NO325016B1 - Fremgangsmate for fremstilling av en proteinanalog til Bordetella-eksotoksin, polypeptidanalog av S1-subenhet fra Bordetella pertussis-toksin og vaksine mot pertussis. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer høyeffektiv, direkte rekombinant ekspresjon av underenhet av Sl, S2, S3, S4 og S5 av Bordetella-eksotoksin i E. coli uten å bruke fusjoner med deler av heterologe proteiner. Nærmere bestemt gir gentek-niske modifikasjoner av underenhetene en klasse av Bordetella-toksinanaloger med evne til å bringe frem toksinnøytraliserende nivåer av antistoffer, og til å være i det vesentlige fri for reaktogene bestanddeler. Genteknisk fremstilte underenheter kan brukes til å fremstille underenhetsvaksine(r) som har immunogen virkning og er i det vesentlige fri for reaktogene bestanddeler.

Uttrykket Bordetella-eksotoksin betegner en gruppe toksiner som kodes for av genomene til forskjellige arter av Bordetella, slik som B. pertussis, B. para pertussis, og

B. bronchiseptica. Andre uttrykk som er vanlig brukt for å be-tegne Bordeteiia-eksotoksin, er kikhostetoksin ("PTX"), lymfo-cytosefremmende faktor ("LPF") og "islet"-aktiverende protein

("IAP").

Kikhoste vedvarer å være en hovedårsak til sykelighet og dødelighet hos småbarn i mange deler av verden. Helcelle-Bordetella pertussis-vaksiner har tilveiebrakt en effektiv måte for å regulere denne sykdommen. Bruken av slike vaksiner er imidlertid blitt direkte korrelert med svake bivirkninger og tidvis relatert til mer alvorlige, og en gang i blant fatale neurologiske tilfeller.

Store anstrengelser er blitt ofret i et forsøk på å eliminere de skadelige bivirkningene som er kjent for å være forbundet med de nåværende vaksiner. Disse har resultert i frem-stillingen og testingen av acellulære vaksiner, og i grunnforsk-ning i et forsøk på å utvikle sikre rekombinante produkter. Et kritisk første trinn mot kloning og utvikling av en rekombinant DNA-utvunnnet vaksine var sekvensering av kikhostetoksinoperonet og etterfølgende deduksjon av aminosyresekvensene til de individuelle underenheter (Locht, C. og Keith, J.M., 1986, Sience, 232:1258-1264; Locht et al., 1986, Nucl. Acids Res., 14:3251-3261; og Nicosia et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83:4631-4635).

Nicosia et al. (1987, Infect. Immun., 55:963-967) demonstrerte at mRNA som koder for hver av underenhetene Sl, S2, S3, S4 og S5 av Bordetella pertussis, kunne transkriberes effek-tivt fra de klonede genene i E. coli. Selv om de påstås å påvise høye nivåer av transkripsjon av det naturlig forekommende kik-hostetoksins polycistroniske budskap, var mengden av proteiner produsert ved direkte ekspresjon svært lav eller ikke påvisbar. Videre var fusjonsproteiner som deretter ble syntetisert, ute av stand til å utvise noen nøytraliserende beskyttende immun-responser.

Barbieri et al. (1987, Infect. Immun., 55:1321-1323) demonstrerte ekspresjonen av Sl-underenheten som et fusjonsprotein i E. coli. Dette fusjonsprotein inneholder de første seks aminosyrene til beta-galaktosidase, fem aminosyrer som kodes for av pUC18-polylinkeren, etterfulgt av aminosyrene 2-235 i Sl-underenheten. Sl-fusjonsproteinet, produsert i små mengder, hadde bare ca. 25 % ADP-ribosyltransferaseaktivitet av autentisk eller naturlig forekommende kikhostetoksin.

Locht et al. (Abstract, Modern Approaches to New Vaccines, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 9.-14. september 1986) var i stand til å uttrykke et fusjonsprotein som inneholder aminosyrene 2-187 i Sl-underenheten. De forutsa at konstruksjonen ikke ville ha toksisk aktivitet fordi de antok at den manglet NAD-bindingssetet forbundet med ADP-ribosyltransferase, den enzymatiske aktivitet ble antatt å være ansvarlig for reaktogenisiteten til toksinet. Etterfølgende forsøk med dette molekylet indikerer at denne avkortede art hadde i det vesentlige ikke-nedsatt enzymatisk aktivitet. Ingen av underenhetene eller underenhetsanalogene fra teknikkens stand har evne til å frembringe toksinnøytraliserende nivåer av antistoffer, og er i det vesentlige fri for enzymatisk aktivitet forbundet med reaktogenisitet.

Teknikkens stand er også beskrevet i C. Locht et al, Nucleic Acids Research, vol. 14, nr. 8, 1986, s. 3251-3261, J. T. Barbieri et al., Infection and Immunity, vol. 55, nr. 5, 1987, s. 1321-1323 og i C. Locht et al., Science, vol. 232, 1986, s. 1258-1263.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 er en skjematisk fremstilling av cistronordenen til PTX-operonet (teknikkens stand: Locht og Keith, ovenfor).

Områdene med Sl, S2, S4, S5 og S3 angir de foreslåtte åpne lese-rammene for hver av disse PTX-underenhetene. Det igjenfylte området like før hvert cistron betegner den antatte signalsekvens. Restriksjonsenzymsetet umiddelbart nedstrøms for hvert cistron-element angir det nedstrømsrestriksjonssetet som brukes i sub-kloningen av cistronet inn i ekspresjonsvektoren. Restriksjonsenzymsetet som befinner seg like innenfor hvert signalsekvens-område, ble benyttet som oppsstrømsrestriksjonssetet for sub-kloningen av cistronet i full lengde inn i ekspresjonsvektoren med en passende oligodeoksynukleotidlinker for fremstilling av den ufullstendige PTX-underenhet med dens signalsekvens intakt. Restriksjonsenzymsetet like innenfor den åpne leseramme i den ufullstendige PTX-underenhet ble brukt med en passende oligodeoksynukleotidlinker som oppstrømsrestriksjonssetet for sub-kloningen av cistronet uten dets innkodede signalsekvens for fremstilling av en PTX-underenhet som er gjort fullstendig ved tilføyelse av metionyl. Figur 2A og 2B er en SDS-polyakrylamidgel og "Western blot" av rekombinante PTX-underenheter. Venstre side av figur 2A viser en "Coomassie Brilliant Blue"-farget gel med de rekombinante PTX-underenheter produsert i målbare mengder; høyre side av figur 2A er en "Western blot" av en parallell gel hvor det benyttes et polyklonalt kanin-anti-PTX-hyperimmunserum. PTX angir feltene som inneholder kikhostetoksin av kommersiell kvalitet. Disse resultatene viser at rekombinant(e) Sl, S2, S3 og S5 alle produserte betydelige mengder. "Western blot" viser at rSl prosesseres fullstendig fra sine forløperproteinarter, rS2 og rS5 prosesseres delvis, og rS3 prosesseres ikke i vesentlig grad under fermenteringsbetingelsene; rS4 ble ikke produsert i tilstrekkelig mengde til å være synlig. Figur 2B viser produktene av ekspresjon som metionylfullførte rekombinante (rm) underenheter. Disse underenhetene lages i betydelige mengder med unntak av rmSl (ikke vist). Figur 3 er en' "Western blot" som viser effekten av oppstrøms,ikke-kodende sekvenser på ekspresjonen av rS2. Detaljene i figuren er gjengitt i teksten. Figur 4 er et autoradiogram av en SDS-polyakrylamidgel som viser ADP-ribosyltransferaseaktivitet av rekombinant

Sl. Rekombinant Sl (500 ng), renset naturlig forekommende kikhostetoksin (1 ug) og reaksjonsbuffer ble hver for seg omsatt med bovint transducin i nærvær av [<32>P]NAD i det vesentlige som beskrevet av Manning et al., 1984, J. Biol. Chem., 259:749-756; West et al., 1985, J. Biol. Chem., 260:14428-14430). Prøvene ble utfelt med kald 10 % trikloreddiksyre, utfellingene ble underkastet SDS-PAGE og deretter autoradiografi. Det radioaktive bånd ved 39 Kd er transducinunderenheten som er blitt ribosylert. Felt A: reaksjonsbufferkontroll; felt B: naturlig forekommende PTX; felt C: rSl. Figur 5 er en grafisk fremstilling av radioimmunprøver som viser immunogenisitet av rSl- og rS4-underenheter i mus. Mus ble hyperimmunisert med rekombinant Sl, metionyl-rS4, naturlig forekommende kikhostetoksin (PTX), kommersiell kikhostevaksine eller eksipiens (NMS); noen preparater inneholdt komplett Freunds adjuvans (CFA). Sera ble samlet inn og fortynninger undersøkt med hensyn på anti-PTX-titer i en fastfase-radio-immunologisk prøve. Figur 6 er en grafisk fremstilling som viser det immunologiske beskyttelsespotensiale til rSl og rS4 i mus mot i.c. tilførsel av B. pertussis: Detaljer ved figuren er gitt i teksten. Figur 7 er den utledede aminosyresekvens til rSl-mutant utvunnet ved ekspresjon av pPTXSl (6A-3/4-1). Figurene 8A og 8B er grafiske fremstillinger av ADP-ribosyltransf erase- og NAD-glykohydrolaseaktivitet til rekombinant analog Sl. Figur 9 er et autoradiogram av en SDS-polyakrylamidgel med rensede Sl-underenhetsproteiner. Figur 10 er et autoradiogram av en ikke-reduserende, ikke-denaturerende polyakrylamidgel med naturlig forekommende holotoksiner fra kombinasjonen av den naturlig forekommende oligomer enten med rekombinant Sl/l eller rekombinant Sl/1-4. Figur 11 er et fotografi av cellemonolag undersøkt med hensyn på tilstedeværelse av cellegrupper ved lysmikroskopi.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et rekombinant DNA-molekyl som omfatter minst en del som koder for underenhet

