疫的精製を含むペプチドおよびタンパク質精製のための当該技術分野での周知技法を使用して精製できる。
本発明の別の態様は、Lol p Ｖペプチドに特異的に反応する抗体に属する。そのような抗体はアレルゲン抽出物を標準化するために、または天然に存在するLol p Ｖを単離するために使用できる。また本発明のLol p Ｖペプチドをアレルゲン抽出物を標準化するために“精製された”アレルゲンとして使用することもできる。例えばマウスまたはウサギのような動物を、抗体反応を誘発できる本発明の単離されたLol p Ｖペプチドの免疫原性型で免疫することができる。ペプチドに免疫原性を付与する技術にはキャリアーへの連結、または他の当該技術分野の周知技術がある。Lol p Ｖペプチドをアジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行状態は血漿または血清標準ELISAでの抗体価の検出により監視することができ、あるいは抗体レベルを評価するために抗原として免疫原を用いる他のイムノアッセイを使用できる。
免疫化の後、抗−Lol p Ｖペプチド抗血清を得ることができ、所望により血清からポリクローナル抗−Lol p Ｖペプチド抗体を得ることができる。モノクローナル抗体を作成するために、抗体産生細胞(リンパ球)を免疫した動物から回収し、そしてミエローマ細胞のような不滅化細胞と標準的な体細胞融合法により融合して、ハイブリドーマ細胞を作成することができる。ハイブリドーマ細胞は本発明のLol p Ｖペプチドと反応性の抗体の生産について免疫化学的にスクリーニングすることができる。これらの血清またはモノクローナル抗体はアレルゲン抽出物を標準化するために使用できる。
本発明のペプチドおよび抗体の使用を通じて、組成および生物活性が一定で、よく明らかにされている調製物を作成でき、そして治療を目的として投与することができる(例えばライグラス花粉感受性個体の、そのようなグラスの花粉または免疫的に関連しているグラスの花粉に対するアレルギー応答を調節するために)。そのようなペプチドの投与は、例えばLol p Ｖアレルゲンに対するＢ-細胞応答、Lol p Ｖアレルゲンに対するＴ−細胞反応または両方の応答を調節することができる。単離されたペプチドはライグラス花粉アレルギーの免疫治療のメカニズムを研究し、そして免疫治療に有用な改良された誘導体および同族体の設計にも使用できる。
本発明は本発明のLol p Ｖペプチドを特異的に認識するＴ細胞クローンにも関する。これらＴ細胞クローンは本発明のペプチドと特異的に反応するＴ細胞レセプターのための遺伝子を単離およびモレキュラークローニングするために適しているかもしれない。Ｔ細胞クローンは実施例２に記載されているように生成でき、あるいはCellular Molecular Immunology,AbulK.Abbasら、ダブリュー．ビー．サンダース社(W.B.Saunders Co.)(1991)第139頁に記載されているように作成できる。本発明は可溶性Ｔ細胞レセプターにも関する。これらのレセプターはLol p Ｖに感受性個体中の関連するＴ細胞サブポピュレーション(T cell subpopulation)抗原−依存性活性化を阻害できる。そのようなＴ細胞レセプターと特異的に反応する抗体も作成できる。そのような抗体はまた、個体でのＴ-細胞−MHC相互作用を遮断するために有用でありうる。可溶性Ｔ−細胞レセプターの作成法はマサチューセッツ州サンダーランドのシンナー アソシエイツ(Sinaur Assoc)の、Immunology；合成(A Synthesis)、第２版、Edward S. Golubら、(1991)第366-369頁に記載されている。
溶解性を増大させ、治療的または予防的効力を増強し、あるいは安定性を増すために(例えばex vivoでの使用期限およびin vivoでのタンパク質溶解分解に対する耐性)、本発明のペプチド構造を修飾することも可能である。修飾されたペプチドは、免疫原性を改変し、そして／またはアレルゲン性を減少するためにアミノ酸置換、削除または付加によりアミノ酸配列が変更するように製造することができ、あるいは同じ目的のために成分を付加したものも製造できる。
例えばペプチドを免疫原の形態で投与した時に強い増殖性反応を誘導する能力を持たずに、あるいはいかなる増殖性応答の可能性を伴うことなく、Ｔ細胞アネルギーを誘導し、かつMHCタンパク質に結合するする能力を維持するようにペプチドを修飾することができる。この場合には、Ｔ細胞レセプターに対する主要な結合残基を周知技術により決定することができる(例えば、各残基を置換し、そしてＴ細胞反応性の有無を測定する)。Ｔ細胞レセプターとの相互作用に必須であると判明した残基を必須アミノ酸を別のものと置換し、好ましくはその存在がＴ細胞反応性を排除せずに強化、減少するか、または影響しないと示されている同様のアミノ酸と置換すること(保存的置換)により修飾できる。加えてこのようなＴ細胞レセプターの相互作用に必須ではないアミノ酸残基を、アミノ酸の導入によりＴ細胞反応性が増大、減少でき、または影響しないが関連のMHCへの結合を排除しない別のアミノ酸に置換して修飾することもできる。
さらに本発明のペプチドは、MHCタンパク質複合体との相互作用に必須であると示されているアミノ酸を別のものと置換し、好ましくはその存在かＴ細胞活性を排除せずに強化、減少するか、または影響しないと示されている同様のアミノ酸と置換すること(保存的置換)により修飾できる。加えてMHCタンパク質複合体との相互作用に必須ではないがMHCタンパク質複合体と結合するアミノ酸残基を、アミノ酸の導入によりＴ細胞反応性が影響を受けずに増大でき、または排除することなく減少する別のアミノ酸に置換して修飾することもできる。非必須アミノ酸に関して好ましいアミノ酸置換には、限定されるものでないが、アラニン、グルタミン酸またはメチルアミノ酸での置換がある。
安定性および／または反応性を増強するために、本発明のペプチドを修飾して天然対立遺伝子変異から生じるタンパク質アレルゲンのアミノ酸配列中に１つ以上の多型性を導入することもできる。加えて、非天然アミノ酸であるＤ−アミノ酸または非アミノ酸同族体に置換するか、または付加して本発明の範囲の修飾ペプチドを製造することもできる。さらに、本発明のペプチドをA.Sehonおよび共同研究者(Wieら、同上)のポリエチレングリコール(PEG)法を使用して修飾し、PEGと連結したタンパク質またはペプチドを生成することもできる。さらに、PEGは本発明のタンパク質またはペプチドの化学合成中に付加することができる。ペプチドまたはそれらの部分の修飾には還元／アルキル化(TarrのMethod of Protein Microcharacterization；J.E.Silvere編集、フマナ出版(Humana Press)、コルフトン、ニュージャージー州)第155-194頁(1986)；アシル化(Tarr、(同上))；適当なキャリアーへの化学的カップリング(MishellおよびShiigi編集、細胞免疫での選択された方法：Selected Methods in Cellular Immunology、WH Freeman、サンフランシスコ、カリフォルニア州(1980)；米国特許第4,939,239号明細書；または緩和なホルマリン処理(Marsh International Archives of Allergy and Applied Immunoly,41:199-215(1971)がある。
本発明のペプチドの精製を容易にし、場合により、そして可溶性を増加するために、ペプチド骨格にレポーター群(reporter groups：１つまたは複数)を加えることができる。例えばペプチドを金属アフィニティークロマトグラフィーで精製するためにポリ−ヒスチジンをペプチドに加えることができる(Hochuli,Eら、Bio/Technology, 6:1321-1325(1988))。さらに不適切な配列を含まないペプチドを単離するために、所望により特異的エンドプロテアーゼ開裂部位をレポーター群とペプチドのアミノ酸配列の間に導入することができる。個体をタンパク質抗原に対してうまく減感作するために、ペプチドに官能基を付加するか、あるいはペプチド中に疎水性Ｔ細胞エピトープまたは疎水性エピトープを含有する領域を含ませないか、あるいはタンパク質またはペプチドの疎水性領域を含ませなくすることにより溶解性を増す必要があるかもしれない。また疎水性残基をより疎水性が低い残基と交換することが必要かもしれないが、そのような交換は上記のようにMHC複合体またはＴ細胞レセプターに対する結合に影響する。
