JP4114971B2

JP4114971B2 - ｈｎＲＮＰＢ１蛋白特異的なモノクローナル抗体およびその製造法

Info

Publication number: JP4114971B2
Application number: JP09600297A
Authority: JP
Inventors: 博菅間; ドレフィスギデオン
Original assignee: 博菅間; ドレフィスギデオン
Priority date: 1997-04-14
Filing date: 1997-04-14
Publication date: 2008-07-09
Anticipated expiration: 2017-04-14
Also published as: JPH10287699A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はｈｎＲＮＰ（heterogeneous ribonucleoprotein；核内不均一リボ核酸蛋白）Ｂ１に特異的に反応し得る抗ｈｎＲＮＰＢ１蛋白モノクローナル抗体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ｈｎＲＮＰ蛋白はｈｎＲＮＡ（heterogeneous nuclear RNA = pre-messenger RNA）と結合する２０数種類の蛋白の総称で、真核細胞の核内に豊富に存在する。その機能としてｐｒｅ−ｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡの代謝（スプライシング等）との関わりが考えられているが、必ずしも明らかになっていないのが現状である。このｈｎＲＮＰのうちｈｎＲＮＰＡ２及びｈｎＲＮＰＢ１蛋白が、ＲＮＡ以外にテロメアＤＮＡ反復配列に結合することが報告された（Cooke, H. J., Nucleic - Acids Res. 1992; 20: 6461 - 4）。テロメアは染色体末端に存在する構造で、正常細胞においては細胞が分裂するたびに短縮し、これが一定の長さ以下に短縮すると細胞は老化する。しかし、癌細胞においてはテロメラーゼ酵素活性があるためテロメアが短縮せず、細胞老化を免れる。また、最近、例えばＲＡ：慢性関節リウマチ（rheumatoid arthritis）、ＭＣＴＤ：混合性結合組織病（mixed connective tissue diseases）、ＳＬＥ：全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus）等の自己免疫疾患の患者血中で、自己抗体であるｈｎＲＮＰＡ２及びｈｎＲＮＰＢ１蛋白に対する抗体価が上昇すること（ＲＡ患者の３５％、ＭＣＴＤ患者の３８％、ＳＬＥ患者の２３％で上昇。）が報告された（Hassfeld W., Arthritis - Rheum. 1995; 38: 777 - 85）。しかし、従来ｈｎＲＮＰＡ２・ｈｎＲＮＰＢ１蛋白に対する特異的な抗体は得られておらず、該蛋白の生理的機能および病理的な意義を明らかにする手段がなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ｈｎＲＮＰＢ１蛋白はｈｎＲＮＰＡ２蛋白と同一の遺伝子からスプライシングの違いによって生じるため、両蛋白はＮ末端の１２アミノ酸以外のアミノ酸配列は同一である（Kozu T., Genomics. 1995; 25: 365 - 71）。また、そのＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列やＣ末端の繰り返しアミノ酸配列には、他のｈｎＲＮＰ蛋白と相同性が認められる。このため、従来の蛋白本体を免疫源として用いる方法では、抗ｈｎＲＮＰＢ１蛋白特異的抗体を得ることは困難で、ｈｎＲＮＰＢ１蛋白のみを認識する抗体は存在しなかった。一方、ｈｎＲＮＰＢ１蛋白はｈｎＲＮＰＡ２蛋白に比較して、テロメアＤＮＡ反復配列に対する結合性が高く、自己抗体である抗核抗体が出現する自己免疫疾患疾病との関係がより深いと考えられることから、抗ｈｎＲＮＰＢ１蛋白抗体は医療面での利用が期待される。