KR0168039B1

KR0168039B1 - 재조합 dna에서 유도한 보르데텔라 외독소 소단위체의 유사체 및 그를 포함하는 백신

Info

Publication number: KR0168039B1
Application number: KR1019890700803A
Authority: KR
Inventors: 닐 버네트 3세 월터
Original assignee: 로버트 디. 웨스트; 암젠 인코포레이티드
Priority date: 1987-09-04
Filing date: 1988-08-26
Publication date: 1999-01-15
Also published as: US5773600A; EP0306318B2; ATE125568T1; DE3854213D1; DK175821B1; GR3017497T3; NO891842L; DE3854213T2; EP0629696A1; WO1989001976A1; FI101632B; KR890701758A; DE3854213T3; IE69753B1; AU2386488A; EP0306318A1; JPH04501051A; IL103121A; FI892131A; DK216289D0

Abstract

내용없음

Description

[발명의 명칭]

재조합 DNA에서 유도한 보르데텔라 외독소 소단위체의 유사체 및 그를 포함하는 백신

[발명의 상세한 설명]

[본 발명의 배경]

본 출원은 1987년 9월 4일자로 제출한 미국 특허출원 번호 제094,307호의 일부 계속 출원이다.

본 발명은 이종성 단백질 부분과의 융합에 의존하지 않고, E. coli에서 보르데텔라(Bordetella) 외독소의 S1, S2, S3, S4 및 S5 소단위체 유사체를 고수준으로 직접 재조합 발현시키는 것에 관한 것이다. 특히, 소단위체의 유전공학 처리된 변이체는 독소-중화 수준의 항체를 유도하는 능력을 지니고 실질적으로 반응원성(reactogenic) 성분이 없는 보르데텔라 독소 유사체류를 제공한다. 유전공학 처리된 소단위체는 면역원성 효능을 지니고 실질적으로 반응원성 성분이 없는 소단위체 백신을 생성하는 데 사용할 수 있다. 보르데텔라 외독소란 용어는 백일해균(B. pertussis), 파라백일해균(B. parapertussis) 및 기관지패혈증균(B. bronchiseptica)과 같은 여러 종의 보르데텔라 게놈에 의해 암호화된 독소군을 의미한다. 보르데텔라 외독소를 나타내는 데 보통 사용되는 다른 용어는 백일해 독소(PTX), 임파구증가-촉진인자(LPF) 및 도(islet)-활성 단백질(IAP)이다.

백일해는 세계의 많은 지역에서 유아병 및 유아사망의 주요 원인으로 남아 있다. 전체-세포 백일해균 백신이 이 병을 치료하는 효과적인 수단으로 제공되었다. 그러나 이러한 백신의 사용은 경미한 부작용과 직접적인 관계가 있었고, 일시적으로 더 심한 부작용 및 경우에 따라서는 치명적인 신경학적 부작용이 발생하였다.

통용하고 있는 백신과 관련하여 알려진 해로운 부작용을 제거하기 위해 다방면의 노력을 하여 왔다. 이러한 결과, 무세포성 백신을 제조하여 시험하였으며, 더 안정한 재조합 산물을 개발하기 위한 노력으로 기본적인 연구가 이루어졌다. 제조합 DNA에서 유도한 백신을 클로닝하고 개발하는 중요한 첫 단계는 백일해 독소 오페론을 시퀀싱한 후 개개의 소단위체의 아미노산 시퀀스를 추론하는 것이다(Locht, C. 및 Keith, J.M., 1986, Science 232 : 1258-1264; Locht, 등의, 1986, Nucl. Acids Res. 14 : 3251-3261; 및 Nicosia 등의, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 4631-4635).

Nicosia 등(1987, Infect. Immun., 55 : 963-967)은 백일해균의 소단위체 S1, S2, S3, S4 및 S5 각각을 암호화하는 mRNA가 E. coli에서 클로닝된 유전자로부터 효율적으로 전사될 수 있음을 설명하였다. 비록 그들이 천연 백일해 독소의 다시스트론성 메시지의 고수준의 전사를 보여주려고 의도하였지만, 직접 발현에 의해 생성된 단백질의 양은 매우 적거나 측정이 불가능하였다. 더군다나, 결과로서 합성된 융합 단백질은 어떠한 중화나 방어 면역 반응도 이끌 수 없었다.

Barbieri 등(1987, Infect. Immun., 55 : 1321-1323)은 E. coli 내의 융합 단백질로서의 S1 소단위체의 발현을 설명하였다. 이들 융합 단백질은 베타-갈락토시다제의 초기 여섯 개 아미노산, pUC18 폴리링커에 의해 암호화된 다섯 개의 아미노산 다음에 S1 소단위체의 아미노산 2 내지 235를 포함한다. 소량으로 생성된 S1 융합 단백질은 고유의 또는 천연 백일해 독소의 약 25%의 ADP-리보실전이효소 활성도만을 가졌다.

Locht 등(Abstract, Modern Approaches to New Vaccines, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, Sept. 9-14, 1986)은 S1 소단위체의 아미노산 2 내지 187을 포함하는 융합 단백질을 발현시킬 수 있었다. 그들은 그 구조가 ADP-리보실전이효소와 결합하는 NAD-결합부위, 독소의 반응원성에 관여한다고 믿어지는 효소활성도가 결여되었다고 여겼기 때문에 그 구조는 독소 활성도가 없다고 예견하였다. 이 분자로 행한 이후의 실험은 이것이 근복적으로 감소하지 않은 효소활성도를 지닌 종을 절단함을 나타냈다. 공지된 선행 기술의 소단위체나 소단위체의 유사체 중 독소-중화 수준의 항체를 유도하는 능력을 지니고 반응원성과 관련된 효소활성도가 실질적으로 없는 것은 없다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 PTX 오페론(선행 기술인 Locht 및 Keith, 상기 문헌 참조)의 시스트론 순서에 대한 개략도이다. S1, S2, S4, S5 및 S3로 표시된 부위는 각각 이들 PTX 소단위체에 대하여 제안된 전사 해독 프레임을 나타낸다. 각각의 시스트론 바로앞의 채워진 부위는 추정상의 신호 시퀀스를 나타낸다. 각각의 시스트론성 요소의 바로 하류에 있는 제한효소 부위는 그 시스트론을 발현 벡터 내로 서브클로닝시키는 데 사용되는 하류 제한부위를 가리킨다. 각각의 신호 시퀀스 부위 바로 안쪽에 위치한 제한효소 부위는 시스트론의 자연 그대로의 신호 시퀀스로 미숙한 PTX 소단위체를 생성하기 위해 적당한 올리고데옥시뉴클레오티드 링커와 함께 전체 길이의 시스트론을 발현 벡터내로 서브클로닝시키기 위한 상류 제한부위로 사용하였다. 각각의 성숙한 PTX 소단위체의 전사 해독 프레임 바로 안쪽에 있는 제한효소 부위는 적당한 올리고데옥시뉴클레오티드 링커와 함께, 메티오닐-성숙 PTX 소단위체를 생성하기 위한 시스트론의 암호화된 신호 시퀀스 없이 시스트론을 서브클로닝시키기 위한 상류 제한 부위로 사용하였다.

제2도는 재조합 PTX 소단위체의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 및 웨스턴 블로트이다. 왼쪽 패널 A는 측정가능한 양으로 생성된 제조합 PTX 소단위체를 쿠마시 브릴리언트 블루로 착색한 겔을 나타낸 것이다. 오른쪽 패널 A는 토끼의 폴리클로날 항-PTX 초면역 혈청을 사용한 평행한 겔의 웨스턴 블로트이다. PTX는 상업용-등급의 백일해 독소를 포함하고 있는 레인을 가리킨다. 이 결과는 재조합(r) S1, S2, S3 및 S5가 모두 상당한 양으로 생성되었음을 설명한다. 웨스턴 블로트는, rS1은 그것의 단밸질원 종으로부터 완전히 프로세싱된 것이고, rS2 및 rS5는 부분적으로 프로세싱된 것이고, rS3는 발효조건하에서 충분히 프로세싱되지 않은 것이며, rS4는 가시화될 수 있을 정도의 충분한 양으로 생성되지 않았음을 나타낸다. 패널 B는 메티오닐-성숙 재조합(rm) 소단위체로서의 발현 생성물을 나타낸 것이다. 이들 소단위체는 rmS1(보이지 않음)을 제외하고는 상당한 양으로 생성된다.

제3도는 rS2의 발현에 대한 상류 비암호화 시퀀스의 효과를 설명하는 웨스턴 블로트이다. 이 도면의 상세한 설명은 본문에 나타나 있다.

제4도는 재조합 S1의 ADP-리보실전이효소 활성도를 설명하는 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 오토래디오그램이다. 재조합 S1(500ng), 정제된 천연 백일해 독소(1 ㎍) 및 반응 완충액을 Manning 등의 1984, J. Biol. Chem. 259 : 749-766; West 등의 1985, J. Biol. Chem. 260 : 14428-14430 문헌에 기술된 바와 같이 실질적으로 [³²P]NAD의 존재하에서 소의 트랜스듀신(transducin)과 각각 반응시켰다. 시료를 차가운 10% 트리클로로아세트산으로 침전시키고, 침전물에 대하여 SDS-PAGE 및 오토래디오그래피를 연이어 실시하였다. 39Kd의 방사상 밴드가 리보실화된 트랜스듀신 소단위체이다. 레인 A는 반응완충액 대조, 레인 B는 천연 PTX, 레인 C는 rS1이다.

제5도는 마우스에서 rS1 및 rS4의 면역원성을 나타내는 방사선 면역측정 그래프이다. 재조합 S1, 메티오닐 rS4, 천연 백일해 독소(PTX), 상업용 백일해 백신, 또는 부형제(NMS)로 마우스를 초면역 시켰다; 몇몇 제제는 프로인트 완전 보조액(CFA)을 포함한다. 혈청을 수집한 다음 고체상 방사선면역측정방법으로 그들의 항-PTX 역가에 대한 희석도를 검사하였다.

