JPH05339295A - 抗体の作成方法 - Google Patents
抗体の作成方法Info
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- JPH05339295A JPH05339295A JP34867791A JP34867791A JPH05339295A JP H05339295 A JPH05339295 A JP H05339295A JP 34867791 A JP34867791 A JP 34867791A JP 34867791 A JP34867791 A JP 34867791A JP H05339295 A JPH05339295 A JP H05339295A
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- dhfr
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- peptide
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】ジヒドロ葉酸還元酵素（以下ＤＨＦＲ）のカル
ボキシル末端に目的ペプチドを結合した融合タンパク質
を作成し、それを免疫用抗原として用いることを特徴と
する抗体の作成方法の提供。 【構成】遺伝子工学的手法を用いた目的ペプチドをカル
ボキシ末端側に有するＤＨＦＲ融合タンパク質の作成、
目的融合タンパク質の宿主菌からの精製分離、および高
度精製した目的融合タンパク質を用いた動物の免疫感作
用、の手段より構成されるペプチドに対する抗体の調製
方法。
ボキシル末端に目的ペプチドを結合した融合タンパク質
を作成し、それを免疫用抗原として用いることを特徴と
する抗体の作成方法の提供。 【構成】遺伝子工学的手法を用いた目的ペプチドをカル
ボキシ末端側に有するＤＨＦＲ融合タンパク質の作成、
目的融合タンパク質の宿主菌からの精製分離、および高
度精製した目的融合タンパク質を用いた動物の免疫感作
用、の手段より構成されるペプチドに対する抗体の調製
方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学的にジヒド
ロ葉酸還元酵素（以下ＤＨＦＲ）のカルボキシル末端に
目的ペプチドを結合した融合タンパク質を作成し、それ
を免疫用抗原として用いることを特徴とする抗体の作成
方法に関するものである。本発明の産業上の利用分野と
しては、臨床検査及び医薬品製造の分野が上げられる。
ロ葉酸還元酵素（以下ＤＨＦＲ）のカルボキシル末端に
目的ペプチドを結合した融合タンパク質を作成し、それ
を免疫用抗原として用いることを特徴とする抗体の作成
方法に関するものである。本発明の産業上の利用分野と
しては、臨床検査及び医薬品製造の分野が上げられる。
【０００２】
【従来の技術】生体内に存在する微量生理活性物質を特
異的に検出し定量する方法として、抗原−抗体反応にお
ける免疫学的分子認識特性と放射性同位元素の放射能ま
たは酵素活性の高感度検出による定量特性を組み合わせ
た放射免疫測定法（ＲＩＡ）及び酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）が知られている。これら免疫測定法は血清など試料
中の測定対象物質を高感度かつ比較的容易に定量できる
ことから、測定対象物質の数が年々増加の一途をたどっ
ており、臨床検査など医療福祉の分野において一つの産
業を形成しつつある。特にＥＩＡはＲＩＡが法的規制の
ある放射性同位元素を用いなければならない不便さがあ
るのに対し、酵素活性を検出手段に用いるため取扱いが
容易であり、最近はＥＩＡによる測定法が普及しつつあ
る。
異的に検出し定量する方法として、抗原−抗体反応にお
ける免疫学的分子認識特性と放射性同位元素の放射能ま
たは酵素活性の高感度検出による定量特性を組み合わせ
た放射免疫測定法（ＲＩＡ）及び酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）が知られている。これら免疫測定法は血清など試料