Sl av Bordetella-eksotoksin, eller et fragment eller derivat av delen, hvor delen eller fragmentet eller derivatet koder for et polypeptid med en biologisk aktivitet som kan (a) frembringe toksinnøytraliserende nivåer av antistoffer og (b) er i det vesentlige fritt for reaktogene bestanddeler. Polypeptid Sl-underenheten eller underenhet derav omfatter en hovedepitop som er kjent for å være viktig ved tilveiebringelse av immunologisk beskyttelse mot kikhostetoksisitet. De toksinnøytraliserende nivåer av antistoffer gir immunologisk beskyttelse mot kikhostetoksisitet. Stedsspesifikk mutagenese resulterer i en analog av underenhet Sl som er i det vesentlige enzymatisk inaktiv.

Sl-underenheten av Bordetella-eksotoksin, fremstilt ved genteknikk, og analogene av denne underenheten gir rekombinante DNA-utvunne underenhetsvaksinematerialer for bruk ved forebyg-gelsen av kikhostesykdom. Sl-underenheten og dens analoger kan gi vaksineprodukter, enten alene eller i kombinasjon med underenhetene S2, S3, S4 og S5, og blandinger derav. Underhetene S2, S3, S4 og S5 kan renses fra B. pertussis eller utvinnes rekombinant som fusjons- eller ikke-fusjonsprodukter. Høye nivåer av rekombinant ekspresjon av underenhetene S2, S3, S4 og S4 av Bordetella-eksotoksin er også blitt oppnådd i E. coli ved direkte ikke-fusjonsmetoder. Alternative rekombinante verter, inkludert gjær, f.eks. S. cerevisiae, og bakterieorganismer, f.eks. Salmonella typhimurium eller typhi, Bacillus sp., og virus, f.eks. vaccinia, kan brukes til ekspresjon av disse underenhetene.

Oppfinnelsen gjelder således en fremgangsmåte for fremstilling av en proteinanalog til Boredetella-eksotoksin som kan utløse toksinnøytraliserende nivåer av antistoffer, og som er vesentlig fri for enzymatiske aktiviteter forbundet med toksinreaktogenisitet, kjennetegnet ved at en vertcelle som er transformert med et DNA-molekyl som koder for Sl-, S2-, S3-, S4-og S5-underenhetene i eksotoksinet hvor Sl-underenheten er blitt modifisert slik at argininet i 9-posisjonen i aminosyresekvensen er erstattet med en lysinrest, dyrkes.

Den gjelder også en polypeptidanalog av Sl-subenhet fra Bordetella pertussis- toksin, kjennetegnet ved at nevnte analog har ulik aminosyresekvens i forhold til naturlig forekommende Sl-subenhet ved substitusjon av lysin på arginin i posisjon 9, der analogen har en biologisk aktivitet som (a) kan utløse toksinnøytraliserende nivåer av antistoffer og (b) er vesentlig fri for enzymatiske aktiviteter som er assosiert med toksinreaktogenitet og en vaksine mot pertussis, kjennetegnet ved at den omfatter et modifisert Bordetella pertussis-toksin der lysin har blitt substituert inn for arginin på posisjon 9 i Sl-subenheten, der det modifiserte Bordetella pertussis-toksinet har en biologisk aktivitet som (a) kan utløse toksinnøytrali-serende nivåer av antistoffer og (b) er vesentlig fri for enzymatiske aktiviteter som er assosiert med toksinreaktogenitet.

Nærmere beskrivelse

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer høyeffektiv, direkte rekombinant ekspresjon av alle PTX-underenheter som er nødvendige for vaksineproduksjon. Videre gir Sl-underenhetene biologisk aktivitet som er svært immunogen og i det vesentlige fri for reaktogene bestanddeler, idet slike bestanddeler er enzymatiske aktiviteter av toksinmolekylet som er relatert til dets toksisitet og reaktogenisitet og fremmedbestanddeler i B. pertussis (f.eks. endotoksin) som ville blitt funnet i vaksine-materialer ekstrahert fra celler av B. pertussis, og er kjent for å være reaktogene. Sl-analogene som brukes alene eller i kombinasjon med andre underenheter av PTX, kan gi vaksineprodukter som er effektive og i stor grad reduserer sannsynlig-heten for bivirkninger fra reaktogene bestanddeler som fore-ligger i ikke-modifiserte, naturlig forekommende eller rekombinant utvunne underenheter.

De enkelte underenheter Sl, S2, S3, S4 og S5 av Bordetella pertussis- toksin ble hver subklonet og direkte uttrykt hver for seg i E. coli.- Signalsekvensen synes å spille en viktig rolle i ekspresjonen av rekombinant Sl (rSl). I fravær av et signalpeptid ble ubetydelige mengder av rSl uttrykt i E. coli. Dersom enten den naturlig forekommende leder i Sl-underenheten eller en syntetisk leder er til stede på preproteinet, fås det høye ekspresjonsnivåer i området 10-30 % av totalt celleprotein. Fermenteringen av rSl-ekspressorceller ved produksjonsskalaen i en satsvis 10 liters fermentor (ved et ikke-optimalisert ekspresjonsnivå på 8 mg Sl/OD-L) resulterer i nesten fullstendig proteolytisk prosessering av rSl til dens fullstendige arter, som vist i figur 2. Fermentering av ekspressorceller på en laboratorieskala ga opphav til ufullstendig prosessert Sl; både preprotein og fullstendig protein ble funnet etter logaritmisk cellevekst. Svikten hos en syntetisk E. coli-spaltbar ledersekvens når det gjelder å fremme signalprosessering, tydet på at ufullstendig spalting ikke er resultatet av ufullstendig gjenkjennelse av E. coli lederpepti-daser for B. pertussis-proteolytiske spaltingsseter. Mangelen på å overvinne prosesseringsblokkeringen, enten ved å øke signalpeptidsyntese under anvendelse av celler som er kotrans-formert med et plasmid som uttrykker E. coli-lederpeptidase i høye nivåer eller ved å redusere Sl-ekspresjonsnivåer ved bruken av en vektor med lavt kopiantall, indikerte at problemet ikke ligger i retning av spaltingssporet. Disse resultatene viser at posttranslasjonell prosessering av fremmede proteiner i E. coli kan reguleres ved dårlig forståtte mekanismer som står i for-bindelse med den fysiologiske tilstand til den voksende celle.

PTX-underenheter S2, S3, S4 og S5 ble likeledes uttrykt i E. coli, som vist i figur 2. På samme måte som rekombinant Sl syntes rS2-, rS3- og rS5-underenhetene å oppvise ufullstendig prosessering ved fermentering i laboratorieskala. Ettersom rSl kunne bli fullstendig prosessert ved produksjonsstørrelsen, kan lignende fermenteringsbetingelser benyttes til å få de øvrige underenhetene i fullstendig prosesserte former. I motsetning til rSl kunne rS4-underenheten uttrykkes ved høye nivåer som et fullstendig metionylpolypeptid, men var ikke påvisbar når den ble uttrykt med sin naturlige lederpeptidsekvens. Underenhetene S2, S3, S4 og S5 er nå alle blitt uttrykt som metionylferdige polypeptider. Aminosyreanalyse av disse molekylene viser at den heterologe (ikke-native) metionylrest i det vesentlige fjernes fra hver art (med unntak av S4) ved cellulær metioninamino-peptidase, hvorved det fås fullt ferdige proteiner med naturlig forekommende sekvens. Metionylresten fjernes ikke i vesentlig grad fra rekombinant S4 på grunn av fullstendigheten til amino-endegjenkjennelsessekvensen for det cellulære enzym. Alle de rekombinante proteinene ble utvunnet som inklusjonslegemer fra lyserte celler. Underenheten ble funnet å ha migreringsmønstre i SDS-PAGE som i det vesentlige er identiske med autentiske, naturlig forekommende underenheter, eller å reagere i "Western blots" med monoklonale og polyklonale antitoksinsera. Som vist i figur 2, oppnås rekombinant ekspresjon av underenhetene Sl, S2, S3, S4 og S5 i E. coli på høyt nivå ved direkte ikke-fusjons-midler.

Selv om alternative fremgangsmåter og materialer kunne brukes ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, er de fore-trukne fremgangsmåter og materialer beskrevet nedenunder.