ｈｎＲＮＰＢ１“蛋白”本体や、キャリアー“蛋白”に結合させたペプチドでマウスを免疫する場合、蛋白中の様々な部位に対して抗体ができる。この為、得られる抗体の抗原決定基が曖昧で、他の蛋白とも交叉反応する可能性があり、臨床応用には問題がある。よって、最初から抗原決定基を特定できる方法で、ｈｎＲＮＰＢ１蛋白特異的な抗体を作製することが必要である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者はｈｎＲＮＰＢ１蛋白とｈｎＲＮＰＡ２蛋白とのＮ末端の１２個のアミノ酸配列が異なることに注目し、これによってｈｎＲＮＰＢ１蛋白に特異的に反応するモノクローナル抗体を作製することを考えた。まず、ｈｎＲＮＰＢ１蛋白Ｎ末端の１６アミノ酸：¹Met Glu Lys Thr Leu Glu Thr Val Pro Leu Glu Arg Lys Lys Arg ¹⁶Glu（下線がｈｎＲＮＰＢ１蛋白特異的アミノ酸配列）８個をリジン骨格に導入した多抗原性ペプチド（ＭＡＰ；multiple antigenic peptide：一分子内に抗原となるアミノ酸配列を８個含むペプチド）を化学合成した。このＭＡＰを直接用いてマウスを免疫し、その脾細胞とミエローマ細胞を融合した。得られたハイブリドーマ細胞を上記のｈｎＲＮＰＢ１蛋白Ｎ末端の１６アミノ酸からなるポリペプチドを用いて、スクリーニング、クローニングした。その結果、ｈｎＲＮＰＢ１蛋白に特異的に反応する抗ｈｎＲＮＰＢ１モノクローナル抗体２Ｂ２を作成することに成功したものである。
【０００５】
本発明は（１）ｈｎＲＮＰＢ１蛋白を特異的に認識するモノクローナル抗体、（２）ｈｎＲＮＰＢ１蛋白のＮ末端の特異的な１２アミノ酸配列：Lys Thr Leu Glu Thr Val Pro Leu Glu Arg Lys Lys を含むペプチドを認識する（１）の抗体、（３）マウスモノクローナル抗体２Ｂ２である（２）記載の抗体、（４）（１）、（２）または（３）記載の抗体を産生するハイブリドーマ、（５）ｈｎＲＮＰＢ１蛋白のＮ末端の特異的な１２アミノ酸配列：Lys Thr Leu Glu Thr Val Pro Leu Glu Arg Lys Lys を含むペプチド、例えば多抗原性ペプチド（multiple antigenic peptid；ＭＡＰ）で免疫した哺乳動物の脾細胞と同種のミエローマ細胞を融合させて得られる細胞をクローニングすることを特徴とする（４）のハイブリドーマの製造法、に関する。
【０００６】
本発明で用いられるｈｎＲＮＰＢ１蛋白のＮ末端の特異的な１２アミノ酸配列：Lys Thr Leu Glu Thr Val Pro Leu Glu Arg Lys Lys を含むペプチドとしては、ｈｎＲＮＰＢ１蛋白Ｎ末端の１６アミノ酸に限定されるものではない。上記１２個のアミノ酸配列そのものの他、その前後にいくつかのアミノ酸配列を有するものが含まれるが、その抗原としての特異性を考慮すると、全部で１８個弱のアミノ酸配列を有するものが好ましく、中でもｈｎＲＮＰＢ１蛋白Ｎ末端配列のペプチドを用いると良い。
特異的な１２アミノ酸配列を含むペプチドのＭＡＰリジン骨格への導入は、市販のＭＡＰ用樹脂に通常のペプチド合成機を用いて行えば良い。また、特異抗体のスクリーニング用のＭＡＰリジン骨格を持たない同配列のペプチドも、通常のペプチド合成機を用いて合成すれば良い。
【０００７】
上記のＭＡＰを用いてモノクローナル抗体を得るためには、モルモット、ラット、マウス等の実験動物が使われるが、製造、操作の簡便性より、マウスを使うことが好ましい。免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合、腹腔内、皮下、静脈内、筋肉内、皮内等のいずれのルートからでも可能であるが、主として腹腔内、皮下、静脈内に注入するのが好ましい。また、免疫間隔、免疫量等も可変度は高く、種々の方法が可能であるが、例えば２週間隔で約２〜６回免疫し、最終免疫後、約１〜５日、好ましくは約２〜４日後に摘出した脾臓細胞を用いる方法がよく用いられる。免疫量は１回にペプチド量として、マウス当り約０．１μｇ以上、好ましくは約１０μｇ〜３００μｇ用いることが望ましい。又、脾臓を摘出する前に、部分採血を行い、血中の抗体価の上昇を確認した上で、脾臓細胞を用いる融合実験を行うことが望ましい。
