DK175821B1 - Rekombinant-DNA-afledte Bordetella-toksinunderenheder og analoge deraf - Google Patents

Description

» DK 175821 B1

Den foreliggende opfindelse angår højniveau, direkte rekombinant ekspression af analoge af underenheder af SI, S2, S3, S4 og S5 af Bordetella exotoksin i E. coll uden at skulle ty til fusioner med dele af he-5 terologe proteiner. Nærmere angivet tilvejebringer genetisk manipulerede modifikationer af underenhederne en klasse af Bordetella toksinanaloge med evnen til at frembringe toksinneutraliserende niveauer af antistoffer, og til i det væsentlige at være uden reaktogene 10 bestanddele. Genetisk manipulerede underenheder kan anvendes til fremstilling af underenhedsvaccine(er), som besidder immunogen virkningsfuldhed og i det væsentlige er uden reaktogene bestanddele.

Udtrykket Bordetella exotoksin betegner en grup-15 pe af toksiner, der kodes af genomerne af forskellige arter af Bordetella, såsom B^ pertussis, B. parapertussis og B^ bronchiseptica. Andre udtryk, der sædvanligvis benyttes til at benævne Bordetella exotoksin er pertussis toksin ("PTX"), lymfocytosis-fremmende faktor 20 ("LPF”) og ø-aktiverende protein (”IAP").

Kighoste er stadig en væsentlig årsag til børne-sygelighed og -dødelighed i store dele af verden. Helcelle Bordetella pertussis vacciner har givet et effek-j tivt middel til bekæmpelse af denne sygdom. Anvendelsen 25 af sådanne vacciner har imidlertid været direkte forbundet med milde bivirkninger, episodisk knyttet til mere alvorlige, og en gang imellem dødelige neurologiske forløb.

Der er foretaget vidtgående undersøgelser i et 30 forsøg på at eliminere de skadelige bivirkninger, der vides at være knyttet til de for tiden benyttede vacciner. Undersøgelserne har resulteret i fremstillingen og afprøvningen af acellulare vacciner,og i grundforsk- 2 DK 175821 B1 ning i et forsøg på at udvikle sikrere rekombinant-produkter. Et kritisk første trin mod kloning og udvikling af en rekombinant-DNA-afledt vaccine var sekvenseringen af petussis toksin operonen og den efterfølgende 5 deduktion af de individuelle underenheders aminosyrese-kvenser. (Locht, C. and Keith, J.M., 1986, Science 232: 1258-1264; Locht et al., 1986, Nucl. Acids

Res. 1_4: 3251-3261; og Nicosia et al., 1986, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 83: 4631-4635).

10 Nicosia et al. (1987, Infect. Immun., 55: 963-967) påviste, at mRNA, der koder for hver af underenhederne SI, S2, S3, S4 og S5 af Bordetella pertussis effektivt kunne transskriberes fra de klonede gener i E. coll. Skønt det påstås, at de opviser store niveauer 15 af transskription af det native pertussis toksin poly-cistroniske budskab, var mængden af proteiner fremstillet ved direkte ekspression meget lav eller upåviseligt. Yderligere var fusionsproteiner, som derefter syntetiseredes, ude af stand til at frembringe neutra-20 liserende eller beskyttende immunreaktioner.

Barbieri et al. (1987, Infect. Immun., 55: 1321-1323) påviste ekspressionen af SI-underenheden som et fusionsprotein i EL coli. Dette fusionsprotein indeholder β-galactosidases første seks aminosyrer, 25 5 aminosyrer, der kodes af pUC18 polylinkeren, efter fulgt af SI-underenhedens aminosyrer 2-235. Sl-fusions-proteinet, fremstillet i små mængder, udviste kun ca.

25% af ADP-ribosyltranferaseaktivitet af autentisk eller nativ pertussis toksin.

30 Locht et al. (Abstract, Modern Approaches to

New vaccines, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, Sept. 9-14, 1986) var i stand til at eksprimere et fusionsprotein indeholdende Sl-un-derenhedens aminosyrer 2-187. De forudsagde, at kon-35 struktionen ikke ville udvise toksisk aktivitet da de mente, at det manglede NAD-bindingsstedet, der er 3 DK 175821 B1 knyttet til ADP-ribosyltransferase, enzymaktiviteten, der formodes at være ansvarlig for toksinets reaktogeni-citet. Efterfølgende forsøq med dette molekyle indikerede, at denne afstumpede form i det væsentlige besid- 5 der uformindsket enzymaktivitet. Ingen af underenhederne eller analoge deraf indenfor den kendte teknik udviser evnen til at frembringe toksinneutraliserende niveauer af antistoffer og er i det væsentlige uden enzymaktivitet, knyttet til reaktogenicitet.

10 På tegningen viser

Fig. 1 en skematisk repræsentation af PTX-operonen's cistron rækkefølge {Prior art Locht and Keith, supra). Regionerne mærket si, S2, S4, S5 og S3 indikerer de foreslåede åbne læserammer for hver af disse PTX-under-15 enheder. De udfyldte områder lige før hver cistron angiver den formodede signalsekvens. Restriktionsenzymstedet umiddelbart downstreams for hvert cistronelement indikerer downstreamsrestriktionsstedet, der benyttes ved sub-kloning af dette cistron i ekspressions-20 vektoren. Restriktionsenzymstedet lokaliseret lige indenfor hver signalsekvensregion benyttedes som opstrømsrestriktionsstedet til sub-kloning af den i fuld længe cistron ind i ekspressionsvektoren med en passende oligodeoxynucleotidlinker til fremstilling af den ikke 25 fuldt udviklede PTX-underenhed med intakt signalsekvens. Restriktionsenzymstedet lige indenfor hver af de fuldt udviklede PTX-underenheders åbne læseramme benyttedes, med en passende oligodeoxynucleotid-linker, som opstrøms-restriktionsstedet til sub-kloning af 30 cistronen uden dets kodede signalsekvens, til fremstilling af en methionyl - fuldt udviklet PTX-under-enhed.

Fig. 2 viser en SDS-polyacrylamidgel og et Western blot af rekombinant-PTX-underenheder. Felt A 35 til venstre viser en Coomassie Brilliant Blue-farvet gel af rekombinant-PTX-underenhederne, fremstillet i 4 DK 175821 B1 målelige mængder; felt A til højre er et Western blot af en parallel gel, hvor man benytter et kanin-poly-klonalt anti-PTX hyperimmunseriim. PTX viser de baner, der indeholder pertussis toksin med en kvalitet som 5 det i handlen gående. Disse resultater viser, at re-kombinant (r) Si, S2, S3 og S5 alle produceredes i betydelige mængder. Western blotet viser, at rSl udvikles fuldt ud fra dets preproteinarter, rS2 og rS5 er delvis udviklet og rS3 er i det væsentlige ikke ud-10 viklet under fermenteringsbetingelserne; rS4 frem stilledes ikke i tilstrækkelig mængde til at være synlig. Felt B viser produkterne af ekspression som methionyl-fuldt udviklet rekombinant-(rmjunderen-heder. Disse underenheder er fremstillet i tilstrække-15 lige kvantiteter med undtagelse af rmSl (ikke vist).

Fig. 3 er et Western blot, som viser virkningen af upstrøms ikke-kodende sekvenser på ekspressionen af rS2. Detaljer i figuren er beskrevet i teksten.

Fig. 4 er et autoradiogram af en SDS-poly-20 arylamidgel, der viser rekombinant-Sl's ADP-ribosyl- transferaseaktivitet. Rekombinant-Sl (500 ng), renset nativ pertussis toxin (1 pg) og reaktionspuffer om-, sattes individuelt med bovin transducin i nærværelse af [32P]NAD, i det væsentlige som beskrevet af 25 Manning et al. 1984, J. Biol. Chem. 259:749-756; West et al. 1985, J. Biol. Chem. 260: 14428-14430). Prøverne bundfældedes med kold 10% trichloreddikesyre, bundfaldene udsattes for SDS-PAGE og efterfølgende autoradiografi. Det radioaktive bånd ved 39 Kd er transducin-30 underenheden, som er blevet ribosyleret. Bane A, reak tionspufferkontrol; bane B, nativ PTX; bane C, rSl.

Fig. 5 en grafisk afbildning af radioimmuno-prøver, der viser rSl og rS4 underenheder's immuno-genicitet i mus. Mus hyperimmuniseredes med rekombi-35 nant-Sl, methionyl-rS4, nativ pertussis toxin (PTX), i handlen tilgængelig pertussis vaccine eller excipiens 5 DK 175821 B1 (NMS); nogle præparater indeholdt komplet Freund's adjuvans (CFA). Sera opsamledes og fortyndinger undersøgtes for deres anti-PTX-titer i en fast-fase radio-i immunoprøve.

5 Fig. 6 er en graf, der viser rSl's og rS4's immunobeskyttende potentiale i mus mod intrakutan udsættelse med pertussis. Detaljer i figuren er beskrevet i teksten.

Fig. 7 viser den deducerede aminosyresekvens i 10 rSl-mutant, der stammer fra ekspression af pPTXSl{6A-3/4-1) .

Fig. 8A og 8B er grafer af rekombinant analog SI's ADP-ribosyltransferase og NAD-glycohydrolase- aktivitet.

15 Fig. 9 viser et autoradiogram af en SDS-poly- acrylamidgel af renset Sl-underenhed-proteiner.

Fig. 10 viser et autoradiogram af et nativ, ikke-reducerende, ikke-denaturerende polyacrylamidgel af holotoksiner fra kombinationen af nativ B-oligomer med 20 enten rekombinant-Sl/1 eller rekombinant-sl/1-4.