Materialer og fremgangsmåter for rekombinant ekspresjon av underenhetene Sl, S2, S3, S4 og S5

Materialer. DNA-modifiserende enzymer ble ervervet fra New England Biolabs (Beverly, Ma), Betesda Research Laboratories (Gaithersburg, Md), Boehringer Mannheim Biochemicals, (Indiana-polis, IN, og International Biotechnologies, Inc. (New Haven, CT); enzymene ble brukt i henhold i produsentenes anbefalinger. Alle kjemikalier og biokjemikalier var av analytisk finhetsgrad. Renset kikhoste-PTX ble ervervet fra List Biological Laboratories, Inc. (Campbell, CA). Syntetiske oligonukleotider ble syntetisert i henhold til Caruthers (1982, H.G. Gussen og A. Lang (red.), "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments", Verlag Chemie Weinheim, FRG, s. 71-79). Kanin-antisera mot hel-PTX ble produsert av Antibodies, Inc. (Davis, CA) og NIAID Rocky Mountain Laboratory. Monoklonale antistoffer mot underenheter fra naturlig forekommende PTX ble produsert ved hjelp av standardmetoder (Kohler og Milstein, 1975, Nature, 256:495-497; Nowinski et al., 1979, Virology 93:111-126). Radio-jodert protein A og kanin-antimuse-IgG ble ervervet fra New England Nuclear (Wilmington, DEL). Anti-Sl- monoklonalt antistoff IB7 (som beskrevet av Sato et al., 1987, Infect. Immun., 55:909-915) var en gave fra H. Sato, NIH, til Keyo, Japan.

Plasmider og bakteriestammer. Plasmid pPTX42 som inneholder PTX-operonet, er blitt beskrevet (se Locht og Keith, supra, og Locht et al., supra). Ekspresjonsplasmidene pCFM1036, PCFM1146, pCFM1152 og pCFM1156 ble avledet ved Amgen.

En nærmere beskrivelse av Amgens ekspresjonsvektor-system er gitt i publisert europeisk patentsøknad nr. 136 490. Slike plasmider kan inneholde en induserbar promoter, et syntetisk ribosombindende sete, en "doning cluster", plasmid-replikasjonsstart, en transkripsjonsterminator, gener som regulerer plasmidkopiantall og et kanamycinresistensgen. De av-ledede plasmider atskiller seg fra hverandre i en rekke hen-seender. Plasmidet pCFM1036 kan avledes fra pCFM836 (europeisk patentsøknad nr. 136 4 90) ved å substituere DNA-sekvensen mellom de unike Aatll- og EcoRI-restriksjonssetene som inneholder den syntetiske PL-promoter, med det følgende oligonukleotid:

Plasmidet inneholder ingen induserbar promoter foran restriksjons-"cluster". Plasmidet pCFM1146 kan avledes fra pCFM836 ved å bytte ut den lille DNA-sekvensen mellom de unike Clal- og Xbal-restriksjonssetene med det følgende oligonukleotid: og ved å ødelegge de to endogene Ndel-restriksjonssetene ved å fylle ut enden med T4-polymeraseenzym, etterfulgt av buttende-ligering. Plasmidet inneholder ikke noe syntetisk ribosombindende sete umiddelbart foran restriksjons-"clusteret". Plasmidet pCFMll56 kan avledes fra pCFM114 6 ved å bytte ut den lille DNA-sekvensen mellom de unike Xbal- og Kpnl-restriksjonssetene med følgende oligonukleotid:

Plasmidet pCFM1152 kan avledes fra pCFM1156 ved å bytte ut DNA-fragméntet fra Bglll til Bglll (248 basepar) som inneholder copB-promoteren, og som utkoder en del av copB-genet, med det tilsvarende DNA-fragment fra plasmid pCFM512 (europeisk patent-søknad nr. 136 490). Dette plasmidet har et lavere kopiantall enn pCFMH56.

Plasmidene pBR322, p(JC18, pUC19 og fag-M13mpl8 og M13mpl9-DNA ble innkjøpt fra Bethesda Research Laboratories. Plasmidet pTD125 som inneholder genet for E. coli-lederpeptidase (Dale, T., 1983, J. Bacteriol., 143:76-83), var en gave fra W. Wickner (UCLA). E. coli-FM5-celler ble utvunnet ved Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, fra E. coli K-12-stamme fra CF. Morris (Bachmann et al., 1976, Bacteriol. Rev., 40:116-167) og inneholder det integrerte lambdafagrepressorgen CIa57 (Sussmann et al., 1962, CR. Acad. Sei., 254:1517-1579). Konstruksjon av de individuelle underenhetsekspresjonsplasmider er beskrevet her. Vektorfremstilling, celletransformasjon og koloniutvelgelse ble utført ved hjelp av standardmetoder (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY).

Analytiske fremgangsmåter. DNA-sekvensering ble gjort ved hjelp av primerforlengelseskjedetermineringsmetoden (Sanger et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74:54 63-54 67; Heidecker et al., 1980, Gene, 10:69-73). Proteinsekvensanalyse ble utført ved hjelp av automatisert Edman-nedbrytning i et ABI 470A-gassfasemikrosekvenseringsapparat (Hewick et al., 1981, J. Biol. Chem., 256:7990-7997; Hunkapillar et al., 1983, Meth. Enzymol., 91:399-413). SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) ble utført som beskrevet av Laemmli (1970, Nature, 277:680-685, eluering av polypeptider fra polyakrylamidgeler skjedde ved hjelp av metoden til Hunkapillar et al. (1983, Meth. Enzymol., 91:227-236), og "Western blotting" ble utført som beskrevet av Burnette (1981, Analyt. Biochem., 112:195-203. For-holdet mellom rekombinant protein og totalt cellulært protein eller totalt inklusjonslegemeprotein ble fastlagt ved hjelp av SDS-PAGE av helcellelysater eller inklusjonslegemepreparater, etterfulgt av farging med Coomassie Brilliant Blue R250 og etterfølgende gelskanning ved hjelp av integrert densiometri. Analyser med hensyn på NAD-glykohydrolase og ADP-ribosyltransferase ble utført som beskrevet tidligere (Katada et al., 1982, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79:3129-3133; Lim et al., 1985, J. Biol. Chem., 260:2585-2588). Reduksjon i den morfologiske respons hos CHO-celler på PTX (Hewlett et al., 1983, Infect. Immun., 40:1198-1203) med antisera mot forskjellige rekombinante underenhetspreparater eller ved hjelp av fremgangsmåten til Gillenius et al. (1985, J. Biol. Stand. 13: 61-66).

Konstruksjon av ekspresjonsplasmider. Alle plasmider ble konstruert fra en serie av generaliserte E. coli-ekspre-sjonsvektorer som atskiller seg som tidligere beskrevet. De enkelte kikhostetoksinunderenhetsgensegmenter ble isolert under anvendelse av restriksjonssetene vist i figur 1 som tilhører teknikkens stand; oppstrømsrestriksjonssetet var like innenfor initieringskodonet for ekspresjon av den signalpeptidholdige form av underenheten, eller like innenfor kodonet foran amino-enderesten til den fullt ferdige, bearbeidede form av underenheten for ekspresjon av den metionylferdige form av under-enhetsanalogen. Koekspresjon av hele B-oligomeren benyttet i ett tilfelle fragmentet som inneholder oppstrøms, ikke-kodende område av S2 til og med enden av S3, og utelot det syntetiske ribosombindende sete til E. coli-ekspresjonsvektoren; i det andre tilfellet ble oppstrøms, ikke-kodende område til S2 fjernet, og det syntetiske E. coli-ribosombindende sete ble inn-føyd. Syntetiske oligonukleotidlinkere ble anvendt til å bevirke innføyelse av gensegmentene i ekspresjonsplasmidene ved en optimal avstand nedstrøms fra den syntetiske promoter og ribosombindingssetet. Oppstrømslinkerne gjenopprettet leserammen til hvert gen, enten tilbake til det autentiske initieringskodon i tilfellet med preunderenhetskonstruksjoner eller til det første kodon i den fullt ferdige aminoende; de sistnevnte oligonukleotider omfattet et metionylinitieringskodon. I noen tilfeller ble kodonbruk endret for å redusere muligheten for sekundærstruktur nær 5'-enden til de resulterende mRNA-er. For eksempel ble cysteinkodonet i posisjon 3 i signalområdet Sl-underenheten (Locht og Keith, supra) byttet ut med kodonet for serin for å eliminere muligheten for skadelige disulfidinteraksjoner.

Etter transformasjon av E. coli-FM5-celler med de forskjellige plasmidkonstruksjonene og utplating på kanamycinholdig agar ble passende antall kolonier valgt ut, replikautplatet,

dyrket som små væskekulturer ("minipreps") og indusert ved 42 °C

i 4 timer. "Minipreps" ble så undersøkt ved hjelp av lysmikroskopi med hensyn til tilstedeværelsen av inklusjonslegemer i bakteriecellene. Preparater som oppviste synlige inklusjoner,

ble identifisert, og tilsvarende kolonier fra replikaplatene ble underkastet laboratoriefermentering ved induksjonstempera-turen i kolbeskala (1 liter); noen preparater ble senere underkastet fermentering med satsvis tilsetning i 10 liters indu-strielle fermentorer. Prøver ble fjernet fra fermentering ved forskjellige tidspunkter etter induksjon og undersøkt med hensyn på tilstedeværelsen av den korrekte PTX-underenhet ved hjelp av SDS-PAGE, etterfulgt av både farging med "Coomassie Brilliant Blue" og "Western blotting"; flekker ble først omsatt med et passende monoklonalt antistoff, undersøkt ved hjelp av autoradiografi og så omsatt med et polyklonalt anti-PTX-serum og fulgt ved hjelp av ytterligere radiografi. Strukturen til plasmidet fra hver ekspresjonsklon ble bekreftet ved restrik-sjonskartlegging av det isolerte plasmid og bekreftet ved hjelp av DNA-sekvensering av sammenknytningsområder.

