FI101632B - Menetelmä Bordetella pertussis-toksiinin alayksikön analogien valmista miseksi ja niitä koodaavia rekombinantti-DNA-molekyylejä - Google Patents
Menetelmä Bordetella pertussis-toksiinin alayksikön analogien valmista miseksi ja niitä koodaavia rekombinantti-DNA-molekyylejä Download PDFInfo
- Publication number
- FI101632B FI101632B FI892131A FI892131A FI101632B FI 101632 B FI101632 B FI 101632B FI 892131 A FI892131 A FI 892131A FI 892131 A FI892131 A FI 892131A FI 101632 B FI101632 B FI 101632B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- recombinant
- toxin
- subunit
- subunits
- analog
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 title claims description 57
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 title claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 17
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 19
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 claims abstract description 10
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 claims abstract description 10
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 55
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 37
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 13
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 12
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 abstract description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 29
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 22
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 229930186900 holotoxin Natural products 0.000 description 16
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 15
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 15
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 14
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 13
- 108010049290 ADP Ribose Transferases Proteins 0.000 description 12
- 102000009062 ADP Ribose Transferases Human genes 0.000 description 12
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 241000894007 species Species 0.000 description 12
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 11
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 11
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 11
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 7
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 101001028244 Onchocerca volvulus Fatty-acid and retinol-binding protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 101150021746 SI gene Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 5
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000007888 toxin activity Effects 0.000 description 5
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108010000193 NAD+ Nucleosidase Proteins 0.000 description 4
- 102000002250 NAD+ Nucleosidase Human genes 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000917014 Bordetella pertussis 18323 Species 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 101000679617 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) Pertussis toxin subunit 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091029480 NONCODE Proteins 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 101150027674 S1 gene Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 101150023807 copB gene Proteins 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PWJFNRJRHXWEPT-UHFFFAOYSA-N ADP ribose Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(O)C(O)C(O)C=O)C(O)C1O PWJFNRJRHXWEPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRNWOUGRCWSEMX-KEOHHSTQSA-N ADP-beta-D-ribose Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SRNWOUGRCWSEMX-KEOHHSTQSA-N 0.000 description 1
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- FRYULLIZUDQONW-UHFFFAOYSA-N Aspartyl-Aspartate Chemical group OC(=O)CC(N)C(=O)NC(CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 101100481524 Escherichia phage N15 gene 20 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- BJFJQOMZCSHBMY-YUMQZZPRSA-N Met-Val Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BJFJQOMZCSHBMY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101800000515 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101800004803 Papain-like protease Proteins 0.000 description 1
- 101800002227 Papain-like protease nsp3 Proteins 0.000 description 1
- 101800001074 Papain-like proteinase Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 101710125805 Pertussis toxin subunit 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101710084578 Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 description 1
- 102000006612 Transducin Human genes 0.000 description 1
- 108010087042 Transducin Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 241000394480 Viola elatior Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- XQJHRCVXRAJIDY-UHFFFAOYSA-N aminophosphine Chemical compound PN XQJHRCVXRAJIDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 229940052491 bordetella pertussis Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229950003188 isovaleryl diethylamide Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 101150055347 repA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K2039/10—Brucella; Bordetella, e.g. Bordetella pertussis; Not used, see subgroups
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
1 101632
Menetelmä Bordetella pertussis-toksiinin alayksikön analogien valmistamiseksi ja niitä koodaavia rekombinantti-DNA-molekyylejä 5 Keksinnön tausta
Keksinnön kohteena on menetelmä Bordetella pertus-sis-bakteerin eksotoksiinin alayksikön SI polypeptidianalo-gin valmistamiseksi, jossa on paikkaspesifinen mutaatio luonnon aminohapposekvenssin väliini 7:n ja proliini 14:n 10 rajaamalla alueella siten, että analogi kykenee synnyttä mään toksiinia neutraloivia vasta-ainepitoisuuksia sen ollessa vapaa toksiinin reaktiivisuuteen liittyvästä entsyymiaktiivisuudesta. Keksintö koskee myös mainittuja analogeja koodaavien rekombinantti-DNA-molekyylejä.
15 Kyseinen keksintö tarjoaa Bordetella-eksotoksiinin
Sl-alayksikköanalogien korkean tason suoran rekombinantti-ilmaisun E. colissa ilman, että joudutaan turvautumaan fuusioihin heterologisten proteiinien osiin. Erityisesti alayksikköjen geenimanipuloidut modifikaatiot muodostavat luo-20 kan Bordetella-toksiinianaloaeia. jotka kykenevät synnyttä mään toksiinia neutraloivia vasta-ainepitoisuuksia ja jotka ovat oleellisesti vapaita reaktogeenisistä aineosista. Gee-nimanipuloituja alayksikköjä voidaan käyttää alayksikköro-kotteen tai -rokotteiden tuottamiseksi, jotka omaavat vas-25 tustuskykyä lisäävää (immunogeenistä) tehoa ja ovat oleel lisesti vapaita reaktogeenisistä aineosista.
Ilmaisulla Bordetella-eksotoksiini tarkoitetaan ryhmää toksiineja, joita koodaavat eri Bordetella-laiien geno-mit, kuten B. oertussiksen. B. parapertussiksen ja B. bron-30 chiseptican. Muita käytettyjä Bordetella-eksotoksiineia • merkitseviä ilmaisuja ovat pertussis- eli hinkuyskätoksiini (PTX), lymfosytoosia edistävä tekijä (LPF) ja saarekkeita aktivoiva proteiini (IAP).
Hinkuyskä on edelleen tärkeä lapsisairastuvuuden ja 35 -kuolleisuuden aiheuttaja useissa osissa maailmaa. Borde- 2 101632 telia pertussis -kokosolurokotteet ovat tarjonneet tehokkaan keinon tämän sairauden kontrollointiin. Näiden rokotteiden käyttö on kuitenkin ollut suorassa yhteydessä lieviin sivuvaikutuksiin, jolloin käyttöön on ajoittain liit-5 tynyt vakavampia, silloin tällöin kohtalokkaita neurologi sia sattumuksia.
Mittavia ponnistuksia on uhrattu yritykseen tämänhetkisiin rokotteisiin liittyviksi tiedettyjen haitallisten sivuvaikutuksien eliminoimiseksi. Nämä ponnistukset ovat 10 johtaneet soluttomien rokotteiden tuottamiseen ja testaa miseen sekä perustutkimuksessa pyrkimykseen kehittää turvallisempia rekombinanttituotteita. Rekombinantti-DNA-per-äisen rokotteen kloonaukseen ja kehittämiseen johtava k-riittinen ensimmäinen askel oli hinkuyskätoksiinioperonin 15 sekvenssointi ja sen jälkeinen yksittäisten alayksiköiden aminohapposekvenssien päätteleminen. (Locht, C. ja Keith, J.M., Science 232 (1986) 1258-1264; Locht et.ai.. Nucl.-
Acids Res . 14 (1986) 3251-3261; ja Nicosia et.ai.. Proc.-Natl.Acad.Sci. USA 83. (1986) 4631-4635) .
20 Nicosia et.ai. (Infect.Immun. 55 (1987) 963-967) osoittivat, että Bordetella pertussiksen kutakin alayksikköä SI, S2, S3, S4 ja S5 koodaava mRNA voitiin tehokkaasti transkriptoida kloonatuista geeneistä E. colissa. Vaikka he esittivät, että oli saatu natiivin hinkuyskätoksiinin poly-25 kistronilähetin voimakas transkriptio, suoraan ilmaisemalla tuotetut proteiinimäärät olivat hyvin alhaisia tai ei-todettavia. Lisäksi sittemmin syntetisoidut fuusioproteiinit eivät kyenneet synnyttämään minkäänlaista neutraloivaa tai suojaavaa immuunivastetta.
30 Barbieri et.ai. (Infect.Immun. 55 (1987) 1321-1323) : osoittivat SI-alayksikön ilmaisun fuusioproteiinina E. co lissa . Tämä fuusioproteiini sisältää β-galaktosidaasin ensimmäiset kuusi aminohappoa, viisi pUC18-polyliittäjän koodaamaa aminohappoa ja sen jälkeen SI-alayksikön aminohapot 35 2 - 235. SI-fuusioproteiini, jota muodostui pieniä määriä, 3 101632 omasi vain noin 25 % alkuperäisen tai natiivin hinkuyskä-toksiinin ADP-ribosyylitransferaasiaktiivisuudesta.
Loch et.ai. (yhteenveto, Modern Approaches to New Vaccines, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har-5 bor, New York, syyskuu 9-14, 1986) kykenivät ilmaisemaan fuusioproteiinin, joka sisälsi SI-alayksikön aminohapot 2 - 187. He ennustivat, että rakenne ei omaisi toksiiniak-tiivisuutta, koska he arvelivat siitä puuttuvan ADP-ribo-syylitransferaasiin liittyvän NAD-sitoutumiskeskuksen, jol-10 loin kyseisen entsyymiaktiivisuuden arvellaan olevan tok siinin reaktogeenisyydestä vastuussa. Myöhemmät kokeet tällä molekyylilla osoittivat tämän typistetyn lajin omaavan oleellisesti vähentymättömän entsyymiaktiivisuuden. Mikään alalla aiemmin tunnetuista alayksiköistä tai alayksikköana-15 logeista ei kykene synnyttämään toksiinia neutraloivia vas ta-ainepitoisuuksia ja niiltä puuttuu oleellisesti reakto-geenisyyteen liittyvä entsyymiaktiivisuus.
Lyhyt kuvaus piirroksista
Kuvio 1 on kaaviollinen esitys PTX-operonin kistro-20 nijärjestyksestä (alan tekninen taso, Locht ja Keith, supra) . Alueet, jotka on merkitty SI, S2, S4, S5 ja S3, o- soittavat kullekin näistä PTX-alayksiköistä esitetyn avoimen lukualueen. Juuri kutakin kistronia edeltävä mustattu alue merkitsee oletettua signaalisekvenssiä. Kustakin k-25 istroniyksiköstä välittömästi alavirtaan sijaitseva rest- riktioentsyymikeskus merkitsee tuota kistronia ilmaisuvek-toriin alakloonattaessa käytettyä alavirta-restriktiokes-kusta. Juuri kunkin signaalisekvenssialueen sisäpuolella sijaitsevaa restriktioentsyymikeskusta käytettiin ylävirta-30 restriktiokeskuksena alakloonattaessa täysimittainen kist- : roni ilmaisuvektoriin käyttäen tarkoituksenmukaista oligo- deoksinukleotidiliittäjää epäkypsän PTX-alayksikön tuottamiseksi ehyen signaalisekvenssin käsittävänä. Juuri kunkin kypsän PTX-alayksikön avoimella lukualueella sijaitsevaa 35 restriktioentsyymikeskusta käytettiin tarkoituksenmukaista « 4 101632 oligodeoksinukleotidiliittäjää käyttäen ylävirta-restrik-tiokeskuksena kistronin alakloonaamiseksi ilman koodattua signaalisekvenssiään metionyyli-kypsän PTX-alayksikön tuottamiseksi .
5 Kuvio 2 on SDS-polyakryyliamidigeeli ja Western blot rekombinantti-PTX-alayksiköistä. Vasemman puoleinen paneeli A on Coomassie Brilliant Blue -värjätty geeli rekombinantti -PTX-alayksiköistä, joita oli muodostunut mitattavia määriä; paneeli A oikealla on Western blot vastaavasta geelis-10 tä, jossa käytettiin kaniinin polyklonaal is ta PTX-vastaista yli-immuuniseerumia. Kaupallista hinkuyskätoksiinia sisältävät vyöhykkeet on merkitty PTX:llä. Nämä tulokset osoittavat, että rekombinantti- (r-) Siitä, S2:ta, S3:a jaS5:tä kutakin muodostui merkittäviä määriä. Western blot osoit-15 taa, että rSl on täysin prosessoitu esiproteiinilajistaan, rS2 ja rS5 ovat osittain prosessoituja ja rS3:a ei ole oleellisesti prosessoitu käytetyissä fermentointiolosuh-teissa; rS4:ää ei muodostunut riittävää määrää sen visu-alisoimiseksi. Paneeli B esittää tuotteita ilmaisusta me-20 tionyyli-kypsinä rekombinantti- (rm-) alayksiköinä. Näitä alayksiköitä rmSlita (ei esitetty) lukuunottamatta muodostuu merkittäviä määriä.
Kuvio 3 on Western blot, josta ilmenee ylävirran ei-koodisekvenssien vaikutus rS2-ilmaisuun. Kuvioon liittyvät 25 yksityiskohdat on esitetty tekstissä.
Kuvio 4 on autoradiokuva SDS-polyakryyliamidigeelis-tä, josta ilmenee rekombinantti-SI:n ADP-ribosyylitransfe-raasiaktiivisuus. Rekombinantti-SI (500 ng) , puhdistettu natiivi hinkuyskätoksiini (1 μg) ja reaktiopuskuri saatet-30 tiin yksittäin reagoimaan nauta-transdusiinin kanssa : [32P] NAD m läsnäollessa oleellisesti kuten kuvanneet Manning et.ai.. J.Biol.Chem. 259 (1984) 749-756; West et.ai..
