JPS63264600A - ウシ白血病ウイルスに対する感染防御抗体を誘導するペプチド分画と、この分画を得る方法と、この分画の遺伝暗号配列と、この分画から製造されるワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ）に対する感染
防御抗体を誘起する新しいペプチド分画とこの分画を得
る方法に関するものである。

本発明はさらに、このペプチド分画から製造されるか、
または、上記ウィルスの生物学的活性の原因となる少な
くとも１つの抗原部位をこの分画と共通に有する合成ペ
プチドから製造されるワクチンにも関する。

従来の技術 ウシ白血病または風土性ウシ白血病は、レトロウィルス
、すなわちウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ）により発生す
る極めて感染力の強い病気である。

主として東ヨーロッパと南北アメリカに発生するこの病
気は、家畜、特にヒツジとウシを襲い、群のほぼ全体に
感染する。この病気は比較的ゆっくりと進行するが、多
くの場合に腫瘍が発生するため感染した家畜は最終的に
は死ぬことになる。この病気の伝染に対処する方法また
は伝染を防止する方法が現在はとんどないだけに、発生
がそれだけ危惧されている。現在までに行われてきた解
決法は、感染した家畜を隔離して屠殺することである。

ウシ白血病に対する感染をいくらかでも防御することが
できるようワクチンを改良する試みが長年にわたって続
けられている。

ジェイ、ミラー（ＪｏＭＩＬＬＥＲ）とヴアン　デア　
マーテン（ＶＡＮ　ＤＥＲＭＡＡＴＥＮ）は、（Ａｎｎ
、　Ｒｅｃｈｅｒｃｂｅ　Ｖａｔ。

第９巻、８７１〜８７７ページ（１９７８年）において
）不活性化させたＢＬＶのエンベロープから得られる糖
タンパク貿をワクチンの主要な有効成分として利用する
ことに言及している。

工）し、　ｆ）’イー、　ハトラスク（Ｌ、Ｖ、ＰＡＴ
ＲＡＳＣＵ）イ也は、（Ｒｅｖ、　Ｍｅｄ、のウィルス
学、第３１巻、９５５〜１００２ページ（１９８０年）
に）不活性化させたＢＬＶをもとにしてＢＬ−ＶＡＣＣ
−ＲＯと呼ばれるウシ白血病ウィルス用ワクチンを製造
する方法を記載している。

二ｌｈ、　マメ’Ｊ　ックス（Ｍ、　！ＪＡＭｉＪＥ］
ＣＫＸ）、デー、ポルトチル（Ｄ、　ＰＯＲＴ［Ｅ置Ｌ
［Ｅ）、アー、ビュルニ−（Ａ。

ＢｔｌＲＮＹ）、ジェイ、ロイネン（Ｊ、ＬＥＵＮＥＮ
）は、（Ｚｂｌ。

ｖｅｔ、　Ｍｅｄ、第Ｂ２７巻、２９１〜３０３ページ
、（１９８１年）に）初乳から得られる受動抗体が動物
の感染を防ぐことを研究した結果を報告している。

エム、オー７７　（Ｍ、　ＯＮ［Ｉ！、ＩＡ）他は、（
Ａｍ、　Ｊ、　Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、　　第４５巻、１２１
２〜１２１５ページ、（１９８４年）に）ｇｐ５１とい
う略号で表されるＢＬＶのエンベロープのうちの分子量
が５１，０００の糖タンパク質に対する抗体がＢＬＶに
対して中和活性を示すことを指摘している。この論文に
は、このｇｐ５１ａタンパク質と、ｐ２４タンパク質と
、感染したヒツジ胎児の腎臓細胞（−ＦＬＫ）とを用い
て得られるワクチンの他、このワクチンをヒツジに投与
したときにいくぶん現れる防御効果が記載されている。

バルファ゛ノウ゛イソチ（ＰＡＲＦＡＮＯＶＩＣＨ）　
　他は、（Ｓｒ。

Ｖｅｔ、　Ｊ、　　第１３９＠、１３７〜１４６ページ
、（１９８３年）に）ホルムアルデヒドと、ロイシンや
りシン等のアミノ酸との間の反応によって生成するアミ
ノメチル化化合物を用いて不活性化ＢＬＶを製造する方
法を言己載している。

シー、エイチ、サイレン（Ｇ、Ｈ，ＴＨＥＩＬＥＮ）他
は、（獣医学と動物科学における最近の話題（Ｃｕｒｒ
ｅｎｔＴｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　！
、１ｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ａｎｉｍａｌ　５ｃｉ−
ｅｎｃｅｓ）第１５巻、５４７〜５５９ページ、（１９
８２年）に）散発性のウシ白血病の骨髄と胸腺から得ら
れたＢＬ−３細胞系の生きた細胞をウシにワクチン接種
したことを記載している。

しかし、上記のどのワクチンも、極めて短期間しか防御
効果がないとか、大規模に投与することができないとい
う問題がある。

所定の条件下ではｇ　ｐ５Ｈ！タンパク質が中和抗体を
誘導することが知られている。

シー、プルツク（Ｃ９ＢＲＵＣＫ）他は、（Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ第１２２巻、３４２〜３５２ページ、（１９８２
年）において）抗−ＢＬＶモノクローナル抗体拮抗によ
りｇｐ５１糖タンパク質に８つの独立な抗原領域がある
ことを証明した。

デー、ポルトチル（Ｄ、　ＰＯＲＴＥ置ＬＥ）他は、（
Ｃｃｍｍ。

巳ｕｒ、　　Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　　（ＲＥＰ）　
　巳ｔｌＲ（１９８４年）　　ＥＵＲ８４７１農業（Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）、４５〜５１ページにおいて）
明らかにグリコシル化されていない分子量が約１５．０
００の分画上に位置しており、ウロキナーゼ溶液を用い
てｇｐ５１糖タンパク質を消化させることにより得られ
る３つのエピトープＦＸＧ、Ｈがウィルスの中和に関与
することを明らかにした。彼らは、エンベロープのｇｐ
５１または生物学的活性部位に対応する領域の遺伝子を
グリコシル化を可能にする形質発現システムに挿入する
ことにより抗ＢＬＶワクチンを製造することが可能であ
ることを予言している。彼らはさらに、有効なエピトー
プを合成ペプチドとして複製することが可能であること
を理論的に予言している。

デー、ポルトチル（Ｄ、ＰＯＲＴＥ置ＬＥ）他は、（Ｊ
。

Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、５ｕｂｌ、　　第１０Ａ
巻、（１９８６年）、２０９ページに記載された要約に
おいて）３つのエピトープＦＳＧ、Ｈが抗ＢＬＶサブユ
ニットワクチンを製造するのに重要な役割を果たす可能
性があることを示唆している。これら３つのエピトープ
は還元剤の存在に敏感であり、糖タンパク質の末端ＮＨ
２上のわずかにグリコシル化された分画上に局在してい
る。分解していないウィルス粒子上で検出されるのはこ
れらエピトープだけである。この点に関しては以前に発
表されたことがない。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的の１つは、後半に述べた研究の流れに従っ
て有効なワクチンに取り込むことのできるペプチド分画
を開発することである。

本発明の別の目的は、ウィルスの生物学的活性の原因と
なる少なくとも１つのエピトープを有するとともに、特
に、中和抗体の形成を誘起するｇｐ５１の分画を提供す
ることである。この分画は、ウシ白血病に対するワクチ
ンの有効成分として利用することができる。

本発明の別の目的は、ｇｐ５１の分画に特有であると同
時に誘起されるもとになったペプチドとＢＬＶを認識す
ることのできる、中和活性の原因となる少なくとも１つ
のエピトープを複製する合成ペプチドを提供することで
ある。

本発明のさらに別の目的は、ＢＬＶの生物学的活性を中
和する抗体を誘起することのできる合成ペプチドを場合
によっては担体タンパク質または他の適当な担体と結合
させた形態で提供することである。

本発明のさらに別の目的は、ＢＬＶの存在を検出するこ
とのできる試薬として使用可能な合成ペプチドを提供す
ることである。

本発明のさらに別の目的は、上記のｇｐ５１糖タンパク
質の分画から、または、場合によっては担体と結合させ
た形態の合成ペプチドから製造したウシ白血病に対する
ワクチンを提供することである。

課題を解決するための手段 本発明によれば、ｇり５１藷タンパク質の抗原部位すな
わちエピトープは、ｇ　ｐ５１分子を指向するモノクロ
ーナル抗体により明らかにされる。

このモノクローナル抗体は、当業者には周知の「ハイブ
リドーマ製造法」により得ることができる。すなわち、
この方法は、前もってｇｐ５１糖クンバク質で免疫化し
たマウスの骨髄細胞と肺臓細胞を融合させた後、形成さ
れたハイブリドーマからｇｐ５１糖タンパク貿に対して
活性のあるモノクローナル抗体を分泌させるハイブリド
ーマを選択する操作からなる。

