FI111731B - Immuunikatoviruksen endonukleaasiproteiinista johdetut polypeptidit ja niiden käyttö diagnostiikassa - Google Patents

Description

Immuunikatoviruksen endonukleaasiproteiinista johdetut polypep- tidit ja niiden käyttö diagnostiikassa 111731 5 Tämä keksintö liittyy polypeptideihin, joita voidaan käyttää havaitsemaan HIV-infektiosta merkkinä olevia anti-HIV-endonuk-leaasivasta-aineita.

HI-viruksen genomin koodaamien antigeenirakenteiden tunnistami-10 nen on olennaisen tärkeää rokotteiden ja serologisten testien kehittämisen kannalta. Env- ja gag-koodatuissa HIV-1- ja HIV-2-proteiineissa on identifioitu useita erittäin herkästi reagoivia antigeenikohtia (8-13). Transmembraaniproteiinin NH2-terminaalissa (pääteosassa) sijaitsevasta antigeenisekvenssistä 15 johdetuilla peptideillä pystytään kategoriseen kahden HIV-tyy-. pin vasta-aineiden erottamiseen (12), ja näiden kahden serotyy- i pin ristiin reagointia on löydetty alueilta, joilla on toisten-* * · sa kanssa homologisia sekvenssejä (12-14) . Seerumireaktiivisuus ’·*" ristiin reagoivilla gag- ja env-alueilla on kuitenkin usein hy- ..20 vin vähäistä, eivätkä kaikki HIV-l-vasta-ainepositiiviset see-> · · i .· rumit paljastu positiivisiksi käytettäessä ristiin reagoiviin v · peptideihin perustuvia serologisia testejä.

Eräs retrovirusten elämänkaaren piirteistä on proviraalisen .’25 DNA:n insertoituminen isäntäkromosomeihin. Viruksen genomin pol-geenin 3'-pään koodaaman proteiinin on osoitettu olevan en- » · » .:** donukleaasiaktiivinen (1) , mikä on tarpeen DNA-integraatiossa. ’...· Useimpien immuunikatovirus- (HIV-) infektion saaneiden yksilöi-f”. den seerumi reagoi endonukleaasiproteiinin p31 kanssa serologi- I I * *.•30 sissa testeissä (2-4) . Ei kuitenkaan ole tunnettua mikä osa proteiinista on vasta-ainevasteen kohde tai kohteita.

Tämän keksinnön kohteena on polypeptidi, jolla on kaava

35 X-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Thr-Ala-Tyr-Phe-B

Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Arg-Trp- Pro-Vai-Lys-Z

2 111731 jossa: B on Leu tai Ile, X on 1-20 aminohappojäämän ketju tai aminoterminaaliryhmä 5 ja Z on 1-20 aminohappojäämän ketju tai karboksiterminaaliryhmä.

Tämän keksinnön kohteena ovat myös keksinnön mukaisen polypep-tidin tai vasta-aineen sisältävät diagnostiset pakkaukset, joi-10 ta käytetään havaitsemaan anti-HIV-endonukleaasivasta-aineita.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .

15 Kuvauksen osana olevissa kuvioissa:

< · I

• · .·. j kuvio 1 kuvaa HIV-1-infektoituneen ja - infekt oi tumat toman yksi- .···. lön seerumin reagointia valikoituihin HIV-l-endonukleaasipepti- ’1J deihin. ELISA-menetelmällä analysoitiin kolmekymmentäkolme « ;!2JD HIV- 1-vasta-ainepositiivista seerumia (täytetyt neliöt) ja nel-’tt1’ jätöistä verrokki s e erumia (tyhjät neliöt) HIV-1-endonukleaasi-’·’ 1 proteiinia edustavia peptidejä käyttäen (6) . Aminohapposekvenssit johdettiin HIV-1-konsensussekvenssistä ja ne näkyvät • · · ·,· : kuvion alaosassa (abskissa) . Isoilla kirjaimilla on merkitty :,25 konsensusaminohappoja ja vähemmän säilyneet aminohapot on mer-, ,·. kitty pienemmillä kirjaimilla. Ordinaatta osoittaa absorptioni arvot 490 nm:ssa. Seerumeista kolme kuului infektoituneille T yksilöille, joiden luokitus on CDC 1 (7), kolmetoista luokkaan CDCII, seitsemän luokaan CDC III ja kymmenen luokkaan CDC IV.

* 30 Koska reaktioalttius muilla kuin End 10 -alueilla oli hyvin vähäistä, kuvioissa on näytetty tulokset vain valikoidusta pep-tidimäärästä, kuvio 2 kuvaa HIV-l-vasta-ainepositiivisen ja verrokkiseerumin 35 reagointia 18 glysiini- (G-) substituoitujen End-10-peptidien 3 111731 sarjaan. Täytetyt neliöt esittävät 13 vasta-ainepositiivisen seerumin keskimääräistä optista tiheyttä. Neljän negatiivisen seerumin vastaavat arvot on esitetty täyttämättömillä neliöillä. Pystyviivat osoittavat standardipoikkeama-arvoja. Keski-5 määräinen reaktiivisuus koskemattoman peptidin End-10:een valittiin edustamaan 100-prosenttista aktiivisuutta ja reagointi substituoituihin peptideihin on ilmaistu suhteessa tähän. Substituutiossa G korvattiin aminohapolla F (asema 663) HIV-1-pol:ssa.

10

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus A. Määritelmiä

Aminohappo jäämä; Tässä kuvatut aminohappojäämät saisivat olla L-isomeerimuodossa. D-isomeerimuodossa olevat jäämät voidaan 15 kuitenkin korvata millä tahansa L-aminohappojäämällä kunhan polypeptidi säilyttää halutun funktionaalisen immunoglobuliinin sitomisominaisuutensa. NH2 tarkoittaa polypeptidin amino- tai karboksipäässä olevaa vapaata aminoryhmää. COOH tarkoittaa polypeptidin karboksipäässä olevaa vapaata karboksiryhmää.

20 Vapaiden polypeptidien aminoterminaalin NH2- ja karboksiter-·.; minaalin COOH-ryhmiä ei tavallisesti merkitä kaavoihin. Pilkku . ! sekvenssin amino- tai karboksiterminaalissa osoittaa, että läs-nä on vielä muita aminohappo jäämiä, NH2- tai COOH-terminaaliryh-‘•••‘ mä. Standardin mukaisen polypeptidinimistön (J. Biol. Chem. , ••••25 243:3552-59, 1969) mukaiset aminohappo jäämien lyhenteet on an-: nettu seuraavassa vastaavuustaulukossa: 1 · 5 4 111731

VASTAAVUUSTAULUKKO

SYMBOLI AMINOHAPPO

1-kiriaiminen 3-kiriaiminen Y Tyr tyrosiini G Gly glysiini 10 F Phe fenyylialaniini M Met metioniini A Ala alaniini S Ser seriini I Ile isoleukiini 15 L Leu leukiini T Thr treoniini V Vai väliini P Pro proliini K Lys lysiini 20 H His histidiini Q Gin glutamiini E Glu glutamiinihappo W Trp tryptofaani R Arg arginiini 25 D Asp asparagiinihappo N Asn asparagiini C Cys systeiini .30

Huomattakoon, että kaikki aminohappojäämäsekvenssit esitetään • tässä kaavoin, joissa vasen ja oikea pää ovat perinteiseen ta-·...* paan aminohappoterminaali ja karboksiterminaali.

• *35 Polypeptidi: tarkoittaa lineaarista sarjaa aminohappojäämiä, jotka ovat liittyvät toinen toisiinsa peptidisidoksin jatkuvien aminohappojäämien alfa-aminoryhmien ja karboksiryhmien välityk-sellä.

• · • · · 40 Peptidi: tarkoittaa tässä toisiinsa polypeptidin tapaan liitty-* « » .* 1 vän alle noin 50 aminohappo jäämän lineaarista sarjaa.

• · i · ·

Proteiini: tarkoittaa toisiinsa peptidin tavoin liittyvän yli • > · · noin 50 aminohappo jäämän sarjaa.

5 111731

Synteettinen peptidi; tarkoittaa kemiallisesti valmistettua ketjua, jossa aminohappojäämät liittyvät toisiinsa peptidi-sidoksin ja niissä ei ole luonnossa esiintyviä proteiineja tai niiden fragmentteja.

5

Nukleotidi: DNA- tai RNA-monomeeriyksikkö, joka muodostuu so- keriosasta (pentoosi), fosfaatista ja typpipitoisesta hetero-syklisestä emäksestä. Emäs liittyy sokeriosaan glykosidisen hiilen (pentoosin 1'-hiili) kautta, ja tämä emäksen ja sokerin 10 yhdistelmä on nukleosidi. Kun nukleosidi sisältää fosfaatti-ryhmän, joka on sitoutunut pentoosin 3'-tai 5'-asemaan sitä kutsutaan nukleotidiksi. Operatiivisesti toisiinsa liittyvien nukleosidien muodostamaa sekvenssiä kutsutaan tässä "nukleoti-disekvenssiksi" ja se esitetään tässä esityksessä kaavalla, 15 jonka suunta vasemmalta oikealle on perinteinen suunta 5'-päästä 3'-päähän.

B..Polypeptidit

Eräässä toteutusmuodossa tämän keksinnön kohteena on polypepti-20 di, joka on tunnettu kaavasta:

•j (Fl) Xn-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Thr-Ala-Tyr-Phe-B

Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Arg-Trp-Pro-Val-Lys-Z».

•25 B on Leu tai Ile, edullisesti Leu. X ja Z ovat amino- ja kar-boksiterminaaliryhmiä. Se, onko läsnä X, ilmoitetaan sen ala- • » indeksillä n, joka on 0 tai 1 niin, että kun n on 0, X ei ole

I · I

läsnä, ja kun n on 1, X on läsnä. Samoin kun m on 0, Z ei ole ... läsnä, ja kun m on 1, Z on läsnä. Edullisesti n=0 ja m=l.

• 3b Edullisesti n=l ja m=0. Edullisesti n=l ja m=l. X voi olla *·* ‘ mikä tahansa aminoterminaalin NH2-ryhmä. X voi myös olla noin 1 ” 20 aminohappo jäämän ketju, joka on läsnä kun n on 1, ja ei ole läsnä kun n on 0. Z voi olla karboksiterminaaliryhmän I · t *, COOH-ryhmä tai karboksiterminaalin NH2-ryhmä. Z voi myös olla **35 noin 1-20 aminohappo jäämän ketju, joka on läsnä kun m on 1, * * ja ei ole läsnä kun m on 0.

6 111731 X voi olla jokin seuraavista aminohappojäämäsekvensseistä: (a) NH2_Gly-Tyr-Ile-Glu-Ala-Glu-Val-Ile-Pro-Ala (b) NH2-Gly-Tyr-Ile-Glu-Ala-Glu-Val-Ile-Pro 5 (c) NHj-Gly-Tyr-Ile-Glu-Ala-Glu-Val-Ile (d) NH2.Gly-Tyr-Ile-Glu-Ala-Glu-Val (e) NH2-Gly-Tyr-Ile-Glu-Ala-Glu (f) NH2.Gly-Tyr-Ile-Glu-Ala (g) NH2.Gly-Tyr-Ile-Glu 10 (h) NH2.Gly-Tyr-Ile (i) NH2.Gly-Tyr (j) NH2.Gly Z voi olla jokin seuraavista aminohappojäämistä:

15 (a) Thr-Ile-His-Thr-Asp-Asn-Gly-Ser-Asn-Phe-COOH

(b) Thr-I le-His-Thr-Asp-Asn-Gly-Ser-Asn-COOH

(c) Thr-11 e-His-Thr-Asp-Asn-Gly-Ser-COOH

(d) Thr-Ile-His-Thr-Asp-Asn-Gly-COOH

(e) Thr-Ile-His-Thr-Asp-Asn-COOH

20 (f) Thr-Ile-His-Thr-Asp-COOH

(g) Thr-Ile-His-Thr-COOH

(h) Thr-Ile-His-COOH

-.1 (i) Thr-Ile-COOH

O (j) Thr-COOH

J?5

Eräässä toteutusmuodossa tämän keksinnön mukaisella polypepti-dillä on kaava: .. . (F2) NH2 -f—Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Thr-Ala-Tyr-Phe-Ile » · ·

'.30 Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Arg-Trp-Pro-Val-Lys—COOH

* * * :T: jossa B on Ile tai Leu, edullisesti Leu. p on arvoltaan sel-lainen kokonaisluku, että homoblokkipolymeeri liukenee vesipi- • * * ·. toiseen 0,15 M natriumkloridiin. Edullisesti p saisi olla ar-"35 voitaan 2 - noin 6.

