CN1033866C - 重组dna产生的博德特氏菌毒素类似物 - Google Patents

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Abstract

通过DNA重组技术产生的博往特氏菌外毒素多个和单个亚基类似物提供的疫苗产品保留了其生物活性，具有高度的免疫原性，能够提供针对疫病攻击的保护作用。通过基因工程产生的亚基变化能够导致这样的产物；它们保留了免疫原性，但没有与毒素反应原性相关联的酶促活性。

Description

重组DNA产生的博德特氏菌毒素类似物
本发明提供了在大肠杆菌中高水平直接表达博德特氏菌外毒素的S1、S2、S3、S4和S5亚基重组类似物的方法，而不需与异源蛋白部分进行融合。更具体地说，通过基因工程对亚基进行修饰，提供了一类博德特氏菌毒素类似物，它们能诱发毒素中和水平的抗体，并且基本上不含有反应原组分。通过基因工程得到的亚基能够用来产生亚基疫苗，它们既具有免疫原效应，又基本上不含反应原组分。
名词“博德特氏菌外毒素”是指一组由博德特氏菌属不同组的基因组编码的毒素，例如百日咳博德特氏菌(Bordetella Prtussis)、副百日咳博德特氏菌(B·Parapertussis)和支气管败血性博德特氏菌(B·bronchiseptica)。通常用来指博德特氏菌外毒素的其它名词还有百日咳毒素(“PTX”)、淋巴细胞增多促进因子(“LPF”)和胰岛活化蛋白(“IAP”)。
在世界许多地区，百日咳仍然是婴儿发病和死亡的主要原因。百日咳博德特氏菌的完整细胞疫苗是控制此疾病的一种有效手段。但是，此疫苗的使用与温和的副作用直接相关，有时甚至于更为严重，偶而与致命的、神经性疾病相关。
已经作出了广泛的努力，以试图消除已知与现行疫苗相关的有害副作用。这些努力导致了非细胞疫苗的生产和试验，在基础研究中，这些努力则导致了试图去生产更为安全的重组产物。为了克隆生产来自重组DNA的疫苗，关键性的第一步是测定百日咳毒素操纵子的顺序，从而推测出单个亚基的氨基酸顺序(Locht，C.和Keith，J.M.，1986，Science 232：1258-1264；Locht等人，1986，Nucl.Acids Res.14：3251-3261；Nicosia等人，1986，proc.Natl.Acad.Sci.USA83：4631-4635)。
Nicosia等人(1987，Infect.Immun.55：963-967)证实，编码百日咳博德特氏菌S1、S2、S3、S4和S5中每一亚基的mRNA能够由大肠杆菌中的克隆基因高效率地转录。尽管他们意欲表明天然百日咳毒素多顺反子信息的高水平转录，但由直接表达产生的蛋白量仍然很低或难以测出。进一步，随后合成的融合蛋白不能诱发任何中和性或保护性免疫应答。
Barbieri等人(1987，Infect.Immun.，55：1321-1323)证实了S1亚基作为融合蛋白在大肠杆菌中的表达。此融合蛋白含有β-半乳糖苷酶的最前面6个氨基酸、由pUC18多人工接头编码的5个氨基酸，随后是S1亚基的氨基酸2至235号。以少量生产的S1融合蛋白，只具有真正的或天然百日咳毒素的大约25％的ADP-核糖基转移酶活性。
Locht等人(Abstract，Modern Approaches to NewVaccines，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1986年9月9-14日)能够表达含有S1亚基2-187号氨基酸的融合蛋白。他们预测此构建物没有毒性，因为他们认为它没有与ADP-核糖基转移酶有关的NAD结合位点，而此酶的活性被认为是毒素反应原性的来源。但随后用此分子进行的实验表明，此截断分子所具有的酶活性基本上没有减少。在现有技术中已知的多个或单个亚基类似物中，没有一个能够诱发毒素中和水平的抗体，而又基本上不具有与反应原性相关的酶活性。
图1是PTX操纵子的顺反子顺序的概图(现有技术，见上面的Locht和Keith)。标有S1、S2、S4、S5和S3的区域代表对每种PTX亚基推测的可译框架。每个顺反子前的黑色区域代表推测的信号顺序。紧靠每个顺反子下游的限制性酶切位点标明了用于将该顺反子亚克隆入表达载体中的下游限制位点。位于每个信号顺序区之内的限制性酶切位点用来作为将完整顺反子亚克隆入表达载体中的上游限制位点，在亚克隆时，用合适的寡聚脱氧核苷酸人工接头使未成熟的PTX亚基的信号顺序完整无损。在刚好位于每个成熟的PTX亚基的可译框之内的限制性酶切位点，与合适的寡聚脱氧核苷酸人工接头一起，用作没有信号顺序的顺反子的亚克隆的上游限制位点，以产生甲硫氨酰—成熟PTX亚基。
图2是PTX重组亚基的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western印迹法的结果。A图左边显示了以可测数量产生的PTX重组亚基胶带的考马斯亮蓝染色结果；图A右边是平行胶带用兔多克隆抗-PTX超免疫血清所作的Westers印迹。PTX标明含有商品级百日咳毒素的泳道。这些结果表明，所产生的重组体(r)S1、S2、S3和S5的数量都很大。Western印迹表明，rS1已由它的前蛋白分子进行了完全的后加工，rS2和rS5只进行了部分后加工，rS3在发酵条件下基本上未被后加工；rS4的产生数量还不足以被观察到。图B显示了作为甲硫氨酰—成熟重组(rm)亚基的表达产物。这些亚基的产生量都很大，只是rmS1除外(数据未出示)。
图3是western印迹法结果，证实了上游非编码顺序对于rS2表达的效应。此图的详情参见后面的说明。
图4是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的放射自显影图，表明重组S1的ADP-核糖基转移酶活性。基本上根据Manning等人(1984，J.Biol.Chem.，259：749-756)和West等人(1985，J.Biol.Chem.，260：14428-14430)所述的方法，使重组S1(500ng)、纯化的天然百日咳毒素(1μg)和反应缓冲液在〔32P〕NAD的存在下分别与牛转导素(transducin)反应。用10％的冷三氯乙酸使样品沉淀，使沉淀进行SDS-PAGE和随后的放射自显影。39Kd处的放射活性带是已被核糖基化的转导素亚基。A道：反应缓冲液对照；B道：天然PTX；C道：rS1。
图5是放射免疫检测的曲线图，显示rS1和rS4亚基在小鼠中的免疫原性。小鼠用重组S1、甲硫氨酰rS4、天然百日咳毒素(PTX)、市售百日咳疫苗或赋形剂(NMS)进行超免疫；有些制剂含有完全Freund氏佐剂(CFA)。收集血清，利用固相放射性免疫检测法检查稀释液的抗-PTX滴度。
