JPS62272989A - 融合タンパク質、抗体およびこれらの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 本発明は、免疫原キャリヤ（担持）タンパク質と融合し
たアミノ酸配列を含む融合タンパク質の製造方法に係る
。また本発明は、そうして製造された融合タンパク質を
用いるポリクローナル抗体の製造方法ならびにこの融合
タンパク質のワクチンとしての用途にも関する。

本発明において、所望のアミノ酸配列をコードしている
遺伝子は単離、合成、その他の方法で得られ、こうして
得られたＤＮＡ断片は、この断片がキャリヤタンパク質
配列をコードしているＤＮＡ部分および宿主細胞中での
高いレベルの発現に必要な別の調節配列に同位相でつな
がるようにして、細菌性発現ベクター中に挿入される。

機能性のタンパク賀部分をコードしているＤＮＡセグメ
ントは、理想的には適当な制限酵素で消化するがあるい
は別の方法で操作して付着末端かプラント末端を生成せ
しめ、互いの連結およびプラスミドまたは別のタイプの
クローニングベクターとの連結を容易にする。

本発明を実施するにはさまざまなりローニングベクター
と発現ベクターが使用できる。細菌中で用いる場合には
プラスミドが好ましいがバクテリオファージやコスミド
に由来するベクターでもよい。哺乳動物や植物の細胞で
クローニングを行なう場合にはウィルス誘導体をベクタ
ーとして使うことができる。プラスミドを用いる場合天
然起源のものでも人工的に合成したものでもよい。選択
した特定のプラスミドは宿主として用いる特定の細胞に
適合しなければならない。

組換えベクターの製造、ベクターを用いた宿主細胞の形
質転換、トランスフェクションまたはプロトプラスト融
合、ベクターの複製、ならびにポリペプチドおよびタン
パク質の発現に使用するさまざまな手順と材料は次の文
献中で論じられている： θＩｄ　ａｎｄ　Ｐｒｉｍｒｏｓｅ、　ｆ’ｒｉｎｃｉ
　ａｌｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　）４ａｎｉ　ｕｌａｔｉｏ
ｎ　（２ｎｄ　Ｅｄ、　１９８１）　：Ｈａｎｉａｔｉ
Ｓ　ｅｔ、　ａｌ、、　１４ｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏ
ｎｉｎＱ、　ａ　ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｖｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎｌ
Ｊ　Ｈａｒｂｏｒ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）
　： ５ｉｌｈａｖｙ　ｅｔ、　ａｌ、、　　Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｅｆｕｓｉｏｎｓ、　　Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　１ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ（１９８４）　： Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　
　　Ｅｄｓ、　　　Ｍｕ　　ｅｔ、　　ａｔ、。

ＶＯＩｔｌｌｅＳ　６８．　１００．　１０１．　　Ｒ
（３ＣＯ１ｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｉ）ａｒｔｓＡ、　
　８　ａｎｄ　Ｃ，Ａｃａｄ、　　Ｐｒｅｓｓ　。

ことによって本明細書中に含まれることとする。

本発明は、形質転換された宿主細−での発現後、免疫原
キャリヤタンパク質に融合したある所定のアミノ酸配列
に対する特異的な抗体を製造することのできる方法を提
供するものである。ざらに詳細に述べると本発明は、所
望のアミノ酸配列、すなわちタンパク質、ペプチドまた
は短いアミノ酸配列に対する抗体の生産に関するもので
ある。抗体は上記の融合タンパク質でマウス、ラビット
、その他の適当な動物を免疫することによって作製する
ことができる。キャリヤ分子があるため、所望のペプチ
ドは接種された動物の免疫系によって認識されやすくな
る。キャリヤ分子と共にポリクローナル性のＢ−細胞刺
激効果を用いると免疫された宿主の免疫応答がさらに＾
められる。

また本発明の重要なひとつの一面は、キャリヤタンパク
質に融合したタンパク質部分をコードしているクローン
化または合成したＤＮＡセグメントの発現によって人間
または動物用のワクチンを生産することである。このよ
うなワクチンを接種するとウィルス、細菌、その他の感
染原に対する中和活性を獲得することができる。

この場合、天然のタンパク質の抗原決定基部分をコード
している合成オリゴヌクレオチドを、キャリヤタンパク
質をコードしている遺伝子と融合する。

形成されたハイブリッドタンパク質を望みの宿主に導入
すると、この宿主中で天然タンパク質の抗原決定基部分
に対する抗体の産生が始まり、すなわち細胞性（細胞媒
介）免疫応答が始まる。ワクチンを製造する方法は、対
象とする生物のタンパク質かＤＮＡ配列（宿主ゲノムが
ＲＮＡであればｃＤＮＡ配列）からタンパク質抗原の抗
原決定基部分のアミノ酸配列を決定し、抗原的にはこの
タンパク質の決定基部分の完全またはほとんど完全な複
製品であるタンパク質をコードしているオリゴヌクレオ
チドセグメントを合成し、この抗原性ペプチド部分をコ
ードしているＤＮＡセグメントを発現ベクター中に導入
し、抗原性ペプチドと結合したキャリヤ（担体）から成
るハイブリッドタンパク質を発現させることからなる。

発現用のプラスミドと、コントロールされた生育条件下
でハイブリッドタンパク質を外部媒質（培地）中に分泌
する宿主系とは、スウェーデン特許出願第８５０５９２
１−０号（出願臼１９８５年１２月１７日、“Ａ　ｍｅ
ｔｈｏｄ　ｔｏ　ｅｘｐｏｒｔ　ａｅｎｅ　ｐｒｏｄｕ
ｃｔｓ　ｔｏ　ｔｈｅｇｒｏｗｔｈ　１ｅｄｅｕｌｌ　
Ｏｆ　（ｌｒａｌ　ｎｅ（ｌａｔｉＶｅ　ｂａＣｔｅｒ
ｉａ”）およびスウェーデン特許出願第８５０５９２２
−８号（出願臼　１９８５年１２月１７日、“　Ｃ０ｎ
５ｔｒＬＩＣｔｉＯｎ　ｏｆ　ａｎＩｇＧ−ｂｉｎｄｉ
ｎｇ　　ｐｒｏｔｅｉｎ　　ｔｏ　　ｆａｃｉｌｉｔａ
ｔｅ　ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｕ
ｓｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”
　）に詳細に記載されている。これらの特許の開示内容
は引用によって本明細書中に含まれるものとする。

ハイブリッドタンパク質はキャリヤと所望のタンパク質
とから構成されている。キャリヤはＩａＧ結合タンパク
質（以後免疫グロブリン結合タンパク質、略してＩＧＢ
ｌという）が好ましく、たとえ゛ば黄色ブドウ球菌（５
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）プロティン
Ａとか、スウェーデン特許出願第８５０５９２２−８号
に定義されているＺ−タンパク質やレンサ球菌（５ｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃａ　Ｉ　）プロティンＧのようなプロ
ティンｌ］運タンパク質がある。

所望のタンパク質はキャリヤ（ＩＧＢ）との融合タンパ
ク質（第１図）として精製することができ、したがって
ＩＱＧアフィニティークロマトグラフイーを用いて一段
階で精製することができる（第８図）。所望のタンパク
質は（ホルモンのような）ポリペプチドの一部または全
体であっても、異なるポリペプチドの組合せでもよい。

所望のタンパク質のアミノ末端残基および／またはカル
ボキシ末端残基の両者がキャリヤと融合していることも
できる。

所望のタンパク質にキャリヤを融合するための物学で　
−−ｍ＝゛　　　　−日常使われてすることができる。

さらに、所望のタンパク質の遺伝子は化学的に合成して
キャリヤ遺伝子と融合することができる。この後者の例
は、インスリン様成長因子Ｉ　（ＩＧＦ−１）およびＩ
ＧＦ−１の一部すなわちＩＧＦ−ＩのＣ−末端アミノ酸
１４個をコードしている合成遺伝子Ｉ　Ｇ　Ｆ−５７−
７０の場合について実施例２と３に挙げである。ＤＮＡ
合成技術を用いると２−タンパク質のような新規な（す
なわち天然にはみられない）タンパク質を生産すること
ができる。

