FI115827B - Menetelmä raiheinän siitepölyallergeenin T-soluepitooppien valmistamiseksi - Google Patents

Description

115827

Menetelmä ralhelnän siitepölyallergeenin T-soluepitooppien valmistamiseksi 5 Suurimman osan heinän siitepölyn proteiineista muodostavat allergeenit, jotka ovat allergian pääsyynä lauhkeissa ilmastoissa (Marsh (1975) Allergens and the genetics of allergy: julkaisussa M. Sela (toimittaja) The Antigens, osa 3, ss. 271-359, Academic Press Inc., Lontoo, New York)., Hill et ai.

10 (1979) Medical Journal of Australia 1, 426-429). Allergiaa aiheuttavien raiheinän proteiinien ensimmäiset kuvaukset osoittivat, että nämä proteiinit eroavat immunokemiallisesti toisistaan, ja ne tunnetaan ryhminä I, II, III ja IV (Johnson ja Marsh (1965) Immunochemistry 3, 91-100). The International 15 Union of Immunological Societies'in (IUIS) nimistön mukaan näitä allergeeneja merkitään Loi p I:llä, Loi p II:11a, Loi p III:11a ja Loi p IV:llä. Niiden lisäksi kirjallisuudessa tunnetaan myös vielä yksi tärkeä Lolium perennen L.-allergeeni, joka on Loi p V ja joka tunnetaan myös Loi p IX:na tai Loi p 20 Ib:nä (Singh et ai. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, 1384-1388. Suphioglu et ai., 1992, Lancet, 339, 569-572.

Mainitut viisi proteiinia on identifioitu raiheinän siitepö- : J; lyssä Lolium perenne L:ssä, ja niiden on todettu toimivan .·**. 25 allergeeneinä, siten että ne herkissä ihmisissä laukaisevat : välittömän (tyypin 1) yliherkkyyden.

> * ·

Loi p V määritellään allergeeniksi, koska se pystyy sitomaan spesifistä IgE:tä raiheinälle herkkien potilaiden seerumissa, : 30 koska se toimii antigeeninä IgG-vasteissa ja laukaisee T-so-luvasteita. Allergeeniominaisuudet on havainnollistettu immu-| noblottaustutkimuksilla, jotka osoittavat, että 80 prosentilla potilaista, jotka olivat herkkiä raiheinän siitepölylle, oli spesifistä IgE-vasta-ainetta, joka sitoutui Loi p V -isomuo->’ 35 töihin (PCT-hakemusjulkaisun numero WO 93/04174, sivu 65).

Nämä tulokset ilmaisevat, että Loi p V on pääasiallinen raiheinän allergeeni.

2 115827

Allergeenien huomattavaa ristireaktiokykyä on havaittu heinän siitepölyjen välillä, kun on käytetty IgE:n sitomismenetelmää (radioallergosorbenttitekniikkaa, RASTia), esimerkiksi kuten Marsh et ai. (1970), J. Allergy, 46, 107-121, sekä Lowenstein 5 (1978), Prog. Allergy. 25, 1-62 (Kargel, Basel), kuvaavat.

Loi p V:n immunokemiallinen suhde heinän muiden antigeenien kanssa on havainnollistettu, siten että on käytetty polyklo-naalisia ja monoklonaalisia vasta-aineita (Zhang et ai, Int 10 Arch Allergy Appi Immunol. 96, 28-34 (1991); Roberts et ai,

Int Arch Allergy Appi Immunol. 98, 178-189 (1992); ja Matt-heisen ja Lowenstein, Clinical and Experimental Allergy, 21, 309-320 (1991). Vasta-aineet on valmistettu puhdistetuiksi proteiineiksi, jotka sitovat IgE-komponentteja. Nämä tulokset 15 havainnollistavat sen, että tärkeät allergeenit, joita on sellaisten heinien siitepölyissä, jotka ovat toisilleen läheisesti sukua, ovat immunokemiallisesti Loi p V:n kaltaisia, ja yleensä ne luonnehditaan ryhmän V allergeeneiksi.

20 Esillä oleva keksintö saa aikaan Loi p V:n eristettyjä peptidejä. Keksinnön piirissä terapeuttisesti käytettävät peptidit : käsittävät ainakin kaksi aluetta, joista kumpikin sisältää Loi p V:n ainakin yhden epitoopin, jonka T-solu tunnistaa. Diag- ; nostisiin tarkoituksiin käytettävät keksinnön peptidit pysty- • < 1 .•".25 vät sitomaan IgE:ta ja käsittävät ainakin yhden epitoopin, t· t>> jonka B-solu tunnistaa.

Keksintö saa aikaan myös muunnettuja peptidejä, joilla on samanlaisia tai tehostettuja terapeuttisia ominaisuuksia kuin 30 vastaavalla, luonnossa esiintyvällä allergeenilla tai sen osalla mutta joiden sivuvaikutukset ovat vähäisemmät, sekä ; sellaisia .muunnettuja peptidejä, joilla on parannettuja omi naisuuksia, kuten esimerkiksi lisääntynyt liukoisuus ja stabiilius. Keksinnön mukaiset terapeuttiset peptidit pystyvät 35 muuntamaan allergista vastetta Loi p V:ta tai allergeeniä kohtaan, joka immunologisesti reagoi ristiin Loi p V:n kanssa, sellaisissa Loi p V:lle herkissä yksilöissä, joille terapeuttisia peptidejä annetaan.

3 115827

Keksinnössä aikaansaadaan myös heinäallergeenihekkyyden diagnoosimenetelmiä sekä terapeuttisia koostumuksia, jotka sisältävät yhtä tai useampaa keksinnön mukaista peptidiä.

5

Esillä oleva keksintö saa aikaan Loi p V -peptidien johdannaisia tai homologeja sekä sellaisia peptidejä, jotka immunologi-sesti reagoivat ristiin Loi p V:n vasta-aineiden tai sellaisten T-solujen kanssa, jotka tunnistavat Loi p V:n, tai niiden 10 johdannaisia tai homologeja.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .

15 Esillä olevan keksinnön lisäpiirteet tulevat paremmin ymmärretyiksi seuraavasta, yksityiskohtaisesta kuvauksesta, joka koskee keksinnön edullisia suoritusmuotoja, yhdessä kuvioiden kanssa, jotka ovat liitteinä.

20 Kuvio 1 esittää cDNA-kloonin 12 R nukleotidisekvenssiä (sekvenssin identifiointinumero 1, ID NRO 1) sekä sen ennustettua aminohapposekvenssiä (sekvenssin identif iointinumero) . Klooni 12R on Loi p V:n täysimittainen klooni.

.···, 25 Kuvio 2 esittää keksinnön erilaisia peptidejä, mittaisia ja ; >-t peräisin Loi p V:sta. 1

Kuvio 3 on graafinen esitys, joka kuvaa T-solujen stimulointi- indeksiä, joka on saatu sellaisten T-solujen 34.:lta viljely- : 30 päivänä, joita on viljelty mainittu aika autologisten, sätei-lytettyjen PBMC: iden kanssa sekä indusoivan Loi p V - aller-: geenin, raa'an raeheinäsiitepölyuutteen tai Bermudaheinän raa'an siitepölyuutteen läsnä ollessa; solujen jakaantuminen eli proliferaatio määritettiin [3H]TdR:n liittymisenä solui-’ 35 hin, tulokset ilmaistaan stimulointi-indeksinä, joka määritet-• tiin, siten että sellaisten solujen antamat iskut minuutissa (CPM), jotka kasvoivat allergeenin läsnä ollessa, 4 115827 jaettiin sellaisten solujen antamalla CPM-arvolla, jotka kasvoivat väliaineessa, joka ei sisältänyt allergeenia, ja kukin allergeenipitoisuus tutkittiin kolmena rinnakkaisnäyt-teenä.

5

Kuvio 4 on graafinen esitys, joka koskee sellaisen T-solulin-jan jakaantumisvastetta synteettisille Loi p V -peptideille, joka on peräisin terveeltä, raiheinän siitepölylle allergiselta aikuiselta ja joka vaste on saatu mainittujen solujen 10 49.:nä viljelypäivänä, tulokset esitetään keskimääräisinä iskuina minuutissa (CPM), jotka on laskettu rinnakkaisviljel-mille, ja solujen taustavaste oli 4894 CPM, kun viljely suoritettiin ilman allergeeniä. Peptidin pitoisuus oli 10 μg/ml.

15 Kuvio 5 on graafinen esitys, joka kuvaa T-solukloonin A12 jakaantumisvastetta synteettisiä Loi p V -peptidejä kohtaan, tulokset ilmaistaan rinnakkaisviljelmien antamina, keskimääräisinä iskuina minuutissa (CPM), solujen taustavaste oli 358 CPM, kun allergeeni puuttui viljelyalustasta, ja Y-akseli 20 esitetään logaritmisella asteikolla. Peptidin pitoisuus alustassa oli 10 /ig/ml.

’· "· Kuvio 6 on graafinen esitys, joka kuvaa toisen sellaisen T-*...· solulinjan jakaantumisvastetta synteettisiä Loi p V -peptidein/ jä kohtaan, joka on peräisin terveeltä, raiheinän siitepölyl-le allergiselta aikuiselta, tulokset ilmaistaan keskimääräi-• sinä iskuina minuutissa (CPM), solujen taustavaste oli 2500 iskua minuutissa (CPM), kun allergeeni puuttui, ja peptidin konsentraatio oli 0,1 μg/ml.

30

Kuvio 7 esittää immunologista dot blot -määritystä, joka on . . tehty 34 päällekkäin menevälle peptidille, jotka on saatu Loi p V:stä (klooni 12 R) ja kiinnitetty nitroselluloosa-'·* suodattimeen (NC-suodattimeen) sekä seulottu yksittäisillä 35·.’ seerumeilla, jotka sitovat humaani IgE:tä, mAbs FMC-A7:llä 5 115827 ja kaniinin polyklonaalisella anti-Lol p V -vasta-ainella. C tarkoittaa raiheinän siitepölyuutetta (1 μ9^Μρ1Μ), jota käytettiin positiivisena kontrollina.

5 Kuvio 8 esittää Loi p V:n B-soluepitooppien identifiointia, joka perustui immunologisiin dot-määrityksiin, jotka kohdistuivat sellaisiin peräkkäisiin synteettisiin peptideihin, jotka menevät päällekkäin ja ovat peräisin kloonista 12R. Kuvio 8a esittää IgE:n sitoutumista 16 positiivisesta seeru-10 mistä, jotka on saatu kaikkiaan 50 potilaalta, jotka ovat allergisia raiheinän siitepölylle (Rast>4); ja kuvio 8b esittää monoklonaalisen tai polyklonaalisen vasta-aineen sitoutumista, arvot ovat dot biotin intensiteetin, joka on mitattu Pharmacia LKB UltraScan XL:llä (Ruotsi), mielivaltaisia den-15 sitomeriyksiköitä. Sellaisia densitometrin arvoja, jotka olivat kaksi tai sitä suurempia (>2), pidettiin positiivisena sitoutumisena taustaan verrattuina, Seerumin ja vasta-aineen arvot kullekin peptidille on laskettu yhteen (piste/peptidi) ja jaettu positiivisten seerumeiden lukumäärällä tai vasta-20 aineella, jotta lopullinen arvo voitiin ilmaista keskiarvona (piste/seerumit tai vasta-aine), seerumeita Cl ja C2 käytettiin negatiivisina kontrolleina (C viittaa raiheinän raakaan '· '· siitepölyuutteeseen (1 μg/täplä) , joka on positiivisena kont-rollina) .

25.'

Kuvio 9 esittää peptidi-inhibitio-dot blot -analyysiä, jossa ; : : käytettiin peptidiä 34 (sekvenssin identifiointinumero 36); : : peptidit 6 (sekvenssin identifiointinumero 8), 24 (sekvenssin identifiointinumero 26) ja 31 (sekvenssin identifiointinumero 30 33) olivat negatiivisina kontrolleina; FPLCrllä puhdistettua

Loi p V:tä, joka merkittiin "IX^llä, ja raiheinän raakaa . . siitepölyuutetta, joka merkittiin "C":ksi, käytettiin posi-tiivisina kontrolleina.

35'. Kuvio 10 on graafinen esitys inhibitio-ELISAsta, jossa käy-tettiin peptidiä 34 (sekvenssin identifiointinumero 36); peptidit 6 (sekvenssin identifiointinumero 8), 24 (sekvenssin 6 115827 identifiointinuxnero 26) sekä 31 (sekvenssin identifioin-tinumero 33) olivat negatiivisina kontrolleina, ja positiivisena kontrollina käytettiin raiheinän raakaa siitepölyuu-tetta.

5

Esillä oleva keksintö saa aikaan eristettyjä peptideitä, jotka ovat peräisin Loi p V:stä. Tässä yhteydessä käytettynä peptidi tai proteiinin fragmentti tarkoittaa aminohapposekvenssiä, jossa aminohappotähteitä on vähemmän kuin proteiinin 10 täydellisessä aminohapposekvenssissä. Termeillä "eristetty" ja "puhdistettu" tässä yhteydessä käytettynä tarkoitetaan keksinnön peptidejä, joissa olennaisesti ei ole soluperäistä ainesta tai viljelyn väliainetta, kun ne on valmistettu yh-distelmä-DNA-tekniikoilla, tai niissä ei ole olennaisesti 15 kemiallisia prekursoreita tai muita kemikaaleja, kun ne on syntetisoitu kemiallisesti. Tässä yhteydessä käytettynä termi keksinnön "peptidi" sisältää sellaisia peptidejä, jotka ovat peräisin Loi p V:stä, joka sisältää allergeenin ainakin yhden T-soluepitoopin, tai termi sisältää osan sellaisesta pepti-20 distä, joka sisältää ainakin yhden T-soluepitoopin, ja (tai) peptidejä, jotka ovat peräisin Loi p V:stä, joka sitoo IgErtä . . ja joka sisältää ainakin yhden B-soluepitoopin.

*··· Keksinnön piiriin kuuluvat myös peptidit, jotka sisältävät 25. ainakin kaksi aluetta, joista kumpikin alue sisältää Loi p V:n ainakin yhden T-soluepitoopin. Sellaiset eristetyt pepti-; dit tai eristettyjen peptidien alueet, joista kukin sisältää ; Loi p V -protediniallergeenin ainakin kaksi T-soluepitooppia, ovat erityisen haluttuja lisääntyneen terapeuttisen tehonsa 30 vuoksi. Keksinnön piiriin kuuluvat myös peptidit, jotka ovat esillä olevan keksinnön peptideille immunologisesti läheisiä (esimerkiksi sen perusteella, että ne reagoivat ristiin vasta-aineen tai T-solun kanssa). Sellaiset peptidit, jotka ovat immunologisesti läheisiä sen perusteella, että ne reagoivat 35 ristiin vasta-aineen kanssa, sitoutuvat vasta-aineisiin, jotka ovat spesifisiä Loi p V:n peptidille. Sellaiset peptidit, jotka ovat immunologisesti läheisiä sen perusteella, 7 115827 että ne reagoivat ristiin T-solun kanssa, pystyvät reagoimaan samojen T-solujen kanssa kuin keksinnön mukainen peptidi.

Keksinnön mukaisia eristettyjä peptidejä voidaan valmistaa 5 yhdistelmä-DNA-tekniikoilla isäntäsolussa, joka on transformoitu nukleiinihapolla, jolla on tällaista peptidiä kooditta-va sekvenssi. Keksinnön mukaiset eristetyt peptidit voidaan valmistaa myös kemiallisella synteesillä. Kun peptidi valmistetaan yhdistelmätekniikoilla, sellaisia isäntäsoluja, jotka 10 on transformoitu nukleiinihapolla, jolla on keksinnön mukaista peptidiä koodittava sekvenssi, viljellään isäntäsoluille sopivassa viljelyalustassa ja peptidit voidaan puhdistaa solujen viljelyalustasta, isäntäsoluista tai molemmista, siten että peptidien ja proteiinien puhdistamiseen käytetään 15 tekniikoita, jotka ovat tekniikan tason mukaisia, mukaan luettuina ioninvaihtokromatografia, geelisuodatuskromatogra-fia, ultrasuodatus, elektroforeesi tai immunologinen puhdistus vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä peptidille, prote-iiniallergeenille, josta peptidi on peräisin, tai sen osalle.

20

Esillä oleva keksintö aikaansaa ekspressiovektoreita ja sellaisia isäntäsoluja, jotka on transformoitu ilmentämään kek-*♦ ’ sinnön nukleiinihapposekvenssejä. Keksinnön mukaista Loi p ·... v -peptidiä koodittava nukleiinihappo tai ainakin sen yksi fragmentti voidaan ilmentää bakteerisoluissa, kuten esimer- » * * kiksi E. colissa. hyöteissoluissa, hiivassa tai nisäkässo-: luissa, kuten esimerkiksi kiinalaisen hamsterin munasarjan soluissa (CHO). Sopivia ilmentymisvektoreita, promoottoreita, voimistajia ja muita ilmentymisen säätelyelementtejä voi 30 löytyä julkaisusta Sambrook et ai. Molecular Cloning: A Labo-. ratory Manual, toinen painos, Cold Spring Harbor Laboratory . . Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Alan ammattimies tuntee muita sopivia ilmentymisvektoreita, promoottoreita, ·’ . voimistajia ja muita ilmentymisen elementtejä. Ilmentymiseen 35*. hiivassa soveltuvat ilmentymisvektorit, joihin kuuluvat Yep-Secl (Baldari et ai. (1987) Embo J. 6, 229-234); pMFa (Kurjan ja Herskowitz (1982) Cell 30, 933-943) ; JRY88 (Schultz et ai.

