DE69022106T2

DE69022106T2 - Pertussistoxin-Mutanten, dieselbe produzierende Bordetella-Stämme und ihre Verwendung als Vakzin gegen Pertussis.

Info

Publication number: DE69022106T2
Application number: DE69022106T
Authority: DE
Inventors: Antonello Covacci; Luciano Nencioni; Mariagrazia Pizza; Rino Rappuoli
Original assignee: Sclavo SpA
Current assignee: Sclavo SpA
Priority date: 1989-04-28
Filing date: 1990-04-25
Publication date: 1996-02-15
Anticipated expiration: 2010-04-26
Also published as: US7666436B1; ES2078258T3; JP2852025B2; CA2015677C; CA2015677A1; ATE127347T1; US7427404B1; GR3018285T3; JP2655583B2; DK0396964T3; JPH03169825A; JPH09163978A; EP0396964B1; EP0396964A1; DE69022106D1; HK17096A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue immunologisch aktive Pertussistoxin- Stämme mit verringerter oder keiner Toxizität, die Pertussistoxin-Mutanten produzieren und sezernieren können, Mittel und Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Entwicklung von wirksamen anti-Pertussis-Impfstoffen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner als anti-Pertussis-Impfstoffe verwendbare immunogene Formulierungen, die als aktiven Bestandteil mindestens eine immunogen aktive Pertussistoxin-Mutante mit verringerter oder keiner Toxizität, die mit Formaldehyd behandelt sein kann, einen Bordetella-Stamm, der diese Mutante produzieren und sezernieren kann, oder einen (Δtox)-Bordetella-Stamm, der kein Pertussistoxin produzieren kann, enthalten.
An Pertussis, einer bakteriellen Infektionskrankheit, die durch Keuchhusten und ernste Atemwegsbeschwerden charakterisiert ist, erkranken Individuen aller Altersgruppen, und in den ersten Lebensjahren sterben 0,5 % der Infizierten.
Bordetella pertussis (B. pertussis), das der ätiologische Wirkstoff von Pertussis ist, produziert während der virulenten Phase (Phase I) mehrere Toxine, von denen das Pertussistoxin (PT) nicht nur das krankheitsauslösende Hauptpathogen, sondern auch das Hauptimmunogen ist.
PT, das die Struktur eines aus fünf unterschiedlichen Untereinheiten (S1, S2, S3, S4 und S5) bestehenden Hexamers aufweist, kann in Versuchstieren einen für einen Schutzes gegen Pertussis ausreichenden Antikörpertiter induzieren.
Eine Infektion kann durch Immunisierung eines Individuums mit einem geeigneten Impfstoff unter Kontrolle gebracht werden.
Gegenwärtig wird ein zellulärer Impfstoff verwendet, der aus vollständigen Zellen von mit Merthiolat behandelten und bei 56ºC abgetöteten, virulenten B. pertussis besteht.
Obwohl dieser Imstoff eine Schutzimmunität verleiht, kann er jedoch unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen, die von einer einfachen Pompholyx, einem Erythem, und Fieber bis zu Krämpfen und Hirnschäden reichen. Daher ging die Verwendung dieses Impfstoffs in den letzten Jahren stark zurück, was ein neues Ausbrechen der Krankheit bewirkt hat.
In der Fachwissenschaft wurden daher azelluläre Impfstoffe vorgeschlagen, die aus einem oder mehreren antigenen toxischen Proteinen bestehen, die von virulenten B. pertussis produziert und sezerniert werden und die mit unterschiedlichen Chemikalien, beispielsweise Formaldehyd (Sato et al., Infect. Immun. 41 (1983), 313- 320), Glutaraldehyd (Quentin-Millet et al., J. Bio. Stand., 16 (1988), 99-108), Tetranitromethan (Siber et al. und Windberry et al., International Workshop of Bordetella pertussis, Hamilton, MO, (1988)), Trinitrobenzolsulfonsäure (Fisch et al., Infect. Immun. 44 (1984), 1-16) und Wasserstoffperoxid (Sekura et al., Infect. Immun. 113 (1983), 806-813), entgiftet worden sind.
Diese Entgiftungsverfahren weisen jedoch die nachstehend beschriebenen Nachteile auf:
1) Reversion der Proteintoxizität. Azelluläre Impfstoffe, die nur aus mit Formaldehyd entgiftetem PT oder aus PT und filamentösem Hämagglutinin (FHA), die beide mit Formaldehyd behandelt worden sind (Y. Sato et al., Lancet 1 (1984), 122- 126), bestehen, können zwar 80 % der Kinder gegen die Krankheit und 50 bis 60 % gegen eine Infektion schützen ("Ad hoc Group for the Study of Pertussis Vaccines", Lancet 1 (1988), 959-960), zeigen jedoch eine Reversion der Toxizität (J. Sortsaeter et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 7 (1988), 637-645).
2) Verringerung der Immunogenität der antigenen Proteine aufgrund der im Entgiftungsstadium erforderlichen strengen Bedingungen,
3) keine Reproduzierbarkeit der entgifteten Produkte,
4) Notwendigkeit von längere Zeit in Anspruch nehmenden Tests zur Ermittlung der Reversion in jeder Präparation und schließlich
5) Risiken beim Umgang mit großen Mengen toxischen Materials für die Personen, die derartige antigene Proteine herstellen.
Die Toxizität des Pertussistoxins wird durch die ADP-Ribosyltransferaseaktivität seiner S1-Untereinheit vermittelt. Um Moleküle mit einer im Vergleich zum Wildtyp-Pertussistoxin (PT) veränderten Toxizität zu erhalten, die zur Präparation von Pertussis-Impfstoffen ohne die vorstehend beschriebenen Nachteile verwendet werden können wurde eine Reihe von Deletionsmutanten des N-terminalen und/oder C- terminalen Teils von S1 konstruiert und in Escherichia coli (E. coli) exprimiert, sowie eine Reihe von zu S1 analoge Peptide, die in ihrer Sequenz eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen enthielten, wie es in der EP-A-0 322 533 offenbart ist.
Dazu wurde das die Untereinheit S1 von PT codierende DNA-Fragment durch stellenspezifische Mutagenese modifiziert, so daß es eine Untereinheit codierte, die an spezifischen Stellen einen anderen Aminosäurerest als in PT enthielt. Die durch Züchtung dieser veränderten E. coli-Stämme erhaltenen Peptide zeigten im Hinblick auf die entsprechenden Pertussistoxin-Peptide eine veränderte Toxizität. Die Expression derartiger Peptide lieferte jedoch Proteine, die an die 98 Aminosäuren aufweisende aminoterminale Sequenz der Bakteriophagen MS2-Polymerase fusioniert waren.
Bei einem in vivo-Test (Mäuse) konnten diese Peptide ferner keine schützenden anti-Pertussis-Antikörper induzieren, da sie wahrscheinlich nicht die gleiche, im nativen Molekül vorhandene strukturelle Konformation aufwiesen. Daher sind Verfahren unter Verwendung von Wirtsmikroorganismen, beispielsweise E. coli, die durch DNA- Rekombinationsverfahren verändert wurden, um heterologe Proteine zu erhalten (das heißt, Proteine, die von diesen Wirtsstämmen normalerweise nicht produziert werden), zur Herstellung von Produkten mit den gewünschten immunogenen Eigenschaften anscheinend nicht geeignet.
Pizza et al. (PNAS USA 85 (1988), 7521-7525) beschreiben die Mutation der Pertussis-S1-Einheit durch eine C- und N-terminale Deletion und durch stellenspezifische Mutagenese an einzelnen und mehreren Stellen zur Produktion von nicht-toxischen Mutanten.
Barberi et al. (Inf. Imm. 56(8) (1988), 1934-1941) beschreiben einzelne Substitutionen der Aminosäuren Asp11, Arg13, Trp26 und Glu139 der S1-Untereinheit, wobei jeweils die enzymatische Aktivität der Untereinheit verringert wird.
EP-A-0 306 318 offenbart Mutationen im Bereich der S1-Untereinheit, die durch Val7 und Pro14 begrenzt werden.
EP-A-0 322 115 (die zum Prioritätsdatum dieser Anmeldung unveröffentlicht war) offenbart verschiedene einzelne und mehrfache Aminosäuresubstitutionen in der S1-Einheit, die die Toxizität angeblich verringern.
EP-A-0 047 802 offenbart die Verwendung von Formaldehyd zur Entgiftung des Pertussistoxins.
Ein erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung von Immunogenen, die zur Herstellung von anti-Pertussis-Impfstoffen, die nicht die Nachteile der im Stand der Technik bekannten Verfahren aufweisen, geeignet sind.
Dazu werden erfindungsgemäß neue Bordetella-Stämme, die Pertussistoxin- Mutanten mit reduzierter oder keiner Toxizität exprimieren und sezernieren können, bereitgestellt.
Ein erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft daher die Bereitstellung von immunogen aktiven Mutanten mit verringerter oder keiner Toxizität, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Aminosäuresequenz der S-Untereinheit an spezifischen Stellen einen oder mehrere deletierte Reste oder durch eine andere Aminosäure substituierte Reste aufweist.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft immunogen aktive Pertussistoxin-Mutanten mit keiner oder verringerter Toxizität, die durch ihre thermische Stabilität und durch verringerte oder fehlende mitogene und Hämagglutinationseigenschaften, die durch eine Behandlung mit 0,035 bis 0,420 Gew./Vol.-% Formaldehyd erhalten werden, gekennzeichnet sind.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft Bordetella-Stämme, die immunogen aktive Pertussistoxin-Mutanten mit einer verringerten oder keiner Toxizität produzieren und sezernieren können.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ein Verfahren zur Herstellung derartiger Bordetella-Stämme.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ein die Züchtung derartiger mutierter Bordetella-Stämme unter geeigneten Bedingungen umfassendes Verfahren zur Herstellung von immunogen aktiven Pertussistoxin-Mutanten mit verringerter oder keiner Toxizität.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Verwendung von Bordetella-Stämmen, die immunogen aktive Pertussistoxin-Mutanten mit verringerter oder keiner Toxizität produzieren und sezernieren können, und/oder (Δtox)-Bordetella- Stämme, die das Pertussistoxin nicht produzieren können, zur Herstellung von wirksamen zellulären anti-Pertussis-Impfstoffen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Verwendung von immunogen aktiven Pertussistoxin-Mutanten mit verringerter oder keiner Toxizität, die gegebenenfalls mit Formaldehyd zur Präparation von wirksamen azellulären anti- Pertussis-Impfstoffen behandelt werden.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ferner als anti- Pertussis-Impfstoffe geeignete immunogene Formulierungen, die in Menschen eine wirksam schützende Antwort gegen Infektionen durch virulente B. pertussis induzieren können, wobei sie eine immunogen wirksame Menge eines Bordetella-Stamms, wie vorstehend beschrieben, enthalten.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ferner als anti- Pertussis-Impfstoffe geeignete immunogene Formulierungen, die in Menschen eine wirksam schützende Antwort gegen Infektionen durch virulente Bordetella pertussis induzieren können, wobei sie eine immunogen wirksame Menge einer gegebenenfalls mit Formaldehyd behandelten immunogen aktiven Pertussistoxin-Mutante mit verringerter oder keiner Toxizität enthalten.
Weitere erfindungsgemäße Gesichtspunkte werden durch die Lektüre der nachstehenden Beschreibung und der nachstehenden Beispiele deutlich.
Erfindungsgemäß wird eine immunologisch aktive Pertussistoxin-Mutante mit verringerter oder keiner Toxizität bereitgestellt, die dadurch gekennzeichnet ist, daß der Aminosäurerest Glu129 und ein Aminosäurerest oder eine Kombination von Resten, die aus Arg9, Asp11, Arg13, Trp26, Phe50, Gly86, IleBB/Tyr89, Asp11/Trp26, Asp11/Phe50, Arg13/Trp26, Arg13/Phe50 und Tyr8/Arg9 ausgewählt sind, deletiert oder durch einen anderen Aminosäurerest, der aus der Gruppe der natürlichen Aminosäuren ausgewählt ist, ersetzt sind, wobei Mutanten ausgeschlossen sind, die eine Arg9- oder Arg13-Deletion aufweisen oder in denen Arg9 oder Arg13 durch Glu in Kombination mit einer Glu129 oder Glu129/Tyr130-Substitution ersetzt sind.
