JP2988622B2 - Ｉｂｄｖ抗原蛋白質 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、伝染性滑液包病ウ
ィルス（ＩＢＤＶ）ゲノムのクローニング及び特徴化、
ＩＢＤＶの宿主保護性抗原のためのクローン化された遺
伝子の同定、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は他の宿主細
胞におけるＩＢＤＶの宿主保護性抗原の全部又は一部を
コードするｃＤＮＡ挿入体の発現及び鶏における、ウィ
ルス中和性抗体の産生における発現された抗体の使用に
関する。本発明は、さらに、発現された抗原を用いてＩ
ＢＤＶに対する有効なサブユニットワクチンの製造及び
診断試験、検定及び同様のものにおいて発現された抗原
の使用に関する。
ィルス（ＩＢＤＶ）ゲノムのクローニング及び特徴化、
ＩＢＤＶの宿主保護性抗原のためのクローン化された遺
伝子の同定、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は他の宿主細
胞におけるＩＢＤＶの宿主保護性抗原の全部又は一部を
コードするｃＤＮＡ挿入体の発現及び鶏における、ウィ
ルス中和性抗体の産生における発現された抗体の使用に
関する。本発明は、さらに、発現された抗原を用いてＩ
ＢＤＶに対する有効なサブユニットワクチンの製造及び
診断試験、検定及び同様のものにおいて発現された抗原
の使用に関する。
【０００２】
【本発明の説明】１つの特に好ましい観点においては、
本発明は、ＩＢＤＶの“正しく”プロセスされた抗原の
製造における組換えＤＮＡ技法の使用のための方法に関
する。そのような“正しく”プロセスされた抗原の製造
は、たとえばこれらの抗原が中和性及び保護性抗体の製
造のためにワクチン成分として有効的に使用され得るこ
とを確保することにおいて特に重要なものである。オー
ストラリア株（００２−７３）のＩＢＤＶのポリペプチ
ドが最近、特徴づけられて来た。先の国際特許ＰＣＴ／
ＡＵ８４／００２５６明細書において、３２Kd構造タン
パク質がＩＢＤＶの主免疫原であり、そしてインビトロ
でウィルスを中和し、そしてＩＢＤＶ感染から鶏を保護
する抗体を鶏中に生成することが開示されている。
本発明は、ＩＢＤＶの“正しく”プロセスされた抗原の
製造における組換えＤＮＡ技法の使用のための方法に関
する。そのような“正しく”プロセスされた抗原の製造
は、たとえばこれらの抗原が中和性及び保護性抗体の製
造のためにワクチン成分として有効的に使用され得るこ
とを確保することにおいて特に重要なものである。オー
ストラリア株（００２−７３）のＩＢＤＶのポリペプチ
ドが最近、特徴づけられて来た。先の国際特許ＰＣＴ／
ＡＵ８４／００２５６明細書において、３２Kd構造タン
パク質がＩＢＤＶの主免疫原であり、そしてインビトロ
でウィルスを中和し、そしてＩＢＤＶ感染から鶏を保護
する抗体を鶏中に生成することが開示されている。
【０００３】さらに研究は、ＩＢＤＶ株００２−７３の
ゲノムの特性及び分子クローニングを導びき、そしてこ
のゲノムは、それぞれおよそ３４００b.p.（ＭＷ ２．
０６×１０6 ）及び２９００b.p.（ＭＷ １．７６×１
０6 ）の長さである二重鎖（ｄｓ）ＲＮＡの２つのセグ
メントから成ることが示されている。インビトロでの翻
訳研究は、大ＲＮＡセグメントが３種の主構造タンパク
質をコードし、そして前に同定された３２Kd宿主保護性
抗原を含むことを示す。長い二重鎖ＲＮＡ分子のクロー
ニングのための新規方法が開発され、そしてＩＢＤＶの
完全なゲノムをクローン化するために使用されて来た。
クローン化されたｃＤＮＡ挿入体に関与する分子ハイブ
リダイゼーション及び発現研究は、３２Kd宿主保護性抗
原をコードするＩＢＤＶゲノムの領域の同定を可能にす
る。この抗原の全体又は一部をコードする、クローン化
された遺伝子は配列決定され、そしてＥ．コリ中に発現
される。さらに、発現されたポリペプチドの鶏における
