DE19823097A1

DE19823097A1 - Mittel gegen saisonale Typ-I-Allergien und bakterielle Infektionen

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Publication number: DE19823097A1
Application number: DE19823097A
Authority: DE
Inventors: Uwe Woelk; Sigrid Goedert; Joachim Jose; Thomas Meyer
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1998-05-22
Publication date: 1999-11-25

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Mittel gegen Typ-I-Allergien und bakterielle Infektionen, z. B. Meningitis.

Description

In der industrialisierten Welt sind 10% bis 30% der Bevölkerung mit Neisseria meningitidis infiziert, ohne ernsthaft zu erkranken. In diesen Fällen besiedelt der Keim die mukosomalen Oberflächen des Naso-Pharynx, wo eine ausbalancierte, lokal begrenzte Infektion entsteht (Cartwright, In: Meningoccoccal Disease (Cartwright and Keith, Hrsg.) (1995), 115-147). Diese pathogenen Neisserien sekretieren u. a. eine als IgA-Protease bezeichnete Serin-Protease, die in der Lage ist, sekretorische s-IgA1-Anti körpermoleküle des Menschen zu spalten (Plaut et al., (1981), Science 190, 1103-1105). Diese Antikörper sind für die primäre Immunabwehr von Krankheitserregern von Bedeutung. Sie umfassen 80% der Immunglobulin-An teile der menschlichen Schleimhäute (Brandtzaeg et al., (1995), APMIS 103, 1 bis 19).

Die IgA-Protease wird im Gegensatz zu den anderen bakteriellen Proteasen als relativ großes Vorläufermolekül hergestellt (Pohlner et al., (1987) Nature 325, 458 bis 461). Neben der eigentlichen reifen Protease werden in einem autokatalytischen Prozeß zwei weitere Proteine freigesetzt, das etwa 3 kDa kleine γ-Peptid und das α-Protein.

Das α-Protein (Dohlman et al., (1993) Biochem. Biophys. Res. Comm. 195, 686-696) besteht vorwiegend aus α-helikalen Coiled-Coil-Bereichen und ist ein stark basisches Protein (pl<10) (Dohlman et al., (1991), Biochem. Biophys. Res. Comm. 181, 787-796).

Mogens Kilian hat ein bis jetzt gültiges Modell vorgeschlagen, das der IgA-Protease eine entscheidende Rolle bei der Kolonisierung von Geweben durch pathogene Keime zuweist (Kilian et al., (1987), Adv. Exp. Med. Biol. 216B, 1261-1269). Die erfolgreiche Besiedelung mit IgA-Protease sekretierenden Erregern beruht danach auf der Präsenz Bakterien-spezifischer IgA-1-Anti körper, die zuvor von heterologen kommensalen Mikroorganismen ausgelöst wurden und zwar auf der Basis kreuzreaktiver Antigene. Durch Spaltung dieser Antikörper und durch eine großflächige Bindung der resultierenden F(ab)-Fragmente kann sich der Erreger nun tarnen. Es ist nicht verwunderlich, daß gegen die Virulenzfaktoren der pathogenen Keime, zu denen auch die IgA-Protease gehört, keine neutralisierenden Antikörper von den kommensalen Bakterien induziert werden.

Temporären Beeinträchtigungen des humoralen Immunsystems, wie angeborene IgA-Defizienzen oder während viraler Infektionen abgesunkene IgA-Titer begünstigen nachweislich allergische Reaktionen (Braendtzaeg (1989), Am. J. Resp. Crit. Care Med. 151, 2081-2087; Busse et al., (1989) Clin. Exp. Allerg. 19, 1-19). Damit im Einklang steht der Befund, daß bei atopischen Kindern signifikant häufiger eine bakterielle IgA-Protease-Akti vität vorgefunden wird (Kilian et al., (1982), Pedr. Res. 38, 182-186). Obwohl es sich bei klassischen Allergenen vor allem um Parasiten-, Pollen-, Antibiotika- und Nahrungsmittelantigene etc. handelt, gibt es Berichte, die einen möglichen Zusammenhang zwischen pathogenen Meningokokken und Allergien postulieren (Borysova et al., (1980), Zntr. bl. Bkt. Hyg. A 48, 323-334). Ein Mechanismus für ein derartiges Zusammenwirken konnte bisher jedoch nicht aufgefunden werden.