Fig. 11 er et fotografi af cellemonolag, der undersøgtes for tilstedeværelsen af cellesammenhobninger ved lysmikroskopi.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilveje-25 bringes et rekombinant-DNA-molekyle indeholdende mindst en del, der koder for underenhed SI af Bordetella exo-toksin, eller et fragment eller derivat af nævnte del, hvor delen eller fragmentet eller derivatet koder for et polypeptid med en biologisk aktivitet, der (a) 30 kan frembringe toksinneutraliserende niveauer af antistoffer og (b) i det væsentlige er uden reaktogene bestanddele. Polypeptid SI underenheden, eller analoge deraf, indeholder et stort epitop, der vides at være vigtigt ved tilvejebringelse af immunobeskyttelse mod 35 pertussis toksicitet. De toksinneutraliserende mængder af antistoffer giver immunobeskyttelse mod pertussis i DK 175821 B1 6 toksicitet. Stedspecifik mutagensis resulterer i en analog af underenhed SI, der i det væsentlige er enzymatisk inaktiv.

Opfindelsen tilvejebringer især et DNA-molekyle, der 5 koder for en polypeptidanalog af underenhed SI af Borde-tella exotoksin, hvor polypeptidanalogen har en aminosyre-sekvens, der adskiller sig fra den naturligt forekommende sekvens af underenhed SI ved en eller flere aminosyrere-ster i området afgrænset af valin 7 og prolin 14 inklusi-ve, hvor arginin 9 er blevet erstattet med lysin, hvilket molekyle koder for en analog, som (a) kan fremkalde toksinneutraliserende niveauer af antistof og (b) er uden enzymaktivitet knyttet til .toksinreaktogenicitet.

15 Den genetisk manipulerede Sl-underenhed af Bor- detella exotoksin og analoge deraf tilvejebringer re-kombinant DNA-afledt underenhedsvaccinematerialer til anvendelse ved forebyggelse af pertussis sygdom. Sl-underenheden og analoge deraf kan tilvejebringe vacci-20 neprodukter, enten alene eller i kombination med underenheder S2, S3, S4 og S5 og blandinger deraf. Underenheder S2, S3, S4 og S5 kan oprenses fra pertussis : eller afledes rekombinant som fusions- eller ikke- fusionsprodukter. Høje niveauer af rekombinant ekspres-25 sion af underenheder S2, S3, S4 og S5 af Bordetella exotoksin er desuden opnået i Eh_ coli ved direkte ikke-fusionsmetoder. Alternative rekombinant-værter, herunder gær f.eks. Sh cerivisiae, og bakterieorganismer, f.eks. Salmonella typhimurium eller typhi, Bacillus 30 sjd. og vira, f.eks. vaccinia, kan anvendes til ekspression af disse underenhedsanaloge.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en på højt niveau direkte rekombinant ekspression af alle PTX-underenheder, der er nødvendige ved vaccine-35 fremstilling. Analoge af Sl-underenheden bevirker yderligere biologisk aktivitet, der yderst immunogen og DK 175821 B1 7 i det væsentlige uden reaktogene bestanddele, idet sådanne bestanddele er enzymatiske aktiviteter for toksinmolekylet, der er knyttet til dets toksicitet og reaktogenicitet og fremmede bestanddele af pertussis (f.eks. endotoksin), som kan findes i vaccinematerialer ekstraheret fra pertussis-celler, og som vides at være reaktogene. SI analogen, benyttet alene eller sammen med andre underenheder af PTX, kan tilvejebringe vaccineprodukter, der er virknings fulde og i stor udstrækning reducerer sandsynligheden for bivirkninger fra reaktogene bestanddele, der eksisterer i umodifice-rede native eller rekombinant-afledte underenheder.

8 DK 175821 B1

De individuelle underenheder SI, S2, S3, S4 og S5 af Bordetella pertussis toksin sub-klonedes hver især og eksprimeredes direkte individuelt i el coli. Signalsekvensen synes at spille en vigtig rolle ved 5 ekspressionen af rekombinant SI (rSl). I fravær af et signalpeptid eksprimeredes utilstrækkelige mængder af rSl' i EL coli. Hvis Sl-underenhedens native leader eller en syntetisk leader findes på preproteinet opnås høje niveauer af ekspression, i størrelsesorden 10 10-30% af det totale celleprotein. Fermenteringen af rSl ekspressorceller i produktionsskala i en føde-batch-10-liter fermenteringstank (ved et ikke-optimeret ekspressionsniveau på 8 mg Sl/OD-L) resulterede i næsten fuldstændig proteolytisk bearbejdning af 15 rSl til dets fuldt udviklede arter, som vist i fig. 2. Fermentering af ekspressorceller i laboratorieskala bevirdede ufuldstændigt bearbejdet SI; både preprotein og fuldt udviklet protein viste sig af følge logaritmisk cellevækst. Manglen hos en syntetisk EL_ 20 coli leader-sekvens med spaltningsevne, til at øge signalbearbejdningen tyder på, at ufuldstændig spaltning ikke er resultat af inkompatibel genkendelse af E. coli leader-peptidaser for Β_^ pertussis proteo-lytiske spaltningssteder. Den manglende evne til at 25 overvinde bearbejdningsblokken, enten ved øgning af signalpeptidasesyntese under anvendelse af celler co-transformeret med en plasmideksprimerende EL_ coli leader-peptidase i store koncentrationer, eller ved at reducere SI ekspressionsniveauer ved anvendelse af en 30 vektor med lavt kopital, indikere at problemet ikke ligger i mætningen af spaltningsvejen. Disse resultater viser, at post-oversættelsesbearbejdning af fremmede proteiner i EL_ coli kan kontrolleres med dårligt for-ståede mekanismer, der er knyttet til den voksende 35 celles fysiologiske tilstand.

PTX underenheder S2, S3, S4 og S5 eksprimeredes på tilsvarende måde i EL_ coli som vist i fig. 2. Lige- 9 DK 175821 B1 som rekombinant SI, viste rS2, rS3 og rS5 underenhederne sig at udvise ufuldstændig bearbejdning ved fermentering i laboratorieskala. Fordi rSl kunne bearbejdes fuldstændigt i produktionsskala kan tilsvarende 5 fermenteringsbetingelser benyttes til opnåelse af de andre underenheder i fuldstændig bearbejdede formek I modsætning til rSl kunne rS4 underenheden eksprimeres i store mængder som et fuldt udviklet methionylpoly-peptid, men var ikke detekterbart når det eksprimeredes 10 med dens naturlige lederpeptidsekvens. Underenheder S2, S3, S4 og S5 er nu alle eksprimeret som methionyl-fuldt udviklede polypeptider. Aminosyreanalyse af disse molekyler viser, at den heterologe (ikke-native) methionylrest i det væsentlige fjernes fra hver art 15 (med undtagelse af S4) ved cellular methionaminopep-tidase til frembringelse af fuldt udviklede proteiner fra nativsekvens. Methionylresten fjernes i det væsentlige ikke fra rekombinant S4 på grund af den amino-terminale genkendelsessekvenses uforenelighed for det 20 cellulare enzym. Alle rekombinant-proteinerne blev udvundet som inklusionslegemer fra lyserede celler. Underenhederne viste sig at have vandringsmonstre i SDS-PAGE, der i det væsentlige var identiske med autentiske, native underenheder, eller at reagere i 25 Western blots med monoklonal og polyklonal antitoksin sera. Som vist i fig. 2, opnås rekombinant ekspression af underenheder SI, S2, S3, S4 og S5-underenheder i E. coll ved direkte, ikke-fusionsmidler.

Skønt alternative fremgangsmåder og materialer 30 kan benyttes ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse, er de foretrukne fremgangsmåder og materialer som beskrevet i det efterfølgende. Alle de efterfølgende anførte referencer skal betragtes som inkorporeret heri i kraft af henvisningen dertil.

35

Materialer.

DNA-modificerende enzymer anskaffedes fra New England Biolabs, (Beverly, MA), Bethesda Research 10 DK 175821 B1

Laboratories, (Gaithersburg, MD), Boehringer Mannheim Biochemicals, (Indianapolis, IN) og international Biotechnologies, Inc., (New Haven, CT); enzymer benyttedes i overensstemmelse med fabrikanternes anbefalinger.

5 Alle kemikalier og biokemikalier var af analytisk reagenskvalitet. Oprenset pertussis toksin PTX anskaffedes fra List Biological Laboratories, Inc. (Campbell, CA). Syntetiske oligonucleotider syntetiseredes i overensstemmelse med Caruthers (1982, i H.G. Gussen and A.

10 Lang (udg.) Chemical and enzymatic synthesis of gene fragments, Verlag Chemie, Weinheim, FRG, s. 71-79). Kanin-antisera mod total PTX fremstilledes ved Antibodies, Inc. (Davis, CA) og NIAID Rocky Mountain Laboratory. Monoklonale antistoffer mod underenheder fra 15 nativ PTX fremstilledes ved standardmetoder (Kohier and Milstein, 1975, Nature 256:495-497; Nowinski et al., 1979, Virology 93:111-126). Radioiodneret protein A og kanin anti-muse IgG anskaffedes fra New England Nuclear (Wilmington, DEL). Anti-Sl monoklonalt antistof 20 IB7 (som beskrevet i Sato et al., 1987, Infect. Immun. 55:909-915) var en gave fra H. Sato, NIH, to Keyo,

Japan.

Plasmider og bakteriestammer.

25 Plasmid pPTX42 indeholdende PTX-operonet er ble vet beskrevet (Locht and Keith, supra and Locht et al., supra. Ekspressionsplasmider pCFM1036, pCFM1146, pCFM1152 og pCFM1156 opnåedes ved Amgen.