このモノクローナル抗体を用いると、特に酵素免疫測定
法（例えばＥＬＩ　ＳＡ法）または放射線免疫検定法に
よりｇ　ｐ５１分子上に８つのエピトープを確言忍する
ことができる。なお、これら８つのエピトープはＡ−Ｈ
の記号で表される。

中和抗体の形成を誘起する抗原部位をｇｐ５１分子上に
位置させるため、ｇｐｓｔ糖タンパク質に対して制御さ
れた条件の下で例えばウロキナーゼを用いてタンパク質
消化を起こさせる。この結果、２つの分画が得られる。

すなわち、第１の分画く分画Ｉ）は分子量が約３５．０
００であり、第２の分画（分画■）はわずかにグリコシ
ル化した末端ＮＨ２（最初の１６０個のアミノ酸）で構
成されていて分子量が約１５．０００である。

各エピトープＡ−Ｈを指向するモノクローナル抗体を用
いてペプチド分画の免疫沈降を行い、次にポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行うと、中和抗体の形成を誘起す
る３つのエピトープＦ、Ｇ、Ｈは分画■の上に位置する
のに対し、エピトープＡ−Ｄは分子量が約３５．０００
の分画■上に見出される。

ウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ）に対する防御効果のある
抗体の形成を誘起する本発明のペプチド分画は、ＢＬＶ
の生物学的活性の原因となるエピトープのうちの少なく
とも１種を有するＢＬＶのエンベロープのｇｐ５１糖タ
ンパク質の分画の配列の全部または一部を複製するペプ
チド配列を含むことを特徴とする。

本発明の実施例の１つによれば、このペプチド分画はｇ
ｐ５１分画そのもので構成されている。ところで、この
ｇｐ５１分画は、以下の特徴を有する。

−上記ｇｐ５１糖タンパク質の末端Ｎ　Ｈ２を表してい
る。

−分子量が約１５．０００であり、わずかにグリコシル
化されている。

−アクセス可能な部位に中和抗体を誘起するエピトープ
を有する。

これらエピトープはさらに以下の特徴を有する。

−これらエピトープに対するモノクローナル抗体により
認識される。

−これらエピトープが、感染したヒツジまたはウシの血
清により選択的に認識される。

−このエピトープが還元剤による変性に対して敏感であ
る。

エピトープＦ、Ｇ、Ｈにより誘起される抗体の中和活性
は、プソイドタイプの阻害テストにより決定されている
。この阻害テストは、ジェイ、ザヴアダ（Ｊ、ＺＡＶＡ
ＯＡ）、ｘ　ル、　セルニー　（Ｌ、　ＣＥＲＮＹ）、
−Ｉ−、ｆ　タ）’　ウｙ　（Ａ、　２ＡＤＡＤＯＶ八
）、ジエイ、ボゾノヴア（Ｊ、Ｂ［］Ｚ［：ｌＮ［ｌＶ
八）、ニー、ディー、アルシュタイン（Ａ、Ｄ、ＡＬＳ
７８１Ｎ）がＪ、　　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ
５ｔ、第６２巻、９５〜１０１ページ、（１９７９年）
に記載している。

本発明のペプチド分画は、ｇｐ５１タンパク質を制御さ
れた条件の下で例えばウロキナーゼ溶液を用いてタンパ
ク質消化を起こさせることにより得ることができる。

得られたペプチド分画は、モノクローナル抗体を用いて
免疫沈降させる。形成されたタンパク質−抗体の複合体
をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行って分離し、次に解離することにより所望の分
画を得る。

この結果から出発して、本発明の発明者は、ペプチド配
列に親水性があるという予言に基づいた方法、または、
ペプチド鎖に柔軟性があると言う予言に基づいた方法を
用いて化学合成用のペプチドを選択する操作を行った。

前者の方法としては、例えば、カイト（ＫＹＴＥ）とト
ウーリトル（ＤＯＯＬ　ＩＴＴＬＥ）がＪｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ）ｏｇｙ第１５７
巻、１０５〜１２３ページ、（１９８２年）に記載した
方法がある。また、後者の方法としては、例えば、カル
プルス（ＫＡＲＰＬＵＳ）　　とシュルツ（ＳＣＨＵＬ
Ｚ）がＮａｔｕｒｗｉｓｓｅｎ−ｓｃｈａｆｔｅｎ、第
７２巻、２１２〜２１５ページ、＜１９８２年）に記載
した方法がある。

本発明の合成ペプチドは、ｇｐ５１分画に特徴的なエピ
トープＦＳＧ、Ｈのうちの少なくとも１つを複製しよう
とする分子量が約１５．０００のペプチド配列を含んで
いる。

好ましいペプチドは、以下の弐Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
−−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−−Ｃｙｓ−Ｐｒ
ｏで表されるペプチドで構成されるか、あるいは、この
式のペプチドを含んでいる。この式は、ｇｐ５１の７８
〜９２配列に対応する。

ポリペプチドは直線状でも環状でもよい。環化は２つの
システィン間のＳ−８結合により起こる。

他の興味あるペプチドとしては、以下の配列を含むペプ
チドまたは完全に以下の配列で構成されているペプチド
がある。

Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−、
へ５ｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−−Ａｓｎ。

Ｐ　ｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒ　ｏ−Ｐｒ　ｏ−Ｇ　Ｉ　ｎ−
Ｐ　ｒｏ−Ａｓ　ｐ−Ｐｈ　ｅ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｇ　ｌ　
ｎ−４ｅｕ−−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ａｓｐ　。

Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−八ｒｇ−Ｔ
ｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ　　。

Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔ
ｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　０これらの式は、ｇ　
ｐ５１Ｆｔタンパク質の配列１４１〜１５５．１４４〜
１５７．３９〜４８に直接対応している。

本発明のペプチドの構成に含まれる様々なアミノ酸残基
上に見出される可能性のある自由反応基を変更してもペ
プチド全体の免疫特性を変化させないのであれば、もち
ろんこのような変更を行うことができる。このように変
更されたペプチドは、当然本発明に含まれる。例えば、
ンステイン残基の一３Ｈ基は（例えば環式または二組化
ペプチドの場合）自由なチオールである二硫化物の形態
でアセトアミドメチル等の保護基により保護される。

同様に、カルボキシル基はアシル化またはエステル化さ
れ、アミノ基はアルキル化される。

本発明のペプチドは、ペプチド合成を行う従来の方法に
よって製造することができる。この合成は、均一な溶液
中または固相中で実施する。

例えば、均一な溶液中での合成法が、フーデンワイル（
ＨＯＵＤＥＮＷＥＹＬ）により「有機化学の方法（！、
Ｉｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　
Ｃｈｅｍｉｅ）　　Ｊという題名の本（ニー、ヴユンシ
ュ（Ｅ、１ｌｉｕｎｓｃｈ）編、第１５−■と■巻、テ
ィーメ（ＴＨＩＥ！、＋８）、シュツッツガルト１９７
４年）に記載されている。

この合成法は、連続したアミノアシルを必要なｊ項番で
２つずつ縮合すること、または、アミノアシルと以前に
形成されていて適当な順番でアミノアシル残基を既に多
数含んでいる分画とを縮合すること、あるいはまた、以
前に調製したこのような分画を縮合することからなる。

この合成方法を実施する場合、これらアミノアシルまた
は分画が有する反応性の基を一方のアミン基と他方のカ
ルボキシル基を除いて前もって保護す乞必要がある。

というのは、アミン基とカルボキシル基が、周知のペプ
チド合成法に従ってペプチド結合を形成する際に、特に
カルボキシル基の活性化の後に必要とされるからである
。変形例として、従来からあるカルボジイミドタイプの
カップリング試薬である例えば１−エチル−３−（３−
ジメチルアミンプロピル）−カルボジイミドを用いてカ
ップリング反応を行わせてもよい。使用するアミノアシ
ルが（例えばリシンの場合のように）補足アミノ基また
は（例えばグルタミン酸の場合のように）別の酸基を含
んでいるときには、例えば、アミン基はカルボベンゾキ
シ基またはｔ−ブチルオキシカルボニル基により、カル
ボキシル基はｔ−ブチルエステル基により保護されるこ
とになる。他の（子息の反応性の基も同様にして保護さ
れる。例えば、問題となっているアミノアシルがＳ基（
例えばシスティン）を含んでいる場合には、アセトアミ
ドメチルまたはバラメトキシベンジルを用いることがで
きる。

アミノ酸１つごとに順番に合成を行う場合には、Ｃ−末
端アミノ酸を、配列中で必要とされる次のアミノアシル
に対応するアミノ酸とまず最初に縮合させ、同様の操作
を次々に繰り返してＮ−末端アミノ酸に至るまで続ける
ことが好ましい。本発明の別の好ましい方法として、ア
ール、ディー。

メリフィールド（ＲｏＤ、　ＭεＲＲＩＦＩＩＥＬＤ）
の「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）　Ｊという題名の論
文（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、　　第８５巻、
２１４９〜２１５４ページ、（１９６３年）に記載され
ている方法を用いることができる。