Bevorzugte erfindungsgemäße Pertussistoxin-Mutanten sind dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest Glu129 und mindestens einer der Aminosäurereste Arg9, Asp11, Asp13 und Trp26 deletiert oder durch einen anderen, aus natürlichen Aminosäuren ausgewählten Aminosäurerest ersetzt sind.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft die Pertussistoxin-Mutanten, die die in Tabelle II, Spalte 1, dargestellten Aminosäuresubstitutionen aufweisen, wobei
- in der ersten Reihe der Name des mutierten Proteins,
- in der zweiten Reihe die Art der durchgeführten Mutation und
- in der dritten Reihe die für die Mutation verwendete Nucleotidsequenz dargestellt sind.
Besonders bevorzugt sind dabei die Pertussistoxin-Mutanten mit den nachstehenden Bezeichnungen
PT28G (PT-129G), L9/28G (PT-9K/129G), L13/28G (PT-13L/129G), 126/28G (PT-26I/129G), L13/I26/28G (PT-13L/26I/129G), PT-88E/89S und E88/S89/28G (PT-88E/89S/129G).
PT-Mutanten mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften werden erfindungsgemäß erhalten, indem Bordetella-Stämme gezüchtet werden, die ein PT codierendes chromosomales, aus B. pertussis isoliertes Gen enthalten, das durch stellenspezifische Mutagenese oder Deletion von Nucleotiden an einer oder mehreren spezifischen Stellen der die S1-Untereinheit codierenden Nucleotidsequenz mutiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden diese Bordetella-Stämme durch ein Verfahren erhalten, das die nachstehenden Schritte umfaßt.
a) Selektion von Wildtyp-Bordetella-Stämmen, die mindestens eine Antibiotika-Resistenz aufweisen,
b) Substitution des das Pertussistoxin codierenden chromosomalen Gens gegen ein anderes Protein codierendes Gen in den in a) erhaltenen Stämmen durch homologe Rekombination,
c) Selektion von Bordetella-Stämmen, denen das in b) erhaltene PT (Δtox)- Gen fehlt,
d) Mutation des aus B. pertussis isolierten Pertussistoxin-Gens,
e) Einführung des mutierten Gens in ein in Bordetella nicht replizierbares, in geeigneter Weise modifiziertes Plasmid,
f) Einführung dieses Plasmids in die in c) selektierten Bordetella (Δtox)- Stämme durch Konjugation und schließlich
g) Isolierung von Bordetella-Stämmen, in denen eine homologe Rekombination mit dem mutierten Pertussistoxin-Gen erfolgt ist.
Erfindungsgemäße Wildtyp-Bordetella-Stämme werden aus den Arten B. pertussis, B. parapertussis und B. bronchiseptica ausgewählt. Obwohl die letzten beiden das Pertussistoxin-Operon aufweisen, produzieren sie das Toxin normalerweise nicht, da ihnen ein funktioneller Promotor fehlt.
In Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden den Bordetella- Stämmen zur Erleichterung der Selektion der mutierten Stämme eine oder mehrere Antibiotika-Resistenzen verliehen.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden diesen Bordetella- Stämmen Nalidixinsäure (nal)- und Streptomycin (str)-Resistenzen verliehen.
In Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch homologe Rekombination die Substitution des PT-codierenden chromosomalen Gens, das in den in a) erhaltenen Stämmen enthalten ist, gegen ein ein anderes Protein als PT codierendes Gen, beispielsweise einer Kanamycin-Resistenz (kan), durchgeführt. Die Rekombination kann unter Verwendung von üblichen bekannten Verfahren und unter Verwendung eines in Bordetella nicht replizierbaren Plasmids durchgeführt werden. Vorzugsweise wird das Plasmid pRTP1 verwendet, dessen Konstruktion S. Stibitz et al. (Gene 50 (1986), 133- 140) beschreiben.
Dieses Plasmid kann durch Konjugation mit zwei Bestandteilen unter Verwendung eines E. coli-Stamms oder mit drei Bestandteilen unter Verwendung eines ein sogenanntes Helfer-Plasmid enthaltenden E. coli-Stamms in Bordetella eingeführt werden. Das pRTP1-Plasmid wird erfindungsgemäß mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und anschließend mit einem EcoRI-DNA-Fragment ligiert, das das Gen enthält, das ein anderes Protein als PT codiert und die Nucleotidsequenzen umfaßt, die den im PT101-ATCC-67854-Plasmid enthaltenden Bereichen 1 bis 420 und 3625 bis 4696 des B. pertussis PT-Gens entsprechen. E. coli-Zellen werden anschließend mit dem erhaltenen Plasmid transformiert und die Transformanten unter Verwendung von üblichen Verfahren selektiert.
Die so selektierten positiven Clone werden anschließend mit den in a) erhaltenen Bordetella-Stämmen konjugiert, die zuvor etwa 48 Stunden bei 37ºC auf Bordet- Gengou (BG)-Medium gezüchtet wurden. Die Konjugation wird mit üblichen Verfahren auf BG Medium 3 bis 6 Stunden bei 37º C unter Zugabe von 10 mM MgCl&sub2; durchgeführt.
Im Stadium c) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Bordetella- Stämme, in denen die homologe Rekombination auf chromosomaler Ebene stattgefunden hat, auf geeignete Antibiotika enthaltendem GB-Selektivmedium selektiert. Wenn nal- und str-resistente Bordetella-Stämme verwendet werden und das sich von PT unterscheidende Gen das Kanamycin-Gen ist, werden dem Medium die Antibiotika nal, str und kan zugesetzt.
Auf diesem Medium wachsen Stämme (resistent gegen drei Antibiotika), in denen das PT-Gen durch das Kanamycin-Gen vollständig ersetzt ist und die das pRTP1- Plasmid, das die Empfindlichkeit für Streptomycin verleiht, verloren haben.
Zum Nachweis derartiger Substitutionen wurden diese Stämme, die nachstehend durch (Δtox) dargestellt sind, mittels Southern-Blot (E. Southern, J. Mol. Biol., 98 (1975), 503-517), ELISA-Test (K.H. Wong und S. K. J. Skelton, Clinical Microbiol. Bd. 26 (1988), 1316-1320) und Toxizitätstest an CHO-Zellen (E. L. Hewlett et al., Infect. Immun. 40 (1983), 1198-1230) charakterisiert.
Die Ergebnisse zeigten:
a) Die Gegenwart von chromosomaler DNA eines Nucleotidfragments mit einem Molekulargewicht, das geringer als das des PT-Gens ist, in den (Δtox)-Stämmen, das sowohl mit diesem Gen als auch mit seinem Substituenten (Kanamycin-Gen) hybridisiert.
b) Keiner der (Δtox)-Stämme konnte das Pertussistoxin in einer durch den ELISA-Test nachweisbaren Menge produzieren und sezernieren.
c) Die Toxizität, die unter Verwendung des 1:10 verdünnten Überstandes von Bordetella (Δtox) ermittelt wurde, war zur Modifikation des Wachstums von CHO- Zellen unzureichend. Eine geringe, nicht-spezifische Toxizität wurde bei Verwendung des reinen Überstandes beobachtet.
Zur Gewährleistung der Fähigkeit dieser (Δtox)-Stämme zur Verleihung eines Schutzes gegen virulente B. pertussis wurde ein intrazerebraler Immunisierungstest, wie in "21/PAR7620.4 CODE OF FEDERAL REGULATIONS, Potency test of pertussis vaccine" beschrieben, durchgeführt. Die erhaltenen, in Beispiel 1 beschriebenen Ergebnisse zeigen, daß diese Stämme, obwohl sie das PT-codierende Gen nicht mehr aufwiesen, noch einen ausgezeichneten Schutz gegen intrazerebrale Infektionen durch virulente B. pertussis induzieren konnten.
In Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde die Konstruktion des mutagenisierten PT-Gens durch Deletion oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide in bestimmten Positionen der Nucleotidsequenz, die die S1-Untereinheit des das B. pertussis PT codierenden Gens codiert, das im Plasmid PT101 ATCC 67854 enthalten ist, durch eine stellenspezifische Mutagenese durchgeführt.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft die Konstruktion von PT- Genen, die die in Tabelle II dargestellten Mutationen enthalten, wobei die in Reihe 3 der ersten Spalte aufgeführten Nucleotidsequenzen verwendet wurden.
In Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden die in Stadium d) erhaltenen mutierten Gene in ein in Bordetella nicht replizierbares Plasmid cloniert.
Dazu wurde Plasmid pRTP1 verwendet, das durch Insertion in die BamHI- Restriktionsstelle des Gens, das die Gentamycin-Resistenz oder die Tetracyclin-Resistenz codiert (beide im Handel erhältlich), modifiziert wurde. Die Clonierung derartiger Gene wurde durch ein üblicherweise in der Gentechnik verwendetes bekanntes Verfahren durchgeführt. Die neuen Vektoren, die als pRTPG1 bzw. pRTPT1 bezeichnet werden, wurden zur Insertion des mutierten PT-Gens in das Chromosom der Bordetella-(Δtox)- Stämme verwendet.
Insbesondere wurden die mutierten Gene in die Plasmide pRTPG1 und pRTPT1 cloniert und die erhaltenen rekombinanten Plasmide durch Transformation in E. coli-Zellen eingeführt. Die Transformanten wurden, wie beschrieben, mit (Δtox)- Bordetella-Stämmen konjugiert.
In der Erfindung kann der von R. Simon et al., Biotech 1 (1983), 784-791, beschriebene Stamm E. coli SM10 verwendet werden.
Schließlich wurden in Schritt g) des erfindungsgemäßen Verfahrens Bordetella-Stämme, die in ihrem Chromosom das mutierte PT-Gen enthalten, selektiert.
Insbesondere wurde zunächst auf Bordetella-Stämme, die das in das Chromosom integrierte rekombinante Plasmid enthalten, selektiert, indem auf BG- Medium, dem nal und Gentamycin oder nal und Tetracyclin zugesetzt worden ist, gezüchtet wurde. Anschließend wurde auf Stämme, die dieses Plasmid verloren haben, selektiert, indem auf str enthaltendem BG-Medium gezüchtet wurde. Schließlich wurden die auf diesem Medium wachsenden Kolonien isoliert und auf nal, str und kan oder nal und str enthaltendem BG-Medium gezüchtet. So wurden auf diesem letzten Medium Bordetella-Kolonien selektiert, die aufgrund der Substitution des kan-Gens durch das mutierte PT-Gen den Kanamycin-Resistenz-Phänotyp verloren haben.
Zur Sicherstellung der Fähigkeit dieser Bordetella-Stämme zur Expression und Sekretion der vom mutierten chromosomalen Gen codierten PT-Mutanten wurden einige dieser Stämme in einem geeigneten Medium gezüchtet, beispielsweise in einem Medium mit der in Beispiel 1 beschriebenen Zusammensetzung. Die Produktionsdaten zeigten:
1) Die B. pertussis-Stämme produzierten die PT-Mutanten in Mengen, die den durch Züchtung der gleichen Wildtyp-Stämme erhaltenen entsprechen,
2) die B. bronchiseptica- und B. parapertussis-Stämme, die normalerweise kein PT-Toxin produzieren, können es überraschenderweise produzieren und in das Kulturmedium sezernieren und
3) der B. parapertussis-Stamm produziert PT in größeren Mengen als B. pertussis.
Diese Ergebnisse zeigten, daß die Substitution des inaktiven Promotors, der in diesen Wildtyp-Bordetella vorhanden war, durch einen effizienten Promotor, beispielsweise den des B. pertussis-PT, die Expression von PT oder dessen Mutanten in diesen Stämmen ermöglichte.
Die wie vorstehend beschrieben erhaltenen PT-Mutanten werden erfindungsgemäß aus zellfreiem Medium unter Verwendung von Reinigungsverfahren gereinigt, die aus Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise das von R. D. Sekura et al., J. Biol. Chem. 258 (1983), 14647-14651, beschriebene Verfahren, ausgewählt werden.