すでに指摘したように本発明の概念はペプチド抗原と免
疫原キャリヤとのｉｎ　ｖｉｖｏでの複合体化に基づい
ている。キャリヤはＩＱＧ結合タンパク質が好ましく、
これはＢ細胞マイトジェン活性［５ｊｏｄａｌ　ｅｔ、
　ａｔ、、　５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｎ＋５ｕｎｏ１．
　１０，５９３（１９７９）］　、反復構造［Ｕｈｌｅ
ｎ　ｅｔ、　ａｔ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　２５９．１６９５−１７０２　（１９８
４）］　、および免疫グロブリンとの複合体を形成する
能力によって免疫応答をさらに高めることができる。本
発明の方法の好ましい態様では、ハイブリッドタンパク
質の中に含まれる抗原部分はクローン化された構造遺伝
子、その一部または合成オリゴヌクレオチドによってコ
ードされているものである。本発明は、あらゆるアミノ
酸配列に対する抗体（ポリクローナル、モノクローナル
）の作成を可能にする手段を提供する。

本発明の別の一面は、ある感染原由来ｉの天然タンパク
質の抗原領域をコードしている合成りＮＡセグメントを
設計することによって、前記のハイブリッドポリペプチ
ドをワクチンとして使用することである。

よく知られた標準的な技術を用い、クローン化ＤＮＡセ
グメントまたは合成りＮＡセグメントによって規定され
る所望のアミノ酸配列と融合したキャリヤタンパク質を
含有する融合タンパク質を使用して動物（たとえばラビ
ット）にポリクローナル抗体を産生させる。

簡単にいうと若いラビットの背中に融合タンパク質を皮
下と筋肉内に投与して免疫する。免疫は罰則的にかつさ
まざまな投与量で行ない、所望のペプチドに対する抗体
のｉｎ　ｖｉｖｏ産生を誘発する。

理想的には、最初１００〜ＳＯＯＩ４を投与しその後筒
３１１１００／ｌｌを投与して免疫する。融合タンパク
質を単独で用いる代わりに完全または不完全フロインド
アジュバントと混合して用いてもよい。理想的には、最
初の免疫には完全フロインドアジュバントを使用し、そ
の後の免疫では融合タンパク質を不完全７０インドアジ
ユバントに乳濁して用いる。

また、融合タンパク質を全量−箇所に注射する代わりに
、投与毎にラビットの背中に皮下注射と筋肉注射を多数
回行なうと好ましい。いろいろな時間間隔でラビットか
ら採血し、血清サンプルの抗−ペプチド応答を電気プロ
ットアッセイによってテストする。ラビットの血清タイ
ターが高いときラビットに放血させ、高速遠心によって
血液を凝固させた後血清を得る。この血清から、プロテ
ィンＡアフィニティークロマトグラフィーまたは硫酸ア
ンモニウム沈澱とその後のＤＥＡＥ−クロマトグラフィ
ーのような標準的な技術によって免疫グロブリンＧ（Ｉ
ＱＧ）画分を精製する。こうして精製したＩＧ画分はハ
イブリッドタンパク質分子のアフィニティー精製用抗体
のひとつの起源として使用することができる。

望のペプチドに　するモノクローナル抗体の製造 クローン化されたＤＮＡによって規定される融合タンパ
ク質はまたモノクローナルな抗−ペプチド抗体の作成に
も使用できる。モノクローナル抗−ペブチド抗体を作成
するための好ましい手順は基本的に米国特許第４，４１
１，９９３号（引用によって本明細書中に含まれるもの
とする）に開示されているようなものである。その手順
では、精製した融合タンパク質を用いてＢ＾１Ｂ／ｃマ
ウスを７〜１４日の間隔で数回免疫する。それぞれの注
射毎にさまざまな最の同定（融合）ペプチドを用いる。

１０〜１００　／Ｊｊが理想的である。最初の注射では
ペプチドを完全７０インドアジユバントに乳濁するのが
理想的であり、その後の接種では不完全フロインドアジ
ュバントにペプチドを乳濁する。融合タンパク質を全団
−箇所に注射する代わりに、投与毎にマウスの身体のい
ろいろな部位、たとえば後足に多数回の注射をする。

免疫の過程でマウスから血清サンプルを採取し、その抗
−ペプチド応答をＲＩＡアッセイでテストする。抗体タ
イターが検出されたら同定ペプチドを生理食塩水と混合
した液を動物に静脈注射する。

数日後動物を殺して牌臓を取出す。牌Ｒ細胞の単細胞懸
濁液を、抗体産生細胞の数を増やすために各種の添加剤
を加えた組織培養用の信地中で培養する。この抗体産生
細胞を信地から単離し、標準法によって精製してその後
のミエローマ（骨髄腫）細胞との融合に使用する。

融合プロセスでは、精製した抗体産生細胞細胞をネズミ
科Ｈｕｒｉｄａｅミエローマ細胞と混合し、この混合物
をベレット化する。その後、遠心による２つの異なるタ
イプの細胞の融合を容易にするため細胞ベレットに融合
剤を添加する。融合剤としては、各種タイプのエチレン
オキサイドと水の縮合ポリマー、たとえばポリエチレン
グリコール（以後ｒＰＥＧＪとする）　１５００などが
ある。その他の可能な融合剤としてはセンダイウィルス
のようなりＮＡ転換性ウィルスやそれから得られた融合
タンパク質がある。融合を最適に行なうためには融合剤
の量と濃度を制御しなければならない。

たとえばＰ　Ｅ　Ｇ　１５００を用いる場合この融合剤
は約４０％（重量／容は）とすべきである。しかし、Ｐ
Ｅ　Ｇ　１５００の容量は０．５〜３Ｉｄの範囲でよく
、ＰＥＧ　１５００の濃度は”信地の容量に対して３５
〜６０重伍％で変えられる。

次に細胞を、融合しなかったミエローマ細胞、ミエロー
マ同士の（二倍体）ハイブリッド、融合しなかった牌臓
細胞および牌臓細胞同士の（二倍体）ハイブリッドの増
殖を排除するように選択された抑制剤と各種の添加剤と
を添加した組織培養信地に再度懸濁して抗−ペプチド抗
体産生モノクローナル細胞を増殖させる。このような増
殖禁止剤すなわち抑制剤としてはヒボキサンチン、アミ
ノプテリンおよびチミジンがある（以後まとめてｒＨＡ
ＴＪという）。

組織培養信地には、ハイブリッド抗体産生細胞の増殖を
誘発するためにフィラー細胞も加える。

未だにはうきりとは確認されていないがこのフィラーａ
ｍは少数のハイブリッド細胞がより容易に増殖できて最
適の細胞密度が得られるようにＩＩ能すると考えられる
。また、フィラー細胞はハイブリッド細胞の増殖に必要
な栄養になるとも考えられる。さまざまなタイプのフィ
ラー細胞が使用でき、たとえばＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸
腺細胞がある。その他のタイプのフィラー細胞としては
ネズミ牌臓細胞、放射線を照射したネズミ腹ｍ浸出細胞
およびネズミマクロファージがある。信地にはいろいろ
な濃度のフィラー細胞を添加することができるが、好ま
しくはフィラー細胞を０．５〜５Ｘ１０６コ／ｄの範囲
の濃度でＨＡＴ含有含有転地加するのが好ましく、最適
な密度は約３Ｘ　１０６コ／ｄである。