J.Biol.Chem. 260 (1985) 14428-14430). Näytteet saostettiin kylmällä, 10-% : isella trikloorietikkahapolla, minkä jälkeen 35 sakoilla suoritettiin SDS-PAGE-ajo, josta otettiin sitten s 101632 autoradiokuva. 39 kilodaltonin kohdalla näkyvä radioaktiivinen nauha on ribosyloitu transdusiini-alayksikkö. Vyöhyke A on reaktiopuskurikontrolli; vyöhyke B on natiivi PTX; vyöhyke C on rSl.
5 Kuvio 5 on graafinen esitys radioimmuunimääritykeis tä, ja siitä ilmenee rSl- ja rS4-alayksiköiden immunogee-nisyys hiirissä. Hiiriä yli-immunoitiin rekombinantti-Slrllä, metionyyli-rS4:llä, natiivilla hinkuyskätoksiinilla (PTX:llä), kaupallisella hinkuyskärokotteella tai täyteai-10 neella (NMS) jotkut valmisteet sisälsivät täydellistä
Freundin tehostetta (CFA:ta). Kerättyjen seeruminäytteiden laimennoksista määritettiin niiden PTX-vastainen tiitteri kiinteäfaasiradio-immuunimäärityksissä.
Kuvio 6 on graafinen esitys, josta ilmenee rSl:n ja 15 rS4:n immuunisuojapotentiaali hiirille B. pertussis -her- kistettä i.c. vastaan. Kuvioon liittyvät yksityiskohdat on esitetty tekstissä.
Kuvio 7 on pPTXSl(6A-3/4-1) ilmaisemalla saadulle rSl-mutantille päätelty aminohapposekvenssi.
20 Kuviot 8A ja 8B ovat graafisia esityksiä rekombi- nanttianalogi-Sl:n ADP-ribosyylitransferaasi- ja NAD-gly-kohydrolaasiaktiivisuuksista.
Kuvio 9 on autoradiokuva puhdistettujen Sl-alayksik-köproteiinien SDS-polyakryyliamidigeelistä.
25 Kuvio 10 on autoradiokuva natiivista, ei-pelkistä- västä, ei-denaturoivasta polyakryyliamidigeelistä, joka saatiin natiivi B-oligomeeri joko rekombinantti-Sl/1:een tai rekombinantti-Sl/1-4:ään yhdistämällä saaduille holo-toksiineille.
30 Kuvio 11 on valokuva soluyksikerroksista, joista etsittiin valomikroskoopilla solurykelmiä.
Keksinnön yhteenveto
Kyseinen keksintö tarjoaa rekombinantti-DNA-molekyy-lin, jolle on tunnusomaista että se koodaa Bordetella per-35 tussis-bakteerin eksotoksiinin alayksikön SI analogia, jos- 6 101632 sa on paikkaspesifinen mutaatio luonnon aminohapposekvenssin väliini 7:n ja proliini 14:n rajaamalla alueella siten, että analogi kykenee synnyttämään toksiinia neutraloivia vasta-ainepitoisuuksia sen ollessa vapaa toksiinin reaktii-5 visuuteen liittyvästä entsyymiaktiivisuudesta. Keksinnön mukaiselle menetelmälle tällaisten analogien valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 4 esitetään.
Polypeptidi-SI-alayksikkö, tai sen alayksikköanalo-10 git, käsittävät tärkeän epitoopin, jonka tiedetään olevan tärkeä hinkuyskätoksiinin myrkkyvaikutuksien vastaisen immuunisuojan muodostuksessa. Toksiinia neutraloivat pitoisuudet vasta-aineita tarjoavat immuunisuojan hinkuyskätoksiinin myrkkyvaikutuksia vastaan. Paikkaspesifisen muta-15 toinnin tuloksena saadaan Sl-alayksikköanalogi, joka on entsymaattisesti oleellisessa mielessä inaktiivinen.
Geenimanipuloitu Bordet el la-eksotoksiinin SI-alayksikkö, ja tämän alayksikön analogit, ovat rekombinantti-DNA-pohjaisia alayksikkörokotemateriaaleja, jotka soveltu-20 vat hinkuyskäsairauden ennaltaehkäisyssä käytettäviksi. Sl- alayksiköstä ja sen analogeista voidaan saada rokotetuot-teita, jolloin niitä käytetään joko yksinään tai yhdistettyinä alayksiköihin S2, S3, S4 ja S5 tai niiden seoksiin. Alayksiköt S2, S3, S4 ja S5 voidaan puhdistaa B. per-25 tussiksesta tai ne voidaan saada rekombinaatiotekniikkaa k- äyttäen fuusio- tai ei-f uusiotuotteina. Bordetella-eksotok-siinin alayksiköiden S2, S3, S4 ja S5 voimakkaaseen rekom-binantti-ilmaisuun on päästy E. colissa myös suorilla, ei-fuusiomenetelmillä. Vaihtoehtoisia rekombinantti-isäntiä, 30 mukaanlukien hiivat, esimerkiksi S. cerevisiae. sekä bak- : teeriorganismit, esimerkiksi Salmonella tvphimurium tai tvohi. Bacillus sp. . sekä virukset, esimerkiksi lehmänrok-kovirus, voidaan käyttää näiden alayksikköanalogien ilmaisemiseksi .
101632
Yksityiskohtainen kuvaus Jäljempänä kuvataan kaikkien rokotteen tuottamiseksi välttämättömien PTX-alayksiköiden voimakkaan suoran rekom-binantti-ilmaisun. Lisäksi Sl-alayksikköanalogit omaavat 5 biologista aktiivisuutta, joka on erittäin immunogeenistä sekä oleellisesti vapaata reaktogeenisistä ainesosista, jolloin nämä ainesosat ovat toksiinimolekyylin myrkyllisyyteen ja reaktogeenisyyteen liittyviä entsymaattisia aktiivisuuksia sekä B. pertussiksen ulkoisia ainesosia (esim. 10 endotoksiini), joita tavattaisiin B, pertussis -soluista uutetuissa rokotemateriaaleissa ja joiden tiedetään olevan reaktogeenisiä. Yksinään käytetyistä tai muihin PTX-alayk-siköihin yhdistetyistä SI-analogeista voidaan saada rokote-tuotteita, jotka ovat tehokkaita ja jotka alentavat huomat-15 tavasti ei-modifioiduissa natiiveissa tai rekombinaatiotek- niikalla saaduissa alayksiköissä esiintyvistä reaktogeenisistä ainesosista aiheutuvien sivuvaikutuksien esiintymis-todennäköisyyttä.
Bordetella pertussis -toksiinin kukin yksittäinen 20 alayksikkö SI, S2, S3, S4 ja S5 alakloonattiin ja ilmais tiin yksittäin suoraan E. colissa. Signaalisekvenssillä on ilmeisesti tärkeä osa rekombinantti-Sl:n (rSl:n) ilmaisussa. Signaalipeptidin puuttuessa E. colissa saatiin ilmaistuksi mitättömiä määriä rSlrtä. Jos esiproteiini käsittää 25 joko SI-alayksikön natiivin johtosekvenssin tai synteetti- sen johtosekvenssin, saadaan voimakas ilmaisu, joka on 10-30 % kokonaissoluproteiinista. Fermentoitaessa rSl:n ilmaisevia soluja tuotantomittakaavassa eräsyötöllä toimivassa 10 litran fermentorissa saatiin (ei-optimoidun ilmaisutason 30 ollessa 8 mg S1/0D-L) rSl:n lähes täydellinen proteolyytti- nen prosessointi sen kypsäksi muodoksi, kuten on esitetty kuviossa 2 . Fermentoitaessa ilmaisusoluja laboratoriomittakaavassa muodostui epätäydellisesti prosessoitua Sl:tä; sekä esiproteiinia että kypsää proteiinia todettiin solujen 35 logaritmisen kasvuvaiheen päätyttyä. Se, ettei synteetti- • 8 101632 nen, E. colissa lohkeava johtosekvenssi kyennyt parantamaan signaalin prosessointia, viittasi siihen, ettei epätäydellinen lohkeaminen ole seurausta siitä, että E. coli -joh-tosekvenssipeptidaasit tunnistivat epäyhteensopivalla ta-5 valla B. pertussiksen proteolyyttisiä lohkaisukeskuksia.
Se, ettei prosessointiestettä onnistuttu poistamaan, joko lisäämällä signaalipeptidaasin synteesiä käyttämällä soluja, jotka oli yhteistransformoitu voimakkaasti E. coli -johtopeptidaasin ilmaisevalla plasmidilla, tai alentamalla 10 Sl-ilmaisutasoa käyttämällä alhaisen kopioluvun omaavaa vektoria, osoitti, ettei ongelmana ole lohkeamisreitin kyllästys. Nämä tulokset osoittavat, että vierasproteiinien translaation jälkeistä prosessointia E. colissa säätelevät mahdollisesti kasvavan solun fysiologiseen tilaan liittyvät 15 mekanismit, joista olla huonosti perillä.
PTX-alayksiköt S2, S3, S4 ja S5 ilmaistiin vastaavalla tavalla E. colissa. kuten esitetty kuviossa 2. Samoin kuin rekombinantti-Sl, rS2-, rS3- ja rS5-alayksiköt vaikuttivat osoittavan epätäydellistä prosessointia laborato-20 riomittakaavassa. Koska rSl voitiin saada täysin prosessoi tuna tuotantomittakaavassa, samankaltaisia fermentoin-tiolosuhteita voidaan käyttää muiden alayksiköiden saamiseksi täysin prosessoidussa muodossa. Vastakohtaisesti rSl:een nähden rS4-alayksikkö voitiin ilmaista korkeina 25 pitoisuuksina kypsänä metionyylipolypeptidinä, jolloin sitä ei kuitenkaan ollut todettavissa ilmaistaessa se natii-veine johtopeptidisekvensseineen. Alayksiköt S2, S3, S4 ja S5 kukin on nyt ilmaistu kypsinä metionyylipolypeptideinä. Näiden molekyylien aminohappoanalyysi osoittaa, että kusta-30 kin lajista (S4:ää lukuunottamatta) heterologisen (ei-na- tiivin) metionyylijäännöksen poistaa oleellisesti solun metioniaminopeptidaasi, jolloin saadaan natiivin sekvenssin omaavia täysin kypsiä proteiineja. Metionyylijäännös ei tule oleellisesti poistetuksi rekombinantti-S4 :stä soluent-35 syymin aminopäätytunnistussekvenssin epäyhteensopivuuden 9 101632 johdosta. Kaikki nämä rekombinanttiproteiinit otettiin talteen solun sisäisinä kappaleina lyysin läpikäyneistä soluista. Alayksiköiden todettiin SDS-PAGEajossa omaavan oleellisesti alkuperäisiin natiiveihin alayksiköihin nähden 5 identtiset kulkeutumiskuviot tai reagoivan Western blot - määrityksissä monoklonaalisen ja polyklonaalisen tok-siinivastaisen seerumin kanssa. Kuten esitetty kuviossa 2, alayksiköiden SI, S2, S3, S4 ja S5 voimakkaaseen rekom- binantti-ilmaisuun E. colissa päästään käyttäen suoria, ei-10 fuusiomenettelyitä.
Vaikka vaihtoehtoisia menetelmiä ja materiaaleja voitaisiin käyttää kyseisen keksinnön käytännössä, seuraa-vaksi selostetaan edulliset menetelmät ja materiaalit. Kaikki tästä eteenpäin referoidut viitteet sisällytetään 15 tähän viitteinä.
Materiaaleja ja menetelmiä alayksiköiden SI, S2, S3, S4 ja S5 rekombinantti-ilmaisua varten
Materiaalit. DNA:ta modifioivat entsyymit hankittiin valmistajilta New England Biolabs (Beverly, MA), Bethesda 20 Research Laboratories (Gaithersburg, MD) , Boehringer Mann heim Biochemicals (Indianapolis, IN) ja International Biotechnologies, Inc. (New Haven, CT); entsyymejä käytettiin valmistajien ohjeiden mukaan. Kaikki kemikaalit ja biokemi-kaalit olivat analyysipuhdasta reagenssilaatua. Puhdistettu ; 25 hinkuyskätoksiini PTX hankittiin valmistajalta List Biolo gical Laboratories, Inc. (Campbell, CA) . Synteettiset oli-gonukleotidit syntetisoitiin Caruthersin mukaan (kirjassa Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments, H.G. Gussen ja A. Lang (toim.), Verlag Chemie, Weinheim, Länsi-30 Saksa, 1982, ss. 71-79). Täydellisen PTX:n vastainen kanii nin vastaseerumi tuotettiin valmistajalla Antibodies, Inc.
« : (Davis, CA) ja laitoksen NIAID Rocky Mountain Laboratory monoklonaaliset, natiivi-PTX:n alayksiköiden vastaiset vasta-aineet tuotettiin vakiomenetelmillä (Kohler ja Milstein, 35 Nature 256 (1975) 495-497; Nowinski et.ai. . Virology 93 * · 10 101632 (1979) 111-126). Radiojodattu proteiini-A ja kaniinin hii-rivastainen IgG hankittiin valmistajalta New England Nuclear (Wilmington, DEL). Monoklonaalinen SI-vastainen vasta-aine IB7 (Saton et.ai.. Infect.Immun. 55 (1987) 909-5 915 kuvaaman mukaan) oli lahja H. Satolta, NIH, Keyolle,
Japani.