中の測定対象物質を高感度かつ比較的容易に定量できる
ことから、測定対象物質の数が年々増加の一途をたどっ
ており、臨床検査など医療福祉の分野において一つの産
業を形成しつつある。特にＥＩＡはＲＩＡが法的規制の
ある放射性同位元素を用いなければならない不便さがあ
るのに対し、酵素活性を検出手段に用いるため取扱いが
容易であり、最近はＥＩＡによる測定法が普及しつつあ
る。
【０００３】免疫測定法を確立する場合、測定対象生理
活性分子に対して特異的に結合する抗体を調製しなけれ
ばならない。一般に、分子量数千もしくはそれ以下のペ
プチドは抗原活性が極めて低く、ペプチドをウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）等の高分子担体に化学結合させ、抗
原活性を高めた複合体を調製し、免疫感作をしなければ
ならない。
活性分子に対して特異的に結合する抗体を調製しなけれ
ばならない。一般に、分子量数千もしくはそれ以下のペ
プチドは抗原活性が極めて低く、ペプチドをウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）等の高分子担体に化学結合させ、抗
原活性を高めた複合体を調製し、免疫感作をしなければ
ならない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来、
低分子ペプチドの高分子担体への結合には、グルタルア
ルデヒドなどの２価性架橋試薬が用いられ、架橋反応の
効率が低いことの他に、架橋反応の原理が、本質的には
アミノ酸側鎖のアミノ基もしくはカルボキシル基の化学
修飾反応であるため、高分子担体に結合したペプチドの
構造が目的ペプチドそれ自身の構造と異なること、すな
わち、修飾されているアミノ酸側鎖の構造がもとのペプ
チドの側鎖が修飾されている形をとること、が原理的に
避けられない大きな問題として上げられていた（岩崎辰
夫、安東民衛、市川かおる、保井孝太郎、「単クローン
抗体−ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」、講談社サイエン
ティフィク）。
低分子ペプチドの高分子担体への結合には、グルタルア
ルデヒドなどの２価性架橋試薬が用いられ、架橋反応の
効率が低いことの他に、架橋反応の原理が、本質的には
アミノ酸側鎖のアミノ基もしくはカルボキシル基の化学
修飾反応であるため、高分子担体に結合したペプチドの
構造が目的ペプチドそれ自身の構造と異なること、すな
わち、修飾されているアミノ酸側鎖の構造がもとのペプ
チドの側鎖が修飾されている形をとること、が原理的に
避けられない大きな問題として上げられていた（岩崎辰
夫、安東民衛、市川かおる、保井孝太郎、「単クローン
抗体−ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」、講談社サイエン
ティフィク）。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を本質的に解消する手段に関して鋭意研究を行い、既
に本発明者らが、遺伝子工学的にＤＨＦＲのカルボキシ
ル末端に異種ペプチドを結合した融合タンパク質の発現
生産技術を確立している（特公平３−４９５５９号公
報、特開昭６３−８９９８１号公報、特開昭６３−１０
２６９６号公報、特開平１−２５２２９０号公報）こと
に着目した。すなわち、目的ペプチドをＤＨＦＲのカル
ボキシル末端側に融合した形で大腸菌などの宿主に大量
に発現させ、これを分離精製し、高度精製した融合タン
パク質を用いて免疫動物を免疫感作することを考案し
た。
点を本質的に解消する手段に関して鋭意研究を行い、既
に本発明者らが、遺伝子工学的にＤＨＦＲのカルボキシ
ル末端に異種ペプチドを結合した融合タンパク質の発現
生産技術を確立している（特公平３−４９５５９号公
報、特開昭６３−８９９８１号公報、特開昭６３−１０
２６９６号公報、特開平１−２５２２９０号公報）こと
に着目した。すなわち、目的ペプチドをＤＨＦＲのカル
ボキシル末端側に融合した形で大腸菌などの宿主に大量
に発現させ、これを分離精製し、高度精製した融合タン