ただ−回の培養で増殖させる代わりに、再懸濁細胞を増
殖信地、フィラー細胞および選択された抑制剤と共にマ
ルチマイクロタイタープレートに移す。数日培養した後
、以上の手順で生成するハイブリドーマ細胞の抗−ペプ
チド抗体応答をＲＩＡアッセイでスクリーニングする。

正の結果を示すハイブリッド細胞を採集し、限界稀釈法
（詳細は米国特許第４，４１１，９９３号）によってク
ローン化する。この限界稀釈法では、抗−ペプチド抗体
産生ハイブリッド細胞を、フィラー細胞と、融合しなか
った牌臓細胞およびミエローマ細胞の増殖を抑える選択
された抑制剤とを含有する信地中ｉｎ　ＶｉｔｒＯで個
別に培養する。ハイブリッド細胞が増殖するクローニン
グ培養物を所望のペプチドに対する反応性に関してＲＩ
Ａアッセイでスクリーニングする。

融合ペプチドと反応する抗体を含有する上清を生じるク
ローン化されたハイプリドーマを採集し、人情生産のた
めにｉｎ　ｖｉｔｒｏで大容量培養する。あるいは抗−
ペプチド抗体をｉｎ　ｖｉｖｏで殖やすこともできる。

すなわち、クローン化したバイプリドーマ細胞をマウス
の腹膜内キャビティに注射し、その後抗−ペブチド抗体
を高濃度で含有する腹膜内腹水を回収する。本出願人の
知見によると、回収した腹水流体は３η／１Ｉｄｌを越
える濃度でモノクローナルな抗−ペプチド抗体を含有し
ている。この腹水流体が含有する抗体は確立されている
技術、たとえば硫１１７ンモニウム沈澱（ｄｔｒｒｅｒ
ｅｎｔ；ａｔｔｏｎａｍｍｏｎｉｕｍ　５ｕｌｆａｔｅ
　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）とそれに続くゲルカラ
ムクロマドグラフイーによって単離濃縮することができ
る。所要により、この抗体のＳｔａ　ｈ　Ｉｏｃｏｃｃ
ｕｓ　ａＵｒｅｌｊｓ由来プロティンＡに対する結合能
に基づいたアフィニティークロマトグラフィーおよび／
またはイオン交換クロマトグラフィーによって抗体をさ
らに精製することができる。

これらのポリクローナル抗体、ハイブリドーマ上清およ
びモノクローナル抗体の抗−ペプチド応答Ｃ３電気プロ
ットアッセイまたは免疫放射アッセイ（Ｉ　ＲＭＡ）に
よってテストした。

以下添附の図面を参照した非限定的実施例によって本発
明をさらに詳細に説明する。

第１図は実施例１〜３に記載した融合タンパク質の概略
図であり、ＳはプロティンＡのシグナル配列、ＩＧＢは
ＩＱＧ結合ドメイン（領域）を表わす。

第２図は、Ｎｉ１ｓｓｏｎ、　Ｂ、、　ｅｔ、　ａｌ、
、　ＥＨＢＯＪ、、　４゜１０７５−１０８０　（１９
８５）に記載のｐＲＩＴ５にｐｃＨ４Ｇ由来のアルカリ
性ホスファターゼをコードしている遺伝子をクローニン
グしてｐＲＩ丁６を構築する際の説明図である。

第３図は種々のポリクローナル性ラビット抗血清につい
てＩＧＦ−Ｉに対する反応性をテストしたＩ　ＲＭＡア
ッセイの結果を示す図である。このアッセイは既に記載
された通りに行なった。抗体稀釈には、（Ｋ３７、Ｋ５
２、ｎｏｎｉｍｓｕｎｅ−非免疫の場合）０．５％Ｂ　
Ｓ　Ａ　（Ｓｉｕａ＞と０．１％ＮＰ４Ｇを含有するＰ
ＢＳを、（Ｋ１８の場合）０．２５％ゼラチンと０．１
％Ｎ４Ｇを含有するＰＢＳを用いた。

Ｋ１８：ＢＳＡに化学的にカップルした合成ＩＧＦ５７
−７０で免疫したラビット（正のコントロール）、Ｋ３
７：プロテインＡ−ＩＧＦ−１遺伝子線合体で免疫した
ラビット、 Ｋ　５２　：　ＺＺ−ＩＧＦ５７−７０で免疫したラビ
ット、ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ　：免疫していない血清（負
のコントロール）。

第４図は実施例に記載したｐＺＺ−ＩＧＦ＝１の構築の
ためのクローニングの説明図である。ＡＭＰはβ−ラク
タマーゼをコードしている遺伝子、Ｓはシグナル配列、
Ａ−ＥはプロティンＡの［ｏＧ結合ドメイン、ｏｒｉは
複製起点（オリジン）、Ｚは合成断片、ＩＧＦ−１はＩ
ＧＦ−１の遺伝子、Ｆｌはファージｆ１由来の複製起点
、ｌ　ａｃＺはβ−ガラクトシダーゼの遺伝子である。

第５図は実施例２と３に記載したクローニングの説明図
である。Ａｍｐはβ−ラクタマーゼをコードしている遺
伝子、Ｓはシグナル配列、２は合成断片、ＩＧＦ−１は
ＩＧＦ−１の遺伝子である。

第６図はｐＥＺＺ−ＩＧＦ−［プラスミドベクターがコ
ードしているＺＺ−ＩＧＦ−１のヌクレオチド配列とア
ミノ酸配列を示す図である。シグナルペプチド、開裂領
域、２つの２−領域およびＩＧＦ−１をコードしている
領域が構築に関与する制限部位と共に示°されている。

第７図はｐＥＺＺ−ＩＧＦ−Ｐプラスミドベクターがコ
ードしているＺＺ−ＩＧＦ５７−７０のヌクレオチド配
列とアミノ酸配列を示す図である。シグナルペプチド、
２つの２−領域および５７〜７０番目のアミノ酸配列を
コードしている領域が構築に関与する制限部位と共に示
されている。

第８図はアフィニティークロマトグラフィーを用いたｚ
ｚ−ｐポリペプチドすなわちＩＧＢ−ペプチドの精製方
法の説明図である。

以下本発明の特定具体例を説明する。

匿ＩＬＩ！ 細菌宿主　以下の実施例では大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）
Ｋ１２の２つの異なる菌株、すなわち、）−１３１０１
［Ｂｏｙｅｒ、　８４１．、　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｊ、
　Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、、　　４１゜４５９−４７２　　
（１９６９）　］と、ＪＭ８３［Ｖｉｅｒａ、　Ｊ、、
　ｅｔ。

ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　　１９．２５９−２６８　（１
９８２）］を用いた。またＳｔａ　ｈ　Ｉｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ａｕｒｅｕｓ　Ｓ　Ａ　１１３　　［ＩＪｈｌｅｎ
　ｅｔ。

ａｌ、、　（１９８４）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
、　１５９．７１３−７１９　］を用いた。これらの菌
株はスウェーデン、ストックホルムのｔｈｅ　Ｄｅｐａ
ｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎ
ｄｅｔｏｔｅｃｈｎｏ＋ｏｇｙ、　Ｒｏｙａｌ　Ｉｎ５
ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可
能である。

クローニングベヒクル　以下の実施例で使用したクロー
ニングベヒクルは、ＤＢＲ３２２［Ｂｏｌｉｖａｌ、　
Ｆ。

ａｔ、　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　２．９３−１１３　（
１９７７）　］　、ｐＥＨＢ１．８［Ｄｅｎｔｅ　ｅｔ
、　ａｔ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　
　１１．１６４５（１９８３）　］　、１）ＲＩＴ５．
　ｐＲＩ丁６および０ＣＨ４０［旧１ｓｓｏｎ。