上記脾臓細胞とリンパ球様細胞との細胞融合は例えば摘出したマウスの脾臓細胞を、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（HGPRT~）や、チミジンキナーゼ欠損（TK~）の様なマーカーを持った適切な同種または異種（好ましくは同種）のミエローマ（例、SP2、P3-X63-Ag・8UI）等の、リンパ球様細胞株との間で融合させる。例えばレーンの方法（Methods in Enzymology 121, 1980; 183 - 192）に準じて融合させることにより製造される。すなわち、たとえばミエローマ細胞と脾細胞とを約３：５の割合で、例えばダルベッコＭＥＭ培地とＮＴＳＣ培地を９：１に混合した培地（以下ＨＹ培地と称する。）に懸濁させ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス等の融合剤が用いられる。ＰＥＧの重合度は、ふつう約１，０００〜６，０００、時間は約０．５〜３０分、濃度は約１０％〜８０％等が用いられるが、好ましい条件の一例として、ＰＥＧ１，５００を約３５％で約４〜１０分間処理することにより、効率よく融合させることが出来る。融合細胞は、ヒポキサンチン−アザセリン培地（ＨＡ培地）等を用いて、選択的且つ、効率的に増殖させることが出来る。
増殖して来た細胞の培養上清は、目的とする抗体産生があるか否かについてスクリーニングを行うことができるが、抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来る。即ち、この場合には、免疫したペプチドに対する抗体産生の有無を、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法等の方法で調べることが出来るが、これらの方法についても種々の変法が可能である。
好ましい測定法の一例として、ＥＩＡを用いる一つの方法について述べる。９６穴マイクロテストプレートに、免疫したペプチドを常法に従ってコートさせておき、これに測定したい培養上清や、マウスの血清を加え、一定時間、定温（約４〜４０℃を示す。以下においても同様。）で反応させる。この後、反応物をよく洗った後、酵素で標識した例えば抗マウス免疫グロブリン抗体（酵素と抗体を常法に従いカプリングさせた後精製したもの）を加え、一定時間、定温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基質を加え、一定時間、定温で反応させ、その後、生成発色物を吸光度または蛍光度等で測定する。選択培地で増殖を示し、免疫に用いたペプチドに対する抗体活性のみられたウエルの細胞は、限界稀釈法等によりクローニングを行うことが望ましい。クローン化された細胞の上清について同様にスクリーニングを行い抗体活性の高いウエルの細胞を増やすことにより、免疫したペプチドと反応性を示すモノクローナル抗体産生ハイブリドーマクローンが得られる。
このようにしてクローン化されたハイブリドーマを、液体培地中で増殖させることにより、培養液から該モノクローナル抗体を得ることができる。また、哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、腹水を採取することにより抗体を取得することが出来る。このためには、例えばマウスの場合、プリスタン（テトラメチルペンタデカン）やミネラルオイル等を前もって接種したＢＡＬＢ／ｃ等のマウスに約１×１０⁴〜１×１０⁷個、好ましくは約５×１０⁵〜２×１０⁶個のハイブリドーマを腹腔内に接種し、約７〜２０日後、好ましくは約１０〜１４日後に腹水液を採取する。腹水に蓄積した抗体は、例えば硫安分画、プロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィー等により、容易にモノクローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離することができる。
【０００８】
【発明の効果】