パク質を用いて免疫動物を免疫感作することを考案し
た。
【０００６】しかしながら、通常行われるＢＳＡなどの
高分子担体に化学的結合法によりペプチドを結合したも
のを用いる場合は、ＢＳＡ１分子に複数個（数十個）の
目的ペプチドが結合するのに対して、本発明の融合タン
パク質の場合は、高分子担体（すなわちＤＨＦＲ部分）
１分子に対して、結合する目的ペプチドが１分子であ
る。このため、本発明で用いられる融合タンパク質を用
いて動物を免疫感作した場合、抗体産生に必要な強い抗
原活性が得られるかに関しては全く不明であった。後に
実施例で示されるように、実験を行った結果、非常に少
量（５０μｇ程度）の融合タンパク質でも、抗体産生を
誘発できることが明らかにされ、これにより、考案した
方法が現実に達成できることを明かにし、本発明を完成
させるに至った。
高分子担体に化学的結合法によりペプチドを結合したも
のを用いる場合は、ＢＳＡ１分子に複数個（数十個）の
目的ペプチドが結合するのに対して、本発明の融合タン
パク質の場合は、高分子担体（すなわちＤＨＦＲ部分）
１分子に対して、結合する目的ペプチドが１分子であ
る。このため、本発明で用いられる融合タンパク質を用
いて動物を免疫感作した場合、抗体産生に必要な強い抗
原活性が得られるかに関しては全く不明であった。後に
実施例で示されるように、実験を行った結果、非常に少
量（５０μｇ程度）の融合タンパク質でも、抗体産生を
誘発できることが明らかにされ、これにより、考案した
方法が現実に達成できることを明かにし、本発明を完成
させるに至った。
【０００７】
【発明の構成】本発明の抗体の作成方法は、目的ペプチ
ドをカルボキシル末端側に有するＤＨＦＲ融合タンパク
質を作成し、これを免疫感作用抗原として用いることに
特徴を有する。
ドをカルボキシル末端側に有するＤＨＦＲ融合タンパク
質を作成し、これを免疫感作用抗原として用いることに
特徴を有する。
【０００８】本発明に従えば、目的ペプチドをカルボキ
シル末端側に有するＤＨＦＲ融合タンパク質を用いるこ
とにより、目的ペプチドに対する抗体を容易に作成する
ことができる。また、従来用いられている高分子に結合
したペプチドと異なり、抗原として用いられる融合タン
パク質がタンパク質として均一である。更に、ペプチド
のアミノ末端がＤＨＦＲのカルボキシル末端と結合して
いる以外は、アミノ酸側鎖は全く修飾されておらず、従
来の方法による原理的な欠点を解消している。
シル末端側に有するＤＨＦＲ融合タンパク質を用いるこ
とにより、目的ペプチドに対する抗体を容易に作成する
ことができる。また、従来用いられている高分子に結合
したペプチドと異なり、抗原として用いられる融合タン
パク質がタンパク質として均一である。更に、ペプチド
のアミノ末端がＤＨＦＲのカルボキシル末端と結合して
いる以外は、アミノ酸側鎖は全く修飾されておらず、従
来の方法による原理的な欠点を解消している。
【０００９】目的ペプチドをカルボキシル末端側に有す
るＤＨＦＲ融合タンパク質を免疫感作用抗原として用い
ることの利点としては、ＤＨＦＲ酵素活性を利用する
ことにより高度に精製することができ、不純物に由来す
る不用な抗体の産生誘導を抑えることができる。融合
タンパク質が均一である。アミノ末端がＤＨＦＲのカ
ルボキシル末端に結合している以外は、目的ペプチドと
全く同一の構造をしている。ＤＨＦＲが細菌由来であ
り、免疫動物との類縁性が非常に離れていることから、
抗体産生に増強効果が期待できる。などである。
るＤＨＦＲ融合タンパク質を免疫感作用抗原として用い
ることの利点としては、ＤＨＦＲ酵素活性を利用する
ことにより高度に精製することができ、不純物に由来す
る不用な抗体の産生誘導を抑えることができる。融合
タンパク質が均一である。アミノ末端がＤＨＦＲのカ
ルボキシル末端に結合している以外は、目的ペプチドと
全く同一の構造をしている。ＤＨＦＲが細菌由来であ
り、免疫動物との類縁性が非常に離れていることから、
抗体産生に増強効果が期待できる。などである。
【００１０】本発明は、（１）遺伝子工学的手法を用い
た目的ペプチドをカルボキシル末端側に有するＤＨＦＲ
融合タンパク質の作成、（２）目的融合タンパク質の宿