Ｂ、、　ｅｔ、　ａｌ、、　ＥＨＢＯＪ、、　　４．１
０７５　（１９８５）　］、１）ｌｌＬ３３．　ＤＥＸ
４−ＩＧＦ−１，ｐＵｃ８−ＺＺｅＪ：ヒｐ２２−ＩＧ
Ｆ−１［にａｂｉｇｅｎ特許出願第８５０５９２２−８
＠、優先日１９８５年１２月１７日］、ならびに　ｐＵ
ｃ８　　［Ｖｉｅｒａ、　Ｊ、、　ｅｔ。

ａｔ、、　Ｇｅｎｅ、　１９．２５９−２６８　（１９
８２）］であった。

緩衝液と信地 整。

Ｐ　Ｂ　Ｓ　：　ＮａＣ１（８，０９＞　、にＩｔ２Ｐ
Ｏ４（０，２ｇ＞　、　Ｎａ２ＨＰ０４Ｘ１２　Ｈ，、
０（２，９９）　、にＣ１（０，２ｇ）　、蒸溜水で１
１１＆：ｉＩ整（ｐＨ７，４）。

Ｐ　ＢＳＴ　：　ＭａＣＩ（８，０ｇ）　、　ＫＨ２Ｐ
Ｏ４（０，２９）　。

（ｐＨ７，４）　　。

ＴＳＢニトリプシン消化ダイズブＯス（３０ｇ）、蒸溜
水で１１に調整、オートクレーブ処理。

ＴＢＡＢ　：　トリプシン消化血液寒天ベース（３０３
）、蒸溜水で１１に調整、オートクレーブ処理。

１」−Ｌｌ いくつかの手順は実施例中で繰返し行なった。

別に特記しないかぎりそれらは常に以下の記載通りに行
なった。分子生物学で日常的に行なわれる方法は記載し
ない（たとえば、市販されている制限酵素、ＤＮＡ連結
（リンカ−）　、１３ａ１３１エキソヌクレアーゼ、Ｓ
１ヌクレアーゼおよびにＩｃｎｏｗポリメラーゼ、ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いた）。

形質転換ニブラスミドＤＮＡによる旦、　ｃｏｌｔ　Ｋ
１２の形質転換は、ＨＯｒｒｉＳＯｎ、　ｏ、／１．、
　ＨｅｔｈＯｄＳ　１ｎＥｎＺＶＩＯＩＯ！ＩＩＶ、　
Ａｃａｄｅｍｉｃ　ＰＩ”＋ＢＳＳ、　６８．３２６−
３３１（１９７９）に記載されている通りに行なった。

この形質転換体は７０ｄ　／　ｉ）のアンピシリンを含
有するプレート（ＴＢＡＢ）上で通常の方法にしたがっ
て選択した。

プラスミドＤＮＡの単１１１ニブラスミドＤＮＡは、Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，、ｅｔ、　ａｌ、、　Ｎｕ
ｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

７、１５１３　（１９７９）に記載のようにして単離し
た。

多数の形質転換体のスクリーニングのための小規模の試
料調製は、に１ｅｓｅｒ、　Ｔ、、　ＰＩａｓａ＋ｉｄ
、　　１２．１９−３６　（１９８４）に記載の通りに
行なった。

ＤＮＡＩＦｉ　　（７）　　Ｌｌｌ：アガロースまたは
ポリアクリルアミドのゲル片からのＤＮＡ断片の溶出は
、Ｈａｘａｔ＊　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、
　　（ＵＳＡ）、　７４．５６０−５６４（１９７７）
の記載の通りに行なった。

゛　　ロース′ル　での　ＮＡの゛結：アガロースゲル
中での直接連結は低温アガロースゲル（Ｌｏｗ　Ｇｅｌ
　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　Ａｇａｒｏｓｅ　Ｇｅ１）
中で電気泳動して実施した。バンドを切出した後ゲル片
を６５℃に加熱して溶かした。Ｔｒ　ｉ　５ｌＷｉ液（
１０ｎＨ。

ｐＨ７，４）を用いて１０倍に稀釈した後連結を実施し
た。

プロティンＡの検出と定量ニブロチインへの定量にはＥ
ＬＩＳＡテスト（エリザ−酵素結合イムノソルベントア
ッセイ）を使用した。このテストには正味の電荷をもた
ない特別なマイクロタイタープレート（オランダ、Ａｍ
５ｔｅｌｓｔａｄ、　Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）を使用する。

コーティング緩衝液に溶かしたヒトＩａＧ（スウェーデ
ン、Ｋａｂｉ社）でウェルを覆う。

テストサンプルを入れ、ウェルの中に吸着されたＩａＧ
のＦｃ部分にプロティンＡを結合させる。

次に、β−ガラクトシダーゼに抱合した（ラビットの）
抗−プロチインＡ（スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ、　
Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）によってプロティン八をアッセ
イする。

アッセイ：コーティング緩衝液に溶かしたヒト■ｇＧ　
（１ｓｎｇ／’ｘｉ！　）の溶液７５成をマイクロタイ
タープレートのウェルに満たし、このプレートを空温で
少なくとも１時間インキュベートする。ウェルをＰＢＳ
ＴｌｏｏＩＪｉでミロ洗浄し、各ウェルに５０屑のサン
プルを入れる。定量のために２倍稀釈を作成する。１時
間インキュベーションした後、ウェルをＰＢＳＴｌｏｏ
ｌｌｌでミロ洗浄し、続いて抗−プロティンＡ−β−ガ
ラクトシダーゼを５０／Ｊｊ！加える（各ウェルに添加
するプロティンＡ結合能の量は、過剰のプロティンＡに
よる滴定で検出されるように各ウェルに添加したｌ１７
Ｇのモル量に対応する）。

４５分間インキュベーションした後、ウェルをＰＢ５Ｔ
１０Ｇ成で五目洗浄し、続いて０ＮＰＧ緩衝液を１２５
ＩＩＩ加える。２０〜３０分間インキュベーションした
後０．１ＭのＮａＯＨを１５０４加えて反応を停止する
。定量は、テストサンプルの２倍稀釈と平行して濃度が
分つているプロティンＡ標準溶液の２倍稀釈を用いて行
なった。光度計によって各ウェルの４０５１’１ｍの吸
収を測定する。

５Ｏ８−ＰＡＧＥ　：　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動は、１０〜２０％の段階的勾配ゲルを用いて
Ｌａｅｍｍｌｉ、　０．に１．　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏ
ｎｄｏｎ）、　２２７　６８０−６８５　（１９７Ｇ）
の記載の通りに行なった。

電気プロット７ツセイ　ＥＩｅＣｔｒＯｂｌＯｔ　ａＳ
Ｓａ　　：Ｌａｅｍｌｌｉ、　Ｕ、に、、　Ｎａｔｕｒ
ｅ　　（Ｌｏｎｄｏｎ）　、　２２７　６８Ｇ−６８５
（１９７０）に記載の不連続５Ｏ８ＩＩ衝液システムを
使用し、還元条件下１０〜２０％ポリアクリルアミドス
ラブゲル中で所望のペプチドの精製試料を電気泳動した
。電気泳動は２０−Ａで３時間行なった。

電気泳動完了後°所望のペプチドをニトロセルロースニ
移Ｌ／７．：　［ＵＳＡ、　７６、４３５０−４３５４
　（１９７９）］　、　コの電気泳動プロットを、残留
する遊離のタンパク質結合部位をブロックするために＋
３７℃で１時間リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３
．５％ヒトＩａＧと共にインキュベートした。これは使
用した特定の免疫検出（ｉａ＋５ｕｎｄｅｔｅｃｔｉｏ
ｎ）のために必要である。