8 115827 (1987) Gene 54, 113-123) ja pYES2 (Invitrogen Corporation,

San Diego, CA). Nämä vektorit ovat vapaasti saatavissa. Baku-lovirus- ja nisäkäsperäisiä ilmentymisjärjestelmiä on myös saatavissa. Esimerkiksi bakulovirusjärjestelmä on kaupalli- 5 sesti saatavissa (PharMingen, San Diego, CA) hyönteissoluissa ilmentämistä varten, kun taas pMSG-vektori on kaupallisesti saatavissa (Pharmacia, Piscataway, NJ) nisäkässoluissa ilmentämistä varten.

10 Sellaisiin sopiviin ilmentymisvektoreihin, joilla voidaan ilmentää E. colissa. kuuluvat muun muassa pTRC (Amann et ai.

(1988) Gene 69, 301-315); pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia); pMAL (N.E. Biolabs, Beverly, MA); pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ); pET-lld (Novagen, Madison, WI) Jameel et ai.

15 (1990) J. Virol. 64, 3963-3966; sekä pSEM (Knapp et ai. (19- 90) BioTechniques 8, 280-281). Esimerkiksi pTRC:n ja pET-lld:n käyttö johtaa fuusioitumattoman proteiinin ilmentymiseen. pMAL:n, pRIT5:n, pSEM:n ja pGEX:n käyttö johtaa sellaisen allergeenin ilmentymiseen, joka on sulautunut yhteen 20 maltoosi E:tä sitovan proteiinin (pMAL), proteiini A:n (pRIT-5:n), typistetyn B-galaktosidaasin (PSEM) tai glutationi S-. transferaasin (pGEX) kanssa. Kun keksinnön mukaista Loi p V - i * peptidiä ilmennetään fuusioproteiinina, erityisen edullista ’··· on saada aikaan entsyymillä pilkottava kohta yhteensulautta- • a 25. misliitokseen, joka on kantajaproteiinin ja Loi p V -peptidin » a * välillä. Loi p V -peptidi voidaan löytää sitten fuusioprote- a a ;(· iinista, siten että käytetään tavanomaisia proteiinien ja :V peptidien puhdistustekniikoita. Sopiviin entsymaattisesti pilkottaviin kohtiin kuuluvat verenhyytymistekijällä Xa sekä 30 trombiinilla pilkottavat kohdat, joita varten sopivia entsyy-meitä ja pilkkomisohjeita on saatavilla kaupallisesti, esi-; merkiksi Sigma Chemical Companyltä, St. Louis, MO sekä N.E. Biolabsilta, Beverly, MA. Erilaisilla vektoreilla on myös erilaisia promoottorialueita, jotka mahdollistavat konstitu-3.5’· tiivisen tai indusoituvan ilmentymisen, esimerkiksi IPTG-in-duktion (PRTC, Amann et ai. (1988) supra; pET-lld, Novagen, Madison, WI) tai lämpötilainduktion (pRIT5, Pharmacia, Pisca- 9 115827 taway, NJ). Voi olla myös sopivaa ilmentää yhdistelmä-Lol p V -peptidejä erilaisissa E. coli-isännissä. joilla sellaisten proteiinien hajotuskyky, jotka ovat yhdistelmä-DNA-tekniikal-la ilmennettyjä, on vähentynyt (esimerkiksi US-patentti 4 758 5 512). Vaihtoehtoisesti voi olla edullista muuttaa nukle- iinihapposekvenssiä, niin että siellä missä tällainen nukleiinihapon muutos ei vaikuta ilmennetyn proteiinin aminohapposekvenssiin, käytetään sellaisia kodoneita, joita E.coli ensisijaisesti käyttää hyväksi.

10

Isäntäsoluja voidaan transformoida ilmentämään keksinnön nukleiiinihapposekvenssejä, siten että käytetään tavanomaisia tekniikoita, kuten esimerkiksi kalsiumfosfaatti- tai kalsium-kloridiyhteissaostusta, DEAE-dekstraanivälitteistä transfek-15 tiota tai elektroporaatiota. Sopivia isäntäsolujen transfor-mointimenetelmiä löytyy julkaisusta Sambrook et ai., katso yllä, ja muista laboratoriokäsikirjoista. Keksinnön mukaisia nukleiinihapposekvenssejä voidaan syntetisoida myös kemiallisesti standarditekniikoita käyttämällä (esimerkiksi syntee-20 sillä kiinteässä jakeessa). Loi p V:tä koodittavan kloonin 12R (kuvataan Loi p Ib.l:nä) eristämisen ja kloonauksen yksityiskohdat esitetään PCT-patenttihakemusjulkaisunumerossa WO · ;· 93/04174.

:,R5 Esillä oleva keksintö antaa käyttöön myös nukleiinihapposekvenssejä, jotka koodittavat keksinnön mukaisia peptidejä.

: :: Sellaiset nukleiinihapposekvenssit, joita käytetään missä tahansa tämän keksinnön sovellutusmuodossa, voivat olla cDNArita, jotka koodittavat vastaavia peptidisekvenssejä, 30 kuten esitetään kuviossa 7, tai vaihtoehtoisesti ne voivat olla mikä tahansa oligodesoksinukleotidisekvenssi, jolla on , . kokonaisuudessaan sekvenssi, joka on esitetty tässä yh-teydessä, tai ne voivat olla tällaisen sekvenssin kanssa samanarvoisia sekvenssejä. Näitä oligodesoksinukleotidisek-:35: venssejä voidaan valmistaa kemiallisesti tai mekaanisesti tunnettuja tekniikoita käyttämällä. Oligonukleotidisekvens-sille toiminnallisesti samanarvoinen on 1) sekvenssi, joka 10 115827 pystyy hybridisoitumaan komplementaariseen oligonukleotidiin, johon Loi p V:n sekvenssi (tai vastaavat sekvenssin osat), joka esitetään kuviossa 1 (sekvenssin identifiointinumero 1) tai sen fragmentit hybridisoituvat, tai 2) (vastaavat sek-5 venssin osat, jotka ovat komplementaarisia nukleiinihapposek-vensseille, jotka koodittavat peptidisekvenssiä, joka on peräisin Loi p V:stä, kuten esitetään taulukossa 1 ja kuviossa 2 (sekvenssin identifiointinumero 1 ja/tai kuvio 3) sekvenssi, joka koodittaa tuotetta (esimerkiksi polypeptidiä tai 10 peptidiä), jolla on samanlaiset toiminnalliset ominaisuudet kuin tuotteella, jota koodittaa Loi p V:n sekvenssi (tai vastaava sekvenssin osa), joka esitetään kuviossa 1 (sekvenssin identifiointinumero 1). Täytyykö toiminnallisen samanarvoisuuden täyttää kriteereistä toinen tai molemmat, perustuu 15 käyttöön (esimerkiksi, jos nukleotidiä on käytettävä vain oligokoettimena, sen tarvitsee täyttää vain ensimmäinen tai toinen kriteeri, jos sitä on käytettävä keksinnön mukaisen Loi p V -peptidin valmistamiseen, sen tarvitsee täyttää vain kolmas kriteeri).

20

Esillä oleva keksintö aikaansaa keksinnön mukaisten Loi p V -peptidien tai niiden osan valmistusmenetelmän, jossa on vai-' heet, joiden mukaan sopivassa viljelyalustassa viljellään isäntää, joka on transformoitu nukleiinihapposekvenssillä, '•'2 5 joka koodittaa keksinnön mukaista Loi p V -peptidiä, jotta : tuotetaan solujen ja viljelyalustan seos, joka sisältää mai- | nittua Loi p V -peptidiä; ja seos puhdistetaan, niin että tuotetaan olennaisesti puhdasta Loi p V -peptidiä. Sellaisia isäntäsoluja, jotka on transformoitu ilmentymisvektorilla, 30 joka sisältää DNA:ta, joka koodittaa keksinnön Loi p V -peptidiä tai sen osaa, viljellään isäntäsoluille sopivassa viljelyalustassa. Keksinnön Loi p V -peptidit voidaan puhdistaa soluviljelmän alustasta, isäntäsoluista tai molemmista, siten että käytetään proteiinien ja peptidien tunnettuja puhdistus-;35: tekniikoita, kuten esimerkiksi ioninvaihtokromatografiaa, ··. geelisuodatuskromatografiaa, ultrasuodatusta, elektroforeesia ; ja immunologista puhdistusta, jossa käytetään vasta-aineita, 11 115827 jotka ovat spesifisiä keksinnön Loi p V -peptideille tai niiden osille.

Esillä olevan keksinnön toinen näkökohta liittyy vasta-ainee-5 seen, joka reagoi spesifisesti Loi p V -peptidin kanssa.

Tällaisia vasta-aineita voidaan käyttää, kun standardoidaan allergeeniuutteita tai eristetään Loi p V, joka esiintyy luonnossa. Keksinnön Loi p V -peptidejä voidaan käyttää myös "puhdistettuina" allergeeneinä allergeeniuutteiden standar-10 dointiin. Esimerkiksi eläin, kuten hiiri tai kaniini, voidaan immunisoida keksinnön mukaisen eristetyn Loi p V -peptidin immunogeenisellä muodolla, joka pystyy aikaansaamaan vasta-ainevasteen. Sellaisiin tekniikoihin, joilla peptidi tehdään immunogeeniseksi, sisältyvät konjugointi kantaja-aineisiin 15 sekä muut tekniikantasoiset menettelytavat. Loi p V -peptidi voidaan antaa adjuvantin kanssa. Immunisoinnin kulkua voidaan tarkkailla, siten että määritetään vasta-ainetiitterit plasmassa tai seerumissa. Vasta-aineiden tasot voidaan määrittää standardi ELISAlla tai muulla immunologisella pitoisuusmääri-20 tysmenetelmällä, jossa immunogeeni on antigeeninä.

: Immunisoinnin jälkeen voidaan saada anti-Lol p V -peptidian- tiseerumi ja jos halutaan, polyklonaaliset anti-Lol p V '··; -peptidivasta-aineet voidaan uuttaa seerumista. Monoklonaa-•35' listen vasta-aineiden tuottoa varten immunisoidusta eläimestä ·...' voidaan korjata talteen vasta-aineita tuottavat solut (lym-: fosyytit) ja sulauttaa ne somaattisten solujen normaaleilla ·' sulauttamismenetelmillä sellaisiin soluihin, jotka tekevät ne kuolemattomiksi, kuten esimerkiksi myeloomasoluihin, jotta 30 tuotetaan hybridoomasoluja. Hybridoomasolut voidaan seuloa

•immunokemiallisesti sen selvittämiseksi, tuottavatko ne sel-: ,·. laisia vasta-aineita, jotka reagoivat keksinnön Loi p V

-peptidien kanssa. Näin valmistettuja seerumeita tai mono-. klonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää allergeeniuutteiden ;3&. standardointiin.

12 115827 Käyttämällä esillä olevan keksinnön peptidejä ja vasta-aineita voidaan tehdä valmisteita, joiden koostumus ja biologinen aktiivisuus ovat tasaisia ja tarkoin määriteltyjä, ja niitä voidaan antaa terapeuttisiin tarkoituksiin (esimerkiksi rai-5 heinän siitepölylle herkän henkilön allergisen vasteen muuntamiseksi mainitun heinän tai sille immunologisesti läheisten heinien siitepölyä kohtaan). Tällaisten peptidien anto voi muuntaa esimerkiksi B-solu- tai T-soluvastetta Loi p V -allergeenille, tai se voi muuntaa molempia vasteita. Eristet-10 tyjä peptidejä voidaan käyttää myös, kun tutkitaan raiheinän siitepölyallergian immunoterapian mekanismia ja kun konstruoidaan muunnettuja johdannaisia tai analogeja, jotka ovat immunoterapiassa käyttökelpoisia.

15 Esillä oleva keksintö koskee myös T-soluklooneja, jotka spesifisesti tunnistavat keksinnön Loi p V -peptidejä. Nämä T-solukloonit voivat soveltua geenin eristämiseen ja molekulaa-riseen kloonaukseen T-solureseptoria varten, joka spesifisesti reagoi keksinnön peptidin kanssa. T-soluklooneja voidaan 20 valmistaa, kuten kuvataan esimerkissä 2 tai julkaisussa Cellular Molecular Immunology, Abul K. Abbas et ai., W.B. Saun-. . ders Co. (1991) sivulla 139. Esillä oleva keksintö koskee !myös liukoisia T-solureseptoreita. Nämä reseptorit voivat inhiboida Loi p V:lle herkässä yksilössä asiaankuuluvan T-'•2-5 solun alapopulaation sellaista aktivoitumista, joka on antigeenin mukaista. Sellaisia vasta-aineita voidaan myös valmis-:.· · taa, jotka pystyvät reagoimaan tällaisen T-solureseptorin : : · kanssa. Näitä .vasta-aineita voidaan käyttää myös, kun estetään T-solu-MCH-vuorovaikutus yksilössä. Liukoisten T-solu-30 reseptoreiden valmistusmenetelmiä kuvataan julkaisussa Immunology; A Synthesis, toinen painos, Edward S. Golub et ai., : .· Sinaur Assoc, Sunderland Massachusetts, (1991) ss. 366-369.

Keksinnön mukaista peptidiä on myös mahdollista muuntaa täl-:35 laisia tarkoituksia varten, kuten esimerkiksi lisäämällä : liukoisuutta, voimistamalla terapeuttista tai ehkäisytehoa , *·> tai stabiiliutta (esimerkiksi varastointiaikaa ex vivo, ja 13 115827 vastustuskykyä proteolyyttistä hajoamista kohtaan in vivo). Voidaan valmistaa sellainen muunnettu peptidi, jossa aminohapposekvenssi on muutettu, kuten esimerkiksi aminohapposubs-tituuution, -deleetion tai -lisäyksen avulla, niin että im-5 munogeenisuutta muunnetaan ja (tai) vähennetään allergeeni-syyttä, tai johon peptidiin komponentti on lisätty samaa tarkoitusta varten.

Esimerkiksi peptidi voidaan muuntaa, siten että se säilyttää 10 kyvyn indusoida T-soluenergiaa ja sitoa MHC-proteiineja ilman kykyä indusoida voimakasta jakaantumisvastetta tai mahdollisesti mitä tahansa jakaantumisvastetta, kun se annetaan im-munogeenin muodossa. Tässä esimerkissä voidaan määrittää kriittiset ryhmät T-solureseptoriin sitoutumista varten, 15 siten että käytetään tunnettuja tekniikoita (esimerkiksi kukin tähde substituoidaan ja määritetään reaktiokyky T-solun kanssa tai sen puuttuminen). Näyttää siltä, että näitä tähteitä, jotka ovat välttämättömiä vuorovaikutukselle T-solu-reseptorin kanssa, voidaan muuntaa, siten että välttämätön 20 aminohappo korvataan toisella, mieluummin samankaltaisella aminohappotähteellä (säilyttävä substituutio), joka näyttää . . voimistavan, vähentävän, mutta ei poistavan T-solun reak- tiokykyä tai joka ei vaikuta ollenkaan mainittuun reaktioky-·... kyyn. Tämän lisäksi ne aminohappotähteet, jotka eivät ole ‘•25 välttämättömiä vuorovaikutukselle T-solureseptorin kanssa, voidaan muuntaa, siten että ne korvataan jollakin muulla :,· aminohappona, jonka sisällyttäminen voi tehostaa, vähentää : : T-solun reaktiokykyä tai ei vaikuta siihen ollenkaan mutta joka ei poista sitoutumista asiaankuuluvan MCH:n kanssa.

30 .Keksinnön peptidejä voidaan lisäksi muuntaa, siten että sel-. · lainen aminohappo, josta on osoitettu, että se on välttämätön vuorovaikutukselle MCH-proteiinikompleksin kanssa, korvataan toisella aminohapolla, mieluummin samankaltaisella aminohap-‘•35 potähteellä (säilyttävä substituutio) , joka näyttää tehosta- : van, vähentävän T-solun aktiivisuutta mutta joka ei poista sitä, tai joka ei vaikuta T-solun aktiivisuuteen. Tämän li- 14 115827 säksi aminohappotähteet, jotka eivät ole välttämättömiä vuorovaikutukselle MCH-proteiinikompleksin kanssa, mutta jotka vielä sitovat MCH-proteiinikompleksia, voidaan muuntaa, siten että ne korvataan toisella aminohapolla, jonka sisällyttämi-5 nen voi tehostaa T-solun reaktiokykyä, ei vaikuta siihen tai joka vähentää T-solun reaktiokykyä mutta ei poista sitä. Ei-välttämättömien aminohappojen edullisiin aminohapposubstituu-tioihin kuuluvat substituutiot alaniinilla, glutamiinihapolla tai metyyliaminohapolla, mutta edulliset substituutiot eivät 10 rajoitu näihin aminohappoihin.