メリフィールドの方法に従ってペプチド鎖を形成するに
は、極めて多孔度の大きなポリマー樹脂上にこのペプチ
ド鎖の第１のＣ−末端アミノ酸を付着させる。このアミ
ノ酸は自身に含まれているカルボキシル基を介して付着
し、アミノ基は例えばｔ−ブチルオキシカルボニル基に
より保護される。

第１のＣ−末端アミノ酸を一旦樹脂に付着させた後に、
樹脂を酸で洗浄することにより保護基をアミノ基から外
す。

アミノ基の保護基がｔ−ブチルオキシカルボニル基であ
る場合には、樹脂を三フッ化酢酸で処理することにより
この基を除去することができる。

次に、ペプチド鎖中で保護された第１のＣ−末端アミノ
酸の非保護アミノ基を介して第２番目のアミノ酸がＣ−
末端アミノアシル残基と結合する。

この第２番目のアミノ酸のカルボキシル基は例えばジシ
クロへキシルカルボジイミドにより活性化され、このア
ミノ酸のアミノ基は例えばｔ−ブチルオキシカルボニル
により保護されることが好ましい。

このようにして、２つのアミノ酸を含み、末端のアミノ
基が保護されている所望のペプチド鎖の第１の部分が得
られる。上記のように、ここでアミン基は非保護状態と
なり、第２番目のＣ−末端アミノ酸を付着させる場合と
同様の条件で第３番目のアミノアシルを付着させる操作
を開始することができる。

このようにして、ペプチド鎖を構成することになるアミ
ノ酸が１つずつ、既に形成されて樹脂上に固着されてい
るペプチド鎖の１回ごとに新たに非保護状態となるアミ
ノ基の位置に付着する。

一旦所望のペプチド鎖の全体が形成されると、ペプチド
鎖を構成する様々なアミノ酸を保護する基を除去し、例
えばフッ化水素酸を用いてペプチドを樹脂から剥離させ
る。

また、本発明のペプチドのＤＮＡコード配列ヲ別の方法
で合成または製造し、通常のプロモーターを用いてそれ
をバクテリア、イースト、細胞系などの形質発現ベクタ
ー内に導入することもできる。

本発明のさらに別の目的は、上記の目的で使用されるＤ
ＮＡコード配列と、この配列からなる、またはこの配列
を含む精製遺伝子を提供することである。

各ＤＮＡ配列は、通常の組換えにより本発明のペプチド
の酸配列から決定することができる。

最後に、ｇｐ５１糖タンパク質または分画■を選択的に
切断することにより、本発明のペプチドまたはポリペプ
チドを生成することが可能である。

本発明はさらに、上記のペプチドモノマーの水溶性オリ
ゴマーにも関する。オリゴマー化により、本発明のペプ
チドの免疫原性が向上する。オリゴマーは２〜１０モノ
マー繰返し単位を含んでいることが好ましい。しかし、
量に関して説明したからといって本発明がその量だけに
限定されるわけではない。

ペプチドの分野で現在実施されている任意の重合化技術
を用いてオリゴマー化を行わせることができる。この重
合化は、オリゴマーまたはポリマーが、所望の免疫原性
を獲得するのに必要とされる数の反応性モノマー繰返し
単位を含むようになるまで継続する。

オリゴマー化またはモノマー重合化の好ましい方法は、
モノマーをグルタルアルデヒド等の架橋試薬と反応させ
ることである。

オリゴマー化またはカップリングには別の方法を用いる
こともできる。例えば、ホモとへテロの二官能性カップ
リング試薬の存在下で、モノマー繰返し単位を、その中
に含まれているカルボキシル基と末端アミノ基、または
別の反応性の基、例工１ｆ−３Ｈを用いて連続的にカッ
プリングさせる方法である。

本発明はさらに、本発明のペプチドまたは上記のオリゴ
マーを担体分子とペプチド上に見出される反応性のある
補足基を用いて多孔性分子と二重結合させることにより
得られる抱合体にも関する。

多孔性分子としては、例えば天然タンパク質、ウィルス
のタンパク質そのもの、生理学的に受容可能であり非毒
性の合成担体がある。適当な基を以下に記載する。

本発明の抱合体の構成に含まれる担体分子または高分子
担体の例としては、天然タンパク質であるテタヌスアナ
トキシン、オボアルブミン、アルブミン血清、キーホー
ル・リンペット（Ｋｅｙｈｏｌｅいｍｐｅｔ）ヘモシア
ニン、チログロブリン等が挙げられる。　７ 合成高分子担体の例としては、例えば、ポリリシンまた
はポ！ｊ　　（Ｄ−Ｌ−アラニン）−ポリ　（Ｌ−リシ
ン）が挙げられる。

文献によると、他のタイプの高分子担体も使用すること
ができる。そのような高分子担体は一般に分子量が２０
．０００である。

本発明の抱合体を合成するためには公知の方法を用いる
ことができる。例えば、フランツ（ＦＲＡＮＴ２）とロ
バートソン（ＲＯＢＥＲＴＳＯＮ＞がＩｎｆｅｃｔ。

ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、第３３巻、１９３〜１９８
ページ、（１９８１年）に記載している方法、または、
ピー、イー。

カウフマン（Ｐ、巳、ＫＡ　Ｕ　Ｆ　Ｆ　？ＪＡ　Ｎ　
）がＡｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　ｆＥｎｖｉ−ｒｏｎｍｅ
ｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　１９８１年１
０月、第４２巻、第４号、６１１〜６１４ページに記載
している、ペプチドと適当な担体分子を用いた方法があ
る。

実際には、カップリング試薬としては、グルタル酸アル
デヒド、エチルクロロフォルミエート、水溶性カルボジ
イミドである〔Ｎ−エチル−Ｎ”（３−ジメチルアミノ
−プロピル）カルボジイミド、ＨＣ１〕、ジイソシアネ
ート、ビス−ジアゾベンジジン、ジクロロ−５−）リア
ジン、トリクロロ−５−）リアジン、臭化シアノゲン、
ベンザキノンの他、アヴラメアス（ＡＶＲＡＭＥＡＳ）
、ターニング（ＴＢＲＮＹＮＣＫ）、グドゥソン（ＧＵ
εＤＳＯＮ）が５ｃａｎｄ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　第８巻、７〜２３ページ、（１９
７８年）に記載したカップリング試薬を用いることが好
ましい。

もちろん、カップリング試薬がこれだけに限定されるこ
と”はない。

ペプチドの１つ以上の反応性の基と、担体分子の１つ以
上の反応性の基とが関与するカップリング方法を用いる
とよい。このような反応性の基としては、タンパク質の
合成に用いられるカップリング試薬である例えば１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジ
イミドやＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール等の存在下
でカップリング反応を起こすことのできるカルボキシル
基とアミノ基が好ましい。グルタルアルデヒドも、特に
ペプチドと担体分子上にそれぞれ見出されるアミノ基同
士を結合させるのに使用することができる。

さらに、２つ以上の本発明のペプチドを二重結合または
それ以外の結合により互いに、または任意の担体タンパ
ク質に結合させることも可能である。

上記の合成オリゴペプチドを動物に投与すると、この動
物の体内にウィルス内で合成成分に対応するアミノ酸配
列を認識することのできる抗体を誘起することができる
。

本発明のペプチドは化学的合成法以外の方法で製造する
ことももちろん可能である。例えば、上記のアミノ酸に
対応する核酸配列を有するベクターにより組換えられた
バクテリアを用いる。

本発明の範囲には、問題となっているペプチドの免疫特
性を太き（は変えることなく所定のアミノ酸配列を変え
たペプチドも含まれる。

さらに、分子量が約１５．０００のｇｐ５１糖タンパク
質の分画をもとにして、または、ｇｐ５１糖タンパク質
分画、特にペプチド７８〜９２に特徴的であり、中和抗
体の形成を誘起する少なくとも１つのエピトープを複製
する、担体と結合した、または結合していない合成ペプ
チドから得られるワクチンを製造することも本発明の目
的の１つである。

ペプチド分画または合成ペプチドと薬理学上の賦形剤お
よび／またはアジュバントとを組み合わせたワクチンは
、一般に注射液の形態である。単位投与量は少なく、生
体の体重１　ｋｇにつき１μｇを越えないことが好まし
い。

使用されるアジュバントは、抗体を混合して油性エマル
ジョンにしたもの、または水酸化アルミニウム等の吸収
剤タイプのものである。

本発明の他の特徴ならびに効果は、添付の図面を参照し
た以下の説明により明らかになろう。

実施例 モノクローナル抗体の製造方法 マウスの免疫孔 完全フロインドアジュバントの存在下でマウスにｇ　ｐ
５１を５０μｇ皮下注射または腹腔的注射した。

この注射を不完全フロインドアジュバントの存在下で２
週間後に繰り返し、アジュバントなしで４週間後に繰り
返した。２か列後にこれらマウスに対して最終回の皮下
注射または静脈注射を行った。