主菌からの精製分離、および（３）高度精製した目的融
合タンパク質を用いた動物の免疫感作用、により達成で
きる。
た目的ペプチドをカルボキシル末端側に有するＤＨＦＲ
融合タンパク質の作成、（２）目的融合タンパク質の宿
主菌からの精製分離、および（３）高度精製した目的融
合タンパク質を用いた動物の免疫感作用、により達成で
きる。
【００１１】目的ペプチドをカルボキシル末端側に有す
るＤＨＦＲ融合タンパク質の遺伝子工学的手法による作
成方法（特公平３−４９５５９号公報、特公平３−３３
３１５号公報、特開昭６３−８９９８１号公報）及び目
的融合タンパク質の宿主菌からの精製分離方法（特開昭
６３−１０２６９６号公報、特開平１−２５２２９０号
公報）に関しては、本発明者らによって開発されてお
り、その方法に従うことにより、高度精製した目的融合
タンパク質を入手することができる。なお、ＤＨＦＲと
の融合タンパク質の作成方法は、枯草菌及び大腸菌由来
のＤＨＦＲを用いた方法について公知であるが、各種生
物由来のＤＨＦＲを用いた場合も可能であることを容易
に類推することができることから、本発明は、ＤＨＦＲ
の起源に限定されない。
るＤＨＦＲ融合タンパク質の遺伝子工学的手法による作
成方法（特公平３−４９５５９号公報、特公平３−３３
３１５号公報、特開昭６３−８９９８１号公報）及び目
的融合タンパク質の宿主菌からの精製分離方法（特開昭
６３−１０２６９６号公報、特開平１−２５２２９０号
公報）に関しては、本発明者らによって開発されてお
り、その方法に従うことにより、高度精製した目的融合
タンパク質を入手することができる。なお、ＤＨＦＲと
の融合タンパク質の作成方法は、枯草菌及び大腸菌由来
のＤＨＦＲを用いた方法について公知であるが、各種生
物由来のＤＨＦＲを用いた場合も可能であることを容易
に類推することができることから、本発明は、ＤＨＦＲ
の起源に限定されない。
【００１２】融合タンパク質の生成は、目的ペプチドを
暗号化するＤＮＡを合成、もしくは単離し、これを本発
明者らが既に開発している融合タンパク質作成用ベクタ
ーに組み込み、目的融合タンパク質を大腸菌などの宿主
菌体で発現させる。宿主菌体を培養し、これから発現し
た融合タンパク質をＤＨＦＲ活性を目安に高度に精製す
る。目的ペプチドに関しては、大腸菌のＤＨＦＲを用い
た場合、２００アミノ酸程度よりなるプロラクチンとの
融合タンパク質の発現生産に関して成功していることか
ら（特開平２−１４２４７９号公報）、任意長さのペプ
チドを用いることができる。
暗号化するＤＮＡを合成、もしくは単離し、これを本発
明者らが既に開発している融合タンパク質作成用ベクタ
ーに組み込み、目的融合タンパク質を大腸菌などの宿主
菌体で発現させる。宿主菌体を培養し、これから発現し
た融合タンパク質をＤＨＦＲ活性を目安に高度に精製す
る。目的ペプチドに関しては、大腸菌のＤＨＦＲを用い
た場合、２００アミノ酸程度よりなるプロラクチンとの
融合タンパク質の発現生産に関して成功していることか
ら（特開平２−１４２４７９号公報）、任意長さのペプ
チドを用いることができる。
【００１３】高度精製した融合タンパク質を用いた免疫
動物の免疫感作は、通常に行われる免疫感作の方法を用
いて行うことができ、免疫感作の方法によって限定され
ない。すなわち、融合タンパク質をアジュバンドと混合
し、日をおいて数回に分けて注射した後、採血し、血液
中から抗体を分離することにより行うことができる。
動物の免疫感作は、通常に行われる免疫感作の方法を用
いて行うことができ、免疫感作の方法によって限定され
ない。すなわち、融合タンパク質をアジュバンドと混合
し、日をおいて数回に分けて注射した後、採血し、血液
中から抗体を分離することにより行うことができる。
【００１４】本発明の実施例では、アミノ酸５残基から
なり、種間の特異性がないため抗原活性が極めて弱いロ
イシンエンケファリン（ＬＥＫ）をとりあげ、ＬＥＫ換
算として１．４μｇのごく少量で有効に免疫感作が行わ
れることを示し、本発明が優れていることを示してい
る。
なり、種間の特異性がないため抗原活性が極めて弱いロ
イシンエンケファリン（ＬＥＫ）をとりあげ、ＬＥＫ換