ペプチド中のＴ細胞エピトープの適性抗原プロセッシングに潜在的に役立たせるために、カノニカル(canonical)プロテアーゼ感受性部位を組換え的、または合成的に２つの領域中に操作することができ、この各領域は少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成る。例えばペプチド構築中にKKまたはRRのような荷電したアミノ酸対をペプチド中の領域間に導入できる。生成したペプチドをカテプシンおよび／または他のトリプシン−様酵素による開裂に対して感受性とし、１つ以上のＴ細胞エピトープを含むペプチドの部分を生成することができる。さらにそのような荷電したアミノ酸残基はペプチドの溶解性の増大をもたらす。
本発明のペプチドをコードするDNAの部位特異的突然変異誘発は、当該技術分野で周知である方法によりペプチドの構造を改変するために使用することができる。中でもそのような方法には縮重オリゴヌクレオチドでのPCR(Hoら、Gene,77:51-59(1989))または変異遺伝子の全合成(Hostomsky,Z.ら、Biochem.Biophys,Res.Comm.,161:1056-1063(1989))がある。細菌での発現を増大させるために、前記の方法を他の手順と組み合わせて使用し、本発明のタンパク質またはペプチドをコードするDNA構築物中の真核コドンをE.coli、酵母、哺乳類細胞または他の有核細胞中で優先的に使用されるコドンに変更することができる。
本発明のペプチドまたは抗体はライグラス花粉症を検出しそして診断するためにも使用できる。例えばそれは、ライグラス花粉に対する感受性を測定する個体から得た血液または血液産物と、Lol p Ｖの単離したペプチドとを血液成分(例えば抗体、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞)がペプチド(１つまたは複数)と結合する適当な条件下で混合して、そしてそのような結合が起こる程度を測定することにより行うことができる。
本発明の単離ペプチドをLol p Ｖ−感受性個体、またはLol p Ｖと交差−反応性のアレルゲンに対してアレルギー性の個体に治療的処方として投与するとき、本発明の単離ペプチドはLol p Ｖライグラス花粉アレルゲンまたはそのような交差−反応性アレルゲンに対する個体の応答を調節することができ、そして好ましくはアレルゲンに対する個体のＢ−細胞、Ｔ−細胞応答、あるいはＢ−細胞応答およびＴ−細胞応答を調節することができる。本明細書において、ライグラス花粉アレルゲンまたは交差−反応性アレルゲンに対する個体のアレルギー応答の調節とは、標準的な臨床方法(例えばVarneyら、British Medical Journal,302:265-269(1990)を参照のこと)により測定されるようなアレルゲンに対する症状が非−応答性であるか、または降下と定義できる(ライグラス花粉誘発喘息症状の降下を含む)。本明細書で述べるように、症状の降下には、個体が本発明のペプチドまたはタンパク質で治療処方を完了した後の個体のアレルゲンに対するアレルギー応答のすべての減少をも含む。この降下は主観的(すなわち患者はアレルゲンが存在してもより快適であると感じる)であってよい。症状の降下は当該技術分野で周知の標準的な皮膚試験により臨床的に測定することもできる。
Ｔ細胞刺激活性を持ち、かつこのように少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成る本発明のLol p Ｖペプチドは、特に治療目的のために望まれるものである。IgEに結合し、かつ少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含んで成る本発明のLol p Ｖペプチドは特に治療目的のために望まれるものである。エピトープについて言えば、エピトープがレセプター認識に必須のアミノ酸を含んで成るところで、エピトープはレセプター、特に免疫グロブリン、組織適合性抗原およびＴ細胞レセプターにより認識される基本的要素または最小単位となるだろう。これらのエピトープを模し、かつLol p Ｖに対するアレルギー性反応を下方制御するか、または減少できるアミノ酸配列も使用できる。Ｔ細胞エピトープは臨床的アレルギー症状の原因であるタンパク質アレルゲンに対する免疫反応の開始および永続化に関与すると考えられている。これらのＴ細胞エピトープは、抗原提示細胞の表面上の適切なHLA分子に結合し、そして関連するＴ細胞サブポピュレーションを刺激することによりＴヘルパー細胞のレベルで初期事象の引き金を引くものと考えられている。これらの事象はＴ細胞の増殖、リンホカインの分泌、局所炎症反応、その部位へのさらなる免疫細胞の補充、およびＢ細胞カスケードを活性化し抗体生産を導く。これら抗体のイソタイプのひとつであるIgEはアレルギー症状の発生に根本的に重要なものであり、その生産は分泌されたリンホカイン類の性質によりＴヘルパー細胞のレベルで、カスケード中でも初期に影響される。
ライグラス花粉アレルギー性患者を、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成り、かつLol p Ｖタンパク質アレルゲンに由来する本発明の単離Lol p Ｖペプチドにさらすと、Ｔ細胞サブポピュレーションがタンパク質アレルゲンに対して非応答性になり、そしてそのようにさらされたた際でも免疫反応の刺激に参加しないように、適切なＴ細胞サブポピュレーションを寛容にし、あるいは免疫性を減少させることができる。さらに少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成る本発明のペプチドまたはその部分を投与することにより、天然に存在するLol p Ｖタンパク質アレルゲンまたはその部分にさらしたものと比較して、リンホカイン分泌プロフィールを調節(モディファイ)することができる(例えばIL-4の減少かつ／またはIL-2の増加)。さらにそのような本発明のペプチドに対してさらすと、通常は天然に存在するアレルゲンに対する応答に参加するＴ細胞サブポピュレーションに影響を及ぼし、これらのＴ細胞をアレルゲンに対して通常さらされる部位(１つまたは複数の例えば鼻腔粘膜、皮膚および肺)から、断片またはタンパク質アレルゲンの治療投与部位(１つまたは複数)へ向かわせる。このＴ細胞サブポピュレーションの再分布により、個体の免疫系が通常の免疫応答をアレルゲンの正常被爆部位で刺激する能力を改善または減少させ、アレルギー症状の降下を生じることができる。
本発明の単離したLol p Ｖペプチドは、Lol p Ｖアレルゲンまたは交差反応性タンパク質アレルゲンに対するアレルギー反応を診断、処置および予防する方法に使用できる。したがって本発明はLol p Ｖアレルゲンまたは交差反応性タンパク質アレルゲンに対するアレルギーを診断するための診断用組成物を提供する。そのような組成物は合成的、または組換え的に生成したLol p Ｖ由来のペプチドおよび医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤を含んで成ることができる。そのような本発明の診断用組成物はラスト法(RAST)、放射性免疫吸着紙試験(paper radioimmunosorbent test：PRIST)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射性免疫アッセイ(RAD)、イムノラジオメトリックアッセイ(immunoradiometric assey:IRMA)、発光免疫アッセイ(LIA)、ヒスタミン放出アッセイおよびIgEイムノブロットのようなアレルギーに関する診断試験に使用できる。本発明はそのようなLol p Ｖペプチドまたはそれらの部分を発現させるために形質転換した宿主細胞中で生産された単離したLol p Ｖペプチドまたはそれらの部分、ならびに医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤を含んで成る治療用組成物も提供する。本発明の治療用組成物は、合成的に製造したLol p Ｖペプチドおよび医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤を含んで成ることもできる。本発明の治療用組成物を減感作させる個体に投与することは周知技術を用いて行うことができる。Lol p Ｖペプチドまたはそれらの部分は、例えば適当な希釈剤、キャリアーおよび／またはアジュバントと混合して個体への投与してもよい。医薬的に許容できる希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝液がある。医薬的に許容できるキャリアーにはポリエチレングリコール(Wieら、(1981)Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.64:84-99)およびリポソーム(Strejanら、(1984)J.Neuroimmunol 7:27)がある。Ｔ細胞アネルギーを誘発するために、治療用組成物は好ましくは非免疫原の形態(例えばアジュバントを含有しない)で投与される。本発明の治療用組成物はライグラス花粉感受性個体または免疫的にライグラス花粉アレルゲンと交差反応性であるアレルゲンに感受性の個体に投与される。