7 111731

Suositeltavassa polypeptidissä on alle noin 30 aminohappojäämää ja se sisältää immunologisesti aktiivisen sekvenssin, joka osoittaa soluunkiinnittymisaktiivisuutta, ja sekvenssillä on kaava: 5 (F3) Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Thr-Ala-Tyr-Phe-Leu Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Arg-Trp-Pro-Val-Lys

Suositeltavampi on polypeptidi, jolla on kaava: 10 (F3) Glu-Tyr-Ile-Glu-Ala-Glu-Val-Ile-Pro-Ala-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Thr-Ala-Tyr-Phe-Leu-Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Arg-Trp-Pro-Val-Lys-Thr-Ile-His-Thr-Asp-Asn-Gly-Ser-Asn-Phe 15

Kaikille tämän keksinnön mukaisille polypeptideille on ominaista, että ne pystyvät immunologisesti imitoimaan HIV-endonukle-aasia (p31).

20 Suositeltavissa toteutusmuodoissa kohteena oleva polypeptidi on operatiivisesti liitetty kiinteään elatuspohjaan, esimerkiksi ·.: agaroosiin, polykarbonaattiin, polystyreeniin, polypropeeniin, nitroselluloosaan, polyesteriin, lasiin, synteettiseen hart-siin, lateksiin, pitkäketjuiseen polysakkaridiin tai vastaa-25 vaan. Edullisesti keksinnön kohteena olevat polypeptidit sai-sivat olla operatiivisesti liitettyjä kiinteään elatuspohjaan, * ♦ joka muodostaa diagnostisen laitteen, esimerkiksi mikrotitteri-levykuopan tai vastaavan.

1« · • 30 Kohteena olevaksi polypeptidiksi luetaan mikä tahansa analogi, ‘ fragmentti tai kemiallinen johdos polypeptidistä, jonka amino-happosekvenssi on esitetty tässä, kunhan tämä polypeptidi pys-tyy immunologisesti sitoutumaan HIV-endonukleaasiproteiinin p31 • aikaan saamiin vasta-aineisiin. Tämän vuoksi kyseessä olevalle •·3·5 polypeptidi lie voidaan suorittaa monenlaisia muutoksia, substi- 111731 8 tuutioita, insertointeja ja deleetioita silloin kun tällaisten muutosten käytöstä on jotain etua.

Termillä "analogi" tarkoitetaan mitä tahansa polypeptidiä, jon-5 ka aminohappojäämäsekvenssi on olennaisesti identtinen tässä spesifisesti esitetyn sekvenssin kanssa, jossa yksi tai useampi jäämä on konservoiden substituoitu funktionaalisesti samanlaisella jäämällä. Esimerkkejä konservoivista substituutioista ovat esimerkiksi yhden ei-polaarisen (hydrofobisen) jäämän kulo ten isoleukiinin, valiinin, leukiinin tai metioniin korvaaminen toisella, yhden polaarisen (hydrofiilisen) jäämän korvaaminen toisella, esimerkiksi arginiini/lysiini, glutamiini/asparagii-ni, glysiini/seriini, yhden emäksisen jäämän kuten lysiinin, arginiinin tai histidiinin korvaaminen toisella tai yhden hap-15 pojäämän kuten asparagiinihapon tai glutamiinihapon korvaaminen toisella.

Käsite "konservoiva substituutio" kattaa myös kemiallisesti johdetun jäämän käyttämisen johtamattoman jäämän asemesta sillä 20 ehdolla, että tällainen polypeptidi osoittaa vaadittua sitoutu-misaktiivisuutta.

. "Kemiallinen johdannainen" tarkoittaa kohteena olevaa polypep-tidiä, jossa on yksi tai useampi jäämä kemiallisesti johdettu 2J5 funktionaalisen sivuryhmän reaktiosta. Tällaisia johdettuja molekyylejä ovat esimerkiksi sellaiset molekyylit, joissa va- t · i « # *,*, paat aminoryhmät on johdettu muodostamaan amiinihydroklorideja, p-tolueenisulfonyyliryhmiä, karbobentsoksiryhmiä, t-butyyliok- ,, . sikarbonyyliryhmiä, kloroasetyyliryhmiä tai formyyliryhmiä.

* * * •3d Vapaita karboksyyliryhmiä voidaan johtaa muodostamaan suoloja, > » » ‘ metyyli- tai etyyliestereitä tai muita esteri- tai hydratsidi-: i : tyyppejä. Vapaita hydroksyyliryhmiä voidaan johtaa muodosta-maan o-asyyli- tai o-alkyylijohdannaisia. Histidiinin imidat- • · · ·, solityppi voidaan johtaa muodostamaan N-im-bentsyylihistidiini. •05 Kemiallisiin johdannaisiin luetaan myös peptidit, jotka sisäl-‘ ‘ tävät yhden tai useamman luonnon aminohappojohdannaisen kahdes- 9 111731 takymmenestä standardiaminohaposta. Esimerkkejä: 4-hydroksi-proliini voidaan korvata proliinilla, 5-hydroksilysiini voidaan korvata lysiinillä, 3-metyylihistidiini voidaan korvata histi-diinillä, homoseriini voidaan korvata seriinillä ja ornitiini 5 voidaan korvata lysiinillä. Tämä keksinnö mukaisiin polypepti-deihin kuuluvat myös polypeptidit, joissa on yksi tai useampi lisäys ja/tai deleetio tai jäämiä, jotka liittyvät polypepti-disekvenssiin, joka on esitetty ohessa, kunhan vaadittu sitou-tumisaktiviteetti säilyy.

10

Termi "fragmentti" viittaa mihin tahansa kohteena olevaan poly-petidiin, jonka aminohapposekvenssi on lyhyempi kuin polypepti-dillä, jonka aminohappojäämäsekvenssi on esitetty tässä.

15 Kohteena oleva polypeptidi voidaan valmistaa käyttämällä kiin-teäfaasisyntetointitekniikkaa, jota alunperin on kuvannut Mer-rifield (J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963). Muita poly-peptidisyntetointitekniikoita on löydettävissä esimerkiksi teoksesta M. Bodanszky et ai., Peptide Synthesis, John Wiley & 20 Sons, 2 d Ed., 1976, samoin kuin muista alaan perehtyneen tuntemista referenssiteoksista. Kooste polypeptidisynteotintitek- '*· nilkoista on löydettävissä teoksesta J. Stuart and J.D. Young, « ·

Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rock-ford, IL, 3d Ed., Neurath, H. et al., Eds., p. 104-237, Acade- * · ♦ 35 mic Press, New York, NY, 1976. Sopivia suojaryhmiä tällaiseen syntetointiin on löydettävissä yllä mainituista teksteistä sa- » · moin kuin teoksesta J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic

. I I

Chemistry, Plenum Press, New York, NY, 1973.

•30 Yleisesti ottaen näissä syntetointimenetelmissä suoritetaan > * ♦ 'sekvenssilisäys käyttämällä yhtä tai useampaa aminohappojäämää tai sopivasti suojattua aminohappo jäämää kasvavaan polypeptidi-ketjuun. Normaalisti suojataan ensimmäisestä aminohappojäämäs- * 4 » ·. tä joko amino- tai karboksyyliryhmä sopivalla, selektiivisesti •35 siirrettävällä suojaryhmällä. Erilaista selektiivisesti siir- 10 111731 rettävää suojaryhmää käytetään aminohappoihin, jotka sisältävät reaktiivisen sivuryhmän, esimerkiksi lysiiniin.

Kiinteäfaasisyntetointi esimerkkinä suojattu tai johdettu ami-5 nohappo kiinnitetään inerttiin kiinteään alustaan suojaamattoman karboksyyli- tai aminoryhmänsä välityksellä. Suojaava amino- tai karboksyyliryhmä poistetaan sitten selektiivisesti ja seuraava sekvenssin aminohappo, jossa on komplementaarinen (amino tai karboksi) sopivasti suojattu ryhmä, sekoitetaan ja 10 saatetaan reaktioon olosuhteissa, jotka ovat sopivat muodostamaan amidiliitoksen jäämään, joka jo on kiinnittynyt kiinteään alustaan. Amino- tai karboksyyliryhmän suojaryhmä poistetaan sitten tästä uudesta lisätystä aminohappojäämstä, ja sitten lisätään seuraava (sopivasti suojattu) aminohappo ja niin edel-15 leen. Kun kaikki halutut aminohapot on liitetty oikeaan sekvenssiin ja kaikki jäljelle jääneet terminaali- ja suojasivu-ryhmät (samoin kuin alusta) poistettu jälkeen päin tai samanaikaisesti, saadaan lopullinen polypeptidi.

20 Tämän keksinnön mukaiseessa polypeptidissä voi olla C-terminaa-liamidiryhmä. C-terminaaliamidit, esimerkiksi kaavan p2 pepti- 1 4 * : dit voidaan normaalisti syntetoida puhtausasteeseen, joka on • · ·,'·· hieman korkeampi verrattuna vastaavaan C-terminaalihappoon jäl-; jempänä kuvatuista syistä. Normaalisti C-terminaalihapon omaa-5|5 vat peptidit pilkkoutuvat seoksessa 92,5 % HF/7,5 % anisolia un yhden tunnin ajan. tähän kuuluu "SNl-tyyppinen" reaktio, jossa • » anisolia käytetään puhdistavana lisäaineena. Tämän tyyppisen » · * reaktion aikana siirrettävistä sivuketjua suojaavista ryhmistä ,,. saadaan vapaita bentsyylityyppisiä karbokaatioita, jotka voivat

I I I

\3'0 reagoida peptidin toisten alueiden kanssa (esim. Met-, Trp- ja • i * '·’ * Cys-jäämät) anisolipuhdistusaineen asemesta. Nämä reaktiot il’: voidaan estää jos pilkkomisessa käytetään "SN2-tyyppistä" reak-"· tiota. Tämä tehdään käyttämällä muunnelmaa Tamin "vähäisen/ * f · \ laajan pilkkoutumisen menetelmää (Tam's "low/high cleavage" t v » ”*3?$ procedure, Int. J. Pept. Prot. Res. 21:57-65, 1983). Käyttä- >l|’l mällä bentshydryyliamiinihartseja (joista saadaan C-terminaa- 11 111731 liamideja) tässä reaktiossa pilkotaan sivuketjua suojaavat ryhmät hellävaraisemmalla ,,SN2-tyyppisellä" reaktiolla, jossa suoritetaan unimolekulaarinen suojaryhmien siirto peptidistä puhdistusaineeseen (ohittamalla reaktiivinen karbokaatiointermedi-5 aatti), jolloin peptidi jää kiinni hartsiin. (Tätä pilkkomis-menetelmää ei voidaa käyttää huomattavasti labiilimpiin hart-seihin, joita käytetään C-terminaalihapon valmistamisessa). Puhdistavan aineen sivutuotteet huudotaan sitten pois ja peptidi pilkotaan hartisista standarin mukaisella "SNl-menetelmäl-10 lä". Tällä päästään tavallisesti vähintään viiden prosentin lisäykseen puhtausasteessa useimpien peptidien kohdalla, ja joskus se on ratkaiseva ero onnistumisen ja epäonnistumisen välillä kun kyseessä ovat pidemmät peptidit tai “vaikeita" jäämiä sisältävät peptidit.

15 Tämän keksinnön mukaiset polypeptidit sisältävät yleensä HIV-endonukleaasijohdetun sekvenssin, jossa on vähintään 15 aminohappo jäämää, enimmillään viisikymmentä aminohappojäämää, edullisesti 20-35 aminohappojäämää. Polypeptidit voidaan liittää 20 ylimääräiseen aminohapposekvenssiin joko N-terminaalin tai C-terminaalin päässä tai molemmissa lisäsekvenssien ollessa 1-100 aminohapon pituisia. Tällaiset ylimääräiset aminohapposekvens-sit, linkkerisekvenssit, eroavat endonukleaasiaminohappojäämä- • · .···. sekvenssistä ja ne voidaan helposti liittää havaittavaan lei- ”?5 maan, kiinteään elatuspohjaan tai muuhun kantajaan. Leimoja, » !!”. kiinteitä alustoja ja kantajia, jotka sopivat käytettäväksi tässä keksinnössä kuvataan kohta. Tyypillisiä linkkereinä ’·* ’ käytettäviä aminohappo jäämiä ovat tyrosiini, systeiini, lysii-ni, glutamiinihappo, aspartagiinihappo ja vastaavat. Suositel-i 3.0 tavia liitosjäämiä ovat karboksiterminaalin Cys ja Lys sekä : aminoterminaalin Tyr.

• · · /···, Mitä tahansa tämän keksinnön mukaista polypeptidiä, jäljempänä » ♦ kuvattu kimeerinen polypeptidi mukaan lukien, voidaan käyttää ..35 farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan muodossa. Sopivia happo-’’ · ja, jotka voivat muodostaa suoloja tämän keksinnön mukaisten 12 111731 polypeptidien kanssa ovat muun muassa epäorgaaniset hapot kuten kloorivetyhappo, bromivetyhappo, perkloorihappo, typpihappo, tiosyaanihappo, rikkihappo, forforietikkahappo, propionihappo, glykolihappo, maitohappo, rypälehappo, ok-5 saalihappo, malonihappo, meripihkahappo, maleiinihappo, fu-maarihappo, antraniilihappo, kanelihappo, naftaleenisul-fonihappo, sulfaniliinihappo ja vastaavat.