免疫原性及びウィルス中和性抗体を産生するためのそれ
らの能力が試験されて来た。
ゲノムの特性及び分子クローニングを導びき、そしてこ
のゲノムは、それぞれおよそ３４００b.p.（ＭＷ ２．
０６×１０6 ）及び２９００b.p.（ＭＷ １．７６×１
０6 ）の長さである二重鎖（ｄｓ）ＲＮＡの２つのセグ
メントから成ることが示されている。インビトロでの翻
訳研究は、大ＲＮＡセグメントが３種の主構造タンパク
質をコードし、そして前に同定された３２Kd宿主保護性
抗原を含むことを示す。長い二重鎖ＲＮＡ分子のクロー
ニングのための新規方法が開発され、そしてＩＢＤＶの
完全なゲノムをクローン化するために使用されて来た。
クローン化されたｃＤＮＡ挿入体に関与する分子ハイブ
リダイゼーション及び発現研究は、３２Kd宿主保護性抗
原をコードするＩＢＤＶゲノムの領域の同定を可能にす
る。この抗原の全体又は一部をコードする、クローン化
された遺伝子は配列決定され、そしてＥ．コリ中に発現
される。さらに、発現されたポリペプチドの鶏における
免疫原性及びウィルス中和性抗体を産生するためのそれ
らの能力が試験されて来た。
【０００４】これに関しての初期研究は、融合タンパク
質の形でＩＢＤＶの３２Kd宿主保護性抗原の製造を導び
く。この試験結果は、その融合タンパク質がひじょうに
免疫原性であり、そして変性された３２Kdタンパク質を
認識する抗体を産生することを示す。しかしながら、こ
れらの抗体は、弱いＥＬＩＳＡ及び弱いウィルス中和性
力価を有する。その融合タンパク質は、ＭＡｂ １７−
８０（変性された３２Kdウィルスタンパク質を認識する
モノクローナル抗体）と強く反応するが、しかしウィル
ス中和性ＭＡｂ １７−８２とは弱く反応する。これら
の結果は、これらの遺伝的に構成された融合タンパク質
がウィルス中和性抗体及び保護性抗体の産生のために必
要な正しい立体構造を持たず、又は他のウィルスタンパ
ク質がエピトープを持たず又は完全なウィルスの中和に
関与されるエピトープの形成において重要でないことを
提案する。
質の形でＩＢＤＶの３２Kd宿主保護性抗原の製造を導び
く。この試験結果は、その融合タンパク質がひじょうに
免疫原性であり、そして変性された３２Kdタンパク質を
認識する抗体を産生することを示す。しかしながら、こ
れらの抗体は、弱いＥＬＩＳＡ及び弱いウィルス中和性
力価を有する。その融合タンパク質は、ＭＡｂ １７−
８０（変性された３２Kdウィルスタンパク質を認識する
モノクローナル抗体）と強く反応するが、しかしウィル
ス中和性ＭＡｂ １７−８２とは弱く反応する。これら
の結果は、これらの遺伝的に構成された融合タンパク質
がウィルス中和性抗体及び保護性抗体の産生のために必
要な正しい立体構造を持たず、又は他のウィルスタンパ
ク質がエピトープを持たず又は完全なウィルスの中和に
関与されるエピトープの形成において重要でないことを
提案する。
【０００５】さらに研究は、ＩＢＤＶの感染を中和する
モノクローナル抗体（ＭＡｂ １７−８２）が、５２Kd
前駆体タンパク質を遺伝子内にコードされたエピトープ
を認識することを示す。タンパク質はＩＢＤＶの４１Kd
及び３７Kd構造タンパク質にプロセスされる。ＭＡｂ
１７−８２と反応する、５２Kd領域から発現されたポリ
ペプチドは、３２Kd構造タンパク質（ＭＡｂ １７−８
０）に対して特異的なモノクローナル抗体によって認識
されるエピトープを含まない。
モノクローナル抗体（ＭＡｂ １７−８２）が、５２Kd
前駆体タンパク質を遺伝子内にコードされたエピトープ
を認識することを示す。タンパク質はＩＢＤＶの４１Kd
及び３７Kd構造タンパク質にプロセスされる。ＭＡｂ
１７−８２と反応する、５２Kd領域から発現されたポリ
ペプチドは、３２Kd構造タンパク質（ＭＡｂ １７−８
０）に対して特異的なモノクローナル抗体によって認識
されるエピトープを含まない。
【０００６】本発明の１つの観点によれば、ＩＢＤＶ
ＲＮＡのすべて又は一部と、特におよそ３４００b.p.の
