JPH02218694A - 合成ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に、ヒト血液サンプル中の低血清レベル
のα−フェトプロティンを測定する手段及び該手段を使
用する測定方法に係る。

特に、本発明は、ヒトα−フェトプロティンを認識し、
これと反応できるが、アルブミン又はその分解生成物を
認識し得ない抗ペプチド抗体の形成を誘発する免疫活性
が付与された合成ペプチドに係る。

さらに、本発明は、該ペプチドの製造手段及び方法、及
び低血清レベルのヒトα−フェトプロティンの測定にお
ける該合成ペプチド及びポリクロナール及びモノクロナ
ール抗ペプチド抗体の使用に係る。

α−フェトプロティン（ＡＦＰ）は、アルブミンと共に
、通常、肝臓細胞の胎児期の間に卵黄嚢の細胞によって
、及び少量は腸管系の細胞によって合成される主要血清
タンパク質の１つである。

該タンパク質はアルブミンとは異なり、出生後では消失
し、妊娠中にはｐｈｏｅｔｕｓの存在のため、及び病理
状態下、特に悪性の肝臓腫瘍及び奇形癌の存在下では大
人の血清中にも再び出現する。

大人の血清中におけるＡＦＰの濃度の測定は、癌の初期
診断では臨床上有用な手段である。

しかしながら、α−フェトプロティンが炎症性疾患（急
性又は慢性肝炎及び肝硬変）に罹った人の血清中及び肝
臓の再生層に見られる（ただし、腫瘍の場合に見られる
よりも低い濃度である）との事実から肝臓腫瘍の特に初
期段階における診断用の特異かつ独自のテストとしてＡ
ＦＰの血清レベルの測定を利用することはかなり制限さ
れる。

実際、この段階では、腫瘍によるＡＦＰレベルの増大と
非腫瘍疾患によって生じた増大とを識別することは困難
である。

現在では、　ＡＦＰの腫瘍マーカー（これは、ヒトの生
理学的サンプル中における該物質の存在が腫瘍の存在を
示すことを意味する）としての使用は、とりわけ、ＡＦ
Ｐの血清レベルが存在する腫瘍組織にかなり良好に比例
するとの予測が裏付けられたことによる。

従って、化学療法または外科的処置の効果をモニターす
るためには、濃度の測定は有効である。

一般に、肝細胞腫瘍は、ヒト血清中に約３００−５００
ｘ９／ｘＱのＡＦＰレベルが見出される場合、すなわち
腫瘍が進行状態にあり、その外科的処置がもはや可能で
ない場合に、信頼性をもって診断される。

それ故、この特殊な分野における重要な点は、特に危険
度の高い世代における肝臓癌の早期診断の必要性に鑑み
、癌を高い特異性で診断する手段及び方法の開発である
。

当分野では、ヒト血液中の八ＦＰの測定を行うために多
くの方法が知られているが、これらの方法は抗ＡＦＰポ
リクロナール抗体の使用に基くものである。

しかしながら、これらの方法は、ポリクロナール抗体の
異質性及びこれらの抽出及び精製の困難性による欠点が
ある。

このような欠点から、これら方法は必ずしも鋭敏ではな
く、特異的ではなく、経済性の面でも実用的ではないも
のと考えられている。

このため、当分野では、モノクロナール抗α−フェトプ
ロティン抗体（ＭＡｂ）の使用に基くヒト血液中のＡＦ
Ｐを測定する他の方法が提案されている。

この目的について多数の文献（特に特許文献）が存在し
ており、２以上のモノクロナール抗ＡＰＰ抗体又は特殊
な反応体、又は特殊な操作条件を使用するＡＦＰを測定
する免疫法が開示されている。

これに関連して、次の研究及び特許が参照される。Ｔ、
　　Ｐｏｒｔｓｍａｎらｒｃｌｉｎ、　　Ｃｈｉｎ、　
ＡｃｔａＪ　１３５：　　１３−２２（１９８３）：　
Ｄ、Ｊ、　Ｂｒｏｃｋらｒｃｌｉｎ、　Ｃｈｉｍ、　Ａ
ｃｔａＪ１２２：　３５３−３５８（１９８２）：　Ｍ
、　Ｕｏｔｉｌａ　ｒＪ、　Ｉｍｍｕｎ。

ＭｅｔｈｏｄｓＪ　４２：　１ｌ−１５（１９８１）：
　ヨーロッパ特許第４８．３５７号；同第１５８，９７
３号。

残念なことには、これらの方法は、特に、使用するモノ
クロナール抗体がＡＦＰ以外のタンパク質とも交差反応
を生じうる点で必ずしも完全なものではない。

実際、当分野で公知の方法に従って操作し、抗原として
α−フェトプロティンの完全分子を使用することにより
、常法に従ってモノクロナール抗ＡＰＰ抗体が調製され
ている。

この結果、得られたＭＡｂは、アルブミンのものと高度
の類似性を示すＡＦＰのエピトープに対して特異性を発
揮しうる。

事実、ＡＦＰとアルブミンとの間の免疫交差反応の可能
性は以前から知られているおり［Ｒｏｕｓ　１ｈａｔ　
ｉらｒＰ、Ｎ、Ａ、ｓ、Ｊ　７３．４６４１（１９７６
）］、最近、その理由がこれら２つのタンパク質におけ
るアミノ酸配列の高度の類似性にあることが明らかにな
った［Ｌａｗら［ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）Ｊ　２９
１．　２０１（１９８１）；ＭａｒｉｎａｇａらｒＰ、
Ｎ、Ａ、ｓ、Ｊ　７９．　７１（１９８３）］。

従って、α−フェトプロティンに対するモノクロナール
抗体の調製に当たり、好適なコントロールを行って該抗
体の特異性を確保しているが、これら２つのタンパク質
の間で非常にわずかな交差反応が生ずる可能性が常に残
っている。

ＡＦＰの測定の際に測定される濃度（２０−４０ｎ９／
　＊Ｑ以下）と比べてアルブミンの血清濃度が極めて高
い（約５０１９／　ｍＱ）ため、この非常に少ない交差
反応も重要なものとなり、誤った結果を生ずることにも
なる。特に、抗ＡＦＰ抗体によって認識される抗原決定
基又はエピトープとの接触によりアルブミンが変性又は
分解される際に、上記２つのタンパク質の間における最
高の交差反応が観察される［ＲｏｕｓｌｈａｔｉらｒＰ
、Ｎ、Ａ、ｓ、Ｊ　７３．４６４１（１９７６）］。