Ekspresjon av rekombinant Sl. Når E. Coli-celler inneholdende Sl-ekspresjonsplasmidet (pPTXSl/1) ble indusert ved 42 °C i en 10 liters fermentor med satsvis tilsetning ved produksjonsskalaen, produserte de et intracellulært hovedprotein med omtrent 26 000 dalton (figur 2A, til venstre, felt rSl) som - migrerte sammen med autentisk PTX-S1 i SDS-PAGE. Partiell aminosyresekvensanalyse (fem omganger) fastslo at dette polypeptidet hadde aminoendesekvensen forutsagt for den fullt ferdige Sl-underenhet (Locht og Keith, supra). Proteinet ble immunkjemisk identifisert som Sl ved sin reaktivitet med et monoklonalt museanti-Sl-antistoff i en "Western blot" (figur 2A, til høyre, felt rSl).

Det bør legges merke til at laboratoriefermentering

av Sl-ekspressorcellene ved 1-literskolbeskalaen resulterte i ufullstendig spalting av rSl-signalpeptidet, et fenomen som også iakttas for ekspresjonen av de øvrige PTX-underenheter i E. coli (se nedenunder). Forsøk ble gjort på å identifisere den mole-kylære blokk for signalprosessering som ses ved kolbeskalaen,

ved hjelp av en serie forsøk utformet for å øke utstrekningen av preproteinspalting: innføyelse av Sl-genet i en ekspresjons-

vektor med lavt kopiantall, substitusjon av en syntetisk E. coli-spaltingssignalsekvens (Picker et al., 1983, Infect. Immun., 42:269-275) for det autentiske Sl-signalpeptid, og kotransformasjon av de underenhetsuttrykkende celler med et ekspresjonsplasmid som inneholder genet for E. coli-lederpeptidase (Date, supra) for å øke grunnivået av dette enzymet. Ingen av disse forsøk førte til noen betydelig endring i signal-spalting. Endring av fermenteringsbetingelsene til en prosess med satsvis tilsetning førte imidlertid til prosessering av pre-Sl til dens fullt ferdige form, som var i det vesentlige komplett.

Suksessen med å uttrykke Sl-underenheten som et fullt ferdig metionylpolypeptid (nedenunder) tilskyndet bruken av den samme strategi med rSl. I motsetning til rS4-ekspresjon i E. coli var imidlertid ekspresjonen av fullt ferdig metionyl-Sl så lav at en "Western blot" var påkrevd for påvisningen. I motsetning til dette ga ekspresjonen av rSl under anvendelse av dens autentiske signalsekvens det fullstendig prosesserte polypeptid ved nivåer på 10-30 % av det totale celleprotein. Som beskrevet senere, kan avkutting av den fullt ferdige aminoende til rSl ved hjelp av rekombinante midler resultere i svært høye ekspresjonsnivåer. Således resulterer substitusjon av så lite som de første to restene av den fullt ferdige Sl-sekvens (AspAsp) med MetVal i betydelig ekspresjon i forhold til den fullt ferdige metionylform.

Ekspresjon av S2, S3, S4 og S5. Som en pålitelighets-test ble PTX-S4-underenhetene først uttrykt som et fullt ferdig metionylprotein uten dets naturlig forekommende lederpeptid og ble, som beskrevet ovenfor, produsert ved høye nivåer i E. coli (figur 2B, til venstre, rmS4-felt). Selv om dets migrering i SDS-PAGE ble noe retardert i forhold til migreringen til S4 fra hele toksinpreparater, hadde proteinet den forutsagte S4-aminosyresekvens. S4 renset fra E. coli ved hjelp av HPLC oppviser den samme retardering i gelelektroforese (Locht et al., supra). Rekombinant S4 reagerer godt med polyklonale antisera i "Western blots" (figur 2B, til høyre, felt remS4), men har redusert reaktivitet med et monoklonalt S4-antistoff.

I motsetning til resultatene som ble oppnådd med Sl, resulterte ekspresjon av S4 med dens naturlig forekommende lederpeptidsekvens (Locht og Keith, supra) i ikke påvisbare proteinnivåer (ikke vist). Det bør imidlertid legges merke til at Nicosia et al. ( supra) forutsier et annet translasjons-startsted lenger oppstrøms; det er mulig at bruk av denne tilleggssekvensen i S4-lederpeptidet vil resultere i mye høyere ekspresjonsnivåer. Rekombinant S2, S3 og S5 ble hver uttrykt med sine naturlig forekommende ledersekvenser (figur 2A, henholdsvis feltene rS2, rS3 og rS5); ingen av disse underenhetene ble fullstendig uttrykt under laboratorieskalafermentering, selv om preliminære forsøk med produksjonsskalafermentering under anvendelse av fremgangsmåten med satsvis tilsetning gir markert forbedring i prosesseringen av S2 og S5. S2, S3 og S5 ble også hver uttrykt i E. coli i en fullt ferdig metionylform ved nivåer som er sammenlignbare med dem som ble oppnådd med deres naturlig forekommende lederpeptider (figur 2B, henholdsvis feltene rmS2, rmS3 og rmS5). Som anmerket ovenfor, prosesseres de heterologe metioninrestene S2, S3 og S5 ved hjelp av cellulær metionin-aminopeptidase, hvorved det fås fullt ferdige polypeptider med naturlig forekommende sekvens.

Hele polycistronsegmentet som utgjør B-oligomerunderenhetene (S2-S4-S5-S3), ble uttrykt under kontroll av PL-promoteren. Figur 3 viser virkningene av oppstrøms, ikke-kodende område på produksjon av S2-underenheten. I ett tilfelle beholdt ekspresjonsplasmidet hele intercistrondelen mellom termineringskodonet til Sl og initieringskodonet til S2 (Locht og Keith, supra), men uten det syntetiske ribosombindingssetet som ble brukt i alle de øvrige ekspresjonsplasmidene. Dette resulterte i syntese av rekombinant S2 som syntes å være fullstendig prosessert når den ble undersøkt i en "Western blot" med et monoklonalt anti-S2-antistoff (figur 3, feltene D og E); selv om det ikke er vist, tyder polyklonalantistoffanalyse på at de øvrige B-oligomerunderenhetene også ble fullstendig prosessert til sine fullt ferdige former. Utbytting av det ikke-kodende inter-cistronsegment med den syntetiske Shine-Delgarno-sekvens resulterte i et mye høyere nivå for rS2-syntese (figur 3, feltene B og C); dette materialet prosesseres imidlertid ufullstendig. Synteseeffektiviteten for hvert cistron synes å være direkte korrelert med dets nærhet til 5'-enden i budskapet, dvs. S2>S4>S5>S3. Et preliminært forsøk hvor det gjenværende av operonet plasseres nedstrøms fra den høyeffektivt uttrykkende Sl-konstruksjon (se ovenfor), resulterte i svært lave syntese-nivåer og ufullstendig prosessering av hver av underenhetene, inkludert Sl.

Egenskaper til rekombinant PTX- underenheter. Svært få, om noen, av de prosesserte PTX-underenheter synes å bli utskilt fra E. coli-cellene, selv om det er en viss indikasjon på at fullstendig prosessert rSl kan bli funnet i en begrenset ut-strekning i det periplasmatiske rom. Massen av hver underenhet ble funnet i form av inklusjonslegemer og utgjorde 10-30 % av det totale celleprotein. Cellelyse ved hjelp av French-press og sentrifugering ved lav hastighet resulterte i pelletfraksjoner som inneholdt opptil 65 % av sitt protein som de enkelte underenheter .

Alle PTX-underenhetene var påvisbare i Western-blots med et polyklonalt kanin-antitoksinserum (figur 2). Som angitt ovenfor, reagerte underenhetene rSl og rS2 godt med spesifikke monoklonale antistoffer i "Western blots". Rekombinant S4, laget som et metionylpolypeptid, hadde redusert reaktivitet med et monoklonalt anti-S4-anti'stoff. Monoklonale antistoffer mot underenhetene S3 og S5 var ikke tilgjengelige, selv om rS3 kunne påvises på en "Western blot" med monoklonalt anti-S2-antistoff i kraft av dets nære sekvenshomologi med S2 (Locht og Keith, supra).