图6的曲线图表明rS1和rS4在小鼠中针对百日咳博德特氏菌脑内攻击的免疫保护能力。此图的详情见下文。
图7是对rS1突变体推测的氨基酸顺序，该突变体是由pPTX S1(6A-3/4-1)的表达产生的。
图8A和8B是S1重组类似物ADP-核糖基转移酶和NAD-糖水解酶的活性的曲线图。
图9是纯化的S1亚基蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)的放射自显影图。
图10是全毒素的天然的、非还原的、非变性的聚丙烯酰胺疑胶的放射自显影图，该全毒素来自天然B寡聚体与重组S1/1或重组S1/1-4的结合。
图11是光学显微镜下细胞单层的照片，以检查聚集细胞的存在。
本发明提供了一种重组DNA分子，它至少包括一个编码博德特氏菌外毒素S1亚基的部分，或所述部分的一个片段或衍生物，其中，所述部分或片段或衍生物编码的多肽具有如下的生物活性：(a)诱发毒素中和水平的抗体以及(b)基本上不含有反应原组分。S1多肽亚基，或其亚基类似物，含有一个主要的抗原决定簇，已知它对于针对百日咳毒性的免疫保护作用是很重要的。毒性中和水平的抗体提供了针对百日咳毒性的免疫保护作用。位点专一性诱变产生了基本上没有酶活性的S1亚基类似物。
通过基因工程得到的博德特氏菌外毒素的S1亚基及此亚基的类似物，为预防百日咳提供了重组DNA产生的亚基疫苗。 S1亚基及其类似物提供的疫苗产品，或是单独的，或是与亚基S2、S3、S4和S5或其混合物结合的。亚基S2、S3、S4和S5能够从百日咳博德特氏菌中纯化得到，或通过基因重组作为融合或非融合产物产生。博德特氏菌外毒素的亚基S2、S3、S4和S5的高水平重组表达，在大肠杆菌中通过直接的非融合法也能达到。另外，可以选择的重组宿主包括酵母，例如啤酒酵母(S.Cerivisiae)，细菌，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或伤寒沙门氏菌(S.typhi)、芽孢杆菌(Bacillus)，以及病毒，例如牛痘病毒，它们也可用来表达这些亚基类似物。
本发明为生产疫苗必需的所有PTX亚基提供了直接的高水平重组表达方法。此外，S1亚基类似物提供的生物活性具有高度的免疫原性，并基本上不含反应原组分，这种组分具有毒素分子中与其毒性及反应原性相关的酶活性，并且基本上不含有百日咳博德特氏菌的次要组分(如内毒素)，而这些次要组分存在于由百日咳博德特氏菌提取出的疫苗物质中，并已知它们具有反应原性。单独或与PTX的其他亚基结合使用S1类似物，能够提供有效的疫苗产品，并大大降低来自反应原组分的副作用的可能性，而该组分存在于未经修饰的天然或重组产生的亚基中。
百日咳博德特氏菌毒素的单个亚基S1、S2、S3、S4和S5分别亚克隆，并直接在大肠杆菌中单独表达。信号顺序似乎在重组S1(rS1)的表达中起着重要作用。没有信号肽存在时，大肠杆菌中rS1的表达量很少。如果前蛋白上存在有S1亚基的天然前导顺序或合成的前导顺序，则可得到高水平表达，范围在占细胞总蛋白的10-30％。如图2所示，rS1表达细胞在分批式10升发酵罐中以生产规模发酵时(在8mg S1/OD-L的非最佳表达水平下)，使rS1的蛋白水解后加工差不多进行完全而产生其成熟分子。以实验规模发酵表达细胞时，S1的后加工进行不完全；前蛋白和成熟蛋白都在细胞的对数生长后出现。合成的大肠杆菌的可切割前导顺序并不能加强信号的后加工，这提示不完全切割的原因并不是大肠杆菌前导肽酶对于百日咳博德特氏菌蛋白水解切割位点的不相容识别。用高水平表达大肠杆菌前导肽酶的质粒对细胞进行其转化以提高信号肽酶的合成，或使用低拷贝数载体降低S1的表达水平，都不能克服后加工的障碍。这表明问题并不在于切割途径的饱和。这些结果表明，大肠杆菌中外源蛋白的转译后加工可能是由所知甚少的机理控制的，它们与生长细胞的生理状态有关。
如图2所示，在大肠杆菌中类似地表达了PTX亚基S2、S3、S4和S5。与重组S1一样，rS2、rS3和rS5亚基在实验规模的发酵中的后加工似乎不完全。由于rS1在生产规模下能进行完全的后加工，则能使用相似的发酵条件以完全加工好的形式产生其它亚基。与rS1截然不同，rS4亚基能够作为成熟的甲硫氨酰多肽高水平表达，但以其天然的前导肽顺序表达时检测不出。现在，亚基S2、S3、S4和S5都已作为甲硫氨酰成熟多肽得到了表达。这些分子的氨基酸分析表明，每个分子(S4除外)上的异源(非天然的)甲硫氨酰残基基本上都由细胞的甲硫氨酸氨基肽酶切除，从而产生具有天然顺序的完全成熟的蛋白。重组S4上的甲硫氨酰残基基本上未被切除，是由于细胞酶的氨基末端识别顺序的不相容性。从溶解细胞中以内含体形式回收所有的重组蛋白。发现这些亚基在SDS-PAGE中的泳动图形与真正的天然亚基基本一致，或在Western印迹法中与单克隆和多克隆抗毒素血清发生反应。如图2所示，在大肠杆菌中，通过直接的非融合方式高水平表达了重组亚基S1、S2、S3、S4和S5。
下面描述了本发明的优选方法和材料，但在实施本发明时可使用不同的方法和材料。下面引用的所有参考文献都并入本申请中作为参考文献。对亚基S1、S2、S3、S4和S5进行重组表达的材料和方法
材料DNA修饰酶购自New England Biolabs(Beverly，MA)，Bethesda Research Laboratories(Gaithersburg，MD)，Boehringer MannheimBiochemicals(Indianapolis.IN)和InternationalBiotechnologies，Inc.，(New Haven，CT)；酶的使用根据厂家的说明进行。所有的化学和生化试剂都是分析纯的。纯化的百日咳毒素PTX购自List Biological Laboratories，Inc.(Campbell，GA)。根据Caruthers的方法(1982，in H.G.Gussen and A.Lang〔eds〕Chemical andenzymatic synthesis of gene fragments，VerlagChemie，Weinheim，FRG，PP71-79)合成寡核苷酸。针对完整PTX的兔抗血清是由Antibodies，Inc.(Davis，CA)生产的，而生产针对天然PTX亚基的NIAID Rocky MountainLaboratory Monoclonal抗体是根据标准方法(Kohlerand Milstein，1975，Nature 256：495-497；Nowinski等人，1979，Virology 93：111-126)进行的。放射性碘标记的蛋白A和兔抗鼠IgG购自New EnglandNuclear(Wilmington，DEL)。抗-S1单克隆抗体IB7(如Sato等人所述，1987，Infect.Immun.55：909-915)是由日本京叶(Kelyo)NIH的H.Sato所赠送。