Sopivia emäksiä, jotka pysytyvät muodostamaan suoloja tämän 10 keksinnön mukaisten peptidien kanssa ovat muun muassa sellaiset epäorgaaniset emäkset kuin natriumhydroksidi, ammo-niumhydroksidi, kaiiumhydroksidi ja vastaavat, sekä orgaaniset emäkset kuten mono-, di- ja trialkyyli- ja aryyli-amiinit (esim. trietyyliamiini, di-isopropyyliamiini, me-15 tyyliamiini, dimetyyliamiini ja vastaavat) ja valinnaisesti : substituoidut etanolamiinit (esim. etanolamiini, dietanol- amiini ja vastaavat) .

« * * # » I I t « I t ;;2fc CL_kimeerisfft polyppptidit t * ; ·* Tämän keksinnön mukainen kimeerinen polypeptidi on sellai-»· · .· · nen, jossa on läsnä vähintään yksi peptidi sekvenssi, jolla on kaava: « « · I · ·

:‘$*5 Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Thr-Ala-Tyr-Phe-B

\ Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Arg-Trp-Pro-Val-Lys, 1 i » • * · ' « · i t · > · jossa B on Leu tai Ile, edullisesti Leu, operatiivisesti liitettynä peptidisidoksen kautta HIV-endonukleaasin kanssa heterologiseen peptidisegmenttiin.

* « 13 111731

Kohteena olevan kimeerisen polypeptidin HIV-endonukleaasijohdetut sekvenssit voivat olla olla jatkuvia tai toistensa vieressä sijaitsevia polypeptidiketjussa. Kun ne ovat vierekkäisiä, segmenttejä erottamassa on aminohappojäämiä, jotka muodostavat 5 erotussegmentin, joka tavallisesti sisältää noin 5 - enimmillään noin 50 jäämää, edullisesti noin 15 - noin 30 jäämää. Kohteena oleva kimeerinen polypeptidi voi sisältää useita kappaleita samoja endonukleaasisegmenttejä. Kun kolme tai sitä useampi endonukleaasisegmentti sijaitsee kohteena olevan kimee-10 risen polypeptidin vieressä erotussegmentit voivat olla samanlaisia tai erilaisia.

Kohteena oleva kimeerinen polypeptidi voi lisäksi sisältää pää-ja/tai häntäsegmentin jossa on 1 - enimmillään noin 50 jäämää, 15 esimerkiksi noin 5 - noin 10, tyypillisesti noin 15 - noin 30 amino- tai karboksiterminaalissaan silloin kun tällainen segmentti on edullinen polypeptidin valmistamisen tai käytön kannalta. Häntäsegmentillä voidaan esimerkiksi saada keino liittää kohteena oleva kimeerinen polypeptidi kiinteään elatuspoh-20 jaan, johtosegmenttiä taas voidaan edullisesti käyttää edistämään polypeptidin erittymistä sen ekspressoituessa soluissa.

D. DNA- ia vhdistelmä-DNA-molekyvlit

Elävissä organismeissa proteiinin tai polypeptidin aminohappo-'?5 jäämäsekvenssi liittyy suoraan geneetisen koodin välityksellä !!'! proteiinia koodaavan geenin deoksiribonukleiinihappoon (DNA).

On siis mahdollista määrittää geeni aminohappojäämäsekvenssin, **’ ts. proteiinin tai polypeptidin avulla.

i llO Eräs tärkeä ja tunnettu geneettisen koodin piirre on sen ylen-: määräisyys. Toisin sanoen useimmissa proteiinien valmistami-seen tarvittavissa aminohapoissa useampi kuin yksi koodaavaa * · * ···. nukleotiditripletti (kodoni) voi koodata, merkitä tiettyä ami-’!* nohappojäämää. Sen vuoksi monet eri nukleotidisekvenssit voi-.35 vat koodata tiettyä aminohappojäämäsekvenssiä. Tällaisia nuk-leotidisekvenssejä pidetään funktionaalisesti ekvivalentteina, 14 111731 koska niillä saadaan tuotettua sama aminohappojäämäsekvenssi kaikissa organismeissa. Joskus puriinin tai pyridiinin mety-loitu muunnelma voidaan lisätä tiettyyn nukelotidisekvenssiin. Tällainen metylointi ei kuitenkaan vaikuta koodaussuhteeseen 5 millään tavoin.

Tämä keksintö kattaa deoksiribonukleiinihappo- (DNA-) molekyylin tai segmentin joka määrittää geenin, joka koodaa, ts. pystyy ekspressoimaan kohteena olevaa polypeptidiä tai kohteena 10 olevaa kimeeristä polypeptidiä. Suositeltavassa DNA-segmentis-sä on nukleotidiemäsjärjestys, joka vastaa sekvenssiä, jolla on kaava: (F5) GAA ACA GGG CAG GAA ACA GCA TAT TTT CTT TTA AAA TTT GCA 15 GGA AGA TGG CCA GTA AAA.

Kohteena olevia polypeptidejä koodaavia DNA-molekyylejä voidaan helposti syntetoida kemiallisin menetelmin, esimerkiksi fosfo-triesterimenetelmällä, jonka ovat kehittäneet Matteucci et ai. 20 (J. Am. Chem. Soc. 103:3185, 1981). Tietenkin kemiallisssa valmistuksessa koodaavaan sekvenssiin voidaan tehdä mitä tahan-·.: sa haluttuja muutoksia yksinkertaisesti korvaamalla sopivat emäkset sellaisilla, jotka koodaavat natiivia aminohappojää-mäsekvenssiä. On kuitenkin suositeltavaa käyttää DNA-molekyy-.2.5 lejä, joissa emässekvenssit ovat osin tai kokonaan identtisiä j·’·, yllä esitetyn sekvenssin kanssa.

I 1 2 DNA-molekyyli, joka sisältää kohteena olevaa polypeptidiä koo-daavan DNA-sekvenssin voidaan valmistaa operatiivisesti sito-: 30 maila (ligatoimalla) sopivia restriktiofragmentteja kummastakin : yllä esitetystä plasmidista tunnetuin menetelmin. Tähän tapaan valmistetuissa tämän keksinnön mukaisissa DNA-molekyyleissä on tyypillisesti kohesiivisiä pääteosia, ts. "riippuvia" yksisäi-"·’ keisiä osia, jotka jatkuvat molekyylin kaksisäikeisen osan ul-••35 kopuolelle. Tässä keksinnössä on suositeltavaa, että DNA-mole- 2 kyyleissä on läsnä kohesiivisiä pääteosia.

15 111731 Tämä keksintö kattaa myös yllä kuvattujen DNA-molekyylien ri-bonukleiinihappo (RNA-) ekvivalentit.

Lisäksi keksintö kattaa yhdistelmä-DNA-molekyylin# joka sisäl-5 tää vektorin, joka on operatiivisesti liitetty replikointia ja/tai ekspressiota varten kohteena olevaan DNA-molekyyliin, ts. DNA-molekyyliin, joka määrittää geeniä, joka koodaa kohteena olevaa polypeptidiä tai kohteena olevaa kimeeristä polypep-tidiä.

10 Tässä termi "vektori" tarkoittaa DNA-molekyyliä, joka pystyy itsenäiseen replikoitumiseen solussa ja johon toinen DNA-seg-mentti voidaan liittää operatiivisesti, niin että saadaan aikaan kiinnittyneen segmentin replikoituminen. Vektorit, jotka 15 pystyvät ohjaamaan kohteena olevan DNA-segmentin tuoman geenin ekspressiota nimitetään tässä "ekspressiovektoreiksi". Yhdis-telmä-DNA-molekyyli (rDNA) on siis hybridi-DNA-molekyyli, jossa on vähintään kaksi nukleotidisekvenssiä, jotka normaalisti eivät luonnossa esiinny yhdessä.

20

Sen vektorin valinta, johon tämän keksinnön mukainen DNA-seg-·.: mentti operatiivisesti liitetään riippuu suoraan, kuten alalla yleisesti on tunnettua, halutuista funktionaalisista ominai-suuksista (esimerkiksi protiiniekspressio), ja transformoita-.25 vasta isäntäsolusta. Nämä rajoitukset ovat tyypillisiä yhdis-*;·’·. telmä-DNA:n muodostamiseen liittyviä ongelmia. Tämän keksinnön kohteena oleva vektori pystyy kuitenkin ainakin ohjaamaan rep-likoitumista, ja edullisesti myös ekspressoimaan kohteena olevaa kimeeristä polypetidin geeniä, joka sisältyy DNA-segment- « · ♦ : 3Ό teihin, joihin se operatiivisesti on liitetty.

• · ·

Suositeltavissa toteutusmuodoissa tämän keksinnön mukaiseen .···. vektoriin kuuluu prokaryoottinen repi ikoni, ts. DNA-sekvenssi, • · • joka pystyy suoraan itsenäiseen replikoitumiseen ja yhdistelmä-•35 DNA-molekyylin ylläpitoon ekstrakromosomaalisesti prokaryootti-’·”· sessä isäntäsolussa, esimerkiksi bakteeri-isäntäsolussa, joka 16 111731 transformoidaan sillä. Tällaiset replikonit ovat alalla hyvin tunnettuja. Toteutusmuotoihin, joihin kuuluu prokaryoottinen replikoni sisältyy myös geeni, jonka ekspressoituminen saa aikaan lääkeresistenssin sillä transformoidussa bakteeri-isännäs-5 sä. Tyypillisiä lääkeresistenssigeenejä ovat sellaiset, jotka saavat mikrobit sietämään ampisilliinia tai tetrasykliiniä.

Prokaryoottisen replikonin sisältäviin vektoreihin kuuluu myös prokaryoottinen promoottori, joka pystyy ohjaamaan kohteena 10 olevan kimeerisen polypeptidin geenin ekspressoitumista (transkriptio ja translaatio) bakteeri-isäntäsolussa esimerkiksi E. colissa, joka transformoitu sillä. Promoottori on DNA-sekvens-sin muodostama ekspressiosäätelyelementti, joka mahdollistaa RNA-polymeraasin sitoutumisen ja transkription. Bakteeri-isän-15 tiin sopivat promoottorisekvenssit ovat tavallisesti plasmidi-vektoreissa, joissa on sopivat restriktiokohdat keksinnön mukaisen DNA-segmentin insertointiin. Tyypillisiä tällaisia vek-toriplasmideja ovat pUC8, pUC9, pBR322 ja pBR329, joita on saatavilla: Biorad Laboratories (Richmond, CA), sekä pPL ja 20 pKK223, joita valmistaa Pharmacia, Piscataway, N.J.

·.: Myös eukaryoottisoluihin, edullisesti selkärankaisten soluihin, sopivia ekspressiovektoreita voidaan käyttää muodostamaan tämän keksinnön mukaisia yhdistelmä-DNA-molekyylejä. Eukaryootti- .25 soluekspressiovektorit ovat alalla hyvin tunnettuja ja niitä on j·'/.. saatavilla useista kaupallisista lähteistä. Tavallisesti täl- *..! laisissa vektoreissa on halutun DNA-segmentin insertointiin sopivat restriktiokohdat. Tyypillisiä tällaisia vektoreita ovat pSVL ja pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-lpML2d (International •‘30 Biotechnologies, inc.) ja pTDTl (ATCC n:o 31255).

• · · .Suositeltavissa toteutusmuodoissa tämän keksinnön mukaisten .···. yhdistelmä-DNA-molekyylien kokoamiseen käytettävissä eukaryoot-·’ tisoluekspressiovektoreissa on selektiomarkkeri, joka toimii •35 eukaryoottisolussa, edullisesti lääkeresistenssiselektiomarkke-ri. Suositeltava lääkeresistenssimarkkeri on geeni, jonka eks- 17 111731 pressoituminen saa aikaan neomysiiniresistenssin, ts. neomysii-nifosfotransferaasi (neo) geeni. Southern et ai., J. Mol. Appi. Genet., 1:327-341, 1982.

5 Keksinnön kohteena on myös rDNA:n muodostamiseen käytettyjen retroviraaliekspressiovektoreiden käyttö. Tässä "retroviraali-nen ekspressiovektori" tarkoittaa DNA-molekyyliä, jossa on promoottori sekvenssi, joka on johdettu retrovirusgenomin pitkältä terminaalitoistoalueelta (LTR).

10

Suositeltavissa toteutusmuodoissa ekspressiovektori on tyypillisesti retroviraalinen ekspressiovektori, joka on edullisesti replikoini-inkompetentti eukaryoottisoluissa. Retroviraalisten vektoreiden kokoamista ja käyttöä kuvaavat esimerkiksi Sorge et 15 ai., Mol. Cell. Biol. 4:1730-37, 1984.