En detaljeret beskrivelse af Amgens's ekspres-30 sionsvektorsystem er beskrevet i den offentliggjorte europæiske patentansøgning nr. 136.490 og er inkorporeret heri i kraft af henvisningen dertil. Sådanne plasmider kan indeholde en inducerbar promotor, et syntetisk ribosombindingssted, en klonings-sammenhob-35 ning, plasmidreplikationsbegyndelsessteder, en tran-skriptionsterminator, gener der regulerer plasmidkopi- DK 175821 B1 11 antallet og et Kanamycln resistens gen. De udledte plasmider adskiller sig fra hinanden indenfor en række områder. Plasmid pCFMl036 kan afledes fra pCFM836 (europæisk patentansøgning nr. 136.490) ved substitu- 5 tion af DNA-sekvensen mellem de entydige Aatll- og og EcoRI-restriktionssteder indeholdende den syntetiske PL-promotor med følgende oligonucleotid:

Aatil EcoRI

10 5' CATCGATTCTAG 3'

31 TGCAGTAGCTAAGATCTTAA

15 Plasmidet indeholder ingen inducerbar promotor, der går forud for restriktionssammenhobningen. Plasmidet pCFMl146 kan afledes fra pCFM836 ved at substituere den lille DNA-sekvens mellem de entydige Clal- og Xbal-restriktionssteder med følgende oligonucleotid: 20

Clal Xbal 5· CGATTTGATT 3' 3' TAAACTAAGATC 5' 25 og ved at ødelægge de to endogene Ndel-restriktionssteder ved endeudfyldning med T4-polymeraseenzym efterfulgt af stumpendeligering. Plasmidet indeholder intet 30 syntetisk ribosombindingssted umiddelbart før restrik-tionssammenhobningen. Plasmidet pCFMll56 kan afledes fra pCFM1146 ved at substituere den lille DNA-sekvens mellem de entydige xbal- og KpnI-restriktionssteder med følgende oligonucleotid: 35 12 DK 175821 B1

Xbai Kpnl 5' CTAGAAGGAAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3’ 3' TTCCTTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5’ 5

Plasmid pCFMH52 kan afledes fra pCFM1156 ved at substituere Bglll- til Bglll-DNA-fragmentet (248 base-10 par) indeholdende copB-promotoren og kode en del af copB-genet med det tilsvarende DNA-fragment fra plasmid pCFM512 (europæisk patentansøgning nr. 136.490). Dette plasmid har et lavere kopital end pCFM1156.

15 Plasmider pBR322, pUC18, pUC19 og phag Ml3mpl8 og M13mpl9 DNA anskaffedes fra Bethesda Research Laboratories, Plasmidet pTD125 indeholdende genet for E. coli leader-peptidase (Dale, T. 1983, J. Bacteriol. 143:76-83) var en gave fra W. Wickner (UCLA). coli 20 FM5-celler stammede fra Amgen Inc., Thousand Oaks, CA fra coli K-12 stamme fra C.F. Morris (Bachmann et. al., 1976, Bacteriol. Rev. 40: 116-167) og indeholder det integrerede λ-phag-repressorgen, CI857 (Sussman, et al., 1962, C.R. Acad Sci. 254:1517-1579).

25 Konstruktionen af de individuelle underenhedekspres- sionsplasmider er beskrevet heri. vektorfremstillingen, celletransformation og koloniudvælgelse gennemførtes ved standardmetoder (Maniatis et al., 1982, Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Springs Harbor 30 Laboratory, NY).

Analytiske procedurer.

DNA-sekvensering gennemførtes ved primer ekstension, kædeterminerings-metoden (Sanger et al., 35 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467;

Heidecker et al., 1980, Gene Π) :69-73). Proteinsekven- DK 175821 B1 13 sanalyser gennemførtes ved automatiseret Edman nedbrydning i et ABI 470A gasfase mikrosekvensapparat (Hewick et al, , 1981, J. Biol. Chem. 256:7990-7997;

Hunkapillar et al., 1983. Meth. Enzymol. 91: 399-413) .

5 SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gennem førtes som beskrevet af Laemmli (1970, Nature 227: 680-685), eluering af polypeptider fra polyacrylamidge-ler gennemførtes efter fremgangsmåden af Hunkapiller et al. (1983, Meth. Enzymol. 9^:227-236), og Western 10 blotting gennemførtes som beskrevet af Burnette (1981,

Analyt Biochem. 112:195-203). Forholdet mellem rekombi-nant protein og totalt cellular protein eller totalt inklusionslegemeprotein vurderes med hjælp af SDS-PAGE af hele celle-lysater eller inklusionslegemes-15 præparater, efterfulgt af farvning med Coomassie

Brilliant Blue R250 og efterfølgende gelscanning ved integrativ densitometri. Prøver for NAD-glycohydro-lase og ADP-ribosyltransferase gennemførtes som beskrevet tidligere (Katada et al.1982, Proc. Natl.

20 Acad. Sci. USA 79: 3129-3133; Lim et al^ 1985, J.

Biol. Chem. 260: 2585-2588). Reduktion i den morfologiske reaktion af CHO-celler overfor PTX (Hewlett et al.

1983, Infect. Immun. 40:1198-1203) med antisera mod forskellige rekombinant-underenhedspræparater gennem-25 førtes efter fremgangsmåden af Gillenius et al. (1985, J. Biol. Stand. 13:61-66).

Konstruktion af ekspressionsplasmider.

Alle plasmider konstrueredes fra en serie af 30 Eh coli generaliserede ekspressionsvektorer med for skelle som beskrevet tidligere. De enkelte pertussis toksinunderenhedsgensegmenter isoleredes under anvendelse af restriktionsstederne vist i den kendte teknik, fig. 1; opstrøms-restriktionsstedet var lige indenfor 35 initieringskodonet til ekspression af den signaltpep-tid-holdige del af underenheden, eller lige indenfor

1A

DK 175821 B1 kodonet for den aminoterminale rest af den fuldt udviklede, bearbejdede del af underenheden til ekspression af den methionyl-fuldt udviklede del af under-enhedsanalogen. Ved co-ekspressionen af hele B oligome-5 ren benyttedes, i det ene tilfælde, fragmentet indeholdende den opstrøms ikke-kodende region af S2 til og med S3-enden og udelod coll. ekspressionsvektorens syntetiske ribosombindingssted; i det andet tilfælde udelukkedes S2 ’ s opstrøms ikke kodende region og det 10 syntetiske Eh_ coli ribosombindingssted indføjedes. Syntetiske oligonucleotid-linkere benyttedes til gennemførsel af indføjningen af gensegmenterne i ekspres-sionsplasmiderne i optimal afstand downstreams fra den syntetiske promotor og ribosombindingsstedet. Op-15 strøms-linkere genetablerede hver gens læseramme enten bag det autentiske initiationscodon, i tilfældet med preunderenhedskonstruktioner, eller til den fuldt udviklede aminoterminus's første codon; sidstnævnte oligonucleotider omfatter et methionylinitiations-20 codon. I nogle tilfælde modificeredes codonanvendelse til at reducere potentialet for sekundær struktur nær 5'-enden af de fremkommende mRNA. Cysteincodonet i position 3 i signalregionen i SI-underenheden (Locht and Keith supra,) substitueredes f.eks. med codonet for 25 serin til eliminering af muligheden for skadelige di-sulfidinteraktioner.

Efter transformation af coli FM5-celler med forskellige plasmidkonstruktioner og udpladning på kanamycinholdig agar valgtes et passende antal koloni- 30 er, replica-udplades, dyrkedes som små væskekulturer 0 {"minipreps") og induceredes ved 42 C i 4 timer. De fremstillede minipreps screenedes dernæst ved lysmikroskopi for tilstedeværelsen af inklusionslegemer i bakteriecellerne. Præparater, der viste tydelige 35 inklusioner identificeredes og dertil svarende kolonier fra replica-pladerne udsattes for laboratoriefermente- DK 175821 B1 15 ring i kolbe-målestok (en liter) ved induktionstemperaturen; nogle præparater udsattes senere for føde-batch fermentering i 10-liter industrielle fermenteringstanke. Prøver fjernedes fra fermenteringen på 5 forskellige tidspunkter efter induktion og undersøgtes for tilstedeværelsen af passende PTX-underenheder ved SDS-PAGE, efterfulgt af både Coomassie Brilliant Blue-farvning og Wester blotting; blots omsattes først med et passende monoklonalt antistof, undersøgtes ved 10 autoradiografi, og omsattes dernæst med et polyklonalt anti-PTX-serum og derefter yderligere autoradiografi. Plasmidets struktur fra hver ekspressionsklon bekræftedes ved restriktionskortlægning af det isolerede plasmid og verificeredes ved DNA-sekvensering af for-15 bindelsesregioner.

Ekspression af rekomblnant SI.

Når ih coli-celler indeholdende Sl-ekspressions-plasmidet (pPTXSl/1) induceredes ved 42°C i en 20 føde-batch ίο-liter fermenteringstank i produktionsskala, producerede de et stort intracellulært protein på ca. 26-000 dalton (fig. 2A venstre, bane rSl), som comigrerede med autentisk PTX SI i SDS-PAGE.

Delvis aminosyresekvensanalyse (5 cycler) viste, at 25 dette polypeptid havde den aminoterminalsekvens, der var forudsagt for den fuldt udviklede Sl-underen-hed (Locht and Keith, supra). Proteinet identificeredes immunokemisk som SI ved dets reaktivitet med et muse-anti-Sl monoklonalt antistof i et Western blot (fig.

30 2A til højre, bane rSl).

Det skal bemærkes, at laboriatoriefermentering af Sl-ekspressorceller i 1-liters kolbeskala resulterede i ufuldstændig spaltning af rSl signalpep-tidet, et fenomen der også observeredes for ekspressio-35 nen af andre PTX underenheder i Eh coll (se det efterfølgende) . Man forsøgte at identificere den molekylære 16 DK 175821 B1 blokering af signalbearbejdningen, som bemærkedes ved en række forsøg i kolbeskala, hvilke forsøg havde til hensigt at øge udstrækningen af preproteinspaltning: inføjning af SI-genet i en ekspressionsvektor med lavt kopiantal, sub-5 stitution af en syntetisk coli spaltelig signalsekvens (Picker et al., 1983, Infect. Ummun. 4j2:269-275) i stedet for det autentiske SI-signalpeptid, og cotransformation af de underenhedseksprimerende celler med et ekspres-sionsplasmid indeholdende genet for E. coli leader- 10 peptidase (Date, supra.) til øgning af det grundlæggende niveau for dette enzym. Ingen af disse tilnærmelser første til nogen signifikant ændring i signalspaltning. Ændring i fermenteringsbetingelser til en føde-batch-proces førte 15 imidlertid til bearbejdning af pre-Sl til dets fuldt udviklede form, der i det væsentlige var fuldstændig.