減感作すべき個体への本発明の治療用組成物の投与は、周知方法を使用してアレルゲンに対する個体の感受性を減少するために十分な(すなわちアレルギー性反応を減少する)投与量および期間で行なわれることができる。治療用組成物の効果的量は、個体のライグラス花粉に対する感受性の程度、年齢、性別および個体の体重、ならびにタンパク質またはそれらの断片が個体中でアレルギー反応を誘発する能力、というよう因子により変化するであろう。
活性化合物(すなわちタンパク質またはそれらの断片)は注射(皮下または静脈中等)、経口投与、吸入法、経皮的投与または直腸内投与のような便利な様式により投与できる。投与経路に応じて、活性化合物をを不活性化する可能性のある酵素、酸および他の自然状態から化合物を保護するために活性化合物を一定の物質で被覆することができる。
例えば単位投与量当たり好ましくは約1μg-3mg、そしてより好ましくは約20-500μgの活性化合物(すなわちタンパク質またはそれらの断片)を注射により投与できる。投薬は至適な治療反応を与えるために調整することができる。例えば幾つかに分割された投与量を日、週、月、1/4年または年単位で必要に応じて投与することができ、あるいは投与量を治療状況の緊急性に指示されるように比例的に減少または増加してもよい。
非経口的投与以外でペプチドを投与するために、不活性化を防止するための物質でタンパク質を被覆するか、またはタンパク質をそのような物質と一緒に投与する必要があるかもしれない。例えばペプチドまたはそれらの部分を酵素阻害剤と共に、またはリポソーム中で投与することができる。酵素阻害剤には膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロフォスフェート(DEP)およびトラジロールがある。リポソームは水中−油−水中CGF乳剤(water-in-oil-in-water CGF emulsion)および従来のリポソームを含む(Strejanら、(1984)J.Neuroimmunol 7：27)。
活性化合物を非経口的、または腹腔内に投与することもできる。分散剤をグリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物、ならびに油中に調製することもできる。通常の使用および保存条件下で、これら調製物は微生物の増殖を防止するために保存剤を含有してもよい。
注入可能な使用に適する医薬組成物には、分散剤の滅菌された注入可能溶液を即座に調製するための、滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散剤および滅菌粉末がある。すべての場合において、組成物は滅菌されなければならず、かつ容易に注射能力(syringability)が存在する程度に流体でなければならない。組成物は製造および保存の条件下で安定でなければならないし、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保護されなければならない。キャリアーは例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセラール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等)、それらの適当な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒質であることができる。例えばリシチン(licithin)のようなコーティング剤を使用することにより適切な流動性を維持することができ、分散剤の場合には必要な粒子サイズを維持することにより、そして表面活性剤を使用することにより維持することができる。微生物作用からの保護は、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チロメロサール等のような種々の抗菌および抗真菌剤により達成できる。多くの場合において、組成物中に例えばマンニトールおよびソルビトールのような糖類、ポリアルコール類、または塩化ナトリウムのような等張剤を含有することが好ましいだろう。注入可能な組成物の長時間に及ぶ吸収作用は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収作用を遅らせる薬剤を組成物中に加えることができる。
滅菌された注入可能溶液は、活性化合物(すなわちタンパク質またはペプチド)を必要な量で、必要に応じて上記に列挙した有効成分の１つまたは混合物と共に適当な溶媒中に包含し、次に濾過滅菌して調製することができる。一般的に分散剤は活性化合物を、基本的な分散媒質および上記に列挙した必要な他の成分を含有する滅菌賦形剤中に包含して調製する。滅菌された注入可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製法は有効成分(すなわちタンパク質またはペプチド)の粉末を産する真空乾燥または凍結乾燥法であり、それに予め滅菌濾過された所望の成分の溶液からの任意に付加される成分を加える。
本発明のペプチドが上記のように適切に保護されるとき、そのペプチドは例えば不活性希釈剤または同化しうる食用キャリアーと一緒に経口的に投与できる。このペプチドおよび他の成分を硬質または軟質殻ゼラチンカプセル中に包含するか、錠剤に圧縮するか、あるいは個人の食事に直接的に含ませることができる。経口治療用投与に関しては活性化合物は賦形剤とともに包含され、そして消化しうる錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、カシュ剤等の状態で使用できる。そのような組成物および調製物は少なくとも１重量％の活性化合物を含有すべきである。組成物および調製物の割合は、もちろん様々であってよく、好都合にも単位重量の5-80％の間でありうる。そのような治療に有効な組成物中の活性化合物量は、適切な投薬が得られるものである。本発明の好適な組成物または調製物は、経口投与量単位で約10μgから約200mgの間の活性化合物を含有するように調製されている。
錠剤、トローチ、ピル、カプセル等は以下のものも含有してよい：ガラガカントガム、アカシア、トウモロコシ澱粉またはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、アルギニン酸等のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑剤；およびシュクロース、ラクトースまたはサッカリンのような甘味剤、あるいはペパーミント、サリチル酸メチル油またはサクランボの香のような芳香剤。単位製剤形がカプセルである場合には上記種類の物質に加えて、液体キャリアーを含有してもよい。様々な他の物質が被覆剤として、または単位製剤の物理的形態を種々に改良するために存在してよい。例えば錠剤、ピルまたはカプセルを、セラック、糖またはその両方で被覆できる。シロップまたはエリキシルは活性化合物、甘味剤としてシュクロース、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素ならびにサクランボまたはオレンジのような香を含むことができる。もちろん任意の単位投与製剤を調製するにあたり使用するいかなる材料も、使用する量で医薬的に純粋かつ実質的に非毒性であるべきである。さらに、活性化合物を徐放性調製物および組成物中に包含することができる。
本明細書で使用する“医薬的に許容できるキャリアー”には任意の、そしてすべての溶媒、分散媒質、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等がある。医薬的な活性物質のための、そのような媒質および薬剤の使用は当該技術分野で周知である。活性化合物と配合禁忌である従来の媒質および薬剤を除くかぎり、治療用組成物にそのような媒質および薬剤を使用することは意図するところである。補助的な活性化合物も組成物中に含有できる。
非経口組成物を単位投与剤形に製剤することは、投与の容易性および投薬の均一性から特に有利である。本明細書で使用する投与単位は、治療すべき哺乳動物個体に単位投薬として適するように物理的に別個の単位を言う；各単位は必要な医薬的キャリアーに関連して所望の治療効果を得るために計算し製造された活性化合物を予め定めた量で含有する。本発明の新規投与単位剤形の仕様は、(ａ)活性化合物の独自の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに(ｂ)個体の感受性を処置するためのそのような活性化合物の配合技術に固有の限界により指定され、そして直接的に依存する。