Plasmidit ia bakteerikannat. PTX-operonin sisältävää plasmidia pPTX42 on kuvattu (katso Locht ja Keith, suora ja Locht et.ai.. suora). Ilmaisuplasmidit pCFM1036, pCFM1146, 10 pCFM1152 ja pCFM1156 muodostettiin laitoksessa Amgen.
Yksityiskohtainen kuvaus Amgenin ilmaisuvektorijärjestelmästä on esitetty EP-hakemusjulkaisussa n:o 136 490, ja se sisällytetään tähän viitteenä. Tällaiset plasmidit voivat sisältää indusoitavan promoottorin, synteettisen 15 ribosomisitoutumiskeskuksen, kloonausrykelmän, plasmidin toisiintumisalkukohdan, transkription lopetuskohdan, plasmidin kopiolukua säätäviä geenejä ja kanamysiiniresistens-sigeenin. Saadut plasmidit eroavat toisistaan lukuisissa suhteissa. Plasmidi pCFM1036 voidaan saada pCFM836:sta (EP-20 hakemusjulkaisu n:o 136 490) substituoimalla yksittäisten
Aatll- ja EcoRI-restriktiokeskuksien välissä sijaitseva ja synteettisen PL-promoottorin sisältävä DNA-sekvenssi seu-raavalla oligonukleotidilla:
: 25 Aatll EcoRI
5' . CATCGATTCTAG 3 '
3' TGCAGTAGCTAAGATCTTAA
30 Plasmidi ei sisällä restriktiorykelmää edeltävää indusoi tavaa promoottoria. Plasmidi pCFM1146 voidaan saada pCFM-’ · 83 6:sta substituoimalla pieni, yksittäisten Clal- ja Xbal- restriktiokeskuksien välinen DNA-sekvenssi seuraavalla oligonukleotidilla : h 101632
Clal Xbal 5 ’ CGATTTGATT 3 ' 3· TAAACTAAGATC 5' 5 ja tuhoamalla läsnä olevat kaksi endogeenistä Ndel-restrik-tiokeskusta täyttämällä päädyt T4-polymeraasientsyymiä käyttäen ja sen jälkeen ligatoimalla tylpät päädyt. Plas-midi ei sisällä välittömästi restriktiorykelmää edeltävää 10 synteettistä ribosomisitoutumiskeskusta. Plasmidi pCFM1156 voidaan saada pCFM1146:sta substituoimalla pieni, yksittäisten Xbal- ja Kpnl-restriktiokeskuksien välinen DNA-sekvenssi seuraavalla oiigonukleotidillä: 15 Xbal Kpnl 5' CTAGAAGGAAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3' 3' TTCCTTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5· 20 Plasmidi pCFM1152 voidaan saada pCFM1156:sta substituoimal la BglII:n ja Bglll:n välinen (248 emäsparin) DNA-fragment-ti, joka sisältää copB-promoottorin ja koodaa osaa copB-geenistä, vastaavalla, plasmidista pCFM512 peräisin olevalla DNA-fragmentilla (EP-hakemusjulkaisu n:o 136,490) . Tämän 25 plasmidin kopioluku on alhaisempi kuin pCFM1156:n.
Plasmidit pBR322, pUC18, pUC19 sekä fagit M13mpl8 ja M13mpl9 hankittiin laitoksesta Bethesda Research Laboratories. Plasmidi pTD125, joka sisältää E. coli -johtopepti-daasigeenin (Dale, T. J.Bacteriol. 143 (1983) 76-83) oli 30 lahja W. Wickneriltä (UCLA). E. coli-FM5-solut saatiin lai toksessa Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, E. coli K-12 -kannasta C.F. Morrikselta (Bachmann et.ai.. Bacteriol.Rev. 40 (1976) 116-167) ja ne sisältävät integroituneena lambdafa-gin repressorigeenin, CI857 (Sussman et .ai. . C.R. Acad. -35 Sei. 254 (1962) 1517-1579). Yksittäisten alayksikköil- „ 101632 maisuplasmidien rakentamista kuvataan tässä. Vektorit tuotettiin, solut transformoitiin ja pesäkkeet valikoitiin va-kiomenetelmien mukaan (Maniatis et.ai.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY).
5 Analyyttiset menettelyt. DNA-sekvenssointi suoritet tiin primeri-laajennus, ketjupääty -menetelmällä (Sanger et,al.. Proc.Natl.Acad.Sei.USA 74 (1977) 5463-5467; Hei- decker et.ai.. Gene 10 (1980) 69-73). Proteiinien sekvenssianalyysit suoritettiin automaattista Edman-pilkkomista 10 käyttäen ABI 470A -kaasufaasimikrosekvenssoijalla (Hewick et.ai.. J.Biol.Chem. 256 (1981) 7990-7997; Hunkapillar et. -ai.. Meth.Enzvmol. 91 (1983) 399-413). SDS-polyakryyliami-digeelielektroforeesi (SDS-PAGE) suoritettiin kuten kuvannut Laemmli (Nature 227 (1970) 680-685), polypeptidit elu-15 oitiin polyakryyliamidigeeleistä Hunkapillarin et.ai. menetelmän mukaan (Meth.Enzvmol. 91 (1983) 227-236), ja
Western blot -määritykset suoritettiin kuten kuvannut Burnette (Analvt.Biochem. 112 (1981) 195-203) . Rekombinantti-proteiinin suhde kokonaissoluproteiiniin tai solunsisäisten 20 kappaleiden kokonaisproteiiniin määritettiin suorittamalla SDS-PAGE-ajo kokonaisten solujen lysaateista tai solun-sisäisiä kappaleita käsittävistä preparaateista, mitä seurasi värjääminen Coomassie Brilliant Blue R250 -valmisteella sekä sen jälkeen geelin pyyhkäisy integroivaa densito-. 25 metriaa käyttäen. NAD-glykohydrolaasi ja ADP-ribosyyli- transferaasi määritettiin kuten aiemmin kuvattu (Katada et.ai.. Proc.Natl.Acad.Sei.USA 79 (1982) 3129-3133; Lim et.ai.. J.Biol.Chem. 260 (1985) 2585-2588). CHO-solujen PTX-vastaisen morfologisen vasteen vähentäminen (Hewlett 30 et.ai.. Infect.Immun. 4 0 (1983) 1198-1203) eri rekombinant- tialayksikköpreparaattien vastaista vasta-seerumia käyttäen suoritettiin Gilleniuksen et.ai. (J.Biol. Stand. 13 (1985) 61-66) menettelyn mukaan.
Ilmaisuolasmidien rakentaminen. Kaikki plasmidit 35 rakennettiin sarjasta E. coli -vleisilmaisuvektoreita. jot- 13 101632 ka eroavat toisistaan kuten aiemmin kuvattu. Yksittäiset hinkuyskätoksiinialayksikköjen geenisegmentit eristettiin käyttäen alan teknisen tason mukaisessa kuviossa 1 esitettyjä restriktiokeskuksia; ylävirran restriktiokeskus oli 5 juuri alayksikön signaalipeptidin sisältävän muodon ilmai sun aloituskodonin sisäpuolella tai juuri alayksikön kypsän, prosessoidun muodon aminopäätyjäännöksen kodonin sisäpuolella alayksikköanalogin metionyyli-kypsän muodon ilmaisemiseksi. B-oligomeerin kokonaisuudessaan yhteisil-10 maisussa käytettiin yhdessä tapauksessa fragmenttia, joka sisälsi S2:n ylävirran ei-koodaavan alueen S3:n loppuun asti ja josta puuttui E. coli -ilmaisuvektorin synteettinen ribosomisitoutumiskeskus; toisessa tapauksessa S2:n ylävirran ei-koodaava alue poistettiin ja insertoitiin synteetti-15 nen E. coli -ribosomisitoutumiskeskus. Synteettisiä oli- gonukleotidiliittäjiä käytettiin geeni segment ti en insertoi-miseksi ilmaisuplasmideihin optimaaliselle etäisyydelle alavirtaan synteettisestä promoottorista ja ribosomisitou-tumiskeskuksesta. Ylävirtaliittäjät palauttivat kunkin gee-20 nin lukualueen joko takaisin alkuperäiseen aloituskodoniin, alayksikköesirakenteiden kyseessä ollen, tai kypsän aminopäädyn ensimmäiseen kodoniin; viimemainitut oligonuk-leotidit sisälsivät metionyylialoituskodonin. Joissakin tapauksissa kodonikäytäntöä modifioitiin taipumuksen toissi-25 jäisen rakenteen muodostukseen saatavien mRNA-sekvenssien 5'-päädyn vaiheilla vähentämiseksi. Esimerkiksi kyste-iinikodoni asemassa 3 Sl-alayksikön signaalialueella (Locht ja Keith, suora) substituoitiin seriinikodonilla haitallisten disulfidivuorovaikutuksien esiintymismahdollisuuden 30 eliminoimiseksi.
Sen jälkeen, kun E. coli FM5 -solut oli transformoitu eri plasmidirakenteilla ja maljoitettu kanamysiiniä sisältävään agar-agariin, valikoitiin tarkoituksenmukaiset määrät pesäkkeitä, jotka kopiomaljoitettiin ja joita kas-35 vatettiin pieninä nesteviljelminä ('minipreparaatti ') indu- 14 101632 soiden 42°C:ssa 4 tunnin ajan. Sitten minipreparaatit seulottiin valomikroskopiaa käyttäen bakteerisolujen sisältämiä solunsisäisiä kappaleita silmälläpitäen. Preparaatit, joissa näkyi selviä solunsisäisiä kappaleita, tunnistettiin 5 ja vastaavat pesäkkeet kopiomaljoista otettiin kolvimitta- kaavan (yksi litra) laboratoriofermentointiin, joka suoritettiin indusointilämpötilassa; jotkut preparaatit otettiin myöhemmin eräsyöttö-fermentointiin 10 litran teollisissa fermentoreissa. Kustakin fermentoinnista otettiin eri ajan-10 kohtina indusoinnin jälkeen näytteitä, joista etsittiin oikeaa PTX-alayksiköä SDS-PAGE-ajossa, jota seurasivat sekä Coomassie Brilliant Blue -värjäys että Western blot -määritys; blot -siirtokopiot saatettiin ensin reagoimaan tarkoituksenmukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa ja tu-15 lokset tutkittiin autoradiografisesti, minkä jälkeen ne saatettiin reagoimaan polyklonaalisen PTX-vastaisen seerumin kanssa ja otettiin jälleen autoradiokuva. Kustakin il-maisukloonista saadun plasmidin rakenne varmistettiin eristetyn plasmidin restriktiokartoituksella ja tuloksen oi-20 keellisuus todennettiin sekvenssoimalla liitosalue-DNA:t.
Rekombinantti-Sl:n ilmaiseminen. Indusoitaessa Sl-ilmaisuplasmidin (pPTXSl/1) sisältäviä E. coli -soluja 42°C:ssa eräsyötöllä toimivassa 10 litran fermentorissa tuotantomittakaavassa ne tuottivat pääasiassa noin 26 000 : 25 daltonin solunsisäistä proteiinia (kuvio 2A, vasen osa, vyöhyke rSl), joka kulkeutui SDS-PAGE-ajossa kuten alkuperäinen PTX-S1. Osittainen aminohapposekvenssianalyysi (5 kierrosta) vahvisti, että tämän polypeptidin aminopäätysek-venssi vastasi kypsälle SI-alayksikölle ennustettua (Locht 30 ja Keith, suora). Proteiini tunnistettiin immuunikemialli sesti Sl:ksi sen reaktiivisuudesta hiiren SI-vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa Western blot -määrityksessä (kuvio 2A, oikea osa, vyöhyke rSl).
Todettakoon, että fermentoitaessa Sl-ilmaisusoluja 35 laboratoriossa yhden litran kolvimittakaavassa tuloksena is 101632 saatiin rSl-signaalipeptidin epätäydellinen lohkeaminen, ilmiö, joka todettiin myös ilmaistaessa muita PTX-alayksik-köjä E. colissa (katso alla). Yrityksiä tehtiin signaali-prosessoinnin kolvimittakaavassa havaitun molekyyliesteen 5 tunnistamiseksi suorittamalla sarja kokeita, jotka oli suunniteltu lisäämään esiproteiinin lohkeamisastetta: in-sertoitiin SI-geeni alhaisen kopioluvun omaavaan ilmai-suvektoriin, substituoitiin alkuperäinen Sl-signaalipeptidi synteettisellä, E. colissa lohkeavalla signaalisekvenssillä 10 (Picker et.ai.. Infect.Immun. 42 (1983) 269-275) sekä yh- teistransformoitiin alayksikön ilmaisevat solut E. coli -johtopeptidaasigeenin sisältävän ilmaisuplasmidin kanssa (Date, supra) tämän entsyymin konstitutiivisen tason nostamiseksi. Mikääm näistä lähestymistavoista ei johtanut mer-15 kittävään muutokseen signaalin lohkeamisessa. Sen sijaan fermentointiolosuhteiden vaihtaminen eräsyöttöprosessiksi johti esi-Sl:n prosessointiin sen oleellisesti täydelliseksi kypsäksi muodoksi.