On kehitetty useita menetelmiä, joilla saadaan operatiivisesti liitettyä DNA vektoreihin komplementaaristen kohesiivisten terminaalien kautta. Insertoitavaan DNA-segmenttiin ja vektori-20 DNA:han voidaan esimerkiksi lisätä komplementaarisia homopoly-meerialueita. Vektori ja DNA-segmentti liitetään sitten yhteen komplementaaristen homopolymeerialueiden välisellä vetysidok-sella voidaan lisätä insertoitavaan DNA-segmenttiin ja vekto-ri-DNA:han. Vektori ja DNA-segmentti liitetään sitten yhteen 25 komplementaaristen homopolymeerihäntien välisellä vetysidoksel-]]·' la ja saadaan muodostettua yhdistelmä-DNA-molekyylejä.

I t

Eräs vaihtoehtoinen menetelmä yhdistää DNA-segmenttejä vektoreihin ovat yhden tai useamman restriktiokohdan sisältävät syn-:3Q· teettiset linkkerit. Aiemmin kuvattuun tapaan endonukleaasi-\* ’ restriktiohajotuksella luotua DNA-segmenttiä käsitellään E.

colin DNA-polymeraasi I:n bakteriofagi T4 DNA-polymeraasilla, ,··*. entsyymeillä, jotka poistavat ulkonevat 3'-pään yksisäikeiset • terminaalit 3'-5'-eksonukleolyyttisen aktiviteettinsa ansiosta •36 ja täyttävät poistuneen 3'-päät polymeroivalla aktiviteetil-’ *“·laan. Näiden aktiviteettien yhdistyminen saa sitten aikaan 18 111731 tasapäisiä DNA-segmenttejä. Tasapäisiä segmenttejä inkuboidaan sitten suuren molaarisen linkkerimolekyyliylimäärän vallitessa kun läsnä on entsyymiä, joka pystyy katalysoimaan tasapäisten DNA-molekyylien, esimerkiksi bakteriofaasi T4 DNA ligaasin, 5 ligatoitumisen. Reaktiotuotteet ovat siis DNA-segmenttejä, joissa on päissään polymeerilinkkerisegmenttejä. Nämä DNA-seg-mentit pilkotaan sitten sopivan restriktioentsyymin avulla ja ligatoidaan ekspressiovektoriin, joka on pilkottu entsyymillä, joka saa aikaan DNA-segmentin kanssa yhteen sopivia terminaale-10 ja.

Erilaisia restriktioendonukleaasikohtia sisältäviä synteettisiä linkkereitä on saatavilla monesta kaupallisesta lähteestä, esimerkkinä International Biotechnologies, Inc. New Haven, CN.

15 Tähän keksintöön kuuluvat myös kuvattujen yhdistelmä-DNA-mole-kyylien RNA-ekvivalentit.

Tämä keksintö liittyy myös isäntäsoluun, joka on transformoitu 20 tämän keksinnön mukaisella yhdistelmä-DNA-molekyylillä, edullisesti rDNArlla, joka pystyy ekspressoimaan kohteena olevaa ki-meeristä polypeptidiä. Isäntäsolu voi olla prokaryoottinen tai eukaryoottinen. Bakteerisolut ovat suositeltavia prokaryootti-siä isäntäsoluja ja tavallisesti ne ovat jokin E. colin kanta, 25 esimerkiksi E. coli DH5, jota valmistaa Bethesida Research La-... boratories, Inc., Bethesida, MD. Suositeltaviin eukaryootti-siin isäntäsoluihin kuuluvat hiivat ja nisäkässolut, edullisesti selkärankaisten solut kuten solut hiiren, rotan, apinan tai ihmisen fibroblastisolulinjoista. Suositeltaviin eukaryootti-: 30 isäntäsoluihin kuuluvat kiinanhamsterin munasolut (Chinese ' hamster ovary cells, CHO), saatavilla ATCC-tunnuksella CCL61 sekä NIH sveitsinhiiren sikiösolut NIH/3T3, saatavilla ATCC-tunnuksella CRL 1658. Tämän keksinnön mukaisia yhdistelmä-DNA- • molekyylejä sisältävät sopivat isäntäsolut voidaan transformoi-••35 da tunnetuin menetelmin, jotka tavallisesti riippuvat käytetys- • : tä vektorityypistä. Prokaryottisten isäntäsolujen transfer- 19 111731 mointia kuvaavat esimerkiksi Cohen et ai., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA, 69:2110, 1972, ja Maniatis et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Mammal, Cold Spring Harbor, NY, 1982. Selkärankaisten eläinten solujen transformointia rDNA:ta sisältäviä 5 retroviraalisia vektoreita käyttäen kuvaavat esimerkiksi Sorge et ai., Mol. Cell. Biol. 4:1730-37, 1984, Graham et ai., Virol.

52:456, 1973 sekä Wigler et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:1373-76, 1979.

10 Onnistuneesti transformoidut solut, ts. solut, jotka sisältävät tämän keksinnön muaisen yhdistelmä-DNA-raolekyylin, voidaan tunnistaa hyvin tunnetuin menetelmin. Solut, jotka on saatu viemällä niihin tämän keksinnön mukainen rDNA voidaan esimerkiksi kloonata tuottamaan monoklonaalisia pesäkkeitä. Solut näistä 15 pesäkkeistä voidaan koota talteen, lysoida, ja niiden DNA-si-sältö tutkia rDNA:n läsnäolon suhteen esimerkiksi menetelmällä, jota on kuvannut Southern, J. Mol. Biol. 98-503, 1975 tai Be-rent et ai., Biotech. 3:208, 1985.

20 Paitsi testaamalla suoraan rDNA:n läsnäoloa onnistunut transformaatio voidaan saada vahvistettua hyvin tunnetuin immunolo-*·· gisin menetelmin kun rDNA pystyy ohjaamaan kohteena olevan ki-meerisen polypeptidin ekspressiota. Onnistuneesti ekspressio-vektorilla transformoidut solut tuottavat esimerkiksi HIV-en- 25. donukleaasipolypeptidiantigeenisyyttä osoittavia proteiineja.

:v. Transformoituneiksi arvioituja soluja otetaan talteen ja niistä • · testataan HIV-endonukleaasiantigeenisyys käyttämällä tälle pep- « » · * tidisegmentille spesifisiä anipolypeptidivasta-aineita.

tl» t · » \30* Näin ollen tähän keksintöön kuuluu transformoitujen isäntäsolu- j * 1 * » i V ‘jen itsensä lisäksi myös näiden solujen viljelmä, edullisesti j ;'i‘:monoklonaalinen viljelmä (kloonihomogeeninen) tai monoklonaali- .‘•‘.sesta viljelmästä johdettu viljelmä viljelyväliaineessa. Edul-» * » ·, lisesti viljelmä saisi sisältää myös proteiinia, joka osoittaa 35'· immunologista ristiin reagointia HIV-endonukleaasin kanssa.

» ♦ 20 111731

Transformoitujen isäntäsolujen viljelyyn käytettävät viljelyvä-liaineet ovat alalla hyvin tunnettuja ja niitä on saatavilla useasta kaupallisesta lähteestä. Kun kyseessä ovat toteutus-muodot, joissa käytetän nisäkkäästä peräisin olevia isäntäsolu-5 ja on edullista käyttää "seerumitonta" väliainetta.

E. Inokulaatit

Eräässä toteutusmuodossa tämän keksinnön mukaista polypeptidiä, edullisesti kaavan F1 mukaista peptidiä, käytetään farmaseutti-10 sesti hyväksyttävässä vesipitoisessa laimennuskoostumuksessa muodostamaan inokulaatti, joka tehoavana määränä annettuna pystyy saamaan aikaan vasta-aineita, jotka immunoreagoivat HIV-endonukleaasin kanssa.

15 Sanaa "inokulaatti" eri taivutusmuodoissaan käytetään tässä kuvaamaan koostumusta, joka sisältää tämän keksinnön mukaista polypeptidiä aktiivisena aineosana valmistettaessa vasta-aineita Integrin beeta aliyksikköä vastaan.

20 Kun polypeptidiä käytetään vasta-aineiden luomiseen tarkoitetaan, että polypeptidiä voidaan käyttää joko yksin tai liitet-tynä kantaja-aineeseen konjugaattina taikka polypeptidipolymee- *\j rinä, mutta eri toteutusmuotojen selvittämisen yksinkertaista-» · miseksi tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä nimitetään koi-

f « I

25 lektiivisesti vain "polypeptidiksi" eri taivutusuodoissaan.

I · * i ♦ * * «

Kuten jo tuli esiin polypeptidin amino- tai karboksiterminaa-leihin voidaan lisätä yksi tai useampi ylimääräinen aminohappo-jäämä edistämään polypeptidin sitoutumista kantajaan. Polypep-*•30' tidin amino- tai karboksipäähän lisättyjen systeiinijäämien on : havaittu olevan erityisen käyttökelpoisia muodostettaessa kon-jugaatteja disulfidisidosten avulla. On kyllä mahdollista » ,···, käyttää muitakin alalla hyvin tunnettuja konjugaatin valmistus- » i menetelmiä. Eräs esimerkki additionaalisista liitosmenetelmis- « t · ·3β tä on Michaelin additioreaktiotuotteiden käyttö, dialdehydien i ‘‘‘kuten glutaraldehydien (Klipstein et ai., J. Infect. Dis.

21 111731 147:318-326, 1983), ja vastaavien käyttö, tai karboimiditekno-logian käyttö kuten vesiliukoisen karboimidin käyttö muodostettaessa amidisidoksia kantajaan. Katsaus proteiinikonjugaatios-ta, liittämisestä aktivoitujen funktionaalisten ryhmien kautta: 5 ks. Aurameas et ai., Scand. J. Immunol., Voi. 8, Suppl. 7:7-23, 1978.

Käyttökelpoisia kantajia tunnetaan alalla hyvin ja ne ovat yleensä itsekin proteiineja. Esimerkkejä tällaisista kantajis-10 ta ovat keyhole-limpettihemosyaniini (KLH), edestiini, tyroglo-buliini, albumiinit kuten naudan seerumialbumiini (BSA) tai ihmisen seerumialbumiini (HSA), veren punasolut kuten lampaan erytrosyytit (SRBC), tetanustoksoidi, koleratoksoidi sekä poly-aminohapot kuten poly(D-lysiini: D-glutamiinihappo) ja vastaa-15 vat.

Kantajan valinta on riippuvaisempi inokulaatin lopullisesta käyttökohteesta ja perustuu kriteereihin, jotka eivät erityisemmin liity tähän keksintöön. Esimerkiksi kantaja, joka ei 20 saa aikaan epäsuotuisaa reaktiota valitussa inokuloitavassa eläimessä, on sopiva.

* · • I * · # *.j Esillä oleva inokulaatti sisältää tehoavan, immunogeenisen mää-rän tämän keksinnön mukaista polypeptidiä, tavallisesti konju- I I » 25 gaattina kantajaan liitettynä. Tehoava polypeptidi- tai prote- • Ml iinimäärä per yksikköannos riippuu muun muassa inokuloitavasta t f .eläinlajista, eläimen ruumiin painosta ja valitusta inokuloin- ► * » ‘ tiohjelmasta kuten alalla on hyvin tunnettua. Tyypillisesti inokulaatti sisältää polypeptidiä tai proteiinia noin 10 mikro- « * i '30* grammasta noin 500 milligrammaan per inokulaatti (annos), edul-!.! ' lisesti noin 50 mikrogrammasta noin 50 milligrammaan per annos.

I I

* I »

! t S

Termi "yksikköannos" tämän keksinnön inokulaatin yhteydessä • ( tarkoittaa fysikaalisesti erillisiä yksiköitä, jotka sopivat I I · 03(yksittäisiksi annoksiksi eläimille, jokainen yksikkö sisältää ‘ennalta määrätyn määrän aktiivista ainetta, jonka on laskettu 22 111731 saavan aikaan haluttu imxnunogeeninen vaikutus yhdessä vaaditun laimentimen, siis kantajan tai vehikkelin kanssa. Tämän keksinnön mukaisen inokulaatin uuden yksikköannoksen tarkempi määritys määräytyy ja on suoraan riippuvainen a) aktiivisen mate-5 riaalin nimenomaisista piirteistä ja erityisestä halutusta immunologisesta vaikutuksesta ja b) tällaisen immunologiseen käyttöön eläimille tulevan aktiivisen materiaalin valmistukseen liittyvistä ominaisrajoituksista, kuten yksityiskohtaisesti tulee tekstistä esiin koska ne ovat tämän keksinnön piirteitä.

10

Inokulaatit valmistetaan tavallisesti kuivatusta kiinteästä polypeptidikonjugaatista dispergoimalla polypeptidikonjugaatti fysiologisesti siedettyyn (hyväksyttyyn) laimentimeen tai ve-hikkeliin, esimerkiksi veteen, suolaliuokseen tai fosfaattipus-15 kuroituun suolaliuokseen muodostamaan vesipitoinen koostumus. Tällaiset laimentimet ovat alalla hyvin tunnettuja ja niitä selvitetään esimerkiksi teoksessa Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980, sivut 1465-1467.