次に、テストするサンプル（ポリクローナル抗体を含有
する動物血清、モノクローナル抗体またはハイブリドー
マ上清）をリン酸緩衝生理食塩水、０．０１％ＮＰ４０
．　３．５％ヒトＩＱＧに稀釈しく理想的には１１５０
〜１／１００Ｇ）　、電気泳動プロットと共に＋４℃で
一晩インキユベートする。ＰＢＳを３回換えてニトロセ
ルロースプロットを濯いだ後、結合した抗体をペルオキ
シダーゼ−族ペルオキシダーゼシステムによって検出す
る。

ＰＢＳ、０．０１％ＮＰ４０，３．５％ヒトＩＱＧで１
：４００に稀釈したラビット抗マウスＩｇＧまたはブタ
抗ラビットＩａＧをニトロセルロースプロットと共に３
７℃で１時間インキュベートした。この紙をＰＢＳで濯
いだ後、１：１６００の稀釈度のマウスＰＡＰまたはラ
ビットＰＡＰの可溶性の複合体と共に３７℃で１時間イ
ンキュベートした。最後にこのプロットを五目ＰＢＳを
換えて濯ぎ、０．１ｑ／ｄノ３，３°−シアミノヘンシ
シン（ｓｉｇＩＩｌａ）トｏ、０１％ノＨ２Ｏ２を含有
する５０１１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中でペルオキシダー
ゼ活性に対して染色した。ニトロセルロースプロットを
脱イオン水浴に移して発色を停止した。

−Ｌ臣■込Ｊ−乙見イ： 精製された所望のペプチドをＯ，ＩＭの炭酸塩緩衝液（
ｐＨ９，４）に稀釈して濃度を約２５〜５０１１ｇ／＃
Ｉｉ！とする。約７５屑を用いて可撓性のＰＶｃマイク
ロタイタープレート（Ｃｏｏｋｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ）をコートした。ＩＧＦ−Ｉに対する反応性を検出
するためにこのアッセイを用いるのであれば稀釈度は５
ＯＮ／ｄとする。−晩＋４℃でインキュベーションした
優、０．５％ＢＳＡと０．１％ＮＰ４０を含有するＰＢ
Ｓかまたは０．２５％ゼラチンと０，１％ＮＰ４０を含
有するＰＢＳでウェルを洗浄した。

さらに各ウェルに０．５％ＢＳＡか０．２５％ゼラチン
を含有するＰＢＳを追加し、その後このマイクロタイタ
ープレートをさらに２時間３７℃でインキュベートして
所望のペプチドと結合しないでウェルの中に残っている
部位を全てブロックする。こうしてＰＢＳは、問題とし
ている抗体がウェルに非特異的に接着するのを阻止する
。この追加のインキュベーションの後ＰＢＳ溶液をデカ
ントする。

次に、テストするサンプル（ポリクローナル抗体を含有
する動物血清、モノクローナル抗体またはハイブリドー
マ上清）をウェルに加え、約１２０分間＋３７℃でイン
キュベートする。インキュベーションの後抗体溶液を除
き、各ウェルをＰＢＳで繰返し洗浄する。その後、約５
０ＩＩＩのＩ　　でラベル（標識）した抗−免疫グロブ
リン抗体を各ウェルに加える。このアッセイを抗−ペプ
チド反応性をもつハイブリドーマ上清を検出するのに用
いるのであれば、　　　■−標識試薬は比活性が１〜５
μＣ１／１４．ウェル当り約３Ｘ１０５Ｃｐ−のラビッ
ト抗−マウス抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ　Ａ／Ｓ）とす
る。

このアッセイを抗−ペプチド反応性をもつラビットのポ
リクローナル抗体を検出するのに用いるのであれば、＊
２５■−１！識試薬は上記と同じ比活性のブタ抗−ラビ
ットＩＱＧ抗体（口ａｋｏｐａｔｔｓＡ／Ｓ）である。

各ウェルには約３Ｘ１０５Ｃｐ−を加える。インキュベ
ーションは一般に＋４℃で一晩である。ＰＢＳで洗浄す
る毎に、ガンマカウンターを用いてマイクロタイターウ
ェルに結合している放射能の」を測定する。ウェル内で
結合している放射能の歯はウェルサンプル中の抗−ペプ
チド抗体の量に直接比例する。

１】 Ｎｉ１ｓｓｏｎ、　Ｂ、　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｅｍｂｏ
、　Ｊ、　４．１０７５−１０８０（１９８５）　（引
用により本明細書中に含まれるものとする）に記載され
ているようにして、Ｌ１匹旦に由来するアルカリ性ホス
ファターゼ遺伝子（シグナル配列は欠く）をｐＲＩＴ５
に挿入した（第２図）。

こう１ノで得られたプラスミドｐＲＩＴ６　　（第２図
）は、天然プロティンへ〇Ｎ末端の２７１個のアミノ酸
残基と、１１残基のリンカ−（つなぎ）領域と、アルカ
リ性ホスファターゼの１３番目の残塁から始まるＣ−末
端部分とで構成される融合タンパク質をコードしている
。プラスミドｐＲＩＴ６を使用してＥ。

凹を形質転換した。ブＯティンＡ−アルカリ性ホスファ
ターゼを生産するために、内因性のアルカリ性ホスファ
ターぜ産生を抑えるべり０．９％リン酸を含有する液体
培地中で細胞を増殖させた。

１）ＲＩＴ６がコードしているプロティンＡ−アルカリ
性ホスファターゼ融合タンパク質はプロティンへのシグ
ナル配列を含有しているため、このハイブリッドは形質
転換された宿主細胞の細胞質膜（ＣＶｔ０Ｉ）ｌａｓｌ
ｉｃ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通って輸送されるはずであ
る。プロティンＡ含量（上記常用方法の項に記載）とア
ルカリ性ホスファターゼ活性とを両方とも測定すると、
この融合タンパク質がペリプラズム中に見られ、その結
果ブドウ球菌のシグナル配列が旦ニー且１」中で酵素の
輸送を指令することができるということが確認される。

アルカリ性ホスファターゼ活性は、業者の薦めに従いｐ
−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｏｍａ　ｐｒｏｄ
ｕｃｔ　Ｎｏ　１０４−０）を用いて比色法でアッセイ
した。

プロティンＡ−アルカリ性ホスファターゼ融合遺伝子を
生産するためにｐＲＩＴ６で形質転換したＬｃｏｌｉ［
ｌ胞をＡ　　　−１の密度となるまで増殖させ５Ｇ た。その後ｔｌｈｌｅｎ　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ
、　２３．３６９−３７８（１９８３）に記載のように
して音波処理で細胞を溶解した。次にアルカリ性ホスフ
ァターゼを精製するために細胞溶解物をＩＱＧ−セファ
ロース４Ｂカラム（スウェーデン、Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）に通した。結合した物質をグリシン緩衝液（０，１Ｈ
ｐＨ３，０）で溶出し、水に対して透析し、凍結乾燥し
た。

この融合タンパク質に対するポリクローナル抗体を製造
するために、完全フロインドアジュバントに乳濁したプ
ロティンＡ−アルカリ性ホスフ？ターゼ８０埒を多部位
に注射してＮｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄラビット二匹を免疫
した。最初の免疫の３週間後と６週間後に同量のタンパ
ク質を二回ブースター注射した。最後のブースター注射
後動物に放血させ、＋４℃で一晩血液を凝固させた後１
０分間３０００ｒｐＨで遠心して血清を調製した。精製
されたＥ、ｃｏｌｉアルカリ性ホスフ？ターゼ（Ｓｉｇ
ｍａ）に対するこの血清の反応性を、上記の電気プロッ
トアッセイの項に記載のようにしてテストした。接種し
たラビットはいずれもアルカリ性ホスファターゼに対す
る特異的な反応性をもつ抗体を産生しているのが判明し
た。