さらに、炎症性肝臓疾患では、α−フェトプロティンの
測定を妨げる変性アルブミンの循環量を増大させる（こ
れにより、測定される濃度の値が上昇する）タンパク質
分解反応の活性化が生ずるとの仮説が提起された。

従って、当分野では、特にアルブミン又はその分解生成
物を認識しない抗ＡＦＰ抗体の開発が求められている。

これにより、診断テストにおける妨害を解消でき、腫瘍
に関する該テストの感度を高めることが可能になる。

このように、本発明の目的は、高い抗原特異性が付与さ
れた手段の開発、及びヒト血液サンプル中のα−フェト
プロティンの濃度を測定するため前記手段を使用する方
法の開発にある。

該目的は、本発明に従い、現在まで未知の合成抗原を提
供することによって達成され、従来技術の問題点を解消
できる。

従って、本発明の目的は、哺乳動物においてヒトα−フ
ェトプロティンを認識し、これと反応できるが、アルブ
ミン又はその分解生成物を認識し得ない抗体の形成を誘
発する免疫活性が付与された合成ペプチドにおいて、該
ペプチドが、ヒトα−フェトプロティンの３８−１１９
領域に相当するアミノ酸配列を有するものであることを
特徴とする合成ペプチドにある。

本発明の他の目的は、組換ＤＮ＾技術による前記ペプチ
ドの調製手段及び調製法にある。

本発明の他の目的は、α−フェトプロティンを認識し、
これと反応できるが、アルブミン又はその分解生成物を
認識し得ないポリクロナール及びモノクロナール抗ペプ
チド抗体の調製における前記合成ペプチドの使用にある
。

本発明のさらに他の目的は、α−フェトプロティンを認
識し、これと反応できるが、アルブミン又はその分解生
成物を認識し得ないポリクロナール及びモノクロナール
抗ペプチド抗体にある。

本発明のさらに他の目的は、α−フェトプロティンを認
識し、これと反応できるが、アルブミン又はその分解生
成物を認識し得ないモノクロナール抗ペプチド抗体を調
製するハイブリドーマにある。

本発明のさらに他の目的は、前記合成ペプチド及び／又
はモノクロナール及びポリクロナール抗ペプチド抗体を
使用するヒト血液サンプル中の低血清レベルα−フェト
プロティンを測定する免疫法にある。

本発明のさらに他の目的は、前記合成ペプチド及び／又
はα−フェトプロティンを認識し、これと反応できるが
、アルブミン又はその分解生成物を認識し得ないポリク
ロナール及びモノクロナール抗ペプチド抗体を包含して
なるヒト血液サンプル中のα−フェトプロティンの濃度
測定を行うための診断用キットにある。

本発明のさらに他の目的は後述の記載及び実施例から明
らかになるであろう。

本発明は、本質的には、免疫活性であり、アルブミンと
の重要な類似性を全く示さないＡＦＰのアミノ酸配列領
域の同定によるものである。

特に、該領域は、ＡＦＰの３８から１１９までのアミノ
酸配列に相当し、下記の式（Ｉ）で表される。

式（１） ％式％ 本発明によれば、上記アミノ酸配列を有するペプチドは
、化学合成又は生物学的方法（組換ＤＮＡ）によって調
製される。

組換ＤＮＡ法で得られるペプチドは、そのアミノ酸末端
部にメチオニン残基又は融合ペプチドを含有しうる。

本発明によれば、実際、アルブミンに対する類似性が低
く、このため、該ペプチドの特異性は極めて高く、代用
抗原性タンパク質として使用される。

ＡＦＰ及びアルブミンをコード付ける遺伝子のヌクレオ
チド配列は、それらのアミノ酸配列と共に、それぞれＭ
ａｒｔｎａｇａらｒＰ、Ｎ、Ａ、ｓｌ　８Ｇ、　４６０
４（１９８３）］及びＤｕｇａｉｅｚｙｋら［ｒＰ、Ｎ
、Ａ、Ｓｉ　？９．７１（１９８２）］によって開示さ
れている。

これら２つのタンパク質の比較から、両アミノ酸配列に
沿って、ドメイン２及び３において最大の高い類似性の
存在が認められた。

本発明によれば、ＡＦＰのアミノ酸配列においてアルブ
ミンにおける相当の類似基を含まない領域を同定するた
めに、両タンパク質の配列を、異なるアミノ酸配列及び
ヌクレオチド配列の分析用プログラム、たとえばＳ、　
Ｄｅｖｅｒｅｕｘらによって開示されたプログラム（Ｇ
ＡＰ）［ｒＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　Ｊ　１２
゜３８７−３９５（１９８４）］を使用することによっ
て整列させた。

このようにして得られた異なる整列の中から、アルブミ
ンに対して最も類似性が低い領域であり、従って最も高
い抗原特異性を有する領域と見られるＡＦＰのアミノ酸
３８番と１１９番との間の領域を見出した（第１図）。

さらに、この領域の親水性に関する分析では、この配列
が良好な免疫原性が付与されたものであると考えられる
ことが示された。

これらの結果に基き、本発明に従い、ＡＦＰに関する高
い特異性を有する抗体の合成に有用なペプチドが合成さ
れる。

これら特性を有するペプチドの合成には、いくつかの方
法が利用できる。

中でも、上記式（Ｉ）の配列でなるペプチドを化学的又
は生化学的に合成できる。

配列（ｒ）によって完全に構成されるペプチドが好適で
ある。

本発明の好適なｌ具体例によれば、式（１）のペプチド
は、当分野で公知の方法の１つ、たとえばＲ，Ｂ、　Ｍ
ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ及びＡ、　Ｍａｒｇｌｉｎによって
開示された固相合成法［ｒＲｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｊ　３９．８４１−８６６（１９７０）］に従って化
学的方法によって合成される。

もちろん、現在の合成装置（多数が市販されている）の
開発に伴って、長いペプチド鎖分子又は長いペプチド鎖
フラグメント（これらは、所望の配列を含有するペプチ
ドを得るように相互に結合される）の合成が可能である
。