20

Inokulaatissa voi lisäksi olla adjuvanttia osana laimenninta.

. Sellaiset adjuvantit kuin täydellinen Freundin adjuvantti , ‘ (CFA), epätäydellinen Freundin adjuvantti (IFA) tai aluna ovat · alalla hyvin tunnettuja materiaaleja ja niitä on kauapallisesti 25' saatavilla useista lähteistä.

* · · • · · · t · · i ’.* F. Polyklonaaliset ia monoklonaaliset anti-peptidivasta-aineet Tämän keksinnön mukainen vasta-aine, olipa se polyklonaalinen tai monoklonaalinen immunoreagoi HIV-endonukleaasin ja kaavan 3CT. Fi raukaisen peptidin kanssa. Vasta-aine ei immunoreagoi kaavan .•:\F4 mukaisen peptidin kanssa.

• · · '·' 'Termi "vasta-aine" eri taivutusmuodoissaan tarkoittaa tässä * · · immunoglobuliinimolekyylejä ja immunoglobuliinimolekyylin im-35j.munologisesti aktiivisia osia, ts. molekyylejä, jotka sisältänevät vasta-ainetta sitovan kohdan eli paratoopin. Esimerkkejä • « 23 111731 vasta-ainemolekyyleistä ovat koskemattomat immunoglobuliinimo-lekyylit, olennaisesti koskemattomat immunoglobuliinimolekyylit ja sellaiset immunoglobuliinimolekyylin osat, jotka sisältävät paratoopin, mukaan lukien osat, joista alalla käytetään nimi-5 tyksiä Fab, Fab', F(ab')2 ja F(v).

"Vasta-ainetta sitova kohta" on vasta-ainemolekyylin rakenteellinen osa, jossa on raskaan ja kevyen ketjun variaabeli- ja hypervariaabelialueet, jotka spesifisesti sitovat antigeeniä 10 (iramunoreagoivat sen kanssa). Termi "immunoreagoida" eri muodoissaan tarkoittaa antigeenideterminantin sisältävän molekyylin ja vasta-ainesitoutumiskohdan sisältävän molekyylin välistä sitoutumista, esimerkiksi kokonaista vasta-ainemolekyyliä tai sen osaa.

15 "Vasta-ainemolekyyli" viittaa antigeenin varsinaiseen rakenteelliseen osaan, joka immunologisesti sitoutuu vasta-aine-sitoutumiskohtaan. Termiä käytetään samaa merkitsevänä kuin "epitooppi".

20 1. Polvklonaaliset vasta-aineet . . Tämän keksinnön mukainen polyklonaalinen vasta-aine im-• · munoreagoi kohteena olevan polypeptidin kanssa, edullisesti • · '· " polypeptidin, jonka aminohappojäämäsekvenssi on kaavan F1 mu-• · · *25' kainen. Kohteena oleva polyklonaalinen vasta-aine on tunnettu myös siitä, ettei se olennaisesti immunoreagoi polypeptidin • kanssa, jolla on kaavan F4 mukainen aminohappojäämäsekvenssi.

Suositeltava polyklonaalinen vasta-aine on tunnettu siitä, että :30. se pystyy immunoreagoimaan HIV-endonukleaasin kanssa. j • · * Tämä keksinnön mukainen polyklonaalinen vasta-aine tuotetaan ·.· · tyypilliseen tapaan immunisoimalla nisäkäs tämän keksinnön mu-• * * kaisella inokulaatilla, edullisesti inokulaatilla, joka sisäl-33. tää kaavan I mukaisen peptidin, ja sen avulla saa nisäkkäässä muodostumaan vasta-ainemolekyylejä, joilla on sopiva polypepti- 24 111731 di-immunospesifisyys. Vasta-ainemolekyylit otetaan sitten talteen nisäkkäästä ja eristetään sinänsä hyvin tunnetuin tekniikoin halutussa määrin, käyttämällä esimerkiksi immunoaffini-teettikromatografiaa immunisoiva polypeptidi kiinteässä faasis-5 sa. Näin tuotettua polyklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää muun muassa tämän keksinnön mukaisissa diagnostisissa menetelmissä ja systeemeissä HIV-infektion identifioinnissa.

2. Monoklonaaliset vasta-aineet 10 Tämän keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine on tunnettu siitä, että se immunoreagoi epitoopin kanssa, jonka muodostaa kaavan F1 mukainen aminohappojäämäsekvenssi. Edullisesti kohteena oleva monoklonaalinen vasta-aine on tunnettu myös siitä, ettei se immunoreagoi polypeptidin kanssa, jolla on kaavan F4 15 mukainen aminohappojäämäsekvenssi.

Suositeltava monoklonaalinen vasta-aine on tunnettu myös siitä, että se pystyy immunoreagoimaan HIV-endonukleaasin kanssa.

20 Käsite "monoklonaalinen vasta-aine" eri taivutusmuodoissaan tarkoittaa vasta-ainemolekyylien joukkoa, joka sisältää vain yhden vasta-ainesitoutumispaikkalajin, joka pystyy immunorea-·. : goimaan tietyn antigeenin kanssa. Monoklonaalisella vasta-ai-,···’ nekoostumuksella on siis tavallisesti vain yhdenlaista sitoutu-*25 misaffiniteettia mihin tahansa antigeeniin nähden, jonka kanssa se immunoreagoi. Monoklonaalinen vasta-ainekoostumus voi sen ·' ·' vuoksi sisältää vasta-ainemolekyylin, jossa on useampi vasta-’·* ' ainesitoutumisikohta, joista jokainen on immunospesifinen eri antigeeniin nähden, esim. bispesifinen monoklonaalinen vasta-• aine. Monoklonaalinen vasta-aine muodostuu tavallisesti vasta-Jaineista, joita tuottavat kloonit, jotka ovat peräisin yhdestä ·;· ainoasta solusta, hybridomasta, joka erittää (tuottaa) vain yhdenlaista vasta-ainemolekyyliä. Hybridomasolu muodostetaan ;* yhdistämällä vasta-ainetta tuottava solu ja myelooma- tai muu itsestään jatkuva solulinja. Tällaisia vasta-aineita ovat en- 25 111731 simmäiseksi kuvanneet Kohler ja Milstein, Nature 256:495-497, 1975, joka on viitteenä oheen liitetty.

3. Menetelmiä monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi 5 Tämän keksinnön kohteena on menetelmä muodostaa monoklonaalinen vasta-aine, joka immunoreagoi kaavan F1 mukaisen polypeptidin kanssa muttei immunoreagoi kaavan F4 peptidin kanssa. Menetelmän vaiheet ovat: 10 a) Immunisoidaan eläin kohteena olevalla polypeptidillä, edullisesti kaavan F1 mukaisella peptidillä. Tämä suoritetaan tavalliseen tapaan antamalla immunologisesti tehoava määrä, ts. immuunivasteen aikaan saamiseen riittävä määrä, immunogeeniä immunologisesti kompetentille eläimelle. Edullisesti eläin 15 saisi olla jyrsijä kuten kaniini, rotta tai hiiri. Nisäkästä pidetään sitten niin kauan, että se tuottaa soluja, jotka erittävät immunogeenin kanssa immunoreagoivia vasta-ainemolekyyle-jä.

20 b) Valmistetaan suspensio immunisoidusta eläimestä saaduista vasta-aineita tuottavista soluista. Tämä suoritetaan tavalli-\ : seen tapaan poistamalla nisäkkään perna ja erottamalla mekaani-·. : sesti yksittäiset pernasolut fysiologisesti siedettyyn väliai-neeseen alalla hyvin tunnettuja menetelmiä käyttäen.

’*25 c) Suspensoituja vasta-aineita tuottavia soluja käsitellään : ·' sitten transformoivalla aineella, joka pystyy tuottamaan trans-V * formoidun ("kuolemattoman") solulinjan. Transformointiaineet ja niiden käyttö kuolemattomien solulinjojen valmistamiseen I 30 ovat alalla hyvin tunnettuja, ja niitä ovat esimerkiksi DNA-virukset kuten Epstein-Barrin virus (EBV), apinavirus 40 (SV 40), polyomavirus ja vastaavat, RNA-virukset kuten Moloneyn hiiren leukemiavirus (Mo-MuLV), Rousin sarkoomavirus ja vastaa-*·;·’ vat sekä myeloomasolut kuten P3X63-Ag8.653, Sp2/0-Agl4 ja vas-,. ;35 taavat.

26 111731

Suositeltavissa toteutusmuodoissa transformoivilla aineilla suoritetulla käsittelyllä saadaan tuotettua hybridoma liittämällä suspensoidut pernasolut sopivan solulinjan hiiren myeloo-masoluihin käyttämällä sopivaa fuusiopromoottoria. Suositelta-5 va suhde on noin 5 pernasolua per myeloomasolu. Kokonaistilavuus noin 10® splenosyyttiä.

Käytettävä solulinja saisi edullisesti olla niin sanottua "lääkeresistenttiä” tyyppiä, niin että fuusioitumattomat myelooma-10 solut kuolevat valikoidussa väliaineessa hybridien jäädessä eloon. Tavallisin luokka ovat 8-atsaguaniiniresistentit solu-linjat, joista puuttuu hypoksantiiniguaniinifosforibosyyli-transferaasientsyymi, ja joka sen vuoksi ei pysy elossa HAT-väliaineessa (hypoksantiini, aminopteriini ja tymidiini). On 15 myös tavallisesti suositeltavaa, että käytettävä myeloomasolu-linja on niin kutsuttua "erittämätöntä" tyyppiä, niin ettei se itse tuota mitään vasta-ainetta, vaikka erittäviäkin tyyppejä voidaan käyttää. Joissain tapauksissa erittävät myeloomalinjat ovat suositeltavia. Suositeltava fuusiopromoottori on polyety-20 leeniglykoli, jonka keskimääräinen molekyylipaino on noin 1000 - 4000 (kaupallisesti saatavilla esim. nimikkeellä PEG \· 1000), mutta muitakin alalla tunnettuja fuusiopromoottoreita \ : voidaan käyttää.

25 d) Transformoidut solut kloonataan sitten, edullisesti mono-klonaalisesti. Kloonaus on edullista suorittaa kudosviljelyvä- f liaineessa, joka ei ylläpidä transformoitumattomia soluja. Kun *·* transformoidut solut ovat hybridoraia tämä tapahtuu tavallisesti laimentamalla ja viljelemällä erillisissä astioissa fuusioitu- * · * : mattomien pernasolujen, fuusioitumattomien myeloomasolujen ja : : : fuusioitujen solujen (hybridomat) seoksia selektiivisessä väli- aineessa, joka ei ylläpidä fuusioitumattomia myeloomasolu ja ... niin pitkään että fuusioitumattomat solut kuolisivat (noin yksi viikko). Laimennos voi olla tyypiltään rajoittavaa, jolloin .,15¾ laimentimen määrä lasketaan statistisesti sellaiseksi, että saadaan eristettyä tietty määrä soluja (esim. 1-4) jokaisessa 27 111731 erillisessä astiassa (esim. mikrotitterilevyn kuopassa). Väliaine on sellainen (esim. HAT-väliaine), joka ei ylläpidä lääke-resistenttiä (esim. 8-atsaguaniiniresistentti) fuusioitumatonta myeloomasolulinjaa.

5 I e) Kloonattujen transformanttien kudosviljelyväliaineesta ar vioidaan erittyneiden kaavan F1 mukaisen HIV-endonukleaasipoly-peptidin kanssa immunoreagoivien vasta-ainemolekyylien läsnä olo. Peptidipositiiviset transformantit tutkitaan edullisesti 10 edelleen sellaisten identifioimiseksi, jotka eivät reagoi peptidin F4 kanssa.

f) Kun vaiheessa (e) on identifioitu haluttu transformantti, se valitaan ja sitä kasvatetaan sopivassa kudosviljelyväliai-15 neessa sopivan ajan, ja sitten haluttu vasta-aine otetaan talteen viljelysupernatantista. Sopiva väliaine ja sopiva vilje-lyaika ovat tunnettuja tai helposti määritettävissä.

Jos halutaan tuottaa selvästi suurempi määrä hieman vähemmän 20 puhdasta monoklonaalista vasta-ainetta haluttu hybridoma voidaan injektoida hiireen, edullisesti syngeeniseen tai semisyn-'*.! geeniseen hiireen. Hybridoma saa muodostumaan vasta-ainetta \ : tuottavia tuumoreita sopivan inkubointiajän jälkeen, ja isäntä-• · ,···. hiiren verenkiertoon ja perintoneumeksudaattiin (askites) saa-‘2*5 daan suuri halutun vasta-aineen pitoisuus (noin 5-20 mg/ml).