ヒトＩＧＦ−Ｉをコードしている遺伝子の合成とクロー
ニングは既に発表されている［　Ｅｌｍｂｌａｄ。

Ａ、、　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｔ旧ｒｄ　Ｅｕｒｏｐｅａ
ｎ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎ　Ｂｉｏ−ｔｅＣｈｎＯＩ
ＯＩＪＶ　ＩＩＩ、　２８７−２９６．　ｖｅｒｌａＱ
　Ｃｈｅｍｉｅ、　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ　　（１９８４）
］　　。

この遺伝子は２４０塩基対の江ＲＩ　／　Ｈ１ｎｄｌｌ
Ｉ断片に含まれており、この断片はＪ、ｇＲＩ部位から
数塩基対下流に開始コドン（ＡＴＧ）をもち、Ｈ１ｎｄ
ｌ１１部位の数塩基対上流に終結コドン（ＴＡＧ）　）
をもっている。ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎ旧１１部位に挿入旧
札１部位Ｆ−Ｉ遺伝子をもつプラスミドｐＵｃ８を用い
、ｌ：、　ｃｏｌｉ１枯草菌（Ｂ　、　５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ）およびいくつかのブドウ球菌種との間の転移（ｔｒ
ａｎｓｆｅｒ）を可能にするシャトルベクター［Ｎｉ１
ｓｓｏｎ、　ａ、、ａｔ。

ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１３．
１１５１−１１６２　（１９８５）］を構築した。機能
性のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有するプラス
ミドｐＣ１９４［ｔｌｏｒｉｎｏｕｃｈｉ。

Ｓ、、　ａｎｄ　Ｗｅｉｓｂｌｕｍ、　Ｂ、、　Ｊ、　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１５０　。

８１５−８２５　（１９８２）］　ｅＨｉｎｄ［ＩＩテ
開裂し、ｐＵＣ８／ＴＧＦ−■プラスミドの唯一のＨ１
ｎｄ１１１部位に挿入した。

ｐｓＰＡ１６［Ｕｈｌｅｎ、　Ｈ，、Ｇｕｓｓ、　Ｂ、
、　Ｎｉ１ｓｓｏｎ、ａ、、Ｇｏｔｚ。

Ｆ、、　　ａｎｄ　Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、　　Ｈ，、Ｊ、
　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、ユせ。

７１３−７１９　（１９８４）］に由来する、プロモー
ターとシグナル配列とブドウ球菌（５ｔａｐｈｙ　ｌ０
ＣＯＣＣａ　ｌ　）のプロティンＡのＩＱＧ結合領域と
を含有する１、１ｋｂ（７）　Ｅ　ＣＯＲＩ　ｌｉ　片
ヲＥＩＵＣ８／ＩＧＦ−１（７）唯一のＥＣｏＲｌ部位
に挿入してプラスミドｐＵＮ２０１を得た。

このプラスミドｐＵＮ２０１では、頭が欠如した５ｔａ
ｐｈｙ＋ｏｃｏｃｃａ＋プロテインＡがＩＧＦ−Ｉ遺伝
子に融合している。この融合タンパク質は予想分子量が
３８．７３である。

このプラスミドを、標準的なプロトプラストトランスフ
ォーメーション（形質転換）によってＬａ１ｊｒｅｔｌ
ｓ　５Ａ１１３中に導入した。

このハイブリッドタンパク質は効率的に発現され、かつ
Ｓ、　ａｕｒｅｕｓの培地中に分泌された。この余分な
細胞性ハイブリッドタンパク質を氷冷し、ＩＱＧ−セフ
ァ０−ス力ラムに通した。結合した物質をＯ，１Ｍグリ
シン緩衝液（ｐＨ３，０）で溶出し、水に対して透析し
、凍結乾燥した。

ＩＧＦ−Ｉに対するポリクローナル抗体を製造するため
に、フロイント完全アジュバントに乳濁したハイブリッ
ドタンパク質２００埒でＮｅｗＺｅａｌａｎｄホワイト
ラビットを免疫した。この注射は好ましくは後足の筋肉
内と肩甲骨の間の皮下の多部位に行なった。最初の免疫
の３週間後と６週間後に、１００〜２００　＃のハイブ
リッドタンパク質を７０インドの不完全アジュバントに
懸濁して二回ブースター注射した。最後のブースター注
射後心臓を穿刺して血液を採取し、−晩凝固させた後３
０ＧＯｒｐｍで１０分間遠心して血清を１１製し、次い
で既に詳述したＩ　ＲＭＡアッセイによってＩＧＦ−■
に対する血清の反応性をテストした。

第３図のラビットに３７は、ハイブリッドタンパク質プ
ロティンＡ−ＩＧＦ−１で免疫したラビットで、天然の
ＩＧＦ−Ｉタンパク質に対する抗体に関してアッセイし
た結果を、天然のＩＧＦ−Ｉに反応性の他の２種のポリ
クローナル抗体の場合と比較して示す。

一７０ベプチ゛に対するポリクローナル　　の　゛下記
表１に示す２種の別個のＤＮＡオリゴマーを化学的に合
成した： （１）　　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、、　９
７．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉ−ｃａｎ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、　３２７８　（１９
７５）　　：■　Ｈａｔｔｅｕｃｃｉ　ｅｔ、　ａｔ、
、　２１．　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　：
（３）　　Ｈａｔｔｅｕｃｃｉ　ｅｔ、　ａｌ、、１０
３．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉ−ｃａｎ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、　３１８５　（１９
８１）。

嚢ｊ− オリゴマ−１５°−ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＧＡＡオ
リゴマー２３°−ＧＡ　ＧＡＣＣＴＴＩＧＦ−１のアミ
ノＭ５７−Ｔｏ　　　　　　　　Ｌｅｕ　ＧｌｕＡＴＧ
　　ＴＡＣＴＧＣＧＣＴ　　ＣＣＧ　　ＣＴＧ　　ＡＡ
Ａ　　ＣＣＧ　　ＧＣＴ　　ＡＡＡＴＡＣＡＴＧ　　Ａ
ＣＧ　　ＣＧＡ　　ＧＧＣＧＡＣＴＴＴ　　ＧＧＣＣＧ
Ａ　　ＴＴＴＭｅｔ　Ｔｌ／ｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　　Ｐ
ｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　ｐｒｏ　Ａｌａ　　ＬＶＳ
ＴＣＴ　　ＧＣＴ　　ＴＡＡ　　Ｇ−３゜ＡＧＡ　　Ｃ
ＧＡ　　ＡＴＴ　　ＧＧＴ　　ＡＧ−５’Ｓｅｒ　　Ａ
ｌａ　　Ｅｎｄ。

これら２つのオリゴマーは一緒になって終結コドン（Ｔ
ＡＡ＞と、表１中のＤＮＡ配列の下に示したアミノ酸配
列に対する一連のコドンとを構成する。

このアミノ酸配列は所望のペプチドの抗原性部分（Ｉ　
Ｇ　Ｆ５７−７０）を構成している。２つのオリゴマー
が組合わせられている表１から分るようにこれらのオリ
ゴマーの一端はＥＣ０ＲＩ制限工ンドヌクレアーゼ開裂
部位と適合性の末端であり、他端は制限エンドヌクレア
ーピ開裂部位ＢａｍＨＩと適合性の末端である。