細胞融合 エル、ニー、ハーゼンベルク（Ｌ、Ａ、　ＨＥＲＺＢＮ
ＢＥ！ＲＧ）他が「免疫学実験ハンドブック（Ｈａｎｄ
ｂｏｏｋ　ｏｆ日Ｘ−ｐｅｒｉｍｅ’ｎｔａｌ　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ）　Ｊ　（ディー、ワイア（Ｄ。

ＷＩＥＩＲ）編）、第２５巻、１〜２５ページ（ブラッ
クウェル（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）社、ロンドン）に記載
した方法に従って、マウスの骨髄細胞を免疫化したマウ
スから採取した膵臓細胞と融合させることによりハイブ
リドーマを生成させた。

得られたハイブリドーマを９６ウエルのプレートに分配
し、マウスのマクロファージと胸腺細胞との存在下でＨ
ＡＴ媒地を用いて選択した。ヨウ素１２５によって標識
された抗−ｇ　ｐ５１抗体を用いた液相中のラジオイム
ノアッセイにより、または、マイクロプレートのウェル
に吸収されたＢＬＶを用いた固相中のラジオイムノアッ
セイにより、抗−ｇｐ５１抗体を生成させるハイブリド
ーマを検出した。後者の場合、ウィルスに吸収された特
定の抗体が、ヨウ素１２５により標識されたマウスの抗
−免疫グロブリンを用いて検出された。洗浄後、特定の
複合体に吸収された放射能がオートラジオグラフ法によ
り明らかにされた。

選択した生成力のあるクローンを２４ウエルのプレート
に移し、半固体のアガロース培地中でサブクローン化し
た。

得られたハイブリドーマ細胞を、ブリスタン塩で前もっ
て処理しであるマウスの腹腔に注射した。

１０〜１５日後、所望のモノクローナル抗体を大量に含
む腹髄細胞を回収した。

プルツク（ＢＲｌｌＣに）他がＪ、Ｉｍｍｕｎｏｊｏｇ
ｉｃａｌ　Ｍｅｔｈ−ｏｄ第５３巻、３１３〜３１９ペ
ージ、（１９８２年）に記載した方法に従ってＤＥＡＥ
−アフィゲル・ブルー上でイオン交換クロマトグラフィ
ーを行うことによりこれらモノクローナル抗体を精製し
た。

これらモノクローナル抗体は、エフ、シー、グリーンウ
ッド（Ｆ、　Ｃ０ＧＲＥＥＮＷＯＯＤ）他がＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ　、第８９巻、１１４〜１
２３ページ、（１９６３年）に記載したクロルアミンＴ
法を用いてヨウ素１２５で標識した。

得られた様々なモノクローナル抗体の所定のエピトープ
に対する特徴は、マイクロ滴定用プレートのウェルに吸
収されたｇｐｓｔ抗原に対する抗体相互の間での競合を
検定することにより決定した。

この目的で、１μｇの放射性同位元素で標識されていな
い精製済モノクローナル抗体を、吸収されたｇ　ｐ５１
　（５０ｎ　ｇ）を含むマイクロ滴定用プラスチック製
プレートのウェル内の５０μｌの体積中で一昼夜４℃に
保温した。

次に、ヨウ素１２５により標識された抗体（１０ｎ　ｇ
　、　１００．０００ｃｐｍ）を添加し、培養を４℃に
てさらに６時間続けた。

ここでマイクロプレートを強く洗浄し、プラスチック製
プレートの各ウェルに付着した放射能をカウンタで測定
した。

２つの抗原部位が極めて接近しているかまたは同じ位置
にある場合、（標識されていない）第１の抗体を対応す
るエピトープに結合させる゛と（標識された）第２の抗
体を対応するエピトープに結合させにくくなるか、また
は結合させることが不可能になることを考慮して結果を
解釈した。

精製したモノクローナル抗体の間での競合検定を行うこ
とにより、ｇｐ５１分子上の８つの独立な抗原部位が得
られた。これら部位は、それぞれＡｌＢ、Ｃ，ＤＳＥＳ
ＦＳＧＳＨという記号で表される。

ＢＬＶの変異体を検出するためのＥＬＩＳＡ法この方法
を以下の条件で適用した。

−所定の抗原部位を指向する精製モノクローナル抗体３
００ｎｇをマイクロ滴定用プレートのウェルの壁面に固
定した。

−洗浄し、不活性なタンパク質であるウシのアルブミン
を用いて飽和させた後、（この不活性なタンパク質と洗
浄剤トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０の存在下で）様々な
遊離ＢＬＶから得られたウィルスのタンパク質の希釈液
を導入してプレートを１６時間４℃に保温した。

−洗浄後、抗原部位を指向するモノクローナル抗体をｇ
　ｐ５１抗原に付着させ、ペルオキシダーゼ酵素とカッ
プリングさせ、４時間４℃に保温した。

−洗浄後、Ｈ，Ｏ□基質に０−フェニレンジアミンを加
えたものを用いて複合体の酵素活性を明らかにした。

一１５分後、６ＮＩ１７）ＨＣＩにより反応を停止させ
、マイクロ滴定用プレートスペクトロメータを用いて光
学密度を測定した。

第１図は、様々な出来のＢＬＶ粒子に対して行ったＥＬ
ＩＳＡテストの結果を示すグラフである。

ＦＬＫ／ＢＬＶ：ヒツジの胎児の腎臓細胞で培養したウ
シ白血病ウィルス（ＢＬＶ）。

ＢＬ／ＢＬＶ：コラモリの肺臓細胞で培養したＢＬＶ０ ＶｄＭ７２９０とＶｄＭ７２６８：アメリカ合衆国アイ
オワ用、アメス（Ａｍｅｓ）のマーチン　ヴアンデア　
マーテン（Ｍａｒｔｉｎ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　！、４ａａ
ｔｅｎ）博士から提供された２つの遊離ＢＬＶ０ ＭＭＷ：ベルギー国のマルタ　マメリックス（Ｍａｒｃ
　Ｍａｍｍｅｒｉｃｋｘ）博士から提供されたＢＬＶ０
縦軸は４６０　ｎｍでの光学密度（０，Ｄ、）を表して
おり、各縦線はエピトープＡ−Ｈを指向するモノクロー
ナル抗体の反応性を示す。エピトープＡ１ＢＳＥを指向
するモノクローナル抗体の反応性は大きく、エピトープ
Ｆ、ＧＳＨを指向するモノクローナル抗体の反応性は小
さい。遊離ＶｄＭ７２６８からのエピトープＦと、遊離
ＭＭ群からのエピトープＧは、突然変異が起こった結果
としてほとんど存在していない。

抗体固定テスト このテストは以下の条件で実行した。

−抗体の濃度の異なる様々な希釈液を用いて各モノクロ
ーナル抗体に所定量のｇｐ５１抗原を固定させた。ここ
では最大放射能の５０％を結合させることのできる希釈
液を選択した。この固定操作はマイクロ滴定用プレート
のウェル内で実行した。

−ウシに由来する血清を次々に３倍に希釈したテスト用
希釈液を一連のウェルに導入して（初期濃度はウェル内
の５０μｌの体積中に１μｌの血清が含まれる濃度）、
マイクロプレートを５時間室温に保温した。

−次に、ヨウ素１２５で標識されたモノクローナル抗体
Ｌｏｎｇを含む５０μｌの溶液を導入して、プレートを
一昼夜４℃に保温した。

−ここでこのプレートを洗浄し、２％ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）溶液を用いて固定された放射能を剥離
させた。

−ガンマ線カウンタを用いて固定された放射能を測定し
、非競合の正常なウシ血清の存在下で吸収された放射能
に対する割合を％で表示した。

第２図は、ｇｐ５１の８つのエピトープを指向する標識
されたモノクローナル抗体を、量を徐々に減らしたウシ
血清（第１５番腫瘍の場合）と競合させた場合の付着（
固着）テストにより得られた結果を示している。横軸は
血清の濃度（μＡ　／１ｆｆ）であり、縦軸は固定され
た標識モノクローナル抗体の量（％）を示す。

雪印（＊）で表した曲線はエピトープＨに特有なモノク
ローナル抗体について得られた曲線である。

星印（☆）で表した曲線はエピトープＦに特有なモノク
ローナル抗体について得られた曲線である。

点圧方形で表した曲線はエピトープＧに特有なモノクロ
ーナル抗体について得られた曲線である。

曲線２−２．５−５．６−６．８−８．９−９．１０−
１０．１５−１５は、それぞれｇｐ５１のエピトープＢ
ＳＤＳＥＳＣＳＡＳＢ’　、Ｄ’を指向するモノクロー
ナル抗体について得られた曲線である。

この図かられかるように、エピトープＦＳＧ。

Ｈを指向するモノクローナル抗体のみがウシ抗血清によ
り変位する。

ウェスターン・プロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ）
法この方法を以下の条件で適用した。

−限外濾過と超遠心分離によりＢＬＶの分散液を得る。

−ＳＯ３と還元剤であるメルカプトエタノールとの存在
下で１００℃にて５分間加熱することによりウィルスを
完全に変性させる。

−ＳＤＳの存在下で１５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行うことによりウィルスのタンパク質を分離する
。