Pollen-Proteine verschiedener Pflanzen sind die häufigsten Auslöser von saisonalen Allergien (Weber et al., (1981) Ann. Allerg. 46, 208-215). Man weiß seit langem, daß zwischen diesen Allergenen eine umfassende Kreuzreaktivität auf IgE-Antikörperebene besteht (Cooke, 1916), J. Imm. 1, 201). So gibt es humorale Kreuzreaktivitäten auch zwischen wenig verwandten Pflanzenfamilien. Am bekanntesten ist die Kreuzreaktivität von Süßgräsern, Karotten und Sellerie (Aalberse et al., (1981) Allerg. Clin. Imm. 68, 356-360).

DE 197 41 955.0 offenbart, daß die bakterielle IgA-Protease direkt an der Entstehung entzündlicher Reaktionen bei einer bakteriellen Meningitis beteiligt sein kann. Als neuer therapeutischer Ansatz bei der Behandlung einer bakteriellen Meningitis wird mit vorgeschlagen, die durch die IgA-Protease hervorgerufene Stimulation der Freisetzung von Cytokinen zu vermindern oder vollständig zu unterdrücken.

Überraschenderweise wurde jetzt gefunden, daß Allergiker, d. h. Personen mit einem hohen Spiegel an allergenspezifischen IgE-Antikörpern, auch einen für das α-Proteinfragment des IgA-Proteasevorläuferproteins spezifischen IgE-Spiegel aufweisen. Weiterhin wurde überraschenderweise festgestellt, daß das α-Protein bzw. Peptidfragmente davon in der Lage sind, allergenspezifische T-Zellklone aus Allergikern zu aktivieren. Bei diesen T-Zellklonen handelt es sich um TH2-Zellen, die große Mengen an Interleukin4, aber nur geringe Mengen oder gar kein Interferon-γ sekretieren. Bei einem Allergiker konnte außerdem sogar gezeigt werden, daß die α-Proteinsequenz immundominant ist.

Für die kreuzreaktive Aktivierung der allergenen T-Zell-Klone konnte eine Peptidsequenz der α-Proteine identifiziert werden, die man in einem repetitiven Motiv mehrerer IgA-Proteasevarianten findet. Diese Sequenz besitzt signifikante Homologie zu einem immundominantem T-Zell-Epitop verschiedener Pollenspezies (Mohapatra, (1994) Imm. Today 15, 596-597). Zum einen haben beide Epitope ähnliche Aminosäurereste an vorhersagbaren MHC-Klasse-II Ankerpositionen, zum anderen sind auch einige dieser Pollenproteine stark basisch geladen (Silvanovich et al., (1991) J. Biol. Chem. 266, 1204-1214, Griffith et al., (1991) FEBS Lett. 297, 210-215). Diese Erkenntnisse zeigen, daß eine mukosomale Infektion mit IgA-Protease sekretierenden Mikroorganismen, z. B. Neisserien, dazu führen kann, daß an sich harmlose Umweltantigene eine Sensibilisierung des Organismus hervorrufen. Bei prädisponierten Personen kann dann durch eine massive Belastung des naiven Immunsystem mit Aeroallergenen eine Typ-I-Allergie entstehen.

Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens

a) ein α-Protein oder ein Fragment davon oder/und
b) ein dafür kodierendes Nukleinsäuremolekül als Wirkstoff und gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Träger- und Hilfsstoffen enthält.

Eine Zusammensetzung, die ein von einem IgA-Proteasevorläufer stammendes α-Protein oder ein immunologisch aktives Fragment davon enthält, ist einerseits als aktiver Impfstoff zur Immunisierung gegen bakterielle Infektionen geeignet, kann aber andererseits als Wirkstoff zur Behandlung von Typ-I-Allergien, insbesondere durch Pflanzenpollen wie etwa Gräser- oder Birkenpollen hervorgerufenen Allergien eingesetzt werden. Durch Verabreichen des Wirkstoffs in einer oder mehreren Applikationen, z. B. durch Injektion, gegebenenfalls zusammen mit bekannten immunologischen Adjuvantien wird im Organismus eine immunologische Reaktion gegen das α-Protein bzw. das IgA-Protease-Vor läuferprotein induziert, wodurch das Risiko einer Erkrankung an bakteriellen Infektionen, z. B. durch Neisserien, verringert bzw. der Ablauf solcher Erkrankungen abgemildert werden kann. Zudem kann durch die Verabreichung der Zusammensetzung gegebenenfalls zusammen mit bekannten immunologischen Adjuvantien eine Typ-I-Allergie, insbesondere eine Allergie gegen Pollenprotein verhindert oder die Schwere der allergenen Symptome abgemildert werden.