本発明の他の具体例によれば、組換ＤＮＡ技術によって
式（Ｉ）のペプチドが得られる。

分子遺伝学の進歩により、各種微生物からの遺伝物質の
結合をインビトロで実施でき、これにより、新たな遺伝
子の組合せが形成され、所望の微生物において新たな遺
伝特性を得ることが可能になった。一般に、組換ＤＮＡ
技術は、所望のポリペプチドをコード付けるＤＮＡフラ
グメントを単離すること、該フラグメントをクローニン
グベクターに挿入し、調節配列［プロモーター：転写開
始部位及びリボゾーム認識部位（ＲＢＳ）］及び／又は
分泌配列のコントロール下に置き、このようにして得ら
れたバイブリドベクター又は組換ＤＮＡの分子を単離す
ること、該分子を形質転換技術によって宿主微生物に導
入すること、該形質転換宿主微生物を培養して、ＤＮＡ
フラグメントを発現させ、所望のポリペプチドの生産を
行うこと、及び最後に培養基又は宿主微生物から発現生
成物を単離、精製することからなる。

本発明によれば、ヒトα−フェトプロテインの３８−　
１１９領域をコード付けるＤＮＡフラグメントが、適当
な制限酵素での消化によってＡＦＰをコード付ける遺伝
子から、又は合成オリゴヌクレオチドの調製によって得
られる。

本発明の好適な具体例によれば、３８−１１９ペプチド
をコード付けるＤＮＡ領域のフィラメントを部分に分裂
させ、これら部分と同一の配列を有する合成オリゴヌク
レオチドを自動合成機によって合成する。

ヌクレオチド配列の分裂は、両フィラメントの成分間に
相補部分を、各ヌクレオチドが他の２つのオリゴヌクレ
オチドと同時にハイプリダイズできるように互い違いに
配列されるように実施される。

その結果、このように合成されたオリゴヌクレ才チドを
結合させることにより、ハイブリダイゼーシヲンの対応
に基き、第４図に示すものと同じタイプの自己組立生成
物が得られる。

実際には、合成オリゴヌクレオチドを、予め適当な制限
酵素で消化したクローニングベクターのＤＮＡと、リガ
ーゼ緩衝液中、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの存在下で混合さ
せ、これにより、反応終了時、自己組立生成物の形成及
び同時にクローニングベクターへの挿入が達成される。

該目的に週するベクターは、組換ＤＮＡ技術において一
般的に使用されるブラスミド及びバクテリオファージの
中から選ばれる。

本発明によれば、大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｔ）のプラスミ
ドｐＥｘ　３４Ａ（アンビシリン耐性をコード付ける遺
伝子及びＭＳ２ファージのＤＮＡポリメラーゼをコード
付ける遺伝子を含有する）を使用できる。

該プラスミドを制限酵素ＢａｍＨ　Ｉ及びＥｃｏＲ　Ｉ
　（自己組立からの生成物のものと結合するシングルフ
ィラメント末端基を生ずる）で消化し、ついでＴ４　Ｄ
ＮＡリガーゼの存在下、合成オリゴヌクレオチドと混合
する。

該反応は緩衝溶液中、温度約１４℃、一夜で行われる。

反応時間経過時、リガーゼ混合物の一定量を使用して、
Ｍ．　Ｍａｎｄｅｌ及びＨｉｇａにより開示された方法
ｃｒＪ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．Ｊ　５３，　１５４（
１９７０）］によってコンビテントとした大腸菌細胞を
形質転換させる。

つづいて、アンビシリンを添加して選択的なものとした
好適な培地（たとえばＬＢ培地）において形質転換体を
培養する。このようにして得られた陽性のコロニーの１
つから、ＤＮＡポリメラーゼによる正確な読取り相の３
８−　１１９ペプチドをコード付ける合成ＤＮＡのフラ
グメントを含有する組換ブラスミドを単雌する。

該プラスミド（Ａ　１　／　ＧＴＡと表示する）を大腸
菌（Ａｔ／　ＧＴＡ）としてアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクシジンに寄託してあり、ＡＴＣＣ　６７
７４２の参照コードが付与されている。

本発明に従い、該ブラスミドを使用して、大腸菌Ｋ１２
、ΔＨ１、Δｔｒｐの細胞を形質転換させ、得られた形
質転換体を使用し、Ｎｉｃｏｓｉａらによって開示され
た方法［ｒｌｎｆ．　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ．Ｊ　５５，
　９６３（１９８７）］に従って操作することにより所
望のペプチドを調製する。

いずれにしても、本発明では、たとえば大腸菌ＪＭ１０
１、大腸菌７１／１８、大腸菌ＪＭ１０ｇの如き大腸菌
の各種菌株又は他の微生物の各種菌株（これらの多くは
入手容易のもの、又は寄託され、たとえばＡＴＣＣの如
き認められた機関からの入手可能なものである）を使用
できる。

本発明によれば、微生物抽出物から融合タンパク質（す
なわちＤＮＡポリメラーゼの一部分及び３８一１１９ア
ミノ酸配列でなる）として３ｇ−１１９ペプチドが得ら
れ、このペプチドでは、ＤＮＡポリメラーゼの一部分が
以下のアミノ酸配列を有する。

ＭｅｔＳｅｒＬｙｓＴｈｒＴｈｒＬｙｓＬｙｓＰｈｅＡ
ｓｎＳｅｒＬｅｙＣｙｓ１１ｅＡｓｐＬｅｕＴｈｒＡｒ
ｇＡｓｐＬｅｕＳｅｒＬｅｕＧ１ｕｌｌｅＴｙｒＧ１ｎ
ＳｅｒｌｌｅＡｌａＳｅｒＶａｌＡＩａＴｈｒＧ１ｙＳ
ｅｒＧ１ｙＡｓｐＰｒｏＨｉｓＳｅｒＡｓｐＡｓｐＰｈ
ｅＴｈｒＡ１ａｌｌｅＡ１ａＴｙｒＬｅｕＡｒｇＡｓｐ
ＧｌｕＬｅｕＬｅｕＴｈｒＬｙｓＨｉｓＰｒｏＴｈｒＬ
ｅｕＧ１ｙＳｅｒＧｌｙＡｓｎＡｓｐＧ１ｕＡＩａＴｈ
ｒＡｒｇＡｒｇＴｈｒＬｅｕＡＩａ１１ｅＡ１ａＬｙｓ
ＬｅｕＬｅｕＳｅｒＴｒｐＧｌｙｌｌｅＡｒｇＡ１ａＴ
ｈｒＧ１ｙＳｅｒＡｓｐＰｒｏ 該タンパク質を５０ｎＭ緩衝液に対して透析し、ついで
抗ＭＳ２−ＤＮＡポリメラーゼ抗体及び抗ヒトＡＰＰ抗
体を使用するウェスタンプロットによって同定した。