Succesen med at eksprimere S4-underenheden som et fuldt udviklet methionylpolypeptid (angivet senere) gav anledning til anvendelse af samme strategi for rSl.

20 Modsat rS4-ekspression i coli, var ekspressionen af fuldt udviklet methionyl Si imidlertid så lav, at et Western blot var nødvendig til dets detektion.

Derimod giver ekspressionen af rSl, idet dets autentiske signalsekvens benyttes, det fuldt bearbejdede poly-25 peptid i koncentrationer på 10-30% af det totale celleprotein. Som det beskrives senere, kan afkortelsen af rSl's fuldt udviklede aminoterminus ved rekombinante midler resultere i yderst høje ekspressionsniveauer.

Faktisk resulterede substitution af så lidt som de to 30 første rester af den fuldt udviklede Sl-sekvens (AspAsp) med Metval i signifikant ekspression i forhold til den methionyl-fuldt udviklede form.

35 DK 175821 B1 17

Ekspression af S2, S3, S4 og S5.

Som en test for gennemførlighed, eksprimeredes PTX S4 underenheden først som et fuldt udviklet methio-nylprotein uden dets native leader-peptid og producere-5 des, som beskrevet ovenfor, i store koncentrationer i E. coli (fig. 2B til venstre, rmS4bane). Skønt dets migrering i SDS-PAGE var svagt forsinket i forhold til S4's fra totale toxinpræparater, havde det den forud-sagte S4-aminosyresekvens. S4 renset fra B_;_ pertussis 10 ved HPLC udviser samme forsinkelse i gelelektroforese (Locht et al. supra). Rekombinant S4 reagerer udmærket med polyklonalt antisera i Western blots (fig. 2B til højre, bane rmS4), men udviser reduceret reaktivitet med et S4-monoklonalt antistof.

15 I modsætning til resultaterne opnået med SI, re sulterede ekspression af S4 med dets native leader-peptidsekvens (Locht and Keith, supra) i umålelige proteinmængder (ikke vist). Det skal imidlertid bemærkes, at Nicosia et al. (supra) forudsiger et andet 20 translationsstartsted længere opstrøms; det er muligt, at anvendelsen af denne yderligere sekvens i S4-leader-peptidet vil resultere i meget større ekspressionsniveauer. Rekombinant S2, S3 og S5 eksprimeredes hver især med deres native leader-sekvenser (fig. 2A, hen-r 25 holdsvis bane rS2, rS3 og rS5); ingen af disse underenheder var fuldt bearbejdet under fermenteringen i laboratoriemålestok, skønt indledende fermenteringsforsøg i produktionsskala med anvendelse af føde-batch-processen giver mærkbar forbedring ved bearbejd-30 ningen af S2 og S5. S2, S3 og S5 eksprimeredes også hver især i EL coli i en methionyl-fuldt udviklet form i koncentrationer, der er sammenlignelige med dem, der opnåedes med deres native leader-peptider (fig. 2B, henholdsvis bane rmS2, rmS3 og rmS5). Som angivet oven-35 for, bearbejdes S2, S3 og S5's heterologe methionin-rester ved cellular methionaminopeptidase til opnåelse af fuldt udviklede polypeptider af nativ sekvens.

18 DK 175821 B1

Hele det polycistroniske stykke, der udgør B-oligomer-underenheder (S2-S4-S5-S3) eksprimeredes under kontrol af P^-promotoren. Pig. 3 viser virkningen af den opstrøms ikke-kodende region på produktionen 5 af S2-underenheden. I et tilfælde beholdt ekspressions-plasmidet hele den intercistroniske del mellem SI1 s termineringscodon og S2’s initieringscodon (Locht and Keith, supra), men uden det syntetiske ribosombindingssted, som benyttet i alle andre ekspressionsplasmider.

10 Dette resulterede i syntesen af rekombinant-S2, som viste sig at være fuldstændigt bearbejdet, når det undersøgtes i et Western blot med et anti-S2 monoklonalt antistof (fig. 3, baner D og E); selv om det ikke er vist, tyder polyklonal antistofanalyse på, at andre 15 B-oligomer underenheder også blev totalt bearbejdet i deres fuldt udviklede forme. Substitution af det ikke-kodende intercistroniske stykke med den syntetiske Shine-Delgarno sekvens resulterede i et meget højere rS2~synteseniveau (fig. 3, baner B og C); dette mate-20 riale er imidlertid ufuldstændigt bearbejdet. Virknings fuldhed en af syntese af hver cistron viste sig at være direkte korreleret til dets nærhed med 5'enden af budskabet, dvs. S2>S4>S5>S3. Et indledende forsøg, hvor den resterende del af operonen anbringes down-25 streams fra den højt-eksprimerende Sl-konstruktion (se ovenfor), resulterede i meget små synteseniveauer og ufuldstændig bearbejdning af hver af underenhederne, inklusive SI).

30 Rekombinant-PTX-underenheder’s egenskaber.

Meget få, hvis nogen af de bearbejdede PTX-underenheder viste sig at blive-sekreteret fra E^_ coli-celier, til trods for at noget tyder på, at fuldt bearbejdet rSl kan findes i det periplasmiske rum i be-35 grænset udstrækning. Massen af hver underenhed fandtes i form af inklusionslegemer og udgjorde 10-30% af DK 175821 B1 19 totalcellular protein. Cellelysis ved hjælp af "French press" og centrifugering ved lav hastighed resulterede i pellet-fraktioner indeholdende op til 65% af deres protein som individuelle underenheder.

5 Alle PTX-underenheder var .detekterbare i Western blots med et polyklonalt kanin-antitoksinserum (fig.

2). Som angivet ovenfor, reagerede underenheder rSl og rS2 udmærket med specifikke monoklonale antistoffer i Western blots. Rekombinant-S4, fremstillet som et 10 methionylpolypeptid udviste reduceret reaktivitet med et anti-S4 monoklonalt antistof. Monoklonale antistoffer overfor underenheder S3 og S4 var ikke tilgængelige, skønt rS3 kunne detekteres på et Western blot med anti-S2 monoklonalt antistof i kraft af dets 15 nære sekvenshomologi med 52 (Locht and Keith, supra).

Når rå rekombinant-rSl-præparater inkuberedes i nærværelse af[32P]NAD med membraner isoleret fra CHO-celler, ADP-ribosyleredes et protein på ca.

41.000 daltons, identisk til det, der ribosyleredes 20 af nativ total PTX; dette molekyle formodes at være -membranreguleringsproteinet af adenylat cyclase komplekset (Bokoch et al. 1983, J. Biol. Chem. 258: 2072-2075; og Hsia et al. 1983, J. Biol. Chem. 259: 1086-1090). Bovint transducin kan benyttes som et 25 substrat for ribosylase (fig. 4), et molekyle som har vist sig at være en acceptor for pertussis toksinkatalyseret ADP-ribose-overførsel fra NAD. (Manning et al. supra; West et al., supra). Dette resultat bekræfter lokaliseringen af ADP-ribosyltransferase-30 aktiviteten på A-promotoren (SI-underenhed) af toksin og antyder, at det rekombinante B_j_ pertussis-protein er foldet i en form, der ligger nær op ad dets native tre-dimentionelle struktur i e_^ coli. Rekombinant-Sl udviste yderligere NAD-glycohydrolaseaktivitet, der 35 også identificeres med A-promotoren. Mus immuniseredes, og denne forstærkedes ved intraperitoneal injektion med r 20 DK 175821 B1 | et rå inklusionslegeme-præparat af rSl eller med renset, rekombinant methionyl-S4. Det benyttede rSl-underenhedsmateriale indeholdt både fuldt bearbejdet polypeptid og ubearbejdet preprotein i et omtrentligt 5 forhold på 1:2, idet den relative immunogenicitet af de to rSl-arter ikke er kendt. Serumprøver testedes i fast-fase RIA for tilstedeværelsen af antitoxin-antistof (fig- 5). Dyr, der modtog rekombinant-Sl udviste en signifikant antitoxinreaktion lige meget 10 om den immuniserede dosis var formuleret med komplet Freund’s adjuvans eller ej. Rekombinant-S4, der kun tildeltes i formuleringer i adjuvansform var også meget immunogene i forhold til hel toksinadjuvans og kommerciel pertussisvaccine.

15 Behandling af dyrkede CHO-celler med hel pertussis toksin resulterede i en "sammenhobet" morpho-logi (Hewlett et al., supra), som kan modvirkes med an-titoksinsera (Gellenius et al., supra). Under indledende forsøg var muse-sera mod rSl eller rS4, fremstillet 20 som beskrevet ovenfor og med relativt høje titere af antitoksin-antistoffer, ikke rutinemæssigt i stand til at neutralisere CHO-cellers reaktion overfor nativ toksin.

25 Immunobeskyttelse af mus med rekombinant SI.

Mus immuniseret med rå rekombinant SI, renset rekombinant S4 og passende kontrolmateriale (se ovenfor) udsattes for intracerebral udsættelse (i.c.) med B. pertussis musevirulent stamme 18323 og dødelighed 30 noteredes helt op til 45 dage efter udsættelse (fig.