质粒和菌株含有PTX操纵子的质粒pPTX42已有过描述(见Locht and Keith，见上；以及Locht等人，见上)。表达质粒pCFM1036，pCFM1146，pCFM1152及pCFM1156是由Amgen产生的。
Amgen表达载体系统的详细描述见于公开的136,490号欧洲专利申请，该文引入本文作为参考文献。这种质粒可含有一个可诱导的启动子，一个合成的核糖体结合位点，一串克隆的顺序，质粒复制原点，一个转录终止子，调节质粒拷贝数的基因和卡那霉素抗性基因。产生的质粒在若干方面相互有别。质粒pCFM1036可从pCFM836(136,490号欧洲专利申请)产生，即用下述寡核苷酸：
     AatII               EcoRI5′          CATCGATTCTAG           3′3′      TGCAGTAGCTAAGATCTTAA取代单一的AatII和EcoRI限制性位点之间的DNA顺序(其中含有合成的PL启动子)。该质粒在限制片段之前不含有可诱导的启动子。质粒pCFM1146可从pCFM836产生，即用下述寡核苷酸：
      ClaI5′           CGATTTGATT           3′3′             TAAACTAAGATC       5′取代单一的ClaI和XbaI限制性位点之间的短DNA顺序，并破坏掉两个内源的NdeI限制性位点，即用T4聚合酶填充末端后进行平头连接。该质粒在紧靠限制性片段之前不含有合成的核糖体结合位点。质粒pGFM1156能从pCFM1146产生，即用下述寡核苷酸：
 XbaI                                      KpnI5′ CTAGAAGGAAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3′3′     TTCCTTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC     5′取代单一的XbaI和KpnI限制性位点之间的短DNA顺序。质粒pCFM1152可从pCFM1156产生，即用来自质粒pCFM512(136,490号欧洲专利申请)的相应的DNA片段取代BglII至BglII的DNA片段(248碱基对)，后者含有copB启动子并编码部分copB基因。此质粒比pCFM1156的拷贝数低。
质粒pBR322，pUC18，pUC19和噬菌体M13mp18和M13mp19 DNA购自BethesdaResearch Laboratories。含有大肠杆菌引导肽酶基因的质粒pTD125(Dale，T.1983，J.Bacteriol.143：76-83)由W.Wickner(UCLA)惠赠。大肠杆菌FM5细胞是由Amgen Inc.，(Thousand Oaks，CA)产生的，它来自C.F.Morris的大肠菌K-12菌株(Bachmann等人，1976，Bacteriol.Rew.40：116-167)，并含有整合的入噬菌体校正基因CI857(Sussman等人，1962，C.R.Acad.Sci.254：1517-1579)。本文中叙述了如何构建单个亚基的表达质粒。根据标准方法(Maniatis等人，1982，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，冷泉港实验室，Ny)进行载体生产、细胞转化和集落选择。
分析程序根据引物延伸的链终止法(Sanger等人，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467；Heidecker等人，1980，Gene 10：69-73)测定DNA顺序。蛋白质顺序分析利用ABI470A型气相微量测序仪根据Edman自动降解法进行(Hewick等人，1981，J.Biol.Chem.256：7990-7997；Hunkapillar等人，1983，Meth.Enzymol。91：399-413)。根据Laemmli(1970，Nature，227：680-685)所述的方法进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据Hunkapiller等人的方法(1983，Meth.Enzymol.91：227-236)从胶带上洗脱多肽，根据Burnette(1981，Analyt.Biochem.112：195-203)所述的方法进行Western印迹法。对完整细胞的溶解物或内含体制剂进行SDS-PAGE，然后用考马斯亮蓝染色，并用集成化密度仪对产生的胶带扫描，从而测定重组蛋白与细胞总蛋白或总内含体蛋白的比例。根据前人所述的方法(Katada等人，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：3129-3133；Lim等人，1985，J.Biol.Chem.260：2585-2588)，检测NAD-糖水解酶和ADP-核糖基转移酶活性。根据Gillenius等人的方法(1985，J.Biol.Stand.13：61-66)，用针对各种重组亚基制剂的抗血清测定CHO细胞对PTX的形态应答的降低(Hewlett等人，1983，Infect.Immun.40：1198-1203)。
表达质粒的构建所有质粒都如前述从一系列大肠杆菌普遍性表达载体构建。利用现有技术图1中所示的限制性位点，分离百日咳毒素中单个亚基基因的片段；上游限制位点刚好位于带有信号肽的亚基的表达起始密码之内，或刚好位于成熟的加工好的亚基的氨基末端残基的密码之内，所表达出来的是甲硫氨酰—成熟形式的亚基类似物。完整的B寡聚体的共表达，在一种情况中，是使用含有S2上游非编码区至S3末端的片段，并略去了大肠杆菌表达载体的合成的核糖体结合位点；在另一种情况中，去掉了S2上游的非编码区，插入了合成的大肠杆菌核糖体结合位点。使用合成的寡核苷酸人工接头，以使表达质粒中插入的基因片段位于合成的启动子和核糖体结合位点下游的最佳位置。上游的人工接头恢复了每个基因的可译框架，所述基因或者位于真正的起始密码之后(在前亚基构建物的情况下)，或位于成熟亚基氨基末端的第一密码之后；后者的寡核苷酸包括一个甲硫氨酰起始密码。在某些情况下，所选择的密码能降低所产生的m RNA5′末端附近的二级结构潜力。例如，用丝氨酸密码取代S1亚基信号区的第3位半胱氨酸密码(Locht和Keith，见上)，以消除二硫桥的可能的有害作用。