上記の常用方法の項に示したように酵素Ｔ４ＤＮＡポリ
ヌクレオチドキナーゼとＡＴＰを用いてこれら２種のオ
リゴマーをリン酸化した。各オリゴマーを２５ｐｍｏｌ
ずつ一緒にし、混合物を１５℃でインキュベートし、約
１時間かけてゆっくりと温度を空温まで下げることによ
ってキナーゼ緩衝液中でハイブリダイズさせた。この組
合わせたオリゴマー用のクローニングベクターは第４図
に示したＤ２Ｚ−ＩＧＦ−Ｉ　テアッｔ：、。Ｌ、　（
７）　ＤＺＺ−ＩＧＦ−１（７）構築は次のようにした
（第４図）。ｐＵｃ８−ＺＺ（Ｋａｂｉｇｅｎ特許出願
第８５０５９２２−８号、優先日１９８５年１２月１１
日）をＦＳＩ）ＩとＥＣ０ＲＩで消化し、ＬＧＴアガロ
ース上で最も小さい断片を単離した。プラスミドベクタ
ー　ｐｌ（Ｌ３３をＬｕ■で消化し、最大の断片をＬＧ
Ｔアガロース上で単離した。プラスミドｐＥＸ４−ＩＧ
Ｆ−ＩをＪＥ！Ｉと１並Ｒ１で消化し、ＩＧＦ−Ｉ遺伝
子からＡＭＰ遺伝子にまたがっている小さい断片を単離
した。これら３つの断片を常用方法の項に記載したよう
にして互いに連結し、連結混合物でＥ、　ｃｏｌｉＪＭ
８３を形質転換した。形質転換体は、アンピシリン７０
ＩＩＩｌ／　ｌｌｌ１を含有する１Ｂ寒天倍地を用いて
選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素で解析
してこの形質転換体がプラスミドｐＺ！−ＩＧＦ−１を
もっていることを確認した。

プラスミドｐ２Ｚ−ＩＧＦ−Ｉを江Ｒ１と堕Ｈｌで消化
し、低ゲル温度（ＬＧＴ）アガロース上で精製した。ｐ
ＺＺ−ＩＧＦ−Ｉからの精製プラスミド断片の一部と（
０，０ｐｍｏｌ）および上記のハイブリダイズしたオリ
ゴマー（６ｐａ＋ｏｌ）を混合して５０屑中で連結した
。この混合物を用いてＥ、Ｃ０Ｉｉのコンピテント（受
容可能）な細胞を形質転換した。形質転換体の選択はア
ンピシリン５ｈｙ　／　ｘｉを含有するＴＢＡＢプレー
ト上で行なった。

得られたコロニーを免疫プロット分析（ｉｌｌｌｔｌｎ
Ｏ−ｂｌＯｔ　ａｎａｌａｙｓｉｓ）によってさらに分
析した。ＩＧＦ−１抗原の検出にはに１８ラビツト血清
（第３図に１８参照）を、ｚｚタンパク質の検出には非
免疫血清を用いた。免疫プロット技術によって同定され
た正のコロニー２個についてはさらに制限酵素マツピン
グによって解析した。このプラスミドを含む細胞を５０
０ｍスケールで増殖させ、アフィニティーゲルクロマト
グラフィー（ＩｏＧ−セファロース）を用いてＺ　Ｚ　
５７−７０ハイブリツドタンパク質を精製した。

このタンパク質を５Ｏ８−ゲル電気泳動とウェスタンプ
ロット分析とを使用して解析した。これら正の菌株２つ
を標準法によって精製した。

プラスミドＤＮＡをＥＣ０ＲＩとＨ１ｎｄｌｌｌで消化
しテＩＧＦ−５７−７０インサート全体と共ニ１）ＵＣ
８（７）ＬＬ！ＨＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ力ｔ　ｙ　ト（
７）一部を切出した。

この構築の出発材料はプラスミドベクターｐｚｚ−ＩＧ
Ｆ−Ｉであった。プロモーター、シグナル配列、２つの
２領域、およびＩＧＦ−１遺伝子を含む遺伝子断片を、
制限エンドヌクレアーゼＮ　ｏｔ　Ｉと凸旧ＩＩによっ
て切出した。この断片をｐＥＨＢＬＢ［Ｄｅｎｔｅ　ｅ
ｔ、　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、
　　１１．６４５（１９８３）　］中でクローン化した
。このプラスミドではＥＣ０ＲＩ制限部位が予めＮ　Ｏ
ｔ　■部位に連結されて圓Ｉ　／　ＬＬｎｄ　Ｉ　Ｔ　
Ｉになっている。

得られたプラスミド（ｐＥＺＺ−ＩＧＦ−１とする）は
、旦ユーシロユに導入すると１Ｚ−ＩＧＦ−１ポリペプ
チドの高い細胞外発現を指令する。

ＩＧＦ−１遺伝子を上記の合成リンカ−断片Ｅ　ｃｏＲ
Ｉ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌで置換えることによって、免疫原
性ペプチド（Ｐ）をコードしている合成リンカ−をＩ）
ＥＺＺ−ｒＧＦ−１中にクローン化した。得られたプラ
スミドベクターは１）ＥＺＺ−Ｐと指称され、ＩＧＦｉ
のペプチド５７−７０　　（以後単にペプチドという）
に融合した２つの７領域をコードしている（第５図）。

ｐＥＺＺ−ＩＧＦ−１の構築においてＺ領域を遺伝子レ
ベルで重合（増幅）した。これはＡ　ｃｃ　［で開裂し
再結合して達成することができる。このようにしてＺ遺
伝子の「頭」と「尾」の末端にそれぞれ異なる付着端配
列をもつＺ断片が切出される。これによってこのＺ断片
の頭と尾を突合せた連結が確保される。プラスミドベク
ターｐＥＺＺ−ＩＧＦ−１をＡ　ＣＣＩで開裂し、Ｚ断
片とベクター断片とをアガロースゲルから回収した。ベ
クター断片を添加する前に精＄ｌｚ断片を２０分間連結
して重合させた。形質転換後イヌ血清を含有する寒天プ
レート上でハローによる選択を行なった。イヌ血清プレ
ート上でコロニーの回りに沈澱ハローを生じるには２個
以十の７断片が必要である。ハローを生じるクローンか
らプラスミドＤＮＡを単離し制限解析をすると７断片を
２〜１０個もつクローンが単離できた。

プロモーターと１０個の７断片を含むＮ０ｔｌ／Ｌ並Ｒ
ｆ制限断片を、ｐＥＺＺ−Ｐ中（祖旦ｌ／江Ｒ１）のＺ
ｚ断片の代わりにクローン化した。得られたプラスミド
ベクター（ｐＥＺＸ−ｐという）は「ペプチド」に融合
した１０個のｚｆ！４域をコードしている。

ＺＺが７で置換えられた遺伝子断片を得るために、プラ
スミドベクター　ｐＥＺＺ−ＰをＮ０ｔＩ／ＥＣ０ＲＩ
で開裂し、プラスミドベクターｐＡｓＺ２［にａｂｔｃ
ｅｎ特許出願第８５０５９２２−８号、優先日１９８５
年１２月１７日］に由来する２断片を連結してベクター
　ＤＥＩ−Ｐを得た。

１１へｉ里亙且１： 抗原Ｚ−Ｐ、　ＺＺ−ＰオヨヒＺＸ−Ｐ　（Ｐハｆｆｉ
記のペプチド）はいずれも同じ方法で作成した。

それぞれプラスミドベクターｐＥＺ−Ｐ、　ｐＥＺＺ−
ＰおよヒＩ）ＥＺＸ−Ｐヲ含有ｔ６Ｅ、　ｃｏｌｉＨＢ
　　１０１株を２１の実験室用ベンチファーメンタ−で
増殖した。

指数増殖期の間３７℃で醗酵後、定常増殖期の始めに温
度を４２℃に変え、４２℃で２時間後ファーメンターを
１０℃に冷やした。遠心後増殖信地をＩｇＧ−セファ０
−ス力ラム（スウェーデン、ＵｐｐＳａｌａ。