제6도는 백일해균의 대뇌내 항원투여에 대항하여 마우스에서의 rS1 및 rS4의 면역방어 잠재력을 설명하는 그래프이다. 도면의 상세한 설명은 본분에 나타나 있다.

제7도는 pPTXS1(6A - 3/4 - 1)의 발현에서 유도한 rS1 돌연변이체의 연역된 아미노산 시퀀스이다.

제8a 및 8b도는 재조합 유사체 S1의 ADP-리보실전이효소 및 NAD 당가수분해효소 활성도의 그래프이다.

제9도는 정제된 S1 소단위체 단백질의 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 오토래디오그램이다.

제10도는 재조합 S1/1 또는 재조합 S1/1-4 둘 중 어느 하나와 천연 B 올리고머와의 조합으로부터 완전독소의 천연, 비-환원, 비-변성 폴리아크릴아미드 겔의 오토래디오그램이다.

제11도는 광학현미경으로 세포집락의 존재여부를 검사한 세포 단층 사진이다.

[본 발명의 요약]

본 발명은 보르데텔라 외독소의 소단위체 S1을 암호화하는 부분 또는 이 부분의 단편이나 유도체 중 적어도 하나를 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공하는데, 여기서 상기 부분 또는 단편이나 유도체는 (a)독소-중화 수준의 항체를 유도할 수 있고 (b) 실질적으로 반응원성 성분이 없는 생물학적 활성도를 지닌 폴리펩티드를 암호한다. 폴리펩티드 S1 소단위체 또는 그것의 소단위체 유사체는 백일해 독성에 대항하는 면역방어를 제공하는 데 중요하다고 알려진 주요 에피토프를 포함한다. 독소-중화 수준의 항체는 백일해 독성에 대항하는 면역방어를 제공한다. 부위-특이 돌연변이유발 결과 효소학적으로 실질적으로 불활성인 소단위체 S1의 유사체가 생성된다.

[보르데텔라]

외독소의 유전공학 처리된 S1 소단위체 및 이 소단위체의 유사체는 백일해 질병의 예방에 사용하기 위한, 재조합 DNA에서 유도한 소단위체 백신 물질을 제공한다. S1 소단위체 및 그것의 유사체는 단독으로 또는 소단위체 S2, S3, S4 및 S5 및 이들의 혼합물과 배합된 백신 생성물을 제공할 수 있다. 소단위체 S2, S3, S4 및 S5는 백일해균으로부터 정제할 수 있거나 융합 또는 비융합 생성물로서 재조합적으로 유도할 수 있다. 보르데텔라 외독소의 소단위체 S2, S3, S4 및 S5의 고수준의 재조합 발현은 또한 직접적인 비융합 방법에 의해 E. coli에서 수행될 수 있다. 효모, 예를들어 사카로마이시즈 세레비시에(S. cerevisiae) 및 박테리아 미생물, 예를들어 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium) 또는 티푸스균(salmonella typhi), 바실러스속(Bacillus) sp. 및 바이러스, 예를들어 종두바이러스(Vaccinia)를 포함하는 선택적인 재조합 숙주들을 이들 소단위체 유사체의 발현을 위해 사용할 수 있다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 백신 생성에 필요한 모든 PTX 소단위체를 고수준으로 직접 재조합 발현시키는 것에 관한 것이다. 또한, S1 소단위체의 유사체는 면역원성이 높고 실질적으로 반응원성 성분이 없는 생물학적 활성도를 제공하는데, 이러한 성분은 백일해균에서 추출한 백신 물질과 함께 발견되며 반응원성인 것으로 알려진 백일해균의 외생 성분(예를들어, 내독소) 및 독성과 반응원성에 관련된 독소 분자의 효소활성도이다. 단독으로 또는 PTX의 다른 소단위체와 함께 배합된 S1 유사체는 비-변형된 천연 또는 재조합-유도 소단위체에 존재하는 반응원성 성분으로부터 부작용의 가능성을 크게 감소시키고 효능이 있는 백신 생성물을 제공할 수 있다.

백일해균 독소의 개개의 소단위체인 S1, S2, S3, S4 및 S5를 E. coli에 각각 서브클로닝시키고 직접 발현시켰다. 신호 시퀀스는 재조합 S1(rS1)의 발현에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타난다. 신호 펩티드가 없을 때에는 얼마안되는 양의 rS1이 E. coli에서 발현되었다. S1 소단위체의 천연 리더(leader) 또는 합성 리더가 단백질원 상에 존재하면, 총 세포 단백질의 10~30% 범위에서 고수준의 발현이 수득된다. 10리터의 유가 발효조(fed-batch 10-liter fermentor)에서 생산 규모(production scale)로 rS1 발현자 세포(expressor cell)를 발효(8 mg S1/0D-L의 비-최적 발현 수준)시킨 결과, 제2도에 나타난 바와 같이 rS1이 그것의 성숙한 종으로 거의 완전히 단백질 가수분해 프로세싱되었다. 발현자 세포의 실험실 규모(laboratory scale)의 발효로 불완전하게 프로세싱된 S1이 생성되었다; 단백질원과 성숙한 단백질 모두 대수 세포성장에 따름을 발견하였다. E. coli의 절단가능한 합성 리더 시퀀스가 신호 프로세싱(processing)을 촉진시키지 못하였으므로, 백일해균 단백질 가수분해 절단부위에 대한 E. coli 리더 펩티드 가수분해 효소의 모순된 인식으로 인해 불완전하게 절단된 것은 아님을 시사하였다. 플라스미드 발현 E. coli 리더 펩티드 가수분해 효소와 함께 고수준으로 형질전환된 세포를 사용하여 신호 펩티드 가수분해 효소 합성을 증가시키거나 복제수가 낮은 벡터를 사용하여 S1 발현 수준을 감소시킴으로써 프로세싱 장애를 극복하는 데 실패한 것은 이 문제가 절단 경로의 포화에 있지 않다는 것을 나타냈다. 이러한 결과는 E. coli 내에서 외래 단백질의 번역후 프로세싱이 성장세포의 생리학적 상태에 관하여 거의 알려지지 않은 기작에 의해 조절될 수 있음을 설명한다.

PTX 소단위체인 S2, S3, S4 및 S5는 제2도에 나타난 바와 같이 E. coli에서 유사하게 발현되었다. 재조합 S1과 마찬가지로, rS2, rS3 및 rS5 소단위체는 실험실 규모의 발효시 불완전하게 프로세싱되는 것으로 보였다. rS1은 생산 규모의 발효시 완전히 프로세싱될 수 있기 때문에, 완전히 프로세싱된 형태의 다른 소단위체를 얻는 데에 유사한 발효 조건을 이용할 수 있다. rS1과는 대조적으로, rS4 소단위체는 성숙한 메티오닐 폴리펩티드로서 고수준으로 발현될 수 있지만, 그것의 천연 리더 펩티드 시퀀스와 함께 발현되었을 때는 검출할 수 없었다. 소단위체 S2, S3, S4 및 S5는 이제 모두 성숙한 메티오닐 폴리펩티드로 발현되었다. 이들 분자의 아미노산 분석은, 이종성(천연이 아닌)메티오닐 잔기가 세포성 메티오닌 아미노펩티다제에 의해 각각의 종(S4를 제외하고)으로부터 충분히 제거되어 천연 시퀀스의 완전히 성숙한 단백질이 제공됨을 알 수 있게 한다. 메티오닐 잔기는 세포 효소에 대한 아미노 말단 인식 시퀀스의 불일치 때문에 재조합 S4로부터 충분히 제거되지 않는다. 모든 재조합 단백질을 용해된 세포로부터 봉입체로서 회수하였다. 소단위체는 원래의 천연 소단위체와 실질적으로 동일한 SDS-PAGE 내의 이동양식을 갖거나 모노클로날 및 폴리클로날 황독소 혈청과 함께 웨스턴 블로트에서 반응함을 발견하였다. 제2도에 나타난 바와 같이, E. coli에서 소단위체 S1, S2, S3, S4 및 S5 소단위체의 고수준의 재조합 발현은 직접적이고 비융합적인 방법으로 수행한다.

선택적인 방법 및 물질을 본 발명의 실시에 사용할 수 있기는 하나, 바람직한 방법 및 물질을 아래에 기술한다. 하기에 인용된 모든 참고문헌들을 본원의 참고자료에 포함한다.

[소단위체 S1, S2, S3, S4 및 S5의 재조합 발현을 위한 물질 및 방법]

[물질]

DNA 수식효소(modifying enzyme)는 뉴잉글랜드 바이오랩스(미국 메사츄세츠 베버리 소재), 베데스다 리서취 라보라토리스(매릴랜드 게이데스버그 소재), 뵈링거 맨하임 바이오케미컬스(인디애나 인디애나폴리스 소재) 및 인터내쇼날 바이오테크날러지스, 인코포레이티드(코네티컷 뉴해븐 소재)에서 구입하였다. 효소는 제조자의 권고에 따라 사용하였다. 모든 화학약품 및 생화학약품은 분석시약 등급이었다. 정제된 백일해 독소 PTX는 리스트 바이올로지컬 라보라토리스, 인코포레이티드(캘리포니아 캠벨 소재)에서 구입하였다. 합성 올리고뉴클레오티드는 Caruthers(1982, in H. G. Gussen 및 A. Lang [eds] Chemical and enzymatic synthesis of gene fragments, Verlag Chemie, Weinheim, FRG, PP 71-79)에 따라 합성하였다. 전체 PTX에 대한 토끼의 항혈청은 안티바디스, 인코포레이티드(캘리포니아 데이비스 소재)에서 제조하였고 천연 PTX로부터의 소단위체에 대항하는 NIAID 로키 마운틴 라보라토리 모노클로날 항체는 표준 방법(Kohler 및 Milstein, 1975, Nature 256 : 495-497; Nowinski 등, 1979, Virology 93 : 111-126)에 의해 제조하였다. 방사성요오드화된 단백질 A 및 토끼의 항-마우스 lgG는 뉴 잉글랜드 뉴클리어(델라웨어 윌밍톤 소재)에서 구입하였다. 항-S1 모노클로날 항체 IB7(Sato 등, 1987, Infect. Immun. 55 : 909-915에 기술된 바와 같이)은 일본 개요의 H. Sato, NIH에서 기증받았다.