ＩＢＤＶ ＲＮＡセグメントと実質的に対応するヌクレ
オチド配列を含んで成る組換え体ＤＮＡ分子を提供す
る。好ましくは、そのヌクレオチド配列は、ＩＢＤＶの
少なくとも１つの構造タンパク質のすべて又は一部をコ
ードする。本発明の１つの特定の観点においては、ＤＮ
Ａ分子は、ＩＢＤＶの３７Kd又は４１／３７Kd構造タン
パク質に実質的に対応する抗原性を示すポリペプチドと
して発現され得る。
ＲＮＡのすべて又は一部と、特におよそ３４００b.p.の
ＩＢＤＶ ＲＮＡセグメントと実質的に対応するヌクレ
オチド配列を含んで成る組換え体ＤＮＡ分子を提供す
る。好ましくは、そのヌクレオチド配列は、ＩＢＤＶの
少なくとも１つの構造タンパク質のすべて又は一部をコ
ードする。本発明の１つの特定の観点においては、ＤＮ
Ａ分子は、ＩＢＤＶの３７Kd又は４１／３７Kd構造タン
パク質に実質的に対応する抗原性を示すポリペプチドと
して発現され得る。
【０００７】本発明の観点の例示によって、ヌクレオチ
ド配列は、実質的に図１０〜１５に示されるような塩基
配列を有する少なくともその一部、又は前記塩基配列の
１又は複数の部分によって特徴づけられ得る。ＩＢＤＶ
ゲノムの大セグメントの完全なヌクレオチド配列及びそ
れに由来されたアミノ酸配列は、図１０〜１５に示され
る。
ド配列は、実質的に図１０〜１５に示されるような塩基
配列を有する少なくともその一部、又は前記塩基配列の
１又は複数の部分によって特徴づけられ得る。ＩＢＤＶ
ゲノムの大セグメントの完全なヌクレオチド配列及びそ
れに由来されたアミノ酸配列は、図１０〜１５に示され
る。
【０００８】ウサギ網状赤血球及び小麦生殖細胞フリー
システムにおけるＩＢＤＶ大セグメントのゲノムＲＮＡ
のインビトロでの翻訳は、ＩＢＤＶゲノムの大セグメン
トの３′末端で１つの停止コドンのみが存在するが、ウ
ィルスタンパク質にサイズ的に等しい不連続ポリペプチ
ドの合成を導びいた。そのウサギ網状赤血球及び小麦生
殖細胞フリーシステムは、ウィルスのポリタンパク質の
プロセスを助けるプロテアーゼを含むことができ、そし
てＩＢＤＶゲノムによってコードされたポリペプチドの
１つは、特定のプロテアーゼであると思われる。さらに
これに関する研究は、上記の融合タンパク質の代わりに
正しくプロセスされたＩＢＤＶの３２Kd又は４１／３７
Kdタンパク質の製造を可能にして来た。
システムにおけるＩＢＤＶ大セグメントのゲノムＲＮＡ
のインビトロでの翻訳は、ＩＢＤＶゲノムの大セグメン
トの３′末端で１つの停止コドンのみが存在するが、ウ
ィルスタンパク質にサイズ的に等しい不連続ポリペプチ
ドの合成を導びいた。そのウサギ網状赤血球及び小麦生
殖細胞フリーシステムは、ウィルスのポリタンパク質の
プロセスを助けるプロテアーゼを含むことができ、そし
てＩＢＤＶゲノムによってコードされたポリペプチドの
１つは、特定のプロテアーゼであると思われる。さらに
これに関する研究は、上記の融合タンパク質の代わりに
正しくプロセスされたＩＢＤＶの３２Kd又は４１／３７
Kdタンパク質の製造を可能にして来た。
【０００９】従って、本発明の特に好ましい態様におい
ては、ＩＢＤＶの３２Kd構造タンパク質又は５２Kd前駆
体タンパク質のすべて又は一部をコードするヌクレオチ
ド配列、及び前記３２Kd又は４１／３７Kd構造タンパク
質を正しくプロセスするためにさらにポリペプチド又は
タンパク質をコードする３４００b.p.セグメントのさら
に一部を含んで成る組換えＤＮＡ分子が提供される。こ
の分子の発現は、正しくプロセスされたタンパク質とし
て３２Kd又は４１／３７Kd構造タンパク質の発現を導び
く。そのような分子は、３２Kd構造タンパク質及び付加
のポリペプチド又はタンパク質の両者をコードすること
ができ、そして３２Kd構造タンパク質を正しくプロセス
するのに必要なプロテアーゼを含むことができる。
ては、ＩＢＤＶの３２Kd構造タンパク質又は５２Kd前駆
体タンパク質のすべて又は一部をコードするヌクレオチ