Näiden koostumusten valmistamiseen sopivat välineet ovat hyvin ’·' * alalla tunnettuja ja niitä on kaupallisesti saatavilla, ja niitä ovat esimerkiksi synteettiset viljelyväliaineet, kasvatet hiiret ja vastaavat. Esimerkki synteettisestä väliaineesta on v : Dulbeccon minimaaliessentiaaliväliaine (DMEM; Dulbecco et ai., .·*·. Virol. 8:396, 1959) johon on lisätty 4,5 gm/1 glukoosia, 20 mm » I · glutamiinia ja 20 % naudansikiöseerumia. Esimerkki kasvate-” tuista hiirikannoista on Balb/c.

..:h 28 111731 Tämän keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine voidaan myös puhdistaa edelleen käyttämällä tunnettuja immunoaffini-teettikromatografiamenetelmiä kohteena oleva, vasta-aineen kanssa immunoreagoiva polypeptidi kiinteässä faasissa.

5

Yllä kuvatulla menetelmällä valmistettua monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää esimerkiksi diagnostisissa ja terapeuttisissa kohteissa, joissa halutaan HIV-endonukleaasia sisältävän immunoreaktiotuotteen muodostumista.

10 G. Hvbridomat ia niiden valmistusmenetelmät Tämän keksinnön mukaiset hybridomat ovat sellaisia, jotka ovat tunnettuja siitä, että ne pystyvät tuottamaan kohteena olevan monoklonaalisen vasta-aineen.

15

Alalla tunnetaan hyvin menetelmiä, joilla tuotetaan tietyn im- munospesifisyyden omaavia vasta-ainemolekyylejä tuottavia (erittäviä) hybridomia, ts. jotka pystyvät immunoreagoimaan tietyn proteiinin, identifioitavan epitoopin tietyssä prote- 20 iinissa ja /tai polypeptidin kansssa. Erityisen sopivaa hybri- domatekniikkaa kuvaavat Niman et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.

USA, 80:4949-4953, 1983, ja Galfre et ai., Meth. Enzymol., \ : 73:3-46, 1981, jotka on liitetty oheen.

• · tl f

• I

25 H. Koemenetelmät il" Alaan perehtyneelle on selvää, että voidaan käyttää lukuisia I t · • heterogeenisiä ja homogeenisiä menetelmiä, kompetitiivisiä tai • < » ’·* ' ei-kompetitiivisiä immunokokeita. Esimerkkejä sopivista kiin-teäfaasikokeista ovat muun muassa entsyymimultippeli-immunokoe- * · · ; ‘30 tekniikat (EMIT) ja fluoresenssi-immunokokeet (FIA) tarkemmin : : : esimerkissä 2 kuvatun ELISA-menetelmän lisäksi. Voidaan kui- .··. tenkin käyttää mitä tahansa menetelmää, jolla saadaan lähtemään * » · signaali vasta-ainereaktiosta tämän keksinnön mukaisen polypep- « · tidin kanssa. Kaikissa näissä koemenetelmissä voidaan käyttää ./5¾ yksinkertaista tai kaksinkertaista vasta-ainetekniikkaa, jossa ‘"'i käytetään immunorektiosta ja sen myötä tämän keksinnön mukaisen 29 111731 polypeptidin kanssa testattavan vasta-aineen sitoutumisesta kertovaa ilmaisinta. Esimerkiksi sopivia tekniikoita selitetään esimerkiksi teoksessa Maggio, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Cleveland, OH, 1981 tai Goldman, Fluorescent Antibody 5 Methods, Academic Press, New York, NY, 1980.

j I Tässä analysointikoemenetelmässä käytetään vaskulaarineste- ! näytettä. On suositeltavaa, että ruumiin nestenäyte on tunnet tu määrä verta tai verijohteista ainetta kuten seerumia tai 10 plasmaa, vaikka onkin mahdollista käyttää myös virtsaa, sylkeä, siemennestettä, vaginaeritettä tai aivo-selkäydinnestettä (CSF).

Eräässä sopivassa menetelmässä määritetään anti-HIV-endonukle-15 aasivasta-aineiden läsnäolo, ja edullisesti määrä vaskulaari-nestenäyteestä. Menetelmässä on seuraavat vaiheet.

a) Vaskulaarinestenäyte sekoitetaan kohteena olevan polypeptidin kanssa immunoreaktioreokseksi. Polypeptidi saisi olla 20 kiinnitetty kiinteään alustaan, niin että immunoreaktioseoksel-la on sekä nestefaasi että kiinteä faasi.

* \ : b) Immunoreaktioseosta pidetään biologisen analysointikokeen • · .···, olosuhteissa ajan, tavallisesti ennalta määrätyn, joka riittää 25 polypeptidiä sisältävän immunoreaktiotuotteen muodostumiseen !."! kiinteässä faasissa. Heterogeenisissa koetavoissa reagenssit ♦ * · < , tavallisesti erotetaan ylläpitovaiheen jälkeen, tavallisesti » · « ' pesemällä ja säilyttämällä kiinteä faasi.

i *3Ö Biologisen analysointikokeen olosuhteet ovat sellaiset, joissa * * » V : tämän keksinnön mukaisten immunokemiailisten reagenssien ja ,···. kokeiltavaksi tarkoitetun vasta-aineen biologinen aktiivisuus » * · ... pysyvät yllä. Näitä olosuhteita ovat muun muassa noin 4 - noin 45 Celsiusasteen lämpö, pH-arvo noin 5 - noin 9 ja ionivahvuus 5 joka vaihtelee tislatun veden ja noin 1 M NaCl vahvuutta. Täi- 30 111731 laisten olosuhteiden optimoimiseen tarvittavat menetelmät ovat alalla hyvin tunnettuja.

c) Määritetään vaiheessa (b) muodostuneen immunoreaktiotuot-5 teen läsnäolo, edullisesti määrä, ja sen myötä anti-HIV-en-donukleaasivasta-aineiden läsnäolo tai määrä vaskulaarines-tenäytteessä.

Yllä mainitun menetelmän suositeltavassa toteutusmuodossa im-10 munoreaktiotuotteen määrä määritetään vaiheen (c) mukaisesti (i) sekoittamalla leimattu spesifinen sideaine, joka pystyy sitomaan polypeptidin sisältävän immunoreaktiotuotteen leimaus-reaktioseoksen muodostamiseksi, (ii) pitämällä leimausreaktio-seosta biologisen analysointikokeen olosuhteissa niin kauan, 15 että leimattu spesifinen sideaine ehtii sitoa polypeptidiä sisältävän immunoreaktiotuotteen leimatun kompleksin muodstami-seksi ja (iii) havaitsemalla mahdollisesti muodostuneen leimautuneen kompleksin läsnäolo tai määrä ja samalla anti-HIV-en-donukleaasivasta-ainetta sisältävän immunoreaktiotuotteen läs-20 näolo tai määrä.

'*,· Eräässä erityisen suositeltavassa toteutusmuodossa leimattu \ : spesifinen sideaine on leimattu anti-IgG.

t · * « t ► · * · 23 Eräässä toteutusmuodossa vaskulaarineste saatetaan immunoreak-* * · • il”, tioon kohteena olevan polypeptidin kanssa leimatussa ja leimaa- i * * ‘mattomassa muodossa. Tavallisesti leimaamaton polypeptidi t * * l<‘ ‘ kiinnitetään kiinteälle alustalle. Yksi anti-HIV-endonukle-aasivasta-aineen haara sitoo kiinteäfaasipolypeptidin ja toinen t $ 9 ;3Q· vasta-aineen haara sitoo leimatun polypeptidin, jolloin muodos-» ♦ » •*ti : tuu kiinteäfaasileimaimmunoreaktiotuote. Leimatun ja leimaa-,·!<, mattoman polypeptidin immunoreaktiot voidaan suorittaa olennai- » i · sesti konkurrentisti, ts. samassa seoksessa tai sarjanomaises- ‘t* ti.

ή' ‘»II» 31 111731

Eräässä toteutusmuodossa kohteena oleva polypeptidi saatetaan immunoreaktioon samanaikaisesti tämä keksinnön mukaisen anti-polypeptidivasta-aineen ja vaskulaarisen nestenäytteen kanssa. Edullisesti polypeptidi kiinnitetään kiinteään alustaan ja an-5 ti-polypeptidivasta-aine leimataan. Vaihtoehtoisesti anti-po-I lypeptidivasta-aine kiinnitetään kiinteään alustaan ja polypep tidi leimataan. Kummassakin tapauksessa muodostuu leimattu kiinteän faasin immunoreaktiotuote, joka osoittaa anti-HIV-en-donukleaasivasta-aineen läsnäolon ja/tai määrän.

10

Edullisesti suoritetaan ei-spesifisten proteiinisitoutumiskohtien estäminen kiinteäfaasialustan pinnalla. Kiinteään faasiin sitoutunut polypeptidi sidotaan esimerkiksi adsorption avulla tai jollain muulla tunnetulla kiinteään elatuspohjaan kiinnit-15 tämismenetelmällä. Sen jälkeen vesiliuosta, joka sisältää kokeeseen vaikuttamatonta proteiinia, esimerkiksi naudan, hevosen tai muuta seerumialbumiinia, joka myöskään ei ole HIV-kontami-noitunutta, sekoitetaan kiinteään faasiin adsorboimaan sekoitettu proteiini polypeptidipitoisen kiinteän alustan pinnalle 20 pinnan proteiininsitoutumiskohtiin, joita monoklonaaliset vas-: ta-ainemolekyylit eivät ole täyttäneet. Tavallinen vesipitoi-·, ; nen proteiiniliuos sisältää noin 3 - noin 10 paino% naudan see-rumialbumiinia PBSrssa pH-arvossa 7,1 - 7,5. Vesipitoisen pro- • · teiiniliuoksen ja kiinteän alustan seosta pidetään tavallisesti 4 « t ;;25 vähintään yhden tunnin ajan 37°C:ssa, ja saatavasta kiinteästä » · · • ·' faasista huuhdotaan sitten sitoutumaton proteiini pois.

• · · • · ·

Vaskulaarinestenäyte voi olla plasmaa tai seerumia kuten jo : ' : tuli esiin. Edullisesti näyte laimennetaan noin 1:10 - 1:5000, : ’$0 edullisemmin noin 1:10.

• · · • * * I. Diagnostiset systeemit • · Tämän keksinnön kohteena on myös diagnostinen systeemi, tavaili· lisesti pakkauksen muodossa ("kitti”), jota voidaan käyttää ·,··>$ toteuttamaan edellä kuvattuja koemenetelmiä. Systeemiin kuulumi vähintään yhteen analysointikokeeseen riittävä määrä koh- 32 111731 teenä olevaa polypeptidiä erilliseksi pakattuna immunokemial-lisena reagenssina. Tavalliseen tapaan pakkauksessa on pakatun reagenssin käyttöohjeet.

5 Eräässä toteutusmuodossa diagnostinen systeemi pakkausmuodossa sisältää kiinteän alustan, jolla on kiinteä elatuspohja, esimerkiksi mikrotitterilevy, johon on kiinnitetty tämän keksinnön mukainen polypeptidi (operatiivisesti kiinnitettynä kiinteään elatuspohjaan) määränä, joka riittää vähintään yhden kokeen 10 suorittamiseen.

Suositeltavissa toteutusmuodoissa yllä kuvattuun diagnostiseen systeemiin kuuluu myös, erilleen pakattuna reagenssina, toista vasta-ainetta, paljastavaa vasta-ainetta, joka sisältää ihmisen 15 IgG:n kanssa immunoreagoivia vasta-ainemolekyylejä. Systeemiin voi lisäksi kuulua, erilleen pakattuna reagenssina, tämän keksinnön mukaista anti-polypeptidivasta-ainetta käytettäväksi kompetitio-ELISA-muodossa.

20 Edullisesti, kun leima on entsyymi, diagnostiseen systeemiin •t ; kuuluu lisäksi yksi tai useampi seuraavista: (i) lähde tunnetun . ! vahvuista petyperoksidia, (ii) visualisoivaa hapettavaa väri-« · aineprekursoria, esim. OPD, (iii) liuosta, joka sisältää lope- • · ’···’ tusainetta. esim, 4 N rikkihappoa, jolla sammutetaan värinmuo-« * · ..25 dostusreaktio, (iv) yhtä tai useampaa puskuriainetta kuivana • V tai nesteenä kokeessa käytettäväksi ja (v) materiaalia standar-• · · >/· : diverrokkikäyrien valmistamiseen.