算として１．４μｇのごく少量で有効に免疫感作が行わ
れることを示し、本発明が優れていることを示してい
る。
【００１５】免疫感作は、ＤＨＦＲのカルボキシル末端
にＬＥＫを連結させた融合タンパク質（ＤＨＦＲ−ＬＥ
Ｋ）を調製し、これを免疫感作用実験動物としてもちい
たＢＡＬＢ／ｃメスマウスにＤＨＦＲ−ＬＥＫを0.5 mg
/mlの濃度になるように生理食塩水で希釈した後、等容
量の完全フロイントアジュバンド（１回目）もしくは不
完全フロイントアジュバント（２及び３回目）と混合
し、マウス腹腔内に３週間ごとに３回投与することによ
り行った。最終注射後１４日目には有効な抗体産生が観
察される。
にＬＥＫを連結させた融合タンパク質（ＤＨＦＲ−ＬＥ
Ｋ）を調製し、これを免疫感作用実験動物としてもちい
たＢＡＬＢ／ｃメスマウスにＤＨＦＲ−ＬＥＫを0.5 mg
/mlの濃度になるように生理食塩水で希釈した後、等容
量の完全フロイントアジュバンド（１回目）もしくは不
完全フロイントアジュバント（２及び３回目）と混合
し、マウス腹腔内に３週間ごとに３回投与することによ
り行った。最終注射後１４日目には有効な抗体産生が観
察される。
【００１６】抗体産生は、マウス尾静脈から採血し、血
清を分離し、これを固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
により力価を測定することにより行うことができる。本
実施例では、以下の方法を用いたが、ＥＬＩＳＡの方法
およびそれに用いられるＬＥＫを固定化したタンパク質
によって本発明は制限されない。
清を分離し、これを固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
により力価を測定することにより行うことができる。本
実施例では、以下の方法を用いたが、ＥＬＩＳＡの方法
およびそれに用いられるＬＥＫを固定化したタンパク質
によって本発明は制限されない。
【００１７】グルタルアルデヒドを用いてＬＥＫを固定
化したＢＳＡを、0.1 M 炭酸ナトリウム緩衝液 pH9.5で
1-10μg/mlの濃度に希釈する。これを、ＥＬＩＳＡ用の
市販の96穴マイクロプレートにウェル当り50μlずつ分
注し、２時間以上４℃で静置し、ウェルに吸着させる。
水で３回洗浄後0.5% BSA-0.025 MEDTA- 0.15M NaCl-10m
M リン酸緩衝液pH7.5(BEPBS)でウェルを満たし１時間以
上室温で静置する。続いて 0.05% Tween 20-0.15 M NaC
l-10mM リン酸緩衝液 pH7.5（TPBS）と水で３回ずつプ
レートを洗浄した後よく水を切って-20℃で使用直前ま
で保存する。測定する血清を 1ウェル当り50μlずつタ
ンパク質固定化プレートに分注し、１時間室温で反応後
TPBSと水で３回ずつ洗浄した後、50μlずつ400倍に0.05
%Tween 20-BEPBS (TBPBS)で希釈した西洋わさびペルオ
キシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG+IgM抗体溶液を分注し
た。続いて１時間室温で静置後同様にプレートを洗浄し
よく水を切った後、50μlずつ各ウェルに0.25mg/ml ABT
S(2,2'-アシ゛ノ-ヒ゛ス(3-エチルヘ゛ンソ゛チアソ゛リン-6-スルホン酸)-0.0025%
H2O2-0.1M クエン酸緩衝液（pH4.2）を加え発色反応を
行った。反応は0.5%のSDS水溶液150μlを加えることで
停止させ、405nm の吸収増加をコロナ社のマイクロプレ
ートリーダーで測定し、プレートに残存しているマウス
ガンマグロブリンを定量した。この方法により、ＬＥＫ
に対する抗体のみを検出できる。
化したＢＳＡを、0.1 M 炭酸ナトリウム緩衝液 pH9.5で
1-10μg/mlの濃度に希釈する。これを、ＥＬＩＳＡ用の
市販の96穴マイクロプレートにウェル当り50μlずつ分
注し、２時間以上４℃で静置し、ウェルに吸着させる。
水で３回洗浄後0.5% BSA-0.025 MEDTA- 0.15M NaCl-10m