−このようにして分離したタンパク質を電気的にニトロ
セルロース膜上に移動させる（ＳＤＳなしの電気泳動緩
衝溶液を使用して電流０．５Ａで４℃にて２時間）。

−不活性タンパク質で膜を飽和させ、この膜をストリッ
プに切断する。

−ｇｐ５１の抗原部位と、対照として用いるｐ２４タン
パク質とを指向するテスト用モノクローナル抗体を有す
る各ストリップを培養する（２０℃にて１６時間）。

−洗浄後、マウス抗免疫グロブリンウサギ血清でストリ
ップを培養する（２０℃にて２時間）。

−洗浄後、ヨウ素１２５で標識されたプロティンへの調
製物でストリップを培養する（２０℃にて１時間）。

−洗浄し乾燥させた後、ストリップのオートラジオグラ
フィーを行う。

−写真を現像して求めるウィルスのタンパク質に対応す
る印を観察する。

第３図は、ＢＬＶ粒子のウェスターン解析を行った結果
を示す図である。この図の左側の部分にウィルスのタン
パク質が示されている。滴定量により決まるチャネルか
ら、エピトープＡ、Ａ′、ＢＸＢ”、Ｄ、Ｄ’　、ＥＳ
ＦＳＧ、Ｈに特有なモノクローナル抗体に対するｇｐ５
１糖タンパク質の反応性がわかる。チャネルＣＳＦ、Ｇ
ＳＨに色の付いた印がないことから、対応するエピトー
プがサンプルの初期処理によって変性したことがわかる
。数字で表示されたチャネルは、ＢＬＶの主要な内部タ
ンパク質であるｐ２４タンパク質を指向する様々なモノ
クローナル抗体に対する結果を示している。

第５図には、ＢＬＶ粒子全体と精製ｇｐ５１糖タンパク
質に対する様々なモノクローナル抗体の反応性が示され
ている。この反応の条件は以下の通りであった。

−ウェルごとに精製ウィルス分散液４００　ｎ　ｇ　。

または精製ｇｐ５１抗原５０ｎｇを用いてマイクロ滴定
用プレートの各ウェルの壁面に抗原を固定させる。

−洗浄し、不活性タンパク質（ウシ血清アルブミン）を
用いて飽和させた後、ウェル内にテストするモノクロー
ナル抗体の一連の希釈液を２００μ！導入しく希釈度１
：２０．１：６０．１：１８０．１：５４０．１：１６
２０．１：４８６０．１：１４５８０．１：４３’７４
０）　、１６時間４℃に保温して反応を起こさせる。

−洗浄後、ウェルごとにベルオキシターゼ酵素と結合し
た１０ｎｇのマウス抗免疫グロブリンヤギ免疫グロブリ
ンＦａｂ分画を添加し、２時間４℃に保温する。

−洗浄後、８２０２基質にＯ−フェニレンジアミン添加
したものを用いて壁面の酵素活性を明らかにする。

一１５分後、６ＮのＨＣＩを用いて反応を停止させ、マ
イクロ滴定用プレートスペクトロスコピーにより光学密
度を測定した。

各抗体に対して、問題となっているテストで光学密度が
最大になるモノクローナル抗体が、希釈度１／２０と１
／６０のときの平均光学密度に対してどれだけの割合で
あるかで結果を表す。

様々なモノクローナル抗体により認識される抗原部位が
横軸に示されている。

ＢＬＶ粒子に対するモノクローナル抗体の反応性は極め
て大きいことがわかる。おそらくエピトープＦ、Ｇ、Ｈ
のみが非変質ウィルス粒子により認識される。一方、こ
れらモノクローナル抗体は、特に部位Ｇで精製ｇｐ５１
に対する反応性が弱い。

分子量が約１５．０００のｇｐ５１分画の調製放射性元
素で標識したｇｐ５１を、プロテアーゼウロキナーゼを
用いて条件を制御しながら酵素消化させた。

凍結乾燥させた酵素は、フランス国イヴリーーシュール
ーセーヌのアボット・ラボラトリーズ（ＡＢＢＯＴＴ　
ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）から提供された。この酵素
は再度分散させて最終濃度を２ｍｇ／ｍｉ２にする。

精製したｇｐ５１抗原を放射性同位体元素で標識する。

このためには、エフ、シー、グリーンウッド（Ｆ、Ｃ３
ＧＲＩＥＥＮＷＯＯＤ）他のクロルアミンＴ法（Ｂｉｏ
−ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　（１９６３年）
、第８９巻、１１４〜１２３ページ）に従ってヨウ素１
２５で標識するか、または、ビー、エフ、タック（Ｂ、
　Ｆ、　ＴＡＣＫ）とアール、エル、ウィルダ−（Ｒ，
Ｌ、　１ｌｌｌＬＤＥＲ）が、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙ−ｍｏｌｏｇｙ、第７８巻、１３８〜１４７ペー
ジ、（１９８１年）に記載した方法をシー、プルツク（
Ｃ８ＢＲ［ＩＣＫ）他が、Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ第１２２巻
、３５３〜３６２ページ、（１９８２年）の方法でわず
かに変更したメチル化とホウ化ナトリウム還元を行う方
法に従って分子のりシン残基をトリチウムで標識する。

”５ｒ　−ｇ　Ｉ）５１を１０ｎｇまたは３Ｈ’　　ｇ
ｐ５１を１１μｇ含む溶液１ｍ１ｌ’に、ウロキナーゼ
調製液を５０μβ添加する。４５分間３７℃に保温した
後、再び同じウロキナーゼ調製液を５０μｌ添加し、９
０分間保温した後にもさらに添加する。

合計で１３５分培養した後、プロテアーゼの抑制剤であ
るフェニルメチルスルフォニルフルオライ）’　（ＰＭ
ＳＦ）を１Ｏ−４モルの濃度で用いてウロキナーゼの活
性を失わせる。

得られたペプチド分画を、モノクローナル抗体を用いて
以下のように免疫沈降させる。

ｐＨが７．２で０．２％のウシ血清アルブミンと０．２
％のトウィーン８０とを含む最終容量が２００μｌの等
張リン酸緩衝溶液に、テストするモノクローナル抗体と
ウロキナーゼで消化させたｇｐ５１のサンプル２５μｌ
を含む腹水５μβを混合する。

２０時間４℃に保温した後、マウス免疫グロブリンを指
向するウサギ血清１μｌを含む緩衝溶液１００μｌを添
加し、再び２０時間４℃に保温する。

抗原−抗体の複合体をスタフィロクス・アウレウス（Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　−プロ
ティンＡの１０％調製液５０μβを用いて４℃で３０分
間免疫沈降させる。

スタフィロクス・アウレウス−プロティンＡを遠心分離
で回収し、ｐＨが４で（１６５％のトリトン（Ｔｏｒｉ
ｔｏｎ）　　Ｘ−１００と０．５％のデオキシクロレー
トとを含むリン酸緩衝溶液で数回洗浄する。

次に、電気泳動用緩衝溶液１００μβ中にスタフィロク
ス・アウレウス−プロティン八を分散させた分散液を３
分間１００℃に加熱した後に遠心分離してバクテリアを
除去する。

解離した抗原−抗体の複合体を含む上澄み液を回収し、
２％のポリアクリルアミド−３ＤＳゲル電気泳動を行い
タンパク質を分離する。

電気泳動の後、ゲルを固定し、乾燥させ、オートラジオ
グラフィーを行う。

オートラジオグラフィーの結果から、抗原部位ＡＳＢ、
Ｃ，Ｄを指向するモノクローナル抗体が約３５．０００
ダルトンの分画（分画Ｉ）を認識していることがわかる
。

一方、抗原部位（Ｅ）　、Ｆ、Ｇ、Ｈを指向するモノク
ローナル抗体は約１５．０００グルトンの分画（分画■
）を認識している。

ｇｐ５１抗原の完全な配列は、この糖タンパク質を暗号
化する遺伝子エンベロープの核酸の配列から導出するこ
とができる（第６図）。

第４図には、ｇ＋）５１分子が、可能なグリコシル化位
置とこの分子の切断が起こる点く矢印で示されている）
とともに簡単に示されている。

用いられている記号は以下の意味をもつ。

＋はチロシンを表す。′ ：はシスティンを表す。

×は可能なグリコシル化位置を表す。

システィンは重要な役割を演じている。というのは、チ
オール基がペプチドを環化させ、エピトープＦＳＧＳＨ
を三次元構造にするためである。

チロシンの水酸基により、ペプチドを放射性同位体元素
であるヨウ素１２５で標識することができる。

実験結果から以下のことがわかる。

ａ）モノクローナル抗体により決まる部位Ｅ、Ｆ、Ｇ、
Ｈが分画■に発生する。この分画■はほとんどグリコシ
ル化していない。さらに、ｇ　ｐ５１のアミノ酸配列の
解析から、ＮＨ，部位にはほとんどグリコシル化位置が
ないことがわかる（末端Ｃ０ＯＨ部分の６に対して２だ
けである〉。