ライグラス花粉タンパク質Lol p Ｖ由来の本発明の種々の単離ペプチドを、第２図および表１に表す。各領域がLol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んでなる少なくとも２つの領域を含んで成るペプチドも本発明の範囲内である。本明細書で使用するように、領域は第２図に示されるような本発明のペプチドのアミノ酸配列またはそのようなペプチドの部分のアミノ酸配列を含むことができる。
本発明の単離ペプチドを得るために、Lol p Ｖを所望の長さの非−重複ペプチドに分割するか、あるいは組換え的または合成的に製造できる実施例１に述べるような所望の長さの重複ペプチドに分割する。少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含んで成るペプチドはIgEに結合できる。少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成るペプチドは、Ｔ細胞増殖またはリンホカイン分泌のようなＴ細胞反応を誘発でき、かつ／またはＴ細胞アネルギーを誘導できる(すなわち寛容化)。少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成るペプチドを決定するために、単離したペプチドを例えばＴ細胞生物学的法により試験して、ペプチドがＴ細胞反応またはＴ細胞アネルギーを誘発するかどうか測定する。Ｔ細胞反応を誘発するか、またはＴ細胞アネルギーを誘導すると判明したこれらのペプチドは、Ｔ細胞刺激活性を有すると定義する。
実施例２に述べるように、ヒトＴ細胞刺激活性はLol p Ｖアレルゲンに感受性の個体(すなわちLol p Ｖアレルゲンに対するIgE媒介免疫反応を有する個体)から得たＴ細胞をアレルゲン由来のペプチドと培養し、そしてペプチドに反応してＴ細胞の増殖が起こるかどうかを測定することにより(例えばトリチウム標識チミジンの細胞内取り込みによる)試験することができる。ペプチドに関するＴ細胞の刺激指数は、ペプチドに反応した最大CPMを対照CPMで除算して算出できる。バックグラウンドの水準の２倍以上の刺激指数(S.I.)を“陽性”と考える。被験者の陽性結果を各ペプチドの刺激指数を算出するために使用する。本発明の好ましいペプチドは少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成り、かつ2.0以上のＴ細胞刺激指数を有する。ライグラス花粉感受性患者を対象として2.0以上のＴ細胞刺激指数を有するペプチドは治療薬として有用であると考える。好適なペプチドは少なくとも2.2のＴ細胞刺激指数を有し、より好ましくは少なくとも2.5、さらに好ましくは少なくとも3.0、よりいっそう好ましくは少なくとも3.4のＴ細胞刺激指数を有する。例えば第４、５または６図に表すような少なくとも2.5のＴ細胞刺激指数を有する本発明のペプチドには、ペプチド１４(配列番号１６)、２５(配列番号２７)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、および３４(配列番号３６)がある。
例えば詳細なマッピング技術により正確なＴ細胞エピトープを決定するために、Ｔ細胞刺激活性を有し、Ｔ細胞生物学的方法によりこのように少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成ると決定されたペプチドを、ペプチドのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかでアミノ酸残基を付加または削除することにより修飾し、そしてその修飾ペプチドに対するＴ細胞活性の変化を測定するために試験する。この方法の後、ペプチドを選択し、そして組換え的または合成的に製造する。好ましい治療用ペプチドは種々の因子(ペプチドに対するＴ細胞反応の強さ(例えば刺激指数)、ライグラス花粉に感受性個体の一群中でのそのペプチドに対するＴ細胞応答の頻度、および前記の他の種のグラス由来の別のアレルゲンとペプチドとの交差−反応の可能性)に基づき選択する。これら選択したペプチドの物理的および化学的特性(例えば溶解性および安定性)を試験してペプチドが治療用組成物として適当であるかどうか、あるいはペプチドに本明細書に記載したような修飾が必要であるかどうかを決定する。選択したペプチドまたは選択した修飾ペプチドのヒトＴ細胞を刺激する能力(例えば増殖の誘導、リンホカイン分泌)を測定する。
さらに、本発明の好適なＴ細胞エピトープ−含有治療用ペプチドは、免疫グロブリンＥ(IgE)に結合しないか、またはペプチドが誘導されたタンパク質アレルゲンよりもIgEに結合する程度が低い。標準的な免疫治療の主な困難は、アナフィラキシーのようなIgEが媒介する反応である。免疫グロブリンＥは抗原が肥満細胞または好塩基球上のIgEに結合および架橋結合し、そして媒介物(例えばヒスタミン、セロトニン、好酸球遊走因子)を放出することにより生じるアナフィラキシー反応のメディエーター(mediator)である。したがってLol p Ｖに感受性である個体群中に実質的な割合で生じるアナフィラキシーは、IgEと結合しないペプチド(１つまたは複数)の免疫療法的使用により、Lol p Ｖアレルゲンに感受性である個体群中において実質的割合(少なくとも約75％)で回避できる。あるいはもしペプチドがIgEに結合しても、そのような結合は肥満細胞または好塩基球から媒介物の放出を生じない。アナフィラキシーの危険性を、IgEとの結合性が減少したペプチド(１つまたは複数)を免疫療法に使用することにより減少できる。さらに、最少のIgE刺激活性を有するペプチドは治療効力に関しても望まれるものである。最少のIgE刺激活性とは、天然のLol p Ｖタンパク質アレルゲンにより刺激されたIgE生産よりも少ないIgE生産および／またはIL-4生産量を言う。
本発明のＴ細胞エピトープを含有するペプチドは、ライグラス花粉−感受性個体に治療的処置の処方で投与したときに、個体のアレルゲンに対するアレルギー応答を調節することができる。特にLol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープの含んで成るか、または少なくとも２つのLol p Ｖ由来領域(各領域は少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成る)を含んで成る本発明のLol p Ｖペプチドは、ライグラス花粉−感受性個体に治療的処置の処方で投与したときに、個体のアレルゲンに対するＴ細胞応答を調節することができる。
本発明の単離されたLol p Ｖ治療用ペプチドは、Lol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成るので、ペプチドは少なくとも約７個のアミノ酸残基を含んで成る。治療的効力を目的として、本発明の好適な治療用組成物は好ましくはLol p Ｖの少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含んで成るので、ペプチドは少なくとも約８個のアミノ酸残基、そして好ましくは少なくとも１５アミノ酸の酸残基を含んで成る。さらに好適な単離ペプチドを含んで成る本発明の治療用組成物は、好ましくはライグラス花粉感受性個体への組成物の治療的投与処方により個体のＴ細胞がタンパク質アレルゲンに対して寛容となるように、全アレルゲンタンパク質中のＴ細胞エピトープを十分な割合で含んで成る。ペプチド合成は長さが増加すると困難になるので、長さが最高約４５アミノ酸の残基、最も好ましくは長さが最高約３０アミノの残基含んで成る本発明の合成的に製造したペプチドが特に好ましい。本発明のペプチドは上記のように組換え的に生産することもでき、４５アミノ酸以上の長さのペプチドは組換え的に生産するのが好ましい。