第６図に示す結果は、予想したように、問題のタンパク
質が上記両タンパク質に対して指図される抗体によって
認識されることを示した。

さらに、その分子量は約２０キロドルトン（ＫＤ）、す
なわちヌクレオチド配列に基いて予想された値と同じ値
に相当する（第５図）。

このようにして得られたペプチドの配列を、直接のデー
タに基くだけでなく、抗体による認識に基いても確認す
るため、トリプシンでの消化後、高速原子衝撃質量スペ
クトルによって分析する。

この技術によれば、アミノ酸の配列を質量データに基い
て確認できる。

第７図は、合成遺伝子の構成に基く融合タンパク質の配
列を示す。質量スペクトルによって同定されたアミノ酸
領域をアンダーラインによって示す。

中でもＡＦＰタンパク質に関して、確認された領域は、
この方法ではペプチド配列の６０％以上を解読できない
ことを考慮すれば、非常に主要なフラクシジンを構成す
るものであることが明らかである。

本発明によれば、該融合タンパク質は、式（Ｉ）の配列
によって構成されるのみのペプチドと同様に、アルブミ
ンとの交差反応を生じないポリクロナール及びモノクロ
ナール抗体の製造用α−フェトプロティン代用抗原とし
て使用される。

一般に、ポリクロナール抗体の調製は、サル、ウマ、ウ
シ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス及びモルモ
ットの如き各種の動物及びニワトリ、シチメンチジウ、
ガチョウ及びアヒルの如き鳥類を免疫することによって
行われる。

八ＦＰ及びアルブミン又はその分解生成物の存在下にお
いて免疫交差反応を生じない抗体を生成するため、特に
ヤギに注目した。

動物の免疫を、本発明に従い、本来の状態又は公知の一
般的方法に従って活性化した合成ペプチドを使用して行
う。

それぞれ抗血清又は抗体を得るための免疫及び加工を、
公知の技術に従って操作を行う事によって実施する。

抗血清又は抗体の加工及び保存を免疫の分野で公知の方
法に従って行う。

その免疫原性特性を説明するため、融合タンパク質をＢ
ａ１ｂ／ｃマウスにそのままで、又は免疫原性力を上昇
させるヘモシアニンと接合させて注射する。

つづいて、免疫されたマウスから採取した血清をラジオ
イミュノアッセイによって分析し、抗α−フェトプロテ
ィン抗体の生成を確認する。

各種の希釈血清を使用して得られた結果は、すべてのマ
ウスが該処置に対してプラスに応答し、完全ＡＦＰ分子
で免疫したウサギの血清によって得られたものと同様の
値を与える。接合させた融合タンパク質１０μ９で処置
した動物の場合に、最高の抗体測定値が見られる。

このようなデータから、本発明によるペプチドが、ヒト
α−フェトプロティンを認識し、反応できる抗体の形成
を誘発する能力を有することが確認される。

本発明によれば、合成ペプチド（Ｉ）は、ＡＦＰに対す
る高度の特異性が付与されたモノクロナール抗体の調製
に使用される。

この目的については、この特殊な分野で一般的に使用さ
れる技術のいずれか、たとえばり、　Ｇ。

ＤａｖｉｓらによってｒＢａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＪ　Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ、ニューヨーク、１９８６年に記載された方法
を使用できる。

実際には、融合タンパク質として得られたペプチドを使
用してＢａ１ｂ／ｃマウスを免疫し、ハイブリドーマを
調製する。

得られた各種の細胞ライン（ハイブリドーマ）の中から
、本来の状態のα−フェトプロティン及び融合組換フェ
トプロティンの両方を認識するが、アルブミンを認識し
ないモノクロナール抗体を生成し得る３１１（ＭＧ１５
゜輩Ｇ２４及びＭＧ３１と表示する）を単離する。

本発明のポリクロナール及びモノクロナール抗体は、ヒ
ト血液中の低レベルＡＦＰの免疫測定法の開発に特に宵
月である。

特に、好適にラジオラベル化した抗体を、ラジオイミュ
ノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光測定法（［ＦＡ）又は
免疫酵素測定法（ＥＬＩＳＡ）で使用できる。

合成抗原が使用可能となれば、当業者であれば、特異な
抗体を生成し、かかる特異な抗体を使用して低レベルの
ＡＰＰを定量するための測定法を開発できるであろう。

免疫測定法によってヒト血液サンプル中のＡＦＰを測定
することを目的とする診断用キットも本発明の精神の範
囲内に包含されるものであり、該キットは、式（１）の
合成ペプチド及び／又はポリクロナール又はモノクロナ
ール抗ペプチド抗体を含有することを特徴とする。

さらに、咳診断用キットは、担体及び反応生成物の発色
及び可視化に必要な反応体を含有しうる。

いずれにしても、本発明の記載に基き、当業者であれば
、ＡＦＰの測定のための診断用キットの開発に必要な条
件及び反応体を容易に見出しうるであろう。

次に、図面について説明する。

第１図は、ヒトα−フェトプロティン（ＲＦＰ）及びヒ
トアルブミン（ＡＬＢ）のアミノ酸配列の整列を示す図
である。図中、アミノ酸を下記の意味において１文字で
表示している。

ａｓｐ　　Ｄ　　　ｔｈｒ　　Ｔ　　　ｇｌｕ　　Ｅ　
　　ｇｌｙ　　Ｇｌｙｅ　　Ｋ　　　ａｌａ　　Ａ　　
　ａｒｇ　　Ｒｖａｔ　　Ｖｈｉｓ　　Ｈｌｅｕ　　Ｌ
　　　ｔｙｒ　　Ｙ　　１ｌｅｕ　　Ｉａｙｓ　　Ｃｍ
ｅｔ　　Ｍ　　　ａｓｎ　　Ｎ　　　ｐｒｏ　　Ｐｇｉ
ｎ　　Ｑ　　　ｐｈｅ　　Ｆ　　　ｇｅｒ　　Ｓ　　　
ｔｒｐ　　ｔなお、図中の縦線は同一のアミノ酸の部分
を示す。