本発明ではｈｎＲＮＰＢ１蛋白に特異的なアミノ酸配列で免疫を行うため、ｈｎＲＮＰＡ２蛋白をはじめとする他のｈｎＲＮＰ蛋白とは交叉反応しない、ｈｎＲＮＰＢ１蛋白特異的抗体が得られる。そして、本発明抗体により特異的かつ簡便にｈｎＲＮＰＢ１蛋白およびその生理活性を検出でき、医学生物学分野におけるｈｎＲＮＰＢ１蛋白の機能と病的意義の解析手段を提供することができる。さらに、ｈｎＲＮＰＢ１蛋白が癌の不死化に関連するテロメアＤＮＡ反復配列と特異的に結合すること、ｈｎＲＮＰＢ１蛋白がリウマチ性疾患で出現する異常な抗リボ核酸蛋白抗体（自己抗体）産生の一因であることから、癌やリウマチ性疾患の診断や治療に関る薬品、医療産業分野で本発明抗体を利用することが可能である。
【０００９】
【実施例】
［ｈｎＲＮＰＢ１蛋白特異的多抗原性ペプチドの合成］
リジンで作製される骨格に、ｈｎＲＮＰＢ１蛋白に特異的な１２アミノ酸配列を含む１６アミノ酸（Met Glu Lys Thr Leu Glu Thr Val Pro Leu Glu Arg Lys Lys Arg Glu）からなるペプチド８個を、Ｆｍｏｃ法にて化学合成し導入した、（下図参照）脱塩、簡易精製したものをｈｎＲＮＰＢ１蛋白特異的多抗原性ペプチドとした。
【００１０】
【化１】

【００１１】
［モノクローナル抗体の作製］
（１）免疫：
上記のｈｎＲＮＰＢ１蛋白特異的多抗原性ペプチド１００μｇをフロイントの完全アジュバントとともにＢＡＬＢ／ｃマウス（♀８週令）腹腔に投与した。２週および４週間後にｈｎＲＮＰＢ１蛋白特異的多抗原性ペプチド１００μｇをフロイントの不完全アジュバントとともにマウスの腹腔内に投与した。
（２）細胞融合：
（１）で示した免疫マウスより、抗原最終投与後３日後に脾臓を摘出し、脾細胞を得た。レーン等の方法（Methods in Enzymology, 121, 1986, 183 - 192）に準じて、脾細胞とマウスミエローマ細胞ＳＰ２／ｏを細胞融合し、さらに、ヒポキサンチンとアザセリンを含む培地を用いて雑種細胞を選択的に増殖させた。
【００１２】
［抗体産生細胞のスクリーニングとクローニング］
ｈｎＲＮＰＢ１蛋白に特異的な１２アミノ酸配列を含む１６アミノ酸からなるペプチドを予め、ポリスチレン製９６穴マイクロテストプレートに固定し、これに雑種細胞の培養細胞上清を反応させ、ＨＲＰ標識マウスＩｇＧヤギ抗体（ファルマシア）を用い酵素免疫測定（ＥＩＡ）法にて、抗ｈｎＲＮＰＢ１蛋白抗体産生細胞を一次スクリーニング、さらにＨｅＬａの細胞のＳＤＳ蛋白標本を用いてウエスターンブロッティングを用い、二次スクリーニングした。続いてｈｎＲＮＰＢ１蛋白特異的な抗体産生陽性ウエルを選び、限界希釈法によりクローニングした。その結果、１２種のハイブリドーマ細胞クローンが得られ、そのうちｈｎＲＮＰＢ１蛋白に対する特異が高いモノクローナル抗体を、多量に、長期間安定して産生し続ける１種のクローンが得られ、ハイブドーマ２Ｂ２と命名した。このＨｙｂｒｉｄｏｍａ２Ｂ２は平成９年１月３１日からＦＥＲＭＰ−１６０５４号として工業技術院生命工学技術研究所に寄託されている。
［モノクローナル抗体の精製とイムノグロブリンクラス］
ｈｎＲＮＰＢ１蛋白特異的なモノクローナル抗体を産生するマウスハイブドーマ２Ｂ２細胞を、予めプリスタン（テトラメチルペンタデカン）を腹腔内に投与しておいたＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に接種し、１４日後復水を採取した。得られた復水はプロテインＡカラムキット（Ampure PA Kit, アマーシャム）を用いて精製後、ＰＢＳで透析した。精製した２Ｂ２抗体のイムノグロブリンクラスは、マウスモノクローナル抗体サブクラス判定キット（IsoStrip, ベーリンガーマンハイム）を用いて決定した。その結果、抗ｈｎＲＮＰＢ１蛋白モノクローナル抗体２Ｂ２は、ＩｇＧ₁、κであった。
【００１３】
【参考例】
本発明抗体の特異性、反応性は極めて高く、ウエスターンブロッティング、免疫染色等で利用できる他、ｈｎＲＮＰＢ１蛋白の機能であるプレ・メッセンジャーＲＮＡおよびテロメアＤＮＡとの結合能の解析に用いることができる。以下にその参考例を示す。