:*·*; Tässä termillä "pakkaus" tarkoitetaan kiinteää elatuspohjaa, • · .Oh sellaista materiaalia kuin lasi, muovi, paperi, folio ja vas-• t;t taavat, jotka pystyvät pidättämään määrätyissä rajoissa tämän *·' keksinnön mukaista polypeptidiä, polyklonaalista vasta-ainetta • « · ·...· tai monoklonaalista vasta-ainetta. Pakkaus voi näin ollen olla .:. esimerkiksi lasiastia, joka sisältää ajateltua polypeptidiä • ·« · .35: milligrammamäärän, tai se voi olla mikrotitterilevykuoppa, johon on operatiivisesti kiinnitetty, ts. kiinnitetty niin, että 33 111731 vasta-aine voi immunologisesti sitoa sen, ajateltua polypepti-diä mikrogrammamäärä.

"Käyttöohjeisiin” kuuluu tavallisesti käsin kosketeltava il-5 maisuväline, jossa kuvataan reagenssipitoisuutta tai ainakin yhtä koemetodiparametriä kuten reagenssin ja sekoitettavan näytteen suhteelliset määrät, reagenssi/näyteseosten ylläpito-ajat, lämpötila, puskuriolosuhteet ja vastaavat.

10 Suositeltavissa toteutusmuodoissa keksinnön mukaiseen diagnostiseen systeemiin kuuluu myös leima, osoitinväline, joka pystyy signaloimaan tämän keksinnön mukaisen polypeptidin tai vasta-ainemolekyylin sisältävän kompleksin muodostumisesta.

15 Tässä termi "kompleksi” tarkoittaa spesifisen sitoutumisreakti-on kuten vasta-aine/antigeeni- tai reseptori/ligandireaktion tuotetta. Esimerkkejä komplekseista ovat immunoreaktiotuot-teet.

20 Tässä termit "leima" ja "osoitinväline" eri kieliopillisissa . . taivutusmuodoissaan tarkoittavat yksittäisiä atomeja ja mole- . ! kyylejä, jotka joko suoraan tai epäsuorasti osallistuvat komp- ; ’· leksin läsnäolosta osoittavan havaittavan signaalin tuottami-• · ·...· seen. Kaikki leimat tai osoitinvälineet voidaan liittää tai ..25 sisällyttää ekspressoituvaan proteiiniin, polypeptidiin tai * · · • V vasta-ainemolekyyliin, joka on osa tämän keksinnön mukaista : : : vasta-aine- tai polypeptidikoostumusta, tai niitä voidaan käyttää erikseen, ja näitä atomeja tai molekyylejä voidaan käyttää !*·’· yksin tai yhdessä lisäreagenssien kanssa. Tällaiset leimat • · .30. ovat sinänsä hyvin tunnettuja kliinisen diagnostisen kemian < I · alalla ja muodostavat osan tätä keksintöä vain siinä mielessä, • « · V ' että niitä käytetään muutoin uusissa proteiinimenetelmissä :...: ja/tai -systeemeissä.

.35: Leimaväline voi olla fluoresoiva leimausaine, joka kemiallisesti sitoutuu vasta-aineisiin tai antigeeneihin niitä denaturoi- 34 111731 matta ja muodostaa fluoroväriä, joka on käyttökelpoinen im-munifluoresenssihavaitsin. Sopivia fluoresoivia leimausaineita ovat sellaiset fluorovärit kuin fluoresoiva isosyanaatti (FIC), fluoresoiva isotiosyanaatti (FITC), 5-dimetyyliamiini-l-nafta-5 leenisulfonyylikloridi (DANSC), tetrametyylirodamiini-isotiosy-anaatti (TRITC), lissamiini, rodamiini 8200 sulfonyylikloridi (RB 200 SC) ja vastaavat. Immunofluoresenssianalyysitekniikoi-den kuvausta löytyy teoksesta DeLuca, "Immunofluorescence Analysis", Antibody As a Tool, Marchalonis, et al., eds., John 10 Wiley & Sons, Ltd., pp. 189-231, 1982, joka on oheen liitetty.

Suositeltavissa toteutusmuodoissa osoitinryhmä on entsyymi, esimerkiksi piparjuuriperoksidaasi (HRP), glukoosioksidaasi tai vastaava. Tapauksissa joissa pääasiallinen osoitinryhmä on 15 entsyymi kuten HRP tai glukoosioksidaasi tarvitaan lisäreagens-seja visualisoimaan se, että on muodostunut reseptori/ligandi-kompleksi (immunoreaktantti). Tällaisiin HRP:n lisäreagenssei-hin kuuluvat vetyperoksidi ja hapetusvärjäysprekursori kuten diaminobentsidiini. Glukoosioksidaasiin sopiva lisäreagnessi 20 on 2,2'-atsido—di-(3—etyyli—bentstiatsoliini-G—sulfonihappo) . . (ABTS).

· Myös radioaktiivisia aineita voidaan käyttää leimausaineina ja niitä käytetään tässä kuvausmielessä. Eräs esimerkki radioak-.23 tiivisesta leimausaineesta on radiaktiivine aine, joka tuottaa • gammasäteilyä. Eräs ryhmä gammasäteilyä tuottavien radioaktiivi :visten aineiden osoitinryhmä ovat alkuaineet, jotka itse emittoivat gammasäteitä kuten 124I, 12SI, 1281, 132I ja slCr. Toinen käyttökelpoinen leimausvälineryhmä ovat itse positroneja emit-3^·. toivat alkuaineet kuten X1C, 18F, lsO ja 13N. Emittoidut posit-• ronit tuottavat gammasäteitä kohdatessaan eläimen ruumissa län-v 'sä olevia elektroneja. Käyttökelpoinen on myös beetaemittori, ‘esimerkiksi 3H lxlindium.

35.:Leimojen sitominen, ts. polypeptidien ja proteiinien leimaaminen on alalla hyvin tunnettua. Esimerkiksi hybridoman tuotta- 35 111731 mat vasta-ainemolekyylit voidaan leimata lisäämällä niihin me-tabolisesti radioisotooppeja sisältäviä aminohappoja komponenttina viljelyväliaineessa. Ks. esimerkiksi Galfre et ai., Meth. Enzymol., 73:3-46, 1981. Proteiinikonjugaatiotekniikat tai 5 liittäminen aktivoitujen funktionaalisten ryhmien avulla ovat erityisen sopivia. Ks. esimerkiksi Aurameas et ai., Scand. J. Immunol., Voi. 8 Suppl. 7:7-23, 1978, Rodwell et ai., Biotech., 3:889-894, 1984 ja US-4493795.

10 Diagnostisiin systeemeihin voi sisältyä myös, edullisesti erillisenä pakkauksena, spesifistä sideainetta. "Spesifinen sideaine" on molekulaarinen kokonaisuus, joka selektiivisesti sitoo tämän keksinnön mukaista reagenssilajia tai kompleksia, joka sisältää tällaista lajia, muttei itse ole tämän keksinnön mu-15 kainen polypeptidi- tai vasta-ainemolekyylikoostumus. Esimerkkejä spesifisistä sideaineista ovat toiset vasta-ainemolekyylit, komplementtiproteiinit tai niiden fragmentit, S. aureus proteiini A ja vastaavat. Edullisesti spesifinen sideaine sitoo reagenssilajia kun tätä lajia on läsnä osana kompleksia.

20 . . Suositeltavissa toteutusmuodoissa spesifinen sideaine on lei-mattu. Jos diagnostisessa systeemissä on leimaamaton spesifi- • nen sideaine, ainetta tavallisesti käytetään vahvistavana ai-·...* neena tai reagenssina. Näissä toteutusmuodoissa leimattu spe- sifinen sideaine pystyy spesifisesti sitomaan vahvistavaa ai-iv: netta kun vahvistava aine on sidottu reagenssilajia sisältävään kompleksiin.

Tämän keksinnön mukaisia diagnostisia pakkauksia voidaan käyt- * * 30 tää ELISA-muodossa havaitsemaan apo E -määrä vaskulaarisesta nestenäytteestä kuten verestä, seerumista tai plasmasta. "ELI-v ·SA" (enzyme-linked immunosorbent assay) tarkoittaa antigeeni-vasta-ainereaktioihin perustuvaa määritysmenetelmää, jossa vas-,:.ta-aine tai antigeeni sidotaan kiinteään faasiin ja entsyymi-35*:antigeeni- tai entsyymi-vasta-ainekonjugaatilla havaitaan ja kvantifioidaan näytteessä läsnä olevan antigeenin määrä. Ku- 36 111731 vaus ELISA-tekniikasta on löydettävissä kappaleesta 22 4. painoksesta teoksesta D.P Sites, Basic and Clinical Immunology, julkaisija Lange Medical Publications of Los Altos, CA, 1982 sekä US-patenteista 3654090, 3850752 ja 4016043, jotka kaikki 5 on oheen liitetty.

Reagenssi kiinnitetään kiinteään elatuspohjaan tavallisesti adsorptiolla vesipitoisesta väliaineesta, vaikka muitakin alaan perehtyneelle tuttuja proteiineille ja polypeptideille sopivia 10 kiinnitystapoja voidaan käyttää.

Suositeltavissa toteutusmuodissa tämän keksinnön mukainen poly-peptidi tai anti-polypeptidi-vasta-ainemolekyyli voidaan kiinnittää kiinteään elatuspohjaan muodostamaan kiinteä alusta, 15 josta tulee pakkaus kohteena olevaan diagnostiseen systeemiin.

Käyttökelpoiset kiinteät elatuspohjat ovat nekin alalla hyvin tunnettuja valmistettaessa kiinteäää alustaa, johon on kiinnitetty reagenssi. Tällaiset materiaalit ovat veteen liukenemat-20 tornia ja niitä ovat esimerkiksi ristisilloitettu dekstraani, . .jota on saatavilla kauppanimellä SEPHADEX (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), agaroosi, läpimitaltaan noin 1 /im - 5 '· *:mm olevat polystyreenihelmet (valmistaa muun muassa Abbott La-•...'boratories of North Chicago, IL), polyvinyylikloridi, polysty-24: reeni, ristisilloitettu polyakryyliamidi, nitroselluloosa- tai • ‘ :nailonpohjaiset verkot kuten levyt, liuskat tai lastat, putket, :':’:levyt tai mikrotitterilevyn kuopat, esimerkiksi polystyreenistä tai polyvinyylikloridista valmistetut. j •β - ! • · . , , , * 3.0;-^eagenssilajit, leimatut spesifiset sideaineet tai vahvistavat ’· aineet missä tahansa tässä kuvatussa diagnostisessa systeemissä v voivat olla liuoksen, esimerkiksi nestedispersion, tai olennai-:..,sesti kuivan jauheen, esim. lyofilisoidussa muodossa. Kun · .-.osoitinaine on entsyymi entsyymin substraatti voi olla systee- 3.¾..piissä erillisessä pakkauksessa. Kiinteä alusta kuten edellä kuvattu mikrotitterilevy sekä yhtä tai useampaa puskuriainetta 37 111731 voidaan myös sisällyttää erilleen pakattuina osina tähän diagnostiseen määrityskoesysteemiin.

Diagnostisiin systeemeihin liittyen esiin tuodut pakkausmateri-5 aalit ovat tavallisesti diagnostisissa systeemeissä käytettyjä. Tällaisia materiaaleja ovat lasi ja muovit (esim. polyeteeni, polypropeeni ja polykarbonaatti), erikokoiset pullot, muoviset ja muovipäällysteiset kotelot ja vastaavat.

10 Esimerkit

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä sitä rajoittamatta.

1. Peptidisyntetointi

Valmistettiin koko endonukleaasisekvenssin kattavat kaksikym-15 mentäkahdeksan lineaarista peptidiä antigeenisten kohtien ilmenemisen ja sijainnin määrittämiseksi HIV-1-endonukleaasipro-teaasissa. Näiden peptidien reagointia tutkittiin ELISA:11a ihmisen seerumilla, joka oli peräisin yksilöiltä, joilla oli todettu HIV-l-infektio. Sekvenssit johdettiin HIV-1 pol kon-20 sensussekvenssisstä (6) ja jokainen peptidi muodostui 20 amino-. .happojäämästä, joissa oli 10 päällekkäin menevän jäämän sekvenssi. Peptidi End 1, proteiinin aminoterminaali, alkaa leu-• · '· ‘:kiinilla kohdassa 547 HIV-1 konsensus pol sekvenssissä. Pepti-’... di End 28, sarjan viimeinen, kattaa proteiinin COOH-terminaa-2J5: liosan ja päättyy asparagiinihappojäämään kohdassa 809.

:: Serologisissa analysointikokeissa käytetyt peptidit syntetoi- tiin menetelmällä, jonka ovat kehittäneet Houghten et ai.,

VjProc, Natl. Acad. Sei. USA, 82:5131-5135, 1985, ja pilkottiin • 3(>·.kiinteää faasia varten moniastialaitteessa Tamin vähäinen/run-'· sas vetyfluoridimenetelmällä (Tam et ai., J. Am. Chem. Soc., 105:6442-6455, 1983). Peptidit todettiin HPLC:llä 80-85-pro-:...senttisesti homogeenisiksi ja niitä käytettiin sen vuoksi ilman .: enempää puhdi stamista.