Das α-Protein kann ein natürliches oder rekombinantes α-Protein oder ein immunologisch aktives Fragment davon sein. Beispiele für geeignete α-Proteine sind α-Proteine aus Bakterien der Gattungen Neisseria, insbesondere von N. meningitidis oder N. gonorrhoeae, Haemophilus, insbesondere H. influenzae und Streptococcus, insbesondere S. pneumoniae. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann nicht nur ein α-Protein, sondern auch eine Mischung mehrerer verschiedener α-Proteine oder α-Proteinfragmenten, z. B. aus unterschiedlichen Organismen wie etwa aus verschiedenen Neisserienspezies enthalten.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann einerseits ein α-Protein oder Fragment davon enthalten, welches in der Lage ist, die Bildung von Antikörpern zu induzieren. Alternativ oder zusätzlich kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung auch in der Lage sein, eine zelluläre, d. h. durch T-Zellen vermittelte Immunanwort zu induzieren.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auf bekannte Weise, z. B. oral, intraperitoneal, subkutan, intravenös oder parenteral verabreicht werden. Darüber hinaus muß die erfindungsgemäße Zusammensetzung den Wirkstoff nicht in Form von Polypeptiden oder Peptiden enthalten. Auch eine Verabreichung als DNA-Vakzin ist möglich, d. h. die Zusammensetzung kann den Wirkstoff in Form eines für ein α-Protein oder ein Fragment davon kodierenden Nukleinsäuremoleküls, vorzugsweise in operativer Verknüpfung mit einer im Organismus des Empfängers aktiven Expressionskontrollsequenz enthalten. Das Nukleinsäuremolekül ist vorzugsweise eine nicht in das Genom des Empfängers integrierende Nukleinsäure, z. B. ein Plasmidvektor und kann einerseits als "nackte DNA" oder andererseits in Verbindung mit geeigneten Trägersubstanzen, z. B. Liposomen, verabreicht werden (Hsu et al., (1996) Int. Immunol. 8, 1405-1411).

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein Peptid oder Peptidmimetikum als Wirkstoff gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Träger- und Hilfsstoffen enthält, wobei das Peptid oder Peptidmimetikum eine äquivalente Bindefähigkeit an MHC-Moleküle wie Peptidsequenzen eines Proteins, vorzugsweise eines α-Proteins aus Bakterien der Gattung Neisseria, oder/und damit kreuzreaktive Peptidsequenzen aus Allergenen aufweist. Eine derartige Zusammensetzung ist für eine direkte Modulation bakterieller Infektionen bzw. die Blockierung allergener Symptome insbesondere bei saisonalen Typ-I-Allergen geeignet. Vorzugsweise enthält die Zusammensetzung als Wirkstoff mindestens ein antagonistisches bzw. partiell antagonistisches Peptid, welches an die gleichen MHC-Rezeptormoleküle wie native Peptidsequenzen bindet, aber keine bzw. nur veränderte T-Zellaktivierung, z. B. verringerte Proliferation, Veränderung des Zytokinprofils etc. aufweist.

Ein erfindungsgemäßes Peptid hat vorzugsweise eine Länge von 6 bis 25 Aminosäuren, besonders bevorzugt von 8 bis 20 Aminosäuren. Weiterhin besitzt es vorzugsweise eine Homologie von mindestens 50%, besonders bevorzugt von mindestens 60% und am meisten bevorzugt von mindestens 70% zu der in Fig. 2 gezeigten Meningokokkensequenz oder/und zu den ebenfalls in Fig. 2 gezeigten Sequenzen von Allergenen.