6). Mus immuniseredes med 50 yg af teststoffet (100 yl af en 1:35 fortynding til kommerciel pertussisvaccine) ved intraperitoneal injektion; immuniteten forstærkedes ved indsprøjtning af en tilsvarende mængde 35 21 dage efter inokulering og musene udsattes 7 dage senere ved i.c. udsættelse af levende pertussis DK 175821 B1 21 stamme 18323 (3 x 104 organisme per dyr). Skønt be skyttelse ikke var forventet på grund af manglen på aktiv holotoksin i de rekombinante præparater, var det overraskende at obervere en øgning i overlevelses-5 tiden for rSl-immuniserede dyr i forhold til uimmuni-serede kontroldyr. En række mus, der yderligere modtog rSl formuleret med adjuvans var fuldstændig beskyttet mod udsættelse. Mus immuniseret med rS4, formuleret med adjuvans, var ikke beskyttet bedre end 10 uimmuniserede mus, til trods for at de udviste en god antistof reaktion (se fig. 5). I et andet indledende forsøg viste rSl, formuleret med et adjuvans, at frembringe dosis-responsbeskyttelse mod udsættelse. Ufuldstændig beskyttelse i i.c.-udsættelsesprøven kan 15 have basis i fraværet af aktiv holotoksin i det immuniserende materiale; ikke desto mindre viser beskyttelse opnået i dette indledende studium, at rekombinant S1-protein er muligt som et underenhedsvaccinemateriale.

Senere studie har ikke bekræftet immunobeskyttelse over 20 for intracerebral udsættelse med pertussis muse virulent stamme 18323.

SI analoge.

Idet metoder til proteinmanipulering og sted-25 specifik mutagenese benyttes, fremstilledes afstumpede Sl-analoge. Regionen afgrænset af valin 7 og prolin 14 viste sig at være en nødvendig region for ADP-ribosyl-transferaseaktivitet hos Sl-molekylet. Et antigenisk epitop, som binder et monoklonalt antistof, der passivt 30 beskytter mod toksinaktivitet i mus (dvs. et epitop, der er indraget i frembringelse af en beskyttende reaktion) ligger i det mindste delvist indenfor regionen afgrænset af valin 7 og prolin 14, inklusive. Mutagenese af Sl-molekyle i regionen afgrænset af valin 7 35 og prolin 14, inklusive, producerede analogmolekyler af SI, som mangler enzymaktivitet, medens det beskyt- 22 DK 175821 B1 tende epitop bevares. Det beskyttende epitop er vigtigt ved tilvejebringelsen af immunobeskyttelse mod pertussis toksicitet. Modifikation af regionen fra valin 7 til og med prolin 14, herunder substitution 5 af én eller flere aminosyrer, resulterer i Sl-analogprodukter, der kan frembringe toksinneutraliserende niveauer af antistoffer, og som i det væsentlige er uden reaktogene bestandele.

10 Subkloning af PTX-Sl-qenet i pUC18.

Plasmid pPTX42, der indeholder hele operonet for Bordetella pertussis toksin (PTX) opnåedes fra J. Keith (NIAID, Rockey Mountain Laboratory) som transformerede JM109 celler. Bakterierne dyrkedes i 15 L-substrat indeholdende ampicillin og plasmidet ud vandtes og rensedes ved standardmetoder (Maniatis et al., supra). Et 792-bp DNA-fragment indeholdende en del af PTX-Sl-genet (cistron) (Locht and Keith, supra) isoleredes fra pPTX42 ved digestion af plasmidet med 20 restriktionsenzymer Aval og Xbal, efterfulgt af acrylamidgelelektroforese og efterfølgende eluering af DNA-fragmentet fra gelen. Dette DNA-fragment starter ved Aval-stedet lige indenfor den åbne læseramme for pre-Sl-proteinet og slutter ved et Xbal-25 sted ved termineringscodonet for SI. Standardklonings vektoren pUC18 digesteredes også med Aval og Xbal og digestet behandledes med phosphatase. Der gennemførtes en ligeringsreaktion med den digesterede pUC18-vektor, 792-bp DNA-fragmentet (Aval-Xbal) af pPTX42 og T4-DNA-30 ligase under anvendelse af standardbetingelser. Friske, kompetente DH52a-celler transformeredes med ligeringsblandingen og transformanterne selekteredes på agarplader med L-substrat indeholdende ampicillin og "Blue-gal" (Bethesda Research Laboratories, Gaithers-35 burg, MD). Tolv hvide kolonier udvalgtes, replika- udpladedes og dyrkedes som 2 ml væskekulturer. Cellerne "minipræpareredes" ved en standard alkalisk i DK 175821 B1 23 lysismetode, DNA digesteredes med Aval og Xbal, og det opnåede digest udsattes for acrylamidgelelektro-forese.

5 Konstruktion af rPTXSl-ekspressionsplasmid pPTXSl/1.

Et Aval-xbal-fragment på 792 bp isoleredes fra plasmid pPTX42 som beskrevet tidligere. Escherichia col i ekspressionsplasmider pCFM1156 og pCFM1036 opnåedes fra Charles F. Morris, Amgen Inc., Thousand Oaks, 10 CA. Plasmid pCFM1156 digesteredes med restriktionsenzymer Ssti og Ndel og et 1,8 Kb DNA-f ragment isoleredes fra en agarosegel ved elektroeluering på NA45-papir (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.). Plasmid pCFM1036 digesteredes med Ssti og Xbal og et 2,8-Kb 15 DNA-fragment isoleredes på samme måde. To komplementære strenge af oligodeoxynucleotid-linker, der rekonstruerer den udgåede del af SI's åbne læseramme, syntetiseredes ved hjælp af a®ainophosphinkemien fra Caruthers et al. (supra). Det syntetiske fragments sekvens 20 ændredes i dets codonanvendelse for at reducere potentiel sekundær struktur i mRNA, mens den autentiske aminosyresekvens bevaredes; en undtagelse fra dette var substitutionen af et Serincodon for cysteincodonet ved aminosyreposition nr. 2 i preproteinsignalfrekvens-25 rækkefølgen til eliminering af alle disulfidinter-aktioner mellem preproteinsignalet og de to cystein-rester i positionerne 41 og 199 i det fuldt udviklede protein. Denne oligodeoxynucleotid-linker havde et Ndel-sted cohæsivt til det i pCFM1156, og en Aval 30 cohæsiv ende til ligering til Aval-stedet i 792-bp DNA-fragmentet i Sl-genet. Sekvensen for dette oligo-deoxynucleotid var: 35 DK 175821 B1 i 24 5‘tatgcgttctac3' 3,acgcaagatgagcc5.

; 5

Der gennemførtes en ligeringsreaktion med 2,8-kb DNA-fragmentet fra pCFM1036, 1,8-Kb DNA-fragmentet fra pCFM1156, 792-bp DNA-fragmentet indeholdende Sl- gensegmentet, oligodeoxynucleotid-linkeren og T4-DNA-10 ligase. Efter ligering transformeredes FM6-celler (opnået fra C.F. Morris, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA.) med ligeringsblandingen og de udpladedes på L-substratagar med kanamycin. Kolonier udvalgtes og re-plika-udpladedes og minipræpareredes ved hjælp af den 15 alkaliske metode (Maniatis et al., supra). Minipræparerede DNA-prøver udsattes for restriktionsenzymkortlægning og viste sig at besidde de forventede DNA-restriktionsfragmenter. Regionen fra begyndelsen af den syntetiske linker indtil det autentiske Sl-gen's 20 åbne læseramme bestemtes ved DNA-sekvensanalyse. Efterfølgende induktion af dette plasmid førte til højniveauekspression af rekombinant Sl-protein.

Konstruktion af rPTXSl ekspressionsplasmid pPTXSl/2.

25 Et DNA-fragment på 181-bp isoleredes fra plasmid pPTXSl/1 ved digestion med Accl og Sphl; efterfølgende rensning af DNA-fragmentet gennemførtes på polyacryl-amidgel. Dette DNA-fragment er en intern, venstre del af Sl-genet. Idet de samme fremgangsmåder benyttedes, 30 isoleredes et 564-bp DNA-fragment, som udgør den resterende højre del af genet fra PTXS1, der var klonet i pUCl8. Dette gennemførtes ved digetion af plasmidet med Sphl og BamHI, idet sidstnævnte enzym .overskærer down-strøms fra Sl-kloningsstedet (Xbal), ved BamHI-stedet 35 indenfor pUC18-kloningssammenhobningen. DNA-fragmenter på 1,8 Kb og 2,8 Kb isoleredes fra ekspressionsvektoren DK 175821 B1 25 PCFM1156 ved digestion med restriktionsenzymer Ndel,

SstI og BamHI, efterfulgt af isolering med agarosegel elektroforese og elektroeluering af DNA-fragmenterne.

En oligodeoxynucleotid-linker syntetiseredes; denne ! 5 dobbelstrengede linker havde Ndel og Accl kohæsive en der og følgende sekvens: 5' tatggacgatccacctgctaccgt3’ 3 ,acctgctaggtggacgatggcata5, 10

Der gennemførtes en ligering ved standardmetoder (Maniatis et al. supra), idet 181-bp (Accl-Sphl) og 564-bp (Sphl-BamHI) DNA-fragmenterne fra pPTXSl/1, 1,8 Kb (Ndel-SstI) og 2,8 Kb (Sstl-BamHI) DNA-fragmenterne 15 fra pCFM1156, oligodeoxynucleotid-linkeren og T4-DNA-ligase benyttedes. Efter ligering benyttedes blandingen til transformation af friske, kompetente FM5-celler. Kanamycinresistente transformanter opnåedes, restriktionsenzymanalyser gennemførtes på minipræparater af 20 plasmid DNA, og strukturen bekræftedes ved DNA-sekvens-analyse af samlingerne.