用各种质粒构建体转化大肠杆菌FM5细胞，在含有卡那霉素的琼脂平板上培养，然后选择合适数目的集落，进行平板复制，以少量液体培养物生长(“微量制备物”)，再于42℃下诱导4小时。然后用光学显微镜检查微量制备物，以筛选含有内含体的细菌细胞。鉴别到明显具有内含体的制备物，使复制平板上的对应集落在诱导温度下进行烧杯规模(1升)的实验室发酵；某些制备物在后来用10升工业发酵罐进行分批式发酵。在诱导后不同时间从发酵液中取样，通过SDS-PAGE后用考马斯亮蓝染色及进行Western印迹转移，以检查合适的PTX亚基的出现；使印迹首先与合适的单克隆抗体反应，通过放射性自显影检查，然后与多克隆抗-PTX血清反应，进一步进行放射自显影。每种表达克隆的质粒的结构，由分离质粒的限制性图谱得到证实，并由结合区的DNA顺序分析得到确定。
重组S1的表达在分批式10升发酵罐中以生产规模于42℃下诱导时，含有S1表达质粒(pPTXS1/1)的大肠杆菌细胞产生一种大约26,000道尔顿的主要胞内蛋白(图2A在左边，rS1泳道)，在SDS-PAGE中，它与真正的PTXS1一起泳动。部分氨基酸的顺序分析(5级循环)确定，此多肽具有为成熟的S1亚基预测的氨基端顺序(Locht和Keith.见上)。免疫化学试验证实此蛋白就是S1，因为在Western印迹法中，它能与鼠抗S1单克隆抗体发生反应(图2A右边，rS1泳道)。
应当注意，S1表达细胞在1升烧杯规模下的实验室发酵不能完全切割掉rS1的信号肽，在大肠杆菌中表达其它PTX亚基也观察到这一现象(见下面)。设计了一系列实验试图鉴别出烧杯规模下看到的信号加工的分子障碍，这些实验是试图提高前蛋白切割的程度；将S1基因插入低拷贝数的表达载体中，用合成的大肠杆菌的可切割信号顺序(Picker等人，1983，Infect.Immun.42：269-275)置换真正的S1信号肽，用含有大肠杆菌前导肽酶基因的表达质粒对亚基表达细胞进行共转化(Date，见上)，以提高此酶的组成水平。这些努力没有一个对信号切割产生了任何显著的改变。然而，对分批式方法的发酵条件的改变，使前S1基本上完全被加工成其成熟的形式。
使S4亚基作为成熟的甲硫氨酰多肽(见下)进行表达的成功，促进了对rS1也使用同样的战略。但与大肠杆菌中rS4的表达不同，成熟的甲硫氨酰S1的表达非常低，必须用Western印迹法进行检测。与此相反，用其真正的信号顺序表达rS1产生加工完好的多肽，表达水平为细胞总蛋白的10-30％。正如后面所述，通过重组手段截断rS1成熟氨基末端能够导致很高水平的表达。事实上，通过对成熟的S1顺序进行少至最初两个残基的置换(用Met-Val取代Asp-Asp)也会相对于甲硫氨酰成熟S1来说使表达显著提高。
S2、S3、S4和S5的表达作为可行性试验，首先使PTX S4亚基作为没有天然前导肽的成熟的甲硫氨酰蛋白得到表达，并如上所述，在大肠杆菌中以高水平生产(图2B左边，rmS4泳道)。尽管相对于完整毒素制剂的S4来说，它在SDS-PAGE中的泳动稍有迟滞，但它具有预测的S4的氨基酸顺序。通过HPLC从百日咳博德特氏菌纯化的S4在凝胶电泳中表现出同样的迟滞现象(Locht等人，见上)。重组S4在Western印迹中与多克隆抗血清反应正常(图2B右边，rmS4泳道)，但与S4单克隆抗体的反应性降低。
与用S1得到的结果不同，使S4带着其天然的前导肽顺序进行表达时(Locht和Keith，见上)，检测不到所产生的蛋白质(未出示)。但应当注意，Nicosia等人(见上)预测在更上游处有一个不同的转译起始位点；有可能在S4的前导肽中使用比额外的顺序会使表达水平高得多。重组S2、S3和S5都带着其天然前导顺序得到了表达(图2A，分别为rS2、rS3和rS5泳道)；在实验室规模的发酵中，这些亚基中没有一个得到了完全的加工，但在利用分批式方法的初级生产规模的发酵实验中，使S2和S5的后加工得到显著改善。还在大肠杆菌中以甲硫氨酰—成熟蛋白的形式表达了S2、S3和S5，其水平与带有其天然前导肽的蛋白的表达水平差不多(图2B，分别为rmS2、rmS3和rmS5泳道)。正如上面指出，S2、S3和S5的异源甲硫氨酸残基通过细胞的甲硫氨酸氨基肽酶切除，以产生天然顺序的完全成熟的多肽。
代表B寡聚体亚基(S2-S4-S5-S3)的完整的多顺反子片段在PL启动子的调控下表达。图3说明上游非编码区对于S2亚基生产的效应。在一种情况中，表达质粒保留有S1终止密码和S2起始密码之间的所有顺反子间顺序(Locht和Keith，见上)，但没有在所有其他表达质粒中所用的合成的核糖体结合位点。结果当用抗-S2单克隆抗体进行Western印迹检查时，所合成的重组S2似乎得到了完全的后加工(图3，D和E泳道)；多克隆抗体的分析结果提示，其他的B寡聚体亚基也完全加工成其成熟形式，但这一结果并未给出。用合成的Shine-Delgarno顺序取代非编码的顺反子间片段，导致rS2的合成水平大大提高(图3，B和C泳道)；但是此物质的加工不完全。每个顺反子的合成效率似乎与信使5′端的邻近性直接相关，即S2＞S4＞S5＞S3。一个初步实验，即将操纵子的剩余部分置于S1的高水平表达构建体(见上)的下游，使每种亚基的合成水平非常低，加工也不完全(包括S1)。
PTX重组亚基的性质尽管某些迹象表明，在外周胞质使周围空间可能存在有限量的完全加工好的rS1，但很少有(即使有的话)加工好的PTX亚基似乎是从大肠杆菌细胞中分泌出来，发现各种亚基的主体以内含体的形式存在，构成细胞总蛋白的10-30％。通过French压力法得到的细胞溶解液经低速离心后，产生的沉淀部分中的蛋白有高达65％是单个亚基。
所有的PTX亚基都能用多克隆的兔抗毒素血清通过Western印迹法检测到(图2)。如上指出，亚基rS1和rS2在Western印迹中能与特异的单克隆抗体正常反应。以甲硫氨酰多肽制备的重组S4，与抗-S4单克隆抗体的反应性降低。得不到针对亚基S3和S5的单克隆抗体，但由于rS3与S2具有密切同源的顺序，因此，rS3能够在Western印迹中用抗-S2单克隆抗体检测出来(Locht和Keith，见上)。