[플라스미드 및 박테리아 균주]

PTX 오페론을 포함하는 플라스미드 pPTX42는 Locht 및 Keith, 상기 문헌 및 Locht 등의 상기문헌에 기술되어 있다. 발현 플라스미드 pCFM1036, pCFM1146, pCFM1152 및 pCFM1156은 암젠에서 유도하였다. 암젠의 발현벡터계의 상세한 설명은 공개된 유럽 특허출원 번호 제136,490호에 기술되어 있고 본원에서 참고문헌으로 인용한다. 그러한 플라스미드는 유도프로모터, 합성 리보좀 결합부위, 클로닝 집락, 복제 플라스미드 기원, 전사 종결자, 플라스미드 복제수를 조절하는 유전자 및 카나마이신 내성 유전자를 포함할 수 있다. 유도된 플라스미드는 여러 면에서 서로 다르다. 플라스미드 pCFM1036은 다음의 올리고 뉴클레오티드 :

로 합성 PL 프로모터를 포함하는 유일한 Aatll 및 ECORI 제한부위 사이의 DNA 시퀀스를 치환함으로써 pCFM836(유럽 특허출원 번호 제136,490호)으로부터 유도할 수 있다. 플라스미드는 제한집락에 앞서는 유도 프로모터를 포함하지 않는다. 플라스미드 pCFM1146은 다음의 올리고뉴클레오티드:

로 유일한 Clal 및 Xbal 제한부위 사이의 작은 DNA 시퀀스를 치환하고, T4 폴리머라제 효소로 말단을 채운 다음 평활 말단 결합에 의해 두 개의 내인성 Ndel 제한부위를 파괴함으로써 pCFM836으로부터 유도할 수 있다. 플라스미드는 제한집락에 바로 앞서는 합성 리보좀 결합부위를 포함하지 않는다. 플라스미드 pCFM1156은 다음의 올리고뉴클레오티드:

로 유일한 Xbal 및 Kpnl 제한부위 사이의 작은 DNA 시퀀스를 치환함으로써 pCFM1146으로부터 유도할 수 있다. 플라스미드 pCFM1152는 플라스미드 pCFM512(유럽 특허출원 번호 제136,409호)로부터의 해당 DNA 단편으로, copB 프로모터를 포함하고 copB 유전자 부분을 암호화하는 Bg1ll 내지 Bg1ll(248 염기쌍) DNA 단편을 치환함으로써 pCFM1156으로부터 유도할 수 있다. 이 플라스미드는 pCFM1156 보다 낮은 복제수를 갖는다.

플라스미드 pBR322, pCU18, pUC19 및 파아지 M13mp 18 및 M13mp 19 DNA는 베데스다 리서취 라보라토리스에서 구입하였다. E. coli 리더 펩티다제에 대한 유전자를 포함하는 플라스미드 pTD125(Dale, T. 1983, J. Bacteriol. 143 : 76-83)는 W. Wickner(UCLA)로부터 기증받았다. E. coli FM5 세포는 C.F. Morris(Bachmann 등의, 1976, Bacteriol. Rev. 40 : 116-167)에게서 수득한 E. coli K-12 균주로부터 캘리포니아 싸우전드 오크스에 있는 암젠 인코포레이티드에서 유도하였고 삽입된 람다파아지 억제자 유전자, Cl₈₅₇(Sussman 등의, 1962, C.R. Acad Sci. 254 : 1517-1579)를 포함한다. 개개의 소단위체 발현 플라스미드의 구성을 본원에서 기술한다. 벡텨 제조, 세포 형질전환 및 콜로니선택은 표준 방법(Maniatis 등의, 1982, Molecular cloning : a laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York)에 의해 수행하였다.

[분석방법]

DNA 시퀀싱을 프라이머-연장, 사슬-종결 방법(Sanger 등의, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74; 5463-5467 : Heidecker 등의, 1980, Gene 10 : 69-73)으로 행하였다. 단백질의 시퀀스는 ABl 사의 470A 가스상 마이크로시쿼네이터(470A gas-phase microsequenator)에서 에드만 분해에 의해 자동적으로 분석되었다(Hewick 등의, 1981, J. Biol. Chem. 256 : 7990-7997; Hunkapillar 등의, 1983, Meth. Enzymol. 91 : 399-413). SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)은 Laemmli(1970, Nature 227 : 680-685)에 의해 기술된 바와 같이 수행하고, 폴리아크릴아미드 겔로부터의 폴리펩티드 용리는 Hunkapiller 등의(1983, Meth. Enzymol. 91 : 227-236) 방법에 의해 행하고, 웨스턴 블로팅은 Burnette(1981, Analyt. Biochem. 112 : 195-203)에 기술된 바와 같이 수행하였다. 총 세포성 단백질 또는 총 봉입체 단백질에 대한 재조합 단백질의 비율은 전체 세포 용해질 또는 봉입체 제제를 SDS-PAGE하고 쿠마시 브릴리언트 블루 R250으로 착색한 다음 적분 농도계(integrative densitometry)로 겔 스캐닝을하여 측정하였다. NAD-당가수분해효소 및 ADP-리보실전이효소에 대한 분석은 전술한 바와 같이 행하였다(Katada 등의 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 3129-3133; Lim 등의 1985, J. Biol. Chem. 260 : 2585-2588). 여러 가지 재조합 소단위체 제제에 대항하는 항혈청을 수반한 PTX에 대한 CHO 세포의 형태학적 반응(Hewlett 등, 1983, Infect. Immun. 40 : 1198-1203)의 감소는 Gillenius 등의 (1985, J. Biol. Stand. 13 : 61-66)의 방법에 의해 수행하였다.

[발현 플라스미드의 구성]

모든 플라스미드를 전술한 바와 같이 서로 다른 일련의 E. coli 발현 벡터로부터 구성하였다. 개개의 백일해 독소 소단위체 유전자 단편들을 선행 기술 제1도에 나타낸 제한부위를 사용하여 분리하였다; 상류 제한부위는 소단위체를 신호 펩티드-함유형으로 발현시키는 개시 코돈 바로 안쪽 또는 소단위체의 유사체를 메티오닐-성숙형으로 발현시키는 소단위체의 성숙하고 프로세싱된 형태의 아미노-말단 잔기에 대한 코돈 바로 안쪽이다. 어떤 경우에 있어서, 전체 B 올리고머의 공동발현은 S2의 상류 비암호화 부위 내지 S3 말단을 포함하는 단편을 사용하되 E. coli 발현 벡터의 합성 리보좀 결합부위를 제외시켰으며, 다른 경우에 있어서는, S2의 상류 비암호화 부위를 삭제하고 합성 E. coli 리보좀 결합부위를 삽입시켰다. 합성 올리고뉴클레오티드 링커는 합성 프로모터 및 리보좀 결합부위의 하류 최적 위치에서 발현 플라스미드 내로 유전자 단편을 삽입시키기 위해 이용하였다.

상류 링커는 각 유전자의 리딩 프레임을, 프리-소단위체 구성의 경우에 있어서는 원래의 개시코돈 뒤로 복귀시키거나 성숙한 아미노 말단의 첫째 코돈 뒤로 복귀시킨다; 후자의 올리고뉴클레오티드는 메티오닐 개시코돈을 함유했다. 일부 경우에 있어서, 결과적으로 생성되는 mRNA의 5' 말단 가까이의 이차구조의 전위를 감소시키기 위해 코돈을 변형하였다. 예를들어, 유해한 이황화물 상호작용의 가능성을 제거하기 위해 S1 소단위체 신호부위내 위치 3의 시스테인 코돈(Locht 및 Keith, 상기문헌)을 세린에 대한 코돈으로 치환하였다.

여러 가지 플라스미드 구성물로 E. coli FM5 세포를 형질전환시키고 카나마이신을 함유한 한천상에 평판화시킨 다음, 적당한 수의 콜로니를 선택하여 레플리카-평판화시키고(replica-plated), 소량의 액체 배양액(미니프랩)에서 배양한 후 4시간 동안 42℃에서 유도시켰다. 그런 다음 박테리아 세포에서 봉입체의 존재에 대해 광학 현미경으로 미니프랩을 스크린하였다. 뚜렷한 봉입을 나타내는 시료를 확인하여 레플리카 평판으로부터의 적합(matching) 콜로니를 유도온도에서 플라스크-규모(1 리터)로 실험실 발효하였다; 어떤 사료들은 나중에 10리터의 공업용 발효조에서 유가 발효를 실시하였다. 여러시간 유도후 발효시킨 다음 시료를 취하여 SDS-PAGE하고 쿠마시브릴리언트 블루-착색과 웨스턴 블로팅으로 적당한 PTX 소단위체의 양상에 대해 관찰하였다; 블로트를 적당한 모노클로날 항체와 먼저 반응시키고 오토래디오그래피로 검사한 다음 폴리클로날 항 -PTX 혈청과 반응시키고 다시 오토래디오그래피를 실시하였다. 각 발현 클론으로부터의 플라스미드 구조는 분리된 플라스미드의 제한 지도화에 의해 확인하고 결합부위(junction region)의 DNA 시퀀싱에 의해 입증하였다.