治療目的に使用することができるLol p Ｖタンパク質アレルゲン由来のペプチドは、Lol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成り、そして以下のペプチドのアミノ酸配列全部または部分を含んで成る：６(配列番号８)、７(配列番号９)、１２(配列番号１４)、１４(配列番号１６)、１６(配列番号１８)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、２５(配列番号２７)、２８(配列番号３０)、３３(配列番号３５)、および３４(配列番号３６)(第２図に表すように)。好ましくは以下のペプチドのアミノ酸配列を含んで成るペプチドは、第４、５または６に表されるように誘導されたペプチドの平均Ｔ細胞刺激指数に等しいか、またはそれより大きい平均Ｔ細胞刺激指数を有する：６(配列番号８)、７(配列番号９)、１２(配列番号１４)、１４(配列番号１６)、１６(配列番号１８)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、２５(配列番号２７)、２８(配列番号３０)、３３(配列番号３５)および３４(配列番号３６)(第２に表す)。治療目的に使用できる、さらにいっそう好ましいLol p Ｖタンパク質アレルゲン由来のペプチドは、第２図に表すように以下のペプチドのアミノ酸配列全部または部分を含んで成る：１４(配列番号１６)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、２５(配列番号２７)、および３４(配列番号３６)。
本発明の１つの観点では、少なくとも２つのペプチド(例えば少なくとも２つのペプチドの物理的混合物)を含んで成る組成物が提供され、それぞれがLol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成る。そのような組成物を治療用組成物の状態で、医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤とともに投与できる。さらに１つ以上の治療用組成物の治療的に効果的な量、およびＴ細胞エピトープを有する少なくとも１つのペプチドを含んで成る治療用組成物をライグラス花粉に感受性の個体に同時に、または連続的に投与できる。
同時に、または連続的に投与できるLol p Ｖペプチドの好適な組成物および好適な組み合わせ(第２図に表されるアミノ酸配列を含んで成るペプチドを含んで成る)には、以下の組み合わせがある：
１４(配列番号１６)および２２(配列番号２４)；
１４(配列番号１６)および２５(配列番号２７)；
１９(配列番号２１)および２２(配列番号２４)；
１９(配列番号２１)および２５(配列番号２７)；
１４(配列番号１６)、２２(配列番号２４)および２５(配列番号２７)；
１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)および２５(配列番号２７)；
１４(配列番号１６)、２２(配列番号２４)、２５(配列番号２７)および３４(配列番号３６)；
１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、２５(配列番号２７)および３４(配列番号３６)；
１４(配列番号１６)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)および２５(配列番号２７)；
１４(配列番号１６)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、２５(配列番号２７)および３４(配列番号３６)；
６(配列番号８)、７(配列番号９)、９(配列番号１１)、１２(配列番号１４)、１４(配列番号１６)、１６(配列番号１８)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、２５(配列番号２７)、３３(配列番号３５)および３４(配列番号３６)；
６(配列番号８)、９(配列番号１１)、１６(配列番号１８)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、および３４(配列番号３６)；ならびに
６(配列番号８)、９(配列番号１１)、１４(配列番号１６)、１６(配列番号１８)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、２５(配列番号２７)および３４(配列番号３６)；
本発明をさらに以下の限定を意図するものではない図面および実施例で説明する。
実施例
実施例１
Lol p Ｖペプチド
Lol p Ｖ(配列番号２)のアミノ酸配列は、第１図に表すATCC番号 のクローン12R(配列番号１)のcDNA配列由来のものであった。Lol p Ｖ(Lol p Ib.1として説明されている)をコードするクローン12Rのクローニングおよびシークエンシングは、国際公開第93/04174号パンフレットに記載されている。30個の12-merおよび４個の13-mer固相ペプチドをBT7400手動ペプチド合成ブロック(manual peptide synthesising block)(バイオテック機器株式会社：Biotech Instruments Ltd、英国)で合成した。これらのペプチドは４個(または５個)のアミノ酸が重複している全Lol p Ｖ配列に対応した。このペプチドをC-末端Fmoc保護アミノ酸樹脂(25mMアウスペップ；auspep、オーストラリア)で合成した。樹脂は連続的に3×1mlのジメチルホルムアミド(DMF：アウスペップ、オーストラリア)で洗浄および排水し、そして次に1mlの脱保護溶液(DP、DMF中の25重量／容量％ピペリジン、アウスペップ、オーストラリア)で10分間処理し、最初のC-末端アミノ酸からFmoc基を除去した。ウェル(well)を次に洗浄し、そして3×1ml DMF、2×1mlジクロロメタン(DCM；アウスペップ、オーストラリア)、そして最後に2×1mlDMFで連続的に洗浄および排水した。選択した10倍過剰のアミノ酸を活性化試薬と混合した(BOP:HOBYT1:1；アウスペップ、オーストラリア)、1mlの活性化溶液(アウスペップ、オーストラリア)に溶解し、そしてカップリングのために適当なウェルに加えた。この手順を所望のペプチド長が得られるまで繰り返した。
ペプチドを次に開裂溶液(90容量／容量％ トリフルオロ酢酸、4容量／容量％ フェノール、１容量／容量％ エタンジチオール；アウスペップ、オーストラリア)で６時間処理し、ウェルからペプチドが開裂しやすくした。回収したペプチドを次に50mlの冷ジエチルエーテル(DEE：アウスペップ、オーストラリア)で沈殿させ、そしてワットマン濾紙１(ワットマン：Whatman、英国)で単離した。これらの濾紙を50mlの凍結乾燥溶液(アウスペップ、オーストラリア)で洗浄し、そして凍結乾燥した。ペプチドをアウスペップラボラトリーのHPLCおよび質量スペクトロメトリーの分析に供し、配列およびペプチド純度を検査した。
ペプチドを水に溶解し、1.6mMの保存溶液を調製した。不溶性ペプチドを１分間の超音波(ブロンソン ソフハファイヤー450：Branson Sofifier 450、米国)により溶解した。
ペプチドをニトロセルロース(NC)フィルターに、他に報告されている変法(Sithigonglu(1991)J.Immunol.Methods,141:23-32)を使用して固定化した。2μlのペプチド保存溶液をNCフィルター(シュライヒャー アンド シウェル：Schliecher & Schuell、西独国)上に約1cmの間をあけて、スポット状に適用した。切片を乾燥し、そして80℃で１時間焼いた後、気密に密閉したプラスチックの箱の中で0.2％グルタルアルデヒド(PBS中)蒸気に室温(18℃)で１時間暴露することにより固定した。蒸留水で徹底的に洗浄した後、NCフィルターをBlotto(PBS中の10％脱脂粉乳)で２時間ブロックし、そして1XTween-PBS(PBS中の0.1％Tween20)および2XPBSでそれぞれ５分間洗浄した。
ペプチドを次にヒトIgEおよびマウス／ウサギIgGエピトープに関して、個体血清(0.5％BSAを含むPBSで1:4に希釈)、MAbs FMC A7(Smartら、(1983)Int.Arch.Allergy Clin.Immunol.72:243)およびポリクローナルウサギ抗−Lol p Ｖ(Lol p Ib)抗体を用いて調査した。
我々の50名の高感度なライグラス花粉アレルギー性個体の中の23名が少なくとも１つのペプチドに結合するIgEを持っていた。個体の大部分が弱から中程度のIgE反応性を有するが、数名は高い反応性を表した。IgE結合に関するドットブロット分析を第７図に表す。
各ドットブロットの強度は、デンシトメータ(ファルマシアLKB Ultra Scan XL、スウェーデン)で測定した。値は任意のデンシトメトリーの単位であり、図８に表す。バックグラウンドと比べて２より大きいデンシトメータの値を、陽性結合と考えた。バックグラウンドと比較してそれぞれ陽性結合。各ペプチドに関して血清および抗体値が加えられ(得点／ペプチド)、そして陽性血清数により除算し最終的な値を平均値(得点／血清)として算出した。血清Ｃ１およびＣ２はグラスアレルギー性ではなく、よって陰性対照として使用した。Ｃは陽性対照として粗ライグラス花粉抽出物(１μｇ／ドット)を言う(実施例３を参照のこと)。