Onnistuminen S4-alayksikön ilmaisemisessa kypsänä 20 metionyylipolypeptidinä (alla) kannusti käyttämään samaa menettelytapaa rSl:n kohdalla. Vastoin rS4-ilmaisua E. colissa kypsän metionyyli-Sl:n ilmaisu oli kuitenkin niin alhainen, että sen toteamiseksi tarvittiin Western blot -määritys. Sitä vastoin ilmaisemalla rSl sen alkuperäistä 25 signaalisekvenssiä käyttäen saatiin täysin prosessoitua polypeptidiä pitoisuuksina 10-30 % kokonaissoluproteiinis-ta. Kuten jäljempänä kuvataan, rSl:n kypsän aminopäädyn typistäminen rekombinaatiotekniikan keinoin saattaa johtaa hyvin voimakkaaseen ilmaisuun. Itse asiassa substituoimalla 30 kypsässä Sl-sekvenssissä esimerkiksi vain kaksi ensimmäistä jäännöstä (AspAsp) jäännöksillä MetVal saadaan metionyyli-r kypsän muodon merkittävä ilmaisu.
S2 :n, S3:n. S4:n ia S5:n ilmaiseminen. Toteutuskelpoisuuden tutkimiseksi PTX-S4-alayksikkö ilmaistiin ensin 35 kypsänä metionyyliproteiininaan ilman natiivia johtopepti- is 101632 diaan ja, kuten edellä kuvattu, sitä muodostui E. colissa korkeita pitoisuuksia (kuvio 2B, vasen osa, rmS4-vyöhyke). Vaikka sen kulkeutuminen SDS-PAGE-ajossa oli jonkin verran hitaampaa kuin ehjää toksiinia käsittävistä preparaateista 5 peräisin olevan S4:n, se omasi ennustetun mukaisen S4- aminohapposekvenssin. B. pertussiksesta HPLC:n avulla puhdistettu S4 osoittaa geelielektroforeesissa samaa hitaampaa kulkeutumista (Locht et.ai.. supra). Rekombinantti-S4 reagoi hyvin polyklonaalisen vastaseerumin kanssa Western blot 10 -määrityksissä (kuvio 2B, oikea osa, vyöhyke rmS4), mutta reagoi hitaammin monoklonaalisen S4-vasta-aineen kanssa.
Vastakkaisesti Sl:llä saatuihin tuloksiin nähden ilmaistaessa S4 natiiveine johtopeptidisekvensseineen (Locht ja Keith, supra) tuloksena oli ei-todettavia prote-15 iinipitoisuuksia (ei esitetty). Huomattakoon kuitenkin, että Nicosia et.ai. (suora) ennustavat toisen, kauempana ylävirran suunnassa sijaitsevan translaatioalkukohdan olevan läsnä; mahdollista on, että käyttämällä tätä lisäsek-venssiä S4-johtopeptidissä saataisiin paljon voimakkaampi 20 ilmaisu. Rekombinantti-S2, -S3 ja -S5 kukin ilmaistiin na tiiveine johtosekvensseineen (kuvio 2A, vyöhykkeet rS2, rS3 ja vastaavasti rS5); laboratoriomittakaavassa fermentoita-essa mikään näistä alayksiköistä ei tullut täysin prosessoiduksi, vaikka alustavissa tuotantomittakaavan fermen-25 tointikokeissa eräsyötöllä toimivaa prosessia käyttäen S2:n ja S5:n prosessointi parani selvästi. S2, S3 ja S5 kukin ilmaistiin myös E. colissa metionyyli-kypsinä muotoina, jolloin pitoisuudet olivat verrattavissa niiden natiiveja johtopeptideja käytettäessä saatuihin pitoisuuksiin (kuvio 3 0 2B, vyöhykkeet rmS2, rmS3 ja vastaavasti rmS5) . Kuten edel lä mainittu, solun metioniaminopeptidaasi prosessoi S2:n, - - S3:n ja S5:n heterologiset metioniinijäännökset ja tulok sena saadaan natiivin sekvenssin omaavia täysin kypsiä po-lypeptidejä.
35 B-oligomeerialayksiköitä (S2-S4-S5-S3) edustava po- lykistronisegmentti kokonaisuudessaan ilmaistiin PL-pro- 17 101632 moottorin kontrollin alaisena. Kuvio 3 havainnollistaa ylävirran ei-koodialueen vaikutuksia S2-alayksikön tuottoon. Yhdessä tapauksessa ilmaisuplasmidissa oli tallella Sl:n lopetuskodonin ja S2:n aloituskodonin välinen kistronien 5 välinen osuus kokonaisuudessaan (Locht ja Keith, supra), jolloin se ei kuitenkaan sisältänyt kaikissa muissa il-maisuplasmideissa käytettyä synteettistä ribosomisitoutu-miskeskusta. Tämän seurauksena syntetisoitui rekombinantti-S2:ta, joka vaikutti täysin prosessoidulta Western blot -10 määrityksessä S2-vastaista monoklonaalista vasta-ainetta käyttäen analysoituna (kuvio 3, vyöhykkeet D ja E) ; joskaan sitä ei ole esitetty, analyysi polyklonaalista vasta-ainetta käyttäen viittasi siihen, että myös muut B-oligomee-rialayksiköt prosessoitiin kypsiksi muodoikseen. Ei-koodaa-15 van kistronien välisen segmentin korvaaminen synteettisellä
Shine-Delgarno-sekvenssillä johti rS2-synteesin huomattavaan voimistumiseen (kuvio 3, vyöhykkeet B ja C); tämä materiaali on kuitenkin epätäydellisestä prosessoitu. Kunkin kistronin synteesin tehokkuus vaikuttaa suoraan verrannol-20 liselta kyseisen kistronin sijaintiin lähellä lähetin 5'- päätyä, eli S2>S4>S5>S3. Alustavassa kokeessa, jossa loput operonista sijoitettiin alavirtaan voimakkaasti ilmaisevasta SI-rakenteesta (katso edellä), tuloksena saatiin jokaisen alayksikön, mukaanlukien Sl:n, hyvin alhainen synteesi .· 25 sekä epätäydellinen prosessointi.
Rekombinantti-PTX-alavksiköiden ominaisuuksia. Prosessoiduista PTX-alayksiköistä vain hyvin vähän, jos yhtään, vaikuttaa erittyvän E. coli -soluista, vaikkakin löytyy joitain viitteitä siitä, että täysin prosessoitua 30 rSl:tä saattaa esiintyä solulimatilassa rajoitetussa mää- . rässä. Kustakin alayksiköstä valtaosa todettiin solunsisäi- sinä kappaleina, ja se muodosti 10-30 % kokonaissoluprote-iinista. Suorittamalla solulyysi ranskalaisessa paineken-nossa ja sitten sentrifugoimalla alhaisella nopeudella saa-35 tiin pellettifraktioita, jotka sisälsivät aina 65 %:iin asti proteiinistaan yksittäisinä alayksiköinä.
• .
ie 101632
Kaikki PTX-alayksiköt voitiin todeta Western blot -määrityksissä polyklonaalisella toksiinivastaisella kanii-niseerumilla (kuvio 2). Kuten edellä mainittu, alayksiköt rSl ja rS2 reagoivat hyvin spesifisten monoklonaalisten 5 vasta-aineiden kanssa Western blot -määrityksissä. Rekom- binantti-S4, joka valmistettiin metionyylipolypeptidinä, reagoi vähäisemmässä määrin S4-vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa. S3- ja S5-alayksikkövastaisia mono-klonaalisia vasta-aineita ei ollut saatavana, joskin rS3 10 oli todettavissa Western blot -määrityksessä S2-vastaista monoklonaalista vasta-ainetta käyttäen sen ja S2:n välisen likeisen sekvenssihomologian ansiosta (Locht ja Keith, supra) .
Inkuboitaessa raaka-rekombinantti-rSl-preparaatteja 15 [32P]NAD:n läsnä ollessa CHO-soluista eristetyillä membraa- neilla noin 41 000 daltonin proteiini ADP-ribosyloitui, jolloin saatiin natiivin, ehyen PTX:n ribosyloimaan nähden identtinen tuote; tämän molekyylin arvellaan olevan adeny-laatti-syklaasikompleksin Ni-membraanisäätöproteiini (Bo-20 koch et.ai.. J.Biol.Chem. 258 (1983) 2072-2075; ja Hsia et.ai.. J.Biol.Chem. 259 (1983) 1086-1090). Rutiinimäärityksen suorittamiseksi ribosylaasin substraattina voidaan käyttää nautatransdusiinia (kuvio 4) , joka molekyyli on osoitettu hinkuyskätoksiinin katalysoiman ADP-riboosisiir-2 5 ron NADrstä vastaanottajaksi. (Manning et.ai., supra; West et.ai. suora). Tämä tulos varmistaa, että ADP-ribosyyli-transferaasiaktiivisuuden sijaintipaikka on toksiinin A-promoottorissa (Sl-alayksikkö), ja viittaa siihen, että B. pertussis -rekombinanttiproteiini laskostuu natiivia kol-30 miulotteista rakennettaan E. colissa läheisesti muistutta vaan muotoon. Lisäksi rekombinantti-SI osoitti NAD-glyko-hydrolaasiaktiivisuutta, joka niinikään paikannettiin A-promoottoriin. Hiiriä immunoitiin ja tehosteet annettiin ruiskuttamalla vatsaontelon sisäisesti rSl:tä epäpuhtaana, 35 solunsisäisistä kappaleista koostuvana preparaattina tai 19 101632 puhdistettua rekombinantti-metionyyli-S4:ää. Käytetty rSl-alayksikkömateriaali sisälsi sekä täysin prosessoitua po-lypeptidiä että ei-prosessoitua esiproteiinia likimääräisessä suhteessa 1:2; kyseisten kahden rSl-lajin suhteellis-5 ta immunogeenisyyttä ei tunneta. Seeruminäytteistä tutkit tiin kiinteäfaasi-RIA:n avulla toksiinin vastaisten vasta-aineiden läsnäolo (kuvio 5). Eläimet, joille annettiin re-kombinantti-Sl:tä osoittivat merkittävää toksiinivastaista vastetta riippumatta siitä, oliko immunointiannokset formu-10 loitu täydellistä Freundin tehostetta sisältäviksi. Rekom- binantti-S4, jota annettiin vain tehosteen sisältävässä muodossa, oli niinikään hyvin immunogeenistä tehosteen kanssa annettuun ehyeen toksiiniin ja kaupalliseen hinkuyskärokotteeseen verrattuna.
15 CHO-soluviljelmien käsittely ehyellä hinkuyskätok- siinilla johtaa 'rykelmä'-morfologiaan (Hewlett et.ai.. supra), joka on takautettavissa toksiinivastaisella seerumilla (Gellenius et.ai.. supra). Alustavissa kokeissa rSl-tai rS4-vastainen hiiriseerumi, joka valmistettiin kuten 20 edellä kuvattu ja jonka toksiinivastaisten vasta-aineiden tiitterit olivat suhteellisen korkeita, ei rutiininomaisesti kyennyt neutraloimaan CHO-solujen natiiville toksiinille tuottamaa vastetta.
Hiirien immuuni suojaus rekombinantti-Sl: tä käyttäen.
.. 25 Epäpuhtaalla rekombinantti-Sl:llä, puhdistetulla rekom- binantti-S4 :llä ja tarkoituksenmukaisilla verrokkimateriaa-leilla (katso edellä) immunoiduille hiirille annettiin ai-vojensisäisenä (i.c.) herkisteenä hiirille tauteja aiheuttavaa B. pertussis -kantaa 18323, ja määritettiin kuollei-30 suus 45 päivää eteenpäin herkisteen antamisesta (kuvio 6).
.· Hiiret immunoitiin 50 ^g:lla testattavaa valmistetta (100 * μΐ kaupallista hinkuyskärokotetta 1:35 laimennoksena) anta malla vatsaontelon sisäinen ruiske; niille annettiin tehosteena sama määrä 21 päivän kuluttua rokottamisesta, minkä 35 jälkeen siitä 7 päivän kuluttua annettiin i.c. herkisteenä « 20 101632 elävää B. pertussis -kantaa 18323 (3 x 104 organismia eläintä kohden). Vaikka suojamuodostusta ei aktiivisen ho-lotoksiinin puuttuessa rekombinanttipreparaateista odotettu, todettiin yllättävästi rSlillä immunoitujen eläinten e-5 loonjääntiaikojen kasvu verrattuna ei-immunoituihin verrok- keihin. Lisäksi tehosteen sisältävää rSl:tä saaneista hiiristä useilla oli täydellinen suoja herkistettä vastaan; tehosteen sisältävällä rS4:llä immunoidut hiiret - niiden osoittaessa tosin hyvää vasta-ainevastetta (katso kuvio 5) 10 - eivät olleet ei-immunoituja hiiriä paremmin suojattuja.
Toisessa alustavassa kokeessa vaikutti siltä, että tehosteen sisältävä rSl synnytti annosriippuvaisen suojan herkistettä vastaan. Epätäydellinen suoja i.c. herkistekokees-sa saattaa johtua aktiivisen holotoksiinin puuttumisesta 15 immunoivasta materiaalista; kuitenkin tässä alustavassa tutkimuksessa aikaansaatu suoja osoittaa, että rekombinant-ti-SI-proteiini tulee kyseeseen mahdollisena alayksikköro-kotemateriaalina. Myöhemmissä tutkimuksissa ei ole vahvistettu immuunisuojan muodostusta aivojensisäistä herkistä-20 mistä vastaan hiirille tauteja aiheuttavalla B. pertussis - kannalla 18323.