第２図は、３ｇ−１１９アミノ酸配列をコード付ける合
成遺伝子を構成するため合成された１３個のオリゴヌク
レオチドのヌクレオチド配列を、一方のフィラメントに
ついては５’−３’の方向で、逆向き平行フィラメント
については３’−５’の方向で示す図である。

第３図は、合成オリゴヌクレオチド間の各種の可能な整
列を示す図である。

第４図は、第２図に示すオリゴヌクレオチドの自己組立
によって得られた３ｇ−１１９ポリペプチドをコード付
ける合成遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。

第５図は、ポリアミドゲルを示す図である。図中、２及
び３は透析前及び後の微生物抽出物に関し、４は分子量
基準（上から下に向って９４．ＯＫＤ。

６７、ＯＫＤ、　４３．ＯＫＤ、　２０．１　ＫＯ，及
び１４．４　ＫＤ）に関し、１は半調製電気泳動によっ
て精製した組換融合ペプチドに関する。

第６図は、第５図に示すサンプルの抗ＭＳ２−　ＤＮＡ
ポリメラーゼ抗体によるウェスタンプロット（Ａ）及び
抗ヒトα−フェトプロティン抗体によるウェスタンプロ
ット（Ｂ）を示す図である。

第７図は、質量スペクトルによって決定された融合タン
パク質の配列を示す図である。該方法によって同定され
たペプチドをアンダーラインＣ＋−−−−−＋＞で示す
。アンダーライン（−−一→は３８−１１９ペプチドの
配列を示す。

下記の実施例は本発明を説明するためのものであり、本
発明を限定するものではない。

実施例１ ライスコンシン大学の遺伝学グループのソフトウェアパ
ッケージに含まれるＧＡＰプログラムを使用することに
よって、α−フェトプロティン及びアルブミンのアミ、
）酸配列を整列させた。

このパッケージは、　Ｓ、　Ｄｅｖｅｒｅｕｘによって
公開されたアミノ酸及びヌクレオチド配列の分析用プロ
グラムでなる［ｒＮｕｃｌ、＾ｃｉｄ　Ｒｅｓ、Ｊ　１
２．３ｇ？−３９５（１９８４）コ。

第１図に示す整列は、これらの部分のみが考慮される場
合、又は各配列における破損の形成が許容される場合に
おいても、これら２つのタンパク質の間の可能なすべて
の整列の中でも最良のものである。整列の異なる理論に
基いて作動するＧＡＰプログラム及びＢｅ５ｔｆｉｔプ
ログラムの両方を使用する場合にも、相当する文献に記
載された他のタンパク質配列と同様に、ＡＦＰの３８−
１１９配列とアルブミンとの間にはさらに重要な整列は
見出されなかった。

従って、３８−１１９配列は上記タンパク質と重大な類
似性を持たないものと結論できる。

３ｇ−１１９配列をコード付ける二重ら線ＤＮＡフラグ
メントを作成するために、自動合成機３ｙｓｔｅｏ＋Ｐ
ｌｕｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ）によって１３個のオリゴヌク
レオチドを合成した。これら１３個のオリゴヌクレオチ
ドの配列を第２図に示す。なお、一方のフィラメントの
場合には５’−３’の方向、逆向き平行フィラメントの
場合には３’−５’の方向で示している。

第３図には、これらオリゴヌクレオチド間の可能な整列
を示す。この結果、オリゴヌクレオチドのすべてを結合
させることにより、ハイブリダイゼーションの対応に基
いて、３ｇ−１１９ペプチドをコード付ける自己組立生
成物、すなわち合成遺伝子が得られた。

プラスミドｐＢＸ　３４Ａ　ＬＯｔｔ９を緩衝溶液（５
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ、　　ｐＨ７，４，１０ｍＭ　
ＭｇＣＱｖ、　　ＥＩＯＩＩＩＩＩＩ　ＮａＣＱ）１０
０ｕ（ｌ中、制限酵素ＢａｍＨＩ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ／　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）３０Ｕ（単位）の存在下、
３７℃で２時間消化した。

得られた混合物を室温（２０−２５℃）に１５分間静置
し、ついで制限酵素旧ｎｄＩｆｆ３０Ｕにより、３７℃
で２時間消化した。

反応混合物６５℃で１５分間加熱することによって酵素
反応を停止させた。ついで、消化混合物を１．５％アガ
ロースゲルに負荷し、７０Ｙで３．５時間泳動させた。

Ｍａｎｉａｔｔｓの方法（ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ；　Ａ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ
ａｌＪ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　１
９８２）に従って操作することによって、約ａｏｏｏ塩
基対（ｂｐ）のＢａＩＩＩ　Ｉ　−ＨｉｎｄｌｌＩフラ
グメントを電気溶出した。

該フラグメント２５０ｎ９を、リガーゼ混合物３０ｕ１
２中、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼｌυの存在下、１４℃で各
合成オリゴヌクレオチド５０００ｎ９と混合させた。混
合物を一夜静置した。ついで、リガーゼ混合物を使用し
て、Ｍ、　Ｍａｎｄｅｌ及びＨｉｇａによって報告され
ている［ｒＪ、　Ｍｏ１．　ＢｉｏｌＪ　５３．１５４
（１９７０）］ように５０ｍＭＣａＣＱ　ｔでコンピテ
ントとした大腸菌に１２．Δ旧。

Δｔｒｐの細胞を形質転換させた。

形質転換体の選別を、アンピシリン３０μｖ／　ｘ（１
を添加したＬＢ寒天培地［Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎ
ｅ（ＤＩＰＣＯ）１０９／（１，Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓ
ｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　（ＤＩＦＣＯ）　５９／（１゜Ｎ
ａＣ＋２１０９／Ｒコの平板上において、３０℃、１８
時間で実施した。

得られたクローンから抽出した組換プラスミドを分析し
て、正確なヌクレオチド配列を有することを証明した。

このようにして、合成遺伝子が、ＭＳ２ファージのポリ
メラーゼの読取りの同じ相におけるＢａｍＨＩ及び旧ｎ
ｄＩＩ［部位に挿入されている組換プラスミドＡ　１　
／　ＧＴＡが同定された。