血清１、１４、３６、４２および４８は、選択した特異的ペプチド(例えばペプチド１９(配列番号２１)、３４(配列番号３６)および７(配列番号９)に対して実質的な親和性を示し、これらはLol p Ｖの主要抗原線状アレルゲン性Ｂ−細胞エピトープ(immunodominant linear allergenic B-cell epitopes)(第７および８図)に分類された。
ペプチド番号７(配列番号９)、１６(配列番号１８)、１９(配列番号２１)、２１(配列番号２３)、２３(配列番号２５)、３０(配列番号３２)および３４(配列番号３６)は最高のヒトIgE−反応性を示し、したがってLol p Ｖの主線状アレルゲン性Ｂ−細胞エピトープ(major linear allergenic B-cell epitopes)に分類された。MAb、FMC-A7およびウサギポリクローナル抗−Lol p Ib抗血清をペプチドに対するIgG結合に関して分析した。このデータを第７図に表す。MAbおよびウサギ抗血清は、一般的にペプチドに対して低い結合性を表した。ペプチド番号１(配列番号３)、７(配列番号９)、１９(配列番号２１)、２３(配列番号２５)、２４(配列番号２６)および２８(配列番号３０)は最高のマウス／ウサギIgG−反応性を示した。
実施例２
１．材料および方法
粗ライおよびバミューダグラス花粉抽出物
ライグラス(Lolium perenne)およびバミューダグラス(Cyndon dactylon)花粉をグリアーラボラトリーズ(Greer Laboratorwies、米国)から乾燥した非−脱脂抽出物として得た。花粉アレルゲンを0.001M NH4HCO3(10重量／容量％)中で抽出し、遠心そして上清をリン酸塩溶液(PBS)で一晩透析した。上清は0.20μmフィルターを通し、タンパク質濃度はバイオラッドのマイクロアッセイ(BioRad Microassay)(バイオラッド、米国)を使用して、製造元の仕様に従い測定した。
Lol p Ｖ
Lol p Ｖを粗ライグラス花粉抽出物から、流体相液体クロマトグラフィー(fluid phase liquid chromatography:FPLC)により精製した。簡単に述べると、粗ライグラス花粉抽出物をEcono-Pac 10DGカラム(バイオ−ラッド、米国)でPBSから20mM Tris pH12(緩衝液Ａ)への緩衝液交換に供した。この抽出物5mgを、予め連続的に緩衝液Ａで5分間、次に緩衝液Ｂ(20mM Tris、pH7)で10分間、そして最後に緩衝液Ａでさらに5分間平衡化したイオン交換FPLCカラム(MonoQ HR5/5；ファルマシア、スウェーデン)に注入した。カラムを緩衝液Ａで10分間洗浄し、Lol p Ｖを結合させ、同時にpI値が12以上の他のタンパク質を溶出させた。Lol p Ｖの溶出は緩衝液Ｂで1ml／分の一定流速で15分間、室温で行った。毎分１ｍｌの画分を回収し、そしてSDS-PAGEおよびイムノブロッティングで分析した。Lol p Ｖを含有する画分をプールし、そしてタンパク質濃度を測定した。
Lol p Ｖペプチド
同じLol p Ｖペプチドを実施例１に記載したように生成した。ペプチド１３(配列番号１５)は極めて少量でしか生成しなかったので、この実験では試験できなかった。
アレルゲン−反応性Ｔ細胞系およびクローンの生成
ライグラス花粉に対する皮膚試験が陽性である健康な成人から得られた末梢血液単核細胞(PBMC)を、ヘパリン化血液試料からFicoll-Paque(ファルマシア、スウェーデン)密度勾配で遠心することにより単離した。最初に1×106/ml PBMCを5μg/mlのLol p Ｖで、96ウェルのＵ型底マイクロタイタープレート(リンブロ：Linbro、米国)中で刺激した。すべての細胞を、１重量/容量％のL-グルタミン(ICN、オーストラリア)、0.125重量/容量％のゲントマイシン(デルタ ウエスト；Delta West、オーストラリア)および５容量/容量％の加熱不活化ヒトA+血清を補給したRPM1-1640(ICN、オーストラリア)組織培養培地中で培養した。培養は37℃で５容量/容量％のＣＯ2雰囲気中で行った。
培養開始７日後、10単位/mlのヒト組換えIL-2(rIL-2：シータス：Cetus、米国)をウェルに加えた。14日目にＴ細胞系を、細胞を24-ウェル組織培養プレート(コースター：Costar、米国)に移し、そして5×105/mlの照射(2000rads)自己PBMC、2.5μg/ml Lol p Ｖ、10-20単位/ml rIL-2、5-10単位/ml Lymphocult(バイオテスト：Biotest、独国)および0.1μg/ml PHA(ウェルカム：Wellcom、英国)を加えて拡張した。系を8-10日ごとに上記のように再刺激した。
Ｔ細胞を次に系を限定希釈してクローン化した。このためにＴ細胞を300、30、３、１および0.3細胞/ウェルで、96−ウェルのＵ型底マイクロタイタープレート中に、1×106/ml照射PBMC、2.5μg/ml Lol p Ｖ、20単位/ml rIL-2、10単位/ml lymphocultおよび0.1μg/ml PHAと一緒に接種した。クローンはrIL-2を4日ごとに供給し、照射PBMC、Lol p Ｖ、rIL-2およびLymphocultを8-10日ごとに加えた。
増殖アッセイに使用する前に、最後の供給細胞、アレルゲンおよびIL-2添加後に系およびクローンを7-8日間休止させた。
増殖アッセイ
5×105/mlのＴ細胞を、5×105/mlの照射自己PBMCおよびLol p Ｖ(0.019-2.5μg/mlまたは0.625-20μg/ml)、あるいはLol p Ｖペプチド(1および10μg/ml)と共に96ウェルのＵ型−底のマイクロタイタープレート中で88時間培養し、そして1μCi/ウェルのトリチウム標識 メチルチミジン([H]TdR；アマシャム：Amersham、米国)をガラス繊維フィルター上に回収する８時間前に適用した。対照カルチャーはアレルゲン無しの細胞、PHAとの細胞、Ｔ細胞のみ、および照射PBMC細胞のみであった。各フィルターに関する１分あたりの計数(CPM)を液体シンチレーションカウンター(LKBワラック：LKB Wallace、フィンランド)で測定した。
免疫表現型分析
Ｔ細胞を直接的に、あるいは以下のモノクローナル抗体を使用する蛍光抗体により間接的に染色した：CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11b、CD16、CD19、CD25、CD45RO、CD45RA、MHCクラスII TcRαβTcRγδ、ｋ軽鎖およびλ軽鎖。間接的蛍光抗体法には、FITC-結合ヤギ-抗-マウスIgF(ab)2(シレナス：Silenus、オーストラリア)を使用した。細胞を次にFACScanフローサイトメーター(ベクトン−デッキンソン：Becton-Dickinson、米国)を使用して分析した。
２．結果
Ｔ細胞系のアレルゲン反応性
培養34日目に、Ｔ細胞系のライおよびバミューダグラス花粉アレルゲンに対する反応性を試験した。一連の濃度範囲にわたって誘導アレルゲンLol p Ｖに対する強い増殖活性があり、そして粗ライグラス花粉抽出物に対しては反応は低かった(第３図)。粗バミューダグラス花粉抽出物に対する反応は無かった。
Lol p Ｖ合成ペプチドに対するＴ細胞系およびクローンの反応性
14日目に初めてＴ細胞系のLol p Ｖ合成ペプチドに対する反応性を試験したが有意な反応性は検出されなかった。しかし27日目に、ペプチド１４(配列番号１６)に対する強い反応性が観察された。49日までペプチド１４(配列番号１６)に対するこの強い反応性は維持されたが、さらにペプチド２５(配列番号２７)(第４図)に対する弱い反応があり、Ｔ細胞系のポリクローナル的特性と一致する。ペプチド１４(配列番号１６)および２５(配列番号２７)のアミノ酸配列を表２に表す。
Ｔ細胞クローンはＴ細胞系から17日目に生じた。得られた8個のＴ細胞クローンの１つをA12と命名したが、これはペプチド１４(配列番号１６)のみに強い反応を表した(第５図)。49日目のクローンA12のＴ細胞系に関する刺激指数が4.8であるの比べて、ペプチド１４(配列番号１６)に対する刺激指数は137であり、ペプチド１４−特異的Ｔ細胞の選択に相関する。
Ｔ細胞系の表現型分析
47日目のＴ細胞系の表現型をフローサイトメトリーにより、細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のパネルを使用して分析した。系はCD2、CD3、CD5、CD４、CD25、CD45RO、MHCクラスIIおよびTcRαβを発現し、活性化成熟ヘルパーＴ細胞の表現型と一致した。
１．材料および方法