M リン酸緩衝液pH7.5(BEPBS)でウェルを満たし１時間以
上室温で静置する。続いて 0.05% Tween 20-0.15 M NaC
l-10mM リン酸緩衝液 pH7.5（TPBS）と水で３回ずつプ
レートを洗浄した後よく水を切って-20℃で使用直前ま
で保存する。測定する血清を 1ウェル当り50μlずつタ
ンパク質固定化プレートに分注し、１時間室温で反応後
TPBSと水で３回ずつ洗浄した後、50μlずつ400倍に0.05
%Tween 20-BEPBS (TBPBS)で希釈した西洋わさびペルオ
キシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG+IgM抗体溶液を分注し
た。続いて１時間室温で静置後同様にプレートを洗浄し
よく水を切った後、50μlずつ各ウェルに0.25mg/ml ABT
S(2,2'-アシ゛ノ-ヒ゛ス(3-エチルヘ゛ンソ゛チアソ゛リン-6-スルホン酸)-0.0025%
H2O2-0.1M クエン酸緩衝液（pH4.2）を加え発色反応を
行った。反応は0.5%のSDS水溶液150μlを加えることで
停止させ、405nm の吸収増加をコロナ社のマイクロプレ
ートリーダーで測定し、プレートに残存しているマウス
ガンマグロブリンを定量した。この方法により、ＬＥＫ
に対する抗体のみを検出できる。
【００１８】
【実施例】次に本発明の実施例をしめす。 （実施例１）ＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパク質の調製 枯草菌または大腸菌のＤＨＦＲの遺伝子にＬＥＫを暗号
化した遺伝子を連結させて作製したＤＨＦＲ−ＬＥＫ遺
伝子を有するプラスミドを含有する大腸菌を遺伝子操作
により調製した（特開昭６３−１０２６９６号公報、特
開平１−２５２２９０号公報）。これら大腸菌について
それぞれ液体培養を行い、得られた菌体を超音波処理、
ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍイオン交換クロマトグラ
フィー及びトヨパールＨＷ５５ゲルクロマトグラフィー
でＤＨＦＲ−ＬＥＫタンパク質分画を精製純化し、ＳＤ
Ｓ電気泳動で均一なバンドを示す枯草菌及び大腸菌ＤＨ
ＦＲ−ＬＥＫ融合タンパク質を得た。
化した遺伝子を連結させて作製したＤＨＦＲ−ＬＥＫ遺
伝子を有するプラスミドを含有する大腸菌を遺伝子操作
により調製した（特開昭６３−１０２６９６号公報、特
開平１−２５２２９０号公報）。これら大腸菌について
それぞれ液体培養を行い、得られた菌体を超音波処理、
ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍイオン交換クロマトグラ
フィー及びトヨパールＨＷ５５ゲルクロマトグラフィー
でＤＨＦＲ−ＬＥＫタンパク質分画を精製純化し、ＳＤ
Ｓ電気泳動で均一なバンドを示す枯草菌及び大腸菌ＤＨ
ＦＲ−ＬＥＫ融合タンパク質を得た。
【００１９】（実施例２）ＤＨＦＲ−ＬＥＫ融合タンパ
ク質の免疫感作 免疫感作用実験動物として、８週令のＢＡＬＢ／ｃメス
マウスを用いた。免疫化はＤＨＦＲ−ＬＥＫを0.5mg/ml
の濃度になるように生理食塩水で希釈した後、等容量の
完全フロイントアジュバンドと混合し、マウス腹腔内に
一匹当り10μgのＤＨＦＲ−ＬＥＫ投与群と50μg投与群
とに分け注射した。２,３回目はアジュバンドとして不
完全フロイントアジュバントを用いた。３週間ごとに３
回注射を行い、３回目の注射後１４日目に尾静脈から採
血し、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりＤＨＦ
Ｒ及びＬＥＫに対する抗体力価を測定した。その結果、
マウス１匹当りＤＨＦＲ−ＬＥＫ50μg投与群３匹と10
μg投与群３匹の３回免疫感作後の血清中の抗体価に両
群の差はみられず、８００倍希釈した血清でも有為なＬ
ＥＫ結合活性が認められた。一方、ＬＥＫをＢＳＡにグ
ルタルアルデヒド法で結合させて調製したＢＳＡ−ＬＥ
Ｋに対しては50μg投与群のマウス２匹の血清にのみＬ
ＥＫ結合活性の存在が認められただけであった。このこ
とは１）ＤＨＦＲ−ＬＥＫの３回投与により抗ＬＥＫ抗