Neben Peptidsequenzen kommen auch sog. Peptidmimetika als Bestandteile der Zusammensetzung in Betracht. Bei solchen Peptidmimetika (Feng et al., (1996) Chem. Biol. 3, 661-670) handelt es sich um synthetische Substanzen, die ähnlich den MHC-restringierten Peptidsequenzen an MHC-Moleküle binden können, wobei aufgrund der starken Wechselwirkung das MHC-Molekül für die natürlichen Peptide blockiert bleibt und somit die Stimulierung von T-Zellen unterbunden wird. Peptidmimetika können sich von Peptiden durch strukturelle Modifikationen, wie eine N-terminale Acylierung, z. B. Acetylierung, eine C-terminale Amidierung oder/und ein Ersetzen der -CONH-Bindung z. B. durch eine -CON(Alkyl)-Bindung unterscheiden. Diese Modifikationen führen zu einer höheren Resistenz gegen proteolytische Degradation unter Beibehaltung der MHC-Binde fähigkeiten (Mailiere et al., (1995) Mol. Immunol. 32, 1377-1385). Ebenso möglich sind Austausche der natürlichen Aminosäuren durch nicht natürliche Aminosäuren, z. B. D-Aminosäuren (Adams et al., (1997) Arzneim. Forsch. 47, 1069-1077). Desweiteren können Nicht-Peptid Substanzen, die irreversibel an den MHC binden und somit die Bindung des natürlichen Peptides inhibieren, über kombinatorische Chemie gefunden werden (Weiss et al., (1996) PNAS 93, 10945-10948).

Ein weiterer Vorteil dieser Peptidmimetika besteht darin, daß sie aufgrund ihres geringen Molekulargewichts in humane Zellen difundieren können und somit MHC-Dimere bereits im endoplasmatischen Reticulum binden können. Außerdem werden die Nichtpeptidsubstanzen durch zelluläre Proteasen nicht abgebaut und haben somit eine längere biologische Halbwertzeit.

Ein Testsystem zur Identifizierung antagonistischer Peptide oder Peptidmimetika ist die Modulation einer Sequenz-spezifischen T-Zell Antwort klonierter T-Zellen in vitro: Hierbei werden das natürliche Peptid und das potentiell antagonistisch wirkende Peptid bzw. Peptidmimetikum zusammen mit Antigen-präsentierenden Zellen (APC) inkubiert (die Kontrolle nur mit dem natürlichen Peptid), die Zellen dann bestrahlt und mit dem T-Zell-Klon inkubiert. Eine Proliferation der Zellen kann nach 3 Tagen über den Einbau von radioaktivem ³H-Thymidin gemessen werden. Mit der gleichzeitigen Messung von sekretierten Cytokinen kann nun die Fähigkeit des Test-Pep tides antagonistisch/partiell antagonistisch zu wirken, bestimmt werden (Matsushita und Nishimura, (1997) Mol. Immunol. 53, 73-80; Hollsberg et al., (1995) PNAS 92, 4036-4040).

Die Applikation dieser Zusammensetzung kann zusammen mit üblichen pharmazeutischen Träger- und Hilfsstoffen und gegebenenfalls auch mit Cytokinen wie etwa Interleukin-2, Interleukin-4, Interleukin-12 oder/und TGF-β erfolgen, die eine zellvermittelte Immunantwort zugunsten TH1- bzw. TH2-Zellen verschieben können.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung sind zur Herstellung eines Mittels gegen bakterielle Infektionen, z. B. bakterielle Mucosaerkrankungen oder Meningitiden oder/und gegen Allergien, z. B. saisonale Typ-I-Pollenallergie, geeignet. Die Verabreichung der Mittel führt zur Ausbildung einer Immunität gegen bakterielle Erreger oder/und zur Vermeidung einer schädigenden Immunantwort auf allergische Reize und somit zur Verringerung entzündlicher Reaktionen.