別のＴ細胞系を実施例２に記載した同じ患者から、実施例２に記載した方法で作成した。増殖アッセイを実施例１に記載したLol p Ｖ合成ペプチドを使用して実施例２に記載した方法で作成した。
２．結果
Lol p Ｖ合成ペプチドに対する反応性についてＴ細胞系を試験した。結果を第６図に表す。増殖はバックグラウンド増殖を引き算して得る。バックグラウンド増殖(培地のみに対する増殖)は2500cpmであった。刺激指数は2500cpmを第６図に示した値に加え、そして2500で除算することにより表された結果から算出した。ペプチド６(配列番号８)、７(配列番号９)、９(配列番号１１)、１２(配列番号１４)、１６(配列番号１８)、１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)、２８(配列番号３０)、３３(配列番号３５)、および３４(配列番号３６)は第６図に表すように2.0以上の刺激指数を有した。最も反応性のペプチド１９(配列番号２１)、２２(配列番号２４)及び３４(配列番号３６)はＴ細胞刺激指数がそれぞれ2.9、3.4、および2.5である。
実施例４
阻害ペプチドドットブロットおよび阻害血清を使用するペプチド３４でのIgE結合実験
Ａ．阻害ペプチドドット−ブロット
簡潔な方法論
ペプチド３４(配列番号３６)、６(配列番号８)、２４(配列番号２６)および３１(配列番号３３)(最後の３つは陰性対照として使用した)、ならびにFPLCで精製したLol p Ｖおよび粗ライグラス花粉抽出物(第９図中それぞれIXおよびＣと呼び、そして陽性対照として使用した)をすでに記載したようにNCに固定化し、焼き、そしてグルタルアルデヒド固定を行った。２つの別ロットの血清(ペプチド34-特異的IgE抗体を有する個体Girgisから得た；１：４希釈)をRT(18℃)で、1mlの血清で希釈した50μgの粗ライグラス花粉抽出物(図中阻害血清と言う)か、または粗抽出物無し(対照血清という)のいずれかと一緒に一晩プレインキュベーションした。ペプチドブロットは次に別個に対照中および粗抽出物とプレインキュベーションした血清中で一晩インキュベーションを行い、その後125Ｉ標識抗−ヒトIgE抗体でインキュベーションし、そしてＸ−線フィルムに最高96時間暴露した。
結果：
対照血清はペプチド３４(配列番号３６)および陽性対照Lol p IXおよび粗ライグラス花粉抽出物に対して強いIgE-結合を与えた。別の対照ペプチド(例えばアラニンが豊富なペプチド３１(配列番号３３)、およびペプチド６(配列番号８)、２４(配列番号２６))はIgE-結合を与えなかった。
粗ライグラス花粉抽出物とプレインキュベーションした血清は、ペプチド３４(配列番号３６)に対してIgE-結合が減少し、陽性対照Lol p Ｖおよび粗ライグラス花粉抽出物に対しても同様であった。
結論：
これらの結果は個体が粗ライグラス花粉抽出物により抑制されることができるペプチド３４-特異的IgE抗体を有することを実証する。
Ｂ．阻害ELISA
簡潔な方法論
ペプチド３４(配列番号３６)、６(配列番号８)、２４(配列番号２６)および３１(配列番号３３)(最後の３つは陰性対照として使用した)ならびに粗ライグラス花粉抽出物(陽性対照として使用した)をマイクロタイタープレートに被覆した。個体血清(１：４に希釈)を種々の濃度の粗ライグラス花粉抽出物有り、または無しでRTで一晩プレインキュベーションした。ペプチド／粗抽出物を被覆したウェルを次に対照および粗抽出物とプレインキュベーションした血清(種々の粗抽出物濃度)とインキュベーションした。プレートを洗浄し、そしてウサギで生産した抗−ヒトIgEとインキュベーションし、そして次にHRP−結合抗−ウサギ抗体とインキュベーションした。プレートをパーオキシダーゼ基質1,2-フェニレンジアミンで発色させ、発色反応を492nmで読んだ。
結果：
第１０図に表すように、対照血清はペプチド３４(配列番号３６)および粗ライグラス花粉抽出物に対してIgE-結合を生じた。粗抽出物の濃度を段階的に上昇すると、ペプチド３４(配列番号３６)および粗抽出物に対するIgE-結合が段階的に減少した。対照ペプチドはすべて有意により低いIgE-結合性を表し、そして阻害剤濃度の増加に伴うIgE-結合性の段階的減少はなかった。対照ペプチドに示される結合は、バックグラウンドによるものであり、これはアッセイ条件によるペプチドまたはウェルに対する非−特異的IgE-結合である。しかし、ELISAでわずかなバックグラウンドが観察されても、ペプチド３４(配列番号３６)および粗抽出物に対するIgE-結合は対照ペプチドよりも高かった。
結論：
阻害ドットブロットの結果のように、阻害剤ELISAの結果はこの個体中においてペプチド３４(配列番号３６)に対する有意なIgE-結合を示した。
当業者は本明細書に記載した発明が特別に記載した以外の変形および改良にも応用できることを理解するであろう。本発明はそのような変形および改良も包含することが理解される。本発明は本明細書中で言及されるすべての方法、特徴、組成物および化合物も、独立して、あるいは集合的に包含し、そして２つ以上の該方法および特徴の任意のおよびすべての組み合わせも包含する。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人
（Ａ）氏名：メルボルン大学
（Ｂ）通り：グラッテン通り
（Ｃ）市：パークビル
（Ｄ）州：ビクトリア
（Ｅ）国：オーストラリア
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：３０５２
（Ｇ）電話番号：３−６１３−３４４−４０００
（Ｈ）ファックス：３−６１３−３４４−７６２８
（ii）発明の名称：ライグラス花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープ
（iii）配列数：３６
（iv）コンピューター読取り先：
（Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル
（Ｃ）実行システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：ＡＳＣＩＩ テキスト
（ｖ）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（vi）先願データ：
（Ａ）出願番号：米国特許出願第０７／８６６，６７９号
（Ｂ）出願日：１９９２年４月９日
（vii）弁理士／代理人に関する情報
（Ａ）氏名：ジョン エム．スラッタリー
デイビス コリジョン カーブ
オーストラリア、メルボルン３０００、リトルコリンズ
ストリート １、
（Ｂ）登録番号：
（Ｃ）参照／処理番号：ＩＰＣ−０１１Ｃ３ＰＣＴ
（ix）電話通信情報
（Ａ）電話：６１３−２５４−２７７７
（Ｂ）ファックス：６１３−２５４−２７００
（２）配列番号１に関する情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１３７６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：４２．．．４２
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ｍａｔ ペプチド
（Ｂ）位置：１１５．．．９４２
（xi）配列の記載：配列番号１：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：３０１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号２：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号３：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号４：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号５：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号６：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号７：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号８：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号９：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１０：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１１：