〔参考例１〕ウエスターンブロッティングによるｈｎＲＮＰＢ１蛋白の組織特異的な発現
ラットの主要な組織からＳＤＳ蛋白標本を作製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ニトロセルロース膜に転写、抗ｈｎＲＮＰＢ１モノクローナル抗体２Ｂ２と反応後、ＥＣＬ（株アマーシャム）にて検出した。（図１）
図１の電気泳動図より分子量３８ｋＤのｈｎＲＮＰＢ１蛋白が各組織で発現されており、その発現量は一定でないことがわかる。
【００１４】
〔参考例２〕免疫蛍光染色による核内ｈｎＲＮＰＢ１蛋白の局在
培養ＨｅＬａ細胞をパラホルムアルデヒドで固定後、抗ｈｎＲＮＰＢ１モノクローナル抗体２Ｂ２を用いて免疫蛍光染色し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。その結果を図２に示す。
図２よりｈｎＲＮＰＢ１蛋白は核小体を除く核質に顆粒状に局在することがわかる。
【００１５】
〔参考例３〕抗ｈｎＲＮＰＢ１蛋白抗体を用いた免疫沈降によるプレ・メッセンジャーＲＮＡ／抗ｈｎＲＮＰ蛋白複合体の２次元電気泳動解析
蛋白を³⁵Ｓでラベルした培養ＨｅＬａ細胞の核質抽出標本を、抗ｈｎＲＮＰＢ１モノクローナル抗体２Ｂ２を用いて免疫沈降し、１次元目を非平行等電位点電気泳動、２次元目をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、フルオログラフィーにて検出した（図３）。
尚、図３の電気泳動図より以下のことが判る。即ち、核内のｈｎＲＮＰＢ１蛋白の大部分は、プレ・メッセンジャーＲＮＡと結合して存在する。また、ｈｎＲＮＰＢ１蛋白が結合しているプレ・メッセンジャーＲＮＡには同時に他のｈｎＲＮＰ蛋白も結合して複合体を形成している。この為、この複合体のｈｎＲＮＰＢ１蛋白に２Ｂ２が反応するので抗ｈｎＲＮＰＢ１抗体２Ｂ２によって免疫沈降すると、ｈｎＲＮＰＢ１蛋白のみでなく、同様にプレ・メッセンジャーＲＮＡに結合して複合体を形成している他のｈｎＲＮＰ蛋白も同時に免疫沈降される。しかしながら、免疫沈降物の２次元電気泳動解析を行うと、それぞれの蛋白が、その等電点と分子量に応じて二次元的に展開され描出される。
〔参考例４〕抗ｈｎＲＮＰＢ１蛋白抗体を用いたテロメアＤＮＡのゲルシフトアッセイ
Ｐ³²でラベルしたテロメア反復配列（ＴＴＡＧＧＧ）₆とＨｅＬａ細胞の核質を抽出液、種々の濃度の抗ｈｎＲＮＰＢ１モノクローナル抗体２Ｂ２およびコントロールＩｇＧを反応させ、アガロースゲルで電気泳動した（図４）。
図４の電気泳動図よりＨｅＬａ細胞の核質抽出液には、テロメア反復配列に対する結合蛋白が含まれるため１段階シフトし、抗ｈｎＲＮＰＢ１モノクローナル抗体２Ｂ２を加えるとさらにもう一段階シフト（スーパーシフト）する。これにより、ｈｎＲＮＰＢ１蛋白がテロメア反復配列と結合することが証明される。これは本発明抗体が特異的に反応するｈｎＲＮＰＢ１蛋白が癌細胞（ＨｅＬａ細胞）の核質内に存在し、テロメアＤＮＡ反復配列と特異的に反応することを示している。
【００１６】
【配列表】
【００１７】
【配列番号：１】

【００１８】
【配列番号：２】

【図面の簡単な説明】
【図１】ｈｎＲＮＰＢ１蛋白が組織特異的に発現されていることを示す電気泳動図である。
【図２】核内ｈｎＲＮＰＢ１蛋白の局在を示す免疫蛍光染色図である。
【図３】抗ｈｎＲＮＰＢ１蛋白抗体を用いた免疫沈降によるプレ・メッセンジャーＲＮＡ／抗ｈｎＲＮＰＢ１蛋白複合体の２次元電気泳動解析図である。
【図４】抗ｈｎＲＮＰＢ１蛋白抗体を用いたテロメアＤＮＡのゲルシフトアッセイに関する電気泳動図である。

Claims

受託番号がＦＥＲＭＰ−１６０５４号であるハイブリドーマ。
受託番号がＦＥＲＭＰ−１６０５４号であるハイブリドーマにより産生される、ｈｎＲＮＰＢ１蛋白のＮ末端の特異的な１２アミノ酸配列：Lys Thr Leu Glu Thr Val Pro Leu Glu Arg Lys Lys を含むペプチドを特異的に認識し、その他のｈｎＲＮＰ蛋白質とは交差反応をしないｈｎＲＮＰＢ１蛋白に特異的なモノクローナル抗体。