Når urensede rekombinante rSl-preparater ble innkubert i nærvær av [<32>P]NAD med membraner isolert fra CHO-celler, ble et protein med omtrent 41 000 dalton ADP-ribosylert, identisk med det som ble ribosylert av naturlig forekommende hel PTX; dette molekylet antas å være Nj-membranregulatorproteinet til adenylat-cyklasekomplekset (Bokoch et al., 1983, J. Biol. Chem., 258:2072-2075; og Hsia et al., 1983, J. Biol. Chem., 259:1086-1090). For rutineanalyseformål kan bovint transducin benyttes som et substrat for ribosylasen (figur 4), et molekyl som er påvist å være en akseptor for kikhostetoksinkatalysert ADP-riboseoverføring fra NAD (Manning et al. supra; West et al., supra). Dette resultatet bekrefter lokaliseringen av ADP-ribo-syltransf eraseaktiviteten på A-promoteren (Sl-underenhet) til toksinet og tyder på at det rekombinante E. coli-protein er foldet i en form som ligger nært opp til dets naturlig forekommende tredimensjonale struktur i E. coli. Videre utviste den rekombinante Sl NAD-glykohydrolaseaktivitet, som også ble identifisert med A-promoteren. Mus ble immunisert og forsterket ved intraperitoneal injeksjon med et urenset inklusjonslegeme-preparat av rSl med renset rekombinant metionyl-S4. rSl-under-enhetsmaterialet som ble brukt, inneholdt både ferdig prosessert polypeptid og ikke-prosessert preprotein i et omtrentlig forhold på 1:2; den relative immunogenisitet til de to rSl-artene er ikke kjent. Serumprøver ble testet i en fastfase-RIA med hensyn på tilstedeværelsen av antitoksinantistoffer (figur 5). Dyr som fikk rekombinant Sl utviste en betydelig antitoksinrespons uansett om de immuniserende doser ble formulert med komplett Freunds adjuvans eller ikke. Rekombinant S4, gitt bare i adjuvanstilsatt form, var også svært immunogen i forhold til heltoksin tilsatt adjuvans og kommersiell kikhostevaksine.

Behandling av de dyrkede CHO-celler med helkikhoste-toksin resulterer i en "clustered" morfologi (Hewlett et al., supra) som kan motvirkes med antitoksinsera (Gellenius et al., supra). I foreløpige forsøk var musesera mot rSl eller rS4 fremstilt som beskrevet ovenfor, og som hadde forholdsvis høye titre av antitoksinantistoffer, ikke rutinemessig i stand til å nøytralisere CHO-cellers respons på naturlig forekommende toksin.

Immunologisk beskyttelse av mus med rekombinant Sl. Mus immunisert med urenset rekombinant Sl, renset rekombinant S4 og passende kontrollmaterialer (se ovenfor) ble utsatt for intracerebral smitte (i.c.) med B. pertussis-musevirulent stamme 18323, og dødelighet ble registrert så lenge som 45 dager etter smitte (figur 6). Mus ble immunisert med 50 ug testartikkel

(100 ul av 1:35 fortynning for kommersiell kikhostevaksine) ved intraperitoneal injeksjon; de ble på nytt immunisert med en identisk mengde 21 dager etter inokulering og smittet 7 dager senere ved hjelp av i.c. smitte med levedyktig B. pertussis-stamme 18323 (3 x IO<4> organismer pr. dyr). Selv om beskyttelse ikke var forventet på grunn av mangel på aktiv holotoksin i de rekombinante preparater, var det overraskende å iaktta en økning i overlevelsestid for rSl-immuniserte dyr i forhold til ikke-immuniserte kontroller. Videre ble et antall mus som fikk adjuvanstilsatt rSl, fullstendig beskyttet mot smitte; mus

immunisert med adjuvanstilsatt rS4 ble, selv om de utviste en god antistoffrespons (se figur 5), ikke beskyttet noe bedre enn ikke-immuniserte mus. I et annet preliminært forsøk viste adjuvanstilsatt rSl seg å gi doseavhengig beskyttelse mot smitte. Ufullstendig beskyttelse i prøven med i.c. smitte kan ha sitt grunnlag i et fravær av aktivt holotoksin i det immuniserende materialet; ikke desto mindre viste beskyttelse oppnådd i denne preliminære undersøkelse at rekombinant Sl-protein har potensial som et underenhetsvaksinemateriale. Senere under-søkelser har ikke bekreftet immunologisk beskyttelse mot intracerebral smitte med E. coj.i-musevirulent stamme 18323.

Sl- analoger

Ved å bruke teknikker for proteinkonstruksjon og stedsspesifikk mutagenese, ble det laget avkuttede Sl-analoger. Området avgrenset av valin 7 og prolin 14 ble funnet å være et påkrevd område for ADP-ribosyltransferaseaktivitet i Sl-molekylet. En antigen epitop som binder et monoklonalt antistoff som beskytter passivt mot toksinaktivitet i mus (dvs. en epitop som er involvert i frembringelse av en beskyttende respons), ligger i det minste delvis innenfor området avgrenset av og innbefattet valin 7 og prolin 14. Mutagenese av Sl-molekylet i området avgrenset av og innbefattet valin 7 og prolin 14 ga analoge mole-kyler til Sl som mangler enzymatisk aktivitet mens den beskyttende epitop ble bibeholdt. Den beskyttende epitop er viktig for tilveiebringelse av immunologisk beskyttelse mot kikhostetoksisitet. Endring av området fra og med valin 7 t.o.m. prolin 14, inkludert substituering og/eller delering av én eller flere aminosyrer, resulterer i Sl-analogprodukter som kan frembringe toksinnøytraliserende nivåer av antistoffer, og som er i det vesentlige fri for reaktogene bestanddeler.

Subkloning av PTX- Sl- genet inn i pUC18

Plasmid pPTX42 som inneholder hele operonet for Bordetella pertussis-toksin (PTX), ble erholdt fra J. Keith (NIAID, Rocky Mountain Laboratory) som transformerte JM109-celler. Bakteriene ble dyrket i L-næringsvæske inneholdende ampicillin, og plasmidet ble utvunnet og renset ved hjelp av standardmetoder (Maniatis et al., supra). Et 792 bp DNA-fragment inneholdende en del av PTX-Sl-genet (cistronet) (Locht og Keith, supra) ble isolert fra pPTX42 ved opplosning av plasmidet med restriksjonsenzymer Aval og Xbal, etterfulgt av akrylamid-elektroforese og etterfølgende eluering av DNAfragmenter fra gelen. Dette DNA-fragmentet begynner ved Aval-setet like innenfor den åpne leseramme for pre-Sl-proteinet og slutter ved et Xbal-sete i termineringskodonet for Sl. Standardkloningsvektoren pUC18 ble også oppløst med Aval og Xbal, og oppløsningsblandingen ble behandlet med fosfatase. En ligeringsreaksjon ble utført med den oppløste pUCl8-vektor, det 792 bp store DNA-fragment (Aval-Xbal) i pPTX42, og T4-DNA-ligase under anvendelse av standardbetingelser. Nyfremstilte kompetente DH52a-celler ble transformert med ligeringsblandingen, og trans-formanten ble utvalgt på agarplater av L-næringsvæske inneholdende ampicillin og "Bluegal". Tolv hvite kolonier ble valgt ut, replikautplatet og dyrket som 2 ml væskekulturer. Cellene ble "minipreppet" ved hjelp av en standard alkalisk lyserings-fremgangsmåte, DNA oppløst med Aval og Xbal, og oppløsnings-blandingen underkastet akrylamidgelelektroforese.

Konstruksjon av rPTXSl ekspresjonsplasmid pPTXSl/ 1. Et Aval-Xbal-fragment med 7 92 bp ble isolert fra plasmid pPTX42, som tidligere beskrevet. Escherichia coli-ekspresjonsplasmider PCFM1156 og pCFM1036 ble erholdt fra Charles F. Morris, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA. Plasmid pCFM1156 ble oppløst med restriksjonsenzymene Sstl og Ndel, og et 1,8 kb stort DNA-fragment ble isolert fra en agarosegel ved hjelp av elektroeluering på Na45-papir. Plasmid pCFM1036 ble oppløst med Sstl og Xbal, og et 2,8 kb stort DNA-fragment ble likeledes isolert. To komplementære tråder av oligodeoksynukleotidlinker, som re-konstituerte den delerte del av den Sl-åpne leseramme, ble syntetisert ved hjelp av aminofosfinkjemien til Caruthers et al.

[ supra). Sekvensen til det syntetiske fragmentet ble, mens man opprettholdt den autentiske aminosyresekvens, modifisert i sin kodonbruk for å redusere potensiell sekundærstruktur i bud-bringer-RNA; et unntak fra dette var utbyttingen av cysteinkodonet med et serinkodon i aminosyreposisjon nr. 2 i pre-proteinsignalsekvensen for å eliminere eventuelle disulfidinteraksjoner mellom preproteinsignalet og de to proteinrestene i posisjonene 41 og 199 i det fullt ferdige protein. Denne

oligodeoksynukleotidlinker hadde et Ndel-sete som er kohesivt for den ene i pCFM1156 og en Aval-kohesiv ende for ligering til Aval-setet i det 7 92 bp store DNA-fragment i Sl-genet. Sekvensen til dette oligodeoksynukleotidet var:

En ligeringsreaksjon ble fremstilt med det 2,8 kb store DNA-fragment fra pCFM1036, det 1,8 kb store DNA-fragment fra pCFM1156, det 7 92 bp store DNA-fragment som inneholder Sl-gen-fragmentet, oligodeoksynukleotidlinkeren og T4-DNA-ligase. Etter ligering ble FM6-celler (erholdt fra CF. Morris, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) transformert med ligeringsblandingen og platet ut i L-næringsagar med kanamycin. Kolonier ble valgt ut både replikautplatet og "minipreppet" ved hjelp av den alkaliske metode (Maniatis et al., supra). "Minipreppede" DNA-prøver ble underkastet restriksjonsenzymkartlegging og funnet å inneha de forventede DNA-restriksjonsfragmenter. Området fra begynnelsen av den syntetiske linker og inn i den åpne leseramme til det autentiske Sl-gen ble fastlagt ved hjelp av DNA-sekvensanalyse. Etterfølgende induksjon av dette plasmidet førte til høyeffektiv ekspresjon av rekombinant Sl-protein.