Fordøjelse af pPTXSl/2 og konstruktion af vektorer med afstumpede Sl-gener_____ 25 Til vurdering af vigtige antigene epitoper og enzymatisk aktive steder nær det fuldt udviklede Sl-molekyles aminoterminale ende fremstilledes afstumpede versioner af dette protein. Ekspressions-plasmidet pPTXSl/2 digesteredes med Ndel, behandledes 30 med exonuclease Bal31 (IBI) under standardbetingelser, og aliquoter fjernedes på forskellige tidspunkter op til 110 min. Derefter fulgte inaktivering af Bal31 i 0 15 min. ved 65 C, prøver analyseredes for øgning i elektroforetisk migrering på agarosegeler- Prøver fra 35 aliquoterne ved 100 min. og 110 min. samledes (fraktion A) og de resterende prøver samledes og digesteredes med 26 DK 175821 B1 yderligere Bal31; aliquoter fjernedes på forskellige tidspunkter op til 180 min. Efter standsning af reaktionen analyseredes aliquoter igen for øgning i elektroforetisk migrering og fire yderligere fraktioner 5 (B, C, D og E) beholdtes. Hver af de fire fraktioner digesteredes individuelt med SstI og DNA-fragmenter på 3-3,5 Kb isoleredes fra agarosegel ved elektroeluering.

Ekspressionsvektor pCFMH56 digesteredes med SstI og Hpal, og et 1,8 Kb DNA-f ragment isoleredes på 10 samme måde. De individuelle 3-3,5 Kb DNA-fragmenter (Bal31 stump-Sstl) fra pPTXSl/2 ligeredes hver især med 1,8 Kb DNA-fragmentet (Sstl-Hpal), idet T4 DNA-ligase benyttedes under standardbetingelser. Friske, kompetente FM5-celler transformeredes med hver individuel ligerings-15 blanding og kanamycin-resistente transformanter isoleredes. Transformanter for hver fraktion A og B afstumpnin-ger udvalgtes, minipreps induceredes ved 42°c, og præparaterne undersøgtes ved lysmikroskopi for tilstedeværelsen af inklusionslegemer.

20 Inklusionspositive præparater minipræpareredes, digesteredes med xbal, og DNA-indføjningerne størrelsesundersøgtes ved agarosegelelektroforese. Prøver i området fra 600-650 bp valgtes til DNA-sekvensering til bekræftelse af afstumpningernes struktur. Efterfølgende 25 analyser af de eksprimerede, rekombinant proteiner indikerede, at en nødvendig region for ADP-ribosyltransferaseaktivitet i Sl-molekylet og en epitop, der er involveret i frembringelsen af en beskyttende reaktion (dvs. en antigenepitop, der binder 30 et monoklonalt antistof som passivt beskytter mod toksinaktivitet i mus) ligger indenfor en region, der er afgrænset af valin 7 og prolin 14 inklusive (for fuld aminosyresekvens, se Locht and Keith, supra) i det fuldt udviklede molekyle. Disse afstumpede versioner af 35 Sl-molekylet, begynder alle i kraft af vektorkonstruktionen ved deres N-termini med methionylvalyl efter- DK 175821 B1 27 fulgt af den afstumpede sekvens.

Mutaqenese af 51.

Til fin-kortlægning af regionen afgrænset af 5 valin 7 og prolin 14, og til fremstilling af analogmolekyler af SI, som mangler enzymaktivitet, men som bevarer det beskyttende epitop i denne region, udsattes rekombinant Sl-genet for mutagenese. Retentionen af det beskyttende epitop defineres ved reaktivitet med mono-10 klonalt antistof 1B7. Dette gennemførtes ved at substituere syntetiske oligodeoxynucleotidsegmenter for den autentiske region, der koder for resterne valin 7 til og med prolin 14. Disse segmenter indeholdt enkelt eller dobbelt codonsubstitutioner til modifikation af 15 den autentiske aminosyresekvens. Modifikation kan opnås ved deletion og/eller substitution. Det ligger indenfor den foreliggende opfindelses omfang at modificere en enkelt base til opnåelse af de ønskede egenskaber i Sl-analoge. En enkelt base kan modificeres for at modi-20 ficere aminosyresekvensen. Det er imidlertid velkendt for en fagmand indenfor området, at den statistiske sandsynlighed for genotypisk reversion til vild-type er større, når en enkelt base modificeres i sammenligning med modifikation af mindst to baser. I en foretrukken 25 udførelsesform medførte hver af disse codonændringer substitution af mindst to baser i hvert codon til reduktion af virkningsfuld-heden af reversioner. Oligodeoxynucleotid-linkere syntetiseredes med Accl og BspMlI kohæsive ender og indeholdt den autentiske 30 Sl-sekvens, med undtagelse af codonændringerne, i angivet i linker-beskrivelserne i Tabel I: 35 DK 175821 B1 28

Tabel I

kcxistruktion: pPTXSl(6A-3/5-1) oodonændring : tyr8 til phe oligodeoxynukleotid -linker-sekvens: 5 5’ v 5 ATTCCGCTATCACTCCCGCCCC3 3. AGGCGATACTGAGGGCGGGCGGCC 5 .

konstruktion: pPTXSl ( 6Α-3/4-1) oodonændring : arg 9 til iy* oligodeoxynukleotid -linker-sekvens: ! 10 5'atacaagtatgactcccgcccg3' I 3.TGTTCATACTGAGGGCGGGCGGCC 51 konstruktion: pPTXS 1 ( 6A-3/3 -1) oodonændring: aspil til 9lu oligodeoxynukleotid -linker-sekvens: 5'ATACCGCTATCAATCCCGCCCG3‘ 15 3.TGGCGATACTTAGGGCGGGCGGCC 5.

konstruktion: pPTXSl ( 6A-3/2-2) codonændring : ser 12 tilgly oligodeoxynucleotid -linker -sekvens: 5’ataccgctatgacggccgcccg3' 3,tggcgatactgccggcgggcggcc5.

konstruktion: pPTXSl ( 6A-3/1-1) codorrcidring : argl3 til lys oligodeoxynukleotid -linker -sekvens: 5’ATACCGCTATGACTCCAAGCCG 3‘ 3,TGGCGATACTCAGGTTCGGCGGCC5.

konstruktion: pPTXSl ( 6A-3/8-1) 25 oodonændring.: tyr8 tilleu og arg9 tilglu oligodeoxynukleotid - linker-sdcvens: 5'ATTGGAATATGACTCCCGCCCG3' 3-ACCTTATACTGAGGGCGGGCGGCC5.

konstruktion: pPTXSl (6A-3/7-2) codonandring : arg9 til asn og serl2 tilgly 30 oligodeoxynukleotid - linker-sekvens: 5 ' ATACAACTATGACGGCCGCCCG 3‘ 3,TGTTGATACTGCCGGCGGGCGGCCj, konstruktion: pPTXSl { 6A-3/6-1) codonændring : aspil til pro og prol4 til asp oligodeoxynukleotid - 1 inker-sekvens: 35 s'ataccgctatccgtcccgcgac3* 3,tggcgataggcagggcgctgggcc5.

DK 175821 B1 29

Til ekspressionsplasmidkonstruktion isoleredes de følgende DNA-fragmenter ved elektroeluering fra aga-rosegeler: 1) et 1824-bp DNA-fragment (Accl til SstI) fra 5 pPTXSl(6A), et plasmid konstrueret som beskrevet tidligere, som eksprimerer et rekombinant Sl-analogmolekyle, der har slettet aspartat 1 og aspartat 2, og som er substitueret med methio-nylvalyl; 10 2) et 3,56-Kb DNA-fragment (SstI til BspMII) fra pPTXSl(33B), et plasmid konstrueret som beskrevet tidligere, som eksprimerer en rekombinant Sl-analog, der har slettet de første 14 aminosyrerester, og som er subsituteret med et 15 methionylvalyl. I denne særlige genkonstruktion skabte stumpende-ligeringen, som resulterede i dette forkortede molekyle, et nyt BspMII-sted.

Dette restriktionssted, der ikke findes i det native si cistroniske element, muliggør an-20 vendeisen af relativ korte oligonucleotid- linkere med Accl og BspMII kohæsive ender til fremkaldelse af mutagenesis.

Disse to DNA-fragmenter ligeredes med de individuelle oligodeoxynucleotidfragmenter, beskrevet oven-25 for, under standardligeringsbetingelser. Disse ligeringer resulterede i hidtil ukendte konstruerede Sl-gener; en del af pPTXSl(6A) tilvejebringer opstrøms-codonerne til Accl-restriktionsstedet, idet de syntetiske fragmenter tilvejebringer forskellige mutationer til 30 codoner mellem AccI-stedet og BspMII-stedet, og en del af pPTXSl(33B) tilvejebringer den resterende del af den SI kodende region downstreams fra det hidtil ukendte BspMII-restriktionssted. Efter ligering benyttedes hver blanding til at transformere et ad-35 skilt præparat af friske, kompetente FM5-celler.

Transformantex udvalgtes, dyrkedes som minipreps, 30 DK 175821 B1 induceredes til produktion af rekombinant protein og inklusionslegems-positive prøver identificeredes ved lysmikroskopi. Disse prøver fermenteredes i større målestok (1-6 liter) ved induktionstemperaturen til frem-5 stilling af større mængder af hver rekombinant analogprotein. Isolerede cellepastaer lyserede i en fransk presse (French press) efter resuspension i destilleret H20 med 1 mM DTT. Inklusionslegemer isoleredes fra disse lysater ved simpel centrifugering ved lav hastighed.

10 Disse inklusionslegemsproteinpræparater indeholdt helt ned til 30% og helt op til 80% af de rekombinante proteiner. Hvert præparat analyseredes for dets evne til binde i et Western blot format (Burnette, supra.) til monoklonalt antistof B2F8 rettet mod et dominant epi-15 top, identificeret under vore studier med afstumpede Si analoge# og til at binde til monoklonalt antistof 1B7, der vides passivt at beksytte mus mod intracerebral udsættelse med virulent El·^ pertussis (Sato et al. supra). Disse prøver vurderedes desuden for ADP-20 ribosyltransferaseaktivitet. De opnåede resultater er vist i Tabel 2.