Die physikalisch-chemischen, biologischen und immunologischen Eigenschaften von bestimmten PT-Mutanten wurden erfindungsgemäß in vitro und in vivo ermittelt.
Im Hinblick auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften zeigte eine Analyse durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) die Abwesenheit von verunreinigenden Proteinen und ein dem PT entsprechendes Muster, während die Analyse der Aminosäuren eine Aminosäurezusammensetzung zeigte, die mit den auf der Basis der bekannten Aminosäuresequenz vorhergesagten Werten übereinstimmte.
Ferner wurde die Abwesenheit von 2,6-O-Dimethyl-beta-cyclodextrin unter Verwendung des von J. G. Beley (1985), "Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology", R. H. Burdon und P. H. Van Knippennberg (Hrsg.) Elsevier, Bd. 16, beschriebenen Verfahrens bestätigt. Die Abwesenheit von Fetuin, des 69 kD- Proteins und von filamentösem Hämagglutinin, die mögliche Kontaminationen von azellulären anti-Pertussis-Impfstoffen darstellen, wurde durch eine Western-Blot-Analyse (H. T. Towbin et al., PNAS USA 73 (1976), 361-365) unter Verwendung von für derartige Proteine spezifischen Antikörpern bestätigt. Schließlich wurde die Abwesenheit des thermonekrotischen Toxins unter Verwendung des von K. T. Kime et al. (Infect. Immun. 52 (1986), 370-377) beschriebenen Tests mit Meerschweinchen bestätigt, während die Abwesenheit von Cyclodextrin, das der Hauptbestandteil des Kulturmediums ist, durch Dünnschichtchromatographie nachgewiesen wurde.
Das Fehlen oder die Verringerung der Toxizität der erfindungsgemäßen PT- Mutanten wurden durch unterschiedliche experimentelle Systeme in vitro und in vivo ermittelt.
Die Ergebnisse, die im Toxizitätstest mit CHO-Zellen (Eierstockzellen des chinesischen Hamsters) erhalten wurden, zeigten im Vergleich zum nativen PT eine um das 10 bis 1 000 000fache verringerte bzw. eine fehlende Toxizität. Insbesondere wurden die besten Ergebnisse unter Verwendung von PT-129G-, PT-9K/129G-, PT- 13L/129G-, PT-26I/129G-, PT-13L/26I/129G-, PT-88E/89S- und PT-88E/89S/129G- Mutanten erhalten.
Ferner wurde in keinem der anderen Tests eine Toxizität des Produkts beobachtet, wenn Maximaldosen verwendet wurden.
Diese Ergebnisse bestätigen, daß alle toxischen PT-Aktivitäten durch die ADP-Ribosyltransferaseaktivität seiner S1-Untereinheit bewirkt werden.
Die einzigen Aktivitäten der PT-Mutanten, die nicht durch die genetischen Manipulationen der S1-Untereinheit verändert wurden, waren die Mitogenität für Zellen und die Fähigkeit zur Hämagglutination, die dem Molekül bekanntermaßen durch die Gegenwart des B-Oligomers verliehen werden.
Tatsächlich bestätigen erfindungsgemäße, nur dieses Oligomer (in Tabelle II mit B angezeigt) sezernierende Bordetella-Stämme, die in vitro auf das Vorhandensein einer mitogenen Aktivität getestet wurden, diese im Stand der Technik bekannte Lehre.
Obwohl die Bedeutung einer derartigen Aktivität in vivo noch unklar ist, kann man davon ausgehen, daß sie minimal sein oder fehlen sollte, da zum Erhalt einer feststellbaren mitogenen Wirkung in vitro hohe Konzentrationen (0,3 bis 1,0 ug/ml) erforderlich sind. Derartige Konzentrationen sind nur an der Stelle der Impfstoffinokulierung vorhanden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden die immunogenen Eigenschaften der PT-9K/129G-Mutante in vivo getestet, wie es in den nachstehenden Beispielen, die jedoch nicht als Einschränkung zu betrachten sind, beschrieben ist. Die Ergebnisse zeigten, daß diese Mutante die Bildung von anti-PT-Antikörpern mit hohen Antikörpertitern induzieren kann und diese Antikörper die toxische Wirkung von PT auf CHO-Zellen neutralisieren können.
Daher ist der Schluß zulässig, daß die zur Konstruktion des mutagenisierten PT-Gens durchgeführten genetischen Manipulationen die typischen immunogenen Eigenschaften des Pertussistoxins nicht verändern und daß im Unterschied zu im Stand der Technik bekannten Darstellungen diese Eigenschaften unabhängig von der enzymatischen Aktivität der PT-S1-Untereinheit sind.
Die Bordetella-Stämme und die enzymatisch inaktiven PT-Mutanten (mit verringerter oder keiner Toxizität), die erfindungsgemäß erhalten wurden, sind daher ausgezeichnet zur Entwicklung von wirksamen anti-Pertussis-Impfstoffen geeignet.
Erfindungsgemäß können als anti-Pertussis-Impfstoffe geeignete immunogene Formulierungen durch Zugabe dieser Stämme oder der von ihnen produzierten Mutanten zu einem pharmazeutisch verträgliclien Träger, wie er üblicherweise als Vehikel für immunogene Materialien in einem Patienten verwendet wird, hergestellt werden. Ein derartiger Träger ist beispielsweise Kochsalzlösung. Das Antigen kann im Träger gelöst oder suspendiert vorhanden sein. Derartige Formulierungen können ferner zur Stimulierung der Immunantwort und daher zur Verbesserung der Wirksamkeit des Impfstoffs ein Adjuvans umfassen. Geeignete Adjuvanzien schließen beispielsweise Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid, Interleukin-1 oder -2 oder deren Peptidfragmente ein.
Als anti-Pertussis-Impfstoffe geeignete immunogene Formulierungen enthalten üblicherweise eine Endkonzentration von Stämmen und von durch sie produzierten Mutanten, die so ausgewählt ist, daß sie eine wirksame Immunität gegen Pertussis verleiht. Der Impfstoff kann nach der Formulierung in einen sterilen Behälter gefüllt und bei verschiedenen Temperaturen, beispielsweise bei 4ºC, 20ºC oder 37ºC, aufbewahrt oder gefriergetrocknet werden. Zur Induzierung einer wirksamen Immunität gegen Pertussis können eine oder mehrere Dosen des passend formulierten Impfstoffs verabreicht werden. Erfindungsgemäße Impfstoffe können durch übliche Verfahren verabreicht werden. Die Behandlung kann durch Verabreichung einer Dosis oder aufeinanderfolgender Dosen erfolgen. Erfindungsgemäße Impfstoffe können ein oder mehrere Antigene, beispielsweise Tetanus-Toxoid oder Diphtherie-Toxoid oder andere Bordetella-Antigene, umfassen.
Um sicherzustellen, daß ein anti-Pertussis-Impfstoff die besten Formulierungen enthält, können PT-Mutanten mit Formaldehyd in Mengen von 0,035 bis 0,420 % (Gew./Vol.), die einem PT-Mutante/Formaldehyd-Gew.-Verhältnis von 0,300 bis 0,025 entsprechen, stabilisiert werden.
Formaldehyd bewirkt in derartigen Konzentrationen nicht nur eine Stabilisierung der Mutante, sondern induziert auch eine Verringerung und/oder das Verschwinden der Mitogenität und der Hämagglutinationsaktivität in Abhängigkeit von der verwendeten Konzentration ohne Veränderung der immunologischen Eigenschaften.
Im Unterschied zu Veröffentlichungen über das CRM197-Diphtherie-Toxin, bei denen die Formaldehyd-Behandlung des Moleküls erforderlich war, um eine schützende Immunität zu erhalten, wurde überraschend festgestellt, daß sowohl mit Formaldehyd stabilisierte als auch nicht stabilisierte PT-Mutanten identische immunologische Aktivitäten (Induktion von neutralisierenden Antikörpern und Schutz gegen intrazerebrale Infektionen durch virulente B. pertussis) zeigten.
Beide Formulierungen (mit und ohne die stabilisierte Mutante) zeigten bei einer Aufbewahrung bei 20ºC oder 4ºC die gleiche Stabilität, während bei 37ºC eine höhere Stabilitat bei der Formaldehyd-behandelten Mutante beobachtet wurde.
Erfindungsgemäße anti-Pertussis-Impfstoffe zeigen im Vergleich zu den im Stand der Technik bekannten Impfstoffen, die als aktiven Bestandteil mit Chemikalien entgiftetes PT enthalten, beträchtliche Vorteile. Die durch genetische Manipulation erfindungsgemäß erhaltenen PT-Mutanten zeigten tatsächlich eine irreversible Toxizitätsveränderung und eine unveränderte Immunogenität. Die Sicherheit der erfindungsgemäßen PT-Mutanten wurde weiter durch den Nachweis bestätigt, daß eine in vivo-Behandlung (Mäuse und Ratten) mit 1500 ug/kg Körpergewicht, das das 1000fache der beim Menschen vorgesehenen Dosis ist, nicht zu einer lokalen oder systemischen toxischen Reaktion führte.
Abschließend sei gesagt, daß erfindungsgemäß mutierte Bordetella-Stämme und vorzugsweise die von ihnen produzierten mutierten PT-Toxine aufgrund ihrer hohen Immunigenität und fehlenden Toxizität zur Entwicklung von synthetischen zellulären und azellulären anti-Pertussis-Impfstoffen mit den gewünschten Eigenschaften besonders geeignet sind.
Erfindungsgemäß wurden Bordetella pertussis (W28) PTL9/28G (PT- 9K/129G), Bordetella parapertussis PT28G (PT-129G) und Bordetella parapertussis PTI26/28G (PT-26I/129G) am 5. April 1989 als ATCC 53894, ATCC 53892 und ATCC 53893 bei der American Type Culture Collection hinterlegt.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1: Schematische Darstellung des zur Entfernung des Pertussistoxin-Gens aus Chromosomen der Bordetella-Stämme und seine Substitution durch mutierte Toxine oder Kanamycin codierende Gene verwendeten Verfahrens.
Figur 2: Die graphische Darstellung zeigt als Ordinate die optische Dichte (O.D.) und die Produktion von PT-129G, das durch Züchtung von B. pertussis W28/PT129G (X), B. bronchiseptica 7865/PT-129G ( ) und B. parapertussis P14/PT- 129G ( )-Stämme erhalten wurde, und als Abszisse die Zeit in Stunden.
Figur 3: 15 % Polyacrylamidgel vom PT-Wildtyp-(A)-Toxin und von den gereinigten Mutanten PT-9K (B), PT-129G (C), PT-26I/129G (D), PT-13L/129G (E) und PT-9K/129G (F).
Figur 4: Die graphische Darstellung zeigt als Abszisse die Dosis von PT und PT-Mutanten, die als ug/Maus ausgedrückt ist, und als Ordinate die Zahl der Leukozyten x 10&sup6; ml&supmin;¹.
Figur 5: Elektrophoretisches Bandenmuster von Wildtyp-PT (Bahnen 1 und 4), von der nicht stabilisierten Mutante PT-9K/129G (Bahnen 2 und 5) und von der gleichen Mutante nach einer Stabilisierung mit Formaldehyd (PTF-9K/129G) (Bahnen 3 und 6) am Tag 0 (Bahnen 1, 2 und 3) und nach 1 Monat bei 37ºC (Bahnen 4, 5 und 6).
Figur 6 zeigt die mitogene PBMC-Antwort auf Wildtyp-PT und auf die PT- 9K/129G-Mutante. Die in diesem Test verwendete PBMC zeigte keine signifikante Antigen-spezifische Antwort auf Hitze-inaktiviertes PT. Die Standardabweichung war weniger als 15 %.
Figur 7 zeigt den Antikörpertiter (ELISA-Test) und die neutralisierende Wirkung von Antikörpern, die nach 1 oder 2 subkutanen Injektionen von PT oder unterschiedlichen Dosen von PTF-9K/129G, die an Al(OH)&sub3; adsorbiert waren, aus Meerschweinchen erhalten wurden. Die Antitoxin-Antikörpertiter sind als Werte der maximalen Absorbtion von unverdünnten Seren (ABS-MAX) ausgedrückt. Die Neutralisierungstiter (NT) werden als Kehrwert der höchsten Serumverdünnung, die eine 100 % Hemmung der durch 120 pg PT induzierten Agglutinationswirkung auf CHO- Zellen in drei Tests induzieren kann, ausgedrückt.
Figur 8: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von PT-9K/129G, das mit unterschiedlichen prozentualen Konzentrationen von Formaldehyd (0,035, 0,042, 0,052, 0,070, 0,105, 0,140, 0,210 und 0,420 %) behandelt worden ist.
Die nachstehend beschriebenen Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren erläutern jedoch nicht einschränken.