使重组rS1粗制品在〔32P〕NAD存在下与由CHO细胞分离的膜保温时，一个大约41,000道个顿的蛋白质被ADP-核糖基化，与通过天然的完整PTX进行的核糖基化一致；此分子被认为是腺苷酸环化酶复合物的Ni膜调节蛋白(Bokoch等人，1983，J.Biol.Chem.258：2072-2075；Hsia等人，1983，J.Biol.Chem.259：1086-1090)。在进行常规检测时，可以使用牛转导素作为核糖基酶的底物(图4)，此分子被证实是百日咳毒素催化的由NAD进行ADP-核糖转移的受体(Manning等人，见上；Wost等人，见上)。此结果证实了ADP-核糖基转移酶活性在毒素的A助催化剂(Promoter)(S1亚基)上的定位，并提示百日咳博德特氏菌重组蛋白在大肠杆菌中的折迭形式与其天然的三维结构相近。进一步，在A助催化剂中还鉴别到了表现出NAD糖水解酶活性的重组S1。用rS1的内含体粗制品或纯化的重组甲硫氨酰S4对小鼠进行免疫及加强(通过腹膜内注射)。所用的rS1亚基物质含有完全加工的多肽和未加工的前蛋白，比例大约为1∶2；这两种rS1分子的相对免疫原性还不了解。通过固相RIA测试血清样品中是否有抗毒素抗体(图5)。不管免疫剂量中是否含有完全Freund氏佐剂，接收重组S1的动物都表现出显著的抗毒素应答。仅以佐剂形式施用的重组S4，相对于加有佐剂的完整毒素和市售的百日咳疫苗来说也具有很强的免疫原性。
用完整的百日咳毒素处理CHO培养细胞导致“聚集的”形态学现象(Hewlett等人，见上)，这一现象所用抗毒素血清给以消除(Gellenius等人，见上)。在初步实验中，如上述制备并具有相对较高的抗毒素抗体滴度的针对rS1或rS4的小鼠血清，并不能在常规条件下中和CHO细胞对天然毒素的应答。
重组S1对小鼠的免疫保护
用粗制的重组S1，纯化的重组S4和合适的对照物质(见上)免疫的小鼠，经受百日咳博德特氏菌小鼠毒性株18323的脑内攻击，在攻击后记录长达45天的死亡率(图6)。通过腹膜注射用50μg测试物质(100μl以1∶35稀释的市售百日咳疫苗)对小鼠免疫；接种后21天再用等量物质给予加强，7天后用存活的百日咳博德特氏菌18323株(每只动物3×104个细胞)进行脑内攻击。尽管没有期望保护作用，因为在重组制剂中缺乏具有活性的全毒素，但令人惊奇地观察到，rS1免疫的动物相对于未免疫的对照来说存活期延长了。进一步，若干接受佐剂化rS1的小鼠完全抵抗住了攻击；用佐剂化rS4免疫的小鼠，尽管表现出良好的抗体应答(见图5)，但得到的保护并不比未免疫的小鼠好。在另一个初步实验中，佐剂化的rS1似乎能针对攻击诱发剂量应答性保护作用。在脑内攻击检测中，不完全保护作用的原因可能是在免疫物质中缺乏活性全毒素；然而，此初步研究中达到的保护作用证实，S1重组蛋白具有作为亚基疫苗物质的潜力。后面的研究还没有证实针对百日咳博德特氏菌小鼠毒性18323株的脑内攻击的免疫保护作用。
S1类似物
利用蛋白质工程和位点专一性诱变技术，制备截断的S1类似物。发现以缬氨酸7和脯氨酸14为界的区域是S1分子ADP核糖基转移酶活性的必需区域。与单克隆结合的抗原决定簇(例如，涉及诱发保护性应答的抗原决定簇)至少有部分位于以缬氨酸7和脯氨酸14为界(包括二者)的区域之内，所述抗体在小鼠中针对毒素活性具有被动保护作用。在以缬氨酸7和脯氨酸14为界(包括二者)的区域中使S1分子诱变，产生的S1类似物分子没有酶促活性，但保留有保护性的抗原决定簇。保护性抗原决定簇对于针对百日咳毒性提供免疫保护作用是很重要的。对缬氨酸7至脯氨酸14的区域进行修饰，包括一个或多个氨基酸的置换和/或缺失，能使S1类似物产品能够诱发毒性中和水平的抗体，并基本上不含有反应原组分。
PTXS1基因亚克隆入pUC18中
含有百日咳博德特氏菌毒素(PTX)完整操纵子的质粒pPTX42，是作为转化的JM109细胞由J.Keith(NIAID，Rocky Mountain Laboratory)处得到的。使细菌培养在含有氨苄青霉素的L-肉汤中，根据标准方法(Maniatis等人，见上)回收和纯化质粒。通过用限制性酶AvaI和XbaI消化质粒，从pPTX42中分离出含有部分PTXS1基因(顺反子)的792-bpDNA片段(Locht和Keith，见上)，进行丙烯酰胺凝胶电泳，然后从胶带上洗脱DNA片段。此DNA片段始于刚好位于前S1蛋白可译框架之内的AvaI位点，止于S1终止密码处的XbaI位点。还用AvaI和XbaI消化标准的克隆载体pUC18，用磷酯酶处理消化产物。利用T4 DNA连接酶和标准条件，用消化的pUC18载体、pPTX42的79-bp DNA片段(AvaI-XbaI)进行连接反应。用连结混合物转化新鲜的感受态DH52α细胞，在含有氨苄青霉素和“Blue-gal”(Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD)的L-肉汤培养基琼脂平板上选择转化体。选择到12个白色集落，平板复制后以2ml液体培养物生长。细胞通过标准的碱性溶解法进行“微量制备”，用AvaI和XbaI消化DNA，使消化产物进行丙烯酰胺凝胶电泳。
rPTXS1表达质粒pPTXS1/1的构建
如前述从质粒pPTX42中分离792bp的AvaI-XbaI片段。大肠杆菌表达质粒pCFM1156和pCFM1036得自Charles F.Morris(Amgen Inc.，ThousandOaks，CA)。用限制性酶SstI和NdeI消化质粒pCFM1156，通过从琼脂糖凝胶电泳洗脱至NA45滤纸(Schleicher & Schuell，Keene，N.H.)上分离到1.8Kb的DNA片段。用SstI和XbaI消化质粒pCFM1036，通过同样方法分离到2.8Kb的DNA片段。通过Caruthers等人(见上)的氨基膦化学法，合成寡聚脱氧核苷酸人工接头的两条互补链，从而重新组成S1可译框架中的缺失部分。合成片段的顺序一方面保留真正的氨基酸顺序，一方面使其所用密码本能降低信使RNA二级结构的潜力；一个例外的情况是用丝氨酸密码置换前蛋白信号顺序中的第2位氨基酸半胱氨酸密码，以消除前蛋白信号和成熟蛋白41和199处的两个半胱氨酸残基之间的任何二硫桥相互作用。此寡聚脱氧核苷酸人工接头具有一个NdeI粘性位点(用于pCFM1156)及一个AvaI粘性末端(用于连接S1基因的792bp DNA片段的AvaI位点)。此寡聚脱氧核苷酸的顺序如下：
   5′TATGCGTTCTAC 3′
      3′ACGCAAGATGAGCC 5′