体を発現させるためにはＤＨＦＲ−ＬＥＫ 50μg（Ｌ
ＥＫ含量：約1.4μg）をマウスに投与すれば、ＤＨＦＲ
１分子に１分子のＬＥＫが結合した融合タンパク質でも
ＬＥＫに対する抗体の産生を惹起できること。２）ＤＨ
ＦＲはカルボキシル末端に遺伝子操作で元来抗原活性が
非常に弱い低分子量ペプチドを結合させることにより抗
原性を付与できる有用な担体になりうることを示唆して
いる。
ク質の免疫感作 免疫感作用実験動物として、８週令のＢＡＬＢ／ｃメス
マウスを用いた。免疫化はＤＨＦＲ−ＬＥＫを0.5mg/ml
の濃度になるように生理食塩水で希釈した後、等容量の
完全フロイントアジュバンドと混合し、マウス腹腔内に
一匹当り10μgのＤＨＦＲ−ＬＥＫ投与群と50μg投与群
とに分け注射した。２,３回目はアジュバンドとして不
完全フロイントアジュバントを用いた。３週間ごとに３
回注射を行い、３回目の注射後１４日目に尾静脈から採
血し、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりＤＨＦ
Ｒ及びＬＥＫに対する抗体力価を測定した。その結果、
マウス１匹当りＤＨＦＲ−ＬＥＫ50μg投与群３匹と10
μg投与群３匹の３回免疫感作後の血清中の抗体価に両
群の差はみられず、８００倍希釈した血清でも有為なＬ
ＥＫ結合活性が認められた。一方、ＬＥＫをＢＳＡにグ
ルタルアルデヒド法で結合させて調製したＢＳＡ−ＬＥ
Ｋに対しては50μg投与群のマウス２匹の血清にのみＬ
ＥＫ結合活性の存在が認められただけであった。このこ
とは１）ＤＨＦＲ−ＬＥＫの３回投与により抗ＬＥＫ抗
体を発現させるためにはＤＨＦＲ−ＬＥＫ 50μg（Ｌ
ＥＫ含量：約1.4μg）をマウスに投与すれば、ＤＨＦＲ
１分子に１分子のＬＥＫが結合した融合タンパク質でも
ＬＥＫに対する抗体の産生を惹起できること。２）ＤＨ
ＦＲはカルボキシル末端に遺伝子操作で元来抗原活性が
非常に弱い低分子量ペプチドを結合させることにより抗
原性を付与できる有用な担体になりうることを示唆して
いる。
【００２０】（実施例３）生成した抗体の免疫交差性 ＬＥＫの対する抗体の免疫交差性を調べるためＬＥＫ類
縁体ペプチドについてＥＬＩＳＡを行った。ＤＨＦＲ−
ＬＥＫ抗体は、ＬＥＫに対し10-7Mから10-4Mの濃度範囲
で用量反応曲線を示し、IC50は約４μＭであった。この
ことはＤＨＦＲ−ＬＥＫを用いた定量用ＥＬＩＳＡの可
能性を示唆している。両抗体の主要なＬＥＫ認識部位
は、両抗体がロイシンの代わりにメチオニンをカルボキ
シル末端に持つＭＥＫに対して弱い免疫交差活性を示し
た一方、ＬＥＫ−ＮＨ2やアミノ末端側にＬＥＫのアミ
ノ酸配列を有するαーネオエンドルフィンに対して全く
交差活性を示さなかった。このことから、カルボキシル
末端側にあるロイシン残基の側鎖部分及びカルボキシル
基であることを示している。また、D-もしくは、L-ロイ
シン及びD-Ala2,D-Leu5-エンケェファリン（２番目と５
番目のアミノ酸が光学異性対のＤ−体に置換されたＬＥ
Ｋ）に対しても交差活性を示さなかった。
縁体ペプチドについてＥＬＩＳＡを行った。ＤＨＦＲ−
ＬＥＫ抗体は、ＬＥＫに対し10-7Mから10-4Mの濃度範囲
で用量反応曲線を示し、IC50は約４μＭであった。この
ことはＤＨＦＲ−ＬＥＫを用いた定量用ＥＬＩＳＡの可
能性を示唆している。両抗体の主要なＬＥＫ認識部位
は、両抗体がロイシンの代わりにメチオニンをカルボキ
シル末端に持つＭＥＫに対して弱い免疫交差活性を示し
た一方、ＬＥＫ−ＮＨ2やアミノ末端側にＬＥＫのアミ
ノ酸配列を有するαーネオエンドルフィンに対して全く
交差活性を示さなかった。このことから、カルボキシル
末端側にあるロイシン残基の側鎖部分及びカルボキシル
基であることを示している。また、D-もしくは、L-ロイ
シン及びD-Ala2,D-Leu5-エンケェファリン（２番目と５
番目のアミノ酸が光学異性対のＤ−体に置換されたＬＥ
Ｋ）に対しても交差活性を示さなかった。
【発明の効果】本発明に従えば、抗原活性の極めて低い
低分子量ポリペプチドに対する抗体調製を効果的に行う
ことができ、免疫抗体法を用いた種々の分析に用いられ