Weiterhin wird die Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele und Figuren erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 die Aminosäuresequenzen der α-Proteine von Neisseria gonorrhoae R16, MS11, N74 (Pohlner et al., (1995) Mol. Mic. 17, 1073-1083/Halter et al., (1989) EMBO J. 8, 2737-2744) und Neisseria meningitidis B1939, D1941 (Pohlner et al., (1995) Mol. Mic. 17, 1073-1083), B2b, B15, B3566, B3614, HF16, Y3576;

Fig. 2 einen Vergleich des kreuzreaktiven T-Zell-Epitops verschiedener Pollenspezies mit dem immundominanten T-Zell-Epitop der α-Proteine. Potentielle DR1-Ankerpositionen sind durch fett gedruckte Buchstaben gekennzeichnet;

Fig. 3 die Bestimmung des Gesamt-IgE-Titers und des Titers gegen Birkenpollen (Betula veruscosa) und Lieschgras-Pollen (Phleum pratensis) in einem RIA-Experiment, sowie die Darstellung des IgE-Titers gegen Rispengras-Pollen (Poa pratensis) und ein rekombinantes α-Protein des Meningokokkenstammes B2b im Westernblot. Spender FJB, RB und HG sind Atopiker. Dagegen ist Spender HAM eine gesunde Kontrollperson;

Fig. 4A) eine Charakterisierung von kreuzreaktiven T-Zell-Klonen.

B) die Proliferation der kreuzreaktiven Klone nach Stimulierung mit Antigen-gepulsten autologen PBMCs. Die Daten sind jeweils Mittelwerte aus zwei parallel angesetzten Mikrokulturen. (A) Klon 1, (B) Klon 2;

C) den Nachweis der Immundominanz der kreuzreaktiven Epitope bei einem weiteren gesunden Spender, der zum Zeitpunkt der Blutentnahmen Träger von Meningokokken war;

Fig. 5 das Ergebnis einer Suche in den Protein-Datenbanken Swissprot und Pir. Nur Proteine, die eine signifikante Homologie zu den immundominanten T-Zell-Epitopen der Pollenproteine und der α-Proteine aufweisen, sind aufgeführt.
SEQ ID NO. 1-5 die Aminosäuresequenzen der Peptide P118 (1), P120 (2), P212 (3), A5 (4) und A6 (5),
SEQ ID NO. 6-13 die Aminosäuresequenzen von Peptidepitopen aus Poa pratensis (6), Phleum pratensis (7), B. alba (8), B. mollis (9), L. perenne (10), H. lanatus (11), P. aquaticus (12) und N. meningitis (13).

Beispiele 1. Methoden 1.1

Periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) verschiedener atopischer und gesunder Spender wurden aus Heparin-stabilisiertem Blut unter Verwendung eines Standard Ficoll-Gradienten (Pharmacia) isoliert. Die PBMC wurden in RPMI-Medium supplementiert mit 5% Hitze inaktiviertem autologem Serum kultiviert. Insgesamt 1×10⁵ Zellen pro Vertiefung in 0,2 ml Kulturmedium wurden in 96 Loch-Rundbodenplatten bei 37°C in 5% CO₂ kultiviert. Zu den Kulturen wurden Peptid-Antigene in den jeweils aufgeführten Konzentrationen gegeben. Nach mehrmaliger Restimulation konnten einzelne T-Zellen über Limiting-Dilution (1 µg/ml PHA als polyklonaler Stimulator) vereinzelt werden.

Diese T-Zell-Klone wurden dann auf ihre Spezifität getestet und weiter charakterisiert. Hierzu wurden 1×10⁵ autologe PBMC für 1 bis 2 h mit den jeweiligen Antigenen inkubiert, mit 5000 rad bestrahlt und in einem Endvolumen von 0,2 ml mit 1 bis 2×10⁴ T-Zellen der Klone inkubiert. Nach 48 h wurden zellfreie Überstände gesammelt und die darin enthaltenden Cytokine durch kommerziell erhältliche Sandwich-ELISAs quantitativ bestimmt. Nach 3 d und 16 bis 22 h konnte die Proliferation anhand der (³H)-Thymidin-Einbaurate in einem Betaplate-Counter gemessen werden. Der Stimulationsindex wurde berechnet, indem die gemittelten cpm-Werte der Ansätze mit Antigen durch die gleichfalls gemittelten cpm-Werte ohne Antigen (Medium-Kontrolle) geteilt wurden.

Zur Charakterisierung der Klone wurden die T-Zellen geerntet, gewaschen und mit Fluoreszenzfarbstoff-markierten monoklonalen Antikörpern gegen die Oberflächenmoleküle CD3 und CD4 markiert. Diese markierten Zellen wurden mittels Durchflußcytometrie (FACScalibur, Becton Dickinson) analysiert.