Beispiel 1

Konstruktion von Pertussistoxin-Gen-freien Bordetella-(Δtox)-Mutanten

Bordetella pertussis-Stämme BP165, BP Tohama und BPW28 (SCLAVO S. p. A.), Bordetella parapertussis BP14 (SCLAVO S. p. A.) und Bordetella bronchiseptica BP7865 (SCLAVO S. p. A.) erhielten eine Streptomycin- (str) und Nalidixinsäure- Resistenz (nal).
Dazu wurden etwa 10¹&sup0; Bakterien von jedem Stamm auf 800 ug/ml str oder 200 ug/ml nal enthaltendem Bordet-Gengou (BG)-Agar (DIFCO)-Medium, dem 15 % fibrinfreies steriles Blut zugesetzt worden waren, plattiert und etwa 100 Stunden bei 37ºC gezüchtet.
Die auf diesen Platten gezüchteten spontanen Mutanten wurden isoliert und das das Pertussistoxin codierende Gen, das in ihrem Chromosom enthalten war, wurde durch das Kanamycin-Strukturgen ersetzt, wobei gemäß dem in Figur 1 dargestellten Schema vorgegangen wurde.
Dazu wurde das Plasmid pRTP1 (Stibiz et al., Gene Bd. 50 (1986), 133-140) verwendet, das in Bordetella nicht repliziert, jedoch durch Konjugation eingeführt werden kann.
Plasmid pRTP1 (10 ug) wurde mit 50 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI gemäß der Anleitung der Lieferfirma (BRL) gespalten. Die Plasmid-DNA wurde anschließend in 10 ul Ligasepuffer (66 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,6, 1 mM ATP, 10 mM MgCl&sub2; und 15 mM Dithiothreit) in Gegenwart von 1 Einheit T4-DNA-Ligase über Nacht bei 14ºC mit 0,2 ug eines EcoRI-DNA-Fragments ligiert, das das die Kanamycin-Resistenz (kan) codierende Strukturgen (Pharmacia, Uppsala) enthielt, das in den das Strukturgen des Pertussistoxins flankierenden Nucleotidsequenzen, die den Bereichen 1 bis 420 und 3626 bis 4692 entsprachen, enthalten war. Dieses Fragment wurde erhalten, indem zunächst die Plasmid-DNA PT101 (ATCC 67854) mit dem nur an den Restriktionsstellen in Position 421 und 3625 spaltenden und die Sequenz 421 bis 3625 eliminierenden Restriktionsenzym BstEII gespalten und anschließend das Fragment mit dem Klenow-Enzym mit glatten Enden versehen wurde. Schließlich wurde das das kan-Gen enthaltende HincII-Fragment mit der linearisierten Plasmid-DNA, wie vorstehend beschrieben, in einem Ligasepuffer in Gegenwart der T4-DNA-Ligase ligiert. Nach etwa 18 Stunden bei 14ºC wurde das Ligierungsgemisch zur Transformation kompetenter E. coli-Zellen verwendet, und die Transformanten wurden auf LB- Agarmedium, dem 50 ug/ml Ampicillin und 50 ug/ml Kanamycin zugesetzt worden waren, über Nacht bei 35ºC selektiert. Schließlich wurde aus einem der positiven Clone das Plasmid mit den erwarteten Eigenschaften isoliert und anschließend mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten. Das das Kanamycin-Gen enthaltende DNA- Fragment wurde auf einem Agarosegel, wie von Maniatis et al., "Methods in Enzymology" beschrieben, isoliert.
Dieses EcoRI-Fragment wurde anschließend mit dem zuvor mit EcoRI gespaltenen pRTP1-Plasmid ligiert und das erhaltene Ligierungsgemisch zur Transformation der von R. Simon et al. (Biotechnol. Bd. 1 (1983), 784-791) beschriebenen E. coli SM10-Zellen verwendet, die wie von Messing "Methods in Enzymology" Bd. 101 (1983), 20-78, beschrieben, kompetent gemacht worden waren.
Die Transformanten wurden 24 Stunden bei 37ºC auf 50 ug/ml Ampicillin und 50 ug/ml Kanamycin enthaltenden LB-Agarplatten (DIFCO, Lab.) selektiert.
Aus einem der positiven Clone wurde ein als pRTP1-Δ-PT-KAN bezeichnetes Plasmid mit den erwarteten Eigenschaften extrahiert. Nacheinander wurden E. coli SM10-Zellen, die mit diesem Plasmid transformiert und etwa 18 Stunden bei 37ºC auf LB-Agar gezüchtet worden waren, mit Bordetella str- oder nal-resistenten Stämmen, die zuvor 48 Stunden auf BG-Medium gezüchtet worden waren, konjugiert. Die Konjugation wurde 3 bis 6 Stunden bei 37ºC auf 10 mM MgCl&sub2; enthaltendem BG- Medium durchgeführt. Die erhaltenen Kolonien wurden anschließend geerntet und auf 30 ug/ml Nalidixinsäure und 50 ug/ml Kanamycin enthaltendem BG-Medium plattiert. Die Platten wurden zur Selektion der gegen derartige Antibiotika resistenten Stämme bei 37ºC inkubiert. Nach 3 Tagen (B. bronchiseptica) und 5 bis 6 Tagen (B. pertussis und B. paratussis) wurden zahlreiche einzelne nal- und kan-resistente, hämolytische Kolonien beobachtet, die in ihrem Chromosom das Plasmid pRTP1-ΔPT-KAN enthielten, das durch homologe Rekombination in einen der das Pertussistoxin-Gen flanklerenden Bereiche integriert war. Zur Erleichterung der Rekombination auch des zweiten Bereichs und somit der Substitution des chromosomalen PT-Gens durch das Kanamycin-Gen wurden die Kolonien erneut auf 400 ug/ml Streptomycin enthaltendem BG-Medium plattiert. Gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren wurden Stämme selektiert, die das pRTP1-Plasmid verloren hatten, das eine gegenüber der chromosomalen Bordetella-Resistenz dominante Streptomycin-Empfindlichkeit verlieh.
Zwei Arten von Kolonien wurden, wie nachstehend beschrieben, erhalten:
1) Kolonien, die str- und nal-resistent und kan-empfindlich waren und die ihre Plasmide vollständig verloren hatten und in denen keine Rekombination stattfand, und
2) Kolonien, die str-, nal- und kan-resistent waren und in denen durch eine doppelte Rekombination (Δtox) das PT-Gen durch das Kanamycin-Gen ersetzt wurde.
Zum Nachweis einer derartigen chromosomalen Substitution wurden die Stämme (Δtox)-W28, (Δtox)-Tohama, (Δtox)-165, (Δtox)-P14 und (Δtox)-7865 gemäß bekannter Techniken durch das Southern-Blot-Verfahren, den ELISA-Test und durch Ermittlung der Toxizität für CHO-Zellen charakterisiert. Dazu wurde die chromosomale DNA, die durch das Verfahren von J. Marmur, J. Mol. Biol. 3 (1961), 208-216, aus diesen Bordetella-Stämmen isoliert worden war, mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten, einer Elektrophorese unterzogen, auf Nitrozellulosemembranen transferiert und anschließend unter Verwendung des PT-Gen-enthaltenden 4696 bp-EcoRI-Fragments und des das unter Verwendung des BRL-Nick-Translationskits radioaktiv markierten kan-Gen enthaltenden DNA-Fragments als Sonden hybridisiert.
Die Hybridisierungsreaktion wurde gemäß dem Verfahren von E. Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975), 503-517, durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigten in der chromosomalen DNA von Bordetella (Δtox)- Stämmen die Gegenwart eines DNA-Fragments mit einem Molekulargewicht, das geringer ist als das des mit beiden Sonden hybridisierenden PT-Gens.
Die Bordetella (Δtox)-Stämme wurden 72 Stunden bei 37ºC in SS-modifiziertem Medium gezüchtet, dessen Zusammensetzung in Gramm/Liter nachstehend beschrieben ist:
L-Natriumglutamat 10,7, L-Prolin 0,24, NaCl 2,5, KH&sub2;PO&sub4;, 0,5, KCl 0,2, MgCl&sub2; x 6H&sub2;O 0,1, CaCl&sub2; 0,02, Tris 6,1, L-Cystein 0,04*, FeSO&sub4; x 7H&sub2;O 0,001*, Niacin 0,004*, Glutathion 0,10*, Ascorbinsäure 0,02*, Resuminsäuren 10,0 und 2,6-O- Dimethyl-beta-cyclodextrin 1,0, pH-Wert 7,6.
Das Medium wurde 20 Minuten sterilisiert, während die mit markierten Bestandteile durch Filtration separat sterilisiert wurden. In regelmäßigen Abständen wurden Mediumproben entnommen und mit 12 000 Upm vier Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Anschließend wurden zum Nachweis der Gegenwart des Pertussistoxins und seiner Toxizität Aliquots der zellfreien Überstände mit dem ELISA-Test und auf eine Toxizität für CHO-Zellen getestet.
Der nach einer Beschreibung von K. H. Wong und S. K. Skelton, J. Clin. Microbiol. Bd. 26 (1988), 1316-1320, durchgeführte ELISA-Test zeigte, daß keiner der (Δtox)-Stämme nachweisbare PT-Mengen produzieren konnte.
Ferner modifizierten die 1:10 verdünnten Überstände die CHO-Zellen nicht (E. L. Hewlett, Infect. Immun. 40 (1983), 1198-1230). Eine unspezifische Toxizität wurde bei Verwendung des unverdünnten Überstandes beobachtet.
Um festzustellen, ob diese Stämme noch einen Schutz gegen virulente B. pertussis verleihen können, obwohl sie PT nicht produzieren, wurden intrazerebrale Immunisierungstests gemäß dem im "CODE OF FEDERAL REGULATION" beschriebenen Verfahren, einem Potenztest des Pertussis-Impfstoffs 21/Par7620, durchgeführt. Dazu wurden die (Δtox)-W28- und Tohama-Stämme und die gleichen Wildtyp-Stämme, die üblicherweise zur Herstellung von anti-Pertussis-Impfstoff verwendet werden, bei 37ºC in 300 ml modifiziertem SS-Medium bis zu einer bei 590 nm gemessenen optischen Dichte von 0,7 gezüchtet. Die Kulturen wurden anschließend 10 Minuten mit 10 000 Upm zentrifugiert (Beckman J21-Zentrifuge mit J10-Rotor) und die Zellen nach ihrer Abtrennung von den Überständen erneut in 50 ml Kochsalzlösung suspendiert und 30 Minuten bei 56ºC gehalten. Anschließend wurden die erhaltenen Suspensionen in einer geeigneten Weise verdünnt, wie im "CODE OF FEDERAL REGULATION" beschrieben, und als übliche Impfstoffe in unterschiedlichen Dosen verwendet. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I dargestellt: Tabelle I Bei intrazerebraler Immunisierung Überlebende Dosis ml/Maus* Tohama
Wie der Tabelle zu entnehmen ist, verleihen die (Δtox)-Stämme, obwohl eine geringe Abnahme des Schutzes beobachtet wurde, trotzdem noch einen sehr guten Schutz und sind daher anscheinend als anti-Pertussis-Impfstoffe besonders geeignet.
* gibt das Volumen der Zellsuspension an.

Beispiel 2

Konstruktion von Bordetella-Mutanten, die PT-Formen mit veränderter Toxizität produzieren