Sl-analogit i
Typistettyjä Sl-analogeja valmistettiin proteiini-manipuloinnin ja paikkaspesifisen mutageneesin menettely-25 tapoja käyttäen. Sl-molekyylin ADP-ribosyylitransferaasi- aktiivisuudelle välttämättömäksi alueeksi todettiin alue, jota rajaavat väliini 7 ja proliini 14. Antigeeninen epi-tooppi, joka sitoo hiirille passiivisen suojan toksiini-aktiivisuutta vastaan antavan monoklonaalisen vasta-aineen 30 (eli epitooppi, joka on mukana synnyttämässä suojavastet- .· ta), sijaitsee ainakin osittain väliini 7:n ja proliini ' 14:n, mainitut mukaanlukien, rajaamalla alueella. Mutatoi- taessa Sl-molekyyliä väliini 7:n ja proliini 14:n, mainitut mukaanlukien, rajaamalla alueella saatiin Sl:n analogimole-35 kyylejä, joilla ei ollut entsyymiaktiivisuutta, mutta joil- ^ 101632 la sen sijaan oli tallella kyseinen suojaepitooppi. Suoja-epitooppi on tärkeä hinkuyskätoksiinivastaisen immuunisuojan muodostuksessa. Väliini 7:n ja proliini 14:n rajaaman alueen modifioinnin, mukaanlukien yhden tai useamman 5 aminohapon korvaus ja/tai deletio, tuloksena saadaan Sl- analogituotteita, jotka kykenevät synnyttämään toksiinia neutraloivia vasta-ainepitoisuuksia ja ovat oleellisesti vapaita reaktogeenisistä ainesosista.
PTX-SI-geenin alakloonaus pUC18:aan. Plasmidi 10 pPTX42, ioka sisältää Bordetella pertussis -toksiini- (PTX- ) operonin kokonaisuudessaan, saatiin J. Keithiltä (NIAID, Rocky Mountain Laboratory) transformoituna JM109-soluihin. Bakteereja kasvatettiin ampisilliiniä sisältävässä L-lie-messä, minkä jälkeen plasmidi otettiin talteen ja puhdis-15 tettiin vakiomenetelmillä (Maniatis et.ai.. supra).
pPTX42 :sta eristettiin 792 bp:n DNA-fragmentti, joka sisälsi osan PTX-S1-geenistä (kistroni) (Locht ja Keith, supra) pilkkomalla plasmidia restriktioentsyymeillä Aval ja Xbal, minkä jälkeen suoritettiin akryyliamidigeelielektroforeesi 20 ja sitten kyseisen DNA-fragmentin eluointi geelistä. Tämä DNA-fragmentti alkaa Aval-keskuksesta, joka sijaitsee juuri esi-Sl-proteiinin avoimella lukualueella, ja päättyy Xbal-keskukseen SI:n lopetuskodonin kohdalla. Standardikloonaus-vektoria pUC18 pilkottiin myös Aval:llä ja Xbal:llä, ja .. 25 saatua pilkkomistuotetta käsiteltiin fosfataasilla. Pilkot tu pUC18-vektori ja pPTX42:n 792 bp:n DNA-fragmentti (Aval-Xbal) ligatoitiin toisiinsa T4-DNA-ligaasireaktiossa vakio-olosuhteissa. Ligatointiseoksella transformoitiin tuoreita, transformoitumiskelpoisia DH52-alfa-soluja, minkä jälkeen 30 transformantit valikoitiin ampisilliiniä ja Blue-gal -val- .* mistetta (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) sisältävissä L-liemi-agar-agar-maljoissa. Valittiin 12 valkoista pesäkettä, jotka kopiomaljoitettiin ja joita kasvatettiin toisaalta 2 ml:n nesteviljelminä. Soluista valmis-35 tettiin 'minipreparaatteja ' tavanomaisella alkalisella lyy- 22 101632 simenettelyllä, DNA pilkottiin Aval:llä ja Xbal:llä, minkä jälkeen pilkkomistuotteilla suoritettiin akryyliamidigee-lielektroforeesi.
rPTXSl-ilmaisuplasmidin pPTXSI/1 rakentaminen.
5 Plasmidista pPTX42 eristettiin 792 bp:n Aval-Xbal-frag mentti kuten aiemmin kuvattu. Escherichia coli -ilmaisup-lasmidit pCFM1156 ja pCFM1036 saatiin Charles F. Morrikselta, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA. Plasmidia pCFM1156 pilkottiin restriktioentsyymeillä SstI ja Ndel, ja agaroo-10 sigeelistä eristettiin 1,8 kb:n DNA-fragmentti elektroelu- oimalla NA45-paperille (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.) . Plasmidia pCFM1036 pilkottiin Sstl:llä ja Xbal:llä ja eristettiin vastaavasti 2,8 kb:n DNA-fragmentti . Kaksi toisiaan komplementoivaa oligodeoksinukleotidiliittäjäsäi ' että, jot-15 ka rekonstituoivat Sl:n avoimelta lukualueelta deletoidun osan, syntetisoitiin Caruthersin et.ai. (suora) aminofosfiinikemiaa käyttäen. Alkuperäinen aminohapposekvenssi säilyttäen synteettisen fragmentin sekvenssiä modifioitiin kodonikäytännön osalta lähetti-RNA:n mahdollisen 20 sekundaärirakenteen muodostumia todennäköisyyden vähentämi seksi; poikkeuksena tähän oli seriinikodonin sijoittaminen kysteiinikodonin aminohappojäännösasemassa n:o 2 tilalle esiproteiinisignaalisekvenssissä, jotta eliminoitiin esi-proteiinisignaalin ja kypsän proteiinin kahden kyste-25 iinijäännöksen asemissa 41 ja 199 väliset mahdolliset di- sulfidivuorovaikutukset. Tässä oligodeoksinukleotidiliittä-jässä oli pCFM1156:n käsittämään nähden sopiva Ndel-keskus, sekä Sl-geenin 792 bp:n DNA-fragment in Aval-keskukseen li-ga toi tavaksi sopiva Aval-pääty. Tämän oligodeoksinukleoti-30 din sekvenssi oli: .· 5' TATGCGTTCTAC 3' 3' ACGCAAGATGAGCC 5' pCFM1036:n 2,8 kb:n DNA-fragmentti, pCFM1156:n 1,8 kb:n 35 DNA-fragmentti, Sl-geenisegmentin sisältävä 792 bp:n DNA- fragmentti sekä oligodeoksinukleotidiliittäjä ligatoitiin toisiinsa T4-DNA-ligaasireaktiossa. Ligatoinnin jäi- 23 101632 keen FM6-soluja (jotka saatiin C.F. Morrikselta, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) transformoitiin ligatointiseoksel-la, minkä jälkeen ne maljoitettiin kanamysiiniä sisältävään L-liemi-agar-agariin. Valikoidut pesäkkeet kopiomaljoitet-5 tiin ja toisaalta niistä valmistettiin minipreparaatteja aikaiimenetelmän mukaan (Maniatis et.ai.. supra). Minipre-paraatti-DNA-näytteille suoritettiin restriktioentsyymikar-toitus, jolloin niiden todettiin käsittävän odotusten mukaiset DNA-restriktiofragmentit. Alue synteettisen liittä-10 jän alusta alkuperäisen SI-geenin avoimeen lukualueeseen analysoitiin DNA-sekvenssianalyysillä. Tämän plasmidin sittemmin suoritettu indusointi johti rekombinantti-Sl-prote-iinin voimakkaaseen ilmaisuun.
rPTXSl-ilmaisuplasmidin pPTXSI/2 rakentaminen.
15 Plasmidista pPTXSl/1 eristettiin 181 bp:n DNA-fragmentti pilkkomalla Acclrllä ja Sphl:llä; saatua DNA-fragmenttia puhdistettiin sitten polyakryyliamidigeelissä. Tämä DNA-fragmentti on SI-geenin vasemman puoleinen sisäosa. Käyttäen samoja menettelyjä geenin oikean puoleista loppuosaa 20 edustava 564 bp:n DNA-fragmentti eristettiin PTXSl:stä, joka oli kloonattu pUC18:aan. Tämä suoritettiin pilkkomalla kyseistä plasmidia Sphlrllä ja BamHI:llä, jolloin viimemainittu entsyymi leikkaa alavirtaan Sl-kloonauskeskuksesta (Xbal), pUC18-kloonausrykelmän alueella sijaitsevan BamHI-25 keskuksen kohdalta. Ilmaisuvektorista pCFM1156 eristettiin 1,8 kb:n ja 2,8 kb:n DNA-fragmentit pilkkomalla restriktio-entsyymeillä Ndel, SstI ja BamHI, minkä jälkeen DNA-fragment it eristettiin agaroosigeelielektroforeesin ja elekt-roeluution avulla. Syntetisoitiin oligodeoksinukleotidi-30 liittäjä; tämä kaksisäikeinen liittäjä käsittää sopivan ·' Ndel- ja Accl-päädyn ja sen sekvenssi on seuraava: 5· TATGGACGATCCACCTGCTACCGT 3’ 3' ACCTGCTAGGTGGACGATGGCATA 5’ 24 101632
Ligatointi suoritettiin vakiomenetelmien mukaan (Maniatis et. ai. . supra) käyttäen reaktiossa pPTXSl/l.-stä peräisin olevia 181 bp:n (Accl-Sphl) ja 564 bp:n (Sphl-Bam-HI) DNA-fragmentteja, pCFM1156 : sta peräisin olevia 1,8 kb:n 5 (Ndel-SstI) ja 2,8 kb:n (Sstl-BamHI) DNA-fragmentteja, oli- godeoksinukleotidiliittäjää ja T4-DNA-ligaasia. Ligatoinnin jälkeen seoksella transformoitiin tuoreita, transformoitu-miskelpoisia FM5-soluja. Valikoitiin kanamysiiniresistentit trans formant it, suoritettiin plasmidi-DNA:sta valmistettu-10 jen minipreparaattien restriktioentsyymianalyysit ja var mistuttiin rakenteesta liitoskohtien DNA-sekvenssianalyysien avulla.
pPTXSl/2:n Bal31-pilkkominen sekä typistettyjä Sl-qeeneiä käsittävien vektorien rakentaminen. Lähellä kypsän 15 Sl-molekyylin aminopäätyä sijaitsevien tärkeiden antigee nisten epitooppien ja entsyymiaktiivisuutta omaavien keskuksien analysoimiseksi tästä proteiinista valmistettiin typistettyjä versioita. Ilmaisuplasmidia pPTXSl/2 pilkottiin Ndel:llä ja käsiteltiin eksonukleaasilla Bal31 (IBI) 20 vakio-olosuhteissa ottaen eri ajankohtina näytteitä aina 110 minuuttiin asti. Bal31:tä inaktivoitiin 15 minuuttia 65°C:ssa, minkä jälkeen näytteitä analysoitiin silmälläpitäen matkan kasvamista elektroforeettisessa kulkeutumisessa agaroosigeelielektroforeesi-ajossa. 100 minuutin ja 110 25 minuutin ajankohtina otetut neste-eränäyttet yhdistettiin (fraktio A), ja loput näytteet yhdistettiin ja pilkottiin edelleen Bal31:llä; näytteitä otettiin eri ajankohtina aina 180 minuuttiin asti. Kun reaktio oli pysäytetty, näytteitä tutkittiin jälleen silmälläpitäen matkan pitenemistä elek-30 troforeettisessa kulkeutumisessa ja saatiin neljä uutta fraktiota (B, C, D ja E) . Kutakin näistä viidestä fraktiosta pilkottiin erikseen Sstl:llä ja agaroosigeeleistä eristettiin elektroeluoimalla 3-3,5 kb:n DNA-fragmentit.
Ilmaisuvektoria pCFM1156 pilkottiin Sstl:llä ja 35 Hpal:llä, ja eristettiin vastaavasti 1,8 kb:n DNA-frag- 25 101632 mentti. Yksittäiset, pPTXSl/2:sta peräisin olevat 3-3,5 kb:n DNA-fragmentit (Bal31 tylppä-Sstl) ligatoitiin tahollaan 1,8 kb:n DNA-fragmenttiin (Sstl-Hpal) T4-DNA-ligaasia vakio-olosuhteissa käyttäen. Tuoreita, transformoitumiskel-5 poisia FM5-soluja transformoitiin kullakin yksittäisellä ligatointiseoksella ja eristettiin kanamysiiniresistentit pesäkkeet. Kummankin fraktion A ja B typistelmätransforman-tit noukittiin talteen, minipreparaatteja indusoitiin 42°C:ssa ja preparaatteja tarkasteltiin valomikroskoopilla 10 solunsisäisten kappaleiden läsnäoloa silmälläpitäen. Näitä kappaleita sisältävistä preparaateista valmistettiin minipreparaatteja, pilkottiin Xbalrllä, minkä jälkeen DNA-in-serttien kokoa tutkittiin agaroosigeelielektroforeesissa. DNA-sekvenssointiin typistelmien rakenteen varmistamiseksi 15 valittiin 600 - 650 bp:n kokoalueella olevat näytteet. Il maistuilla rekombinanttiproteiineilla sittemmin suoritetut analyysit osoittivat, että Sl-molekyylin ADP-ribosyyli-transferaasiaktiivisuudelle välttämätön alue sekä suojavas-teen muodostukseen liittyvä epitooppi (eli antigeeninen 20 epitooppi, joka sitoo hiirille passiivisen suojan tok- siiniaktiivisuutta vastaan antavan monoklonaalisen vasta-aineen) sijaitsevat kypsässä molekyylissä väliini 7:n ja proliini 14:n rajaamalla alueella, mainitut mukaanlukien (täydellisen aminohapposekvenssin osalta katso Locht ja “ 25 Keith, supra). Vektorirakenteen ansiosta kaikki nämä Sl- molekyylin typistetyt versiot alkavat N-päädyssään sekvenssillä metionyylivalyyli, jota seuraa typistetty sekvenssi.