[재조합 S1의 발현]

S1 발현 플라스미드(pPTX S1/1)를 포함하는 E. coli 세포를 10리터의 유가 발효조에서 생산규모로 42℃에서 유도시키면, 세포는 SDS-PAGE에서 원래의 PTX S1과 함께 이동하는 약 26,000 달톤의 주요 세포내 단백질을 생성하였다(제2A도 왼쪽, rS1 레인). 부분적 아미노산 시퀀스 분석(5회)으로 이 폴리펩티드가 성숙한 S1 소단위체에 대해 예측된 아미노 말단 시퀀스(Locht 및 Keith, 상기문헌)를 갖는다는 것을 입증하였다. 웨스턴 블로트에서 마우스의 항-S1 모노클로날 항체와의 반응성에 의해 이 단백질을 면역화학적으로 S1으로 규정하였다(제2a도 오른쪽 rS1 레인).

1리터 플라스크 규모로 S1 발현자 세포를 실험실 발효하면 E. coli 내의 다른 PTX 소단위체의 발현에서도 관찰되는 현상인, rS1 신호 펩티드의 불완전한 절단을 초래한 것에 주의해야 한다(하기 참조). 단백질원 절단의 정도를 증가시키기 위해 고안된 일련의 실험에 의해 플라스크 규모로 나타나는 신호 프로세싱에 대한 분자 장애를 확인하기 위한 시도가 있었다. 즉, 낮은 복제수의 발현 벡터내로 S1 유전자의 삽입, 원래의 S1 신호펩티드에 대한 절단가능한 E. coli 합성 신호 시퀀스의 치환(Picker 등의 1983, Infect. Immun. 42 : 269-275), 및 이러한 효소의 구성수준을 증가시키기 위한 E. coli 리더 펩티다제에 대한 유전자를 포함하는 발현 플라스미드(Date, 상기 문헌)로 소단위체-발현 세포를 공동 형질전환시키는 것이 그것이다. 이러한 시도 중 어느것도 신호 절단에 있어서 어떤 분명한 변화를 가져오지 않았다. 그러나, 유가 처리한 발효조건의 변경은 프리-S1을 프로세싱하여 실질적으로 완전해진 성숙형이 되게 하였다.

성숙한 메티오닐 폴리펩티드(하기)로서의 S4 소단위체 발현에 대한 성공은 rS1에 대해서도 동일한 전략을 이용하도록 고무시켰다. 그러나 E. coli에서의 rS4 발현과는 달리, 성숙한 메티오닐 S1의 발현은 너무 낮아서 그것의 검출을 위해 웨스턴 블로트가 필요하였다. 반대로, 원래의 신호 시퀀스를 사용한 rS1의 발현으로 총 세포 단백질의 10~30% 수준으로 완전히 프로세싱된 폴리펩티드를 수득하였다. 후기하는 바와 같이, 재조합 수단에 의한 rS1의 성숙한 아미노 말단의 절단은 매우 고수준의 발현을 초래할 수 있다. 실제로, 성숙한 S1 시퀀스의 처음 두 개 잔기(AspAsp)를 MetVal로 치환하면 메티오닐 성숙형에 비하여 현저한 발현을 초래한다.

[S2, S3, S4 및 S5의 발현]

실행가능한 실험으로써, PTX S4 소단위체를 그것의 천연 리더 펩티드 없이 성숙한 메티오닐 단백질로 먼저 발현시키고, 상기한 대로 E. coli 내에서 고수준으로 생성시켰다(제2B도 왼쪽, rmS4 레인). 비록 SDS-PAGE에서의 이동이 전체 독소 시료로부터의 S4의 이동에 비해 약간 지연된다 할지라도, 그것은 예측된 S4 아미노산 시퀀스를 지니고 있었다. HPLC에 의해 백일해균으로부터 정제된 S4는 겔 전기영동에서도 동일한 지연을 나타낸다(Locht 등의 상기문헌). 재조합 S4는 웨스턴 블로트에서 폴리클로날 항혈청과 잘 반응하나(제2B도의 오른쪽 rmS4), S4 모노클로날 항체와의 반응성은 감소하였다.

S1에서 수득한 결과와는 대조적으로, 천연 리더 펩티드 시퀀스를 수반한 S4의 발현(locht 및 Keith, 상기문헌)은 검출할 수 없을 정도의 단백질을 생성시켰다(나타나 있지 않음). 그러나, Nicosia 등(상기문헌)이 보다 상류에 다른 번역 개시부위를 예측한 것에 주목해야 한다; S4 리더 펩티드내의 이러한 부가적 시퀀스의 사용은 훨씬 고수준의 발현을 가능하게 한다. 재조합 S2, S3 및 S5를 각각 그들의 천연 리더 시퀀스와 함께 발현시켰다(제2A도, 각각 rS2, rS3 및 rS5 레인); 유가 처리를 이용한 예비 생산-규모의 발효 실험이 S2 및 S5의 프로세싱에 있어서 현저한 증진을 제공한다해도, 이들 소단위체의 어느것도 실험실 규모의 발효 중에 완전히 프로세싱되지 않았다. S2, S3 및 S5 또한 그들의 천연 리더 펩티드와 함께 수득된 것들과 비교될 만한 수준에서 메티오닐-성숙형으로 E. coli 내에서 각각 발현시켰다(제2B도 각각 rmS2, rmS3 및 rmS5 레인). 상기한 바와 같이, S2, S3 및 S5의 이종성 메티오닐 잔기를 세포성 메티오닐 아미노펩티다제로 프로세싱하여 천연 시퀀스의 충분히 성숙한 폴리펩티드를 수득하였다.

B 올리고머 소단위체(S2-S4-S5-S3)를 나타내는 전체 폴리시트론성 단편을 P_L프로모터의 조절하에서 발현시켰다. 제3도는 S2 소단위체의 생성에 대한 상류 비암호와 부위의 영향을 나타낸 것이다. 한 경우에 있어서, 발현 플라스미드는 모두 다른 발현 플라스미드에 사용된 합성 리보좀 결합부위가 없는 것을 제외하고나는 S1의 종결코돈과 S2의 개시코돈(Locht 및 Keith, 상기문헌)사이의 전체 인터시스트론성(intercistronic) 부위를 보유했다. 이것은, 항-S2 모노클로날 항체로 웨스턴 블로트 실험을 하였을 때 완전히 프로세싱된 것으로 보이는 재조합 S2의 합성을 가져왔다(제3도, D 및 E); 비록 나타나 있지는 않지만, 폴리클로날 항체 분석은 다른 B 올리고머 소단위체 또한 그들의 성숙형으로 완전히 프로세싱된다는 것을 나타냈다. 합성 샤인-델가르노 시퀀스(Shine-delgarno Sequence)로 비암호화 인터시스트론성 단편을 치환하면 훨씬 높은 수준의 rS2 합성을 초래하였다(제3도, B 및 C 레인); 그러나, 이 물질은 불완전하게 프로세싱된다. 각 시스트론의 합성 효율은 메시지의 5' 말단에 대한 근접과 직접적으로 관련된 것으로 보인다, 즉 S2 S4 S5 S3. 오페론 잔존부를 발현정도가 높은 S1 구조의(상기 참조)하류에 위치시킨 예비실험은 매우 낮은 수준의 합성 및 S1을 포함하는 각 소단위체의 불완전한 프로세싱 결과를 가져왔다.

[재조합 PTX 소단위체의 특성]

완전히 프로세싱된 rS1이 원형질외극내 제한된 범위에서 발견될 것이라는 일부의 지적이 있기는 하나, 가령 존재한다면, 극소량의 프로세싱된 PTX 소단위체가 E. coli 세포로부터 분비되는 것처럼 보인다. 각 소단위체의 대부분은 봉입체 형태로 발견되었고 총 세포성 단백질의 10~30%로 구성되었다. 프렌치 프레스(French press) 및 저속 원심분리에 의한 세포 용해로 각각의 소단위체로서 그들 단백질의 65%까지를 포함하는 펠릿 분획을 수득했다.

모든 PTX 소단위체는 폴리클로날 토끼의 항독소 혈청을 이용하여 웨스턴 블로트로 검출가능하였다(제2도). 상기한 바와 같이, 소단위체 rS1 및 rS2는 웨스턴 블로트에서 특이 모노클로날 항체와 잘 반응하였다. 메티오닐 폴리펩티드로서 만들어진 재조합 S4는 항-S4 모노클로날 항체와의 반응성은 낮았다. rS3은 S2와의 밀접한 시퀀스 상동성(Locht 및 Keith, 상기문헌)으로 인해 항-S2 모노클로날 항체를 이용하여 웨스턴 블로트로 검출할 수 있기는 하나, 소단위체 S3 및 S5에 대한 모노클로날 항체는 이용할 수 없었다.

조(粗) 재조합 rS1 시료를 CHO 세포에서 분리한 막과 함께 [³²P]NAD의 존재하에서 배양시켰을 때약 41.000달톤의 단백질은 천연의 전체 PTX에 의해 리보실화되는 것과 동일하게 ADP-리보실화되었다; 이 분자는 아데닐레이트 사이클라제 복합체(adenylate cyclase complex)의 Ni막 조절 단백질인 것으로 여겨진다(Bokoch 등의 1983, J. Biol. Chem. 258 : 2072-2075; 및 Hsia 등의 1983, J. Biol. Chem. 259 : 1086-1090). 일반적인 검정을 위해, NAD로부터 백일해 독소-촉매된 ADP-리보스 전이를 위한 수용체로 설명되는 분자인 리보실라제의 기질로서 소의 트랜스듀신을 사용할 수 있다(제4도). Manning 등의 상기문헌; West 등의 상기문헌을 참조하라. 이 결과는 독소의 A 프로모터(S1 소단위체)상의 ADP-리보실전이효소 활성도의 위치를 확증하고, 재조합 백일해균 단백질이 E. coli 내에서 그것의 천연 3차 구조에 가까운 형으로 접혀진다는 것을 나타낸다. 또한 재조합 S1은 A 프로모터와 함께 확인된 NAD-당 가수분해효소 활성도를 나타냈다. 마우스를 면역시키고 rS1의 조봉입체 시료나 정제된 재조합 메티오닐 S4로 복강내 주사하여 추가항원자극 시켰다. 사용한 rS1 소단위체 물질은 완전히 프로세싱된 폴리펩티드와 프로세싱되지 않은 단백질원을 약 1 : 2의 비율로 포함했으며, 그 두 rS1 종의 상대적 면역원성은 알려져 있지않다. 항독소항체의 존재여부를 가리기 위해 고체상 RIA에서 혈청 시료를 실험하였다(제5도). 재조합 S1을 투여한 동물은, 면역량(immunizing doses)을 프로인트 완전 보조액과 함께 제형화했든 안했든 간에 상당한 항독소 반응을 일으켰다. 면역보강 형태로만 제공되는 재조합 S4 또한 면역보강된 전체 독소 및 상업용 백일해 백신에 비해 상당히 면역원성이었다.