Zur Einführung von mutierten Formen des Pertussistoxin-Gens in das Chromosom von (Δtox)-Stämmen, die wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten wurden, wurde das Plasmid pRTP1 durch Einführung des die Gentamycin-Resistenz codierenden Gens (Pharmacia, Uppsala) und des die Tetracyclin-Resistenz codierenden Gens (Pharmacia, Uppsala) in die BamHI-Stelle modifiziert. Die Clonierung dieser Gene wurde unter Verwendung der bekannten, von Maniatis et al. beschriebenen DNA- Rekombinationsverfahren durchgeführt. Diese neuen Vektoren mit der Bezeichnung pRTPG1 bzw. pRTPT1 wurden anschließend zur Einführung der mutierten Stämme des Pertussistoxins in das Bordetella-Chromosom verwendet. Insbesondere wurden diese Gene durch Deletion oder Substitution von Nucleotidsequenzen durch andere Aminosäuren codierende Nucleotidsequenzen in dem im Plasmid PT101 (ATCC 67854) enthaltenen PT-codierenden Gen unter Verwendung des Verfahrens der stellenspezifischen Mutagenese erhalten. Insbesondere wurden PT-Gene konstruiert, die die in der ersten Spalte der nachstehend beschriebenen Tabelle II dargestellten Mutationen in der S1- Nucleotidsequenz enthielten.
Nach der Clonierung wurden die EcoRI-Fragmente, die die vorstehend beschriebenen Mutationen in den pRTPG1- und pRTPT1-Plasmiden enthielten, zur Transformation von E. coli SM10-Zellen verwendet und die so erhaltenen Transformanten mit den (Δtox)-Bordetella-Stämmen konjugiert. Die Kolonien, die die Integration von derartigen Plasmiden in ihr Chromosom zeigten, wurden anschließend auf BG-Mediumplatten, die 30 ug/ml/ml und 20 ug/ml Gentamycin oder 30 ug/ml nal und 12,5 ug/ml Tetracyclin enthielten, selektiert. In allen so selektierten Kolonien war das Plasmid in das Chromosom integriert. Anschließend wurden die erhaltenen Kolonien, wie beschrieben, zur Selektion auf einen Plasmidverlust auf 400 ug/ml Streptomycin enthaltendem BG-Medium plattiert. Die Kolonien, die auf diesem Medium wachsen konnten, wurden anschließend gleichzeitig auf BG-Platten gezüchtet, die jeweils enthielten:
a) nal 30 ug/ml, str 400 ug/ml und 50 ug/ml Kanamycin,
b) nal 30 ug/ml und str 400 ug/ml.
Die in a) erhaltenen Kolonien hatten das Plasmid verloren und entsprachen daher den ursprünglichen (Δtox)-Kolonien, die noch Kanamycin-resistent waren.
Die auf dem Medium b) gewachsenen Kolonien hatten andererseits die Resistenz gegen Kanamycin verloren, dessen Gen durch das mutierte Gen ersetzt worden war.
Zum Nachweis der Fähigkeit der in b) erhaltenen Kolonien zur Produktion und Sekretion einer PT-Mutante wurden B. pertussis W28/PT-129G-, B. parapertussis P14/PT-129G- und B. bronchiseptica 7865/PT 129G-Stämme auf BG-Platten vermehrt und anschließend in 15 ml modifiziertem SS-Medium 72 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Die Daten für die PT-Mutantenproduktion, die durch eine Überwachung mit dem ELISA-Test erhalten wurden, sind in Figur 2 dargestellt und zeigen, daß alle getesteten Bordetella-Stämme die PT-Mutante produzierten und B. parapertussis die doppelte Menge im Vergleich zu anderen Bordetella-Stämmen produzierte.
Die Daten über die Produktion von PT-Mutanten, die durch Züchtung, wie vorstehend beschrieben, von B. pertussis W28-, BP165- und B. parapertussis P14- Stämmen erhalten wurden, die das PT-Gen enthielten, das die in der ersten Spalte von Tabelle II dargestellten Mutationen umfaßte, sind in der dritten Spalte der gleichen Tabelle dargestellt und zeigen, daß
- alle getesteten Stämme die PT-Mutanten exprimieren und sezernieren konnten,
- einige diese PT-Mutanten in einer Menge produzierten, die mit der vom Wildtyp-PT (++++) erhaltenen Menge vergleichbar ist, und
- B. parapertussis P14 im Vergleich zu B. pertussis die doppelte Menge PT- Mutanten produzierten.
Einige dieser Stämme (mit B angegeben) sezernierten nur das Oligomer B des Pertussistoxins (das aus den Untereinheiten S2, S3, S4 und S5 besteht).
Die nach den intrazerebralen Immunisierungstests erhaltenen Ergebnisse zeigten ferner, daß diese Bordetella-Stämme zur Entwicklung von zellulären anti- Pertussis-Impfstoffen geeignet sind. Tabelle II Einführung der Mutation in PT-Mutante Name/Mutation Produktion Toxizität CHO % ungereinigt/gereinigt

Beispiel 3

A) Produktion und Reinigung von PT-Mutanten

Die B. parapertussis P14/PT-129G-, B. pertussis W28 9K/129G-, B. pertussis W28 13L/129G- und B. pertussis W28 26I/129G-Stämme wurden in einem 30 l- Chemap-Fermentationsgefäß, das 20 l modifiziertes SS-Medium (pH-Wert 7,4) enthielt, gezüchtet, wobei Luft mit 0,1 v/v/m durchgeleitet wurde. Der gelöste Sauerstoff wurde bei 20 % gehalten, wobei mit variierenden Umdrehungszahlen (minimal 200 bis maximal 700 Umdrehungen pro Minute) geschüttelt wurde. Die Temperatur wurde auf 35ºC eingestellt und der pH-Wert durch Verwendung einer Lösung, die 1,5 N Glutaminsäure, 1,5 N Chlorwasserstoffsäure und 0,15 N Prolin enthielt, am Neutralpunkt gehalten. Wenn die Kulturen nach etwa 36 bis 48 Stunden eine bei 590 nm gemessene optische Dichte von 14 bis 18 erreichten, wurden die Zellen durch Zentrifugation des Fermentationsmediums (Beckman JCF-7-Zentrifuge, 19 000 Upm, 30 Minuten bei 4ºC, mit einer Fließrate von 600 ml/Minute) entfernt und die mutierten Proteine aus dem zellfreien Überstand gereinigt und unter sterilen Bedingungen (durch eine Durapor - Patrone (Millipore) von 0,22 mu) durch Absorption auf Affi-Gel-Blau und anschließender Affinitätschromatographie auf Sepharose-Fetuin , wie von R. D. Sekura et al. (J. Biol. Chem. 258 (1983), 14647-14561) beschrieben, filtriert.

B) Ermittlung der physikalisch-chemischen Eigenschaften der gereinigten PT-Mutanten

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften einiger PT-Mutanten, die wie vorstehend beschrieben gereinigt worden waren, wurden durch Gelelektrophorese auf mit Coomassie-Blau angefärbtem Polyacrylamid-Natriumdodecylsulfat (SDS) ermittelt, wobei das von U. K. Laemmli, Nature 227 (1970), 680-685, beschriebene Verfahren verwendet wurde.
Die in Figur 3 dargestellten Ergebnisse zeigen die Abwesenheit von verunreinigenden Proteinen und ein mit dem Wildtyp-PT identisches Muster.
Eine weitere Kontrolle zum Nachweis von eventuell vorhandenen anderen Verunreinigungen, insbesondere von Substanzen, die im Fermentationsverfahren zur Herstellung der Mutanten verwendet wurden, bestätigte
1) die Abwesenheit von 2,6-O-Dimethyl-beta-cyclodextrin, die gemäß dem von J. G. Beeley, "Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology", R. H. Burdon und P. H. Van Knippenberg (Hrsg.), Elsevier Bd. 16 (1985), beschriebenen Verfahren ermittelt wurde,
2) die Abwesenheit von Fetuin, des 69 kD-Proteins und von filamentösem Hämagglutinin, die die möglichen Verunreinigungen von azellulären anti-Pertussis- Impfstoffen sind, und die durch Western-Blot-Analyse (H. T. Towbin et al., PNAS USA 73 (1976), 361-365) unter Verwendung von spezifischen Antikörpern gegen diese Proteine ermittelt wurde,
3) die Abwesenheit des thermonekrotischen Toxins, die durch den an Meerschweinchen durchgeführten, von K. T. Kume et al., Infect. Immun. 52 (1986), 370-377, beschriebenen Test ermittelt wurde, und
4) die Abwesenheit von Cyclodextrin, dem Hauptbestandteil des Kulturmediums, die durch Dünnschichtchromatographie ermittelt wurde. Die PT-Mutanten (80 % Ausbeute) zeigen eine Reinheit von 99 %.

Beispiel 4

In vitro-Charakterisierting von PT-Mutanten

A) Toxizität für CHO-Zellen

Der Test wurde unter Verwendung der ungereinigten und gereinigten, 1:10 in DMEM-Medium verdünnten Überstände der Kulturen von einigen Bordetella-Stämmen, die die in der ersten Spalte von Tabelle II dargestellten Mutationen enthielten, durchgeführt (Flow Lab., Mclean, Va).
Die in der vorstehenden Tabelle II dargestellten Ergebnisse zeigen eine Verringerung der Toxizität der Pertussistoxin-Mutanten im Hinblick auf Wildtyp-PT. Die besten Ergebnisse werden für die Mutanten PT-26I/129G, PT-9K/129G und PT- 13L/129G erhalten, bei denen keine Toxizität beobachtet wurde.
Ferner zeigt die nicht-entgiftete PT-129G-Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Pertussistoxin eine Restaktivität von 1,5 bis 10 %, während die gleiche Mutante, die, wie von J. J. Munoz et al. (Infect. Immun. 32 (1981), 243-250) beschrieben, mit Glutaraldehyd entgiftet worden war, keine nachweisbare Toxizität für CHO- Zellen zeigt.

B) Ermittlung der Affinitätskonstante unter Verwendung des RIA-Tests

Mit diesem Test wurde die Affinitätskonstante einiger PT-Mutanten für polyclonale Antikörper (anti-PT-Ziegen-Gammaglobuline, SCLAVO S. p. A.) und monoclonale anti-S1-Antikörper (1B7, nach einer Beschreibung von H. Sato et al., Infect. Immun. 46 (1984), 422-428) ermittelt.
Jeder der 96 Vertiefungen mit flachen Böden in Mikrotiterplatten aus Polystyrol (Dynatech Laboratories Inc., Alexandria, VA) wurden 200 ul 5 mM Glycinpuffer, pH-wert 9,2, der 10 ug/ml Antikörper enthielt, zugesetzt. Nach Inkubation über Nacht bei 4ºC wurden die Platten mit 2,5 % (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin (BSA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert 8,0, gesättigt und mit 100 ul PBS, das 0,125 ml/l Tween-20 enthielt, gewaschen. Die Platten wurden anschließend in jeder Vertiefung mit 10&sup5; Cpm (Zerfälle pro Minute) des mit ¹²&sup5;I markierten Pertussistoxins in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen (0,01 - 0,025 - 0,05 - 0,1 - 0,25 - 0,5 - 1,0 ug/ml) von PT und PT-Mutanten inkubiert. Nach drei Stunden bei Raumtemperatur (20 bis 25ºC) wurden die Platten ausgiebig mit PBS gewaschen, und die eingebaute Radioaktivität wurde mit einem Gammazähler (Packard Inst., USA) gemessen. Jede Probe wurde zweimal analysiert. Das Pertussistoxin wurde durch das Standard-Chloramin T-Verfahren (BDH Chem., England) mit radioaktivem Iod markiert, wobei die Anweisungen der Lieferfirma befolgt wurden.
Die in der nachstehenden Tabelle III dargestellten Ergebnisse zeigen, daß alle PT-Mutanten das vom monoclonalen Antikörper 1B7 erkannte Epitop behielten, eine hohe Affinität für anti-Pertussistoxin-Ziegen-Gammaglobuline aufwiesen und daher das PT-Toxin neutralsieren konnten. Tabelle III Affinitätskonstante (Ka (l/mol)) PT-Mutanten anti-PT-Ziegen-Immunglobuline

Beispiel 5

In vivo-Charakterisierung von PT-Mutanten

Die biologischen Eigenschaften einiger PT-Mutanten und die Möglichkeit ihrer Verwendung in einem anti-Pertussis-Impfstoff wurden, wie nachstehend beschrieben, getestet.

A) Intrazerebrale Immunisierung

Der Test wurde unter Verwendung des zellulären Standardimpfstoffs (Kontrolle), der PT-129G-Mutanten, die unbehandelt oder mit Glutaraldehyd entgiftet (PT-129G Det) verwendet wurden, und von PT-26I/129G durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV dargestellt. Tabelle IV Zellulärer Standardimpfstoff Gereinigte PT-Mutanten Dosis Überlebende Tiere ml/Maus ug/Maus
Die niedrige Überlebensrate (*) bei Verwendung von PT-129G wird durch die etwa 1 bis 2 % der Toxizität des PT-Toxins ausmachende Resttoxizität der Mutante bewirkt.