SI:n mutatointi . Väliini 7:n ja proliini 14 :n rajaaman alueen tarkaksi kartoittamiseksi sekä Sl-analogimole-30 kyylien tuottamiseksi, joilta puuttuu entsyymiaktiivisuus, vaikka niillä on tallella tämän alueen suojaepitooppi, re-kombinantti-SI-geeniä mutatoitiin. Suojaepitoopin säilymisen määrittelee reaktiivisuus monoklonaalisen vasta-aineen 1B7 suhteen. Tämä suoritettiin korvaamalla synteettisillä 35 oligodeoksinukleotidisegmenteillä jäännöksiä väliini 7 - 26 1 0 1 6 3 2 proliini 14 koodaava alkuperäinen alue. Nämä segmentit sisälsivät yhden tai kahden kodonin korvauksia alkuperäisen aminohapposekvenssin modifioimiseksi. Modifiointiin voidaan päästä tekemällä deletioita ja/tai korvauksia. Kyseiseen 5 keksintöön kuuluu yksittäisen emäksen modifiointi SI-analo gien haluttujen ominaisuuksien saamiseksi. Yksittäistä emästä voidaan modifioida aminohapposekvenssin modifioimiseksi. Alan ammattilaiset havaitsevat kuitenkin, että tilastollinen todennäköisyys genotyypin palautumiselle takai-10 sin villityypiksi on suurempi modifioitaessa yhtä emästä verrattuna vähintään kahden emäksen modifiointiin. Tämän vuoksi edullisessa suoritusmuodossa kuhunkin näistä ko-donimuutoksista kuului ainakin kahden emäksen korvaaminen kussakin kodonissa palautumisten tehokkuuden alentamiseksi . 15 Oligodeoksinukleotidiliittäjät syntetisoitiin Accl- ja
BspMII-koheesiopäädyt käsittäviksi ja ne sisälsivät alkuperäisen SI-sekvenssin, lukuunottamatta taulukon I liittäjä-kuvauksissa mainittuja kodonimuutoksia: «« * 27 101632
Taulukko I
rakenne: pPTXSl(6A-3/5-1) kodonimuutos: tyr8 - phe oligodeoksinukleotidiliittäj äsekvenssi: 5 5'ATTCCGCTATGACTCCCGCCCG 3' 3'AGGCGATACTGAGGGCGGGCGGCC 5' rakenne: pPTXSl(6A-3/4-1) kodonimuutos: arg9 - lys oligodeoksinukleotidiliittäj äsekvenssi: 10 5'ATACAAGTATGACTCCCGCCCG 3' 3'TGTTCATACTGAGGGCGGGCGGCC 5' rakenne: pPTXSl(6A-3/3-1) kodonimuutos: aspll - glu oligodeoksinukleotidiliittäj äsekvenssi: 15 5'ATACCGCTATGAATCCCGCCCG 3' 3'TGGCGATACTTAGGGCGGGCGGCC 5' rakenne: pPTXSl(6A-3/2-2) kodonimuutos: serl2 - gly oligodeoksinukleotidiliittäjäsekvenssi: 20 5'ATACCGCTATGACGGCCGCCCG 3' 3'TGGCGATACTGCCGGCGGGCGGCC 5' rakenne: pPTXSl(6A-3/1-1) kodonimuutos: argl3 - lys oligodeoksinukleotidiliittäj äsekvenssi: 25 5'ATACCGCTATGACTCCAAGCCG3' 3'TGGCGATACTGAGGTTCGGCGGCC 51 rakenne: pPTXSl(6A-3/8-1) kodonimuutos: tyr8 - leu ja arg9 - glu oligodeoksinukleotidiliittäjäsekvenssi: 30 5'ATTGGAATATGACTCCCGCCCG 3' ·; 3 ' ACCTTATACTGAGGGCGGGCGGCC 5' rakenne: pPTXSl(6A-3/7-2) kodonimuutos: arg9 - asn ja serl2 - gly oligodeoksinukleotidiliittäj äsekvenssi: 35 5'ATACAACTATGACGGCCGCCCG 31 3'TGTTGATACTGCCGGCGGGCGGCC 5' rakenne: pPTXSl(6A-3/6-1) ·, kodonimuutos: aspll - pro ja prol4 - asp : oligodeoksinukleotidiliittäj äsekvenssi : 40 51ATACCGCTATCCGTCCCGCGAC 3' 3'TGGCGATAGGCAGGGCGCTGGGCC 51 28 101632
Ilmaisuplasmidien rakentamiseksi seuraavat DNA-fragmentit eristettiin elektroeluoimalla agaroosigeeleistä: 1) 1824 bp:n DNA-fragmentti (AccI-SstI) pPTXSl(6A):-sta, plasmidista, joka rakennettiin kuten aiemmin 5 kuvattu ja joka ilmaisi rekombinantti-SI-analogi- molekyylin, josta aspartaatti 1 ja aspartaatti 2 ovat deletoituneet ja korvattu metionyylivalyylilia; 2) 3,56 kb:n DNA-fragmentti (Sstl-BspMII) pPTXSl(33- 10 B):stä, plasmidi, joka rakennettiin kuten aiemmin kuvattu ja joka ilmaisi rekombinantti-SI-analogin, josta 14 ensimmäistä aminohappojäännöstä ovat deletoituneet ja korvattu metionyylivalyylilla. Tässä nimenomaisessa geenirakenteessa tämän edestä lyhen-15 netyn mokekyylin tuottanut tylppäpääty-ligatointi loi uuden BspMII-keskuksen. Tämä restriktiokeskus, jota ei esiinny natiivissa Sl-kistroniyksikössä, mahdollisti suhteellisen lyhyiden, Accl- ja BspMII-koheesiopäädyt käsittävien oligonukleotidiliittä-20 jien käytön mutatoinnin suorittamiseksi.
Nämä kaksi DNA-fragmenttia ligatoitiin edellä kuvattuihin yksittäisiin oligodeoksinukleotidifragmentteihin tavanomaisissa ligatointiolosuhteissa. Näiden ligatointien tuloksena muodostui uusia SI-geenirakenteita: osa pPTXSl(-25 6A):sta, joka toi mukanaan ylävirtakodonit Accl- restriktiokeskukseen asti, synteettiset fragmentit, jotka toivat mukanaan erilaisia mutaatioita kodoneihin Accl-keskuksesta BspMII-keskukseen, sekä osa pPTXSl(33B):stä, joka toi mukanaan loput Sl-koodialueesta alavirtaan uudesta 30 BspMII-restriktiokeskuksesta. Ligatoinnin jälkeen kullakin seoksella transformoitiin erillisiä, tuoreita transformoi-tumiskelpoisia FM5-soluja käsittäviä preparaatteja. Valittuja transformantteja kasvatettiin minipreparaatteinä, ne indusoitiin tuottamaan rekombinanttiproteiinia ja solun-35 sisäisiä kappaleita sisältävät näytteet identifioitiin va- 29 1 0 1 6 3 2 lomikroskopilla. Näitä näytteitä fermentoitiin suuremmassa mittakaavassa (1-6 litraa) indusointilämpötilassa suurempien määrien kutakin rekombinanttianalogiproteiinia valmistamiseksi. Eristetyille solutahnooille suoritettiin lyysi 5 ranskalaisessa painekennossa, kun solut oli ensin uudel- leenlietetty tislattuun veteen, joka käsitti pitoisuuden 1 mM DTT. Näistä lysaateista eristettiin solunsisäiset kappaleet yksinkertaisen, alhaisella nopeudella suoritetun sent-rifugoinnin avulla. Nämä solunsisäisiä kappaleita sisältä-10 vät proteiinipreparaatit sisälsivät toisaalta vain 30 % ja toisaalta jopa 80 % rekombinanttiproteiinia. Kustakin preparaatista analysoitiin sen kyky sitoutua Western blot -määrityksessä (Burnette, supta) monoklonaaliseen vasta-aineeseen B2F8, joka on tutkimuksissamme typistetyillä Sl-analo-15 geilla tunnistetun dominoivan epitoopin vastainen vasta- aine, ja sen kyky sitoutua monoklonaaliseen vasta-aineeseen 1B76, jonka tiedetään passiivisesti suojaavan hiiriä aivo-jensisäisesti annettua tauteja aiheuttavaa B. pertussis -herkistettä vastaan (Sato et.ai.. supra). Näytteistä määri-20 tettiin niinikään ADP-ribosyylitransferaasiaktiivisuus.
Saadut tulokset on esitetty taulukossa 2.
Taulukko 2 vasta-ainesitoutuminen ADP-RT-aasi-nävte _B2F8_1B7_ aktiivisuus 25 - - - PTX (kaupp.) + + + rPTXS (pPTXSl/1) + + + pPTXSl(6A-3/1-1) + + + pPTXSl(6A-3/2-2) + + + -.n pPTXSl (6A-3/3-1) + + + pPTXSl(6A-3/4-1) + + pPTXSl(6A-3/5-1) + + + pPTXSl(6A-3/6-1) I. pPTXSl (6A-3/7-2) 35 pPTXSl (6A-3/8-1) 30 101632
Sl-analogi 4-1 (arg9 - lys) osoitti vain vähän tai ei laisinkaan transferaasiaktiivisuutta, jolloin reaktiivisuus neutraloivan monoklonaalisen vasta-aineen 1B7 suhteen oli kuitenkin tallella. Vain äärimmäisen pieniä määriä 5 entsyymiaktiivisuutta saatiin esiin lisäämällä 4-1-proteii- nin määrää määrityksessä (kuvio 8A); useaan kertaan toistetut määritykset viittasivat siihen, että Sl-analogin spesifinen ADP-ribosyylitransferaasiaktiivisuus oli alentunut ainakin kertoimen 5,000 mukaan. Yhden jäännöksen korvauksen 10 käsittäviin mutantteihin liityvän NAD-glykohydrolaasiaktii- visuuden määrityksessä (kuvio 8B) paljastui samankaltainen kuvio kuin saatiin arvioitaessa ADP-ribosyylitransfe-raasiaktiivisuutta. Sl-analogi 4-1 osoitti vain vähän tai ei laisinkaan glykohydrolaasiaktiivisuutta, mikä viittasi 15 tämän aktiivisuuden voimakkuuden alenemiseen ainakin ker toimen 50-100 mukaan.
Koska kloonin pPTXSl (6A-3/4-1) tuottama rekombinant-ti-Sl-analogimolekyyli, kuviossa 7 esitetyn mukaisesti, sekä sen modifikaatiot, kykenevät säilyttämään sitoutumisen 20 passiivisesti suojaavaan monoklonaaliseen vasta-aineeseen (eli kykenevät säilyttämään pääasiallisen suojaepitoopin) ja koska niistä puuttuu toksiiniaktiivisuuden pääasiallinen merkki (ADP-ribosyylitransferaasi), niillä on sovellutusmahdollisuuksia turvallisina, taloudellisina alayksikköro-’ 25 kotteina, joko yksinään tai muihin PTX-alayksiköihin yhdis tettynä. Kloonin pPTXSl(6A-3/4-1) tuottamat SI-analogit, joissa arginiinin 9 korvaa lysiini, havainnollistavat rSl-analogeja, jotka omaavat halutut, turvallisille alayksikkö-rokotteille välttämättömät ominaisuudet. Muut 6A-3/4-l-ana-30 logit voisivat sisältää esimerkiksi aspartyyliaspartyyli- jäännökset asemissa 1 ja 2, metionyyliaspartyyliaspartyyli-jäännökset asemissa 0, 1 ja 2, ja metionyylivalyyliaspar-tyylijäännökset asemissa 0, 1 ja 2.
Tämän hetkiset soluja sisältämättömät rokotteet si-35 sältävät SI-, S2-, S3-, S4- ja S5-alayksiköitä. Hinkuyskä- 31 101632 toksiinin nisäkässoluviljelmissä tuottamien morfologisten modifikaatioiden on viime aikoina osoitettu olevan Sl-ala-yksikön ominaisuus (Burns et.ai.. Infect.Immun. 55 (1-987) 24-28), vaikka tämä vaikutus on osoitettu vain B-oli-5 gomeerin läsnäollessa. Alustavat tässä kuvatut tutkimukset osoittavat sellaisen yhden alayksikön rokotteen toteutus-kelpoisuuden, joka hyödyntää rSl-analogeja, joilla on tallella pääasiallinen suojaepitooppi, mutta joilta puuttuu toksiiniaktiivisuus. Sl-analogeilla on niinikään sovelluit) tusmahdollisuuksia yhdistettyinä alayksiköihin S2, S3, S4 ja S5. Nämä alayksiköt saattavat lisätä Sl-vastaista immuunivastetta ja voivat sinänsä sisältää suojaepitooppe-ja. Tähän keksintöön kuuluu, että- Sl-alayksikköanalogeja sisältävät rokotteet voivat edelleen sisältää ainakin yhtä 15 sanottua Bordetella-eksotoksiinialayksikköä S2, S3, S4 tai S5 tai niiden seoksia. S2, S3, S4 tai S5 voivat olla B. pertussiksesta saatuja alayksiköitä tai geenimanipuloituja alayksiköitä ja niiden analogeja. Geenimanipuloituihin alayksikkötuotteisiin voi kuulua fuusioproteiineja ja ei- 20 fuusioproteiineja.