用T4 DNA连接酶和pCFM1036的2.8KbDNA片段、pCFM1156的1.8Kb DNA片段，含有S1基因片段的792-bp DNA片段和寡聚脱氧核苷酸人工接头进行连接反应。连接以后，用连结混合物转化FM6细胞(得自C.F.Norris，Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA)，在含有卡那霉素的L-肉汤培养基琼脂平板上培养。选择集落，根据碱性法(Naniatis等人，见上)进行平板复制和微量制备。使微量制备的DNA样品作限制性酶切图谱，发现它具有所期望的DNA限制性片段。通过DNA顺序分析，评价从合成的人工接头至真正的S1基因可译框架的区域。此质粒经过随后的诱导导致S1重组蛋白的高水平表达。
rPTXS1表达质粒pPTXS1/2的构建
通过AccI和SphI消化，从质粒pPTXS1/1分离181bp的DNA片段；然后在聚丙烯酰胺凝胶上纯化此DNA片段。此DNA片段位于S1基因内部的左手部分。利用同样的方法，从PTXS1中分离出代表该基因剩余的右手部分的564bp片段，并克隆至p.UC18中。这是通过下述完成的：用SphI和BamHI消化质粒，BamHI酶切割S1克隆位点(XbaI)的下游，即位于pUC18克隆片段之内的BamHI位点。通过限制性酶NdeI、SstI和BamHI消化，用琼脂糖凝胶电泳分离及DNA片段的电泳洗脱，从表达载体pCFM1156中分离1.8Kb和2.8Kb的DNA片段。合成一个寡聚脱氧核苷酸人工接头；此双链人工接头具有NdeI和AccI粘性末端和下述顺序：
5′TATGGACGATCCACCTGCTACCGT3′
   3′ACCTGCTAGGTGGACGATGGCATA5′
利用来自pPTXS1/S的181-bp(AccI-SphI)和564-bp(SphI-BamHI)DNA片段，来自pCFM1156的1.8Kb(NdeI-SstI)和2.8Kb(SstI-BamHI)DNA片段，寡聚脱氧核苷酸人工接头和T4 DNA连接酶，根据标准方法(Maniatis等人，见上)进行连接反应。连接之后，用混合物转化新鲜的感受态FM5细胞。得到卡那霉素抗性的转化体，用质粒DNA的微量制备物进行限制性酶分析，结构的证实是通过结合处DNA顺序分析进行的。
pPTXS1/2的Bal31消化及具有截断S1基因的载体的构建
为了评价重要的抗原决定簇及成熟S1分子氨基末端附近的酶促活性位点，制备了此蛋白质的截断部分。用NdeI消化表达质粒pPTXS1/2，在标准条件下用核酸外切酶Bal31(IBI)处理，在长达110分钟内的不同时间取出等分试样。在65℃下使Bal31纯化15分钟后，通过琼脂糖凝胶电泳分析样品中的泳动的上升。合并100分钟和110分钟收集的样品(组分A)，再合并剩余的样品并再用Bal31消化；在长达180分钟的不同时间取出等分试样。使反应终止后，再次检查等分试样中泳动的上升，得到另外4个组分(B、C、D和E)。用SstI单独消化所有5种组分，从琼脂糖凝胶中通过电泳洗脱分离3-3.5Kb的DNA片段。
用SstI和HpaI消化表达载体pCFM1156，用同样方法分离1.8Kb的DNA片段。在标准条件下，利用T4 DNA连接酶将来自pPTXS1/2的每一种3-3.5KbDNA片段(Bal31平头-SstI)与1.8Kb的DNA片段(SstI-HpaI)连接。用每一种连接混合物转化新鲜的感受态FM5细胞，分离卡那霉素抗性转化体。挑出组分A和B截断物的转化体，在42℃下诱导微量制备物，用光学显微镜检查制剂中是否存在内含体。内含体阳性的制剂进行微量制备，用XbaI消化，通过琼脂糖凝胶电泳检查DNA插段的大小。选择大小范围在600-650bp的样品进行DNA顺序测定，以证实截断物的结构。随后对表达的重组蛋白所作分析表明，S1分子ADP-核糖基转移酶活性和涉及诱发保护性应答的抗原决定簇(即与单克隆抗体结合的抗原决定簇，该抗体能在小鼠中被动地抵抗毒素活性)的必需区域，位于成熟分子中以缬氨酸7和脯氨酸14(包括二者)为界的区域之内(全氨基酸顺序参见Locht和Keith，同上)。这些S1分子的截断部分，由于载体的构建，其氨基端都始于甲硫氨酰缬氨酰，后面则是截断的顺序。
S1的诱变
为了改变以缬氨酸7和脯氨酸14为界的区域，以产生没有酶活性的S1分子类似物，同时保留这一区域中的保护性抗原决定簇，使重组的S1基因进行诱变。保护性决定簇的保留是通过与单克隆抗体1B7的反应性定义的。这是通过用合成的寡聚脱氧核苷酸片段置换残基缬氨酸7至脯氨酸14的真正编码区而完成的。这些片段中含有一个或两个密码置换以改变真正的氨基酸顺序。通过缺失和/或置换能够进行修饰。改变单一碱基以得到S1类似物的所需特性是在本发明范围之内。能够改变单一碱基以修饰氨基酸顺序。但本领域的专业人员将认识到，改变单一碱基与改变至少两个碱基相比较，基因型回复至野生型的统计学可能性更大。因此，在一优选方案中，这些密码变化中的每一个都至少涉及一个密码中两个碱基的置换，以降低回复的效率。合成具有AccI和BspMII粘性末端的寡聚脱氧核苷酸人工接头，它们含有真正的S1顺序，但具有表1所述人工接头中指出的密码有如下改变：
               表1
构建体：pPTXS1(6A-3/5-1)
密码改变：tyr8至Phe
寡集脱氧核苷酸人工接头顺序：
5′ATTCCGCTATGACTCCCGCCCG3′
   3′AGGCGATACTGAGGGCGGGCGGCC5′
构建体：pPTXS1(6A-3/4-1)
密码改变：arg9至lys
寡聚脱氧核苷酸人工接头顺序：
5′ ATACAAGTATGACTCCCGCCCG3′
    3′TGTTCATACTGAGGGCGGGCGGCC5′
构建体：pPTXS1(6A-3/3-1)
密码改变：asp11至glu
寡聚脱氧核苷酸人工接头顺序：
5′ATACCGCTATGAATCCCGCCCG3′
   3′TGGCGATACTTAGGGCGGGCGGCC5′
   表1(续)构建体：pPTXS1(6A-3/2-2)密码改变：Ser12至gly寡聚脱氧核苷酸人工接头顺序：5′ATACCGCTATGACGGCCGCCCG3′3′TGGCGATACTGCCGGCGGGCGGCC5′构建体：pPTXS1(6A-3/1-1)密码改变：arg13至lys寡聚脱氧核苷酸人工接头顺序：5′ATACCGCTATGACTCCAAGCCG3′3′TGGCGATACTGAGGTTCGGCGGCC5′构建体：pPTXS1(6A-3/8-1)密码改变：tyr8至leu以及arg9至glu寡聚脱氧核苷酸人工接头顺序：5′ATTGGAATATGACTCCCGCCCG3′3′ACCTTATACTGAGGGCGGGCGGCC5′构建体：pPTXS1(6A-3/7-2)密码改变：arg9至asn以及ser12至gly寡聚脱氧核苷酸人工接头顺序：5′ATACAACTATGACGGCCGCCCG3′3′TGTTGATACTGCCGGCGGGCGGCC5′