ド配列、及び前記３２Kd又は４１／３７Kd構造タンパク
質を正しくプロセスするためにさらにポリペプチド又は
タンパク質をコードする３４００b.p.セグメントのさら
に一部を含んで成る組換えＤＮＡ分子が提供される。こ
の分子の発現は、正しくプロセスされたタンパク質とし
て３２Kd又は４１／３７Kd構造タンパク質の発現を導び
く。そのような分子は、３２Kd構造タンパク質及び付加
のポリペプチド又はタンパク質の両者をコードすること
ができ、そして３２Kd構造タンパク質を正しくプロセス
するのに必要なプロテアーゼを含むことができる。
【００１０】本発明の観点のヌクレオチド配列は、天
然、合成又は半合成源から、又は天然の材料の操作によ
って得られることが認められるであろう；さらにこのヌ
クレオチド配列は天然に存在する配列であることがで
き、又はそれは、そのような配列を含有するＤＮＡ分子
がＩＢＤＶの１又は複数の構造タンパク質の抗原性を示
すポリペプチドとして発現され得るとすれば、突然変
異、たとえば単一又は複数の塩基の置換、欠失、挿入及
び逆位によって、そのような天然に存在する配列に関係
され得る。ヌクレオチド配列は、それに隣接して配置さ
れている発現制御配列、たとえばＩＢＤＶの核酸又は異
種源のいづれかに由来される制御配列を含むことができ
る。
然、合成又は半合成源から、又は天然の材料の操作によ
って得られることが認められるであろう；さらにこのヌ
クレオチド配列は天然に存在する配列であることがで
き、又はそれは、そのような配列を含有するＤＮＡ分子
がＩＢＤＶの１又は複数の構造タンパク質の抗原性を示
すポリペプチドとして発現され得るとすれば、突然変
異、たとえば単一又は複数の塩基の置換、欠失、挿入及
び逆位によって、そのような天然に存在する配列に関係
され得る。ヌクレオチド配列は、それに隣接して配置さ
れている発現制御配列、たとえばＩＢＤＶの核酸又は異
種源のいづれかに由来される制御配列を含むことができ
る。
【００１１】本発明はまた、プロモーター配列及びイニ
シエター配列を含む発現制御配列、及びＩＢＤＶの少な
くとも１つの構造タンパク質のすべて又は一部をコード
するヌクレオチド配列を含んで成る組換え体ＤＮＡ分子
を提供する。さらにもう１つの観点において、本発明
は、プロモーター配列及びイニシエター配列を有する発
現制御配列を含んで成る、ＩＢＤＶの少なくとも１つの
構造タンパク質のすべて又は一部を発現することができ
る組換え体ＤＮＡクローニングビークル、及びＩＢＤＶ
の少なくとも１つの構造タンパク質のすべて又は一部を
コードするヌクレオチド配列を提供する。さらに観点に
おいては、上記のような組換え体ＤＮＡクローニングビ
ークル及び／又は組換え体ＤＮＡ分子を含む宿主が提供
される。
シエター配列を含む発現制御配列、及びＩＢＤＶの少な
くとも１つの構造タンパク質のすべて又は一部をコード
するヌクレオチド配列を含んで成る組換え体ＤＮＡ分子
を提供する。さらにもう１つの観点において、本発明
は、プロモーター配列及びイニシエター配列を有する発
現制御配列を含んで成る、ＩＢＤＶの少なくとも１つの
構造タンパク質のすべて又は一部を発現することができ
る組換え体ＤＮＡクローニングビークル、及びＩＢＤＶ
の少なくとも１つの構造タンパク質のすべて又は一部を
コードするヌクレオチド配列を提供する。さらに観点に
おいては、上記のような組換え体ＤＮＡクローニングビ
ークル及び／又は組換え体ＤＮＡ分子を含む宿主が提供
される。
【００１２】さらにもう１つの観点においては、上記の
ようにして組換え体ＤＮＡクローニングビークルにより
形質転換又は感染された宿主細胞によって産生され得
る、ＩＢＤＶ抗原性を示すポリペプチドが提供される。
そのように発現されたポリペプチドは、図１０〜１５に
実質的に示されるような塩基配列に由来するＩＢＤＶの
少なくとも１つの構造タンパク質のすべて又は一部、又
は前記配列の１又は複数の部分を含むことができる。そ
のようなポリペプチドは、宿主細胞から単離され、そし
て必要なら、宿主細胞又は他のタンパク質を実質的に含