배양된 CHO 세포를 전체 백일해 독소로 처리하면 항독소 혈청(Gellenius 등의 상기문헌)과 함께 폐기될 수 있는 집락(clustered) 형태(Hewlett 등의 상기문헌)가 된다. 예비실헙에서, 상기한 바와 같이 제조하고 상대적으로 높은 항독소 항체 역가를 갖는 rS1 또는 rS4에 대한 마우스 혈청은 일반적으로 천연 독소에 대한 CHO 세포 반응을 중화시킬 수 없었다.

[재조합 S1을 이용한 마우스의 면역방어]

조(粗) 재조합 S1, 정제된 재조합 S4, 및 적당한 대조 물질(상기참조)로 면역시킨 마우스를 백일해균 마우스 독성 균주 18323으로 대뇌내(i. c.) 항원투여한 다음 항원투여 후 45일 동안의 사망률을 기록하였다(제6도). 50㎍의 실험용품(1 : 35로 희석한 상업용 백일해 백신 100㎕)을 복강내 주사하여 마우스를 면역시켰다; 접종 후 21일째에 동일량으로 추가항원자극시키고 7일 후에 생존 백일해균 균주 18323(3×10⁴미생물/동물)을 i. c. 항원투여하였다. 재조합 제제내의 활성 완전독소의 결핍으로 방어를 기대할 수는 없었지만, 면역시키지 않은 대조에 비해 rS1으로 면역시킨 동물의 생존기간이 증가됨을 관찰한 것은 놀랄만한 것이었다.

또한, 면역보강된 rS1을 투여한 다수의 마우스는 항원투여에 대해서 완전히 방어되었다; 면역보강된 rS4로 면역시킨 마우스는 비록 양호한 항체반응을 나타낸다 할지라도(제5도 참조) 면역시키지 않은 마우스나 다름없이 방어되었다. 다른 예비실험에서, 면역보강된 rS1은 항원투여에 대한 투여량-반응 방어(dose-responsive protection)를 유도하는 것으로 나타났다. i. c. 항원투여 측정에 있어서 불완전한 방어는 면역화 물질내에 활성 완전독소의 결여에 그 기초를 둘 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이 예비연구에서 획득한 방어는 재조합 S1 단백질이 소단위체 백신 물질로서의 잠재력을 지닌다고 설명한다. 이후의 연구는 백일해균 마우스 독성 균주지닌다고 설명한다. 이후의 연구는 백일해균 마우스 독성 균주 18323의 대뇌내 항원투여에 대한 면역방어를 확인하지 못했다.

[S1 유사체]

단백질 공학 및 부위-특이 돌연변이유발 기술을 이용하여 절단형 S1 유사체를 제조하였다. 발린 7과 프롤린 14로 한정된 부위가 S1 분자의 ADP-리보실전이효소 활성도에 필요한 부위임이 밝혀졌다. 마우스에서 독소 활성도에 대하여 수동적으로 방어하는 모노클로날 항체와 결합하는 항원성 에피토프(즉, 방어 반응 유도와 관련된 에피토프)는 적어도 발린 7과 프롤린 14에 의해 한정된 부위 내에 집중적으로 위치한다. 포괄적으로, 발린 7과 프롤린 14에 의해 한정된 부위 내에서 S1 분자의 돌연변이 유발은 방어성 에피토프를 유지하는 반면 효소 활성도가 결여된 S1의 유사체 분자를 생성시켰다. 방어성 에피토프는 백일해 독성에 대항하는 면역방어를 제공하는 데 중요하다. 발린 7 내지 프롤린 14 부위내 아미노산 중 하나 이상의 치환 및/또는 삭제를 포함하여 변형시킨 결과 독소-중화 수준의 항체를 유도할 수 있고 실질적으로 반응원성 성분이 없는 S1 유사체를 생성하였다.

[pUC18 내로 PTX S1 유전자의 서브클로닝]

백일해 독소(PTX)에 대한 전체 오페론을 포함하는 플라스미드 pPTX42를 형질전환 JM109 세포로서 J. Keith(NIAID, 로키 마운틴 라보라토리)에게서 수득하였다. 암피실린을 함유하는 L-육즙 내에서 박테리아를 배양시킨 후 플라스미드를 회수하여 표준 방법(Maniatis 등의, 상기 문헌)으로 정제하였다. 제한효소 Aval 및 Xbal으로 플라스미드를 절단한 다음 아크릴아미드 겔 전기영동에 이어 겔로부터 DNA를 용리시킴을로써 pPTX42로부터 PTXS1 유전자(시스트론)(Locht 및 Keith의 상기문헌) 부분을 함유하는 792-bp DNA 단편을 분리하였다. 이 DNA 단편은 프리-S1 단백질에 대한 전사 해독 프레임의 바로 안쪽 Aval 부위에서 시작하여 S1에 대한 종결코돈의 Xbal 부위에서 끝난다. 또한 표준 클로닝 벡터 pUC18을 Aval 및 Xbal으로 절단한 후 이 절단을 포스파타제로 처리하였다. 표준 조건하에서 절단된 pUC18 벡터, pPTX42의 792-bp DNA 단편(Avla-Xbal) 및 T₄DNA 리가아제로 결합반응을 수행하였다. 신선한 감응 DH52α세포를 결합 혼합물로 형질전환시킨 다음 암피실린과 블루-갈(Blue-gal)(미국 매릴랜드 게이더스버그 소재 베데스다 리서치 라보라 토리스에서 구입)을 포함하는 L-육즙의 한천 평판상에서 형질전환체를 선택하였다. 12개의 흰 콜로니를 선택하고, 레플리카 평판화시킨 후, 2ml의 액체 배양액에서 배양하였다. 표준 알칼리 용해 방법으로 세포를 미니프렙하여 DNA를 Aval 및 Xbal으로 절단시킨 다음 절단물을 아크릴아미드 겔 전기영동시켰다.

[rPTX1 발현 플라스미드 pPTXS1/1의 구성]

792bp의 Aval-Xbal 단편을 예기한 바와 같이 플라스미드 pPTX42로부터 분리하였다. E. coli 발현 플라스미드 pCFM1156 및 pCFM1036은 미국 캘리포니아 사우전드 오크스 암젠 인코포레이티드의 Char les F. Morris에게서부터 수득하였다. 플라스미드 pCFM1156을 제한효소 Sstl 및 Ndel으로 절단시키고 1.8kb의 DNA 단편을 NA45 페이퍼상의 전기용리에 의해 아가로스 겔로부터 분리하였다(Schleicher Schuell, keene, N. H.). 플라스미드 pCFM1036을 Sstl 및 Xbal으로 절단시키고 2.8kb의 DNA 단편을 상기와 같이 분리하였다. S1 전사 해독 프레임의 삭제된 부분을 재구성하는 올리고데옥시뉴클레오티드 링커의 두 상보적 가닥을 Caruthers 등의(상기 문헌)아미노포스핀 케미스트리(aminophosphine chemistry)로 합성하였다. 원래의 아미노산 시퀀스를 유지시키면서, 메신저 RNA의 이차구조의 전위를 감소시키기 위하여 그의 코돈 사용 한도 내에서 합성 단편의 시퀀스를 변형시켰다; 단백질원의 신호와 성숙한 단백질의 위치 41 및 199의 두 시스테인 잔기 사이의 어떤 이황화물 상호작용도 제거하기 위하여 단백질원 신호 시퀀스의 아미노산 위치 2에서 시스테인 코돈을 세린 코돈으로 치환하는 것은 예외이다. 이 올리고데옥시뉴클레오티드링커는 pCFM1156의 한쪽에 결합할 수 있는 Ndel 부위와 S1 유전자의 792-bp DNA 단편의 Aval 부위에 결합하기 위한 Aval 부착 말단을 지녔다. 이 올리고데옥시뉴클레오티드의 시퀀스는 다음과 같았다. :

pCFM1036의 2.8kb DNA 단편, pCFM1156의 1.8-kb DNA 단편, S1 유전자 단편을 포함하는 792-bp DNA 단편, 올리고데옥시뉴클레오티드 링커, 및 T4 DNA 리가아제로 결합반응 시켰다. 결합 후, FM6 세포(미국 캘리포니아 사우전드 오크스 암젠 인코포레이티드의 C.F. Morris에게서 수득)를 결합 혼합물로 형질전환시킨 다음 카나마이신을 수반한 L-육즙 한천에 평판화시켰다. 콜로니를 선택한 후 알칼린법(Maniatis 등의 상기문헌)으로 레플리카-평판화시키고 미니프렙하였다. 미니프렙한 DNA 시료를 제한효소 지도화한 결과 예상한 DNA 제한단편을 포함함이 밝혀졌다. 합성 링커의 시작으로부터 진정한 S1 유전자의 전사 해독 프레임내로의 부위를 DNA 시퀀스 분석에 의하여 평가하였다. 이후의 이 플라스미드의 유도는 재조합 S1 단백질의 고수준의 발현을 가져왔다.