Konstruksjon av rPTXSl ekspresjonsplasmid pPTXSl/ 2. Et DNA-fragment på 181 bp ble isolert fra plasmid pPTXSl/1 ved oppløsning med AccI og SphI; etterfølgende rensing av DNA-fragmentet skjedde på en polyakrylamidgel. Dette DNA-fragmentet er en indre, venstresidig del av Sl-genet. Ved å bruke de samme fremgangsmåter, ble et 564 bp stort DNA-fragment som utgjør den gjenværende høyresidige del av genet, isolert fra PTXS1 som var klonet inn i pUC18. Dette ble utført ved oppløsning av plasmidet med SphI og BamHI, idet det sistnevnte enzym kutter nedstrøms fra Sl-kloningssetet (Xbal), ved BamHI-setet innenfor den pUC18-klonende "cluster". DNA-fragmenter på 1,8 kb og 2,8 kb ble isolert fra ekspresjonsvektoren pCFMH56 ved oppløsning med restriksjonsenzymene Ndel, Sstl og BamHI, etterfulgt av agarose-gelelektroforese og elektroeluering av DNA-fragmentene. En oligodeoksynukleotidlinker ble syntetisert; denne dobbelttrådede linker hadde Ndel- og Accl-kohesive ender og den følgende sekvens:

En ligering ble utført ved hjelp av standardmetoder (Maniatis et al., supra) ved benyttelse av de 181 bp (AccI-SphI) og 564 bp (Sphl-Bamhl) store DNA-fragmentene fra pPTXSl/1, de 1,8 kb (Ndel-Sstl) og 2,8 kb (Sstl-BamHI) store DNA-fragmentene fra pCFM1156, oligodeoksynukleotidlinkeren og T4-DNA-ligase. Etter ligering ble blandingen brukt til å transformere nyfremstilte, kompetente FM5-celler. Kanamycinresistente transformanter ble erholdt, restriksjonsenzymanalysene utført på "miniprepper" av plasmid-DNA, og strukturen bekreftet ved hjelp av DNA-sekvensanalyse av forbindelsene.

Bal31- oppløsning av pPTXSl/ 2 og konstruksjon av vektorer med avkortede Sl- gener. For å bestemme viktige antigene epitoper og enzymatisk aktive seter nær aminoenden til det fullt ferdige Sl-molekyl, ble avkortede versjoner av dette proteinet laget. Ekspresjonsplasmidet pPTXSl/2 ble oppløst med Ndel, behandlet med eksonukleasen Bal31 (IBI) under standardbetingelser, og alikvoter ble fjernet til forskjellige tidspunkter opp til 110 minutter. Etter inaktivering av Bal31 i 15 minutter ved 65 °C ble prøver analysert med hensyn på økninger i elektroforetisk migrering ved elektroforese på agarosegeler. Prøver fra ali-kvotene ved 100 minutter og 110 minutter ble slått sammen (fraksjon A), og de gjenværende prøver slått sammen og oppløst med ytterligere Bal31; alikvoter ble fjernet til forskjellige tidspunkter opp til 180 minutter. Etter stansing av reaksjonen ble alikvoter på nytt undersøkt med hensyn på økninger i elektroforetisk migrering, og fire ytterligere fraksjoner (B, C, D og E) ble beholdt. Hver av de fem fraksjonene ble hver for seg oppløst med Sstl, og DNA-fragmenter på 3-3,5 kb ble isolert fra agarosegeler ved elektroeluering.

Ekspresjonsvektor pCFM1156 ble oppløst med Sstl og Hpal, og et 1,8 kb stort DNA-fragment likeledes isolert. De individuelle 3-3,5 kb store DNA-fragmenter (Bal31 butt-Sstl) fra pPTXSl/2 ble hver ligert med det 1,8 kb store DNA-fragment (Sstl-Hpal) under anvendelse av T4-DNA-ligase under standardbetingelser. Nyfremstilte, kompetente FM5-celler ble transformert med hver individuell ligeringsblanding og kanamycinresistente transformanter isolert. Transformanter av hver av fraksjonene A- og B-avkortinger ble plukket ut, "miniprepper" indusert ved 42 °C og preparatene undersøkt ved lysmikroskopi med hensyn på tilstedeværelsen av inklusjonslegemer. Inklusjonsposi-tive preparater ble "minipreppet", oppløst med Xbal og DNA-inn-skuddene undersøkt med hensyn på størrelse ved agarosegelelek-troforese. Prøver som varierte i størrelse fra 600 til 650 bp, ble valgt ut for DNA-sekvensering for å bekrefte strukturen til avkortningene. Etterfølgende analyser av de uttrykte rekombinante proteiner indikerte at et påkrevd område for ADP-ribosyl-transf eraseaktivitet i Sl-molekylet og en epitop som er involvert i frembringelse av en beskyttende respons (dvs. en antigen epitop som binder et monoklonalt antistoff som passiv beskytter mot toksinaktivitet i mus), ligger innenfor et område som er avgrenset fra og med valin 7 og til og med prolin 14 (for full aminosyresekvens, se Locht og Keith, supra) i det fullt ferdige molekyl. Disse avkortede versjoner av Sl-molekylet begynner alle, i kraft av vektorkonstruksjonen, i sine N-ender med metionylvalyl, etterfulgt av den avkortede sekvens.

Mutagenese av Sl. For å finkartlegge området avgrenset av valin 7 og prolin 14, og for å fremstille analogmolekyler av Sl som mangler enzymatisk aktivitet mens den beskyttende epitop er bibeholdt i dette området, ble det rekombinante Sl-gen underkastet mutagenese. Bibeholdelse av den beskyttende epitop bestemmes av reaktivitet med monoklonalt antistoff 1B7. Dette ble utført ved å bytte ut det autentiske området som koder for restene fra og med valin 7 til og med prolin 14, med syntetiske oligodeoksynukleotidsegmenter. Disse segmentene inneholdt enkle eller doble kodonsubstitusjoner for å endre den autentiske aminosyresekvens. Modifikasjon kan oppnås ved delering og/eller substituering. Det er innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse å endre en enkel base, hvorved de ønskede karakteris-tika til Sl-analogene fås. En enkelt base kan endres for å endre aminosyresekvensen. Det er imidlertid anerkjent av fagfolk innen teknikken at den statistiske sannsynlighet for genotypisk rever-sjon til villtype er større når en enkelt base endres sammen-lignet med modifikasjon av minst to baser. Ved en foretrukket utførelsesform omfattet derfor hver av disse kodonendringer substitueringen av minst to baser i hvert kodon for å redusere reversjonseffektiviteten. Oligodeoksynukleotidlinkerne ble syntetisert med AccI- og BspMII-kohesive ender og inneholdt den autentiske Sl-sekvens, bortsett fra de kodonendringer som er anmerket i linkerbeskrivelsene i tabell I:

For ekspresjonsplasmidkonstruksjon ble de følgende DNA-fragmenter isolert ved elektroeluering fra agarosegeler: 1) et 1824 bp DNA-fragment (AccI til Sstl) fra pPTXS.l(6A), et plasmid konstruert som tidligere beskrevet som uttrykte et rekombinant Sl-analog-molekyl hvor aspartat 1 og aspartat 2 er delert og erstattet med metionylvalyl; 2) et 3,56 Kb DNA-fragment (Sstl til BspMII) fra pPTXSl(33B), et plasmid konstruert som tidligere beskrevet som uttrykte en rekombinant Sl-analog hvor de første 14 aminosyrerestene var delert og erstattet med metionylvalyl. I denne spesielle genkonstruksjonen skapte den buttendede ligering som resulterte i dette forkortede molekyl, et nytt BspMII-sete. Dette restriksjonssetet som ikke er til stede i det naturlig forekommende Sl-cistron-element, muliggjorde utnyttelsen av forholdsvis korte oligonukleotidlinkere med AccI- og BspMII-kohesive ender for å bevirke mutagenesen. Disse to DNA-fragmentene ble ligert med de enkelte oligodeoksynukleotidfragmentene beskrevet ovenfor under standardligeringsbetingelser. Disse ligeringene resulterte i nykonstruerte Sl-gener: en del av pPTXSl(6A) tilveiebrakt ved oppstrømskodonene til punktet for Accl-restriksjonssetet, de syntetiske fragmentene tilveiebrakte de forskjellige mutasjoner til kodoner mellom Accl-setet og BspMII-setet, og en del av pPTXSl(33B) tilveiebrakte det gjenværende av det Sl-kodende området nedstrøms fra det nye BspMII-restriksjonssetet. Etter ligering ble hver blanding brukt til å transformere et separat preparat av de fremstilte, kompetente FM5-celler. Transformanter ble plukket ut, dyrket som "minipreps", indusert til å produsere rekombinant protein, og inklusjonslegemepositive prøver ble identifisert ved hjelp av lysmikroskopi. Disse prøvene ble fermentert ved en større skala (1-6 liter) ved induksjonstempe-raturene for å fremstille større mengder av hvert rekombinant analogprotein. Isolerte cellemasser ble indusert i en fransk presse etter resuspensjon i destillert H2O med 1 mM DTT. Inklusjonslegemer ble isolert fra disse lysatene ved enkel sentrifugering ved lav hastighet. Disse inklusjonslegemeprotein-preparater inneholdt så lite som 30 % og så mye som 80 % av de rekombinante proteiner. Hvert preparat ble analysert med hensyn på evne til å binde i et "Western blot-format" (Burnette, supra) til monoklonalt antistoff B2F8 rettet mot en dominant epitop identifisert i vår undersøkelse med avkortede Sl-analoger, og til å binde til monoklonalt antistoff 1B7 kjent for passivt å beskytte mus mot intracerebral smitte med virulent E. coli (Sato et al., supra) . Prøvene ble også bestemt med hensyn på ADP-ribo-syltransf eraseaktivitet . De oppnådde resultater er vist i tabell 2.