Tabel 2

Antistofbinding ADp-RTase

Prøve B2F8 1B7 Aktivitet: 25 ingen - PTX (kommerciel) + + + rPTXS (pPTXSl/1) + + + pPTXSl{6A-3/1-1) + ♦ + pPTXSl(6A-3/2-2) + + + pPTXSl(6A-3/3-1) + ♦ + pPTXSl(6A-3/4-1) + + pPTXSl(6A-3/5-1) + + + 30 pPTXSl(6A-3/6-1) - pPTXSl(6A-3/7-2) - - pPTXSl(6A-3/8-1) -

Sl-analog 4-1 (Arg9->Lys) udviste ringe eller ingen transferaseaktivitet, mens reaktivitet med neu-35 traliserende mAb 1B7 bevaredes. Kun særdeles små mængder enzymaktivitet kunne vises ved at øge mængden DK 175821 B1 31 af 4-1 protein i prøven (fig. 8A); gentagende bestemmelser indikerede, at Sl-analogens specifikke ADP-ribosyltransferaseaktivitet var reduceret med en faktor på mindst 5.000. Måling af NAD-glycohydrolase-5 aktiviteten, knyttet til enkelt-rest substitutionsmutanterne (fig. 8B), viste et mønster, der svarede til det, der opnåedes ved evaluering af ADP-ribosyl-transferaseaktivitet. Sl-analog 4-1 udviste ringe eller ingen detekterbar glycohydrolaseaktivitet, hvil-10 ket indikerer en reduktion i betydningen af dets aktivitet med en faktor på mindst 50-100.

På grund af dets evne til at bevare binding til et passivt-beskyttende monoklonalt antistof (dvs. beholder et større beskyttende epitop) og fordi det 15 mangler en større markør for toksisk aktivitet (ADP-ribosyltransferase), har det rekombinante Sl-analog-molekyle, produceret ved klon pPTXSl (6A-3/4-1), som vist i fig. 7 og modifikationen deraf, anvendelse som sikre, økonomiske underenhedsvacciner, enten alene 20 eller i kombination med andre PTX-underenheder. Sl- analoge fremstillet ved klon pPTXSl(6A-3/4-1), hvori lysin er substitueret med arginin 9, belyser rSl-analoge med de ønske egenskaber, der er nødvendige for sikre underenhedsvacciner. Andre analoge af 25 6A-3/4-1 kan f.eks. omfatte aspartylaspartylrester i positioner 1 og 2, methionylaspartylaspartylrester i positioner 0, 1 og 2, og methionylvalylaspartylrester i positioner 0, 1 og 2.

Por tiden benyttede acellulare vacciner indehol-30 der SI, S2, S3, S4 og SS underenheder. De morphologiske modifikationer, der frembringes i dyrkede mammaliacel-ler af pertussis toksin, har for nylig vist sig at være en egenskab hos Sl-underenheden (Burns et al., 1987,

Infect. Immun. 55:24-28), skønt denne virkning kun er 35 påvist i nærværelse af B-oligomeren. Indledende studier beskrevet heri, viser muligheden for en enkelt under- DK 175821 B1 32 enhedsvaccine, idet man benytter rSl-analoge, der beholder et væsentligt beskyttende epltop, men mangler toksisk aktivitet. SI-analoge kan også finde anvendelse sammen med underenheder S2, S3, S4 og S5. Disse under-5 enheder kan forstærke immunreaktionen mod SI og kan i sig selv have beskyttende epitoper. Det ligger indenfor denne opfindelses omfang, at vacciner indeholdende Sl-underenhedsanaloge yderligere kan inkludere mindst én af de nævnte underenheder S2, S3, S4, S5 og blandin-10 ger deraf, af Bordetella exotoksin. SI, S3, S4 , S5 kan være underenheder, der afledes fra pertussis, eller genetisk manipulerede underenheder og analoge deraf. Ge- i netisk manipulerede underenhedsprodukter kan indeholde fusionsproteiner og ikke-fusionsproteiner.

15 For forsøgene beskrevet i det efterfølgende af snit ændres ekspressionssystemet til at frembringe en Sl-underenhedsanalog (Sl/i-4), som har lysin-for-arginin 9-substitutionen, men som ikke har de native aspartylaspartatrester ved aminoterminussen.

20

VURDERING AF BIOLOGISK AKTIVITET AF

_SI/1-4-ANALOGE OG Sl/1

Rekombinant Sl-protein af nativ sekvens (Sl/1) og analog Sl/1-4 (som beskrevet ovenfor, indeholder 25 Arg 9 > Lys-substitutionen og de aspartylaspartat ami-noterminale grupper fra den native sekvens) isoleredes individuelt fra EL_ coli-producerende celler ved en fremgangsmåde som omfatter cellenedbrydning, centrifugering, urinstofsolubilisering, ionbytningschromato-30 grafi og gelfiltreringschromatografi. Cellepastaene suspenderedes i 25 mM Tris-puffer, pH 8,5, og lyseredes ved højtrykssplittelse (French -press). Lysatet centrifugeredes og de opløselige pellets, der indeholdt rekombinant Sl-proteinerne, opløstes i 8 M urinstof, 25 35 mM Tris, pH 8,5. Efter tilsætning af CuS04 til en koncentration på 50 μΜ, omrørtes blandingerne natten over DK 175821 B1 33 til dannelse af disulfidbindinger i de rekombinante Sl-proteiner. Blandingerne fortyndedes med lige voluminer af 8 M urinstof, 25 mM natriumcitrat, pH 3,8, og overførtes til kolonner med S-Sepharose ("fast-flow") 5 ækvilibreret ved pH 3,8 i 8 -M urinstof· Kolonnerne elueredes med lineære gradienter af NaCl (0-0,5 M) i 8 M urinstof, 12,5 mM natriumcitrat, pH 3,8. Brede toppe opsamledes fra hver kolonne og titreredes til pH 7,5.

Disse puljer af chromatografiske fraktioner overførtes 10 adskilt til Sephacryl S-200-kolonner, ækvilibreret i 2 M urinstof, 10 mM kaliumphosphat, pH 7,5 og puljer af elueringsmaterialet opsamledes, hvilket udgjorde oxideret, monomere, rekombinant Sl-proteiner af hver type (Sl/1 og Sl/1-4). Rensede Sl-underenhedsproteiner 15 analyseredes ved SDS-PAGE efterfulgt af sølvfarvning af proteinerne i geler (fig. 9). Geler (12,5% acrylamid) gennemkørtes under reducerende betingelser. Bane l, molekylvægtstandarder (Pharmacia). Bane 2, 2 yg B.

pertussis holotoksin (List Biological Laboratories).

20 Bane 3, 0,2 yg B. pertussis si-underenhedsprotein (List Biological Laboratories). Bane 4, 0,2 yg rekombinant

Sl/l. Bane 5, 0,2 yg rekombinant Sl/1-4. Bane 6, blank.

Bane 7, 0,4 yg Sl-underenhedsprotein (List). Bane 8, 0,4 yg rekombinant Sl/1. Bane 9, 0,4 yg rekombinant 25 S2/1-4. På dette præparationstrin var rekombinant Sl- typerne mere end 90% rene.

For at vurdere den biologiske aktivitet af Si-Arg 9 t>Lys-mutationen, var det nødvendigt at opnå sammenknytningen af den mutante analoge og · det re-30 kombinante Sl-protein af nativ sekvens i pertussis i holotoksin-arter. Yderst rensede pertussis toksin B- oligomer (en pentamerisk struktur af toksinunderen-heder S2, S3, S4 og S5) tilvejebragtes af D. Burns,

Center for Biologies Evaluation and Research, Food and 35 Drug Administration. De to forskellige Sl-underenheds-arter fik lov til individuelt at knyttes til B-oligo- DK 175821 B1 34 meren til dannelse af holotoksinmolekyler {indeholdende enten Sl/1 eller Sl/1-4) ved efterfølgende metode.

Lige molære mængder af rekombinant Si-typer og B-oligomer samledes i opløsninger med 2 M urinstof, 5 10 mM kaliumphosphat, pH 7,5 og inkuberedes i 30 min.

O

ved 37 C. Holotoksindannelse vurderedes ved elektro-forese i nativ acrylamidgeler (fig. 10). Gel 1, rekombinant Sl/l og nativ oligomer. Gel 2, rekombinant Sl/l-4 og nativ B-oligomer. Gel 3, nativ B-oligomer.

10 Gel 4, nativ B. pertussis holotoksin. Gel 5, rekombinant Sl/1. Gelerne viser, at holotoksintyper samledes fra kombinationen af nativ B-oligomer med enten rekombinant Sl/1 eller rekombinant Sl/1-4.

Semi-rekombinant holotoksiner (B-oligomer plus 15 enten Sl/1 eller analog Si.1-4) undersøgtes dernæst for deres evne til at frembringe en sammenhobende reaktion i kinesiske hamster ovarieceller (CHO) in vitro; denne reaktion har vist sig at være et mål for pertussis toksin's cytopathicitet. Eksperimentelle prøver 20 og passende kontrolprøver fortyndedes i CHO-celle- kulturmedium (Dulbecco modificeret Eagle medium med 10% fetal bovinsesrum), steriliseredes ved ultrafiltrering og fortyndedes yderligere ved serieoverførsel til plastkul turplader med 96-brønde. Ca. 5-7 x 103 frisk 25 trypsinerede CHO-celler {American Type Culture

Collection CCL 61, CHO-K1-celler) sattes til hver brønd, og pladerne inkuberedes ved 37 C i 5% C02 i 48-72 timer. Cellemonolagene vaskedes med phosphat-pufferindstillet saltopløsning, farvedes med krystal-30 violet og undersøgtes for tilstedeværelsen af celle-sammenhobninger ved lysmikroskopi.