ｂ）チロシン部分をヨウ素１２５で標識したｇｐ５１抗
原を極めてうずく希釈したプロテイナーゼに調製液を用
いて（クロルアミンＴ法により）制御下で消化させると
、部位ＥＳＦＳＧ、Ｈを指向するモノクローナル抗体は
使用した放射能の９０％を越える割合を沈降させる。こ
れに対して同じ条件で部位Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄを指向するモ
ノクローナル抗体は使用した放射能の１１％さえも沈降
させない。

この結果から、エピトープＥＳＦＳＧＳＨはヨウ素１２
５を固定するチロシンが豊富な領域に見出されることが
わかる。これは、ｇｐ５１の末端ＮＨ２の場合である（
ｇ　ｐ５１は８つのチロシンを有するのに対し、末端Ｃ
０ＯＨはチロシンが１つだけである）。

ｃ）ＳＤＳ　（硫酸ドデンル）洗浄剤と還元剤（メルカ
プトエタノール）の存在下で実施したウェスターン・プ
ロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ）の実験（第３図〉
から、モノクローナル抗体との反応性がない抗原部位　
（Ｃ）　、ＦＳＧが変性していることがわかる。さらに
、ヨウ素１２５で標識されたｇｐ５１抗原の放射線免疫
測定により、抗原を最初にメルカプトエタノール還元剤
１０ミリモルで１５分間処理する場合には、位置（Ｃ）
　、Ｆ、ＧＳＨを指向するモノクローナル抗体に対する
反応性がないことがわかる。

この結果から、位置Ｃ５ＦＳＧ、Ｈの変性は、特に還元
剤が存在していることに起因することがわかる。従って
、これら抗原部位は二硫化結合に依存する抗原構造を有
することが導かれる。末端ＮＨ２にはシスティンが極め
て豊富であることに注意されたいく末端ＮＨ，は６つの
残基を有するのに対し、末端Ｃ０ＯＨは２つの残基しか
もたない）。

ａ）、ｂ）、Ｃ）の結果から、エピトープＥ１Ｆ、Ｇ、
Ｈを有する分画■はｇｐ５１抗原の末端ＮＨ，であるこ
とがわかる。

抗ペプチドに関係する生物学的活性によりこの結果が確
認される。

オリゴペプチドの調製 第１表のペプチドの合成は、メリフィールドがＪ、八ｍ
、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、　　（１９６３年）、第
４５巻、２１４９〜２１５４ページに記載した面相法を
用いて行うことができる。

この表では、ＬとＢでペプチドの由来が異なることを示
している。アミノ酸配列を示す列では、（ペプチドＬ３
９−４８の場合のように）同じペプチドの配列内で起こ
る可能性のあるわずかな変異は下線で表示しである。こ
の同じ表にはペプチドし７８−９２の環化変異体も示さ
れている。ｇｐ５１糖タンパク質のアミノ酸配列は第６
図に示されている。

この配列は、ＢＬＶの４つの変異体のＤＮＡ配列から決
定された（Ｔ１５−２　：腫瘍番号１５、ＬＢ２８５と
ＶｄＭ：２つの分離したウィルス、ＦＬＫ：ヒツジの胎
児の腎臓細胞上で培養したＢＬＶ）。

アミノ酸を表す文字は以下の意味をもつ。Ａ−ＡｌａＳ
ＣＣｙｓＳＤ　　ＡｓｐＳＥ　　ＧｌｕＳＦ　　Ｐｈｅ
、　Ｇ−ＧｌｙＳＨ−ＨｉｓＳＩ　−１１ｅ、　Ｋ　−
Ｌｙｓ、　Ｌ−Ｌｅｕ、Ｍ−ＭｅｔＳＮ　−Ａｓｎ、　
Ｐ　−Ｐｒｏ、　Ｑ−ＧｌｎＳＲ−ＡｒｇＳＳ　−５ｅ
ｒ、　Ｔ−Ｔｈｒ、　Ｖ−Ｖａｔ、　Ｗ−Ｔｒｐ、　Ｙ
　−Ｔｙｒ０第６図の枠で囲まれた部分のアミノ酸配列
と下線を引いたアミノ酸配列は、化学的に合成されたペ
プチドである。

オリゴペプチドの合成 メリフィールドの面相法を用いて合成を行った。

ペプチド鎖は、ベンジルエステルタイプ（クロロメチル
化タイプ）またはアミドタイプ（ベンズヒドリルアミン
樹脂）の結合によりスチレンとジビニルベンゼンのポリ
マー（ポリアミドタイプでもよい）に二重結合した第１
のＣ−末端アミノ酸を出発材料として形成する。以下に
示すＮ−末端を指向するアミノ酸が、以下の操作を主と
するサイクルの操作を繰り返すことにより連続的に添加
される。

１）ＣＨ２Ｃ１２溶液中で三フッ化酢酸（ＴＦＡ）を用
いてＢＯＣ基（アミノ基を保護するにに使われる第三ブ
チルオキシカルボニル）の保護を解除する。

２）ＣＨ，ＣＩ□中に溶解させたジイソプロピルアミン
（ＤＩＥＡ）を用いて、アミノ化された基を中和する。

３）ジシクロへキシル−カルボジイミドまたは（例えば
オルトニトロフェノールの）活性化されたエステルの調
製液を用いて導入することになるアミノ酸のカルボキシ
ル基を活性化させることによりカップリングさせる。別
のカップリング試薬を樹脂に対して（３〜６倍）過剰に
添加する。

カップリング操作の後、樹脂上に自由アミ７基がないこ
とをニンヒドリンテスト１ごより確言忍する。

陽性反応の場合には、カップリング操作を繰り返す。

合成の間、アミノ酸の側鎖の反応性の基は以下の第２表
に記載した基を使用することにより保護される。

第２表 合成が終わると、１０％ｐ−クレゾール（Ｖ／Ｖ）と５
％硫酸ジメチル（Ｖ／Ｖ）を含む無水フッ化水素酸で１
時間処理することによりペプチドを樹脂と保護基から解
放する。

この処理後にはシスティンを保護するアセトアミドメチ
ル（ａｃｍ）基のみが変化せずに残る。

ここでゲルでの濾過と逆相分配クロマトグラフィーによ
りペプチドを精製する。

酸加水分解を行った後にアミノ酸を分析してペプチドの
同定を行う。このペプチドの均一性は、３つの異なった
溶媒系内のシリカ層上でのクロマトグラフィーと逆相高
圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を行うこ
とにより確認する。

保護解除とペプチド７８−９２の環化 台まれている２つのシスティン残基がＳ−アセトアミド
メチル基により保護されたペプチド７８〜９２の２０ｍ
ｇ　（１１，６フイクロモル）をｐＨ４の脱ガス酢酸水
溶液１ｒｎｌ中に溶解させる。

これに、８ｍｇ（２５マイクロモル）の酢酸水銀を添加
する。撹拌しながら窒素雰囲気中で反応を室温にて３時
間行わせる。反応媒体を１５ｒｎｌの脱ガス水で希釈し
、撹拌しなからＨ，Ｓを１０分間通気する。この溶液を
第４フリツトガラスで濾過し、窒素を２時間通気して脱
ガスする。２００ｍ１の脱ガス水で再び希釈し、希釈し
たアンモニアを用いてｐＨを７．５に調整する。空気を
２００時間通気ることによって再び酸化させる。次に、
反応媒体を凍結乾燥させる。得られる環式ペプチドを超
微細バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）　Ｐ　２で濾過するこ
とによって精製す・る。異なる溶媒系内のＴＬＣとＲＰ
−ＨＰＬＣとにより保護解除されていない対照に対する
この環式ペプチドの均一性を調べる。

完全に酸加水分解させた後にアミノ酸を分析し、Ｆ、Ａ
、Ｂ、Ｓ、（Ｆａｓｔ　Ａｔｏｍ　Ｂｏｍｂａｒｄｍｅ
ｎｔ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：高速原子照射スペク
トロスコピー〉により分子量を測定することによってペ
プチドの同定を行う。

このようにして得られたペプチドを出発物質として、免
疫特性が強化されたオリゴマーが以下の操作により得ら
れる。

炭酸水素ナトリウム０．１モル溶液に溶解させた上記の
ペプチド５ｍｇを２５ｇ／βのグルタルアルデヒド水溶
液と混合してペプチドの最終濃度を０．１％にする。反
応は、暗くして撹拌した状態で室温にて５日間行わせる
。生成したオリゴマーは、ＰＢＳ等の適当な緩衝溶液を
用いて透析するとよい。

オリゴペプチドを担体とカップリングさせる免疫特性を
向上させる目的で本発明のペプチドを適当な担体分子、
例えばキーホール・リンベット・ヘモシアニンまたはチ
ログロブリンと結合させるためには、ホモ三官能性試薬
またはへテロ二官能性試薬の存在下で以下に記載する方
法のうちのいずれかを用いる。ホモニ官能性またはへテ
ロ二官能性試薬に関してもやはり以下に示す。