B) Leukozytose

Gruppen von vier 7 bis 8 Wochen alten, weiblichen BALB/c-Mäusen mit einem Gewicht von etwa 20 g wurden am Tag 0 0,2 ml einer sterilen, pyrogenfreien physiologischen Kochsalzlösung intravenös injiziert, die allein (Kontrolle) verwendet wurde oder außerdem enthielt:
- (0,004 - 0,02 - 0,04 - 0,1 - 0,5 und 1,0 ug/Maus) PT,
- (0,1 - 0,5 - 2,5 - ug/Maus) PT-13L,
- (0,1 - 0,5 - 2,5 - 12,5 - 25,0 und 50,0 ug/Maus) PT-9K, PT-129G, entgiftetes PT-129G, PT-26I/129G, PT-13L/129G und PT-9K/129G.
Nach drei Tagen wurde den Mäusen Blut entnommen, und die Gesamtzahl der mononukleären Zellen (PBMC)/ml peripheren Bluts wurde einzeln in "turk"-Lösung (0,01 % Gentianviolett und 3 % Essigsäure) gezählt. Ein Teil des peripheren Bluts jeder Maus, das zuvor mit einer rote Blutkörperchen lysierenden Lösung behandelt worden war, wurde anschließend in einem FACS (Fluoreszenz-aktivierbaren Zellsorter) gezählt, um die prozentuale Zunahme der Lymphocyten und polymorphkernigen Zellen in den mit den unterschiedlichen Toxinen behandelten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen zu messen.
Die in Figur 4 dargestellten Ergebnisse zeigen allgemein eine Verringerung der Toxizität der PT-Mutante im Vergleich zu PT, die bei den Mutanten PT-26I/129G, PT-9K/129G und PT-13L/129G den Wert von 0,01 % unterschritt.
Der gleiche Test wurde mit Gruppen von BALB/c-Mäusen durchgeführt, indem am Tag 0 0,5 ml sterile physiologische Lösung allein oder kombiniert mit PT oder der PT-9K/129G-Mutante in den gleichen, vorstehend beschriebenen Konzentrationen intraperitoneal injiziert wurden.
Drei Tage nach der Verabreichung wurden Blutproben aus dem orbitalen Plexus der Tiere entnommen und wie vorstehend beschrieben getestet. Die Ergebnisse, die als durchschnittliche +/- Standardabweichung der Leukozytenzählungen von 5 individuell getesteten Tieren ausgedrückt wurden, sind in Figur 4 und in Tabelle V im Vergleich zu PT und PT-9K/129G dargestellt. Tabelle V Antigen Dosis ug/Maus Leukozytose (PBMC/ml x 10&supmin;&sup6;) Kochsalzlösung

C) Histamin-Empfindlichkeit

Gruppen von fünf 7 bis 8 Wochen alten, weiblichen BALB/c-Mäusen mit einem Gewicht von etwa 20 g wurden am Tag 0 0,5 ml sterile, pyrogenfreie physiologische Kochsalzlösung allein (Kontrolle) oder mit unterschiedlichen Dosen von PT und unbehandeltem PT-129G oder nach einer Entgiftung mit Glutaraldehyd (PT-129G Det.) intraperitoneal inokuliert. Sechs Tage nach der Verabreichung wurden den Mäusen 0,5 ml sterile, pyrogenfreie, physiologische Lösung, die 4 mg Histamindihydrochlorid pro Maus (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) enthielt, intraperitoneal inokuliert.
Die getöteten Mäuse wurden 24 Stunden nach der Verabreichung von Histamin registriert. Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen VI und VII dargestellt. Dosis/Maus Tabelle VI Tag Tote Tiere/Gesamtzahl Dosis/Maus 0,5 ml/i.p. Dosis/Maus 0,5 ml/i.p. Histamin (4 mg) Kochsalzlösung Tabelle VII Tag 0 Dosis/Maus 0,5 ml/i.p. Tag +6 Dosis/Maus 0,5 ml/i.p. Histamin (4 mg) Tote Tiere/Gesamtzahl Kochsalzlösung

D) Anaphylaxie

Die Potenzierung der anaphylaktischen Empfindlichkeit wurde gemäß dem von L. Steinman et al., PNAS USA 82 (1985), 8733-8736, beschriebenen Verfahren ermittelt.
Gruppen von fünf 7 bis 8 Wochen alten (H-2d), weiblichen BALB/c-Mäusen mit einem Gewicht von etwa 20 g wurde am Tag -1, +1 und +6 eine Lösung intraperitoneal inokuliert, die 0,2 ml sterile, pyrogenfreie, physiologische Kochsalzlösung allein (Kontrolle) oder mit Rindersertimalbumin (BSA) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) enthielt. Den gleichen Gruppen von Mäusen wurden anschließend am Tag 0 und +2 0,4 ml pyrogenfreie, sterile Kochsalzlösung allein oder kombiniert mit 40, 100 und 500 ng/Maus an PT, 100, 500 und 2500 ng/Maus an unbehandeltem PT-129G oder PT-129G nach einer Entgiftung mit Glutaraldehyd (PT-129G Det.) oder 500, 2500 und 7500 ng/Maus an PT-9K/129G intravenös inokuliert. Tote Tiere wurden zwei Stunden nach der letzten BSA-Verabreichung registriert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle VlII dargestellt. Tabelle VIII Tag Dosis/Maus Getötete Tiere/Gesamtzahl Kochsalzlösung

E) IAP (Insel-Aktivierungsprotein)

Die Aktivierung der Langerhans-Inseln durch PT oder durch PT-9K/129G wurde, wie von J. G. Kreeftenberg et al., J. Biol. Stand. 12 (1984), 151-157, beschrieben, ermittelt.
Gruppen von fünf 5 bis 7 Wochen alten, weiblichen BALB/c-Mäusen mit einem Gewicht von etwa 20 g wurden 0,2 ml pyrogenfreie, sterile Kochsalzlösung allein (Kontrolle) oder kombiniert mit 25 ug/ml PT9K/129G oder 1 ug/ml PT intraperitoneal inokuliert. Nach 4 Tagen wurden die als mE/l ausgedrückten Insulintiter im Mäuseserum ermittelt.
Die Ergebnisse zeigten erwartungsgemäß eine durch PT induzierte signifikante Erhöhung der Insulinsekretion (19,6 mE/l), während die durch die PT-9K/129G- Mutanten induzierten Sekretionswerte (5 mE/l) mit den durch die Kontrolle erhaltenen Werten (8 mE/l) vergleichbar waren.

Beispiel 6

Formaldehydbehandlung der PT-9K/129G-Mutante

A) Untersuchung der Wirkung der Behandlung auf die Mitogenität, Hämagglutinierungsaktivität und Affinitätskonstante der Mutante PT-9K/129G

Die gemäß Beispiel 3 gereinigte Mutante PT-9K/129G wurde gegen PBS, pH- Wert 7,4, das 0,025 % Lysin (Ajinomoto, Japan) und 0,01 % Merthiolat (Elanco, USA) enthielt, 24 Stunden bei 4ºC dialysiert und anschließend erneut in PBS suspendiert. Nach der Bestimmung des Proteingehalts (O. H. Lowry et al., J. Biol. Chem. 193 (1951), 265-275) wurden zu Aliquots des Gemisches unterschiedliche Konzentrationen (0,035 % bis 0,420 % (Gew./Vol.)) an Formaldehyd (4 % Lösung in PBS, pH-Wert 7,4) zugesetzt, um ein Endverhältnis der Mutante zu Formaldehyd von 0,300 bis 0,025 (Gew./Gew.) zu erhalten. Die erhaltenen Gemische wurden 48 Stunden bei 37ºC, ohne und mit 0,025 M Lysin, inkubiert und anschließend wiederholt gegen PBS dialysiert. Die Gemische wurden anschließend getestet, um ihren Gehalt an freiem Formaldehyd zu ermitteln, wobei ein Gehalt festgestellt wurde, der niedriger als 0,01 % (Gew./Vol.) war. Ferner zeigten die auf SDS-PAGE analysierten Gemische das gleiche elektrophoretische Muster wie PT und die Gegenwart einiger zusätzlicher Banden, von denen eine mit den Untereinheiten S2 und S3 und die andere mit höherem Molekulargewicht mit der Untereinheit S1 (Figur 5, Bahn 3) wanderte.
Die mitogene Aktivität der mit unterschiedlichen Formaldehyd- Konzentrationen behandelten PT-9K/129G-Mutante (PTF-9K/129G) wurde anschließend durch die Antwort von mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Bluts (PBMC) ermittelt, die aus normalen Erwachsenen isoliert worden waren, im Vergleich zu der mit PT und der gleichen unbehandelten Mutante erhaltenen Antwort (Figur 6). Dazu wurden die PBMC-Zellen in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten, die 96 Vertiefungen mit flachen Böden aufwiesen (Costar, Cambridge, MA), in einer Konzentration von 10&sup5;/Vertiefung verteilt, wobei die Vertiefungen 0,2 ml RPMI 1640 (Gibco Laboratories, Paisley), dem 2 mM L-Glutamin, 1 % nichtessentielle Aminosäuren, 10 x 10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol und 10 % menschliches Serumalbumin zugesetzt worden waren, enthielten. PT und die PTF-9K/129G- und PT-9K/129G- Mutanten wurden anschließend zugesetzt, wobei in jede Vertiefung jeweils eine Konzentration von 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 und 6,0 ug/ml gegeben wurde. Nachdem 96 Stunden bei 37ºC inkubiert worden war, wurde jeder Vertiefung 1 uCi ³H-Thymidin (sp. act. 185 GBq/mmol, Amersham International, Amersham UK) zugesetzt. Nach 16 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Zellen mit einem Gerät zur Zellgewinnung (Skatron, Lier, Norwegen) auf Glaswollfilter gesammelt und die eingebaute Radioaktivität wurde durch Flüssigszintillationsmessung ermittelt. Die Ergebnisse, die in Figur 6 (PT und PT-9K/129G) und Tabelle IX (PT-9K/129G und PTF-9K/129G) dargestellt sind, zeigten, daß:
1) die PT-9K/129G-Mutante eine dem PT-Protein entsprechende mitogene Aktivität gegen menschliche T-Lymphocyten behielt. Dies stimmt mit der Beobachtung überein, daß diese mitogene Aktivitat durch die Gegenwart des B-Oligomers bewirkt wird, und
2) die Erhöhung der Formaldehydkonzentrationen die mitogene Aktivitat bis zum Verschwinden verringerte.
Die Hämagglutinierungsaktivität der Mutante PTF 9K/129G wurde, wie von Sato et al., Infect. Immun. 41 (1983), 313-320, beschrieben, unter Verwendung von mit Glutaraldehyd fixierten roten Blutkörperchen von Hühnern als Zielzellen ermittelt. Die in Tabelle IX dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Behandlung mit steigenden Dosen Formaldehyd die Hämagglutinierungsaktivität der Mutante fortschreitend reduziert.
Die Affinitätskonstante wurde, wie im vorstehenden Beispiel 4 beschrieben, ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX dargestellt. Tabelle IX Formaldehyd (Dosis) Mitogenitäta (ug/ml) Hämagglutinierungb (ug/Vertiefung) Affinitätc [Ka(L/Mol)] Gammaglobuline
"a": Die Ergebnisse werden als durchschnittliche Zerfälle pro Minute (Cpm x 10&supmin;³) für jede in zwei Ansätzen getestete Kultur ausgedrückt.
"b": Die Ergebnisse werden als die Proteindosis ausgedrückt, die eine vollständige Agglutination der mit Glutaraldehyd fixierten roten Blutkörperchen von Hühnern bewirkte.
"c" ist die durch einen RIA-Test ermittelte Affinitätskonstante.
"d" ist der Prozentsatz (Gewicht/Volumen) Formaldehyd in der Probe, wie beschrieben.
"e" zeigt das Mutanten/Formaldehyd-Verhältnis (Gew./Gew.) in der Probe.

B) Untersuchung der Wirkung der Formaldehyd-Behandlung auf die Stabilität von PT- 9K/129G

PT, die unbehandelte Mutante PT-9K/129G und die gleiche, mit 0,035 % (Gew./Vol.) Formaldehyd behandelte Mutante (PTF-9K/129G) wurden bei 4ºC, 20ºC und 37ºC gehalten.
Anschließend wurden die Proteine nach 120 Tagen (4ºC und 20ºC) und 30 Tagen (37ºC) getestet, um das elektrophoretische Profil und die Affinitätskonstante für polyclonale (anti-PT-Gammaglobuline) Antikörper (A) und monoclonale (1B7) Antikörper (B) zu ermitteln.
Die Ergebnisse (Tabelle X und Figur 5) zeigen, daß die über einen Zeitraum von 120 Tagen bei 4ºC und 20ºC gehaltenen Moleküle keine Änderung ihres elektrophoretischen Musters oder ihrer Affinitätskonstante zeigten.
Die gleichen Moleküle, die dreißig Tage bei 37ºC gehalten worden waren, zeigten jedoch eine fortschreitende Abnahme der Intensität der Bande, die der S1- Untereinheit von PT und der PT-9K/129G-Mutante (Figur 5, Bahnen 4 und 5) entsprach, während dies bei der PTF-9K/129G-Mutante nicht beobachtet wurde (Figur 5, Bahn 6). Tabelle X Tage Konservierungstemperatur Affinität
"a": Die Daten, die mittels einer nicht-linearen Regressionsanalyse ermittelt wurden, werden als Ka (L/Mol) ausgedrückt und stellen den geometrischen Durchschnitt des für eine in dreifacher Ausführung getesteten Probe erhaltenen Werts dar. Die Werte der Standardabweichung übersteigen niemals 15 %.
"b": N.D. = Nicht ermittelt.