まないポリペプチドを提供するために精製され得る。発
現されたポリペプチドが融合ポリペプチドの形で存在す
る場合、それらは“外来性”ペプチド部分を除去するた
めに切断され得る。
ようにして組換え体ＤＮＡクローニングビークルにより
形質転換又は感染された宿主細胞によって産生され得
る、ＩＢＤＶ抗原性を示すポリペプチドが提供される。
そのように発現されたポリペプチドは、図１０〜１５に
実質的に示されるような塩基配列に由来するＩＢＤＶの
少なくとも１つの構造タンパク質のすべて又は一部、又
は前記配列の１又は複数の部分を含むことができる。そ
のようなポリペプチドは、宿主細胞から単離され、そし
て必要なら、宿主細胞又は他のタンパク質を実質的に含
まないポリペプチドを提供するために精製され得る。発
現されたポリペプチドが融合ポリペプチドの形で存在す
る場合、それらは“外来性”ペプチド部分を除去するた
めに切断され得る。
【００１３】上記のような発現されたポリペプチドは、
図１０〜１５に示されたヌクレオチド配列の一部のパー
ミューテーション及び組合せによって構成され得る。本
発明はまた、ＩＢＤＶの少なくとも１つの構造タンパク
質のすべて又は一部、特に３２Kd及び／又は４１／３７
Kd構造タンパク質の抗原性を示す合成ペプチド又はポリ
ペプチドに及ぶ。
図１０〜１５に示されたヌクレオチド配列の一部のパー
ミューテーション及び組合せによって構成され得る。本
発明はまた、ＩＢＤＶの少なくとも１つの構造タンパク
質のすべて又は一部、特に３２Kd及び／又は４１／３７
Kd構造タンパク質の抗原性を示す合成ペプチド又はポリ
ペプチドに及ぶ。
【００１４】本明細書に使用される場合、用語“合成的
な”とは、ペプチド又はポリペプチドが、化学的及び／
又は生物学的手段、たとえば化学的合成によって、又は
生物学的合成を導びく組換えＤＮＡ技法によって製造さ
れることを意味する。もちろん、そのようなポリペプチ
ドは、正しくプロセスされ、そして折りたたまれたタン
パク質の、宿主細胞による直接的な発現によって、又は
当業界で良く知られた方法による、宿主細胞により産生
された融合ポリペプチドの切断及び宿主細胞又はクロー
ニングビークルのＤＮＡによってコードされた付加ポリ
ペプチドから目的とするポリペプチドの分離によって得
られる。他方、いったんその目的とするポリペプチドの
アミノ酸配列がたとえばその目的とするポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列の決定によって確立されれ
ば、そのポリペプチドは、たとえば良く知られたMerrif
ieldの固相合成法〔Marglin and Merrifield, (1970)〕
によって合成的に製造され得る。
な”とは、ペプチド又はポリペプチドが、化学的及び／
又は生物学的手段、たとえば化学的合成によって、又は
生物学的合成を導びく組換えＤＮＡ技法によって製造さ
れることを意味する。もちろん、そのようなポリペプチ
ドは、正しくプロセスされ、そして折りたたまれたタン
パク質の、宿主細胞による直接的な発現によって、又は
当業界で良く知られた方法による、宿主細胞により産生
された融合ポリペプチドの切断及び宿主細胞又はクロー
ニングビークルのＤＮＡによってコードされた付加ポリ
ペプチドから目的とするポリペプチドの分離によって得
られる。他方、いったんその目的とするポリペプチドの
アミノ酸配列がたとえばその目的とするポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列の決定によって確立されれ
ば、そのポリペプチドは、たとえば良く知られたMerrif
ieldの固相合成法〔Marglin and Merrifield, (1970)〕
によって合成的に製造され得る。
【００１５】ＩＢＤＶの構造タンパク質の抗原性特性を
示すポリペプチドは、血清学的診断、及び良く知られた
当業界のワクチン製造法による、ＩＢＤＶに対する単価