る抗体の調製に貢献することが大である。
低分子量ポリペプチドに対する抗体調製を効果的に行う
ことができ、免疫抗体法を用いた種々の分析に用いられ
る抗体の調製に貢献することが大である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (1)
- 【請求項１】ペプチドに対する特異的な抗体を作成する
ために免疫動物を免疫化する際、ジヒドロ葉酸還元酵素
のカルボキシル末端に目的のペプチドを結合した融合タ
ンパク質を用いて免疫化することを特徴とする抗体の作
成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34867791A JPH05339295A (ja) | 1991-12-05 | 1991-12-05 | 抗体の作成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34867791A JPH05339295A (ja) | 1991-12-05 | 1991-12-05 | 抗体の作成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05339295A true JPH05339295A (ja) | 1993-12-21 |
Family
ID=18398618
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34867791A Pending JPH05339295A (ja) | 1991-12-05 | 1991-12-05 | 抗体の作成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05339295A (ja) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62272989A (ja) * | 1986-04-25 | 1987-11-27 | カビ・フアーマシア・アクテイエボラーグ | 融合タンパク質、抗体およびこれらの製造方法 |
| JPS63102696A (ja) * | 1986-10-20 | 1988-05-07 | Agency Of Ind Science & Technol | ジヒドロ葉酸還元酵素―ロイシンエンケファリン融合タンパクおよびその製造方法 |
| JPH02218694A (ja) * | 1988-07-29 | 1990-08-31 | Sclavo Spa | 合成ペプチド |
| JPH03502584A (ja) * | 1988-08-30 | 1991-06-13 | アプライド・リサーチ・システムス・エー・アール・エス・ホールディング・エヌ・ブイ | ホルモン分泌を変化させる組換え体融合タンパク質 |
-
1991
- 1991-12-05 JP JP34867791A patent/JPH05339295A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62272989A (ja) * | 1986-04-25 | 1987-11-27 | カビ・フアーマシア・アクテイエボラーグ | 融合タンパク質、抗体およびこれらの製造方法 |
| JPS63102696A (ja) * | 1986-10-20 | 1988-05-07 | Agency Of Ind Science & Technol | ジヒドロ葉酸還元酵素―ロイシンエンケファリン融合タンパクおよびその製造方法 |
| JPH02218694A (ja) * | 1988-07-29 | 1990-08-31 | Sclavo Spa | 合成ペプチド |
| JPH03502584A (ja) * | 1988-08-30 | 1991-06-13 | アプライド・リサーチ・システムス・エー・アール・エス・ホールディング・エヌ・ブイ | ホルモン分泌を変化させる組換え体融合タンパク質 |
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