[rPTXS1이 발현 플라스미드 pPTXS1/2의 구성]

Accl 및 Sphl으로 절단시켜 플라스미드 pPTXS1/1으로부터 181-bp의 DNA 단편을 분리하였다; 이후에 DNA 단편을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정제하였다. 이 DNA 단편은 S1 유전자 내부의 좌측 부분이다. 동일한 방법을 사용하여, 우측 부분에 남아있는 유전자를 나타내는 564-bp의 DNA 단편을 pUC18 내로 클로닝된 PTXS1으로부터 분리하였다. 이는 pCU18 클로닝 집략 내의 BamHl 부위에서 S1 클로닝 부위(Xbal)의 하류를 절단하는 효소인 BamHl 및 Sphl으로 플라스미드를 절단시킴으로써 수행하였다. 발현 백터 pCFM1156을 제한효소 Ndel, Sstl, 및 BamHl으로 절단한 다음 아가로스 겔 전기영동 및 DNA 단편의 전기용리에 의해 1.8kb 및 2.8kb의 DNA 단편을 분리하였다. 올리고데옥시뉴클레오티드 링커를 합성하였다; 이 이중가닥의 링커는 Ndel 및 Accl 부착 말단을 지녔으며 그 시퀀스는 다음과 같았다 :

pPTXS1/1으로부터의 181-bp(Accl-Sphl) 및 564-bp(Sphl-BamHl) DNA 단편, pCFM1156으로부터의 1.8kb(Ndel-Sstl) 및 2.8kb(Sstl-BamHl) DNA 단편, 올리고데옥시뉴클레오티드 링커, 및 T4 DNA 리가아제를 사용하여 표준 방법(Maniatis 등의 상기 문헌)으로 결합시켰다. 결합시킨 후, 신선한 감응 FM5 세포를 형질전환시키는 데 이 혼합물을 사용하였다. 카나마이신-내성 형질전환체를 수득하고, 플라스미드 DNA의 미니프렙 상에서 제한효소 분석을 수행한 후, 결합부위의 DNA 시퀀스 분석으로 구조를 확인하였다.

[pPTXS1/2의 Ba131 절단 및 절단된 S1 유전자를 수반한 벡터의 구성]

성숙한 S1 분자의 아미노 말단에 가까운 효소학적-활성부위와 중요한 항원성 에피토프를 평가하기 위하여 이 단백질의 절단 변이체를 제조하였다. 발현 플라스미드 pPTXS1/2를 Ndel으로 절단하고 표준 조건하에서 엑소뉴클레아제 Ba131(IBI)로 처리한 후, 110분까지 여러 시간대에서 분취량을 취하였다. 65℃에서 15분간 Ba131을 불활성화시킨 다음, 아가로스 겔 상에서 전기영동법에 의한 전기영동 이동성의 증가에 대해서 시료를 분석하였다. 100분 및 110분대 분취량으로부터 시료를 풀링한 후(분획 A)남아있는 시료들을 풀링하여 부가 Ba131로 절단시켰다; 180분까지 여러 시간대에서 분취량을 취하였다. 반응을 팍칭(quenching)시킨후, 전기영동 이동성의 증가에 대해 시료를 다시 분석하고 네 개의 부가 분획(B, C, D 및 E)을 유지시켰다. 다섯 개의 분획 각각을 Sstl으로 개별적으로 절단시켜서 3-3.5kb의 DNA 단편들을 전기용리에 의해 아가로스 겔로부터 분리하였다.

발현벡터 pCFM1156을 Sstl 및 Hpal으로 절단시킨 후, 1.8-Kb의 DNA 단편을 상기와 같은 방법으로 분리하였다. pPTSX1/2로부터의 개별적인 3-3.5Kb의 DNA 단편(Bal31 블런트-Sstl)을 표준 조건하에서 T4 DNA 리가아제를 사용하여 1.8-kb의 DNA 단편(Sstl-Hpal)과 결합시켰다. 신선한 감응 FM5 세포를 각각의 개별 결합혼합물로 형질전환시킨후 카나마이신-내성 형질전환체를 분리하였다. 분획 A와 B 절단형의 각 형질전환체를 선택한 후, 미니프렙을 42℃에서 유도시키고, 봉입체의 존재여부를 확인하기 위하여 광학 현미경으로 시료를 검사하였다. 봉입 양성 시료를 미니프렙하여 Xbal으로 절단한 후, 아가로스 겔 전기영동으로 DNA 삽입물의 크기를 조사하였다. 절단형의 구조를 확인하기 위한 DNA 시퀀싱을 위하여 600-650 bp 크기의 범위인 시료를 선택하였다. 발현된 재조합 단백질에 대한 이후의 분석은, S1 분자의 ADP-리보실전이효소 활성도에 필요한 부위 및 방어 반응 유도에 관련된 에피토프(즉, 마우스에서 독소 활성도에 대해 수동적으로 방어하는 모노클로날 항체와 결합하는 항원성 에피토프)가 성숙한 분자의 발린 7과 프롤린 14에 의해 한정된 부위(전체 아미노산 시퀀스에 대한 것임, Locht 및 Keith의 상기문헌 참조) 내부에 있음을 나타냈다. 벡터 구성에 의한 S1 분자의 이와 같은 절단 변이는 모두 절단된 시퀀스에 따르는 메티오닐발릴기를 수반한 그들의 N-말단에서 시작한다.

[S1의 돌연변이유발]

발린 7과 프롤린 14에 의해 한정된 부위를 상세히 지도화하고 이 부위 내에서 방어 에피토프는 보유하되 효소 활성도가 결여된 S1의 유사체 분자를 생성하기 위하여 재조합 S1 유전자를 돌연변이유발시켰다. 방어 에피토프의 보유는 모노클로날 항체 1B7과의 반응성에 의해 분명해진다. 이는 발린 7 내지 프롤린 14 잔기를 암호화하는 원래의 부위에 대한 합성 올리고데옥시뉴클레오티드 단편을 치환함으로써 수행하였다. 이들 단편은 원래의 아미노산 시퀀스를 변이시키기 위해 하나 또는 두 개의 코돈을 치환하였다. 변형은 삭제 및/또는 치환에 의해 이루어질 수 있다. S1 유사체의 원하는 성질을 얻기 위해 하나의 염기를 변이시키는 것이 본 발명의 범위내에 속한다. 아미노산 시퀀스를 변이시키기 위하여 하나의 염기를 변이시킬 수 있다. 그러나 적어도 두 개의 염기를 변이시킬 때에 비해 하나의 염기를 변이시킬 때, 본 분야의 숙련된 기술자들은 야생형으로의 유전자형 복귀의 통계적 가능성이 더 크다는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서, 바람직한 실시형태에 있어서, 각각의 이러한 코돈 치환은 복귀 능력을 감소시키기 위하여 각 코돈 중 적어도 두 개의 염기 치환을 포함하였다. Accl 및 BspMll 부착 말단을 갖는 올리고데옥시뉴클레오티드 링커를 합성하였고, 이 링커는 다음 표 1의 링커 설명에서 지적한 코돈 치환을 제외하고는 원래의 S1 시퀀스를 포함했다 :

발현-플라스미드 구성을 위하여, 다음 DNA 단편을 아가로스 겔로부터 전기용리에 의하여 분리하였다:

1) pPTXS1(6A)로부터의 1824-bp DNA 단편(Accl 내지 Sstl), 아스파테이트 1 및 아스파테이트 2를 삭제하고 메틸오닐발릴기로 치환된 재조합 S1 유사체 분자를 발현시키는 플라스미드를 예기한 바와 같이 구성하고;

2) pPTXS1(33B)로부터의 3.56-bp DNA 단편(Sstl 내지 BspMll), 초기 14개 아미노산 잔기를 삭제하고 메틸오닐발릴기로 치환한 재조합 S1 유사체를 발현시키는 플라스미드를 예기한 바와 같이 구성하였다. 이와 같은 특정 유전자의 구성에 있어서, 이러한 단축된 분자를 초래하는 블런트-말단 결합은 새로운 BspMll 부위를 생성시켰다. 천연 S1 시스트론성 요소에는 존재하지 않는 이 제한 부위는 Accl 및 BspMll 부착 말단을 갖는 비교적 짧은 올리고뉴클레오티드 링커를 이용함으로써 돌연변이유발을 가져온다. 이들 두 DNA 단편을 표준 결합 조건하에서 상기한 개별적인 올리고데옥시 뉴클레오티드 단편으로 결합시켰다. 이들 결합은 새롭게 구성된 S1 유전자를 생성하였다: Accl 제한부위의 포인트에 대한 상류 코돈을 제공하는 pPTXS1(6A) 부분, Accl 부위와 BspMll 부위 사이의 코돈에 다양한 돌연변이를 제공하는 합성 단편, 및 새로운 BspMll 제한부위의 하류를 암호화하는 S1의 잔존부를 제공하는 pPTXS1(33B)의 부분, 결합시킨 후, 각 혼합물을 신선한 감응 FM5 세포 각각의 시료를 형질전환시키는 데 사용하였다.

형질전환체를 선택하여 미니프렙스로 배양한 후, 재조합 단백질을 생성하도록 유도시키고, 봉입체-양성 시료를 광학 현미경으로 확인하였다. 각 재조합 유사체 단백질의 보다 많은 양을 제조하기 위하여 이들 시료를 유도온도에서 보다 큰 규모(1-6 리터)로 발효시켰다. 분리된 세포 페이스트를 1mM DTT와 함께 증류수 내에서 재현탁시킨 후 프렌치 프레스로 용해시켰다. 간단한 저속 원심분리로 이들 용해질로부터 봉입체를 분리하였다.

이들 봉입체 단백질 시료는 30% 및 80%의 재조합 단백질을 포함하였다. 각 시료를 절단형 S1 유사체와 더불어 본 연구에서 확인한 우성 에피토프에 대항하여 유도된 모노클로날 항체 B2F8에 대하여 웨스턴 블로트 포맷(Burnette의 상기문헌)에서 결합하는 능력, 및 독성 백일해균(Sato 등의 상기문헌)을 수반하는 대뇌내 항원투여에 대항하여 수동적으로 마우스를 보호하는 것으로 알려진 모노클로날항체 1B7에 결합하는 능력에 관하여 분석하였다. 또한 ADP-리보실전이효소 활성도에 대하여 시료를 분석하였다. 수득된 결과는 표 2에 나타나 있다.