又は多価ワクチンの製造に利用されるであろう。さら
に、そのようなワクチン及びその使用法並びに定量及び
定性分析が国際特許ＰＣＴ／ＡＵ８４／００２５６明細
書に詳しく開示されている。次の詳細な説明は、ＩＢＤ
Ｖ株００２−７３のゲノムの特性及び分子クローニング
に関する。添付図面において、図１は、ウサギの網状赤
血球溶解物中に合成されたＩＢＤＶ ＲＮＡ翻訳生成物
の電気泳動、特に翻訳生成物のＭＷ及びＩＢＤＶ ＲＮ
Ａセグメントのコード割当て（ｉ）ＭＷ標準；（ii）画
分化されていないＩＢＤＶ ＲＮＡ；（iii ）ＩＢＤＶ
ＲＮＡの大セグメント；（iv）ＩＢＤＶ ＲＮＡの小
セグメントを示す。
示すポリペプチドは、血清学的診断、及び良く知られた
当業界のワクチン製造法による、ＩＢＤＶに対する単価
又は多価ワクチンの製造に利用されるであろう。さら
に、そのようなワクチン及びその使用法並びに定量及び
定性分析が国際特許ＰＣＴ／ＡＵ８４／００２５６明細
書に詳しく開示されている。次の詳細な説明は、ＩＢＤ
Ｖ株００２−７３のゲノムの特性及び分子クローニング
に関する。添付図面において、図１は、ウサギの網状赤
血球溶解物中に合成されたＩＢＤＶ ＲＮＡ翻訳生成物
の電気泳動、特に翻訳生成物のＭＷ及びＩＢＤＶ ＲＮ
Ａセグメントのコード割当て（ｉ）ＭＷ標準；（ii）画
分化されていないＩＢＤＶ ＲＮＡ；（iii ）ＩＢＤＶ
ＲＮＡの大セグメント；（iv）ＩＢＤＶ ＲＮＡの小
セグメントを示す。
【００１６】図２は、ＩＢＤＶの完全な大ＲＮＡセグメ
ントを包含するクローン化された挿入体のマップであ
る。材料及び方法 材料及びそれらの源は、ＤＮＡポリマラーゼ１のクレノ
ウフラグメント、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＤＮアーゼ１及び
ＲＮアーゼＡ（Boehringer）；ウサギ網状赤血球溶解
物、〔α−32Ｐ〕ＡＴＰ，〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ、
〔35Ｓ〕メチオニン及びＰｓｔＩ（Amerisham ）；ＲＮ
アーゼ不含スクロース、ＤＮＡポリマラーゼ１及び小麦
生殖細胞溶解物（Bethesda Research Laboratories）；
ＲＮアーゼ不含プロナーゼ（Calbiochem）；アガロース
及びリゾチーム（Sigma ）；低融点のアガロース及びＳ
ＤＳ（Bio-Rad ）、ジエチルピロカルボネート及びアク
リジンオレンジ（Merck ）；ニトロセルロースフィルタ
ー及びＮＡ４５メンブランフィルター（Schleicher and
Schuell）；逆転写酵素（ＲＴアーゼ）（Life Science
s Incl, st, Petersburg, Fla.）；ターミナルトランス
フェラーゼ（Ratliffe, LosAlamos, N.M.）；ＲＮアシ
ン（Promega Biotech, Madison, Wisc. ）である。
ントを包含するクローン化された挿入体のマップであ
る。材料及び方法 材料及びそれらの源は、ＤＮＡポリマラーゼ１のクレノ
ウフラグメント、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＤＮアーゼ１及び
ＲＮアーゼＡ（Boehringer）；ウサギ網状赤血球溶解
物、〔α−32Ｐ〕ＡＴＰ，〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ、
〔35Ｓ〕メチオニン及びＰｓｔＩ（Amerisham ）；ＲＮ
アーゼ不含スクロース、ＤＮＡポリマラーゼ１及び小麦
生殖細胞溶解物（Bethesda Research Laboratories）；
ＲＮアーゼ不含プロナーゼ（Calbiochem）；アガロース
及びリゾチーム（Sigma ）；低融点のアガロース及びＳ
ＤＳ（Bio-Rad ）、ジエチルピロカルボネート及びアク
リジンオレンジ（Merck ）；ニトロセルロースフィルタ