Seuraavassa osassa kuvattuja kokeita silmälläpitäen modifioimme ilmaisujärjestelmää Sl-alayksikköanalogin (S-1/1-4) tuottamiseksi, joka omaa arginiini9 - lysiini -korvauksen, mutta joka niinikään omaa aminopäädyssään natiivit 25 aspartyyliaspartaattijäännökset.
Sl/l-4-analogien ja Sl/l:n biologisen aktiivisuuden määritys
Natiivin sekvenssin omaava rekombinantti-SI-proteiini (Sl/l) ja analogi Sl/1-4 (kuten edellä kuvattu, sisäl-30 tää arg9 - lys -korvauksen sekä natiivin sekvenssin aspar- j tyyliaspartaatti-aminopäätyjäännökset) eristettiin erikseen
E. coli -tuottosoluista menettelyn mukaan, joka käsitti solujen rikkomisen, sentrifugoinnin, ureaan liuottamisen, ioninvaihtokromatografia-ajon sekä geelisuodatuskromatogra-35 fia-ajon. Solupastat lietettiin 25 mM Tris-puskuriin, pH
32 101632 8.5, ja lyysi tuotettiin korkean paineen avulla rikkomalla (ranskalainen painekenno). Lysaatit sentrifugoitiin ja ei-liukoiset pelletit, jotka sisälsivät rekombinantti-Sl-pro-teiinit, liuotettiin liuokseen, joka käsitti pitoisuudet 8 5 M urea, 25 mM Tris, pH 8,5. Kuparisulfaattia lisättiin pi toisuuteen 50 μΜ, minkä jälkeen seoksia sekoitettiin yön yli, jotta rekombinantti-Sl-proteiinien disulfidisidokset saattoivat muodostua. Seoksia laimennettiin vastaavalla tilavuudella liuosta, joka käsitti pitoisuudet 8 M urea, 25 10 mM natriumsitraatti, pH 3,8, minkä jälkeen ne panostettiin S-Sepharose- ('nopeavirtaus' -) kolonneihin, joita oli tasapainotettu pH 3,8:ssa 8 M urealiuoksessa. Kolonneja elu-oitiin käyttäen lineaarista natriumkloridigradienttia (0 -0,5 M) liuoksessa, joka käsitti pitoisuudet 8 M urea, 12,5 15 mM natriumsitraatti, pH 3,8. Kummastakin kolonnista kerät tiin eluoituvat leveät piikit, jotka titrattiin pH-arvoon 7.5. Nämä kromatografiafraktiopoolit panostettiin erikseen Sephacryl S-200 -kolonneihin, joita oli tasapainoitettu liuoksessa, joka käsitti pitoisuudet 2 M urea, 10 mM ka- 20 liumfosfaatti, pH 7,5, ja eluoituvasta materaalista kerät tiin pooleja, jotka edustivat kummankin lajin (Sl/1 ja Sl/1-4) hapettuneita, monomeerisiä rekombinantti-SI-proteiineja. Puhdistettuja Sl-alayksikköproteiineja analysoitiin SDS-PAGE-ajossa, minkä jälkeen proteiinit värjättiin ho-25 pealla geeleissä (kuvio 9). Geeliajot (12,5-%:inen akryy- liamidi) suoritettiin pelkistävissä olosuhteissa. Vyöhykkeessä 1 molekyylipainostandardit (Pharmacia). Vyöhykkeenä 2, 2 ^g B.pertussis -holotoksiinia (List Biological Laboratories) . Vyöhykkeenä 3, 0,2 μg B. pertussis -Sl-alayksikkö-30 proteiinia (List Biological Laboratories). Vyöhykkeenä 4, ·’. 0,2 μg rekombinantti-Sl/1:tä. Vyöhykkeenä 5, 0,2 μg rekom- binantti-Sl/1-4:ää. Vyöhykkeenä 6, sokeakoe. Vyöhykkeenä 7, 0,4 μg Sl-alayksikköproteiinia (List). Vyöhykkeenä 8, 0,4 μg rekombinantti-Sl/1:tä. Vyöhykkeenä 9, 0,4 μg rekom- 35 binantti-S2/l-4:ää. Valmistuksen tässä vaiheessa rekom- binantti-Sl-lajien puhtausaste oli yli 90 %.
33 101632 SI:n arg9 - lys -mutaation biologisen aktiivisuuden määrittämiseksi oli välttämätöntä aikaansaada mutanttian-alogin ja natiivin sekvenssin omaavan rekombinantti-SI-proteiinin yhteenliittyminen hinkuyskä-holotoksiinilajiksi.
5 Erittäin puhdasta hinkuyskätoksiini-B-oligomeeria (tok- siinialayksiköt S2, S3, S4 ja S5 käsittävä pent ameer i rakenne) saatiin D. Burnsilta, Center for Biologies Evaluation and Research, Food and Drug Administration) . Kyseisten kahden erilaisen Sl-alayksikkölajin annettiin erikseen liittyä 10 B-oligomeeriin holotoksiinimolekyylien (jotka sisältäisivät joko Sl/l:n tai Sl/l-4:n) muodostamiseksi seuraavan menettelyn mukaan. Sama moolimäärä rekombinantti-SI-lajia ja B-oligomeeria yhdistettiin liuoserissä, jotka käsittivät pitoisuudet 2 M urea, 10 mM kaliumfosfaatti, pH 7,5, ja in-15 kuboitiin 30 minuuttia 37°C:ssa. Holotoksiinin muodostumis ta tarkkailtiin elektroforeettisesti natiivi-akryyliamidi-geeleissä (kuvio 10) . Geeli 1, rekombinantti-Sl/1 ja natii-vi oligomeeri. Geeli 2, rekombinantti-SI/1-4 ja natiivi B-oligomeeri. Geeli 3, natiivi B-oligomeeri. Geeli 4, natiivi 20 B. pertussis -holotoksiini. Geeli 5, rekombinantti-SI/1.
Geelit osoittavat, että holotoksiinilajit muodostuivat natiivin B-oligomeerin liittyessä joko rekombinantti - Sl/1 :een tai rekombinantti-Sl/1-4:ään.
Puolirekombinantti-holotoksiineja (B-oligomeeri + 25 joko Sl/1 tai analogi SI.1-4) tarkasteltiin niiden kyvyn osalta synnyttää rykelmävaste kiinalaisen hamsterin muna-sarjasoluissa (CHO-soluissa) in vitro; tämän vasteen on osoitettu olevan hinkuyskätoksiinin solumyrkkyvaikutuksien mitta. Tutkittavat näytteet sekä tarkoituksenmukaiset ver-3 0 rokkinäytteet laimennetiin CHO-solukasvualustaan (Dulbeccon modifioitu Eagle-kasvualusta, joka sisälsi 10 % vasikansi-kiöseerumia) , steriloitiin ultrasuodattamalla ja laimennettiin edelleen sarjasiirroin 96-kuoppaisissa muovisissa so-luviljelmälevyissä. Kuhunkin kuoppaan mitattiin noin 5-7 x 35 103 vast'ikään trypsiinillä käsiteltyä CHO-solua (American 3« 101632
Type Culture Collection CCL 61, CHO-K1 -soluja), minkä jälkeen maljoja inkuboitiin 37°C:ssa 5 % hiilidioksidia käsittävässä ilmakehässä 48-72 tuntia. Soluyksikerrokset pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja värjättiin kris-5 tallivioletilla, minkä jälkeen niistä etsittiin solurykel- miä valomikroskoopin avulla.
Kuvio 11 havainnollistaa näissä analyyseissa saatuja tuloksia; erityisen kiinnostavia ovat Sl/1-4-analogia koskevat, paneeleissa G, H ja J esitetyt tulokset. Sl/l-4-ana-10 logissa yksinään sekä Sl/1-4-analogista ja B-oligomeeristä muodostettu! holotoksiinin 1/1600-laimennoksessa ilmenee solurykelmien puuttuminen, jolloin 1/200-laimennoksessa näkyy lähes olematon määrä rykelmämuodostusta. Paneeli A esittää soluja, joita on käsitelty vain puskurin l/200-lai-15 mennoksella. Paneeli B vastaa käsittelyä vain B-oligomee- rillä laimennoksena 1/200; tämän laimennoksen kohdalla näkyy vähäinen määrä rykelmämuodostusta, ja se johtuu puhdistuksessa jääneestä kontaminoivasta natiivista Sl-alayksi-köstä. Paneelia B voidaan verrata tästä samasta kuopasta 20 saatuun toiseen kenttään (paneeli I) , jossa näkyy selvästi B-oligomeeripreparaatin rykelmämuodostusaktiivisuus laimennoksena 1/200. Paneeli C esittää soluja, joita on käsitelty natiivilla, kaupallista laatua edustavalla Sl-alayksiköllä (List Biologicals) laimennoksena 1/2000. Paneeli D on 25 natiivi, kaupallista laatua edustava hinkuyskäholotoksiini (List Biologicals) laimennoksena 1/2000, ja siitä ilmenee hinkuyskätoksiinin dramaattinen solumyrkkyvaikutus CHO-soluviljelmälle. Paneeli E on natiivin sekvenssin omaava re-kombinantti-Sl-alayksikkö (Sl/1) laimennoksena 1/2000. Pa-30 neeli F esittää Sl/l:tä yhdistettynä B-oligomeeriin ja lai- .·: mennettuna 1/2000; vaikutus CHO-solurykelmämuodostukseen vaikuttaa aivan yhtä dramaattiselta kuin natiivin holotoksiinin kohdalla, ja tukee fysikaalisia geelituloksia (edellä) osoittaen B-oligomeerin ja rekombinantti-Sl-proteiinin 35 käsittävää holotoksiini-yhteenliittymää. Paneeli G havain- 35 101632 nollistaa, että arg9 - lys -mutantti-Sl/l-4 : llä yksinään ei ole mitään vaikutusta CHO-soluihin. Paneelista H ilmenee CHO-solurykelmämuodostuksen puuttuminen Sl/1-4-analogista ja B-oligomeeristä muodostetun holotoksiinin 1/1600-laimen-5 noksesta. Laimennoksena 1/200 (paneeli J) Sl/1-4:n sisältä vän holotoksiinin voidaan todeta aikaansaaneen jonkin verran rykelmämuodostusta, jolloin analogi-SI-lajin rykelmä-muodostusvaikutuksen osuus vaikuttaa lähes olemattomalta verrattuna B-oligomeeriin yksinään samana laimennoksena 10 (paneeli I).
Alustavia kokeita on suoritettu eri hinkuyskätok-siinilajien sen tehokkaan pitoisuuden kvantitoimiseksi, joka tarvitaan synnyttämään CHO-solurykelmämuodostusilmiö. Alustavat tulokset viittaavat siihen, että sekä kaupallinen 15 hinkuyskätoksiini että rekombinantti-Sl/1:tä sisältävä ho- lotoksiini kykenevät aiheuttamaan solurykelmämuodostusta niinkin alhaisina pitoisuuksina kuin 0,25 - 0,30 ng/ml; sitä vastoin Sl/1-4-analogia sisältävää holotoksiinia tarvitaan ainakin pitoisuus 10 - 25 ng/ml rykelmämuodostusvai-20 kutuksen indusoimiseksi.
Nämä tulokset varmistavat sen, että hinkuyskätoksii-nin solumyrkkyvaikutus on peräisin sen Sl-alayksikköosuu-desta, ja on suorassa suhteessa sen entsymaattisiin aktiivisuuksiin. Merkittävämpää on, että nämä kokeet osoittav-25 at, että verraten myrkytön hinkuyskätoksiinimolekyyli on muodostettavissa paikkaohjautuvan mutatoinnin avulla saaduista spesifisistä rekombinantti-toksiinialayksiköistä.
Kyseisen keksinnön on määrä kattaa kaikki sellaiset modifikaatiot ja parannukset, jotka kuuluvat kyseisen kek-30 sinnön, siinä muodossa kuin se patentoitavaksi vaaditaan, .· kattamaan alueeseen.