■　−グルタルアルデヒド等のホモ三官能性試薬。

実験条件は以下のようにまとめられる。

炭酸水素ナトリウム０゜１モル溶液の２．５艷に溶解さ
せた高分子（タンパク質または合成高分子）２．５ｍｇ
をペプチド２１ｍｇと混合する。撹拌しながら室温にて
１時間接触させた後、グルタルアルデヒドを２段階で添
加し、カップリング試薬の最終濃度を０．１％にする。

室温で暗い状態にして５日間接触状態を保つ。溶液をＰ
ＢＳで透析した後、形成された抱合体を回収する。

■　−以下の官能基を結合させるヘテロ二官能性試薬 １、アミンとカルボキシル −無水物を混合する方法 実験方法は、エム、エル、ティラフ個。

Ｌ、ＴＩＬＡＫ）が、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ第１１巻、８４９〜８５４ページ、（１９７９
年）に記載した一般的な方法に対応する方法である。

２、カルボキシルとアミンまたはアルコール−水溶性カ
ルボジイミドを用いる方法 実験方法は、ティー、エル、グツドフ レンド（Ｔ、　Ｌ、　ＧＯＯＤＦＲＩＢＮＯ）他が、５
ｃｉｅｎｃｅ第１４４巻、１３４４ページ、（１９６４
年）に記載している方法である。

３．７ミノとメルカプト −様々な試薬が利用されるが、その中でも最も一般的な
ものとして以下の試薬がある。

ａ）６−マレイミトーカブロイツクーアシルーＮ−ヒド
ロキシ−スクシンイミド−エステル（ＭＣ３）。この試
薬を用いたカップリング方法は、リ−（ＬＥＥり他が、
Ｍｏ１ｅｃ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１７巻、７４９〜７５
６、（１９８０年）に記載されている。

ｂ）Ｎ−スクシンイミジル−３（Ｓ−ピリジル−ジチオ
）プロピオネート　（ＳＰＤＰ）。使用方法は、カール
ソン（ＣＡＲＬＳＯＮ）他がＢｉｏｃｈｅｍＪ、第１７
８巻、７２３〜７２７ページ、（１９７８年）に記載し
た方法である。

動物の免疫化 年令約３か月のウサギに、担体分子であるキーホール・
リンペット・ヘモシアニンヲ５００μｇ含む等張リン酸
緩衝溶液１−を同量の完全フロインドアジュバントでエ
マルジョン化させた抱合体調製物を１５日間隔で３回皮
内注射した。第３回目の注射の８日後に血液を採取し、
回収した血清に対して様々な測定を行った。

抗体の検出 以下の条件でＥＬＩＳＡ法を実施することにより抗体を
検出した。

−抗原をマイクロ滴定用プレートの各ウェルの壁面に固
定させる。このとき、精製したウィルスの分散液４００
　ｎ　ｇ、または、精製したｇｐ５１抗原５０ｎｇ、ま
たは、合成ペプチド５０ｎｇをウェルごとに用いる。

−保温し、洗浄し、不活性タンパク質（ウシ血清アルブ
ミン）で飽和させた後、テストする抗血清の様々な希釈
液をウェル内に２００μ！導入する（希釈度は、２０．
６０．１８０．５４０．１６２０．４８６０．１４５８
０．４３７４０である）。次に、１６時間４℃に保温す
る。

−洗浄後、抗血清がウサギからのものである場合にはペ
ルオキシダーゼ酵素とカップリングしたプロティンＡを
１０ｎｇ含む緩衝溶液をウェルごとに１００μｌ添加す
る。あるいは、アフィニティークロマトグラフィーによ
り精製され、希釈の際に用いられる抗血清の免疫グロブ
リンを特に指向し、ペルオキシダーゼ酵素とカップリン
グした抗体を１１００ｎ含む緩衝溶液をウェルごとに１
００μｌ添加する。次に、２時間４℃に保温する。

−洗浄Ｌ　Ｈ２Ｏ。基質にＯ−フェニレンジアミンを加
えたものを用いて壁面の酵素活性を明らかにする。

一１５分後、６ＮのＭＣＩを用いて反応を停止させ、マ
イクロ滴定用プレートスペクトロメータを用いて光学密
度を測定した。

合成ペプチドおよび天然ペプチドに対する抗ペプチド血
清の反応性を調べるのにＥＬＩＳＡテストを利用した。

得られた結果は第３表にまとめられている。

対照として、精製したｇｐ５１抗原に対するウサギの抗
血清をテストした。

第７図は、先に説明した条件でＥＬＩＳＡ法を適用する
ことにより、精製したｇ　ｐ５１抗原に対するウサギの
抗ペプチド抗血清を滴定した結果として得られた曲線を
示すグラフである。第８図は、精製したＢ　Ｌ　Ｖ　Ｉ
ｎ子に対する抗ペプチド抗血清の滴定曲線を示す同様の
グラフである。横軸は希釈度の逆数の対数であり、縦軸
は４６０ｎｍで測定された光学密度（０，Ｄ、　）を表
す。

曲線ａは、抗−ｇｐ５１に対して得られた参照用曲線で
ある。

曲線すは、抗−Ｌ２５５〜２６８に対して得られた曲線
である。

曲線Ｃは、抗−８５９〜６９に対して得られた曲線であ
る。

曲線ｄ　＋、ま、抗−８２６０〜２６８と抗−３１４４
〜１５５に対して得られた曲線である。

曲線ｅは、抗−Ｌ７８〜９２と環式抗−Ｌ７８〜９２に
対して得られた曲線である。

曲線ｆは、抗−Ｌ１４４〜１５７に対して得られた曲線
である。

曲線ｇとｈは、他のペプチドに対して得られた曲線であ
る。

この結果から、精製したｇｐｓ１ａタンパク質が抗原と
して使用されるときには、反応性は以下の順番で低下す
る。

抗−ｇｐ５１＞抗−２５５〜２６８〉抗−５９〜６９他
の抗−ペプチドの活性はさらに小さい。

抗原としてＢＬＶ全体を使用する場合には、反応性の間
の順序は以下のようになる。

抗−ｇｐ５１＞抗−２５５〜２６８＞（直線状または環
式の）抗−７８〜９２ 抱合体で既に免疫化しであるウサギ血清をテストしてＢ
ＬＶの生物学的活性を決定した。これは、ＶＳＶ　（Ｂ
ＬＶ）プソイドタイプの抑制テストを用いて評価する。

このテストについては、ジェイ。

ザラアダ（Ｊ、　ＺＡＶＡＤＡ）、エル、セルニー（Ｌ
、ＣＥＲＮＹ）、（ｉ’　ッ）’、　　ｆ　ウｙ　）’
　５　（Ｚ、ＺＡＶＡＤＯＲＡ）、ジェイ、ボゾノヴｙ
　（Ｊ、　ＢＯＺＯＮＯＶＡ）、ニー、　　ディー、フ
ルシｓタイン（Ａ、　Ｄ、　ＡＬＳＴＢＩＮ）がＪ、Ｎ
ａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、第６２巻、９５〜１
０１ページ、（１９７９年）に記載している。

プソイドタイプの抑制テストは、慢性的にＢＬＶに感染
した細胞内の水痘性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）による感
染によって遺伝子がＶＳＶの遺伝子であり、カつ、エン
ベロープがＢＬＶのエンベロープである（プソイドタイ
プ）ウィルス粒子が生成するというジエイ、ザヴアダ他
の観察に基づいている。

これらＶ　Ｓ　Ｖ／Ｂ　Ｌ　Ｖプソイドタイプは、中和
や宿主特異性に関してＢＬＶのｇｐ５１の糖タンパク質
のエンベロープと関係した特性を有する。これらプソイ
ドタイプ内のＶＳＶ遺伝子により、これらプソイドタイ
プに感染したサルの細胞上に溶菌領域が急速に（２４〜
３６時間で）形成される。

簡単に説明すると、テストする血清を有するプソイドタ
イプを中和するためには、テストする細胞上に２００の
溶菌領域を形成することのできるプソイドタイプの調製
物（１０−’、　ｉｏ−”、１０−３．１０−４とこれ
以外の中間の希釈度）を１ｍｌ混合する。これら血清は
３０分間５６℃で加熱することによって前もって不活性
にしておく。

２０℃で１時間培養した後、各混合物の０．５−をベト
リ皿内のサルの細胞層に接種する。９０分間保温した後
、無菌等張緩衝溶液を用いて洗浄することによりこの接
種を除去し、細胞を寒天層で覆う。

２４〜３６時間３７℃に保温した後、細胞を中性レッド
で染色し、残った溶菌領域を数える。

ＢＬＶに対する抗体を中和するための滴定量は、テスト
する血清がないときに発生する溶菌領域に対して５０％
の溶菌領域が得られる血清希釈度を決定することにより
得られる。結果が第４表にまとめられている。