1.2

Rekombinantes α-Protein von Neisseria meningitidis B2b und der wäßrige Extrakt von Poa pratensis-Pollen wurde zuerst in einem 12,5%igem SDS-PAGE aufgetrennt und dann auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Nach Beendigung des Transfers wurde die Membran zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen für 1 h mit 1×TBS, 5% Milchpulver blockiert, über Nacht mit den humanen Seren (Verd. 1 : 5 bzw. 1 : 10) und anschließend mit einem anti-IgE-Antikörper-Peroxidase (HRP)-Konjugat inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit 1×TBS, 0,1% Tween 20 wurde der Blot mit den Chemikalien eines ECL-Kits durch eine Lichtreaktion entwickelt.

1.3

Die quantitative Bestimmung der IgE-Titer wurde mit dem CAP-System von Pharmacia nach Liappis und Starke (Allergol. 20 (1995), 291-295) durchgeführt.

1.4

Alle Homologie-Suchen wurden mit den jeweils neuesten Ausgaben der Protein-Datenbanken SwissProt und Pir unter dem GCG-Programm durchgeführt (August 1997). Die für diese Suchen verfügbaren Algorithmen waren fasta, blast und wordsearch.

2. Ergebnisse 2.1

In allen pathogenen Neisserien-Stämmen konnte ein α-Protein nachgewiesen werden. Obwohl diese Proteine einen ausgeprägten Polymorphismus aufweisen, besitzen sie mehrere konservierte Eigenschaften (Fig. 1). Eine amphipatische Coiled-Coil ausbildende Domäne ist mit gegenläufigen Pfeilen überstrichen. Unterstrichen sind Varianten eines repetitiven Sequenzmotivs, in dem sich das immundominante T-Zell-Epitop befindet. Grau unterlegt sind die stark basischen Domnen. Der konservierte N-Terminus und der basische C-Terminus aller α-Proteine ist jeweils umrahmt. Die Positionen der Aminosäuren beziehen sich auf ihre relative Position zu dem B1939 α-Protein.

Fig. 2 zeigt eine Zusammenstellung von Sequenzen eines allergenen T-Zell-Epitops, das in verschiedenen Pflanzenpollen vorkommt. Es handelt sich hierbei um ein immundominantes Epitop, das von ungefähr 40% der Pollen-Aller giker erkannt wird (Schenk et al., (1995) J. Aller. Clin. Imm. 96, 986-996). Interessanterweise hat gerade diese Sequenz der Pollenallergene signifikante Übereinstimmungen zu dem beschriebenen T-Zell-Epitop der neisseriellen α-Proteine.

2.2

In Seren von Atopikern wurde ein Titer von spezifischen IgE-Antikörpern gegen das α-Protein nachgewiesen. Hingegen lagen im Serum der gesunden Kontrollperson HAM keine spezifischen IgE-Antikörper gegen das α-Protein vor (Fig. 3).

2.3

Es gelang bei einem atopischen Spender zwei kreuzreaktive T-Zell-Klone zu isolieren und weiter zu charakterisieren (Fig. 4A). Diese T-Zell-Klone konnten sowohl durch ein allergenes Pollen-Epitop (P118, Poa pratensis), als auch das neisserielle Epitop des rekombinanten aB2b Proteines (P121, N. me. B2b) aktiviert werden. Ein stabiler Klon gehörte dem THO-Typ an, der andere war ein TH2-Klon. Es ist allgemein bekannt, daß dieser Subtyp nur durch Allergene und nicht durch bakterielle Protein-Sequenzen spezifisch aktiviert wird. Darüber hinaus reagierten beide T-Zell Klone sogar auf eine weitere Peptid-Sequenz (Fig. 4B). Dieses Epitop (A5) stammt von einem Protein aus Pseudomonas aeruginosa, einem weit verbreiteten humanpathogenen Keim. Aufgrund der großen Übereinstimmung der drei Peptid-Epitope war man in der Lage, umfangreiche Datenbanksuchen nach ähnlichen Motiven durchzuführen. Schließlich konnten weitere 18 homologe Sequenzen gefunden werden (Fig. 5). Die Austestung eines weiteren Peptids aus dieser Serie, das Parvalbumin-Peptid (A6) aus Gadus callaris, führt allerdings zu keiner Proliferation der isolierten T-Zell-Klone (Fig. 4B). Die Sequenzen der in diesem Beispiel verwendeten Peptide bzw. Polypeptide waren wie folgt:

2.4

Aufgrund der vorliegenden Daten kann folgende Aussage getroffen werden:
Es gibt eine eindeutige Beziehung zwischen den Epitopen aus Umweltantigenen, Autoantigenen und bakteriellen Proteinen (u. a. neisserielles α-Protein), die durch ihre immunogene Ähnlichkeit zu einer Anreicherung allergener T-Zellklone führen. Trotz der immunogenen Ähnlichkeit dieser Epitope werden Unterschiede in der Stimulation der Immunantwort offenbart, die wahrscheinlich mit der individuellen MHC-Restrikion zusammenhängen. Hierdurch wird erstmalig eine schlüssige Erklärung zur Pathogenese der oft zu chronischem Asthma führenden Typ-I-Aller gien (Heuschnupfen, etc.) präsentiert. Die identifizierten homologen Sequenzen und die gezeigte Kreuzreaktivität der etablierten allergenen T-Zell-Klone sind ein Indiz dafür, daß die Auslösung und Aufrechterhaltung einer Pollenallergie Ausdruck einer ganzjährigen kreuzreaktiven T-Zell-Memory ist, die durch latente bakterielle Infektionen stimuliert wird (Molekulares Mimicry).

Der allergische Spender (Atopiker HG, Fig. 4), dessen Klone hier beschrieben sind, wurde nachträglich MHC-typisiert. Es ergab sich folgender homozygoter Haplotyp: DR4/DRw53, DRB1(0401) und DRB4(0101). Die Identifizierung einer potentiellen MHC-Restriktion erlaubt die Herstellung maßgeschneiderter Substanzen, die antagonistisch bzw. teilweise antagonistisch wirken.

2.5

Die α-Proteine pathogener Neisserien können allergenspezifische T-Zell-Klone aktivieren, was zur Sekretion großer Mengen an IL-4, aber nur geringer Mengen an IFNγ führt. Mit diesem immundominanten T-Zell-Epitop lassen sich auch bei gesunden Personen T-Zell-Klone zur Proliferation stimulieren.

Der α-Protein-Anteil des IgA-Protease-Vorläuferproteines spielt somit eine wichtige Rolle bei der Entstehung bzw. Aufrechterhaltung bestimmter Typ-I-Aller gien und ist vermutlich direkt an der Ausbildung allergischer Symptome während der Kolonisation des oberen respiratorischen Traktes beteiligt.

Sequenzprotokoll

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie mindestens

(a) ein α-Protein oder ein Fragment davon oder/und
(b) ein dafür kodierendes Nukleinsäuremolekül
als Wirkstoff gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Träger- und Hilfsstoffen enthält.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das α-Protein ausgewählt ist aus natürlichen und rekombinanten α-Proteinen.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das α-Protein ausgewählt ist aus α-Proteinen der Gattungen Neisseria, Heamophilus und Streptococcus.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie in der Lage ist, die Bildung von Antikörpern zu induzieren.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie in der Lage ist, eine zelluläre Immunantwort zu induzieren.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein Peptid oder Peptidminimetikum als Wirkstoff gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Träger- und Hilfsstoffen enthält, wobei das Peptid oder Peptidmimetikum eine äquivalente Bindefähigkeit an MHC-Moleküle wie Peptidsequenzen eines α-Proteins oder/und damit kreuzreaktive Peptidsequenzen aus Allergenen aufweist.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide eine Länge von 6 bis 25 Aminosäuren aufweisen.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide eine Homologie von mindestens 50% zu einer der in Fig. 2 gezeigten Peptidsequenzen aufweisen.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide oder Peptidmimetika die Wechselwirkung natürliche Peptide mit MHC-Molekülen mindestens teilweise blockieren.

10. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Mittels gegen bakterielle Infektionen.

11. Verwendung nach Anspruch 10 zur Herstellung eines Mittels gegen bakterielle Meningitiden. 12. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Mittels gegen Allergien.

13. Verwendung nach Anspruch 10 zur Herstellung eines Mittels gegen saisonale Typ-I-Pollenallergien.