Claims (8)
1. Rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa Bordetella pertussis-bakteerin ek- 5 sotoksiinin alayksikön SI analogia, jossa on paikkaspesi-finen mutaatio luonnon aminohapposekvenssin väliini 7:n ja proliini 14:n rajaamalla alueella siten, että analogi kykenee synnyttämään toksiinia neutraloivia vasta-ainepitoisuuksia sen ollessa vapaa toksiinin reaktiivisuuteen 10 liittyvästä entsyymiaktiivisuudesta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rekombinantti- DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että paikkaspesi- finen mutaatio sijaitsee arginiini 9:n kohdassa.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen rekombinantti-
15 DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että arginiini 9 on korvattu lysiinillä.
4. Menetelmä Bordetella pertussis-bakteerin ekso-toksiinin alayksikön SI polypeptidianalogin valmistamiseksi, jossa on paikkaspesifinen mutaatio luonnon amino- 20 happosekvenssin väliini 7:n ja proliini 14:n rajaamalla alueella siten, että analogi kykenee synnyttämään toksiinia neutraloivia vasta-ainepitoisuuksia sen ollessa vapaa toksiinin reaktiivisuuteen liittyvästä entsyymiaktiivisuudesta, tunnettu siitä, että mikro-organis-25 meja, jotka on transformoitu patenttivaatimuksen 1 mukai sen manipuloidun geenin sisältävällä biologisesti toiminnallisella DNA:11a kasvatetaan olosuhteissa, joissa mainittu geeni ekspressoituu, ja geenituote otetaan talteen viljelmästä.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan polypeptidi, joka antaa immuunisuojan pertussistoksiinia vastaan.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan polypeptidi, 35 jonka paikkaspesifinen mutaatio sijaitsee arginiini 9:n 37 1 0 1 6 3 2 kohdassa.
7. Patenttivaatimuken 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan polypeptidi, jossa arginiini 9 on korvattu lysiinillä.
8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi formuloidaan rokotteeksi. • · 38 1 0 1 6 3 2
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9430787A | 1987-09-04 | 1987-09-04 | |
| US9430787 | 1987-09-04 | ||
| US23248288A | 1988-08-17 | 1988-08-17 | |
| US23248288 | 1988-08-17 | ||
| PCT/US1988/002983 WO1989001976A1 (en) | 1987-09-04 | 1988-08-26 | Recombinant dna-derived bordetella toxin subunit analogs |
| US8802983 | 1988-08-26 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI892131A0 FI892131A0 (fi) | 1989-05-03 |
| FI892131A FI892131A (fi) | 1989-05-03 |
| FI101632B1 FI101632B1 (fi) | 1998-07-31 |
| FI101632B true FI101632B (fi) | 1998-07-31 |
Family
ID=26788722
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI892131A FI101632B (fi) | 1987-09-04 | 1989-05-03 | Menetelmä Bordetella pertussis-toksiinin alayksikön analogien valmista miseksi ja niitä koodaavia rekombinantti-DNA-molekyylejä |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5773600A (fi) |
| EP (2) | EP0306318B2 (fi) |
| JP (1) | JP2918895B2 (fi) |
| KR (1) | KR0168039B1 (fi) |
| CN (1) | CN1033866C (fi) |
| AT (1) | ATE125568T1 (fi) |
| CA (1) | CA1341560C (fi) |
| DE (1) | DE3854213T3 (fi) |
| DK (1) | DK175821B1 (fi) |
| ES (1) | ES2076160T5 (fi) |
| FI (1) | FI101632B (fi) |
| GR (1) | GR3017497T3 (fi) |
| IE (1) | IE69753B1 (fi) |
| IL (3) | IL87608A0 (fi) |
| NO (2) | NO301844B1 (fi) |
| WO (1) | WO1989001976A1 (fi) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5925546A (en) * | 1987-11-02 | 1999-07-20 | Chiron S.P.A. | Immunologically active polypeptides with altered toxicity useful for the preparation of an antipertussis vaccine |
| IT1223334B (it) * | 1987-11-02 | 1990-09-19 | Sclavo Spa | Polipeptidi immunologicamente attivi con una tossicita' alterata utili per la preparazione di un vaccino antipertosse |
| US6713072B1 (en) * | 1987-11-02 | 2004-03-30 | Chiron S.R.L. | Immunologically active polypeptides with altered toxicity useful for the preparation of an antipertussis vaccine |
| GB8727489D0 (en) * | 1987-11-24 | 1987-12-23 | Connaught Lab | Detoxification of pertussis toxin |
| US5332583A (en) * | 1987-11-24 | 1994-07-26 | Connaught Laboratories Limited | Vaccine containing genetically-detoxified pertussis holotoxin |
| US5358868A (en) * | 1987-11-24 | 1994-10-25 | Connaught Laboratories Limited | Genetic detoxification of pertussis toxin |
| US7232671B2 (en) * | 1989-02-15 | 2007-06-19 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Pertussis toxin gene: cloning and expression of protective antigen |
| CA2009991A1 (en) * | 1989-02-15 | 1990-08-15 | Witold Cieplak | Pertussis toxin gene: cloning and expression of protective antigen |
| DE69022106T2 (de) * | 1989-04-28 | 1996-02-15 | Sclavo Spa | Pertussistoxin-Mutanten, dieselbe produzierende Bordetella-Stämme und ihre Verwendung als Vakzin gegen Pertussis. |
| US5786189A (en) * | 1989-11-29 | 1998-07-28 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Vaccine |
| GB9326174D0 (en) * | 1993-12-22 | 1994-02-23 | Biocine Sclavo | Mucosal adjuvant |
| US20030072774A1 (en) * | 1994-06-10 | 2003-04-17 | Diane M. Gajewczyk | Proteinaceous adjuvants |
| BR9608114A (pt) * | 1995-05-04 | 2000-10-31 | Connaught Lab | Vacinas de pertussis a celular e processos para preparação das mesmas |
| CA2253937A1 (en) * | 1996-05-10 | 1997-11-20 | Phylomed Corporation | Methods for oxidizing disulfide bonds using ozone |
| FR2754543B1 (fr) * | 1996-10-11 | 1998-12-31 | Pasteur Institut | Souche de bordetella deficiente dans la production de toxine et exprimant une proteine hydride, liposomes comprenant de la fha et leurs utilisations comme vaccins, et utilisation de la fha pour stimuler les reponses immunitaires |
| US6818222B1 (en) | 1997-03-21 | 2004-11-16 | Chiron Corporation | Detoxified mutants of bacterial ADP-ribosylating toxins as parenteral adjuvants |
| US9453251B2 (en) | 2002-10-08 | 2016-09-27 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens |
| GB0313916D0 (en) | 2003-06-16 | 2003-07-23 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine composition |
| JP2008507294A (ja) | 2004-07-26 | 2008-03-13 | ダウ グローバル テクノロジーズ インコーポレイティド | 菌株遺伝子操作による改善されたタンパク質発現のための方法 |
| AU2005317304B2 (en) * | 2004-12-17 | 2011-06-23 | De Staat Der Nederlanden, Vert. Door De Minister Van Vws | Deacylation of LPS in Gram negative bacteria |
| JP5444553B2 (ja) | 2007-04-27 | 2014-03-19 | フェネックス インコーポレイテッド | 微生物宿主を迅速にスクリーニングして、異種タンパク質発現の収率および／または質が改善されている特定の株を同定する方法 |
| US9580719B2 (en) | 2007-04-27 | 2017-02-28 | Pfenex, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
| ITMI20090946A1 (it) | 2009-05-28 | 2010-11-29 | Novartis Ag | Espressione di proteine ricombinanti |
| CA2793978C (en) | 2010-03-30 | 2021-08-03 | Pfenex Inc. | High level expression of recombinant toxin proteins |
| US9169304B2 (en) | 2012-05-01 | 2015-10-27 | Pfenex Inc. | Process for purifying recombinant Plasmodium falciparum circumsporozoite protein |
| US20140037680A1 (en) | 2012-08-06 | 2014-02-06 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Novel method |
| JP2015525794A (ja) | 2012-08-06 | 2015-09-07 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 乳児においてｒｓｖ及び百日咳菌に対する免疫応答を惹起するための方法 |
| MX362793B (es) | 2013-03-08 | 2019-02-13 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Vacuna acelular contra pertussis. |
| BE1022008B1 (fr) | 2013-08-05 | 2016-02-03 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Compositions immunogenes combinees |
| CN109172818B (zh) * | 2018-08-02 | 2021-10-22 | 浙江康佰裕生物科技有限公司 | 一种蛋白牛痘疫苗及其效力检测方法 |
| US20220047690A1 (en) * | 2018-10-15 | 2022-02-17 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Vaccine polypeptide compositions and methods |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4704362A (en) * | 1977-11-08 | 1987-11-03 | Genentech, Inc. | Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression |
| FR2590483B1 (fr) * | 1985-11-22 | 1988-12-09 | Pasteur Institut | Antigenes purifies ayant des proprietes vaccinantes contre b. pertussis, moyens notamment adns recombinants pour les produire et compositions de vaccins les contenant |
| CA1340373C (en) * | 1986-01-28 | 1999-02-02 | Rino Rappuoli | Cloning and sequencing of the dna fragment which codes for the five subunits of the pertussis toxin, a hybrid plasmid containing the dna fragment and micro-organisms transformed by the hybrid plasmid and capable of expressing all or some of the subunits of the pertussis toxin |
| DE3781541T2 (de) * | 1986-12-23 | 1993-05-06 | Univ Leland Stanford Junior | Modifiziertes pertussistoxin. |
| IT1223334B (it) * | 1987-11-02 | 1990-09-19 | Sclavo Spa | Polipeptidi immunologicamente attivi con una tossicita' alterata utili per la preparazione di un vaccino antipertosse |
| GB8727489D0 (en) * | 1987-11-24 | 1987-12-23 | Connaught Lab | Detoxification of pertussis toxin |
| IT1223529B (it) * | 1987-12-18 | 1990-09-19 | Sclavo Spa | Epitopo immunodominante protettivo contenuto nella subunita' s1 della tossina della pertosse |
-
1988
- 1988-08-26 KR KR1019890700803A patent/KR0168039B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-08-26 WO PCT/US1988/002983 patent/WO1989001976A1/en active IP Right Grant
- 1988-08-26 JP JP63507460A patent/JP2918895B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-30 IL IL87608A patent/IL87608A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-08-30 IL IL10312188A patent/IL103121A/en not_active IP Right Cessation
- 1988-09-01 EP EP88308124A patent/EP0306318B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-01 ES ES88308124T patent/ES2076160T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-01 AT AT88308124T patent/ATE125568T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-09-01 EP EP94109317A patent/EP0629696A1/en not_active Withdrawn
- 1988-09-01 DE DE3854213T patent/DE3854213T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-02 IE IE266888A patent/IE69753B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-09-02 CA CA 576469 patent/CA1341560C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-09-05 CN CN88107056A patent/CN1033866C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-05-03 NO NO891842A patent/NO301844B1/no not_active IP Right Cessation
- 1989-05-03 DK DK198902162A patent/DK175821B1/da active
- 1989-05-03 FI FI892131A patent/FI101632B/fi not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-09-09 IL IL103121A patent/IL103121A0/xx unknown
-
1995
- 1995-06-06 US US08/468,679 patent/US5773600A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-21 GR GR950402614T patent/GR3017497T3/el unknown
-
1997
- 1997-06-09 NO NO19972642A patent/NO325016B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI101632B (fi) | Menetelmä Bordetella pertussis-toksiinin alayksikön analogien valmista miseksi ja niitä koodaavia rekombinantti-DNA-molekyylejä | |
| Calderwood et al. | Nucleotide sequence of the Shiga-like toxin genes of Escherichia coli. | |
| US4950740A (en) | Recombinant diphtheria vaccines | |
| FI112090B (fi) | Menetelmä, plasmidi ja mikro-organismi difteriatoksiinin tai sen kanssa ristireagoivan CRM-proteiinin tuottamiseksi | |
| Hwang et al. | Functional domains of Pseudomonas exotoxin identified by deletion analysis of the gene expressed in E. coli | |
| Antoine et al. | Roles of the disulfide bond and the carboxy-terminal region of the S1 subunit in the assembly and biosynthesis of pertussis toxin | |
| JP2714068B2 (ja) | 遺伝子操作による百日ぜきトキシンの無毒化 | |
| US5601827A (en) | Diphtheria toxin vaccines | |
| US6455673B1 (en) | Multi-mutant diphtheria toxin vaccines | |
| JP2685442B2 (ja) | ボルデテラ・パータツシス染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩフラグメント | |
| Petersen et al. | Recombinant derivatives of Pasteurella multocida toxin: candidates for a vaccine against progressive atrophic rhinitis | |
| JPH10234388A (ja) | 淋菌ｐｉタンパク質およびワクチンの製造 | |
| Rule et al. | Overproduction and nucleotide sequence of the respiratory D-lactate dehydrogenase of Escherichia coli | |
| JPS62272989A (ja) | 融合タンパク質、抗体およびこれらの製造方法 | |
| US6309648B1 (en) | Protective epitopes of adenyl cyclase-haemolysin (AC-Hly), their application to the treatment or to the prevention of bordetella infections | |
| Goldschmidt et al. | Regions of the Streptococcus sobrinus spaA gene encoding major determinants of antigen I | |
| SE462285B (sv) | Expression av koleratoxinets bindande subenhet med hjaelp av fraemmande promotor- och/eller ledarpeptidstrukturer | |
| Holmans et al. | Cloning and surface expression in Escherichia coli of a structural gene encoding a surface protein of Haemophilus influenzae type b | |
| US7144576B1 (en) | Modified pertussis toxin | |
| AU623867C (en) | Recombinant DNA-derived bordetella toxin subunit analogs | |
| NZ545713A (en) | Clostridium toxin, and process for the preparation of immunogenic compositions | |
| WO1992017587A1 (en) | Bordetella bronchiseptica outer membrane antigen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: AMGEN INC. |
|
| MA | Patent expired |