Stabiiliuden ja (tai) reaktiokyvyn voimistamiseksi keksinnön peptidit voidaan muuntaa myös siten, että sisällytetään yksi tai useampi polymorfismi proteiiniallergeenin aminohapposek-15 venssiin, joka on peräisin luonnonmukaisesta alleelivariaa- tiosta. Lisäksi voidaan korvata tai lisätä D-aminohappoja, ei-luonnonmukaisia aminohappoja tai ei-aminohappoanalogeja, jotta aikaansaadaan muunnettu peptidi, joka kuuluu keksinnön piiriin. Tämän lisäksi esillä olevan keksinnön peptidejä 20 voidaan muuntaa, siten että käytetään Sehon ja hänen kolle-goittensa polyetyleeniglykolimenetelmää (PEG-menetelmää), ·_ (Wie et ai. katso yllä), jotta tuotetaan proteniini tai peptidi, joka on konjugoitu PEG:n kanssa. Sitäpaitsi PEG voidaan lisätä keksinnön proteiinin tai peptidin kemiallisen syntee-'•£•5 sin aikana. Peptidien tai niiden osien muuntamiseen voivat kuulua myös pelkistäminen ja alkylointi (Tarr julkaisussa Li Methods of Protein Microcharacterization, J.E. Silver, toi-^ · mittaja, Humana Press, Clifton, NJ, ss. 155-194 (1986); asy- lointi (Tarr, katso yllä); kemiallinen kytkentä sopivaan 30 kantajaan (Mishell ja Shiigi, toimittajat, Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman, San Francisco, CA (1980); : ,· US-patentti 4 939 239; tai mieto formaliinikäsittely (Marsh ‘1!. International Archives of Allergy and Applied Immunology, 41, . 199-215 (1971)).

:35.

: Keksinnön mukaisten peptidien puhdistamisen helpottamiseksi ,·· ja mahdollisesti niiden liukoisuuden lisäämiseksi peptidiket- 15 115827 juun on mahdollista liittää reportteriryhmiä. Esimerkiksi polyhistidiiniä voidaan lisätä peptidiin sen puhdistamiseksi affiniteettikromatografiän avulla, jossa käytetään immobi-lisoitua metalli-ionia (Hochuli, E. et ai., Bio/Technology, 5 6, 1321-1325 (1988). Sen lisäksi voidaan aikaansaa, jos halu taan, endoproteaasin spesifisiä pilkkomiskohtia reportteri-geenin ja peptidin aminohapposekvenssien väliin, jotta peptidien eristäminen helpottuu, niin että asiaankuulumattomat sekvenssit eivät seuraa mukana. Jotta yksilö onnistuneesti 10 saataisiin epäherkäksi proteiiniantigeenille, voi olla tarpeellista lisätä peptidin liukoisuutta, siten että peptidiin lisätään toiminnallisia ryhmiä tai peptideihin ei sisällytetä hydrofobisia T-soluepitooppeja tai alueita, jotka sisältävät hydrofobisia epitooppeja, tai proteiinin tai peptidin hydro-15 fobisia alueita. Voi olla myös välttämätöntä korvata hydrofobiset tähteet vähemmän hydrofobisilla tähteillä, tällaiset muutokset vaikuttavat MCH-kompleksiin tai T-solureseptoriin sitoutumiseen, kuten edellä kuvattiin.

20 Jotta mahdollisesti autetaan T-soluepitooppien sopivaa anti-geeniprosessointia peptidin sisällä sellaisten alueiden väliin, jotka kukin sisältävät ainakin yhden T-soluepitoopin, voidaan konstruoida kanonisia, proteaasille herkkiä kohtia yhdistelmägeenitekniikan avulla tai synteettisesti. Esimer-•.25 kiksi peptidiä konstruoitaessa voidaan viedä varattuja amino-happopareja, kuten esimerkiksi KK tai RR, alueiden väliin, · peptidin sisälle. Saatu peptidi voidaan tehdä herkäksi katep-:Y 'siinin ja (tai) muiden trypsiinin kaltaisten entsyymien aikaansaamalle pilkkomiselle, jotta tuotetaan sellaisia pepti-30 din osia, jotka sisältävät yhden tai useampia T-soluepitoop-. peja. Sen lisäksi tällaiset varatut aminohapot voivat lisätä . . peptidin liukoisuutta.

. Keksinnön peptidiä koodittavan DNA:n sellaista mutageneesiä, 35 joka kohdistuu tiettyyn paikkaan, voidaan käyttää peptidin rakenteen muuntamiseen, johon käytetään tekniikan tason mukaisia menetelmiä. Tällaisiin menetelmiin voi kuulua muun 16 115827 muassa PCR, jossa käytetään degeneroituja oligonukleotidejä (Ho e£ ai., Gene, 77, 51 - 59 (1989), tai mutatoitujen geenien kokonaissynteesi (Hostomsky, Z, et ai., Biochem. Biophys, Res. Comm., 161, 1056 - 1063 (1989). Edellä mainittuja mene-5 telmiä voidaan käyttää bakteeriperäisen ilmentymisen tehostamiseen, siten että mainitut menetelmät yhdistetään muiden menettelytapojen kanssa, jotta aitotumaisperäiset kodonit muunnetaan DNA-rakenteissa, jotka koodittavat keksinnön proteiinia tai peptideitä, sellaisiksi kodoneiksi, joita ensisi-10 jaisesti käytetään E. colissa. hiivassa, nisäkässoluissa tai muissa aitotumaisten eliöiden soluissa.

Esillä olevan keksinnön peptidejä ja vasta-aineita voidaan käyttää myös sellaisen siitepölyherkistymän ilmaisuun ja 15 diagnoosiin, jonka raiheinä aiheuttaa. Tämä voitaisiin tehdä esimerkiksi siten, että Loi p V:n eristettyhin peptideihin yhdistetään verta tai verinäytteitä, jotka on saatu yksilöltä, jonka herkkyys raiheinän siitepölylle on määritettävä, sellaisissa olosuhteissa, jotka soveltuvat veren komponent-20 tien (esimerkiksi vasta-aineiden, T-solujen, B-solujen) sitomiseen peptidi(e)n kanssa ja joissa voidaan määrittää laa-, . juus, jolla tällainen sitominen tapahtuu.

* i · '··· Kun esillä olevan keksinnön eristettyjä peptidejä annetaan '.25 hoito-ohjeiden mukaan yksilölle, joka on herkkä Loi p V:lle ·... tai joka on allerginen sellaiselle allergeenille, joka risti-j · reagoi ristiin Loi p V -peptidin kanssa, ne pystyvät muun- tamaan yksilön allergista vastetta raiheinän siitepölyaller-geenille Loi p V:lle tai mainitulle, ristiinreagoivalle yksi-30 lön allergeenille ja mieluummin ne pystyvät muuntamaan yksilön B-soluvastetta, T-soluvastetta tai sekä B-solu- että T-. . soluvastetta allergeenille. Raiheinän siitepölyallergeenille herkän yksilön allergisen vasteen muuntaminen voidaan tässä ·’ , yhteydessä määritellä allergeenivasteen puuttumisena tai 35. allergiaoireiden vähenemisenä, kun ne on määritetty kliini- sillä standardimenettelytavoilla (katso esimerkiksi Varney et ai., British Medical Journal, 302, 265-269 (1990), ja määri- 17 115827 telinään sisältyy sellaisten astmaoireiden väheneminen, jotka raiheinän siitepöly indusoi. Tässä yhteydessä tarkoitetaan, että oireiden väheneminen tarkoittaa yksilön allergisen vasteen kaikkea vähenemistä, sen jälkeen kun yksilön hoito kek-5 sinnön mukaisella peptidillä tai proteiinilla on päättynyt. Tämä väheneminen voi olla subjektiivista (se on, potilas tuntee olonsa mukavammaksi, vaikka allergeeni on läsnä). Oireiden väheneminen voidaan määrittää yhtä hyvin kliinisesti, siten että käytetään standardi ihotestejä, jotka ovat 10 tekniikan tason mukaisia.

Esillä olevan keksinnön sellaisia Loi p V -peptidejä, joilla on T-soluja stimuloivaa aktiivisuutta ja jotka käsittävät täten ainakin yhden T-soluepitoopin, halutaan erityisesti 15 terapeuttisiin tarkoituksiin. Niihin halutaan erityisesti esillä olevan keksinnön sellaisia Loi p V -peptidejä, jotka sitovat IgE:tä ja sisältävät ainakin yhden B-soluepitoopin.

Kun viitataan epitooppiin, tarkoitetaan peruselementtiä tai pienintä yksikköä, jonka reseptori, erityisesti immunoglobu- 20 liinit, histokompatibiliteettiantigeenit ja T-solureseptorit, tunnistaa, siellä missä epitooppi sisältää aminohappoja, jotka ovat välttämättömiä reseptorin tunnistamiselle. Voidaan käyttää myös aminohapposekvenssejä, jotka matkivat epitooppi- en aminohapposekvenssejä ja jotka pystyvät säätämään pienem- ‘35 mäksi tai vähentämään allergista vastetta Loi p V:lle. T-* « 1 soluepitooppien uskotaan kytkeytyvän immuunivasteen alkami- • · seen sellaista proteiiniallergeeniä kohtaan, joka on vastuus-- - sa allergian kliinisistä oireista, sekä tämän immuunivasteen ikuistamiseen. Ajatellaan, että nämä T-solut laukaisevat 30 varhain tapahtumat T-auttajasolun tasolla, siten että ne sitoutuvat sopivaan HLA-molekyyliin sellaisen solun pinnalla, : ,· jossa antigeeni on, ja stimuloivat asiaankuuluvaa T-solupopu-‘ij. laatiota. Nämä tapahtumat johtavat T-solun jakaantumiseen, . lymfokiinin erittymiseen, paikallisiin tulehdusreaktioihin, * 3.5· uusien immuunisolujen hankkimiseen tulehduskohtaan, B-solu-: kaskadin aktivoitumiseen, joka johtaa vasta-aineiden tuot- ,1··’ toon. Näiden vasta-aineiden yksi isotyyppi IgE on olennaises- * > ♦ 1 18 1 1 5827 ti tärkeä allergisten oireiden kehittymiselle, ja eritettyjen lymfokiinien laatu vaikuttaa sen tuottoon aikaisin tapahtuma-kaskadissa, T-auttajasolun tasolla.

5 Raiheinän siitepölyn allergeeneille allergisten potilaiden alttiiksipano esillä olevan keksinnön eristetyille Loi p V -peptideille, jotka käsittävät ainakin yhtä T-soluepitooppia ja ovat peräisin Loi p V -proteiiniallergeenistä, voivat lisätä sopivien T-solupopulaatioiden vastustuskykyä tai tehdä 10 ne tehottomiksi, niin että ne eivät reagoi proteiinialler- geenille eivätkä osallistu immuunivasteen stimulointiin tällaisessa altistuksessa. Sitäpaitsi kun annetaan esillä olevan keksinnön mukaista peptidiä tai sen osaa, joka sisältää ainakin yhden T-soluepitoopin, voidaan muuntaa lymfokiinin erit-15 tymisprofiilia verrattuna altistukseen luonnossa esiintyvälle Loi p V -allergeenille tai sen osalle (esimerkiksi siitä seuraa, että IL-4 pienenee ja/tai IL-2 lisääntyy). Tämän lisäksi altistus keksinnön mukaisille peptideille voi vaikuttaa T-solun alapopulaatioihin, jotka normaalisti osallistuvat 20 vasteeseen luonnossa esiintyvää allergeenia kohtaan, siten että nämä T-solut poistetaan siitä kohdasta (niistä kohdis-. ta), jotka normaalisti joutuvat alttiiksi allergeenille (esi- merkiksi nenän limakalvolta, ihosta ja keuhkoista) , sellai-*·<· seen kohtaan (sellaisiin kohtiin), joihin hoitona annetaan *2!5 fragmenttia tai proteiiniallergeeniä. Tämä T-solun alapopu-laatioiden uudelleenleviäminen tai pieneneminen voi parantaa . tai heikentää yksilöiden immuunijärjestelmän kykyä stimuloida :Y tavallista immuunivastetta sellaisessa kohdassa, joka normaa listi altistuu allergeenille, minkä seurauksena allergiset 30 oireet vähenevät. 1 > I I t t. Keksinnön eristettyjä Loi p V -peptidejä voidaan käyttää allergisten reaktioiden diagnosointi- ja käsittelymenetelmis-. sä sekä silloin, kun estetään allergisia reaktioita Loi p V -35> allergeenia tai ristiinreagoivaa proteiiniallergeeniä koh-: taan. Täten esillä oleva keksintö saa aikaan diagnostisia koostumuksia Loi p V -allergeenin tai ristiinreagoivan pro- 19 115827 teiiniallergeenin aiheuttaman allergian diagnoosiin. Tällaiset koostumukset voivat sisältää synteettisesti tai yhdistel-mätekniikalla valmistettuja peptidejä, jotka ovat peräisin Loi p V:ltä, sekä farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa tai 5 ohenninta. Tällaisia keksinnön mukaisia diagnostisia koostumuksia voidaan käyttää allergian diagnosointikokeissa, kuten esimerkiksi radioallergosorbenttikokeessa (RAST), paperi-immunosorbenttikokeessa (PRIST), entsyymiin kytketyssä im-munosorbenttimäärityksessä (ELISAssa), radioimmunologisessa 10 pitoisuusmäärityksessä (RIA), immunoradiometrisessä määrityksessä (IRMA), luminesenssiin perustuvassa immunologisessa pitoisuusmäärityksessä (LIA), histamiinin vapautumisen määrittämisessä ja IgE-immunobloteissa. Esillä oleva keksintö saa aikaan myös terapeuttisia koostumuksia, jotka sisältävät 15 eristettyjä Loi p V -peptidejä tai niiden osia, jotka on tuotettu sellaisessa isäntäsolussa, joka on transformoitu ilmentämään tällaista Loi p V -peptidiä tai sen osaa, sekä farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa tai ohenninta. Terapeuttisia koostumuksia voidaan antaa yksilölle, joka on teh-20 tävä epäherkäksi, siten että käytetään tunnettuja tekniikoita. Yksilölle vidaan antaa Loi p V -peptidejä tai niiden osia esimerkiksi sopivaan ohentimeen, kantajaan ja/tai laimenti- « · meen yhdistettyinä. Farmaseuttisesti hyväksyttäviin ohenti- '··; miin kuuluvat keittosuolaliuos sekä veteen valmistetut pus-• · *•26 kuriliuokset. Farmaseuttisesti hyväksyttäviin kantajiin kuu- luvat polyetyleeniglykoli (Wie et ai. (1981) Int. Arch. Al-lergy Appi. Immunol. 64, 84-99) sekä liposomit (Strejan et : : ai. (1984) J. Neuroimmunol. 7, 27). Siinä tarkoituksessa, että T-solut tehdään tehottomiksi, terapeuttisia koostumuksia 30 annetaan mieluummin ei-immunogeenisessä muodossa, esimerkiksi ne eivät sisällä mitään adjuvanttia. Keksinnön terapeuttisia . t. koostumuksia annetaan raiheinän siitepölylle herkille yksi-loille tai sellaisille yksilöille, jotka ovat herkkiä aller-. geenille, joka immunologisesti reagoi ristiin raiheinän sii- » 3,5* tepölyallergeenin kanssa.

t i 20 115827

Kun esillä olevan keksinnön terapeuttisia koostumuksia annetaan käsiteltävälle yksilölle, siedätyshoitoon voidaan käyttää tunnettuja antotapoja ja sellaisia ajanjaksoja, jotka ovat tehokkaita yksilön herkkyyden vähentämiseksi (se on, 5 allergisen vasteen vähentämiseksi) allergeenille. Terapeut tisten koostumusten tehokkaat määrät vaihtelevat sellaisten tekijöiden mukaan, kuten esimerkiksi yksilön raiheinäsiitepö-lyherkkyyden aste, ikä, sukupuoli ja yksilön paino sekä proteiinin tai sen fragmentin kyky saada yksilössä esiin vaste 10 antigeenille.

Aktiivista yhdistettä (esimerkiksi proteiinia tai sen fragmenttia) voidaan antaa tavanomaisella tavalla, kuten esimerkiksi ruiskeena (ihonalaisena, laskimonsisäisenä, jne.), 15 oraalisesti eli suun kautta, sisäänhengitettynä, antona ihon läpi tai peräsuoleen. Antotavan mukaan aktiivinen aine voidaan päällystää materiaalilla, joka suojaa sitä entsyymeiltä, hapoilta ja muilta luonnonmukaisilta olosuhteilta, jotka voivat inaktivoida yhdisteen.

20

Esimerkiksi injektiona voidaan antaa annosyksikköä kohti . mieluummin noin 1 /ig - 3 mg ja vielä mieluummin noin 2 0-500 « *

Mg aktiivista yhdistettä (se on, proteiinia tai sen fragment- < '*·· tia) . Annosohje voidaan säätä, siten että aikaansaadaan opti-• · '26 mi terapeuttinen vaste. Esimerkiksi voidaan antaa useita » * · jaettuja annoksia päivittäin, viikoittain, kuukausittain, t » ·,· neljännesvuosittain tai vuosittain, kuten tarvitaan, tai sitä ,* voidaan oikeassa suhteessa vähentää tai lisätä, niin kuin hoitotilanne vaatii.

30 . Peptidin antamiseksi muuten kuin parenteraalisena antona voi . t. olla tarpeellista päällystää proteiini materiaalilla, joka t » estää sen inaktivoitumisen, tai antaa proteiini tällaisen , materiaalin kanssa. Peptidi tai sen osa voidaan antaa esimer-35· kiksi entsyymi-inhibiittoreiden kanssa tai liposomeissa.

Entsyymi-inhibiittoreihin kuuluvat haiman trypsiini-inhibiit-_···’ tori, di-isopropyylifluorifosfaatti (DFP) sekä trasyloli.

21 115827

Liposomeihin kuuluvat vesi öljyssä -vedessä-CGF-emulsiot sekä tavanomaiset liposomit (Strejan et ai., (1984) J. Neuroim-munol. 7, 27).

5 Aktiivista yhdistettä voidaan antaa parenteraalisesti tai vatsaonteloon. Voidaan myös valmistaa dispersioita glyseroliin, nestemäisiin polyetyleeniglykoleihin ja sekä niiden seoksiin ja öljyihin. Tavanomaisissa varastointi- ja käyttö-olosuhteissa nämä valmisteet voivat sisältää säilöntäaineita 10 mikro-organismien kasvun estämiseksi.