Sl-analogen 4-1 (Arg9->Lys) utviste liten eller ingen transferaseaktivitet, mens den beholdt reaktivitet med nøytrali-serende mAb 1B7. Bare ekstremt små mengder enzymatisk aktivitet kunne avsløres ved å øke mengden av 4-1-protein i analysen (figur 8); gjentatte bestemmelser indikerte at den spesifikke ADP-ribosyltransferaseaktivitet til Sl-analogen ble redusert med en faktor på minst 5000. Måling av NAD-glykohydrolaseaktivitetén forbundet med mutantene med enkelrestsubstitusjon (figur 8B) avslørte et lignende mønster som det som ble oppnådd fra evaluering av ADP-ribosyltransferaseaktivitet. Sl-analog 4-1 utviste liten eller ingen påvisbar glykohydrolaseaktivitet, noe som indikerer en reduksjon i størrelsen på denne aktiviteten ved en faktor på minst 50-100.

På grunn av sin evne til å bibeholde binding til et passivt beskyttende monoklonalt antistoff (dvs. bibeholde en beskyttende hovedepitop) og mangel på en hovedmarkør for toksisk aktivitet (ADP-ribosyltransferase) har det rekombinante Sl-analogmolekyl fremstilt ved hjelp av klon pPTXSl(6A-3/4-1), som vist i figur 7, og modifikasjoner derav anvendelse som sikre økonomiske underenhetsvaksiner, enten alene eller i kombinasjon med andre PTX-underenheter. Sl-analogene fremstilt ved hjelp av klon pPTXSl(6A-3/4-1), hvor arginin 9 er byttet ut med lysin, er illustrerende for rSl-analoger med de ønskede egenskaper som er nødvendige for sikker underenhetsvaksine. Andre analoger av 6A-3/4-1 kunne omfatte f.eks. aspartylaspartylrester i posisjonene 1 og 2, metionylaspartylaspartylrester i posisjonene 1, 0 og 2, og metionylvalylaspartylrestene i posisjonene 0, 1 og 2.

Nåværende acellulære vaksiner inneholder Sl-, S2-, S3-, S4- og S5-underenheter. Den morfologiske modifikasjon som frem-bringes i dyrkede pattedyrceller ved hjelp av kikhostetoksin, er nylig blitt påvist å være en egenskap hos Sl-underenheten (Burns et al., 1987, Infect. Immun., 55:24-28), selv om denne effekt bare er blitt demonstrert i nærvær av B-oligomeren. Preliminære undersøkelser som her er beskrevet, demonstrerer gjennomførbar-heten av en enkelt underenhetsvaksine under benyttelse av rSl-analoger som bibeholder en viktig beskyttende epitop, men som mangler toksisk aktivitet. Sl-analoger har også anvendelse i kombinasjon med underenheter S2, S3, S4 og S5. Disse underenhetene kan forøke immunresponsen til Sl, og kan i seg selv ha beskyttende epitoper. Det er innenfor omfanget av oppfinnelsen at vaksiner omfattende Sl-underenhetene videre kan omfatte minst en av underenhetene S2, S3, S4, S5 og blandinger derav av Bordetellaendotoksin. S2, S3, S4 og S5 kan være underenheter avledet fra E. coli, eller genetisk fremstilte underenheter og deres analoger. Genetisk fremstilte underenhetsprodukter kan omfatte fusjonsproteiner og ikke-fusjonsproteiner.

For formålene ved forsøkene beskrevet i det følgende avsnitt, endret vi ekspresjonssystemet for å produsere en Sl-underenhetsanalog (Sl/1-4) som har lysin-for-arginin 9-substitusjonen, men som også har de naturlig forekommende aspartyl-aspartatrester i sin aminoende.

Bestemmelse av biologisk aktivitet av Sl/ l- 4- analogene og Sl/ l

Rekombinant Sl-protein med naturlig forekommende sekvens (Sl/l) og analog Sl/1-4 (som beskrevet ovenfor, inneholder Arg 9-Lys-substitusjonen og aspartylaspartat-aminoende-restene til den naturlig forekommende sekvens) ble hver for seg isolert fra E. coli- fremstillingscellene ved hjelp av en fremgangsmåte som omfattet celleutbrytning, sentrifugering, urea-oppløseliggjøring, ionebytterkromatografi og gelfiltrerings-kromatografi. Cellemassene ble oppslemmet i 25 mM Tris-buffer, pH 8,5, og lysert ved hjelp av høytrykksoppbrytning (fransk presse). Lysatene ble sentrifugert, og de uoppløselige pelleter inneholdende de rekombinante Sl-proteiner ble oppløseliggjort i 8 M urea, 25 mM Tris, pH 8,5. Etter tilsetningen av CuS04 til en konsentrasjon på 50 um ble blandingene omrørt over natten for å muliggjøre dannelse av disulfidbindinger i de rekombinante Sl-proteiner. Blandingene ble fortynnet med et like stort volum 8 M urea, 25 mM natriumsitrat, pH 3,8, og tilført kolonner med S-Sepharose ("hurtigstrømming") ekvilibrert ved pH 3,8 i 8 M urea. Kolonnene ble eluert med lineære gradienter av NaCl (0-0,5 M) i 8 M urea, 12 mM natriumsitrat, pH 3,8. Brede topper ble tatt opp fra hver kolonne og titrert ved pH 7,5. Disse sammenblandinger av kromatografiske fraksjoner ble tilført separat til Sephakryl S-200-kolonner ekvilibrert i 2 M urea, 10 mM kaliumfosfat, pH 7,5, og det ble samlet opp blandinger av eluerende materiale som utgjorde oksiderte, monomere, rekombinante Sl-proteiner av hver art (Sl/l og Sl/1-4) . Rensede Sl-underenhetsproteiner ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE, etterfulgt av sølvfarging av proteinene i gelene (figur 9). Geler (12,5 % akrylamid) ble kjørt under reduserende betingelser. Felt 1: molekylvekt-standarder. Felt 2: 2 |ig E. coli-holotoksin. Felt 3: 0,2 \ ig E. coli-Sl-underenhetsprotein. Felt 4: 0,2 \ iq rekombinant Sl/l. Felt 5: 0,2 \ ig rekombinant Sl/1-4. Felt 6: blindprøve. Felt 7: 0,4 ug Sl-underenhetsprotein. Felt 8: 0,4 \ ig rekombinant Sl/l. Felt 9: 0,4 jag rekombinant Sl/2-4. På dette fremstillingsstadiet var de rekombinante Sl-arter mer enn 90 % rene.

For å bestemme den biologiske aktivitet til Sl-Arg-»Lys-mutasjonen, var det nødvendig å oppnå forbindelsen mellom den mutante analog og det rekombinante Sl-protein med nativ sekvens i kikhosteholotoksinarter. Høyrenset kikhostetoksin B-oligomer (en pentamerstruktur av toksinunderenhetene S2, S3, S4 og S5) ble tilveiebrakt av D. Burns, Center for Biologics Evaluation and Research, Food and Drug Administration. De to forskjellige Sl-underenhetsartene fikk hver for seg bindes til B-oligomeren, hvorved det ble dannet holotoksinmolekyler (inneholdende enten Sl/l eller Sl/1-4) ved hjelp av den følgende fremgangsmåte. Like store molare mengder av rekombinante Sl-arter og B-oligomer ble blandet sammen i oppløsninger av 2 M urea, 10 mM kaliumfosfat, pH 7,5, og ble inkubert i 30 minutter ved 37 °C. Holotoksindannelse ble bestemt ved elektroforese i native akrylamidgeler (figur 10). Gel 1: rekombinant Sl/l og nativ oligomer. Gel 2: rekombinant Sl/1-4 og nativ B-oligomer. Gel 3: nativ B-oligomer. Gel 4: nativt E. coli-holotoksin. Gel 5: rekombinant Sl/l. Gelene indikerer at holotoksinarter ble samlet fra blandingen av nativ B-oligomer med enten rekombinant Sl/l eller rekombinant Sl/1-4.