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１２：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１３：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１４：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１５：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１６：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１７：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１８：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号１９：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２０：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２１：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２２：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２３：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２４：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２５：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２６：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２７：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２８：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号２９：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号３０：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号３１：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号３２：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号３３：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号３４：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号３５：
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線
（ii）分子型：ペプチド
（xi）断片型：内在的
（xi）配列の記載：配列番号３６：
Claims (15)
- 配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３５および配列番号３６のアミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸配列のみから成り且つ少なくとも2.0のＴ細胞刺激指数を有するLol p Ｖの単離ペプチド。
- 上記ペプチドがLol p Ｖの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで成り、該ペプチドが配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３５、および配列番号３６のアミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸配列のみから成る、請求の範囲第１項記載の単離ペプチド。
- 上記ペプチドがLol p Ｖの少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含んで成り、該ペプチドが配列番号９、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号３２、および配列番号３６のアミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸配列のみから成る、請求の範囲第１項記載の単離ペプチド。
- 少なくとも2.0のＴ細胞刺激指数を有する請求の範囲第２項記載の単離ペプチドまたはそのエピトープ含有部分。
- 請求の範囲第１項記載のペプチドをコードする配列を有する単離核酸分子。
- 請求の範囲第５項記載の核酸で形質転換させた宿主細胞中で生産された単離ペプチド。
- 請求の範囲第１項記載のペプチドをコードする核酸配列を含んで成る発現ベクター。
- 少なくとも１つの請求の範囲第２項記載の単離ペプチドおよび医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤を含んで成る、ライグラスに対する感受性を治療するための治療用組成物。
- Lol p ＶアレルゲンまたはLol p Ｖアレルゲンと免疫的に交差反応性のアレルゲンに対する個体の感受性を治療するための、請求の範囲第８項記載の治療用組成物。
- 個体から得た血液試料を少なくとも１つの請求の範囲第１項記載のペプチドと、血液成分がペプチドと結合する適当な条件下で混合し、そしてそのような結合の発生の程度を、個体のライグラスに対する示しうる感受性として測定することを含んで成る、個体のLol p Ｖに対する感受性の検出法。
- 結合の発生程度がＢ細胞機能、Ｔ細胞機能、Ｔ細胞増殖あるいはＴ細胞機能およびＢ細胞増殖の組み合わせをアッセイすることにより測定される請求の範囲第１０項記載の方法。
- 少なくとも２つの請求の範囲第１項記載の単離されたペプチドおよび製薬学的に許容し得るキャリアーまたは希釈剤を含んで成る、ライグラス花粉に対する個体の感受性を治療するための、請求の範囲第８項記載の治療用組成物。
- 医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤、および配列番号８、配列番号９、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３５、および配列番号３６から成る群から選択された少なくとも２つのLol p Ｖペプチドを含んで成る、ライグラス花粉に対する感受性を治療するための治療用組成物であって、Lol p Ｖ感受性個体に対して投与されたときに個体のＴ細胞がLol p Ｖに寛容となるように十分な割合でLol p ＶのＴ細胞エピトープを含んで成る、該治療用組成物。
- 配列番号１６および配列番号２４；
配列番号１６および配列番号２７；
配列番号２１および配列番号２４；
配列番号２１および配列番号２７；
配列番号１６、配列番号２４および配列番号２７；
配列番号２１、配列番号２４および配列番号２７；
配列番号１６、配列番号２４、配列番号２７および配列番号３６：
配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７および配列番号３６；
配列番号１６、配列番号２１、配列番号２４および配列番号２７：
配列番号１６、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７および配列番号３６：
配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３５)および配列番号３６；
配列番号８、配列番号１１、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４および配列番号３６；ならびに
配列番号８、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７および配列番号３６；
から成る群から選択されたペプチドの組み合わせを含んで成る請求の範囲第８項記載の、ライグラス花粉に対する感受性を治療するための治療用組成物。 - Lol p ＶアレルゲンまたはLol p Ｖアレルゲンに免疫的に交差反応性のアレルゲンに対する個体の感受性を治療するための、請求の範囲第１２から１４項のいずれか１に記載の治療用組成物。
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