第　　４　　表 この結果から、ペプチド７８〜９２を指向する抗体には
プソイドタイプを抑制する顕著な効果があることがわか
る。同様に、ペプチド３９〜４８と１４４〜１５７を指
向する抗体にはプソイドタイプを抑制する優れた効果が
あることがわかる。

ｇｐ５１抗原を指向するウサギ血清とＢＬＶに感染した
動物の血清の多数のサンプルの、プラスチック製ウェル
の壁面に固定させた化学的に合成したオリゴマーに対す
る反応性を研究した。結果が第５表にまとめられている
。この表には、応答したヒツジまたはウシの血清に関す
る結果のみが示されている（この表に記載がない血清か
らは応答がなかった）。

この結果から、テストした血清の中で限られた数の血清
のみがオリゴペプチド（ウシ血清の番号１５と２８５な
らびにヒツジ血清の番号３５．３８．６５．６７．６８
．９８）を言忍識する。オリゴペプチド７８〜９２は、
ウシ血清（１５番）とヒツジ血清（６５番）の両方によ
り認識される。

さらに、この結果から以下の知見が得られる。

−ウサギ血清（血清の番号１６７と２６７０　）の反応
性にはわずかな差が認められた。これは、投与されたｇ
　Ｉ）５１ｍ製物炉間じではなく、しかも投与を受けた
動物が異なっていたという事実により説明できるであろ
う。

−ＢＬＶ粒子を接種することにより得られたウサギ血清
の反応性は、ｇｐ５１を投与されていたウサギからの血
清の反応性とほぼ同じである。

−モノクローナル抗体は、担体とカップリングしたオリ
ゴペプチドとは反応しない。

オリゴペプチド７８〜９２は、担体タンパク質と結合す
ると中和抗体を誘起する優れた特性を示す。

従って、このオリゴペプチドはワクチンの開発に特に好
ましい。

オリゴペプチド７８〜９２のもつ免疫特性により、動物
の血液サンプル中にＢＬＶが存在しているかどうかの診
断を行うことができる。

さらに、本発明のｇｐ５１糖タンパク質の分画または合
成タンパク質は、抗体を探すための抗原として利用する
ことができる。特に、診断または分析、適当な宿主内に
誘起することによるモノクローナル抗体をはじめとする
抗体の生成、さらには、ワクチンの製造に応用すること
が可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、モノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡテス
トによりｇｐ５１糖タンパク質の８つのエピトープを明
らかにした図である。 第２図は、ｇｐ５１の８つのエピトープに特有なモノク
ローナル抗体を感染したウシ血清の量を増加させながら
添加した場合の固定テストで得られた結果を示すグラフ
である。 第３図は、ＢＬｖ粒子のウェスターン解析の結果を示す
図である。 第４図は、ｇｐ５１分子と切断が起こる地点を簡単に示
した図である。 第５図は、ｇｐ５１調製物に対する様々なモノクローナ
ル抗体の反応性を示す図である。 第６図は、４つのＢＬＶ変異体のＤＮＡ配列から決定さ
れたｇｐ５１糖タンパク質のアミノ酸配列を示す図であ
る。 第７図は、ｇｐ５１糖タンパク質に対するウサギ抗ペプ
チド血清の滴定曲線を示すグラフである。 第８図は、ＢＬＶ全体に対するウサギ抗ペプチド血清の
滴定曲線を示すグラフである。

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. （１）ウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ）に対する防御効果
   のある抗体の形成を誘起するペプチド分画であって、Ｂ
   ＬＶの生物学的活性の原因となるエピトープ（Ｆ、Ｇ、
   Ｈ）のうちの少なくとも１種を有するＢＬＶのエンベロ
   ープのｇｐ５１糖タンパク質の分画の配列の全部または
   一部を複製するペプチド配列を含むことを特徴とするペ
   プチド分画。
2. （２）上記分画そのもので構成されており、この分画が
   、 −上記ｇｐ５１糖タンパク質の末端ＮＨ＿２を表してお
   り、 −分子量が約１５，０００であり、わずかにグリコシル
   化されており、 −アクセス可能な部位に上記ウィルスの生物学的活性の
   原因となるエピトープを有する ことを特徴とする請求項１に記載のペプチド分画。
3. （３）−上記ペプチド分画から生成したエピトープが、
   このエピトープに対して形成されるモノクローナル抗体
   により認識され、 −このエピトープが、感染したヒツジまたはウシの血清
   により選択的に認識され、 −このエピトープが還元剤による変性に対して敏感であ
   る ことを特徴とする請求項１または２に記載のペプチド分
   画。
4. （４）請求項２または３に記載のペプチド分画を得る方
   法であって、ｇｐ５１糖タンパク質に対して制御された
   条件下でタンパク質消化を起こさせることを特徴とする
   方法。
5. （５）上記タンパク質消化をウロキナーゼを用いて起こ
   させることを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. （６）ｇｐ５１糖タンパク質のタンパク質切断により得
   られる上記分画の免疫沈降をあらかじめ形成したハイブ
   リドーマから生成されたモノクローナル抗体を用いて行
   い、請求項１〜３に記載の分画を認識する上記モノクロ
   ーナル抗体を分泌させ、タンパク質−抗体の複合体をポ
   リアクリルアミドゲル電気泳動を行うことにより分離し
   、この複合体を解離させて所望の分画を得ることを特徴
   とする請求項４または５に記載の方法。
7. （７）請求項１〜３に記載のｇｐ５１分画から生成され
   て、中和抗体の形成を誘導する少なくとも１つのエピト
   ープを複製する請求項１に記載の合成ペプチド。
8. （８）アミノ酸の配列がｇｐ５１糖タンパク質の７８〜
   ９２配列にほぼ対応していることを特徴とする請求項７
   に記載のペプチド。
9. （９）式Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔ
   ｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐ
   ｈｅ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏに対応し、このペプチド
   はオリゴマー化されているかまたは環式であってシステ
   イン部位で保護され、または保護されておらず、環化は
   ２つのシステイン間のＳ−Ｓ結合により起こることを特
   徴とする請求項８に記載のペプチド。
10. （１０）アミノ酸の配列がｇｐ５１糖タンパク質の１４
    ４〜１５７配列にほぼ対応していることを特徴とする請
    求項７に記載のペプチド。
11. （１１）式Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−
    Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−
    Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐに対応し、このペプチドがモノ
    マー化またはオリゴマー化されていることを特徴とする
    請求項１０に記載のペプチド。
12. （１２）アミノ酸の配列がｇｐ５１糖タンパク質の３９
    〜４８配列にほぼ対応していることを特徴とする請求項
    ７に記載のペプチド。
13. （１３）式Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−
    Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−−Ｌｅｕに対応し、
    このペプチドがモノマー化またはオリゴマー化されてい
    ることを特徴とする請求項１２に記載のペプチド。
14. （１４）式Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−
    Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−−Ａｓｐに対応し、
    このペプチドがモノマー化またはオリゴマー化されてい
    ることを特徴とする請求項１２に記載のペプチド。
15. （１５）テタヌスアナトキシン、オボアルブミン、血清
    アルブミン、チログロブリン、ヘモシアニン等の天然タ
    ンパク質からなる群、または、ポリリシン、ポリ（ＤＬ
    −アラニン）ポリ（Ｌ−リシン）等の合成担体からなる
    群から選択された高分子担体とカップリングしているこ
    とを特徴とする請求項７〜１４のいずれか１項に記載の
    ペプチド。
16. （１６）ウィルスのタンパク質そのもので構成される群
    から選択される担体タンパク質とカップリングしている
    ことを特徴とする請求項７〜１４のいずれか１項に記載
    のペプチド。
17. （１７）二重結合またはそれ以外の結合により相互に、
    または任意の担体タンパク質とカップリングした請求項
    ７〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも２つのペプ
    チド。
18. （１８）請求項１〜３に記載のペプチド分画と、請求項
    ７〜１４に記載の合成ペプチドとによりイン・ビボで誘
    起される抗体。
19. （１９）請求項１〜３に記載のペプチド分画と、請求項
    ７〜１４に記載の合成ペプチドとにより生成されたエピ
    トープ（ＦまたはＧまたはＨ）を特に認識するモノクロ
    ーナル抗体。
20. （２０）請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド
    分画または請求項７〜１４のいずれか１項に記載の合成
    ペプチドを、ワクチンの製造に使用されるタイプの薬理
    学上の賦形剤または基剤と組み合わせることを特徴とす
    るウシ白血病に対するワクチン。
21. （２１）ＢＬＶの存在検出用試薬として使用されること
    を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプ
    チド分画または請求項７〜１４のいずれか１項に記載の
    合成ペプチド。
22. （２２）形質発現ベクター内で請求項７〜１４のいずれ
    か１項に記載のペプチドの形質を発現させるのに応用可
    能なＤＮＡ配列コード。
23. （２３）請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド
    分画または請求項７〜１７のいずれか１項に記載の合成
    ペプチドを応用した、抗体探索用の抗原。
24. （２４）請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド
    分画または請求項７〜１７のいずれか１項に記載の合成
    ペプチドを応用した、抗体、特にモノクローナル抗体の
    誘起または調製方法。