Semirekombinante holotoksiner (B-oligomer pluss enten Sl/l eller analog Sl/1-4) ble så undersøkt med hensyn på evne til å frembringe en "clustering"-respons i ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO) in vitro; denne responsen er blitt vist å være et mål for cytopastisiteten til kikhostetoksin. Forsøks-prøver og passende kontrollprøver ble fortynnet i CHO-celle-kulturmedium (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium med 10 % kalve-fosterserum), sterilisert ved ultrafiltrering og ytterligere fortynnet ved hjelp av serieoverføring i 96-brønners kultur-skåler av plast. Omtrent 5-7 x IO<3> nytrypsiniserte CHO-celler (American Type Culture Collection CCL 61, CHO-Kl-celler) ble tilsatt til hver brønn, og skålene ble inkubert ved 37 °C i 5 % CO2 i 48-72 timer. Cellemonolagene ble vasket med fosfatbufret saltoppløsning, farget med krystallfiolett og undersøkt med hensyn på tilstedeværelse av celle-"clusters" ved hjelp av lysmikroskopi.

Figur 11 viser resultatene av slike analyser; av særlig interesse er resultatene av panelene G, H og J, som vedrører Sl/l-4-analogen. Sl/l-4-analogen alene og 1/1600 fortynning av holotoksin dannet fra Sl/l-4-analog og B-oligomer viser en mangel pA celle-"clustering", idet 1/200-fortynningen utviser en neglisjerbar mengde "clustering".

Panel A er celler behandlet med en 1/200-fortynning av buffer alene. Panel B er behandlet med B-oligomer alene, ved en fortynning på 1/200; en liten mengde "clustering" er synlig ved denne fortynning og kan tilskrives forurensende nativ Sl-underenhet som blir tilbake etter rensing. Panel B kan sammenlignes med et annet område av den samme brønnen (panel I), som klart viser "clustering"-aktivitet av B-oligomerpreparatet ved en fortynning på 1/200. Panel C er celler behandlet med nativ Sl-underenhet av kommersiell finhetsgrad med 1/2000 fortynning. Panel D er nativ kikhosteholotoksin av kommersiell finhetsgrad ved 1/200 fortynning, noe som demonstrerer den dramatiske cytopatiske effekt av kikhostetoksin på CHO-celler i kultur. Panel E er rekombinant Sl-underenhet med nativ sekvens (Sl/l) ved en fortynning på 1/2000. Panel F viser Sl/l kombinert med B-oligomer og fortynnet til 1/2000; effekten av CHO-celle-"clustering" synes akkurat så dramatisk som med nativ holotoksin og understøtter de fysikalske gelresultater (se ovenfor) som oppviser holotoksinforbindelse med B-oligomer og oppviser holotoksinforbindelse med B-oligomer og det rekombinante Sl-protein. Panel G illustrerer at Arg 9-»Lys-mutant Sl/1-4 i seg selv ikke har noen effekt på CHO-cellene. Panel H viser den manglende CHO-celle-"clustering" ved en 1/1600 fortynning av holotoksin dannet fra Sl/l-4-analogen og B-oligomeren. Ved en fortynning på 1/200 (Panel J) kan en viss "clustering" av det Sl/l-4-holdige holotoksin ses; bidraget til "clustering"-effekten fra de analoge Sl-arter synes imidlertid neglisjerbar når man sammenligner med B-oligomer selv ved den samme fortynning (panel I).

Innledende forsøk er blitt gjort for å kvantifisere den effektive konsentrasjon av de forskjellige kikhostetoksinarter som er påkrevd for å frembringe CHO-celle-"clustering"-feno-menet. Preliminære resultater indikerer at både kommersielt kikhostetoksin og holotoksinet som inneholder rekombinant Sl/l kan forårsake celle-"clustering" ved så lave konsentrasjoner som 0,25-0,30 ng/ml; i motsetning til dette er holotoksin inneholdende Sl/l-4-analogen påkrevd ved konsentrasjoner på minst 10-25 ng/ml for å indusere "clustering"-effekten.

Disse resultatene bekrefter at den cytotoksiske effekt av kikhostetoksin ligger i dens Sl-underenhetsrest og at den er direkte relatert til dens enzymatiske aktiviteter. Mer viktig er det at disse forsøkene viser at et forholdsvis ikke-toksisk kikhostetoksinmolekyl kan dannes fra bestemte rekombinante toksinunderenheter avledet ved hjelp av seterettet mutagenese.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en proteinanalog til Boredetella-eksotoksin som kan utløse toksinnøytraliserende nivåer av antistoffer, og som er vesentlig fri for enzymatiske aktiviteter forbundet med toksinreaktogenisitet, karakterisert ved at en vertcelle som er transformert med et DNA-molekyl som koder for Sl-, S2-, S3-, S4-og S5-underenhetene i eksotoksinet hvor Sl-underenheten er blitt modifisert slik at argininet i 9-posisjonen i aminosyresekvensen er erstattet med en lysinrest, dyrkes.

2. Fremgangsmåten ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinanalogen omfatter minst én hovedepitop som er kjent for å være viktig når det gjelder å tilveiebringe immunologisk beskyttelse mot Bordetella-toksisitet.

3. Polypeptidanalog av Sl-subenhet fra Bordetella pertussis- toksin, karakterisert ved at nevnte analog har ulik aminosyresekvens i forhold til naturlig forekommende Sl-subenhet ved substitusjon av lysin på arginin i posisjon 9, der analogen har en biologisk aktivitet som (a) kan utløse toksinnøytrali-serende nivåer av antistoffer og (b) er vesentlig fri for enzymatiske aktiviteter som er assosiert med toksinreaktogenitet.

4. Analog ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte toksinnøytrali-serende nivåer av antistoffer tilveiebringer immunbeskyttelse mot Bordetella-toksisitet.

5. Analog ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte biologiske aktivitet i (b) blir oppnådd ved setespesifikk mutagenese som fører til at nevnte analog i all hovedsak er enzymatisk inaktiv.

6. Analog ifølge krav 3, karakterisert ved at den inkluderer en amino-terminal metionylvalyl-sekvens.

7. Analog ifølge krav 3, karakterisert ved at den omfatter en aminosyresekvens som er avbildet i figur 7.

8. Vaksine mot pertussis, karakterisert ved at den omfatter et modifisert Bordetella pertussis- toksin der lysin har blitt substituert inn for arginin på posisjon 9 i Sl-subenheten, der det modifiserte Bordetella pertussis-toksinet har en biologisk aktivitet som (a) kan utløse toksinnøytraliserende nivåer av antistoffer og (b) er vesentlig fri for enzymatiske aktiviteter som er assosiert med toksinreaktogenitet.

9. Vaksine ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte toksinnøytrali-serende nivåer av antistoffer tilveiebringer immunbeskyttelse mot Bordetella-toksisitet.

10. Vaksine ifølge krav 9, karakterisert ved at den ytterligere omfatter en polypeptidanalog av Sl-subenheten på Bordetella pertussis-toksin som omfatter en aminosyresekvens som avbildet i figur 7.

11. Analog ifølge krav 3, karakterisert ved at minst arginin på posisjon 9 på N-terminalen til den modne Sl-subenhet har blitt substituert med lysin for å redusere toksisiteten uten skadelig å påvirke de immunologiske egenskapene, og der analogen av Sl-subenheten til toksinet er fremstilt ved hjelp av en prosess med a) seterettet mutagenese av genet for nativ Sl-subenhet fra pertussistoksin og b) uttrykking av nevnte gen som er mutert ved seterettet mutagenese.

12. Vaksine ifølge krav 9, karakterisert ved at den ytterligere omfatter en effektiv mengde av et immunbeskyttende, generelt detoksi-fisert Bordetella pertussis- toksin som omfatter en analog av en Sl-subenhet der minst arginin på posisjon 9 på N-terminalen i den modne Sl-subenheten har blitt substituert med lysin, for derved å redusere ADP-ribosyltransferaseaktiviteten til Sl-subenheten, og der nevnte vaksine blir fremstilt ved en prosess med a) seterettet mutagenese av genet for nativ Sl-subenhet fra pertussistoksin, b) uttrykking av nevnte gen som er mutert ved seterettet mutagenese og c) inkorporering av analogen av Sl-subenheten i et toksinmolekyl.

13. Vaksine ifølge krav 9, karakterisert ved at den omfatter en analog av Sl-subenheten til Bordetella pertussis- toksin, der minst argininresten på posisjon 9 på N-terminalen til den modne Sl-subenhetsekvensen har blitt substituert med lysin, der analogen av Sl-subenheten, når den uttrykkes, blir gjenkjent av et antistoff som overfører immunbeskyttelse mot Bordetella pertussis og som mangler enzymatisk aktivitet som er assosiert med Bordetella pertussis-toksinreaktogenitet, der Sl-subenheten blir fremstilt ved prosessen med a) seterettet mutagenese av genet for Sl-subenheten til det native Bordetella pertussis-toksinet og b) inkorporering av nevnte gen som er mutert ved seterettet mutagenese i en bakteriecelle.

14. Analog ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte analog er for-skjellig i aminosyresekvens i forhold til sekvensen til den native Sl-subenhetsekvensen med minst en aminosyresubstitusjon som inkluderer substitusjonen av lysin for arginin på posisjon 9.