ー及びＮＡ４５メンブランフィルター（Schleicher and
Schuell）；逆転写酵素（ＲＴアーゼ）（Life Science
s Incl, st, Petersburg, Fla.）；ターミナルトランス
フェラーゼ（Ratliffe, LosAlamos, N.M.）；ＲＮアシ
ン（Promega Biotech, Madison, Wisc. ）である。
【００１７】ランドムプライマーを、Taylorなど., (19
76) によって記載された方法によって羊ＤＮＡから調製
した。ＵＫウシのロタウィルス二重鎖ＲＮＡが、Dr.M.D
yall-Smithによって調製された。ウィルス：ＩＢＤＶ株
００２−７３は、オーストラアにおいて、Firth (1974)
によって市販の鶏群に最初に報告され、そしてCentral
Veterinary Laboratory, Weybridge, U.K でＩＢＤＶと
して確認された。そのウィルスは、４〜６週のSPF Whit
e Leghorn 鶏に日常、担持され、感染後３日で滑液包か
ら単離され、そしてスクロース及びＣｓＣｌグラジェン
トに基づいて連続的分別によって精製された。
76) によって記載された方法によって羊ＤＮＡから調製
した。ＵＫウシのロタウィルス二重鎖ＲＮＡが、Dr.M.D
yall-Smithによって調製された。ウィルス：ＩＢＤＶ株
００２−７３は、オーストラアにおいて、Firth (1974)
によって市販の鶏群に最初に報告され、そしてCentral
Veterinary Laboratory, Weybridge, U.K でＩＢＤＶと
して確認された。そのウィルスは、４〜６週のSPF Whit
e Leghorn 鶏に日常、担持され、感染後３日で滑液包か
ら単離され、そしてスクロース及びＣｓＣｌグラジェン
トに基づいて連続的分別によって精製された。
【００１８】ＩＢＤＶ ＲＮＡの単離及び精製
新たに感染された滑液包のホモジネートを、０℃で１５
分間、１７，０００ｇで回転せしめた。透きとおった上
清液を、２mlスクロースクッション（４０％）の上層に
注ぎ、そしてそのウィルス粒子を、２℃で２．５時間、
２２，０００rpm でＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ４０ローター
でクッションを介してペレット化した。そのペレット
を、１０mMのＴｒｉｓ．（pH７．５）、１０mMのＮａＣ
ｌ、１０mMのＥＤＴＡ、０．２％のＳＤＳ及び０．１％
のジエチルピロカルボネート中に懸濁し、そして３７℃
で１時間、ＲＮアーゼ不含プロナーゼ（１mg／ml）によ
り消化した。
分間、１７，０００ｇで回転せしめた。透きとおった上
清液を、２mlスクロースクッション（４０％）の上層に
注ぎ、そしてそのウィルス粒子を、２℃で２．５時間、
２２，０００rpm でＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ４０ローター
でクッションを介してペレット化した。そのペレット
を、１０mMのＴｒｉｓ．（pH７．５）、１０mMのＮａＣ
ｌ、１０mMのＥＤＴＡ、０．２％のＳＤＳ及び０．１％
のジエチルピロカルボネート中に懸濁し、そして３７℃
で１時間、ＲＮアーゼ不含プロナーゼ（１mg／ml）によ
り消化した。
【００１９】その溶液を、フェノール及びクロロホルム
（１：１）により抽出し、そして水性相中のＲＮＡを、
エタノールによる沈殿によって回収した。その二重鎖ウ
ィルスＲＮＡを、示差塩沈殿法（differential salt pr
ecipitation)(Diaz-Ruiz andKaper, 1978）によって、
鶏の細胞性ＲＮＡから精製した。個々のＲＮＡ又はＤＮ
Ａセグメントを、ＮＡ４５メンブランフィルター上で電
気泳動し、次に７０℃で１ＭのＮａＣｌ及び０．０５Ｍ
のアルギニンにより溶離することによってアガロースゲ
ルから単離した。他方、ＲＮＡバンドを、低融点のアガ
ローススラブゲルから切断し、そして０．５％ ＳＤＳ