C) Analyse der Aminosäurezusammensetzung

Die Analyse der Aminosäurereste der Mutante PT-9K/129G wurde vor und nach der Behandlung mit 0,035 % Formaldehyd, wie von D. H. Spackman et al., Anal. Chem. 30 (1958), 1190-1206, beschrieben, durchgeführt. Die saure Hydrolyse von PT- Mutanten wurde 24 Stunden bei 110ºC in 6N HCl in vakuumversiegelten Gefäßen durchgeführt. Die Aminosäureanalyse wurde anschließend unter Verwendung eines Geräts für die Aminosäureanalyse (Kontron, Zürich, Schweiz) durchgeführt.
Tryptophan wurde durch die saure Hydrolyse abgebaut und konnte daher nicht ermittelt werden. Ferner wurden durch die saure Hydrolyse Asparagin und Glutamin jeweils zu Asparaginsäure und Glutaminsäure hydrolysiert. In Tabelle XI sind die Werte, die der Summe von Asparagin + Asparaginsäure (Asx) und Glutamin + Glutaminsäure (Glx) entsprechen, dargestellt. Tabelle XI Aminosäuren
"a": Theoretische Werte, die von der Primärstruktur des Proteins abgeleitet wurden und als Amonosäure/Protein-Verhältnis ausgedrückt werden.
"b": N.D. = Nicht ermittelt.
"c": Der unterstrichene Wert zeigt die Lysinzunahme nach einer Formaldehyd-Behandlung in Gegenwart von 0,025 M Lysin.

Beispiel 7

Toxizität der PTF-9K/129G-Mutante für CHO-Zellen

1 x 10&sup4; CHO-Zellen wurden 48 Stunden mit unterschiedlichen PTF- 9K/129G-Dosen (0,01 bis 5 ug/ml) und PT-Dosen (0,3 pg bis 90 ng/ml) inkubiert. Anschließend wurde die Minimaldosis, die die morphologische Veränderung der Zellen bewirken konnte, ermittelt.
Die Ergebnisse zeigten, daß der PTF-9K/129G-Mutante die Toxizität in der getesteten Maximaldosis (5 ug/ml) fehlte und sie eine mindestens 10&sup6; Mal geringere Toxizität als PT (5 pg/ml) aufwies.

Beispiel 8

In vivo-Charakterisierung der biologischen Eigenschaften der PTF-9K/129G-Mutante

A) Anaphylaxiepotenzierung

Die Induktion der Anaphylaxie-Empfindlichkeit wurde gemäß dem von L. Steinman et al., PNAS USA 82 (1985), 8733-8736, beschriebenen Verfahren ermittelt.
Gruppen von fünf 5 bis 7 Wochen alten, weiblichen BALB/c-Mäusen mit einem Gewicht von etwa 20 g wurden an den Tagen -1, +1 und +6 0,2 ml sterile, pyrogen freie physiologische Kochsalzlösung allein oder kombiniert mit 1 mg BSA (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) pro Maus intraperitoneal inokuliert. Die gleichen Gruppen von Mäusen wurden anschließend an den Tagen 0 und +2 mit 0,2 ml pyrogenfreier, steriler Kochsalzlösung allein oder kombiniert mit 0,04, 0,1 und 0,5 ug PT/Maus oder 2,5 und 7,5 ug PTF-9K/129G/Maus intravenös behandelt. Die Zahl der getöteten Tiere wurde 2 Stunden nach der letzten BSA-Verabreichung registriert. Die Ergebnisse sind in Tabelle XII dargestellt.

B) Histamin-Empfindlichkeit

Gruppen von 5 bis 7 Wochen alten, weiblichen BALB/c-Mäusen mit einem Gewicht von etwa 20 g wurden am Tag 0 0,5 ml pyrogenfreie, sterile physiologische Kochsalzlösung allein oder kombiniert mit 0,004, 0,02, 0,04, 0,1, 0,5 und 1 ug PT oder 2,5, 12,5, 25,0 und 50,0 ug PTF-9K/129G intraperitoneal inokuliert.
Am Tag +6 wurden den Mäusen 0,5 ml pyrogenfreie, sterile physiologische Kochsalzlösung, die 4 mg Histamindihydrochlorid enthielt, intraperitoneal inokuliert.
Die Zahl der getöteten Tiere wurde 24 Stunden nach der Histamin- Verabreichung registriert. Die Ergebnisse sind in Tabelle XII dargestellt.

C) Leukozytose

Gruppen von fünf 5 bis 7 Wochen alten, weiblichen BALB/c-Mäusen mit einem Gewicht von etwa 20 g wurden am Tag 0 0,5 ml pyrogenfreie, sterile physiologische Lösung allein oder mit 0,004, 0,02, 0,04, 0,1, 0,5 und 1,0 ug PT oder 2,5, 12,5, 25,0 und 50,0 ug PTF-9K/129G intraperitoneal inokuliert.
Am dritten Tag nach der Verabreichung wurden Blutproben aus dem orbitalen Plexus der Tiere entnommen und getestet, um den Grad der Leukozytose zu ermitteln. Die Ergebnisse, die als Durchschnitt der Standardabweichung (+/-) der Leukozytenzählungen von 5 einzeln getesteten Tieren ausgedrückt werden, sind in Tabelle XII dargestellt. Tabelle XII Dosis ug/Maus Kochsalzlösung * N.D. = nicht ermittelt (b) = Gleiche Zahl von toten Tieren bei insgesamt 5 Mäusen/Gruppe
Wie der Tabelle entnommen werden kann, entwickeln die Mäuse drei Tage nach ihrer intraperitonealen Inokulierung eine dosisabhängige Leukozytose. Die Erhöhung der Zahl der mononukleären Zellen des peripheren Bluts (BPMC) war bei 0,020 ug gereinigtem PT-Toxin statistisch signifikant, während das PTF-9K/129G in einer Dosis von 50 ug/Maus die Leukozytose nicht fördern konnte.
Diese Mutante, die in den gleichen Dosen, wie vorstehend beschrieben, intraperitoneal inokuliert wurde, war nach der Histamin-Verabreichung für die Maus nicht lethal. Pt hingegen, das in einer Dosis von 0,5 ug/Maus inokuliert wurde, bewirkte 100% Sterblichkeit.
Die Fähigkeit des Pertussistoxins zur Potenzierung der BSA-Anaphylaxie, ein Phänomen, das mit den durch den zellulären anti-Pertussis-Impfstoff bewirkten Enzephalopathien in Zusammenhang stand, fehlte bei der PTF-9K/129G-Mutante.
Die Anaphylaxie-Potenzierung, die bei 80 % der mit 0,040 ug PT inokulierten Mäusen den Tod verursachte, wurde bei Mäusen, die mit 7,5 ug PTF-9K/129G behandelt worden waren, nicht beobachtet.

D) Akute Toxizität

Die intraperitoneale oder subkutane Untersuchung der Toxizität wurde gemäß den Anweisungen der "OMS" (WHO Tech. Rep. Ser. 638 (1979), 60-80) durchgeführt.
Gruppen von 5 Mäusen und 5 Ratten wurden die PT-9K/129G- und PTF- 9K/129G-Mutanten (1 500 ug/kg Körpergewicht) intraperitoneal und subkutan inokuliert. Die Tiere wurden anschließend 14 Tage beobachtet, währenddessen keine Gewichtsveränderungen oder andere Symptome, die eine lokale oder systemische Reaktion angezeigt hätten, registriert wurden.

Beispiel 9

Entwicklung des azellulären anti-Pertussis-Impfstoffes

A) Analyse der Immunogenität der PTF-9K/129G-Mutante

Zur Untersuchung der Immunogenität der PTF-9K/129G-Mutante wurden Gruppen von sechs 4 Wochen alten Meerschweinchen mit einem Gewicht von 350 g 0,5 ml pyrogenfreie, sterile physiologische Kochsalzlösung subkutan inokuliert, die 0,001 mg Natriumethylquecksilberthiosalicylat, 3, 10, 25 und 50 ug PTF-9K/129G, das an AL(OH)&sub3; (1 mg/ml) absorbiert war, und 0,75 ml (entsprechend dem 1,5fachen der menschlichen Dosis) des klassischen, trivalenten DPT-Impfstoffs (anti-Diphtherie, anti- Pertussis und anti-Tetanus) (SCLAVO, S. p. A.) aus abgetöteten B. pertussis als Pertussis-Bestandteil enthielt.
4 Wochen nach der ersten Impfung wurden Blutproben entnommen und den Tieren erneut die gleiche Dosis PTF-9K/129G und DPT-Impfstoff subkutan inokuliert. 2 Wochen nach der zweiten Impfung wurden weitere Blutproben entnommen. Die aus den Proben erhaltenen Seren wurden anschließend zur Ermittlung des Antikörper- und anti- PT Titers mit dem ELISA Test und zur Ermittlung der Fähigkeit der Antikörper zur Neutralisierung von PT mit dem CHO-Test untersucht. Der ELISA Test, der eine modifizierte Version des von Engvall tind Perlmann (J. Immunol. 109 (1972), 129-135) beschriebenen Verfahrens war, wurde, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt:
Einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol mit flache Böden aufweisenden Vertiefungen (Dynatech Laboratories Inc., Alexandria, VA) wurden pro Vertiefung 200 ul PBS, pH-Wert 7,4, die 1 ug gereinigtes PT (Antigen) enthielt, zugesetzt. Die Antigen-Adsorption an der festen Phase wurde in einer feuchten Kammer 3 Stunden bei 37ºC und anschließend über Nacht bei 4ºC durchgeführt. Nachdem zur Minimierung der nicht-spezifischen Adsorption der Serumproteine an das Plastikmaterial 1 % BSA in PBS zugesetzt worden war, wurden die Serumproben, die aus Meerschweinchen erhalten und mit 0,05 % Tween-20 enthaltendem PBS in einer Verdünnungsreihe auf 1:9 120 verdünnt worden waren, jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte zugesetzt und 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Schließlich wurden Ziegen-anti-Meerschweinchen-IgG-Antikörper, die mit alkalischer Phosphatase (Miles, Yeda, Israel) konjugiert waren, die 1:3 000 mit 0,05 % Tween-20 enthaltendem PBS verdünnt waren, jeder Vertiefung zugesetzt und die Platten 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Volumina von 100 ul wurden in allen Schritten und zum Waschen der Platten zwischen den Inkubationen verwendet. Die Waschschritte wurden dreimal unter Verwendung von 0,05 % Tween-20 und 0,02 % NaN&sub3; enthaltendem PBS durchgeführt. Die kolorimetrische Reaktion, die sich bei Raumtemperatur 30 Minuten nach Zugabe des spezifischen Substrats (p-Nitrophenylphosphat, 1 mg/ml) entwickelte, wurde bei 405 nm in einem "Titertek Multiskan" (Flow Laboratories, Mclean, VA) gemessen.
In jeder Platte waren Vertiefungen als Kontrolle mit Serumproben ohne Antigen und umgekehrt. Die Antikörpertiter wurden ermittelt, wobei in einer graphischen Darstellung die Verdünnungen des Serums (Abszisse), das in zweifacher Ausführung getestet wurde, gegen den Durchschnitt der jeweiligen Absorptionen (Ordinaten) dargestellt ist. Der Schnittpunkt zwischen dem Wendepunkt der Kurve und der Absorptionsachse zeigte den Wert der Absorption des unverdünnten Serums (ABS- MAX). Die ABS-MAX Werte, die für jede Gruppe von mit DPT und unterschiedlichen Dosen an PTF-9K/129G immunisierten Tieren erhalten worden waren, wurden nach je der Probennahme mit den jeweiligen Prä-Immunseren (Figur 7) verglichen. Die Erhöhung des ABS-MAX wurde für statistisch bedeutsam gehalten, wenn er mindestens 4 Mal höher als der für ein Prä-Impfstoffserum erhaltene Wert war.
Wie aus der Figur 7 zu ersehen ist, zeigten die 4 Wochen nach der ersten Inokulierung entnommenen unverdünnten Seren Absorptionswerte (ABS-MAX, 1 Dosis) bei 405 nm, die 32 bis 40 Mal höher als die vor der Immunisierung ermittelten Werte waren. Eine weitere Erhöhung um 50 % (ABS-MAX, 2 Dosen) wurde bei Seren beobachtet, die zwei Wochen nach der zweiten Inokulierung entnommen worden waren.
Die nach der Immunisierung mit PTF 9K/129G beobachtete Erhöhung des Antikörpertiters korrelierte mit der ins CHO-Test ermittelten neutralisierenden Aktivität. Seren, die nach einer einzelnen Injektion von 3, 10, 25 und 50 ug PTF-9K/129G erhalten worden waren, konnten tatsächlich die Agglutinationswirkung auf CHO-Zellen, die durch 120 pg PT in Verdünnungen von 1:20, 1:20, 1:20 bzw. 1:80 induziert wurde, neutralisieren. Die Fähigkeit zur Neutralisierung des Toxins erhöhte sich nach der zweiten Immunisierung erheblich. Tatsächlich konnten Antikörper, die von Tieren erhalten wurden, die mit 3 ug PTF-9K/129G immunisiert worden waren, die Toxinaktivität in einer Verdünnung von 1:1,280 neutralisieren (Figur 7).