実施例２ 合成遺伝、子の発現 バイブリドプラスミドＡＩ／ＧＴＡで形質転換させた大
腸菌の細胞をＬＢ培地（１％Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏ
ｎｅ。

０．５％Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、　
１％ＮａＣｌ２．　ｐＨ７，５）２ＯｘＱ中、３０℃で
一夜培養した。

つづいて、この培養物１０ｍＱを同じＬＢ培地で希釈し
て４００ｘＱとし、３０℃に２時間、４２℃に２．５時
間維持した。ついで、培養物をＢｅｃｋｍａｎ　トラン
ク遠心分離機において５０００ｒｐｍで１０分間遠心分
離し、分離された細胞を２５％ショ糖、１０ｄ　Ｔｒｉ
ｓ　ｐＨ８，１ｍＭＥＤＴＡの溶液ＳｚＱ中に再度懸濁
させた。

得られた混合物にリゾチーム（４０，ｍｙ／　ｘ＋２）
溶液１００μｉ２及び０．５Ｍ　ＥＤＴ、Ａ　Ｏ，８ｘ
（ｌを添加した。

３７℃で３０分間インキュベートした後、溶解緩衝液（
１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　
ｐＨ６，６３＋＋Ｍ　ＥＤＴＡ）８１を添加した。

得られた混合物を水浴内に１５分間維持し、３７℃に３
０分間維持した。ついで、細胞を音波処理し、８０００
ｒｐｍで３０分間遠心分離した。

ついで、ペレットを１Ｍ尿素５．ｗ（２中に懸濁させ、
３７℃に３０分間維持し、上述の如く遠心分離し、７Ｍ
尿素５．１ｔ１２中に再度懸濁させた。

タンパク質抽出物を５０１１＋Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ
７，０に対して透析した。

透析の間に、微生物のタンパク質の多くが沈殿し、融合
タンパク質は溶液中に残った。

タンパク質抽出物（所望のタンパク質をかなり富有する
）を、Ｌａｍｅａ＋ｓｌｉによる方法［ｒＮａｔｕｒｅ
Ｊ　２２ユ。

６８０（１９７０）］によって調製したポリアクリルア
ミドゲル上での電気泳動によって分析した。

０．０２４６Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液、０．１９Ｍグリシン
、ｐＨ８，３，１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
中、３Ｇ−３５ａ＋＾／ゲル、８時間で泳動させた。

電気泳動終了後、ゲルをクマシーブルー（０，０５％ク
マシーブルー、５２％メタノール、７％酢酸）によって
染色し、つづいて６．３１％メタノール、７％酢酸で脱
色させることによって可視化させた（第５図）。

得られた物質は十分に融合タンパク質を富有していた（
電気泳動チャンネルにおける可視物質の８０−９０％を
示す）。

さらに、ペプチドを抗ＭＳ２−ＤＮＡポリメラーゼ抗体
及び抗α−フェトプロティン抗体でのウェスタンプロッ
トによって同定した（第６図）。

該タンパク質は、配列部分を含有するタンパク質に対し
て指図される抗体によって認識された。

実施例３ 合成ポリクロナール抗ペプチド抗体の調製雄性Ｂａ１ｂ
／ｃマウス（生後２−３週間）８匹を、上記実施例２に
記載の如くして得られた融合タンパク質、及びヘモシア
ニンと接合させた該タンパク質を腹腔内注射することに
よって免疫した。

実際には、接合を、同量（重量）の組換タンパク質及び
ヘモシアニン粉末（キーホールリンペットヘモシアニン
、ＳｉｇｍａＸｌ（ＬＨ）をＰＢＳ　ｔ　ｘＱ中、グル
タルアルデヒド（最終濃度０．５％）の存在下で混合し
、得られた混合物を室温（２０−２５℃）で１時間イン
キニーベートすることによって実施した。

ついで、接合生成物を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７
，０に対して透析し、組換タンパク質（ヘモシアニンに
接合されたもの、又は接合されていないもの）ｌＯμ？
及び４０μ？をＰＢＳ緩衝液１００μＱで希釈し、溶液
をフロイント完全アジュバントで２００μｌに希釈した
。

このようにして得られた溶液を使用し、下記のスケジュ
ールに従って腹腔内注射によってマウスを免疫した。

見↓ｊ■巳す（【 １、マウス２匹について、フロイント完全アジュバント
を添加した接合ペプチド（１０μｇ）を投与 ２、マウス２匹について、フロイント完全アジュバント
を添加した接合ペプチド（４０μ９）を投与 ３、マウス２匹について、フロイント完全アジュバント
を添加した組換ペプチド（１０μ？）を投与 ４、マウス２匹について、フロイント完全アジュバント
を添加した組換ペプチド（４０μ９）を投与 ５、マウス２匹について、ＰＢＳ緩衝液２００μＱを投
与（コントロール） １５日後、フロインド不完全アジュバント１００μＱを
使用して上述の処置と同様にマウスを処置した（第２回
目の処置）。

１５日の間隔で同じ処置を２回以上繰返し行った。

終了後、免疫したマウスから採取した血清を、０．５％
ゼラチンを含有するＰＢＳ（０，４％ＫＣｉ２．０．４
％ＫＨ，ＰＯ，，１６％ＮａＣＩＪ、　２，３％Ｎａｔ
ＨＰＯＪにより１：１０で希釈し、各種希釈液をラジオ
イミュノアッセイ（ＲＩＡ）によってテストして、抗α
−フェトプロティン抗体の生成を証明した。

実際には、９６個の平底の穴を有するポリスチレン板に
おいて、　ＰＢＳ中にα−フェトプロティン２０μｖ／
ｘＱを含有する溶液１００μｌを注入し、室温に２時間
維持することによってα−フェトプロティンを吸収させ
た。

板をＰＢＳ　２００μｅで４回洗浄し、同じ緩衝液中に
０．５％ゼラチンを含む溶液を３７℃において１時間し
み込ませた。

上述の如く洗浄した後、各々の穴に希釈血清１００μｇ
を充填した。

室温に２時間維持した後、さらに洗浄を行い、ｌ″ｓＩ
でラジオラベル化したマウス又はウサギの抗免疫グロブ
リン抗体のＰＢＳ溶液を１００μＱ／穴で各々の穴に充
填した（８００００ｃｐｏ＋／穴）。