Injektointiin soveltuvat farmaseuttiset koostumukset sisältävät steriilejä vesiliuoksia (siinä tapauksessa, että koostumukset ovat vesiliukoisia) tai dispersioita sekä steriileitä 15 jauheita dispersiosta muodostettavien steriilien, injektoitavien liuosten erittäin nopeaa valmistusta varten. Kaikissa tapauksissa koostumusten täytyy olla steriileitä ja niiden täytyy olla nestemäisiä siinä määrin, että ne voidaan helposti injektoida. Niiden täytyy kestää valmistus- ja käyttöolo-20 suhteissa, ja ne täytyy suojella mikro-organismikontaminaa-tiota, kuten esimerkiksi bakteeri- ja sienikontaminaatiota, : vastaan. Kantaja voi olla liuotin tai dispersion väliaine, joka sisältää esimerkiksi vettä, etanolia, polyolia (esimer-. ·'· kiksi glyseraalia, propyleeniglykolia ja nestemäistä polyety-.’2-5 leeniglykolia yms.), niiden sopivia seoksia ja kasviöljyjä.

; Sopivaa juoksevuutta voidaan ylläpitää esimerkiksi, siten että käytetään pinnoitinta, kuten esimerkiksi lesitiiniä pitämään yllä 'tarvittavaa partikelikokoa dispersion tapauksessa, sekä käyttämällä pinta-aktiivisia aineita. Mikro-or-30 ganismien toiminta estetään erilaisilla bakteerien- ja sienien vastaisilla aineilla, esimerkiksi parabeeneillä, klooribu-·.* · tanolilla·, fenolilla, askorbiinihapolla, tiomersaalilla yms..

: : Monissa tapauksissa on edullista sisällyttää koostumukseen isotonisia aineita, esimerkiksi sokereita, polyalkoholeja, .‘35 kuten esimerkiksi mannitolia ja sorbitolia, tai natriumklori-dia. Injektoitavien koostumusten pidennetty absorptio aikaan-saadaan, siten että koostumuksiin sisällytetään agenssi, joka 22 115827 viivyttää absorptiota, kuten esimerkiksi alumiinimonos-tearaatti ja gelatiini.

Steriilejä, injektoitavia liuoksia voidaan valmistaa, siten 5 että aktiivinen yhdiste (esim. proteiini tai peptidi) sisällytetään tarvittavaan määrään liuotinta yhden edellä mainitun ainesosan tai tarvittaessa niiden yhdistelmien kanssa, tämän jälkeen se steriloidaan. Dispersiot valmistetaan yleensä siten, että aktiivinen yhdiste sisällytetään steriiliin ve-10 hikkeliin, joka sisältää dispersion perusväliaineen ja muita tarvittavia ainesosia, jotka edellä on lueteltu. Kun kysymyksessä on steriili jauhe steriileitä, injektoitavia liuoksia varten, edullisessa valmistusmenetelmässä ne kuivataan tyhjössä tai ne jäädytyskuivataan, mikä tuottaa aktiivisen ai-15 nesosan (esimerkiksi proteiinin tai peptidin) jauheen ja muun lisäksi tulevan ainesosan sen aiemmasta, steriiliksi suodatetusta liuoksesta.

Kun keksinnön peptidi on sopivasti suojattu, kuten edellä 20 kuvataan, se voidaan antaa oraalisesti, esimerkiksi inertin ohentimen tai assimiloituvan, syötäväksi kelpaavan kantajan kanssa. Peptidi ja muut ainesosat voidaan sulkea myös kovaan tai pehmeään gelatiinikapseliin, puristaa tableteiksi tai . sisällyttää suoraan yksilöiden ruokavalioon. Oraalista, tera- .25 peuttista antoa varten aktiivinen yhdiste voidaan sisällyttää täyteaineisiin ja sitä voidaan käyttää nautittavien tablet-tien, poskitablettien, pillereiden, kapseleiden, eliksiirien, 'suspensioidensiirappien, suulakkojen yms. muodossa. Tällaisten koostumusten ja valmisteiden tulisi sisältää ainakin 30 yksi painoprosentti aktiivista yhdistettä. Koostumusten ja . valmisteiden prosenttimäärä voi tietenkin vaihdella, ja se ·.· · voi olla sopivasti noin 5-80 painoprosenttia. Aktiivisen yhdisteen määrä tällaisissa terapeuttisesti käytettävissä koostumuksissa on sellainen, että saadaan sopiva annostus.

.‘3.5 Edulliset koostumukset tai valmisteet valmistetaan esillä olevan keksinnön mukaan, siten että oraalinen annosyksikkö sisältää noin 10 μg - 200 mg aktiivista yhdistettä.

23 115827

Tabletit, pillerit, kapselit ja yms. voivat sisältää myös seuraavia ainesosia: sideainetta, kuten esimerkiksi gragant-tikumia, arabikumia, maissitärkkelystä tai gelatiinia; täyte-taineita, kuten esimerkiksi dikalsiumfosfaattia; hajostusai-5 neita, kuten esimerkiksi maissitärkkelystä, perunatärkkelystä, algiinihappoa yms.; liukuaineita, kuten esimerkiksi mag-nesiumstearaattia; ja makeutusaineita, kuten esimerkiksi sakkaroosia, laktoosia tai sakkariinia, tai mausteita, kuten esimerkiksi piparminttuöljyä, talvikkiöljyä ta kirsikkamaus-10 tetta. Kun annosyksikkömuoto on kapseli, se voi sisältää edellämainituntyyppisten materiaalien lisäksi nestemäistä kantajaa. Erilaisia muita materiaaleja voi olla päällysteinä tai muutoin annosyksikön fysikaalisen muodon muuntamiseksi. Esimerkiksi tabletit, pillerit tai kapselit voidaan päällys-15 tää sellakalla, sokerilla tai molemmilla. Siirappi tai eliksiiri voi sisältää aktiivista yhdistettä, sakkaroosia makeu-tusaineena, metyyli- ja propyyliparabeeneja säilöntäaineina, väriä ja mausteita, kuten esimerkiksi kirsikka- ja appel-siiniaromia. Tietenkin minkä tahansa materiaalin, jota käyte-20 tään annosyksikkömuodon valmistuksessa, tulisi olla farmaseuttisesti puhdas ja käytettyinä määrinä oleellisesti : myrkytön. Sitä paitsi aktiivinen aine voidaan sisällyttää valmisteisiin ja formulaatioihin, joista sen vapautuminen on . pitkittynyttä.

. . Tässä yhteydessä käytettynä "farmaseuttisesti hyväksyttävä '!!.* kantaja" sisältää mitkä tahansa ja kaikki liuottimet, dispersion väliaineet, päällysteet, bakteerien- ja sienienvastaiset aineet, isotoniset ja absorptiota viivyttävät aineet yms..

30 Tällaisten väliaineiden ja agenssien käyttö farmaseuttisesti aktiivisiin aineisiin on tekniikan tason mukaan hyvin tunnet-·,· tua. Paitsi sikäli kuin jokin tavanomainen väliaine tai : : agensssi on aktiivisen yhdisteen kanssa yhteensopimaton, sen : käyttö terappeuttisissa koostumuksissa on mahdollista. Koos- ,‘3,5 tumuksiin voidaan myös sisällyttää täydentäviä aktiivisia yh-disteitä.

1 1 5827 24

On erityisen edullista formuloida parenteraaliset koostumukset annosyksikön muotoon annon helpottamiseksi ja annostuksen tasaisuuden saavuttamiksi. Annosyksikkömuoto tässä yhteydessä käytettynä tarkoittaa fysikaalisesti erillisiä yksiköitä, 5 joita jakamattomina annoksina sovelletaan hoidettaviin nisäkkäisiin; kukin yksikkö sisältää ennalta määrätyn määrän aktiivista yhdistettä, jonka määrä on laskettu niin, että se tuottaa toivotun terapeuttisen vaikutuksen, kun se on yhdistetty haluttuun farmaseuttiseen kantajaan. Keksinnön mukai-10 sten uusien annosyksikkömuotojen spesifikaatioita määräävät (a) aktiivisen yhdisteen ainutlaatuiset ominaisuudet ja tietty terapeuttinen vaikutus, joka on saavutettava, sekä (b) sellaiset rajoitukset, jotka yhdisteen tekniikan tason mukaan ovat luonteenomaisia, kun tällainen aktivinen yhdiste yhdis-15 tetään yksilöiden herkkyyden hoitoon, ja nämä spesifikaatiot ovat mainittujen tekijöiden mukaisia.

Kaksinnön mukaisia, erilaisia eristettyjä peptidejä, jotka ovat peräisin raiheinän siitepölyproteiinista Loi p V, esite-20 tään kuviossa 2 sekä taulukossa 1. Sellaiset peptidit, jotka sisältävät ainakin kaksi aluetta, joista kukin alue sisältää ainakin yhden Loi p V:n T-soluepitoopin, ovat myös keksinnön piirissä. Tässä yhteydessä käytettynä alue voi sisältää kek-. sinnön peptidin sekvenssin sellaisena, kuin se esitetään ,·2·5 kuviossa 2, tai mainitun peptidin osan aminohapposekvenssin.

Y,' Jotta voidaan saada esillä olevan keksinnön eristettyjä pep-tideitä, Loi p V jaetaan halutunmittaisiin peptideihin, jotka eivät mene päällekkäin, tai halutunmittaisiin, päällekkäin 30 meneviin peptideihin, jotka voidaan tuottaa yhdistelmä-DNA-tekniikalla tai synteettisesti, kuten esimerkissä 1 esite-: : : tään. Sellaiset peptidit, jotka sisältävät ainakin yhden B- soluepitoopin, pystyvät sitomaan IgE:tä. Sellaiset peptidit, .Y jotka sisältävät ainakin yhden T-soluepitoopin, pystyvät ;3,5 houkuttelemaan esiin T-soluvasteen, kuten esimerkiksi T-solun jakaantumisen tai lymfokiinin erittymisen sekä (tai) pystyvät Ϋ* indusoimaan T-soluenergiaa (se on, niiden vastustuskyvyn li- 25 115827 saamisen). Sellaisten peptidien määrittämiseksi, jotka sisältävät ainakin yhtä T-soluepitooppia, eristetyt peptidit tutkitaan esimerkiksi T-solulle soveltuvilla biologisilla tekniikoilla sen tutkimiseksi, houkuttelevatko peptidit esiin T-5 soluvasteen tai inkusoivatko ne T-solujenergiaa. Sellaisilla peptideillä, joiden havaittiin houkuttelevan esiin T-soluvas-teen tai indusoivan T-solujen energiaa, määritetään olevan T-soluja stimuloivaa aktiivisuutta.

Kuten esitetään esimerkissä 2, humaani T-soluja stimuloiva 10 aktiivisuus voidaan tutkia, siten että viljellään sellaisia T-soluja, jotka on saatu Loi p V -allergeenille herkältä yksilöltä (se on, sellaiselta yksilöltä, jolla on IgE-välit-teinen immuunivaste Loi p V -allergeenille sellaisen peptidin kanssa, joka on peräisin allergeenista, ja määrittämällä, 15 jakaantuvatko T-solut vasteena peptidille, kuten mitattiin esimerkiksi solujen ottamana, tritioituna tymidiininä. Stimulointi-indeksit T-solujen peptidivasteille voidaan laskea maksimi CPM:nä (iskuina minuutissa), joka saadaan peptidivas-teella, jaettuna kontrollin CPM:llä. Sellaista stimulointi-20 indeksiä (S.I.), joka on yhtä suuri tai suurempi kuin kaksi kertaa tausta, pidetään "positiivisena". Positiivisia tulok-siä käytetään stimulointi-indeksin laskemiseen kullekin pep-tidille ja kullekin tutkitulle potilaalle. Tämän keksinnön . edulliset peptidit sisältävät ainakin yhden T-soluepitoopin, ,35 ja niiden T-solustimulaatio-indeksi on 2,0 tai sitä suurempi. Sellaista peptidiä, jonka T-solustimulaatioindeksi on yhtä suuri kuin 2,0 tai sitä suurempi raiheinän siitepölylle herkällä potilaalla, pidetään käyttökelpoisena, terapeuttisena aineena. Edullisten peptidien stimulointi-indeksi on ainakin 30 2,2, edullisemmin ainakin 2,5, vielä edullisemmin ainakin .3,0, vielä edullisemmin ainakin 3,4. Esimerkiksi keksinnön : : ‘ sellaisiin peptideihin, joiden T-soluindeksi on ainakin 2,5, ; * kuten kuvioissa 4, 5 tai 6 esitetään, kuuluvat peptidit 14 1 (sekvenssin identifiointinumero 16), 25 (sekvenssin identifies ointinumero 27), 19 (sekvenssin identifiointinumero 21), 22 (sekvenssin identif iointinumero 24) ja 34 (sekvenssin identi-; "· fiointinumero 36).

26 115827

Kun täsmälliset T-soluepitoopit määritetään esimerkiksi tarkoilla kartoitustekniikoilla, muunnetaan peptidiä, jolla on T-solua stimuloivaa aktiivisuutta ja jossa täten on ainakin yksi T-soluepitooppi T-solua koskevilla biologisilla teknii-5 koilla määritettynä, siten että peptidin joko amino- tai karboksipäähän lisätään tai siitä poistetaan aminohappotähteitä, jotta voidaan määrittää T-solun reaktiokyky muunnettua peptidiä kohtaan. Peptidit valitaan tätä tekniikkaa noudattamalla ja niitä tuotetaan joko yhdistelmä-DNA-tekniikalla tai 10 synteettisesti. Edulliset terapeuttiset peptidit valitaan erilaisten tekijöiden perusteella, joihin kuuluvat T-soluvas-te peptidiä kohtaan (esimerkiksi stimulointi-indeksi), T-soluvasteen esiintymistaajuus peptidiä kohtaan sellaisten yksilöiden populaatiossa, jotka ovat herkkiä raiheinän siite-15 pölylle, sekä peptidin mahdollinen ristireaktiokyky sellaisten muiden allergeenien kanssa, jotka ovat peräisin muista heinälajeista, joita aiemmin on kuvattu. Tutkitaan valittujen peptidien fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet (esimerkiksi liukoisuus, stabiilius) sen määrittämiseksi, soveltu-20 vatko peptidit terapeuttisissa koostumuksissa käytettäviksi vai onko peptidejä muunnettava tässä yhteydessä kuvatulla tavalla. Määritetään valittujen peptidien tai valittujen, • t muunnettujen peptidien kyky stimuloida humaani T-soluja (esi- • · · . .· merkiksi indusoida jakaantumista, lymfokiinien erittymistä). ,*•25 . Tämän lisäksi edulliset, keksinnön mukaiset terapeuttiset peptidit, jotka sisältävät T-soluepitoopin, eivät sido im-·* munoglobuliini-E:tä (IgE:tä), tai ne sitovat sitä oleellises ti vähemmän kuin proteiiniallergeeni, josta peptidi johde-30 taan. Standardi immunoterapian pääkomplikaatiot ovat IgE- välitteiset vasteet, kuten esimerkiksi anafylaksia. Immuno-. : globuliini-E on niiden anafylaktisten reaktioiden välittäjä, : jotka ovat tuloksena antigeenin sitoutumisesta tai ristiin- ’ sitoutumisesta IgE:hen syöttösolujen tai basofiilien pinnalla !?.5 sekä välittäjäaineiden (esimerkiksi histamiinin, serotonii-;·, nin, eosinoliiliperäisten kemotaktisten tekijöiden) vapautu- :>(> misesta. Täten oleellisella prosentilla populaation yksilöi- * * I » 27 115827 tä, jotka ovat herkkiä Loi p V:lle, ahafylaksia voitaisiin välttää, siten että immunoterapiassa käytetään sellaista peptidiä tai sellaisia peptideitä, jotka eivät sido IgE:tä oleellisella prosenttimäärällä (esimerkiksi ainakaan noin 75 5 prosentilla) sellaisten yksilöiden populaatiosta, jotka ovat herkkiä Loi p V -allergeenille, tai jos peptidi sitoo IgE:tä, sellainen sitominen ei aiheuta välittäjäaineiden vapautumista syöttösoluista tai basofiileistä. Anafylaksiariskiä voitaisiin vähentää, siten että immunoterapiassa käytettäisiin 10 peptidiä tai peptidejä,, joiden sitoutuminen IgE:hen on vähentynyt. Terapeuttisen tehon vuoksi halutaan ennen kaikkea sellaisia peptideitä, joilla IgE:tä stimuloiva aktiivisuus on mahdollisimman vähäistä. Tällainen minimaalinen IgE:tä stimuloiva aktiivisuus tarkoittaa sellaista IgE:n tuottoa, joka on 15 vähäisempää kuin natiivin Loi p V -peptidin simuloima IgE:n ja (tai) IL-4:n tuotto.

Sellainen T-soluepitooppi, joka sisältää keksinnön mukaista peptidiä, kun sitä terapeuttisessa hoito-ohjelmassa annetaan 20 raiheinän siitepölylle herkälle yksilölle, pystyy muuntamaan yksilön allergista vastetta allergeenille. Esityisesti sel-r\ laiset keksinnön mukaiset Loi p V -peptidit, jotka sisältävät ainakin yhtä Loi p V -peptidin T-soluepitooppia tai ainakin , ,* kahta aluetta, jotka ovat ovat peräisin Loi p V:stä, joista .26 kumpikin sisältää ainakin yhtä T-soluepitooppia, kun näitä t peptideitä annetaan raiheinän siitepölylle herkälle yksilöl-"Y le, ne pystyvät muuntamaan yksilön T-soluvastetta aller-’·’ geenille.