B) Analyse der Potenz eines zellulären anti-Pertussis-Impfstoffs in Mäusen

Gruppen von 16 3 bis 4 Wochen alten, männlichen CD1-Mäusen (Charles River, Calco, Italien) mit einem Gewicht von etwa 16 g wurden gemäß den OMS- Normen 0,5 ml sterile Kochsalzlösung intraperitoneal inokuliert, die 0,24, 1,20, 1,92, 4,80, 12,00 und 30,00 ug flüssiges (nicht absorbiert) PT-9K/129G und 0,24, 1,20, 6,00 und 30,00 ug der gleichen, mit 0,035 % Formaldehyd stabilisierten Mutante (PTF- 9K/129G), die an Al(OH)&sub3; (1 mg/ml) absorbiert war, enthielt. Als positive Kontrolle wurden Gruppen von Mäusen 0,00032, 0,001, 0,008 und 0,04 ml zellulärer anti- Pertussis-Standardimpfstoff (National Institute of Health, Bethesda, MD) intraperitoneal inokuliert. 14 Tage nach der Verabreichung wurden die Mäuse intrazerebral (IC) mit einer Suspension von virulenten B. pertussis (Stamm 18323, SCLAVO S. p. A.), die 300 im Durchschnitt letale Dosen enthielt, infiziert. Die Mäuse wurden anschließend 14 Tage beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle XIII dargestellt. Tabelle XIII Zellulärera Impfstoff Azellulärer Impfstoff absorbiert flüssig Dosis ml Überlebende Tiereb Maus
"a": Impfstoff enthält acht internationale schützende Einheiten/ml.
"b": Werte werden als Zahl der überlebenden Mäuse von insgesamt 16 getesteten Mäusen ausgedrückt.
"c": N. D. = Nicht ermittelt.
"d": Dosis, die 50 % der Mäuse gegen intrazerebrale Infektionen durch das virulente B. pertussis 18323 schützte.
Wie aus der Tabelle zu ersehen ist, induzierte das an Al(OH)&sub3; absorbierte PTF-9K/129G in einer Dosis von 1,2 ug/Maus in 50 % der Mäuse (PD&sub5;&sub0;) einen Schutz gegen Paralyse oder Tod.
Bessere Ergebnisse wurden mit flüssigem, nicht mit Formaldehyd behandeltem PT-9K/129G erhalten.
Bei Verwendung von PT-9K/129G als Immunogen wurde unmittelbar nach der intrazerebralen Immunisierung tatsächlich ein hundertprozentiger Schutz erreicht. Der PD&sub5;&sub0; (1,1 ug/Maus) veränderte sich jedoch nicht in signifikanter Weise.

Beispiel 10

Klinische Versuche mit dem azellulären anti-Pertussis-Impfstoff an erwachsenen Versuchspersonen

In dieser Untersuchung wurde die Toleranz und Immunogenität (Fähigkeit zur Induzierung spezifischer neutralisierender Antikörper) des azellulären anti-Pertussis- Impfstoffs, der PTF-9K/129G als aktiven Bestandteil enthielt, an einer Gruppe von Versuchspersonen getestet.
Dazu wurden 29 gesunde Erwachsene beiderlei Geschlechts ausgewählt, die anti-PT-Antikörpertiter unter 20 ELISA-Einheiten (EE)/ml aufwiesen. Die Patienten wurden gemäß ihrer Anamnese (unbekannt/negativ für Pertussis, positiv für die Krankheit, positiv für die Impfung) unterteilt.
Nach einer Zufallsauswahl innerhalb jeder Gruppe wurden die Patienten nacheinander behandelt mit:
1) Azellulärem anti-Pertussis-Impfstoff, der die PTF-9K/129G-Mutante enthielt (18 Versuchspersonen). Jede Dosis von 0,5 ml enthielt 15 ug PTF-9K/129G (aktiver Bestandteil), 0,001 mg Natriumethylquecksilberthiosalicylat und 0,5 mg Aluminiumhydroxid (Excipient). Oder
2) einem Plazebo, das aus einer Aluminiumhydroxid-Suspension mit einem dem Impfstoff vergleichbaren Aussehen bestand (11 Versuchspersonen). Nach einer Zufallsauswahl wurden jedem Patienten im Abstand von 6 Wochen 2 Dosen anti- Pertussis-Impfstoff oder 2 Dosen Plazebo in der Höhe des linken Deltamuskels intramuskulär verabreicht.
Die Patienten wurden nach Beginn des Experiments 3 Monate beobachtet und alle lokalen und/oder systemischen Nebenwirkungen notiert.
Die Verabreichung von vollständigem Plasma und/oder menschlichen Gammaglobulinen wurde 3 Monate vor Beginn des Experiments und während dessen gesamter Dauer vermieden.
Im gleichen Zeitraum wurde auch die Verabreichung von Cortisonverbindungen und/oder antihypertonischen Arzneimitteln vermieden.
Die Patienten wurden 30 Minuten nach der Verabreichung des Impfstoffs unter strenger Beobachtung gehalten. Während der 5 Tage nach der Verabreichung des Impfstoffs wurde jeden Tag die Körpertemperatur in der Achselhöhle gemessen und eine Untersuchung und Abtastung der Verabreichungsstelle und an den Stellen der oberflächlich gelegenen Lymphknoten-Satelliten ("satellite superficial lymphoglandular locations") durchgeführt.
4 Tage nach der Verabreichung des anti-Pertussis-Impfstoffs wurde jedem Patienten zur Durchführung von hämatologischen, hämatochemischen und immunologischen Tests (Aktivierungsmarker von lymphoiden Zellen wie CD3, CD4, CD19, CD25, CD23, CD14 und CD57; in vitro-Proliferation hinsichtlich PT, PT-9K/129G und Tetanustoxin-Antigenen) eine Probe des venösen peripheren Bluts entnommen.
30 Tage nach der Verabreichung des Impfstoffs wurden außer der Antikörpertitration Tests zur Messung der zellvermittelten Immunität und eine IgE- Titration durchgeführt.
Die gleichen Analysen wurden gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren nach der zweiten Impfstoff- oder Plazeboverabreichung durchgeführt.
Die Abwesenheit von Nebenwirkungen nach der ersten und zweiten Impfstoffverabreichung zeigte eine vollständige Toleranz gegenüber der PTF-9K/129G- Mutante an.
Für jede Versuchsperson wurden der anti-Pertussis-Antikörpertiter (ELISA- Test) und die neutralisierende Wirkung (CHO-Zellen) ermittelt.

Claims

1. Immunologisch wirksame Pertussistoxin-Mutante mit reduzierter oder keiner Toxizität, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest Glu129 und ein Aminosäurerest oder eine Kombination von Resten, ausgewählt aus Arg9, Asp11, Arg13, Trp26, Phe50, Gly86, Ile88/Tyr89, Asp11/Trp26, Asp11/Phe50, Arg13/Trp26, Arg13/Phe50 und Tyr8/Arg9, deletiert sind oder durch einen unterschiedlichen Aminosäurerest ersetzt sind, der ausgewählt ist aus den natürlichen Aminosäuren, ausschließlich Mutanten mit einer Arg9- oder Arg13-Deletion oder einem Ersatz von Arg9 oder Arg13 durch Glu in Kombination mit einem Ersatz von Glu129 oder Glu129/Tyr130.

2. Pertussistoxin-Mutante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäurereste Glu129 und Arg9 durch die Aminosäurereste Gly bzw. Lys ersetzt sind.

3. Pertussistoxin-Mutante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäurereste Glu129 und Trp26 durch die Aminosäurereste Gly bzw. Ile ersetzt sind.

4. Pertussistoxin-Mutante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäurereste Glu129, Arg13 und Trp26 durch die Aminosäurereste Gly, Leu bzw. Ile ersetzt sind.

5. Pertussistoxin-Mutante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäurereste Glu129 und Arg13 durch die Aminosäurereste Gly bzw. Ile ersetzt sind.

6. Pertussistoxin-Mutante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäurereste Ile88, Tyr89 und Glu129 durch die Aminosäurereste Glu, Ser bzw. Gly ersetzt sind.

,7. Bordetella-Stamm, dadurch gekennzeichnet, daß das Bordetella-Chromosom ein Gen enthält, das ein Pertussistoxin codiert, und Expressions- und Sekretions-Regulationssequenzen, wobei die S1-Untereinheit-Nucleotidsequenz eine Pertussistoxin-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert.

8. Bordetella-Stamm nach Anspruch 7, wobei Bordetella Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis oder Bordetella bronchiseptica ist.

9. Bordetella pertussis (W28) PT-9K/129G (ATCC 53894)

10. Bordetella parapertussis PT-261/129G (ATCC 53893)

11. Verfahren zur Herstellung eines Bordetella-Stamms nach einem der Ansprüche 7 bis 10, umfassend die folgenden Schritte:

a) Auswählen eines Wildtyp-Bordetella-Stamms, der resistent gegenüber mindestens einem Antibiotikum ist;

b) Ersetzen des chromosomalen Gens, das das Pertussisgen codiert, im in (a) erhaltenen Stamm mit einem Gen, das ein unterschiedliches Protein codiert, durch homologe Rekombination;

c) Auswählen eines Bordetella-Stamms, der frei ist von dem in (b) erhaltenen PT (Δtox)-Gen;

d) Mutagenisierung des aus B. pertussis isolierten Pertussistoxin-Gens, wobei ein Gen produziert wird, das eine Pertussistoxin-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert;

e) Insertion des mutagenisierten Gens in ein geeignet modifiziertes Plasmid, das in Bordetella nicht replizierbar ist;

f) Insertion des Plasmids in Bordetella-Stämme (Δtox) die in (c) ausgewählt wurden, durch Konjunktion und schließlich

g) Isolieren der Bordetella-Stämme, in denen eine homologe Rekombination mit dem mutagenisierten Pertussistoxin-Gen stattgefunden hat.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei in Schritt d) das Pertussistoxin-Gen vom Plasmid PT-101 ATCC 67854 isoliert wurde.

13. Verfahren zur Herstellung einer Pertussistoxin-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 6, erhalten durch folgendes Verfahren: Züchten eines Bordetella-Stammes nach den Ansprüchen 7 bis 10 und Isolieren und Reinigen der Pertussistoxin-Mutante.

14. Verwendung einer Pertussistoxin-Mutante nach einem der Ansprüche 1 bis 6 als Wirkstoff für die Herstellung eines zellulären anti-Pertussis-Impfstoffes, der Menschen eine wirksame Schutzimmunität gegen Infektionen durch virulente Bordetella pertussis verleihen kann.

15. Verwendung der Bordetella-Stämme nach einem der Ansprüche 7 bis 10 als Wirkstoff für die Herstellung von zellulären anti-Pertussis-Impfstoffen, die Menschen eine wirksame Schutzimmunität gegen Infektionen durch virulente Bordetella pertussis verleihen können.

16. Immunogene Formulierung, geeignet als azellulärer anti- Pertussis-Impfstoff, der in Menschen Schutzimmunität gegen Infektionen durch virulente Bordetella pertussis induzieren kann, enthaltend eine immunologisch wirksame Menge einer Pertussistoxin-Mutante nach jedem der Ansprüche 1 bis 6.

17. Immunogene Formulierung, geeignet als zellulärer anti- Pertussis-Impfstoff, der im Menschen eine Schutzimmunität gegen Infektionen durch Bordetella pertussis induzieren kann, enthaltend eine immunologisch wirksame Menge eines Bordetella Stamms nach den Ansprüchen 7 bis 10.

18. Verfahren zur Herstellung einer Pertussistoxin-Mutante nach der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend den Schritt der Behandlung mit Formaldehyd zwischen 0,035 % (Gew./Vol.) und 0,420 % (Gew./Vol.) zum Erhalt einer thermisch stabilen Pertussistoxin-Mutante.

19. Gen, das eine Pertussistoxin-Mutante nach der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert.

20. Plasmid, enthaltend das Gen gemäß der Definition in Anspruch 19.

21. Mikroorganismus, transformiert mit einem Plasmid gemäß der Definition in Anspruch 20.