Ｐｈａｒ＊ａｃｉａ）に流した。塩（５０ｎ＋ＨＴｒｉ
ｓ　ｐＨ７，４゜１５０ａ＋ＨＮａＣＩ）を含有するＴ
ｒｉｓｌｌｌｊ液をベッドボリュームの５倍容量用いて
カラムを洗浄し、Ｎｉ１４ＡｃでｐＨ２，８に滴定した
１８　ＨＡｃを用いて生成物を溶出した。溶出した物質
を凍結乾燥し、免疫に使用できるようにしておいた（第
８図）。

７ｎインドの完全アジュバントに懸濁した２Ｚ−ＩＧＦ
−５７−７０融合タンパク質２００ＩＪｓを、好ましく
は後足と肩甲骨間の多部位に筋肉内および皮下注射して
ＮｅｗＺｅａｌａｎｄホワイトラビットに初期免疫を施
した。最初の注射の３週間後から１３！１間の間隔で五
目フロイントの不完全アジュバントに懸濁した同じ漫の
タンパク質を用いて追加のブースター注射をした。三回
目のブースター後注射した動物の耳静脈から血液サンプ
ルを採取し、＋４℃で一晩血液を凝集させ、エツペンド
ルフ遠心管中１２．０００ｒｐｍで１０分間遠心して血
清を調製した。

血清中にＩＧＦ−Ｉに対して反応性の抗体が存在するか
どうかを、既に詳述したＩ　ＲＭＡアッセイを用いてテ
ストした。第３図のラビットに５２は、ハイブリッドタ
ンパク質７Ｚ−ＩＧＦ−１−５７−７０で免疫した一匹
のラビットについて天然のＩＧＦ−１タンパク質と反応
性の抗体の存在をアッセイした結果を、天然のＩＧＦ−
Ｉタンパク質と反応性の他の２つのポリクローナル抗体
の結果と比較して示す。

この結果は、このハイブリッドタンパク質に対して得ら
れた特異的抗体が天然ＩＧＦ−１を認識することを示し
ている。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１〜３に記載した融合タンパク質の概略
図であり、ＳはプロティンＡのシグナル配列、ＩＧＢは
ＩＱＧ結合ドメイン（領域）を表わす。 第２図は、Ｎｉ１ｓｓｏｎ、　Ｂ、、　ｅｔ、　ａｌ、
、　ＥＨＢＯＪ、、　４゜ＩＱ７５−１０８０　（１９
８５）に記載のｐＲＩＴ５にｐｃＨ４０由来のアルカリ
性ホスファターゼをコードしている遺伝子をクローニン
グしてｐＲＩＴ６を構築する際の説明図である。 第３図は種々のポリクローナル性ラビット抗血清につい
てＩＧＦ−１に対する反応性をテストしたｌ　ＲＭＡア
ッセイの結果を示す図である。このアッセイは既に記載
された通りに行なった。抗体稀釈には、（Ｋ３７、Ｋ５
２、ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ＝非免疫の場合）０．５％Ｂ　
Ｓ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ）と０，１％ＮＰ４０を含有する
ＰＢＳを、（Ｋ１８の場合）　０．２５％ゼラチンと０
．１％Ｎ４０を含有するＰＢＳを用いた。 Ｋ１８：ＢＳＡに化学的にカップルした合成ＩＧＦ５７
−７０で免疫したラビット（正のコントロール）、Ｋ３
７：プロテインＡ−ｒＧＦ−１１１伝子融合体で免疫し
たラビット、 Ｋ　５２　：　ＺＺ−ＩＧＦ５７−７０　ｒ免疫したラ
ビット、ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ　：免疫していない血清（
負のコントロール）。 第４図は実施例に記載したｐＺＺ−ＴＧＦ−１の構築の
ためのクローニングの説明図である。ＡＭＰはβ−ラク
タマーゼをコードしている遺伝子、Ｓはシグナル配列、
Ａ−ＥはプロティンＡのＩＱＧ結合ドメイン、ｏｒｉは
複製起点（オリジン）、ｚは合成断片、ＩＧＦ−ＩはＩ
ＧＦ−１の遺伝子、Ｆｌはファージｆ１由来の複製起点
、Ｉ　ａｃＺはβ−ガラクトシダーゼの遺伝子である。 第５図は実施例２と３に記載したクローニングの説明図
である。Ａｍｐはβ−ラクタマーゼをコードしている遺
伝子、Ｓはシグナル配列、Ｚは合成断片、ＩＧＦ−１は
ＩＧＦ−１の遺伝子である。 第６図はｐＥＺＺ−ＩＧＦ−１プラスミドベクターがコ
ードしているＺＺ−ＩＧＦ−１のヌクレオチド配列とア
ミノＪ！＆！列を示す図である。シグナルペプチド、開
裂領域、２つの２−領域およびＩＧＦ−Ｉをコードして
いる領域が構築に関与する制限部位と共に示されている
。 第７図は１）ＥＺＺ−ＩＧＦ−Ｐプラスミドベクターが
コードしているＺＺ−ＩＧＦ５７−７０のヌクレオチド
配列とアミノ酸配列を示す図である。シグナルペプチド
、２つの２−領域および５７〜７０番目のアミノ酸配列
をコードしている領域が構築に関与する制限部位と共に
示されている。 第８図はアフィニティークロマトグラフィーを用いたｚ
ｚ−ｐポリペプチドすなわちｌＧ３−ペプチドの精製方
法の説明図である。 代理人弁理士　中　　　村　　　　至 く　　　　の　　　　　Ｏ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）免疫原キャリヤタンパク質と融合したアミノ酸配
   列を含む融合タンパク質を製造するための方法であって
   、前記配列をコードしているクローン化または合成ＤＮ
   Ａセグメント（このＤＮＡセグメントは前記免疫原キャ
   リヤタンパク質をコードしている遺伝子と融合している
   ）を発現ベクター中に導入し、このような発現ベクター
   を用いて宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞に融合タ
   ンパク質を発現させ、これを回収することを特徴とする
   方法。
2. （２）前記ＤＮＡセグメントをプラスミド中に導入する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）前記プラスミドが天然産または人工製であること
   を特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の方法。
4. （４）適当な制限酵素で消化することによって前記ＤＮ
   Ａ断片を導入することを特徴とする特許請求の範囲第１
   項〜第３項のいずれかに記載の方法。
5. （５）天然タンパク質の抗原決定基をコードしている合
   成ＤＮＡセグメントを発現ベクター中に導入し、前記キ
   ャリヤタンパク質をコードしている遺伝子と融合するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれ
   かに記載の方法。
6. （６）キャリヤタンパク質が免疫グロブリン結合タンパ
   ク質（ＩＧＢ）であることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項〜第５項のいずれかに記載の方法。
7. （７）キャリヤタンパク質が￥Ｓ．ａｕｒｅｕｓ￥プロ
   テインＡまたはこれに関連したタンパク質であることを
   特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の方法。
8. （８）アミノ末端残基とカルボキシ末端残基が双方とも
   キャリヤタンパク質と融合していることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載の方法。
9. （９）特許請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載
   の方法によって製造された融合タンパク質。
10. （１０）特許請求の範囲第９項に記載の融合タンパク質
    を用いて動物を免疫し、この動物に放血させ、生成した
    抗体を動物の血清から回収することからなるポリクロー
    ナル抗体の製造方法。
11. （１１）免疫される動物が哺乳動物であることを特徴と
    する特許請求の範囲第１０項に記載の方法。
12. （１２）哺乳動物がラビットおよびマウスの中から選択
    されることを特徴とする特許請求の範囲第１１項に記載
    の方法。
13. （１３）特許請求の範囲第９項に記載の融合タンパク質
    の、ワクチンとしての用途。
14. （１４）ウィルス、細菌、その他の感染に対抗するため
    の、特許請求の範囲第１３項に記載の用途。
15. （１５）特許請求の範囲第９項に記載の融合タンパク質
    の、モノクローナル抗体を製造するための用途。