30 Keksinnön mukainen, eristetty terapeuttinen Loi p V -peptidi käsittää ainakin yhden Loi p V:n T-soluepitoopin, ja sen mu-; kaisesti peptidi sisältää ainakin noin seitsemän aminohappo- tähdettä. Terapeuttisen tehon vuoksi keksinnön edulliset , ’ terapeuttiset koostumukset mieluummin sisältävät ainakin t * I » 35 kahta Loi p V:n T-soluepitooppia, ja sen mukaisesti peptidi '·;· sisältää ainakin noin kahdeksan aminohappo- ja mieluummin : ainakin viisitoista aminohappotähdettä. Tämän lisäksi sellai- 28 1 1 5827 set terapeuttiset koostumukset, jotka sisältävät edullisia, eristettyjä keksinnön mukaisia peptidejä, sisältävät mieluummin riittävän prosenttimäärän koko proteiiniallergeenin T-soluepitooppia, niin että koostumuksen anto siitepölylle 5 allergiselle yksilölle terapeuttisen hoito-ohjelman mukaan tuottaa yksilössä T-soluja, joilla on proteiiniallergeenin vastustuskykyä. Sellaiset keksinnön mukaiset synteettiset peptidit, joka sisältävät aina noin 45 aminohappotähdettä peptidin pituussuunnassa ja mieluummin aina noin 30 aminohap-10 potähteeseen saakka, ovat erityisen haluttuja, koska pituuden lisäykset voivat tuottaa vaikeuksia peptidisynteesissä. Keksinnön mukaisia peptidejä voidaan tuottaa myös yhdeistelmä-DNA-tekniikalla, kuten edellä kuvataan, ja on edullista, että 45 aminohapon mittaiset tai sitä pitemmät peptidit valmiste-15 taan yhdestelmä-DNA-tekniikalla.

Sellaisilla peptideillä, jotka ovat peräisin Loi p V -prote-iiniallergeenistä ja joita voidaan käyttää terapeuttisiin tarkoituksiin, sisältävät ainakin yhden Loi p V:n T-soluepi-20 toopin, ja ne sisältävät kaikki seuraavien peptidien aminohapposekvenssit tai niiden osan: 6 (sekvenssin identifioin-tinumero 8), 7 (sekvenssin identifiointinumero 9), 12 (sek-: venssin identifiointinumero 14), 14 (sekvenssin identifioin- .···, tinumero 16), 16 (sekvenssin identif iointinumero 18), 19 ‘25 (sekvenssin identifiointinumero 21), 22 (sekvenssin identifioi; ointinumero 24), 25 (sekvenssin identifiointinumero 27), 28 (sekvenssin identif iointinumero 30), 33 (sekvenssin identifi-: ointinumero 35) sekä 34 (sekvenssin identifiointinumero 36) *.·: (kuten esitetään kuviossa 2), mieluummin sellaisella pepti- 30 dillä, joka sisältää seuraavien peptidien aminohapposekvenssit: 6 (sekvenssin identifiointinumero 8), 7 (sekvenssin identifiointinumero 9), 12 (sekvenssin identifiointinumero : ·'. 14), 14 (sekvenssin identif iointinumero 16), 16 (sekvenssin identif iointinumero 18), 19 (sekvenssin identif iointinumero 35 21), 22 (sekvenssin identifiointinumero 24), 25 (sekvenssin '· identifiointinumero 27), 28 (sekvenssin identifiointinumero ... 30), 33 (sekvensin identif iointinumero 35) ja 34 (sekvenssin 29 115827 identifiointinumero 36) (kuten esitetään kuviossa 2), keskimääräinen T-solun stimulaatioindeksi on yhtä suuri tai suurempi kuin sellaisen peptidin mainittu indeksi, josta se on johdettu, kuten esitetään kuvioissa 4, 5 tai 6. Vieläpä vielä 5 mieluummin sellaiset peptidit, jotka ovat peräisin Loi p V -proteiiniallergeenistä, jota voidaan käyttää terapeuttisiin tarkoituksiin, sisältää seuraavien peptidien aminohapposekvenssit kokonaan tai niiden osan: 14 (sekvenssin identifiointinumero 16), 19 (sekvenssin identifiointinumero21), 22 (sek-10 venssin identifiointinumero 24), 25 (sekvenssin identifiointinumero 27) sekä 34 (sekvenssin identifiointinumero 36), kuten esitetään kuviossa 2.

Esillä olevan keksinnön eräässä näkökohdassa aikaansaadaan 15 koostumus, joka sisältää ainakin kaksi peptidiä (esimerkiksi ainakin kahden peptidin fysikaalisen seoksen), joista kumpikin sisältää Loi p V:n ainakin yhden T-soluepitoopin. Sellaisia koostumuksia voidaan antaa terapeuttisen koostumuksen muodossa farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai ohenti-20 men kanssa. Tämän lisäksi yhden tai useamman sellaisen terapeuttisen koostumuksen tehokkaita määriä, jotka sisältävät ainakin yhtä peptidiä, jolla on T-soluepitooppi, voidaan : antaa yksilölle, joka on herkkä raiheinän siitepölylle.

25 Loi p V -peptidien edullisiin koostumuksiin ja edullisiin yh-;;; distelmiin (jotka sisältävät sellaisia peptideitä, joilla on /; kuviossa 2 esitetyt aminohapposekvenssit) ja joita voidaan : : : antaa samanaikaisesti tai peräkkäin, kuuluvat seuraavat yh- ,' · distelmät: 30 14 (sekvenssin identifiointinumero 16) ja 22 (sekvenssin . identifiointinumero 24); 14 (sekvenssin identifiointinumero 16) ja 25 (sekvenssin I ;’· identifiointinumero 27); 19 (sekvenssin identifiointinumero 21) ja 22 (sekvenssin 35 identifiointinumero 24); 19 (sekvenssin identifiointinumero 21), 25 (sekvensin identifiointinumero 27) 30 115827 14 (sekvenssin identifiointinumero 16), 22 (sekvenssin identif iointinumero 24 ja 25 (sekvenssin identifiointinumero 27); 19 (sekvenssin identifiointinumero 21), 22 (sekvenssin identif iointinumero 24) ja 25 (sekvenssin identifiointinumero 5 27) , 14 (sekvenssin identifiointinumero 16), 22 (sekvenssin identif ioitinumero 24), 25 (sekvenssin identifiointinumero 27) ja 34 (sekvenssin identifiointinumero 36); 19 (sekvenssin identifiointinumero 21), 22 (sekvenssin iden-10 tifiointinumero 24), 25 (sekvenssin identifiointinumero 27) sekä 34 (sekvenssin identifiointinumero 36); 14 (sekvenssin identifiointinumero 16), 19 (sekvenssin identif iointinumero 21), 22 (sekvenssin identifiointinumero 24) sekä 25 (sekvenssin identifioininumero 27); 15 14 (sekvenssin identifiointinumero 16), 19 (sekvenssin iden tif iointinumero 21), 22 (sekvenssin identifiointinumero 24), 25 (sekvenssin identifiointinumero 27) sekä 34 (sekvenssin identifiointinumero 36); 6 (sekvenssin identifiointinumero 8), 7 (sekvenssin identifi-20 ointinumero 9), 9 (sekvenssin identifiointinumero il), 12 (sekvenssin identifiointinumero 14), 14 (sekvenssin identifi-ointinumero 16), 16 (sekvenssin identifiointinumero 18), 19 (sekvenssin identifiointinumero 21), 22 (sekvenssin identifi-.···. ointinumero 24), 25 (sekvenssin identif iointinumero 27), 33 ‘25 (sekvenssin identifiointinumeo 35) ja 34 (sekvenssin identi-f iointinumero 36); ··; 6 (sekvenssin identifiointinumero 8), 9 (sekvenssin identifi- : ointinumero 11), 16 (sekvenssin identif iointinumero 18), 19 '.· ‘ (sekvenssin identifiointinumero 21), 22 (sekvenssin identifi- 30 ointinumero 24) ja 34 (sekvenssin identifiointinumero 36); ja . 6 (sekvenssin identifiointinumero 8), 9 (sekvenssin identifi-ointinumero li), 14 (sekvenssin identifiointinumero 16), 16 ; ;'· (sekvenssin identif iointinumero 18) , 19 (sekvenssin identif i- ointinumero 21), 22 (sekvenssin identifiointinumero 24), 25 35 (sekvenssin identifiointinumero 27) sekä 34 (sekvenssin iden-'· '· tifiointinumero 36) .

31 115827

Esillä olevaa keksintöä valaisevat liääksi seuraavat kuviot sekä esimerkit, jotka eivät rajoita keksintöä.

Esimerkit 5

Esimerkki 1 Loi p V -peptidit

Loi p V:n (sekvenssin identifiointinumero 2) aminohapposekvenssi pääteltiin kloonin 12R, jolla on ATCC-numero , cDNA-10 :sta, kuten esitetään kuviossa 1. Loi p V:tä (kuvattu Loi p Ib.lehtenä) koodittavan kloonin 12R kloonaus ja sekvensointi kuvataan PCT-hakemuksen julkaisunumerossa WO 93/04174. Kolmekymmentä sellaista kiinteän faasin peptidiä, joissa oli 12 aminohappotähdettä, ja neljä 13 aminohappotähdettä sisältävää 15 kiinteän faasin peptidiä syntetisoitiin BT7400:lla manuaalisessa peptidisynteesierässä (Biotech Instruments Ltd, UK). Nämä peptidit vastasivat koko Loi p V -sekvenssiä, jossa neljä (tai viisi) aminohappoa oli päällekkäin. Peptidit syntetisoitiin aminohappohartseilla, jotka oli suojattu C-ter-20 minaalisesti Fmocellä (25 mmoolia, Auspep, Australia). Hartsit pestiin ja valutettiin kuiviksi peräkkäin 3x1 ml:11a dimetyyliformamidia (DMF: Auspep, Australia) ja sitten niitä : käsiteltiin 1 ml:11a liuosta, joka poisti suojauksen (DP, 25- .···. prosenttinen piperidiini, paino/tilavuus, DMF:ssä; Auspep, 2-5 Australia) kymmenen minuutin ajan, jotta Fmoc-ryhmä poistui !!! ensimmäisestä C-terminaalisesta aminohaposta. Sitten kammiot /*; pestiin ja kuivattiin peräkkäin 3x1 ml:11a DMF:a, 2x1 : ml:lla dikloorimetaania (DCM; Auspep, Australia) ja lopuksi 2 ‘ xl ml :11a DMF: a. Kymmenkertaiset ylimäärät valittuja amino-30 happoja yhdistettiin sitten aktivoivan reagenssin kanssa .(B0P:H0BYT 1:1, Auspep, Australia), liuotettiin 1 ml:aan aktivointiliuosta (Auspep, Australia) ja lisättiin sopiviin • kammioihin kytkentää varten. Menettely toistettiin, kunnes saatiin haluttu peptidin pituus.

35; ’· ’ Sitten peptideitä käsiteltiin pilkkomisliuoksella (90 tilavuusprosenttia trifluorietikkahappoa, 4 tilavuusprosenttia 32 115β27 fenolia, 1 tilavuusprosentti etaaniditiolia; Auspep, Australia) kuuden tunnin ajan, jotta helpotettiin peptidin pilkkomista kammioista. Sitten kootut peptidit saostettiin 50 ml:-ssa kylmää dietyylieetteriä (DEE: Auspep, Australia) ja sit-5 ten ne eristettiin Whatmanin suodatinpaperilla nro 1 (Whatman, UK). Nämä suodatinpaperit pestiin 50 ml:11a lyofilisoin-tiliuosta (Auspep, Australia) ja ne jäädytyskuivattiin. Aus-pep-laboratoriot (Auspep Laboratories) analysoivat peptidit HPLC:llä ja massaspektrometrillä sekvenssin ja peptidin puh-10 tauden tarkistamiseksi.

33 1 1 5 8 2 7

Taulukko 1

Pep- Peptidi- Pep- Pep- IgE Hydrofobisuus 5 tidi sekvenssi tidi tidi nro N-pääte/ Mp* pi C-pääte (D) 1 ADAGYTPAAAAT__1194 5.0 Hydrofobinen 2 AAATPATPAATPA 1111 6.1__Hydrofobinen 3 AATPAAAGGKAT__987 10.¾ Hydrofobinen 4 GKATTDEQKLLE__1333 8.4__Hydrof iilinen 5 KLLEDVNAGFKA__1305 8.0 + ( 3 . G ; Hydrof iilinen 5 GEKAAVAAAANA__1062 10.5 +(2.0' Hydrofobinen 7 AANAPPADKFK:__1243 10.2 +(5.0) Hydrof iilinen 8 KFKIFEAAFSES 1405 7.3_ [Hydrofobinen 9 FSESSKGLLATS__1227 8.0 _Hydrof iilinen 10 LATSAAKAPGLI__1113 10.5 +(7.0) Hydrof niinen 11 PGLIPKLNTAYD__1303 5.2__2__Hydrof iilinen 12 TAYDVAYKAAEG__1259 5.3 _j Hydrofobinen 13 AAEGATPEAKYD__1223 4.5 +(4.0) Hydrof iilinen 14 AKYDAFVTALTE__1329 4.2 Hydrofobinen 15 ALTEGLRV: AGA 1171 8.2 Hydrofobinen 15 I AG AL EV H A VK P A 1277 8.C .(4.0 Hydrofobinen -,7 i. vk PATE EV P AA__HS3 4.4 _Hydrof iilinen 18 V P AAKI P TG E L QI__1338 8.0 + (5.0 Hydrof iilinen ; 19 GELQI VPK IDAA__1272 4.4 .(11.0 Hydrof iilinen ; . _20 IDA_-.FKI.-_-.TAA 1163 7.0 - Hydrofobinen : V ' 21 ATAANAAPTNDK 114 5 7.0 -(12.0 Hydrofobinen 1-,- TND”-"--SAF 1407 4.2 -(2.0· jHydrofobinen ' --x 1 “— ---!---' ^ w -j-1 23 ESAFNKALNECT 1327 4.4 . (IC.C jHydrofiilinen j 2 4 NECTGGAYETYK 13 3 6 6.1 - i 2 . S ; Hydrofobinen • ·' 25 ETYKFIPSLEAA 1370 4.4 Hydrofobinen , ’: · 2- t τη lyvQivi it 1235 7.1 - j Hydrof iilinen 2“ YAATVAAPEVKY 1283 7.1 .:/,0- [Hydrofobinen '3 EVEYivTE-_-.LT 1342 4·4 - | Hydrofobinen 20 1 AA.LT?'_-.IT.AMTQA 1292 |l0.4 l-TT | Hydrofobinen j 34 1 1 5827 3 C AHTQAQKAGKPA__1202 10. S - i 4 . ~ ' Hydrof iilinen 31 GKPAAAAATAAA 971 10. Ξ - Hydrofobinen 3 2 ΤΛΑΑΤΥΑΤΑΑΑΤ__1020 6.1 __Hydrofobinen 3 3 AAATAAAGAATA__918__8.1__Hydrofobinen 34 GAATAAAGGYKA 1009 |l0.3 1+(12.0) [Hydrofobinen 115827 35

Peptidin immunologiset dot blot -pitoisuusmääritykset Peptidit liuotettiin veteen, jotta saatiin 1,6-millimolaari-nen varastoliuos. Liukenemattomat peptidit liuotettiin ääni-käsittelyllä (Branson Sofifer 450, USA), joka oli yhden mi-5 nuutin mittainen.

Peptidit kiinnitettiin nitroselluloosasuodattimeen (NC-suo-dattimeen), siten että käytettiin muunnettua menetelmää, joka on muualla julkaistu (Sithigonglu (1991), J. Immunol. Met-10 hods, 141, 23-32). Kaksi μΐ peptidin varastoliuoksia pantiin täplinä NC-suodattimelle (Schleicher & Schuell, Länsi-Saksa) noin yhden cm:n etäisyydelleen toisistaan. Sen jälkeen kun paperikaistaleet oli kuivattu ja niitä oli käsitelty 80 °Cr-ssa yhden tunnin ajan, ne fikseerattiin, siten että ne ase-15 tettiin yhden tunnin ajaksi alttiiksi haihtuvalle, 0,2-prosenttiselle glutaarialdehydille, joka oli PBSrssä ja tiiviisti suljetuissa muovirasioissa, huoneenlämpötilassa (18 °Crss-a). Perusteellisen pesun jälkeen, johon käytettiin tislattua vettä, NC-suodattimet peitettiin Blottolla (10-prosenttinen 20 rasvaton kuivamaito PBSrssä) kahden tunnin ajaksi ja ne pestiin IX Tween-PBS:llä (0,1 prosenttia Tween-20:ntä PBSrssä) sekä kaksi kertaa PBSrllä, viiden minuutin ajan kullakin ,·. pesukerralla. Sitten peptidit seulottiin humaani IgE- ja t « !..* hiiren/kaniinin IgG-epitooppien suhteen yksittäisillä seeru-’2!5 meillä (laimennettu lr4 PBSrssä 0,5-prosenttisella BSArlla), ;;; MAbs FMC A7rllä (Smart et ai. (1983), Int. Arch. Allergy ]··; Clin. Immunol. 72, 243) ja kaniinin polyklonaalisella anti-Loi p V -vasta-aineella (Loi p Ib) .