板を３７℃に２時間維持し、ＰＢＳで洗浄し、ついで各
人について放射能をカウントした。

この測定において、血清中の抗α−フェトプロティン免
疫グロブリンの濃度の上昇に伴って、１分当たりのカウ
ント数（ｃｐｌｌ）が上昇する。

各種希釈液について得られた結果は次のとおりである。

なお、比較のため、未処置のマウス（免疫前のマウス）
について得られた結果を併記する。

血清希釈液　免疫訂　ｌＯμ９　１０μ９７にＬＳＩ　
　４０μ９　４０μ？／ＩＬＨ包阻と　ｋ組と一全」上
−包阻り一包ｎ−１：１０　　　１７４６　　　５３９
Ｇ　　　　１０８３０　　　１０８８０　　　　６２８
１：１００　　　　７６９　　　２０５７　　　　７６
５２　　　　５７３０　　　　４２４２１：１０００　
　　　４７９　　　　７１１　　　　４３１０　　　　
２２５９　　　　３２２６すべてのマウスが処置に対し
てプラスの応答を示し、α−フェトプロティンの完全分
子で免疫したウサギの血清を分析することによって得ら
れたものと同様の値を示した。

同様の測定において、α−フェトプロティンを注射する
ことによってウサギで調製したコントロールの血清では
下記の結果を示した。

血清希釈液　　未処置　　コントロール」旺畦　　−一
工蛇齢−− １：２５０　　　　　＞１００　　　　３６４４１：５
００　　　　　＞１００　　　　３２５７１：１０００
　　　　　＞１００　　　　３０２１接合ペプチド１０
μ９で処置したマウスの血清において最高の抗体測定値
が観察された。

従って、この覆の抗血清は、α−フェトプロティンを認
識する場合に有効であり、アルブミンとの類似性を持た
ない分子フラグメントを使用して得られる利点がある。

実施例４ モノクロナール抗α−フェトプロティン抗体の調製 １群のＢａ１ｂ／ｃマウスを、実施例３と同様に操作す
ることによつて合成融合ペプチドで免疫した。

その後、マウスの膵臓を採取し、Ｌ、Ｇ、　Ｄａｖｉｓ
。

Ｍ、Ｄ、　Ｄｉｂｎｅｒ及びＪ、Ｆ、　Ｂａｔｔｅｒｙ
によってｒＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙＪ　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニ
ューヨーク、１９８６年に開示された方法に従って、ハ
イブリドーマを調製した。

ついで、得られた融合生成物を、上記実施例３に記載し
たラジオイミュノアッセイによって分ｌＦ？して、α−
フェトプロティン、融合ペプチド及びアルブミンを認識
する能力を測定した。

このようにして、α−フェトプロティン及び融合ペプチ
ドを認識するが、アルブミンを認識しないハイブリドー
マ（Ｎｏ、２９）を同定した。

ついで、゛このハイブリドーマを希釈による２つの連続
クローニングに供した。

第１表に、第１回目のクローニング後において、上記実
施例３に記載のラジオイミュノアッセイによって、ハイ
ブリドーマのいくつがのものに関して行ったへＦＰ、組
換タンパク質及びアルブミンに対する各活性度の分析結
果を示す。

第　　１　　表 ２９．１ ２９．２ ２９．３ ２ｇ、４ ２９．５ ２９．９ ２９．１０ ５．４０８ ５．５６３ ５、２３９ ７．７９１ ８．３８３ ６．９９８ ７．８２９ １０．４８８ ９．６３Ｂ ６．６１５ ９．１１７９ １０．４０６ ９．１０１ ８．６０６ 表中に示した数値は、各未処理のミエローマ上澄み液に
関する２つの結果から得られた平均値である。

これらハイブリドーマのいくつかを第２のクローニング
に供した。これにより、Ｎｏ、２９．１に由来の細胞ラ
インＭ（ｉ１５、ＭＧ２４及びＮｏ、２９．３に由来の
肛３１を選択することができた。

これら３種のハイブリドーマ（ＭＧ１５、ＭＧ２４及び
ＭＧ３１）は、α−フェトプロティン及び融合タンパク
質に対する良好な認識性を発揮するが、アルブミン又は
その分解生成物に対する認識性を持たないモノクロナー
ル抗体分泌細胞ラインの代表的なものである。これらの
細胞ラインを使用し、腹腔的投与（約２，０００，００
０細胞／マウス）してＢａ１ｂ／ｃマウスを処置し、ハ
イブリドーマに関して一般的に使用される技術に従って
Ａ−セファロ−スタンバク質カラムを通過させることに
より、腹水から抗体を精製した。

これら３Ｎのハイプリドーマから得られたモノクロナー
ル抗体はすべてＩｇＧ１のサブクラスに属し、ＡＦＰ結
合力及び親和力によって特徴づけられる。

特に、これら抗体のＡＰＰ結合力を測定するため、セフ
ァロース−マウス抗γ−グロプリンヲ収容スる１ｙｓｅ
−ｐｈａｓｅカラム（ＳＣＬＡＶＯ）を使用し、Ｔｒｉ
ｓ−Ｈ（４緩衝液ｐＨ８，６（１００ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ
、　２Ｃ１ａＭ　ＥＤＴ＾、０．５％ＮＭＳ。

０．１％ＢＳＡ）中に各種の濃度で含有される被検抗体
の溶液２００μ（２、ｌ”’Ｉ−ＡＦＰ（総ｃｐｍ＝　
４５０００）及びＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８，８２００μＱ
を充填した。

ついで、カラムを室温（２０−２５℃）に２時間維持し
、液相を浸出させ、洗浄液２ｇＩＱで洗浄し、カウント
した。

３種類のモノクロナール抗体は、濃度０．１μ９／ＲＱ
で結合力５０％を示した。

一方、同じカラムを使用し、結合力が約３０％となる濃
度の抗体溶液２００＊ｌＪ、　Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８，
６で希釈した濃度Ｌｎ９／ｘＱから１００Ｏｒ＋９／ｊ
ｌ（２までのＡＰＰ溶液２００ａ　（ｌ及び”’１−Ａ
ＦＰ　２００ｍ１２を充填して親和力を測定した。室温
に２時間維持した後、液を浸出させ、カラムを洗浄し、
カウントした。