        表1(续)构建体：pPTXS1(6A-3/6-1)密码改变：asp11至Pro以及Pro14至asp寡聚脱氧核苷酸人工接头顺序：5′ATACCGCTATCCGTCCCGCGAC3′3′TGGCGATAGGGAGGGCGCTGGGCC5′
为了构建表达质粒，通过电泳洗脱从琼脂糖凝胶中分离下述DNA片段。
1)来自pPTXS1(6A)的1824-bp DNA片段(AccI至SstI)，该质粒如前述构建，它表达重组S1的类似物分子，该分子缺失了门冬氨酸1和门冬氨酸2，并由甲硫氨酰缬氨酰所置换；
2)来自pPTXS1(33B)的3.56Kb DNA片段(SstI至BspMII，该质粒如前述构建，它表达S1的重组类似物，该类似物缺失了最初14个氨基酸残基并以甲硫氨酰缬氨酰置换。在此特殊的基因构建中，平头末端连接使此前面缩短的分子中产生一个新的BspMII位点。此限制位点不存在于天然的S1顺反子元素中，使得能够使用带有AccI和BspMII粘性末端的相对较短的寡聚脱氧核苷酸人工接头产生诱变。
在标准的连接条件下，使这两个DNA片段与上述的单个的寡聚脱氧核苷酸片段连接。这些连接反应导致新的S1基因的建成：pPTXS1(6A)部分提供AccI限制位点的上游密码子，合成片段提供AccI和BspMII位点间的各种密码突变，pPTXS1(33B)部分则提供新的限制位点BsPMII下游的S1编码区的剩余部分。连接以后，用每种混合物转化新鲜的感受态FM5细胞的分离制备物。挑出转化体，以微量制备物生长，诱导产生重组蛋白，用光学显微镜鉴别内含体阳性样品。这些样品在诱导温度下以更大规模(1-6升)发酵，以制备更大量的各种重组类似物蛋白。细胞再悬浮于加有1mMDTT的蒸馏水中，然后分离细胞泥并用French压力溶解。通过简单的低速离心从这些溶解物中分离内含体。这些内含体蛋白制剂中含有少至30％，多至80％的重组蛋白。对每种制剂进行分析，检查其在Western印迹法(Burnette，见上)中与单克隆抗体B2F8结合的能力，此抗体是针对我们在研究中用截断的S1类似物鉴别出的优势决定簇的，及其与单克隆抗体1B7结合的能力，此抗体已知能被动保护小鼠抵抗毒性百日咳博德特氏菌的脑内攻击(Sato等人，见上)。还评价样品的ADP-核糖基转移酶活性。所获结果示于表2。
                       表225样品              抗体    结合   ADP-核糖基
                  B2F8    1B7    转移酶活性
无                -       -       -
PTX(市售品)       +       +       +
rPTXS(pPTXS1/1)   +       +       +
pPTXS1(6A-3/1-1)  +       +       +
pPTXS1(6A-3/2-2)  +       +       +
pPTXS1(6A-3/3-1)  +       +       +30pPTXS1(6A-3/4-1)  +       +       -
pPTXS1(6A-3/5-1)  +       +       +
pPTXS1(6A-3/6-1)  -       -       -
pPTXS1(6A-3/7-2)  -       -       -
pPTXS1(6A-3/8-1)  -       -       -
S1类似物4-1(Arg9→Lys)很少或没有表现出转移酶活性，但保留了与中和性单克隆抗体1B7反应的能力。只有在检测中提高4-1蛋白的用量，才能观察到极为少量的酶活性(图8A)；重复测定表明，S1类似物的专一性ADP-核糖基转移酶活性被降低了至少5000倍。测量与单残基置换突变有关的NAD-糖水解酶活性(图8B)所揭示的图形与评价ADP-核糖基转移酶所获相似。S1类似物4-1很少有或检测不到糖水解酶活性，表明此活性的降低幅度至少为50至100倍。
由于重组S1的类似物分子保留有与被动保护性单克隆抗体结合的能力(即保留有主要的保护性决定簇)，并缺少毒素活性的主要标志(即ADP-核糖基转移酶活性)，因此，如图7所示通过克隆的pPTXS1(6A-3/4-1)产生的这些类似物分子和其修饰物，能够作为安全而经济的亚基疫苗加以应用，单独或与其它PTX亚基结合均可。通过克隆pPTX51(6A-3/4-1)产生的S1类似物(其中用赖氨酸置换了精氨酸9)，可用来说明具有为安全的亚基疫苗所必需的性质的rS1类似物。6A-3/4-1的其它类似物可以包括(例如)，在位置1和2处的门冬氨酰门冬氨酰残基，在位置0、1和2处的甲硫氨酰门冬氨酰门冬氨酰残基，以及在位置0、1和2处的甲硫氨酰缬氨酰门冬氨酰残基。
现行的非细胞疫苗含有S1、S2、S3、S4和S5亚基。最近的研究表明，百日咳毒素对培养的哺乳动物细胞产生的形态变化是S1亚基的性质(Burns等人，1987，Infect.Immun.55：24-28)，但此效应只是在存在有B寡聚体时得到证实。此处所述的初步研究证实了这样的可行性：即使用rS1类似物的单一亚基疫苗，它保留有主要的保护性决定簇但缺乏毒素活性。S1类似物还能与亚基S2、S3、S4和S5结合应用。这些亚基可能扩大对于S1的免疫应答，它们本身也可能具有保护性决定簇。含有S1亚基类似物的疫苗能够进一步包括博德特氏菌外毒素的至少一种所述的亚基S2、S3、S4、S5和其混合物，此疫苗也在本发明范围之内。S2、S3、S4和S5能够是来自百日咳博德特氏菌的亚基，或基因工程构建的亚基和其类似物。基因工程构建的亚基产物能够包括融合蛋白和非融合蛋白。
为了下面部分所述的实验目的，我们改变了表达系统以产生S1亚基类似物(S1/1-4)，它具有精氨酸9至赖氨酸的置换，但在其氨基末端同时具有天然的门冬氨酰门冬氨酸残基。
S1/1-4类似物及S1/1的生物活性的评价