« · 30 Viidestäkymmenestä raiheinän siitepölylle allergisesta henkilöstä kahdellakymmenelläkolmella oli IgErtä, joka sitoutui ainakin yhteen peptidiin. Vaikka pääosalla henkilöitä ilmeni : vähän tai kohtuullisesti reaktiokykyistä IgErtä, oli useita, ,;· joilla reaktio oli voimakas. Dot blot -analyysi IgE-sitoutu-3*5* misen suhteen esitetään kuviossa 7.

t » * » » tili 36 115827

Kunkin dot blot-analyysin intensiteetti mitattiin densitomet-rillä (Pharmacia LKB Ultra Scan XL, Sweden). Arvot annetaan mielivaltaisina densitometrin yksiköinä ja ne esitetään kuviossa 8. Kahta suurempia densitometrin arvoja pidettiin 5 positiivisena sitoutumisena taustaan verrattuna. Kullekin peptidille on laskettu yhteen seerumin ja vasta-aineen antamat arvot (piste/peptidi) ja tulos on kaettu positiivisten seerumeiden lukumäärällä, niin että lopullinen arvo ilmaistaan keskiarvona (piste/seerumit). Seerumit Cl ja C2 eivät 10 olleet heinälle allergisen seerumeita, ja niitä käytettiin negatiivisina kontrolleina. C tarkoittaa raakaa raiheinän siitepölyuutetta (1 /xg/täplä) , joka on positiivisena kontrollina (katso esimerkki 3).

15 Seerumeilla 1, 14, 36, 42 ja 48 ilmeni huomattavaa affiniteettia spesifisten peptidien valikoimaa kohtaan (esimerkiksi peptideitä 19 (sekvenssin identifiointinumero 21), 34 (sekvenssin identifiointinumero 36) sekä 7 (sekvenssin identifi-ointinumero 9) kohtaan), jotka luokiteltiin Loi p V:n immu-20 nodominanteiksi, lineaarisiksi, allergeenisiksi B-soluepi-toopeiksi (kuviot 7 ja 8).

,·. Sellaisilla peptideillä, joiden numerot olivat 7 (sekvenssin • · identif iointinumero 9), 16 (sekvenssin identif iointinumero '25 18), 19 (sekvenssin identifiointinumero 21), 21 (sekvenssin

» I

;;; identifiointinumero 23), 23 (sekvenssin identifiointinumero 25), 30 (sekvensin identifiointinumero 32) sekä 34 (sekvens- I · •',1 Sin identif iointinumero 36) , ilmeni suurin reaktiokyky humaa- f > ni IgE:n kanssa, ja täten ne luokiteltiin Loi p V:n tärkeik-30 si, lineaarisiksi, allergeenisiksi B-soluepitoopeiksi. MAb FMC-A7 ja kaniinin polyklonaalinen anti-Lol p Ib -antiseerumi analysoitiin peptideihin sitoutuvan IgG:n suhteen. Nämä tu-: lokset esitetään kuviossa 7. MAbs ja kaniinin antiseerumi , näyttivät vähän sitoutuvan peptideihin. Peptidinumeroilla 1 3·5· (sekvenssin identif iointinumero 3), 7 (sekvenssin identifi-‘ ointinumero 9), 19 (sekvenssin identifiointinumero 21), 23 (sekvenssin identifiointinumero 25), 24 (sekvenssin identifi- < * i > » 37 115827 ointinumero 26) sekä 28 (sekvenssin identifiointinumero 30) ilmeni suurin reaktiokyky hiiren/kaniinin IgG:n kanssa.

Esimerkki 2 5 1. Materiaalit ja menetelmät

Raa'at rai- ja Bermuda-heinän siitepölyuutteet Raiheinän (Lolium perenne) ja Bermuda-heinän (Cvnodon dactv-10 lon) siitepölyjä saatiin Greer Laboratoriesilta (USA) kuivina uutteina, joista rasvaa ei oltu poistettu. Siitepölyaller-geenit uutettiin 0,001-molaarisella NH4HC03:lla (10-prosent-tinen, paino/tilavuus), ne sentrifugoitiin ja supernatantteja dialysoitiin fosfaatilla puskuroidussa keittosuolaliuoksessa 15 (PBS) yön ajan. Sitten supernatanttien annettiin läpäistä 0,20 Mm:n suodatin ja proteiinipitoisuus määritettiin BioRad Microassayllä (BioRad, USA) valmistajan ohjeiden mukaan.

Loi p V

20 Loi p V puhdistettiin raaoista raiheinän siitepölyuutteista nestefaasinestekromatografiällä (FPLC). Lyhyesti sanottuna, . . raa'an siitepölyuutteen PBS-puskuri vaihdettiin 20-mmolaari-seen Trisiin, pH 12, (puskuri A), Econo-Pac 10DG -pylväässä '··' (Bio-Rad, USA) . Tänä uute, 5 mg, ruiskutettiin ioninvaihto- :2:5 FPLC-pylvääseen (Mono Q HR 5/5; Pharmacia Sweden) , sitä tasa- painotettiin etukäteen peräkkäin puskurilla A viiden minuutin : : ; ajan, sitten puskurilla B (20-mmolaarinen Tris, pH 7,0) kym-: Ynenen minuutin ajan ja sekä lopuksi puskurilla A vielä viiden minuutin ajan. Pylvästä pestiin puskurilla A kymmenen minuu-30 tin ajan, mikä salli Loi p V:n sitoutuvan sekä muiden pro-. teiinien eluoituvan pl-arvoissa, jotka olivat 12 tai siitä . . suurempia·. Loi p V eluoitiin puskurilla B vakionopeudella, joka oli 1 ml/minuutti, viidentoista minuutin ajan huoneen-*·’ , lämpötilassa. Koottiin jakeet, joiden suuruus oli 1 ml, ja : '35 sitten ne analysoitiin SDS-PAGElla ja immunoblottausteknii- kalla. Sellaiset jakeet, jotka sisälsivät Loi p V:tä, koottiin yhteen ja niiden proteiinipitoisuus määritettiin.

38 115827

Loi p V -peptidit

Valmistettiin samanlaisia Loi p V -peptidejä, kuin kuvattiin esimerkissä 1. Peptidiä 13 (sekvenssin identifiointinumero 15) valmistettiin vain pieninä määrinä eikä niitä voitu tut-5 kia tässä kokeessa.

Allergeenille reaktiokykyisten T-solulinjojen ja -kloonien tuottaminen

Perifeerisen veren mononukleaarisia eli yksitumaisia soluja 10 (PBMC), jotka olivat peräisin sellaiselta terveeltä aikuisilta, joilla ihotesti raiheinän siitepölylle oli positiivinen, eristettiin heparinisoiduista verinäytteistä, siten että verinäytteet sentrifugoitiin Ficoll-Paque-tiheysgradientissa (Pharmacia, Sweden). Aluksi 1 x 106/ml PBMC:tä stimuloitiin 5 15 Aig:lla/ml Loi p V:tä 96-kammioisissa, U-pohjaisissa mikro-tiitterilevyissä (Linbro, USA). Kaikkia soluja viljeltiin RPMl-1640-kudosviljelmäväliaineessa (ICN, Australia), jota oli täydennetty 0,125 prosentilla (paino/tilavuus) gentomy-siiniä (Delta West, Australia) sekä 5 prosentilla (tilav./ti-20 lav.) lämmöllä inaktivoitua humaani A+ -seerumia. Viljelyt tapahtuivat 37 °C:ssa, 5-prosenttisessa (tilav./tilav.) C02-kehässä.

·...· Seitsemän päivän kuluttua viljelyn aloittamisesta kammioihin :.:.2’5 lisättiin kymmenen yksikköä/ml yhdistelmä-DNA-tekniikalla : : valmistettua ihmisen IL-2:hta (rIL-2; Cetus, USA). T-solulin- • jaa levitettiin 14. päivänä, siten että solut siirrettiin 24- kammioiselle kudosviljelmälevylle (Costar, USA) ja lisättiin 5 x 105/ml säteilytettyä, autologista eli koeyksilön kudospe-30 räisiä PBMC:itä, 2,5 μg/ml Loi p V:tä, 10-20 yksikköä/ml Lym-phocultia (Biotest, Germany) sekä 0,1 Mg/ml PHA:ta (Wellcome, , . UK). Solulinjaa stimuloitiin uudelleen joka 8.-10. päivä, kuten kuvattiin.

:\35 Sitten solut kloonattiin solulinjan rajalaimennuksella. Tätä varten T-solut siirrostettiin, siten että 96-kammioisissa, U-;,· pohjaisissa mikrotiitterilevyissä kammiota kohti tuli 300, 39 115827 30, 3, 1 ja 0,3 solua yhdessä lxl06:n kanssa säteilytettyä PBMC:tä/ml, 2,5 Mg Loi p V:tä/ml, 20 yksikköä rIL-2:hta/ml, 10 yksikköä Lymphocultia /ml sekä 0,1 iiq PHA:ta/ml. Klooneja ylläpidettiin rIL-2:n avulla joka neljäs päivä, ja säteily-5 tettyjä, autologisia PBMC:itä, Loi p V:tä, rIL-2:hta sekä Lymphocultia lisättiin joka 8.-10. päivä.

Ennenkuin solulinjoja ja -klooneja käytettiin lisääntymismää-rityksissä, niitä testattiin uudelleen 7-8 päivän ajan, sen 10 jälkeen kun syöttösolujen, allergeenin ja IL-2:n viimeinen lisäys oli tehty.

Lisääntymismääritykset 5 x 105 T-solua/ml viljeltiin säteilytettyjen, autologisten 15 PBMC:iden kanssa, joita oli 5 x 105/ml, sekä Loi p V:n (0,019-2,5 Mg/ml tai 0,625-20 /xg/ml) tai Loi p V -peptidien (1 ja 10 Mg/ml) kanssa 96-kammioisilla, U-pohjaisilla mikro-tiitterillevyillä 88 tunnin ajan, sitten niihin lisättiin tritioitua metyylitymidiiniä ([H]TdR; Amersham, USA) 1 μΟί 20 kammiota kohti kahdeksan tunnin ajaksi, ennen kuin ne koottiin lasikuitusuodattimille. Kontrolliviljelmät sisälsivät . . soluja ilman allergeenia, soluja ilman PHA:ta, T-soluja yksi-nään sekä säteilytettyjä PBMC-soluja yksinään. Määritettiin ’··' kunkin suodattimen antamat iskut minuutissa, siten että käy-‘•25 tettiin nestetuikelaskijaa (LKB Wallace, Suomi).

:,· · Immunofenotyypitys :Y: T-solut värjättiin suoraan tai epäsuorasti immunofluore- soivalla aineella, siten että käytettiin monoklonaalisia 30 vasta-aineita, jotka olivat seuraavat: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CDllb, CD16, CD19, CD25, CD45RO, CD45RA, MCH luokka II ; · TcRaB TcRri, kevyt k-kevyt ja kevyt lambda-ketju. Epäsuoraa ’!!. immuno-fluoresenssia varten käytettiin FITCrhen konjugoitua, hiiren Ig F(ab)2:hta kohtaan lampaalla muodostettua vasta- •,'35 ainetta (Silenius, Australia). Sitten solut analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä (Becton-Dickinson, USA) .

40 1 1 5 8 2 7 2. Tulokset T-solulinjan reaktiokyky allergeeniä kohtaan T-solulinja tutkittiin 34. viljelypäivänä reaktiokyvyn suh-5 teen rai- ja Bermuda-heinän siitepölyn allergeenejä kohtaan. Pitoisuuksien vaihtelun rajoissa jakaantumisvaste oli voimakas indusoivalle allergeenille Loi p V, ja vaste raa'alle raiheinän siitepölyuutteelle oli vähäisempi (kuvio 3). Bermuda-heinän raa'alle siitepölyuutteelle ei ollut mitään vastet-10 ta.

T-solulinjan ja -kloonien reaktiokyky synteettisiä Loi p V -peptidejä kohtaan T-solulinja tutkittiin ensin reaktiokyvyn suhteen synteetti-15 siä Loi p V -peptidejä kohtaan 14. päivänä mutta mitään vastetta ei havaittu. Kuitenkin 27. päivänä havaittiin voimakas vaste peptidiä 14 kohtaan (sekvenssin identifiointinumero 16). Voimakas reaktiokyky peptidiä 14 (sekvenssin identifi-ointinumero 16) kohtaan säilyi 49. päivään saakka, mutta 20 lisäksi oli heikompi vaste peptidille 25 (sekvenssin identi- fiointinumero 27) (kuvio 4) yhdenmukaisesti T-solulinjan polyklonaalisen luonteen kanssa. Peptidien 14 (sekvenssin identif iointinumero 16) ja 24 (sekvenssin identif iointinumero 27) aminohapposekvenssit esitetään taulukossa 2.

: :25 T-solukloonit tuotettiin T-solulinjasta 17. päivänä. Kahdek-: .·. sasta T-solukloonista saatiin yksi klooni, joka merkittiin ,·,* A12:ksi ja jolla ilmeni voimakas vaste vain peptidiä 14 (sek venssin identifiointinumero 16) kohtaan (kuvio 5). Kloonin 30 A12 vasteen stimulointi-indeksi peptidille 14 (sekvenssi identifiointinumero 16) oli 137, verrattuna 4,8:aan, joka saatiin T-solulinjalle 49. päivänä, ja se korreloi peptidille ’ 14 spesifisten T-solujen kanssa.

.’.3*5 T-solulinjan fenotyypin analyysi ... T-solulinjan fenotyyppi analysoitiin 47. päivänä virtaussyto- metrillä, siten että käytettiin monoklonaalisten vasta-ainei- 41 115827 den sarjaa solun pintamarkkereita vastaan. Linja ilmensi CD2:hta, CD3:a, CD5:ttä, CD4:ää, CD25:ttä, CD45RO:ta, MHC:n luokkaa II sekä TcTa6:aa, mikä oli yhdenmukaista aktivoitujen, kypsien T-auttajasolujen fenotyypin kanssa.

5

Taulukko 2 T-soluja kohtaan reaktiokykyisten Loi p V -peptidien aminohapposekvenssit

Peptidi Aminohapposekvenssi

10 14 (sekvenssin identifioin- AKYDAFVTALTE

tinumero 16) 25 (sekvenssin identifioin- ETYKFIPSLEAA tinumero 27) 15

Esimerkki 3 1. Materiaalit ja menetelmät

Samasta potilaasta, kuin kuvattiin esimerkissä 2, valmistet-20 tiin toinen T-solulinja esimerkissä 2 esitetyn menettelytavan mukaan. Jakaantumismäärityksiin käytettiin esimerkin 2 mukai-sesti synteettisiä Loi p V -peptideitä, joita kuvataan esi- . merkissä 1.

•”25 2. Tulokset t t t .T-solulinja tutkittiin reaktiokykynsä suhteen synteettisiä ' Loi p V -peptidejä kohtaan. Tulokset esitetään kuviossa 6.

Jakaantuminen ilmaistaan tuloksina, joista jakaantumisen tausta-arvo on vähennetty. Jakaantumisen tausta-arvo (jakaan-30 tuminen yksinomaan viljelyalustaan) oli 2500 iskua minuutis-Y ' sa. Stimulointi-indeksit laskettiin tuloksista, jotka on saatu siten, että kuviossa 6 esitettyihin tuloksiin on lisät-Y ty 2500 iskua minuutissa ja jaettu 2500:11a. Peptideillä 6 (sekvenssin identifiointinumero 8), 7 (sekvenssin identifies ointinumero 9), 9 (sekvenssin identifiointinumero 11), 12 : (sekvenssin identifiointinumero 14), 16 (sekvenssin identifi- 42 115827 ointinumero 18), 19 (sekvenssin identifiointinumero 21), 22 (sekvenssin identifiointinumero 24), 28 (sekvenssin identifi-ointinumero 30), 33 (sekvenssin identifiointinumero 35) ja 34 (sekvenssin identifiointinumero 36) stimulointi-indeksi oli 5 suurempi kuin 2,0 tai saman suuruinen, kuten esitetään kuviossa 6. Reaktiokykyisimmät peptidit ovat 19 (sekvenssin identifiointinumero 21), 22 (sekvenssin identifiointinumero 24) sekä 34 (sekvenssin identifiointinumero 36), kun vastaavat T-solun stimulointi-indeksit olivat olivat 2,9, 3,4 ja 10 2,5.

Esimerkki 4

IgE:n sitoutumista peptidin 34 kanssa koskevat tutkimukset, joissa käytetään peptidin inhibition määrittämistä dot blot 15 -tekniikalla sekä inhibitio-ELISAlla A. Peptidin inhibitio dot-bloteilla

Lyhyt metodiikka: 20 Peptidit 34 (sekvenssin identifiointinumero 36), 6 (sekvenssin identifiointinumero 8), 24 (sekvenssin identifiointinumero 26) sekä 31 (sekvenssin identifioinitinumero 33) (kolmea ·,'* viimeksi mainittua peptidiä käytettiin negatiivisina kontrol- leina) sekä FPLCrllä puhdistettu Loi p V sekä raiheinän raaka : :25 siitepölyuute (merkitty vastaavasti IX:nä ja C:nä kuviossa 9 ;'** sekä käytetty positiivisina kontrolleina) immobilisoitiin ; ,· NC:lle, kuumennettiin ja fikseerattiin glutaarialdehydillä, kuten aiemmin Jcuvattiin. Kahta erillista seerumierää (saatu tutkimuskohteelta Girgis, jolla oli peptidille 34 spesifisiä 30 IgE-vasta-aineita; laimennettu 1:4) esi-inkuboitiin yön ajan huoneenlämpötilassa (18 °C) joko 50 μg:n kanssa raiheinän raakaa siitepölyuutetta millitrassa laimennettua seerumia (kuviossa merkitty inhiboiduksi seerumiksi) tai ilman raakaa uutetta (merkitty kontrolliseerumiksi). Peptidien blotteja ,35 inkuboitiin sitten erikseen kontrollissa sekä raa'an uutteen kanssa esi-inkuboidussa seerumissa yön ajan, jonka jälkeen inkuboitiin 125J:11a leimattujen anti-humaani IgE -vasta-ai- 1 1 5827 43 neiden kanssa ja altistettiin X-säteilylle aina 96 tunnin ajaksi.