Pig. li viser resultaterne af sådanne analyser; resultaterne fra felterne G, H og j, der vedrører Sl/l-4-analogen er af særlig interesse. Sl/l-4-analogen 35 alene og l/1600-fortyndingen af holotoksin, dannet ud fra Sl/l-4-analog og B-oligomer, viser en mangel på DK 175821 B1 35 cellesammenhobning, idet l/200-fortyndingen udviser en negligerbar mængde af sammenhobning. Felt A er celler behandlet med en 1/200's fortynding af puffer , alene. Felt B er behandling med B-oligomer alene, ved 5 en fortynding på 1/200; små mængder af sammenhobning er synlige ved denne fortynding og må tillægges forurening af nativ SI-underenhed, der bliver tilbage efter rensning. Felt B kan sammenlignes med et andet område i den samme brønd (felt I), hvilket tydeligt viser sam-10 menhobningsaktivitet af B-oligomerpræpareringen ved en fortynding på 1/200. Felt C er celler behandlet med nativ, af kommerciel kvalitet SI-underenhed (List Biologicals) ved 1/2000 fortynding. Felt D er nativ, af kommericel kvalitet pertussis holotoksin (List 15 Biologicals) ved 1/2000 fortynding, hvilket viser den dramatiske cytopathiske virkning af pertussis toksin på CHO-celler under dyrkning. Felt E er rekombinant Sl-underenhed af nativ sekvens (Sl/1) ved en fortynding på 1/2000. Felt F viser Sl/1 kombineret med B-oligomer 20 og fortyndet til 1/2000; virkningen af CHO-cellesammen-hobning viser ..sig lige så dramatisk som med nativ holotoksin og understøtter de fysiske gelresultater (ovenfor), hvilket viser holotoksinsammenknytning med B-oligomer og rekombinant Sl-proteinet. Felt G viser 25 at Arg. 9 Lys-mutant Sl/1-4 i. sig selv ikke har nogen virkning på CHO-cellerne. Felt H viser manglen på CHO-cellesammenhobning ved en 1/1600's fortynding af holotoksin dannet ud fra Sl/l-4-analogen og B-oligomeren. Ved en fortynding på 1/200 (felt J) be-30 mærkes en vis sammenhobning af Sl/l-4-holdig holotoksin; bidraget til sammenhobningsvirkningen fra de analoge Sl-typer viser sig imidlertid at være negligerbare i sam-menliging med B-oligomer i sig selv ved den samme fortynding (felt I).

35 Der har været gennemført indledende forsøg for kvantitivt at bestemme den virkningsfulde koncentration DK 175821 B1 36 af forskellige pertussis toksintyper, der er nødvendig til fremkaldelse af CHO-cellesammenhobningsfænomenet. Indledende resultater antyder, at både kommerciel pertussis toksin og holotoksin indeholdende rekombinant 5 Sl/1 kan bevirke sammenhobning ved koncentrationer helt ned til 0,25-0,30 ng/ml; i modsætning hertil er holotoksin indeholdende Sl/l-4-analogen nødvendig i koncentrationer på mindst 10-25 ng/ml for at inducere sammenhobningsvirkningen.

10 Disse resultater bekræfter, at den cytotoksiske i virkning af pertussis toksin ligger i dens Sl-under- enhedsdel, og at den er direkte knyttet til dens enzymaktiviteter. Af større betydning er, at disse forsøg viser, at et relativt ikke-toksisk pertussis 15 toksinmolekyle kan dannes ud fra specifik rekombinant toksinunderenheder, afledt ved steddirigeret mutagenesis.

Det er tilsigtet, at den foreliggende opfindelse omfatter alle sådanne modifikationer og forbedringer, som 20 ligger indenfor den foreliggende opfindelses omfang.

Trækkene gengivet i den foregående beskrivelse, i de følgende krav og/eller i de ledsagende tegninger kan, både hver for sig og i en hvilken som helst kombination, være af afgørende betydning for realisering af opfindelsen i 25 dens forskellige former.

Claims (19)

1. DNA-molekyle, der koder for en polypeptidanalog af underenhed SI af Bordetella exotoksin, hvor polypepti-danalogen har en aminosyresekvens, der adskiller sig fra 5 den naturligt forekommende sekvens af underenhed Si ved en eller flere aminosyrerester i området begrænset af valin 7 og prolin 14 inklusive, hvor arginin 9 er blevet erstattet med lysin, hvilket molekyle koder for en analog, som (a) kan fremkalde toksinneutraliserende niveauer af anti- 10 stof og (b) er uden enzymaktivitet knyttet til toksinreak-togenicitet.

2. DNA-molekyle ifølge krav 1, som også koder for en væsentlig epitop, der er vigtig for tilvejebringelse af immunbeskyttelse mod Bordetella-toksicitet.

3. DNA-molekyle ifølge krav 1, hvor nævnte Bordetel- la exotoksin udvælges fra gruppen bestående af B_;_ pertussis, B. parapertussis og B. bronchiseptica exotoksiner.

4. Polypeptidanalog af underenhed SI .af Bordetella exotoksin, hvor polypeptidanalogen har en aminosyrese- 20 kvens, som adskiller sig fra den naturligt forekommende sekvens af underenhed SI ved en eller flere aminosyrerester i området afgrænset af valin 7 og prolin 14 inklusive, hvor arginin 9 er blevet erstattet med lysin, hvilken polypeptidanalog (a) kan fremkalde toksinneutraliserende 25 niveauer af antistof og (b) er uden enzymaktivitet knyttet til toksinreaktogenicitet.

5. Analog ifølge krav 4, som omfatter en væsentlig epitop, der er vigtig for tilvejebringelse af immunbeskyt- [ telse mod Bordeltella-toksicitet.

6. Analog ifølge krav 4, hvor de toksinneutralise rende niveauer af antistof tilvejebringer immunbeskyttelse mod Bordetella-toksicitet.

7. Analog ifølge krav 4, hvor nævnte Bordetella exotoksin udvælges fra gruppen bestående af B_;_ pertussis, B. 35 parapertussis og B^_ bronchiseptica exotoksiner. 38 DK 175821 B1

8. Analog ifølge krav 4, hvor den aminoterminale ende af analogen omfatter en methionylvalyl-sekvens.

9. Analog af underenhed SI af Bordetella exotoksin, hvor analogen omfatter en aminosyresekvens som vist i Fig. 5 7.

10. Forbedret vaccine til immunisering mod Bordetella pertussis, der omfatter en polypeptidanalog af underenhed SI af Bordetella exotoksin, hvor polypeptidanalogen har en aminosyresekvens, som adskiller sig fra den natur- 10 ligt forekommende sekvens af underenhed SI ved en eller flere aminosyrerester i området afgrænset af valin 7 og prolin 14 inklusive, hvor arginin 9 er blevet erstattet med lysin, hvilken polypeptidanalog (a) kan fremkalde toksinneutraliserende niveauer af antistof og (b) er uden en- 15 zymaktivitet knyttet til toksinreaktogenicitet.

11. Forbedret vaccine ifølge krav 10, hvor analogen omfatter mindst en væsentlig epitop, der er vigtig for tilvejebringelse af immunbeskyttelse mod Bordetella-toksicitet.

12. Forbedret vaccine ifølge krav 10, hvor de tok sinneutraliserende niveauer af antistof tilvejebringer immunbeskyttelse mod Bordetella-toksicitet.

13. Forbedret vaccine ifølge krav 10, hvor nævnte Bordetella exotoksin udvælges fra gruppen bestående af B_;_ 25 pertussis, B. parapertussis og B_;_ bronchiseptica exotoksi-ner.

14. Forbedret vaccine ifølge krav 10, der yderligere omfatter mindst en af underenhederne S2, S3, S4 og S5, samt blandinger deraf, af Bordetella exotoksin.

15. Forbedret vaccine ifølge krav 14, hvor mindst en af underenhederne S2, S3, S4 og S5, samt blandinger deraf, af Bordetella exotoksin er genetisk manipuleret.

16. Forbedret vaccine ifølge krav 15, hvor de genetisk manipulerede underenheder S2, S3, S4 og S5 udtrykkes 35 som ikke-fusionsproteiner i rekombinante værter udvalgt DK 175821 B1 39 fra gruppen bestående af coli, S. cerivisiae, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Bacillus sp. og vaccinia.

17. Fremgangsmåde til frembringelse af et DNA-5 molekyle, hvilken fremgangsmåde omfatter at frembringe et DNA-molekyle, der koder for en polypeptidanalog af underenhed Si af Bordetella exotoksin, ved punktspecifik muta-genese af det til underenhed SI svarende DNA-molekyle i området afgrænset af valin 7 og prolin 14 inklusive, hvor 10 arginin 9 er blevet erstattet med lysin, hvilket molekyle koder for en analog, som (a) kan fremkalde toksinneutraliserende niveauer af antistof og (b) er uden enzymaktivitet knyttet til toksinreaktogenicitet.

18. Fremgangsmåde til frembringelse af et polypep-15 tidanalog af underenhed SI af Bordetella exotoksin, hvilken fremgangsmåde omfatter punktspecifik mutagenese af et i DNA-molekyle, der koder for underenhed SI, i området af grænset af valin 7 og prolin 14 inklusive, hvor arginin 9 er blevet erstattet med lysin, hvilken polypeptidanalog 20 (a) kan fremkalde toksinneutraliserende niveauer af anti stof og (b) er uden enzymaktivitet knyttet til toksinreaktogenicitet.

19. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbedret vaccine til immunisering mod Bordetella pertussis omfat- 25 tende fremstilling af en vaccine, der omfatter en polypeptidanalog af underenhed SI af Bordetella exotoksin, ved punktspecifik mutagenese af et DNA-molekyle, der koder for underenhed SI, i området afgrænset af valin 7 og prolin 14 inklusive, hvor arginin 9 er blevet erstattet med lysin, 30 hvilken polypeptidanalog (a) kan-fremkalde toksinneutraliserende niveauer af antistof og (b) er uden enzymaktivitet knyttet til toksinreaktogenicitet.