通过包括细胞破碎、离心、脲增溶，离子交换层析和凝胶过滤层析的程序，由大肠杆菌生产细胞中分开分离天然顺序(S1/1)和类似物S1/1-4(如上所述，含有Arg9至Lys的置换和天然顺序的门冬氨酰门冬氨酸氨基末端残基的重组S1蛋白。细胞泥悬浮于25mM Tris缓冲液中(PH8.5)，并通过高压破碎(French压力)溶解。使溶解液离心，不溶的沉淀(含有重组的S1蛋白)溶于8M脲、25mM Tris PH8.5中。加入浓度为50μM的CuSO4后，过夜搅动混合物，使之在重组S1蛋白中形成二硫键。用等体积的8M脲，25mM柠檬酸钠PH3.8稀释混合物，上到用8M脲(PH3.8)平衡的S-Sepharose(“快流”型)柱中。柱子用在8M脲、12.5mM柠檬酸钠PH3.8中的Nacl线性梯度(0-0.5M)洗脱。从每个柱中收集宽峰，滴定至PH7.5。这些层析组分的收集液分别上到用2M脲、10mM磷酸钾PH7.5平衡的Sephacryl S-200柱中，收集洗脱物质中代表每种分子(S1/1和S1/1-4)氧化单体型的重组S1蛋白的组分。纯化的S1亚基蛋白通过SDS-PAGE分析，随后对凝胶中的蛋白进行银染色(图9)。使凝胶(12.5％的丙烯酰胺)在还原条件下电泳。泳道1，分子量标准(pharmacia)。泳道2，2μg百日咳博德特氏菌全毒素(List Biological Laboratories)。泳道3，0.2μg百日咳博德特氏菌S1亚基蛋白(List BiologicalLaboratories)。泳道4，0.2μg重组的S1/1。泳道5，0.2μg重组的S1/1-4。泳道6，空白。泳道7，0.4μgS1亚基蛋白(List)。泳道8，0.4μg重组的S1/1。泳道9，0.4μg重组的S2/1-4。在此制备片段，重组S1分子的纯度大于90％。
为了评价S1中Arg9→Lys突变的生物学活性，必须将突变类似物和天然顺序的重组S1蛋白结合进百日咳全毒素分子中。高度纯化的百日咳毒素B寡聚体(毒素亚基S2、S3、S4和S5的五聚体结构)是由D.Burns(Center for BiologicsEvaluation and Research，Food and DrugAdministration)提供的。通过下述方法，使两种不同的S1亚基分子分别与B寡聚体结合以形成全毒素分子(含有S1/1或S1/1-4)。使等摩尔数量重组S1分子和B寡聚体在2M脲、10mM磷酸钾PH7.5的溶液中结合，于37℃下保温30分钟。通过在自然的丙烯酰胺凝胶中的电泳评价全毒素的形成(图10)。凝胶1，重组S1/1和天然寡聚体。凝胶2，重组S1/1-4和天然的B寡聚体。凝胶3，天然的B寡聚体。凝胶4，天然的百日咳博德特氏菌全毒素。凝胶5，重组的S1/1。胶带表明全毒素分子是由天然B寡聚体和重组S1/1或重组S1/1-4的结合而装配的。
然后检查半重组全毒素(B寡聚体加工S1/1或类似物S1/1-4)体外诱发仓鼠卵巢(CHO)细胞的聚集应答的能力；此应答已表明是百日咳毒素细胞致病性的量度。将实验样品和合适的对照样品稀释至CHO细胞培养基中(Dulbecco改变的Eagle培养基，含有10％小牛血清)，通过超滤消毒，在96孔塑料培养皿中通过一系列转移进一步稀释。在每孔中加入大约5-7×103刚用胰蛋白酶处理的CHO细胞(美国典型培养物收集中心CCL61，CHO-K1细胞)，培养皿在5％CO2中于37℃保温48-72小时。用磷酸缓冲液洗涤细胞单层，用紫晶染色，通过光学显微镜检查是否存在细胞聚集现象。
图11给出了此分析的结果；特别有趣的是图G、H和J的结果，它们与S1/1-4类似物有关。单独用S1/1-4类似物，及稀释1600倍的由S1/1-4类似物和B寡聚体形成的全毒素都没有表现出细胞聚集，稀释200倍时表现出可以忽略的聚集。图A是仅用稀释200倍的缓冲液处理的细胞。图B仅用B寡聚体处理，稀释度为1/200；此浓度下可观察到少量聚集，可归因于纯化后残留的天然S1亚基污染物。图B可与同孔中的另一区域相比较(图I)，清楚表明B寡聚体制剂在1/200稀释度时的聚集活性。图C是用天然的商品级S1亚基(List Biologicals)以1/2000稀释度处理的细胞。图D是以1/2000稀释的天然的商品级百日咳全毒素(List Biologicals)，表明百日咳毒素对于培养中的CHO细胞有显著的细胞病理效应。图E是以1/2000稀释的天然顺序的重组S1亚基(S1/1)。图F是1/2000稀释的S1/1和B寡聚体的结合物；CHO细胞的聚集效应似乎与用天然的全毒素一样显著，并支持表明B寡聚体和重组S1蛋白结合的全毒素的物理凝胶结果(见上)。图G说明Arg9→Lys突变的S1/1-4本身对CHO细胞没有效应。图H表明以1/1600稀释的由S1/1-4类似物和B寡聚体形成的全毒素没有CHO细胞聚集效应。以1/200稀释时(图J)，能够观察到通过含有S1/1-4全毒素的某些聚集；但是，与B寡聚体本身在同样稀释度下的效应(图I)比较，S1类似物分子对聚集效应的贡献似乎可以忽略。
已经进行了初步实验，以定量确定为诱发CHO细胞聚集现象所需的各种百日咳毒素分子的有效浓度。初步结果表明，市售的百日咳毒素和含有重组S1/1的全毒素都能在低至0.25-0.30ng/ml的浓度下导致细胞聚集，与此相反，为了诱导聚集效应，含有S1/1-4类似物的全毒素的必需浓度至少是10-25ng/ml。
这些结果证实，百日咳毒素的细胞毒性效应存在于S1亚基部分，它直接与其酶促活性相关。更重要的是这些实验表明，能够从通过定位诱变产生的专一性重组毒素亚基形成相对无毒的百日咳毒素分子。
本发明应当包括所有这种变化和改进，只要它们落入本发明的权利要求范围内。

Claims (7)

1.一种生产包括已通过精氨酸9的位点专一性诱变而由赖氨酸代替精氨酸得到的博德特氏菌外毒素S1亚基类似物的多肽的方法，其中所述的类似物(a)具有诱发毒素中和水平的抗体的能力和(b)不具有与毒素反应原性相联系的酶活性，所述方法包括：
在合适的营养物条件下使经包括编码所述多肽的DNA顺序的DNA载体转化或转染的原核或真核宿主细胞进行生长，以及
分离所述载体中所述DNA顺序表达的所需多肽产物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的毒性中和水平抗体提供针对百日咳毒性的免疫保护作用。
3.根据权利要求1的方法，其中所述博德特氏菌外毒素是百日咳博德特氏菌。
4.根据权利要求1的方法，其中宿主细胞是原核细胞。
5.根据权利要求4的方法，其中原核宿主细胞是大肠杆菌。
6.一种生产对抗百日咳的疫苗的方法，其中包括按照权利要求1-5中任一项的方法生产多肽，将所述多肽与可药用的载体或辅助剂或二者混合。
7.根据权利要求6的方法，其中所述疫苗包括博德特氏菌外毒素中的亚基S2、S3、S4和S5中的各种。
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