Tulokset: 5 Kontrolliseerumi antoi tulokseksi IgE:n voimakkaan sitoutumisen peptidiin 34 (sekvenssin identifiointinumero 36) sekä positiivisiin kontrolleihin Loi p IX:ään ja raiheinän raakaan siitepölyuutteeseen. Muut kontrollipeptidit (esimerkiksi alaniinia runsaasti sisältävä peptidi 31 (sekvenssin identi-10 fiointinumero 33) sekä peptidit 6 (sekvenssin identifioin- tinumero 8), 24 (sekvenssin identifiointinumero 26) eivät sitoutuneet IgE:hen.

Raiheinän raa'an siitepölyuutteen kanssa esi-inkuboitu seeru-15 mi antoi tulokseksi IgE:n vähentyneen sitoutumisen peptidiin 34 (sekvenssin identifiointinumero 36) sekä positiivisiin kontrolleihin Loi p V:hen ja raiheinän raakaan siitepölyuutteeseen.

20 Johtopäätökset: Nämä tulokset havainnollistavat, että tällä henkilöllä on peptidille 34 spesifisiä IgE-vasta-aineita, jotka voidaan '· * inhiboida raiheinän raa'alla siitepölyuutteella.

5 B. Inhibitio-ELISA

Lyhyt metodiikka:

Teptidit 34 (sekvenssin identif iointinumero 36) , 6 (sekvens- s sin identifiointinumero 8), 24 (sekvenssin identifiointinume-30 ro 26) ja 31 (sekvenssin identifiointinumero 33) (kolme vii-- meistä peptidiä käytettiin negatiivisina kontrolleina) sekä , , raiheinän siitepölyuute (käytetty positiivisena kontrollina) ' ; levitettiin mikrotiitterilevyille. Henkilön seerumia (laimen nettu 1:4) esi-inkuboitiin raiheinän raa'an siitepölyuutteen : ,35 kanssa, jota käytettiin erilaisina pitoisuuksina, tai ilman sitä, yön ajan, huoneenlämpötilassa. Kammioihin levitettyä ;/ peptidiä/raakaa uutetta inkuboitiin kontrollin ja raa'an 1 1 5827 44 uutteen kanssa esi-inkuboidun seerumirt kanssa raa'an uutteen erilaisilla pitoisuuksilla. Levyt pestiin ja niitä inkuboi-tiin anti-humaani IgE -vasta-aineen kanssa, joka oli aikaansaatu kaniinissa, ja sen jälkeen HRP:hen konjugoitujen anti-5 kaniini-vasta-aineiden kanssa. Levyt kehitettiin peroksi- daasisubstraatin 1,2-fenyleenidiamiinin kanssa ja värireaktio luettiin 492 nm:ssä.

Tulokset: 10 Kuten kuviossa 10 osoitetaan, kontrolliseerumin IgE sitoutui peptidiin 34 (sekvenssin identifioinitinumero 36) sekä rai-heinän raakaan siitepölyuutteeseen. Raa'an uutteen pitoisuuden asteittainen lisäys vähensi asteittain IgE:n sitoutumista sekä peptidiin 34 (sekvenssin identifiointinumero 36) että 15 raakaan uutteeseen. Kaikki kontrollipeptidit sitoutuivat huomattavasti vähemmän IgE:hen, eikä ollut mitään merkittävää korrelaatiota IgE:n sitomisen asteittaisen vähenemisen ja inhibiittorin pitoisuuden lisääntymisen välillä. Kontrolli-peptideillä ilmennyt sitoutuminen johtuu taustasta, se on, 20 epäspesifisestä IgE:n sitoutumisesta peptideihin tai kammioon, mikä johtuu määritysolosuhteista. Kuitenkin vaikka ELI-. . SAssa havaittiin vähäistä taustaa, IgE sitoutui peptidiin 34 (sekvenssin identif iointinumero 36) ja raakaan uutteseen enemmän kuin kontrollipeptideihin.

:-25

Johtopäätökset: ·.: Kuten inhibitio-dot blot -kokeen tulokset ilmaisivat, samoin : :: Inhibitio-ELISA-kokeiden perusteella tällä henkilöllä ilmenee

IgE:n merkittävää sitoutumista peptidiin 34 (sekvenssin iden-30 tifiointinumero 36).

: Alan ammattimiehelle on täysin selvää, että tässä kuvattua keksintöä voidaan varioida tai muuntaa muilla tavoin, kuin nyt on kuvattu. On ymmärrettävää, että keksintö sisältää myös :35 kaikki tällaiset variaatiot ja muunnokset. Keksintö sisältää myös kaikki vaiheet, piirteet, koostumukset ja yhdisteet, ···' joita tässä patenttijulkaisussa käsitellään tai joihin viita- 45 115827 taan yksittäin tai kollektiivisesti, sekä mainittujen vaiheiden tai piirteiden jokaisen kahden tai sitä useamman yhdistelmän sekä kaikki yhdistelmät.

46 1 1 5827

SEKVENSSILISTAUS (1) YLEISET TIEDOT

(i) HAKIJA: (A) NIMI: UNIVERSITY OF MELBOURNE 5 (B) KATU: Grattan Street (C) KAUPUNKI: Parkville

(D) OSAVALTIO: VIKTORIA

(E) MAA: Australia (F) POSTINUMERO: 3052 10 (G) PUHELIN: 3-613-344-4000 (H) TELEFAX: 3-613-344-7628 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Raiheinän siitepölyallergeenin T-soluepitoopit 15 (lii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 36 (iv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Taipuisa levyke 20 (B) TIETOKONE: IBM PC yhteensopiva (C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS : (D) OHJELMISTO: ASCII Text

y. (V) NYKYISEN HAKEMUKSEN TIEDOT

':25 (A) HAKEMUSNUMERO: 2·;' (B) JÄTTÖPÄIVÄ: : '(vi) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO:US07/866,679 30 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 09-APR-1992 ; ;· (viii) ASIAMIESTÄ KOSKEVAT TIEDOT: !·; (A) NIMI: John M. Slattery •; Davies Collison Cave '•35 1 Little Collins Street, Melbourne 3000

Australia .· ·; (B) REKISTERÖITINUMERO: 47 1 1 5827 (C) VIITE-/LUETTELONUMERO: IPC-011C3PCT (ix) TIETOLIIKENNEYHTEYSTIEDOT: (A) PUHELIN: 613-254-2777 (B) TELEFAX: 613-254-2770 5 (2) SEKVENSSIN ID NO:l TIEDOT:: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 1376 emäsparia 10 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA 15 (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS: CDS

(B) SIJAINTI: 42..942 20 (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: kypsä peptidi (B) SIJAINTI: 115..942 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 1 :^:25 CGCTATCCCT CCCTCGTACA aacaaacgca agagcagca atg gcc GTC CAG AAG 54

Met Ala Vai Gin Lvs ·...· -25 :.: : tac acg gtg gct cta ttc ctc gcc gtg gcc ctc gtg gcg ggc ccg gcc -Tyr Thr Vai Ala Leu Phe Leu Ala Vai Ala Leu Vai Ala Gly d>o m" --- -20 ' -15 -10 ‘ 3 g GCC TCC TAC GCC GCT GAC GCC GGC TAC ACC CCC GCA GCC GCG GCC AC~

Ala Ser Tyr Ala Ala Asp Ala Gly Tyr Thr Pro Ala Ala Ala Ala Thr 1 5 10 CCG GCT ACT CCT GCT GCC ACC CCG GCT GCG GCT GGA GGG AAG GCG ACG : .* Pro Ala Thr Pro Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala Gly Gly Lvs A'a Thr ~~~ ’; · 15 20 25 ’·' . ACC GAC GAG CAG AAG CTG CTG GAG GAC GTC AAC GCT GGC TTC AAG GCi ,'35 Thr Asp Glu Gin Lys Leu Leu Glu Asp Val Asn Ala Gly Phe Lvs μΪ _ 30 35 40 ‘ “

GCC GTG GCC GCC GCT GCC AAC GCC CCT CCG GCG GAC AAG TTC AAG A.TC

Ala Val Ala Ala Ala Ala Asn Ala Pro Pro Ala Asp Lvs Phe Lvs tt-

45 50 55 ‘' %'C

TTC GAG GCC GCC TTC TCC GAG TCC TCC AAG GGC CTC CTC GCC ACC TCC

Phe Glu Ala Ala Phe Ser Glu Ser Ser Lys Gly Leu Leu Ala Thr ser 65 70 75 48 115827 GCC GCC AAG GCA CCC GGC CTC ATC CCC AAG CTC GA'C ACC GCC TAC GAC ? ? :

Ala Ala Lys Ala Pro Gly Leu He Pro Lys Leu Asp Thr Ala Tyr Asp 80 85 90 GTC GCC TAC AAG GCC GCC GAG GGC GCC ACC CCC GAG GCC AAG TAC GAC 411

Val Ala Tyr Lys Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pro Giu Ala Lvs Τ'/r Asp 95 100 105 5 GCC TTC GTC ACT GCC CTC ACC GAA GCG CTC CGC GTC ATC GCC GGC GCC ,c -

Ala Phe Val Thr Ala Leu Thr Glu Ala Leu Arg Val lie Ala Gly Ala 110 115 120

CTC GAG GTC CAC GCC GTC AAG CCC GCC ACC GAG GAG GTC CCT GCT GCT

Leu Glu Val His Ala Val Lys Pro Ala Thr Glu Glu Val Pro Ala Ala 125 130 135 140 10 AAG ATC CCC ACC GGT GAG CTG CAG ATC GTT GAC AAG ATC GAT GCT GCC =?-

Lys He Pro Thr Gly Glu Leu Gin He Val Aso Lvs He Asd Ala AH ~~ 145 150 ' 155 TTC AAG ATC GCA GCC ACC GCC GCC AAC GCC GCC CCC ACC AAC GAT AAG ; -

Phe Lys He Ala Ala Thr Ala Ala A. n Ala Ala Pro Thr Asn Asp Lys 150 lo5 170 TTC ACC GTC TTC GAG AGT GCC TTC AAC AAG GCC CTC AAT GAG TGC ACG 15 phe Thr Val Phe Glu Ser Ala Phe Asn Lys Ala Leu Asn Glu Cys Th- ~ : 175 180 185

GGC GGC GCC TAT GAG ACC TAC AAG TTC ATC CCC TCC CTC GAG GCC GCG

Gly Gly Ala Tyr Glu Thr Tyr Lys Phe lie Pro Ser Leu Glu Ala AH

190 195 200

GTC AAG CAG GCC TAC GCC GCC ACC GTC GCC GCC GCG CCC GAG GTC AAG

Val Lys Gin Ala Tyr Ala Ala Thr Val Ala Ala Ala Pro Glu Vai Ly's 20 205 210 215 220 TAC GCC GTC TTT GAG GCC GCG CTG ACC AAG GCC ATC ACC GCC ATG AC~ . . Tyr Ala Val Phe Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala He Thr Ala Me- Hi :/·! 225 230 235 CAG GCA CAG AAG GCC GGC AAA CCC GCT GCC GCC GCT GCC ACA GGC GC~

Gin Ala Gin Lys Ala Gly Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly O'" H- :2^’ 240 245 250 ° ~ GCA ACC GTT GCC ACC GGC GCC GCA ACC GCC GCC GCC GGT GCT GCC p,-- ; ,· Ala Thr Val Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala 255 260 265 '“r ·.· 'GCC GCT GCT GGT GGC TAC AAA GCC TGATCAGCTT GCTAATATAC TACTGAAC'—

Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Lys Ala 10 - 270 275 30 ATGTATGTGC ATGATCCGGG CGGCGAGTGG TTTTGTTGAT AATTAATCTT CG1^-, TCATGCAGCC GCGATCGAGA GGGCTTGCAT GCTTGTAATA ATTCAATATT TTTCA^___ '·'·" TTTTGAATCT GTAAATCCCC ATGACAAGTA GTGGGATCAA GTCGGCATGT ATCA.C——- ‘ ’ . ATGCGAGTTT AAC G ATGGGG AG TTT ATC AA AGAATTTATT ATTAAAAAAA AAA.;.;_-,..

35· ; AAAAAAAAAA AAAAAAAGAG CACGCTATCC CTCCCTCGTA CAAACAAACG CAAGA.G·- - - - : ’ AATGGCCGTC CAGAAGTACA CGGTGGCTCT ATTCCTCGCC GTGGCCCHC TGCr~~ ~~ - GGCCGCCTCC TACGCCGCTG ACC-CTTAAAC ATTCATATCA TCAT ' ' 49 1 1 5 8 2 7 (2) SEKVENSSIN ID NRO 2 TIEDOT:

(i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET

(A) PITUUS: 301 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 5 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (Xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 2

Mac Ala Vai Gin Lys Tyr Thr Vai Ala Leu Phe Leu Ala Vai Ala Leu -25 -20 -15 -10

Vai Ala Gly Pro Ala Ala Ser Tyr Ala Ala Asp Ala Gly Tyr Thr Pro -5 1 5

Ala Ala Ala Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala 10 15 20

Gly Gly Lys Ala Thr Thr Asd Glu Gin Lys Leu Leu Glu Asd Vai Asr.

25 30 35

Ala Gly Phe Lys Ala Ala Vai Ala Ala Ala Ala Asn Ala Pro Pro Ala 40 45 50 55

Asp Lys Phe Lys Ile Phe Glu Ala Ala Phe Ser Glu Ser Ser Lys Glv 60 65 70

Leu Leu Ala Thr Ser Ala Ala Lys Ala Pro Gly Leu Ile Pro Lvs Leu 75 80 85

Asp Thr Ala Tyr Asp Vai Ala Tyr Lys Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pre · 90 95 100 ·<· Glu Ala Lys Tyr Asp Ala Phe Vai Thr Ala Leu Thr Glu Ala Leu Arc 105 ‘ ’ 110 115

Vai Ile Ala Gly Ala Leu Glu Vai His Ala Vai Lys Pro Ala Thr Glu 120 ' 125 130 135 ; ,· Glu Vai Pro Ala Ala Lys Ile Pro Thr Gly Glu Leu Gin Ile Vai Asp 14 0 145 15 0 ' ·’ ' Lys Ile Asp Ala Ala Phe Lys Ile ^la Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala '155 160 165

Pro Thr Asn Asp Lys Phe Thr Vai Phe Glu Ser Ala Phe Asn Lys Ala 170 ‘ 175 180 50 115827

Leu Asn Glu Cys Thr Gly Gly Ala Tyr Glu Thr Tyr Lys Phe He Pro 185 190 195

Ser Leu Glu Ala Ala Val Lys Gin Ala Τ'/r Ala Ala Thr Val Ala Ala r 200 205 ?10 b .-.ia Pro Glu Val Lys Tyr Ala Val Phe Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala 220 225 230

He Thr Ala Met Thr Gin Ala Gin Lys Ala Gly Lys Pro Ala Ala Ala 235 240 245 ln Ala Ala Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala 250 255 260

Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Gly Tvr Lys Ala 265 270 ‘ 275 15 (2) SEKVENSSIN ID NRO 3 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 20 (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · (ϋ) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi :25· (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 3:

Ala Asp Ala- Gly Tyr Thr Pro Ala Ala Ala Ala Thr 3 0 1 5 10 (2) SEKVENSSIN ID NRO 4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 13 aminohappoa ,>' (B) TYYPPI: aminohappo ·’* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 115827 51 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen 5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 4:

Ala Ala Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ala Ala Thr Pro Ala 1 5 10 (2) SEKVENSSIN ID NRO 5 TIEDOT: 10 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) TOPOLOGIA: lineaarinen 15 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 5: 20

Ala Ala Thr Pro Ala Ala Ala Gly Glv Lvs Ala Thr 1 .5 10 > * ' (2) SEKVENSSIN ID NRO 6 TIEDOT: t :¾¾ (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: *.ti< (A) PITUUS: 12 aminohappoa ; (B) TYYPPI: aminohappo | * Λ ;V - (d) TOPOLOGIA: lineaarinen 30 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen 'Ύ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 6: 3,5, Gly Lys Ala Thr Thr Asd Glu Gin Lv s Lea Leu Glu 1 5 10 t 52 115827 (2) SEKVENSSIN ID NRO 7 TIEDOT: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 7:

Lys Leu Leu Glu Asp Vai Asn Ala Gly Phe Lys Ala 1 5 ’'10 (2) SEKVENSSIN ID NRO 8 TIEDOT: 15 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 20 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (V) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 8: 25·'· xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: ; ' ; Gly Phe Lys Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Asn Ala 1 5 ίο (2-) SEKVENSSIN IJD NRO 9 TIEDOT: 30 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo : (C) TOPOLOGIA: lineaarinen 35^ (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen 53 1 1 5827 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID N.RO 9:

Ala Ala Asn Ala Pro Pro Ala Asp Lys Phe Lys lie 1 5 10 (2) SEKVENSSIN ID NRO 10 TIEDOT: 5 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) TOPOLOGIA: lineaarinen 10 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen 15 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 10:

Lys Phe Lvs Ile Phe Glu Ala Ala Phe Ser Glu Ser 1 5 10 (2) SEKVENSSIN ID NRO 11 TIEDOT: 20 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo • · (D) TOPOLOGIA: lineaarinen :,25 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi : (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 11: 30 Phe Ser Glu Ser Ser Lys Gly Leu Leu Ala Thr Ser 15 10 , . (2) SEKVENSSIN ID NRO 12 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: \ (A) PITUUS: 12 aminohappoa . '35 (B) TYYPPI: aminohappo (C) TOPOLOGIA: lineaarinen 1 1 5827 54 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (Xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 12: ^ Leu Ala Thr Sei Ala Ala Lys Ala Pro Gly Leu

I ; 1C

(2) SEKVENSSIN ID NRO 13 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 10 (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOELKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (ΧΪ) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 13:

Pro Gly Leu Ile Pro Lys Leu Asn Thr Ala Tyr Asp 1 5 10 20 (2) SEKVENSSIN ID NRO 14 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa . 25 (B) TYYPPI: aminohappo ··· (C) TOPOLOGIA: lineaarinen •':v .(ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 14: : ; ' Thr Ala Tvr Asp Yal Ala Tyr Lys Ala Ala Glu C-Ty 1 ' 5 10 ,'3‘5 (2) SEKVENSSIN ID NRO 15 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 55 1 1 5827 (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSIN ID NRO 15: 10 Ala Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala Lvs Tyr Asp 1 5 10 (2) SEKVENSSIN ID NRO 16 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 15 (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 20 (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 16: .Ala Ly s Tyr Asd Ala Pne Vai Thr Ala Leu Thr Glu 1 *5 13 • 25 f: (2) SEKVENSSIN ID NRO 17 TIEDOT: . X i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa 30 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi :‘3 5 (V) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 17:

Ala Leu Thr Glu Gly Leu Arg Vai lie Ala Gly Ala V. 15 10 56 1 1 5 8 2 7 (2) SEKVENSSIN ID NRO 18 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 13 aminohappoa 5 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 10 (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 18: lie Ala G lv Ala Leu Glu Vai His Ala Vai Lys Pro Ala 1 ' 5 i: 15 (2) SEKVENSSIN ID NRO 19 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen :.;25 f": (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 19: 1 : Ala Vai Lys Pro Ala Thr Glu Glu Vai Pro Ala Ala

1 c 1C

(2) SEKVENSSIN ID NRO 20 TIEDOT: 30 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: .(a) PITUUS: 13 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ; · 3*5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 57 1 1 5 8 2 7 (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 20:

Vai Pro Ala Ala Lys Ile Pro Thr Glv Glu Leu Gin Ile r 15 10 5 (2) SEKVENSSIN ID NRO 21 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa 10 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 15 (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 21:

Gly Glu Leu Gin Ile Vai Asp Lys Ile Asp Ala Ala 1 5 10* 20 (2) SEKVENSSIN ID NRO 22 TIEDOT: *· *' (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ·... (A) PITUUS: 12 aminohappoa :.£5 (B) TYYPPI: aminohappo : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen .·;· -(ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 22:

Ile Asp Ala Ala Phe Lys Ile Ala Ala Thr Ala Ala V 1 5 10 :'-35 (2) SEKVENSSIN ID NRO 23 TIEDOT: 58 1 1 5827 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 23:

Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala Pro Thr Asn Asp Lvs 1 5 10 (2) SEKVENSSIN ID NRO 24 TIEDOT: 15 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 20 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen ;* (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 24: . .25 ‘.I. Thr Asn Asp Lys Phe Thr Vai Phe Glu Ser Ala Phe 1 5 10 :;Υ - (2) SEKVENSSIN ID NRO 25 TIEDOT: 30 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo :,· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen .*[3*5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi r. (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen 59 1 1 5827 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 25:

Glu Ala Ser Phe Asn Lys Ala Leu Asn Glu Cvs Thr 1 5 10 (2) SEKVENSSIN ID NRO 26 TIEDOT: 5 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 10 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen 15 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 26:

Asn Glu Cys Thr Gly Gly Ala Tyr Glu Thr Τ'/r Lys 1 5 ' 10 (2) SEKVENSSIN ID NRO 27 TIEDOT: 20 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa . , (B) TYYPPI: aminohappo

k t I

’· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen III ' ' t i a \*25 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi ’ » a a t > f · . (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 27.

30 Glu Thr Tyr Lys Phe Ile Pro Ser Leu Glu Ala Ala 1 5 10 (2) SEKVENSSIN ID NRO 28 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ‘35 (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo .(D) TOPOLOGIA: lineaarinen iti 60 115827 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen 5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 28:

Leu Glu Ala Ala Val Lys Gin Ala Tyr Ala Ala Thr 1 5 10 (2) SEKVENSSIN ID NRO 29 TIEDOT: 10 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA:lineaarinen 15 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 29: 20 Tyr Ala Ala Thr Vai Ala Ala Pro Glu Vai Lys Tyr 1 5 10 . . (2) SEKVENSSIN ID NRO 30 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ’·έ·5 (a) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 30 (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen *·';·' (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 30: • · Glu Vai Lvs Tyr Ala Vai Pne Glu Ala Ala Leu Thr .·, : 1 ' 5 10 35 (2) SEKVENSSIN ID NRO 31 TIEDOT: 61 1 1 5827 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 13 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 31:

Ala Ala Leu Thr Lys Ala Ile Thr Ala Met Thr Gin Ala 1 5 10 (2) SEKVENSSIN ID NRO 32 TIEDOT: 15 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 20 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi : (V) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 32: 2.5 Ala Met Thr Gin Ala Gin Lys Ala Gly Lys Pro ala ’... ‘ 1 5 10 :·'· : (2) SEKVENSSIN ID NRO 3 3 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 30 (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo I .(D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi ’ '35 (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 33: '·" Gly Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala 15 10 62 1 1 5827 (2) SEKVENSSIN ID NRO 34 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa 5 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (i i) MOLEKYYLITYYPPI:peptidi 10 (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 34:

Thr Aid Ala Ala Thr Vai Ala Thr Ala Ala Ala Thr 1 5 10 15 (2) SEKVENSSIN ID NRO 35 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 12 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen .·. ; (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen ‘;25 :···: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 35: L: : Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala 1 5 10 (2) SEKVENSSIN ID NRO 36 TIEDOT: 30 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: : (A) PITUUS: 12 aminohappoa ,·:· (B) TYYPPI: aminohappo • · (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ’. 35 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: peptidi 63 1 1 5827 (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NRO 36:

Giy A ia. Ala Thr Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Ly s Ala * 5 10

Claims (17)

115827 64

1. Menetelmä Loi p V -peptidin tai sen homologin valmistamiseksi peptidin käsittäessä aminohapposekvenssin, joka on va- 5 littu ryhmästä, joka koostuu peptidien 6 (sekvenssin identi-fiointinumero 8), 7 (sekvenssin identifiointinumero 9), 14 (sekvenssin identifiointinumero 16), 16 (sekvenssin identi-fiointinumero 18), 19 (sekvenssin identifiointinumero 21), 22 (sekvenssin identifiointinumero 24), 23 (sekvenssin identifi-10 ointinumero 25), 24 (sekvenssin identifiointinumero 26), 25 (sekvenssin identifiointinumero 27), 28 (sekvenssin identifi-ointinumero 30), 30 (sekvenssin identifiointinumero 32), 33 (sekvenssin identifiointinumero 35) ja 34 (sekvenssin identi-fiointinumero 36) aminohapposekvensseistä, jotka on esitetty 15 kuvassa 2, tunnettu siitä, että menetelmässä (i) ilmennetään mainittua peptidiä koodaavaa nukleiinihappoa solussa, tai (ii) syntetisoidaan mainittu peptidi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 20 että mainittu peptidi käsittää Loi p V:n ainakin yhden T-solu- epitoopin mainitun peptidin käsittäessä aminohapposekvenssin, > j joka on valittu ryhmästä, joka koostuu peptidien 6 (sekvenssin identifiointinumero 8), 7 (sekvenssin identifiointinumero 9), 12 (sekvenssin identifiointinumero 14), 14 (sekvenssin identi-25 f iointinumero 16), 16 (sekvenssin identif iointinumero 18), 19 , (sekvenssin identifiointinumero 21), 22 (sekvenssin identifi- · ointinumero 24), 25 (sekvenssin identifiointinumero 27), 28 I » '< ' (sekvenssin identifiointinumero 30), 33 (sekvenssin identifi- ointinumero 35) sekä 34 (sekvenssin identifiointinumero 36) ·,; · 30 aminohapposekvensseistä, jotka esitetään kuviossa 2. • t • ·

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, '!,! että mainittu peptidi käsittää Loi p V:n ainakin yhden B-solu- 7 epitoopin, mainitun peptidin käsittäessä aminohapposekvenssin, :ti_! 35 joka on valittu ryhmästä, joka koostuu peptidien 7 (sekvenssin : *,: identifiointinumero 9), 16 (sekvenssin identifiointinumero 18), 19 (sekvenssin identifiointinumero 21), 23 (sekvenssin identi-fiointinumero 25), 24 (sekvenssin identifiointinumero 26), 28 115827 65 (sekvenssin identifiointinumero 30), 30 (sekvenssin identifi-ointinumero 32) sekä 34 (sekvenssin identifiointinumero 36) aminohapposekvensseistä, jotka esitetään kuviossa 2.

4. Eristetty nukleiinihapposekvenssi, tunnettu siitä, että se koodittaa patenttivaatimuksessa 1 esitettyä peptidiä.

5. Nukleiinihapposekvenssin funktionaalinen ekvivalentti, tunnettu siitä, että se koodittaa patenttivaatimuksessa 1 esi- 10 tettyä peptidiä.

6. Menetelmä polyklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka reagoi spesifisesti patenttivaatimuksessa 1 esitetyn peptidin kanssa, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää eläimen 15 immunisoimisesta peptidillä, joka on valmistettu patenttivaatimuksen 1 mukaisesti ja sen jälkeen mainittujen vasta-aineiden eläimestä eristämisen.

7. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, 20 joka reagoi spesifisesti patenttivaatimuksessa 1 esitetyn peptidin kanssa, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää patentti-: vaatimuksen 6 mukaan immunisoidun eläimen solun sulauttamises- ,···, ta immortaloivan solun kanssa, jolloin mainitut sulautetut ”! solut (hybridooma) tuottavat mainitun monoklonaalisen vasta- 25 aineen. ·"· · 8. I Imen tyrni svekt or i , tunnettu siitä, että se käsittää nukle- ’ iinihapposekvenssin, joka koodittaa patenttivaatimuksessa 1 esitettyä peptidiä. : 30 » * * »

9. Menetelmä terapeuttisen koostumuksen valmistamiseksi, tun- \ nettu siitä, että menetelmässä yhdistetään ainakin yksi pepti- di, joka on valmistettu patenttivaatimuksen 2 mukaisen mene-·;*’ telmän mukaisesti, farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai : : 35 laimentimen kanssa.

10. Menetelmä yksilön herkkyyden ilmaisemiseksi Loi p V:tä kohtaan, tunnettu siitä, että yksilöltä saatu verinäyte yhdis- 115827 66 tetään ainakin yhden patenttivaatimuksessa 1 esitetyn peptidin kanssa, sellaisissa olosuhteissa, jotka soveltuvat veren komponenttien sitomiseen peptidin kanssa, ja määrätään laajuus, jolla mainittu sitominen tapahtuu siten, että määritetään B-5 solun toiminta, T-solun toiminta, T-solun lisääntyminen tai Τ'-solun toiminnan ja B-solun lisääntymisen yhdistelmä, mikä on osoituksena yksilön herkkyydestä raiheinän siitepölylle.

11. Menetelmä terapeuttisen koostumuksen valmistamiseksi, tun-10 nettu siitä, että menetelmässä yhdistetään farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja tai laimennin vähintään kahden Loi v P-peptidin kanssa, jotka on valittu ryhmästä käsittäen peptidit 6 (sekvenssin identifiointinumero 8), 7 (sekvenssin identifi-ointinumero 9), 12 (sekvenssin identifiointinumero 14), 14 15 (sekvenssin identifiointinumero 16), 16 (sekvenssin identifi-ointinumero 18), 19 (sekvenssin identifiointinumero 21), 22 (sekvenssin identifiointinumero 24), 25 (sekvenssin identifi-ointinumero 27), 28 (sekvenssin identifiointinumero 30), 33 (sekvenssin identifiointinumero 35) sekä 34 (sekvenssin iden-20 tifiointinumero 36), jotka on tuotettu millä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukaisella menetelmällä, jolloin mainitulla .j menetelmällä tuotetaan koostumus, joka sisältää riittävän ,···. pitoisuuden Loi p V:n T-solun epitooppeja siten, että koostu musta annettaessa Loi p V:lle herkistyneelle yksilölle, yksi-25 lön T solut alkavat sietää Loi p V:tä. 1 1 5827 67 fieringsnummer 30), 30 (sekvensens identifieringsnummer 32), 33 (sekvensens identifieringsnummer 35) och 34 (sekvensens identifieringsnummer 36), kännetecknat av att vid förfarandet (i) uttrycks nukleinsyra som kodar nämnda peptid i en cell, 5 eller (ii) sä syntetiseras nämnda peptid.

2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att nämnda peptid innefattar ätminstone en T-cellepitop av Loi p V, varvid nämnda peptid innefattar en aminosyrasekvens, som är 10 vald ur en grupp, som bestär av i figur 2 illustrerade amino-syrasekvenser av peptider 6 (sekvensens identifieringsnummer 8), 7 (sekvensens identifieringsnummer 9), 12 (sekvensens identifieringsnummer 14), 14 (sekvensens identifieringsnummer 16), 16 (sekvensens identifieringsnummer 18), 19 (sekvensens 15 identifieringsnummer 21), 22 (sekvensens identifieringsnummer 24), 25 (sekvensens identifieringsnummer 27), 28 (sekvensens identifieringsnummer 30), 33 (sekvensens identifieringsnummer 35) och 34 (sekvensens identifieringsnummer 36). 20 3. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att nämnda peptid innefattar ätminstone en B-cellepitop av Loi p V, , : varvid nämnda peptid innefattar en aminosyrasekvens, som är , vald ur en grupp, som bestär av i figur 2 illustrerade amino- syrasekvenser av peptider 7 (sekvensens identifieringsnummer 25 9), 16 (sekvensens identif ieringsnummer 18), 19 (sekvensens ’”* identifieringsnummer 21), 23 (sekvensens identifieringsnummer '·>' · 25), 24 (sekvensens identif ieringsnummer 26), 28 (sekvensens '.· : identif ieringsnummer 30) , 30 (sekvensens identif ieringsnummer 32), samt 34 (sekvensens identifieringsnummer 36). 30

4. Isolerad nukleinsyrasekvens, kännetecknad av att den kodar en peptid enligt patentkrav 1.

5. Funktionell ekvivalent av en nukleinsyrasekvens, känne- ; : 35 tecknad av att den kodar en peptid enligt patentkrav 1.

6. Förfarande för att framställa en polyklonal antikropp som reagerar specifikt med en peptid enligt patentkrav 1, känne- 115827 68 tecknat av att förfarandet innefattar immunisering av ett djur med en peptid som framställts enligt patentkrav 1 och därefter isolering av nämnda antikroppar frän djuren. 5 7. Förfarande för att framställa en monoklonal antikropp som reagerar specifikt med en peptid enligt patentkrav 1, kanne-tecknat av att förfarandet innefattar fusionering av en immu-niserad djurcell enligt patentkrav 6 med en immortaliserande cell, varvid nämnda fusionerade celler (hybridom) producerar 10 nämnda monoklonala antikropp.

8. Expressionsvektor, kännetecknad av att den innefattar en nukleinsyrasekvens, som kodar en peptid enligt patentkrav 1. 15 9. Förfarande för att framställa en terapeutisk komposition, kännetecknad av att vid förfarandet kombineras ätminstone en peptid framställd enligt patentkrav 2 med en farmaceutiskt acceptabel bärare eller diluent. 20 10. Förfarande för att exponera känsligheten hos en individ mot Loi p V, kännetecknat av att ett blodprov som erhällits , : frän individen kombineras med ätminstone en peptid enligt ,·*·. patentkrav 1, under förhällanden lämpliga för bindning av ’! blodkomponenterna med peptiden, och omfattningen av nämnda ;;; 25 bindning definieras sä att man definierar B-cellens aktivitet, ·’·’ T-cellens aktivitet, T-cellens ökning, eller en kombination av

1 T-cellens aktivitet och B-cellens ökning, vilket indikerar V ’ individens känslighet för pollen av rajgräs. * s |j : 30 11. Förfarande för att framställa en terapeutisk komposition, : * * *: kännetecknad av att vid förfarandet kombineras en farmaceu- • * » tiskt acceptabel bärare eller diluent med ätminstone tvä Loi v P-peptider, som är valda ur en grupp innefattande peptider 6 (sekvensens identifieringsnummer 8), 7 (sekvensens identifie-: : 35 ringsnummer 9), 12 (sekvensens identifieringsnummer 14), 14 (sekvensens identifieringsnummer 16), 16 (sekvensens identifier ingsnummer 18), 19 (sekvensens identifieringsnummer 21), 22 (sekvensens identifieringsnummer 24), 25 (sekvensens iden- 115827 69 tifieringsnurnmer 27), 28 (sekvensens identifieringsnummer 30), 33 (sekvensens identifieringsnuinmer 35) och 34 (sekvensens identifieringsnummer 36) , vilka är framställda med ett förfar-ande enligt vilket som heist av patentkraven 1-3, varvid med 5 nämnda förfarande framställs en komposition, som innefattar en tillräcklig hait av epitoper av T-celler av Loi p V sä, att da man ger av kompositionen tili en individ som är känslig för Loi p v, börjar individens T-celler tolerera Loi p V. 10