S1 유사체 4-1(Arg9→Lys)은 중화 mAb 1B7과의 반응성을 유지하는 반면 전이효소 활성도를 거의 나타내지 않음이 밝혀졌다. 측정 과정에서 4-1 단백질의 양을 증가함으로써 단지 극히 소량의 효소활성도를 나타낼 수 있었으며(제8a도); 측정을 반복함에 따라 S1 유사체의 고유 ADP-리보실전이효소 활성도가 적어도 5000개의 인자에 의하여 감소함이 밝혀졌다. 하나의-잔기 치환 돌연변이체와 관련된 NAD 당가수분해효소 활성도의 측정(제8b도)은 ADP-리보실전이효소 활성도의 평가로부터 수득한 것과 유사한 양상을 나타냈다. S1 유사체 4-1은 당가수분해효소 활성도를 거의 나타내지 않았는데, 이는 적어도 50 내지 100개의 인자에 의하여 이 활성도의 규모가 감소함을 의미한다.

수동적-방어 모노클로닐 항체에 결합하고(즉, 주요 방어 에피토프를 보유함) 독성 활성도의 주요 마커(marker)(ADP-리보실전이효소)를 결여시키는 능력 때문에, 제7도에 나타난 바와 같은 클론 pPTXS1(6A-3/4-1)에 의하여 생성된 재조합 S1 유사체 분자 및 그의 변이체를 단독으로 또는 다른 PTX 소단위체와 배합하여 안전하고 경제적인 소단위체 백신으로 사용할 수 있다. 클론 pPTXS1(6A-3/4-1)에 의하여 생성된 S1 유사체 가운데 아르기닌 9에 리신이 치환된 것은 안전한 소단위체 백신의 바람직한 특성을 갖는 rS1 유사체들의 실례이다. 6A-3/4-1의 다른 유사체들은, 예를 들어 위치 1 및 2에 아스파틸아스파틸 잔기를, 위치 0,1 및 2에 메티오닐아스파틸아스파틸 잔기를, 위치 0,1 및 2에 메티오닐발릴아스파틸 잔기를 포함할 수 있다.

현재 사용되고 있는 무세포성 백신은 S1, S2, S3, S4 및 S5 소단위체를 포함한다. 배양된 포유동물 세포에서 백일해 독소에 의하여 생성된 형태학적 변형은 이러한 결과가 단지 B 올리고머의 존재하에서만 설명될 지라도 S1 소단위체의 특성임이 최근 밝혀졌다(Burns 등의 1987, Infect. lmmun. 55 : 24-28). 본원에서 기술한 예비연구는 주요 방어 에피토프는 보유하되 독성 활성도가 결여된 rS1 유사체를 사용하는 단일 소단위체 백신의 실행가능성을 입증한다. 또한 S1 유사체는 소단위체 S2, S3, S4 및 S5와 배합하여 적용된다. 이들 소단위체는 S1에 대한 면역반응을 증가시킬 수 있으며 그들 자신이 방어 에피토프를 지닐 수 있다. S1 소단위체 유사체를 포함하는 백신에 보르데텔라 외독소의 상기 소단위체 S2, S3, S4, S5의 적어도 하나, 및 그의 혼합물을 더 포함시킬 수 있음은 본 발명의 범위내이다. S2, S3, S4, S5는 백일해균으로부터 유도된 소단위체이거나 유전공학 처리된 소단위체 및 그의 유사체일 수 있다. 유전공학 처리된 소단위체 생성물은 융합 단백질 및 비-융합 단백질을 포함할 수 있다.

다음 실험을 위하여, 아르기닌 9에 대한 리신의 치환을 포함하지만, 또한 그 아미노 말단에 천연 아스파틸아스파테이트를 포함하는 S1 소단위체의 유사체(S1/1-4)를 생성시키는 발현계를 변이시켰다.

[S1/1-4 유사체 및 S1/1의 생물학적 활성도 평가]

천연 시퀀스의 재조합 S1 단백질(S1/1) 및 유사체S1/1-4(상기한 바와 같이 Arg9→Lys 치환 및 천연 시퀀스의 아스파틸아스파테이트 아미노 말단 잔기를 포함한다)를 세포파괴, 원심분리, 요소 가용화, 이온 교환 크로마토그래피, 및 겔 여과 크로마토그래피를 포함하는 방법으로 E. coli 생성자 세포(producer cell)로부터 각각 분리하였다. 25mM 트리스 완충액, pH 8.5에 세포 페이스트를 현탁시킨 후, 고압파괴(프렌치 프레스)로 용해시켰다. 용해질을 원심분리하고, 재조합 S1 단백질을 포함하는 불용성 펠릿을 8M 요소, 25mM 트리스, pH 8.5에 용해시켰다. CuSO를 50μM의 농축물에 가한 후, 그 혼합물을 밤새 교반하여 재조합 S1 단백질내에 이황화물 결합을 형성하게 하였다. 혼합물을 같은 부피의 8M 요소, 25mM 시트르산나트륨, pH 3.8로 희석하고, 8M의 요소로 pH 3.8에서 평형화된 S-세파로스 컬럼(빠른-유속)에 적용시켰다. 8M 요소, 12.5mM 시트르산나트륨, pH 3.8에서 NaCl(0-0.5M)의 선형 기울기로 컬럼을 용리시켰다. 넓은 폭의 피크를 나타내는 것을 각 컬럼으로부터 수집하고 pH 7.5로 적정하였다. 이들 크로마토그래피 분획의 풀(pool)을 2M 요소, 10Mm 인산칼륨, Ph 7.5로 평형화된 세파크릴 에스-200컬럼에 따로 따로 적용시키고, 용리물질의 풀을 수집한 결과 각 종(S1/1 및 S1/1-4)의 산화된 단량체 재조합 S1 단백질임을 나타냈다. 정제한 S1 소단위체 단백질을 SDS-PAGE 한 다음 겔내 단백질의 은-착색법으로 분석하였다(제9도). 겔(12.5% 아크릴아미드)을 환원 조건하에서 러닝시켰다. 레인 1, 분자량 표준(파마시아). 레인 2,2μg의 백일해균 완전독소(리스트 바이올로지컬 라보라토리스). 레인 3,0.2μg의 백일해균 S1 소단위체 단백질(리스트 바이올로지컬 라보라토리스). 레인 4,0.2μg의 재조합 S1/1. 레인 5,0.2μg의 재조합 S1/-4. 레인 6. 블랭크(blank). 레인 7,0.4μg의 S1 소단위체 단백질(리스트). 레인 8,0.4μg의 재조합 S1/1, 레인 9,0.4μg의 재조합 S2/1-4. 이 제조단계에서 재조합 S1 종은 90%이상 순수하였다.

S1 Arg9→Lys 돌연변이의 생물학적 활성도를 측정하기 위해서는 돌연변이 유사체 및 천연 시퀀스의 재조합 S1 단백질을 백일해 완전독소 종으로 결합시킴이 필요했다. 고도로 정제된 백일해 독소 B 올리고머(독소 소단위체 S2, S3, S4 및 S5의 오량체 구조)는 센터포 바이올로직스 이벨루에이션 앤드 리서치, 푸드 앤드 드러그 어드미니스트레이션(Genter for biologics Evaluation and Research, Food and Drug Administration)의 D. Burns에 의해 공급받았다. 두 개의 다른 S1 소단위체 종을 완전독소 분자(S1/1 또는 S1/1-4 중 어느하나를 포함하는)를 형성시키기 위하여 다음에 기술하는 방법으로 B 올리고머와 개별적으로 결합시켰다. 같은 물량의 재조합 S1종과 B 올리고머를 2M 요소, 10mM 인산칼륨, pH 7.5의 용액에서 혼합하고, 37℃에서 30분간 항온시켰다. 완전독소 형성 여부는 천연 아크릴아미드 겔 내의 전기영동으로 측정하였다(제10도), 겔 1, 재조합 S1/1 및 천연 올리고머. 겔 2, 재조합 S1/1-4 및 천연 올리고머. 겔 3, 천연B 올리고머. 겔 4, 천연 백일해균 완전독소. 겔 5, 재조합 S1/1. 겔들은 완전독소 종이 재조합 S1/1 또는 재조합 S1/1-4 둘중 어느 하나와 천연 B 올리고머와의 결합을부터 되었음을 표시한다.

반-재조합 완전독소(B 올리고머에 S1/1 또는 유사체 S1/1-4 중 어느 하나를 더한 것)를 시험관내 차이니즈 햄스터 난소(CHO)세포 내에서의 집락 반응(clustering response)을 유도하는 능력에 대해 시험하였으며; 이 반응은 백일해 독소의 세포변성을 측정할 수 있음을 나타냈다. 실험 시료 및 적당한 대조 시료를 CHO 세포 배양액[10%의 우태아 혈청을 수반한 둘베코의 변형된 이글 배향액(Dulbecco modified Eagle medium)]으로 희석시킨 후, 한외여과로 멸균하고, 96-웰 플라스틱 배양접시에 연속적으로 이동시켜 더 희석하였다. 약 5-7 × 10개의 신선하게 트립신처리된 CHO 세포(아메리칸 타잎 컬쳐 콜렉션 CCL 61, CHO-K1 세포)를 각 웰에 가한 후, 접시를 5% CO로 48-72시간 동안 37℃에서 항온시켰다. 세포 단층을 인산 완충용액-염으로 세척한 후, 크리스탈 바이올렛으로 착색하여 광학 현미경으로 세포 집락의 존재여부를 검사하였다.