親和力を５ｃａｔｃｈａｒｄの分析法［ｒＡｒ＋ｎ、　
Ｎ、Ｙ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｊ　５１．８８０（２９４９）コによって測定
した。

上記３種類の抗体はすべて４−５ＸＩＦ”２１モルの親
和力を有しており、市販されている最良の抗体と比較し
て、抗ＡＦＰ抗体に関して非常に良好な値であった。

さらに、ｐＨ４ないし９の緩衝液を使用することによっ
て、同相におけるこれらモノクロナール抗体の攻撃の可
能性が証明された。

このような３種類の抗体は、本発明によるペプチドをマ
ウスの免疫に使用し、ついでクローンを選別することに
よって得られるモノクロナール抗体の代表的なものであ
り、ヒトＡＦＰの測定用キットの開発に使用される。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトα−フェトプロティン及びヒトアルブミン
のアミノ酸配列の整列を示す図、第２図は３ｇ−１１９
アミノ酸配列をコード付ける合成遺伝子を構成する１３
個の合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す
図、第３図は合成オリゴヌクレオチド間の各種の可能な
整列を示す図、第４図は３ｇ−１１９ポリペプチドをコ
ード付ける合成遺伝子のヌクレオチド配列を示す図、第
５図はポリアミドゲルを示す図、第６図Ａ及びＢは２種
類の抗体によるウェスタンプロットを示す図、及び第７
図は融合タンパク質の配列を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　哺乳動物においてヒトα−フェトプロテインを認識
   し、これと反応できるが、アルブミン又はその分解生成
   物を認識し得ない抗体の形成を誘発する免疫活性が付与
   された合成ペプチドにおいて、該ペプチドが、ヒトα−
   フェトプロテインの３８−１１９領域に相当する式（
   I ）【遺伝子配列があります】 で示されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴
   とする、合成ペプチド。 ２　請求項１記載のものにおいて、前記式（ I ）のア
   ミノ酸配列が、アミノ酸鎖末端にメチオニン残基を有す
   る、合成ペプチド。 ３　請求項１記載のものにおいて、前記式（ I ）のア
   ミノ酸配列が、アミノ酸鎖末端に融合ペプチドを有する
   、合成ペプチド。 ４　請求項３記載のものにおいて、前記融合ペプチドが
   、大腸菌のＭＳ２ファージのＤＮＡポリメラーゼのアミ
   ノ酸配列 【遺伝子配列があります】 を有する部分に相当する、合成ペプチド。 ５　下記ヌクレオチド配列で表される前記式（ I ）の
   ペプチドをコード付けるＤＮＡフラグメント。 【遺伝子配列があります】 ６　クローニングベクターと請求項５記載のＤＮＡフラ
   グメントとを結合させることによって得られた組換ＤＮ
   Ａ分子であって、前記ＤＮＡフラグメントが、調節配列
   ［プロモーター：リボゾーム認識部位］及び／又は前記
   ＤＮＡフラグメントによってコード付けられたペプチド
   の発現及び／又は分泌を誘発する分泌配列のコントロー
   ル下に置かれたことを特徴とする、組換ＤＮＡ分子。 ７　請求項６記載のものにおいて、前記クローニングベ
   クターが、大腸菌、桿菌、酵母及び哺乳動物細胞のプラ
   スミド又は複製及び発現バクテリオファージでなる群か
   ら選ばれるものである、組換ＤＮＡ分子。 ８　請求項７記載のものにおいて、前記クローニングベ
   クターが大腸菌のプラスミドｐＥＸ３４Ａである、組換
   ＤＮＡ分子。 ９　アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
   ＡＴＣＣ６７７４２として寄託された大腸菌Ｋ１２、Δ
   Ｈ１、Δｔｒｐ（Ａ１／ＧＴＡ）で表される請求項８記
   載の組換ＤＮＡ分子。 １０　請求項６−９記載の組換ＤＮＡ分子で形質転換さ
   れた宿主微生物において、該微生物が大腸菌、桿菌、酵
   母及び哺乳動物細胞でなる群から選ばれたものであるこ
   とを特徴とする、宿主微生物。 １１　請求項９記載の組換ＤＮＡ分子で形質転換された
   請求項１０記載の宿主微生物（大腸菌Ｋ１２、Ｈ１、ｔ
   ｒｐ）。 １２　炭素源、窒素源及び無機物を含有する培地におい
   て、請求項１０記載の形質転換微生物を培養することか
   らなる発酵法によって得られた請求項１記載のペプチド
   。 １３　炭素源、窒素源及び無機物を含有する培地におい
   て、請求項１１記載の形質転換微生物を培養することか
   らなる発酵法によって得られた請求項４記載のペプチド
   。 １４　ヒトα−フェトプロテインを認識し、これと反応
   できるが、アルブミン又はその分解生成物を認識し得な
   いポリクロナール及びモノクロナール抗ペプチド抗体の
   調製に使用する、請求項１−４記載の合成ペプチドの使
   用法。 １５　ヒトα−フェトプロテインを認識するが、アルブ
   ミン又はその分解生成物を認識し得ないモノクロナール
   抗体を分泌するハイブリドーマ。 １６　特異的にヒトα−フェトプロテインと反応するが
   、アルブミン又はその分解生成物とは反応し得ないモノ
   クロナール抗体。 １７　ヒト血液サンプル中の低血清レベルのα−フェト
   プロテインを定量する免疫法において、被検サンプルを
   、ヒトα−フェトプロテインを認識し、これと反応でき
   るが、アルブミン又はその分解生成物を認識し得ないポ
   リクロナール又はモノクロナール抗ペプチド抗体とイン
   キュベートすることを特徴とする、α−フェトプロテイ
   ンの免疫測定法。 １８　ヒト血液サンプル中の低血清レベルのα−フェト
   プロテインを定量する免疫法において、被検サンプルを
   、請求項１−４記載のペプチドとインキュベートするこ
   とを特徴とする、α−フェトプロテインの免疫測定法。 １９　請求項１−４記載のペプチドを包含してなる、ヒ
   ト血清サンプル中のヒトα−フェトプロテインを免疫測
   定するための診断用キット。 ２０　請求項１６記載のポリクロナール及びモノクロナ
   ール抗体を反応体として包含してなる、ヒト血清サンプ
   ル中のヒトα−フェトプロテインを免疫測定するための
   診断用キット。