35..: 38 111731 2. Serologiset kokeet

Suoritettiin peptidi-ELISA seuraavaan tapaan. Mikrotitterile-vyn kuoppia (Lindbro, Flow, Scotland) päällystettiin peptidillä (Ιμΐ/kuoppa) uudelleensuspensoituna 0,01 M karbonaattipuskuriin 5 huoneenlämmössä yli yön. Sen jälkeen kuopat estettiin 5-pro-senttisella naudan seerumialbumiinilla. Käytettiin 100 μΐ rea-genssejä per kuoppa. Suoritettiin viisi pesua (0,9 % NaCl ja 0,005 % Tween 20 tislatussa vedessä) ELISA-menetelmän eri vaiheiden välillä. Postiiviset seerumit ja verrokit laimennettiin 10 1/100 ja levyjä inkuboitiin yksi tunti 37°C:ssa. Lisättiin ihmisen IgG y-ketjuille (Dakopatts, Danmark) peroksidaasikonju-goitua immunoglobuliinia laimennettuna 1/2000 (1 tunti, 37°C). Substraattina käytettiin 1,2-fenyleenidiamiinidihydrokloridia. Reaktion annettiin jatkua kymmenen minuuttia ja pysäytettiin 15 sitten käyttämällä 3 M H2S0«. Levyt luettiin 490 nm:ssa Titer-tek spektrofotometrilla ja lukemat katsottiin postitiiviseksi kun ne olivat suuremmat kuin negatiivisen ihmisseerumin keskimääräinen optinen tiheys plus kolme standardipoikkeamaa (SD). Peptidin End 10 keskimääräinen optinen tiheys plus kolme kertaa 20 SD oli 0,8.

; Jokaista peptidiä käytettiin erikseen ELISA-systeemissä HIV-1-*· infektoituneiden ja negatiivisten verrokkiseerumien kanssa. ‘../Yksikään 14:sta vasta-ainenegatiivisesta verrokkiseeerumista ei 2%' reagoinut peptidien kanssa. Kaikki 33 HIV-1-vasta-ainepostii-• '/vista seerumia, valittuna HIV-infektion erilaisista kliinisistä vaiheista (7) reagoivat voimakkaasti yhden 28 peptidistä, End » 10:n kanssa (kuvio 1). Infektoituneen seerumin reaktiivisuus :\\oli havaittavissa vielä suurillakin laimennoksilla (1:10000). 3·0·, Aminohapposekvenssi End 10 on ETGQETAYFLLKLAGRQPVK. Proteiinin ’· muiden osien reaktiivisuus ei eronnut seerumireaktioista, joita ‘saatiin infektoituneista eli HIV-vasta-ainenegatiivisista yksi-:.,.:löistä. Tämän vuoksi kuviossa 1 nähdään ELISA-tulokset vain .:.muutamasta valitusta peptidistä. Peptidiä End 10 edustava ami-3£..-nohapposekvenssi sijaitsee endonukleaasiproteiinin keskiosassa 39 111731 (alkaa kohdasta 655) ja on hyvin konservoitunut eri HIV-iso-laattien keskuudessa (taulukko 1).

Taulukko 1 5

Eri HIV-1- ja HIV-2-isolaattien vertailu peptidiä End 10 edustavan HIV-l konsesussekvenssin kanssa

Kanta Sekvenssi 10 * * ** * **** ***

HIV-1 konsensus ETGQETAYF ? LKLAGRWPVK

HIV-1 BRV L

HXB2 L

MN L

15 OYI I

SF2 L

HAN L

RF I

ELI L

20 Z2 I

. . NDK L

. : MAL I

• · « · ·

25:' HIV-2 konsensus ? RQ L L S IT

j’v HIV-2 ROD S

NIH2 S

ISY s

ST S

36:·. BEN S

*,· · i

D194 S I

♦ ♦ · I

v : GH1 S I

» » ·

DH05 T

35.!: 40 111731 1. Sekvenssit johdettiin Meyer et ai.:n tapaan (6). Peptidiä End 10 edustava sekvenssi alkaa aminohaposta 655 pol HIV-1 konsensuksessa. Vastaava sekvenssi alkaa kohdasta 519 HIV-2-kon-sensussekvenssissä. Kirjaimet joissa on asteriski yläpuolella 5 tarkoittavat, että nämä aminohapot ovat konservoituneet sekä HIV-1- että HIV-2-sekvenssikannoissa. Kysymysmerkki ? osoittaa substituutioita alla olevalla jäämällä.

Vastaava alue HIV-2- (taulukko 1) ja apinan immuunikatoviruksen 10 (SIV) genomissa on myös hyvin konservoitunut. Verrattaessa HIV-l-sekvenssiä ja HIV-2-isolaatteja nähdään yleinen 55 prosentin homologisuus. Jotkut aminohappopätkät ovat kuitenkin täysin konservoituneita eri serotyypeissä. Tämän havainnon vuoksi HIV-1 peptidi End 10 testattiin myös 30 seerumilla, 15 jotka oli saatu HIV-2-infektoituneilta yksiöiltä. Yllättäen kaikki HIV-2-seerumit reagoivat voimakkaasti peptidin kanssa ja reaktioiden intensiteetti oli verrattavissa HIV-1- seerumilla saavutettuihin (tietoja ei esillä).

20 Löydöllämme, että peptidi endonukleaasialueelta reagoi kaikkien . . HIV-1- ja HIV-2-seerumien kanssa voi olla merkittäviä diagnos-; tisia vaikutuksia. End 10:een perustuvalla serologisella tes-tiliä voidaan varmistaa yksittäisten proteiinien tai niiden *·..* osien identifiointi, täytyy olla tehokas tapa immuunitunnistuk-.23’ seen.

: i : 3. Substituutiokokeet

Peptideillä End 9 ja End 11 saadtu negatiiviset tulokset osoit-tivat, että osia ainmohapposekvensseistä ETGQETAYFL ja 3P,LKLAGRWPVK täytyy olla läsnä reagointiin HIV-vasta-aineiden ; kanssa. Peptidin End 10 aminohappojen suhteellisen osuuden ‘määrittämiseksi valmistettiin sarja peptidejä sekventiaalisin substituutioin eri End 10 jäämillä, glysiini valmistettuna ja ELISA-menetelmällä. Aina kun substituutiolla päästiin 70 pro-35.: senttiseen tai sitä suurempaan optisen tiheyden vähenemiseen (490 nm) verrattuna koskemattomaan End 10 -peptidiin substitu- 41 111731 oitua jäämää pidettiin olennaisena vasta-ainesitoutumiselle. Tässä kokeessa käytettiin kolmeatoista HIV-vasta-ainepostiivis-ta seerumia. Minkä tahansa neljän aminohapon korvaaminen peptidin keskiosissa, fenyylialaniini (aminohappo HIV-1 pol kon-5 sensussekvenssin aminohappo kohta 663), leukiinit (kohdat 664 ja 666) ja tryptofaani (kohta 670) johti kriittiseen optisen tiheyden vähenemiseen (kuvio 2). Koska kaikki neljä kriittistä aminohappoa sijaitsevat yhden tai useamman ei-kriittisen jäämän välissä tulokset viittaavat siihen, että läsnä on jatkumaton, 10 ainutlaatuinen epitooppi HIV-endonukleaasiproteiinissa.

VIITEKIRJALLISUUS

5 1. Grandgenett et ai., (1978) Virology. 89:119-132.

2. Lillehoj et ai., (1988) J. Virol.. 62:8? 3053-3058.

20 3. Steiner et ai., (1986) J. Virol.. 58(1):9-16.

4. Allan et ai., (1987) Blood. 69(1):331-333.

* · · 5. Houghten et ai., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei.

·£ 322Δ# 82:5131-5135.

6. Meyers et ai., (1990) Human retroviruses and AIDS

1990.

• · 7. Center for Disease Control, (1986) jama July 4.

*\ 256(1):20-25.

I , « 8. Wang et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. PSA. 83:6159-6163.

•3-5: 9. Palker et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. PSA. 84:2479-2483.

42 111731 10. Palker et ai., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. PSA. 85:1932-1936.

5 11. Norrby et ai., (1987) Nature. 329:248-250.

12. Norrby et ai., (in press) Comparison of linear antigenic sites in the envelope proteins of human immunodeficiency virus (HXV) type 2 and type 1.

10 13. Broliden et al., (in press) Specific synthetic peptides for detection of and discrimination between HIV-1 and HIV-2 infection.

15 14. Goudsmit et al., (1989) J. AIDS. 2:297-302.

15. Kyte et al., (1982) J. Mol. Biol.. 157:105-132.

16. Chou et al., (1978) Adv. Enzvmol.. 47:45-148.

20 17. Kopchick et al., (1981) J. Virol.. 37:274-283.

« · t 18. Panet et al., (1975) Proc. Natl. Acad. Sci..

"f 72:2535-2539.

•2$ I « » 19. Panganiban et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.

; 22Ä, 81:7885-7889.

• » • · '•3°: 20. Donehower et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.

,···, 22Δ# 81:6461-6465.

• · · 21. Tam et al., (1983) J. Am. Chem. Soc. . 105:6442-6455.

22. Houghten et al., (1986) Int. J. Pept. Protein Res.. 27:675-683.

43 111731

Vaikka keksintöä on tässä kuvattu tiettyjen suositeltavien toteutusmuotojen valossa ja niihin liittyvissä esimerkeissä alaan perehtyneelle on selvää, että on mahdollista tehdä monelaisia muunnelmia, muutoksia, pois jättämisiä ja korvaamisia ilman, 5 että poistuttaisiin keksinnön suojapiiristä. Tämän vuoksi on tarkoitus, että tätä keksintöä rajoittavat vain seuraavat patenttivaatimukset .

* » • · # · I · · t · · t * · » I I * * % • * · • · * · • * ·

* t I

* · · « * ♦ » t I t

Claims (14)

111731

1. Polypeptidi, jolla on kaava:

5 X-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Thr-Ala-Tyr-Phe-B Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Arg-Trp-Pro-Vai-Lys-Z tunnettu siitä, että B on Leu tai Ile, 10. on 1-20 aminohappojäämän ketju tai aminoterminaaliryhmä ja Z on 1-20 aminohappojäämän ketju tai karboksiterminaaliryhmä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, tunnettu siitä, et-15 tä X:llä on kaava: ; ; NH2-Gly-Tyr-Ile-Glu-Ala-Glu-Val-Ile-Pro-Ala. • · · < « ’···* 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, tunnettu siitä, et- ..!20 tä Z:lla on kaava: : : : Thr-Ile-His-Thr-Asp-Asn-Gly-Ser-Asn-Phe-COOH.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi kiinnitettynä ,*:25 kiinteään alustaan. » · · » » · *L‘ 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, • · * että kiinteä alusta on kollageeniä. .**.•30 6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että kiinteä alusta on nitroselluloosaa tai polyesteriä.

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että kiinteä alusta on lasia, synteettistä hartsia tai pitkä-35 ketjuista polysakkaridia. 111731

8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että kiinteä alusta on synteettisen hartsin kuituja.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, jolla on kaava: 5 NH2-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Thr-Ala-Tyr-Phe-Leu Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Arg-Trp- Pro-Vai-Lys -COOH.

10. Menetelmä anti-HIV-endonukleaasivasta-aineiden toteamisek-10 si, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet, joissa (a) sekoitetaan suonen nestettä patenttivaatimuksen l mukaisen, kiinteään kantajaan sidotun polypeptidin kanssa immunoreak-tioseoksen muodostamiseksi, jossa on kiinteä ja nestemäinen faasi; 15 (b) pidetään mainittua immunoreaktioseosta biologisissa ana- . . lyysiolosuhteissa ajanjakso, joka riittää polypeptidiä sisältä-; ; vän immunoreaktiotuotteen muodostumiseen kiinteässä faasissa; • '· (c) erotetaan kiinteä ja nestemäinen faasi; ja (d) määritetään immunoreaktiotuotteen läsnäolo kiinteässä faa-.!20 sissa ja siten anti-HIV-endonukleaasivasta-aineiden läsnäolo. • : : : 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidillä on kaava: , ·;25 H2N-Glu-Thr-Gly-Gin-Glu-Thr-Ala-Tyr-Phe-Leu-Leu-Lys- » · Leu-Ala-Gly-Arg-Trp- Pro-Vai-Lys-COOH. • « · '...· 12. Diagnostinen pakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää pa- tenttivaatimuksen 1 mukaisen polypeptidin siihen kiinnitettynä :\30 määrässä, joka riittää vähintään yhden analyysin suorittamiseen.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen diagnostinen pakkaus, tunnettu siitä, että polypeptidillä on kaava: 35 H2N-Glu-Thr-Gly-Gin-Glu-Thr-Ala-Tyr-Phe-Leu-Leu-Lys- Leu-Ala-Gly-Arg-Trp-Pro-Vai-Lys-COOH. 111731