제11도는 이와 같은 분석 결과를 나타낸 것이며; 특히 S1/1-4 유사체와 관련된 패널 G, H 및 J의 결과가 흥미롭다. S1/1-4 유사체 단독 및 S1/1-4 유사체와 B 올리고머로부터 형성된 완전독소의 1/1600 희석은 무시할 수 있을 정도의 집락량을 나타내는 1/200 희석에 대하여 세포 집락성 결여를 입증한다. 패널 A는 1/200 희석의 완충액 만으로 처리된 세포이다. 패널 B는 1/200 희석으로, B 올리고머 만으로 처리한 것이다; 이 정도의 희석시 소량의 집락은 가시화되며 이는 정제후 잔존하는 오염된 천연 S1 소단위체에 기인한 것이다. 패널 B는 1/200 희석시 B 올리고머 시료의 집락 활성도를 명백하게 나타내는 이와 같은 동일한 웰(패널 l)의 다른 부분과 비교할 수 있다. 패널 C는 1/2000 희석의 천연적이고 상업용-등급의 S1 소단위체(리스트 바이올로지컬스)로 처리된 세포이다. 패널 D는 1/2000 희석의 천연적이고, 상업용-등급의 백일해 완전독소(리스트 바이올로지컬스)이며, 이는 배지내의 CHO 세포상에서 백일해 독소의 급격한 세포변성의 결과를 나타낸다. 패널 E는 1/2000 희석의 천연 시퀀스(S1/1)의 재조합 S1 소단위체이다. 패널 F는 B 올리고머와 결합되고 1/2000로 희석된 S1/1을 나타내며; CHO 세포 집락성의 결과는 천연 완전독소에서와 같이 급격히 나타나며, B 올리고머 및 재조합 S1 단백질과 결합하는 완전독소를 나타내는 물리적 겔 결과를 뒷받침한다. 패널 G는 Arg9→Lys 돌연변이체 S1/1-4 만으로는 CHO 세포상에 아무런 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 패널 H는 S1/1-4 유사체 및 B 올리고머로부터 형성된 완전독소의 1/1600 희석시 CHO 세포 집락성이 결여됨을 나타낸다. 1/200 희석(패널 J)시, S1/1-4-함유 완전독소에 의한 다소의 집락은 나타날 수 있으나, 유사체 S1 종에 의한 집락성 결과에의 기여는 동일한 희석(패널 l)에서의 B 올리고머만으로 비교할 때 무시할 수 있는 것으로 나타난다.

CHO 세포의 집락 현상을 유도하는 데 필요한 다양한 백일해 독소 종의 효과적인 농도를 측정하기 위하여 초기실험을 행하였다. 예비 결과는 상업용 백일해 독소와 재조합 S1/1을 포함하는 완전독소 모두가 0.25-0.30ng/ml 만큼 낮은 농도에서 세포 집락을 유발할 수 있음을 나타낸다; 반대로, S1/1-4 유사체를 포함하는 완전독소는 집락 결과를 유도하기 위해서 적어도 10-20ng/ml의 농도가 필요하다.

이 결과들은 백일해 독소의 세포독성 효과가 그의 S1 소단위체 부분에 존재하며 그것의 효소 활성도와 직접적인 연관이 있음을 나타낸다. 보다 중요하게, 이 실험은 비교적 비독성인 백일해 독소 분자가 특정 부위의 돌연변이유발에 의하여 유도된 특이 재조합 독소 소단위체로부터 형성될 수 있음을 설명한다.

첨부하는 본 발명의 특허청구의 범위 내에서 가능한 모든 변형 및 개선을 본 발명에 포함하고자 한다.

Claims

보르데텔라 외독소의 소단위체 S1을 암호화하는 부분, 또는 이 부분의 단편이나 유도체 중 적어도 하나를 포함하는 재조합 DNA 분자에 있어서, 상기 부분이나 단편 또는 유도체는 (a)독소-중화 수준의 항체를 유도할 수 있고 (b) 독소 반응원소와 관련된 효소 활성도가 없는 생물학적 활성도를 지닌 폴리펩티드를 암호함을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 상기 부분은 백일해 독성에 대항하는 면역방어를 제공하는데 중요한 것으로 알려진 주요 에피토프를 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
제1항에 있어서, 상기 독소-중화 수준의 항체는 백일해 독성에 대항하는 면역방어를 제공함을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
제1항에 있어서, 상기 (b)의 생물학적 활성도는 효소학적으로 불활성인 소단위체 S1의 유사체를 생성시키는 부위-특이 돌연변이 유발에 의해 수득함을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
제4항에 있어서, 상기 S1 소단위체는 발린 7과 프롤린 14에 의해 한정된 부위 내에서 S1 소단위체의 부위-특이 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
제5항에 있어서, 상기 부위-특이 돌연변이는 아르기닌 9부위에서 발생함을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
제6항에 있어서, 아르기닌 9를 리신으로 치환함을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
제1항에 있어서, 상기 보르데텔라 외독소는 백일해균(B. pertussis), 파라백일해균(B. parapertussis) 및 기관지패혈증균(B. bronchiseptica)으로 이루어진 균에서 선택한 것임을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
보르데텔라 외독소 S1 소단위체의 유사체에 있어서, 상기 유사체는 (a)독소-중화 수준의 항체를 유도할 수 있고 (b) 독소 반응원소와 관련된 효소 활성도가 없는 생물학적 활성도를 지님을 특징으로 하는 보르데텔라 외독소 S1 소단위체의 유사체.
제9항에 있어서, 상기 유사체는 보르데텔라 독성에 대항하는 면역방어를 제공하는데 중요한 것으로 알려진 주요 에피토프 중 적어도 하나를 포함함을 특징으로 하는 보르데텔라 외독소 S1 소단위체의 유사체.
제9항에 있어서, 상기 독소-중화 수준의 항체는 보르데텔라 독성에 대항하는 면역방어를 제공함을 특징으로 하는 보르데텔라 외독소 S1 소단위체의 유사체.
제9항에 있어서, 상기 (b)의 생물학적 활성도는 효소학적으로 불활성인 상기 유사체를 생성시키는 부위-특이 돌연변이 유발에 의해 수득함을 특징으로 하는 보르데텔라 외독소 S1 소단위체의 유사체.
제12항에 있어서, 상기 S1 소단위체는 발린 7과 프롤린 14에 의해 한정된 부위 내에서 S1 소단위체의 부위-특이 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 보르데텔라 외독소 S1 소단위체의 유사체.
제13항에 있어서, 상기 부위-특이 돌연변이는 아르기닌 9부위에서 발생함을 특징으로 하는 보르데텔라 외독소 S1 소단위체의 유사체.
제14항에 있어서, 아르기닌 9를 리신으로 치환함을 특징으로 하는 보르데텔라 외독소 S1 소단위체의 유사체.
제9항에 있어서, 상기 보르데텔라 외독소는 백일해균, 파라백일해균 및 기관지패혈증균으로 이루어진 군에서 선택한 것임을 특징으로 하는 보르데텔라 외독소 S1 소단위체의 유사체.
제9항에 있어서, 아미노-말단은 메티오닐발릴 시퀀스를 포함함을 특징으로 하는 보르데텔라 외독소 S1 소단위체의 유사체.
제9항에 있어서, 상기 유사체는 제7도에 도시한 바와 같은 아미노산 시퀀스를 포함함을 특징으로 하는 보르데텔라 외독소 소단위체 S1의 유사체.
(a)독소-중화 수준의 항체를 유도할 수 있고 (b) 독소 반응원성과 관련된 효소 활성도가 없는 생물학적 활성도를 지니는 유전공학 처리된 보르데텔라 외독소 소단위체 S1을 포함함을 특징으로 하는 개량백신.
제19항에 있어서, 상기 소단위체 S1은 보르데텔라 독성에 대항하는 면역방어를 제공하는 주요 에피토프 중 적어도 하나를 포함함을 특징으로 하는 개량백신.
제19항에 있어서, 상기 독소-중화 수준의 항체는 보르데텔라 독성에 대항하는 면역방어를 제공함을 특징으로 하는 개량백신.
제19항에 있어서, 상기 (b)의 생물학적 활성도는 효소학적으로 불활성인 소단위체 S1의 유사체를 생성시키는 부위-특이 돌연변이 유발에 의해 수득함을 특징으로 하는 개량백신.
제22항에 있어서, 상기 부위-특이 돌연변이는 발린 7과 프롤린 14에 의해 한정된 부위 내에서 유도함을 특징으로 하는 개량백신.
제23항에 있어서, 상기 부위-특이 돌연변이는 아르기닌 9부위에서 발생함을 특징으로 하는 개량백신.
제24항에 있어서, 아르기닌 9를 리신으로 치환함을 특징으로 하는 개량백신.
제19항에 있어서, 상기 보르데텔라 외독소는 백일해균, 파라백일해균 및 기관지패혈증균으로 이루어진 군에서 선택한 것임을 특징으로 하는 개량백신.
제19항에 있어서, 보르데텔라 외독소의 소단위체 S2, S3, S4 및 S5의 적어도 하나, 및 그의 혼합물을 더 포함함을 특징으로 하는 개량백신.
제25항에 있어서, 보르데텔라 외독소의 상기 소단위체 S2, S3, S4 및 S5의 적어도 하나, 및 그의 혼합물은 유전공학 처리된 것임을 특징으로 하는 개량백신.
제19항에 있어서, 상기 유전공학 처리된 소단위체 S2, S3, S4 및 S5는 E. coli, 사카로마이시즈 세레비시에(S. cerevisiae), 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium), 티푸스균(Salmonella typhi), 바실러스속(Bacillus) sp. 및 종두바이러스(vaccinia)로 이루어진 군에서 선택한 재조합 숙주에서 비-융합 단백질로서 발현함을 특징으로 하는 개량백신.
제29항에 있어서, 상기 유전공학 처리된 소단위체 S2, S3, S4 및 S5는 독소-중화 항체를 유도하는 능력을 보유하는 소단위체 S2, S3, S4 및 S5의 유사체를 포함함을 특징으로 하는 개량백신.