を含む低塩緩衝液５モル中に溶融（７０℃）した。その
溶液を、フェノールにより抽出し、そしてアガロース相
中のＲＮＡを、エタノールにより沈殿せしめた。
（１：１）により抽出し、そして水性相中のＲＮＡを、
エタノールによる沈殿によって回収した。その二重鎖ウ
ィルスＲＮＡを、示差塩沈殿法（differential salt pr
ecipitation)(Diaz-Ruiz andKaper, 1978）によって、
鶏の細胞性ＲＮＡから精製した。個々のＲＮＡ又はＤＮ
Ａセグメントを、ＮＡ４５メンブランフィルター上で電
気泳動し、次に７０℃で１ＭのＮａＣｌ及び０．０５Ｍ
のアルギニンにより溶離することによってアガロースゲ
ルから単離した。他方、ＲＮＡバンドを、低融点のアガ
ローススラブゲルから切断し、そして０．５％ ＳＤＳ
を含む低塩緩衝液５モル中に溶融（７０℃）した。その
溶液を、フェノールにより抽出し、そしてアガロース相
中のＲＮＡを、エタノールにより沈殿せしめた。
【００２０】ハイブリダイゼーション プローブ
温和なアルカリ消化に続いて、〔ｒ−32Ｐ〕により、Ｉ
ＢＤＶ ＲＮＡをラベルした（Goldbachなど．1978）。
ｃＤＮＡプローブを、ＲＴアーゼの存在下でｃＤＮＡ合
成を開始するために、ランドムプライマーを用いて、変
性された二重鎖ＲＮＡから調製した。次に、ＲＮＡ鋳型
を、ＮａＯＨによる消化によって破壊した。クローン化
されたＤＮＡフラグメントのニック翻訳を、Rigby など
（1977）によって記載されているようにして本質的に行
なった。すべての放射能によりラベルされたプローブ
を、室温で２Ｍの酢酸アンモニウム及びイソプロパノー
ルからの沈殿（３ｘ）により、反応しなかったアイソタ
イプから精製した。
ＢＤＶ ＲＮＡをラベルした（Goldbachなど．1978）。
ｃＤＮＡプローブを、ＲＴアーゼの存在下でｃＤＮＡ合
成を開始するために、ランドムプライマーを用いて、変
性された二重鎖ＲＮＡから調製した。次に、ＲＮＡ鋳型
を、ＮａＯＨによる消化によって破壊した。クローン化
されたＤＮＡフラグメントのニック翻訳を、Rigby など
（1977）によって記載されているようにして本質的に行
なった。すべての放射能によりラベルされたプローブ
を、室温で２Ｍの酢酸アンモニウム及びイソプロパノー
ルからの沈殿（３ｘ）により、反応しなかったアイソタ
イプから精製した。
【００２１】インビトロでのＩＢＤＶ ＲＮＡの翻訳
１０mMのリン酸（pH６．８）３μｌ中ＩＢＤＶ ＲＮＡ
（１〜２μｇ）を、２分間１００℃で加熱し、そしてす
ぐに、ドライアイス／エタノール中で冷却した。次に、
４０mMの水酸化メチル水銀１μｌを添加し、そしてその
混合物を室温で１０分間、放置した。７００mMのβ−メ
ルカプトエタノール１μｌ及びＲＮアジン１μｌ（２５
ユニット）を添加し、そしてその溶液を室温でさらに５
分間、インキュベートした。アリコート（１μｌ）を、
〔35Ｓ〕メチオニン（乾燥した）５μCi及びウサギ網状
赤血球溶解物３０μｌを含む管に移し、そしてその溶液
を３０℃で１時間、インキュベートした。
（１〜２μｇ）を、２分間１００℃で加熱し、そしてす
ぐに、ドライアイス／エタノール中で冷却した。次に、
４０mMの水酸化メチル水銀１μｌを添加し、そしてその
混合物を室温で１０分間、放置した。７００mMのβ−メ
ルカプトエタノール１μｌ及びＲＮアジン１μｌ（２５
ユニット）を添加し、そしてその溶液を室温でさらに５
分間、インキュベートした。アリコート（１μｌ）を、
〔35Ｓ〕メチオニン（乾燥した）５μCi及びウサギ網状
赤血球溶解物３０μｌを含む管に移し、そしてその溶液
を３０℃で１時間、インキュベートした。
【００２２】その反応混合物を、引き続けて鶏の抗血
清、ウサギ抗−鶏ＩｇＧ及びプロティンＡ−セファロー
ス（Pharmacia ）と反応せしめた。そのプロティンＡ−
セファロース−抗原−抗体複合体を０．１％ ＮＰ−４
０を含むリン酸緩衝溶液により広範囲にわたって洗浄
し、そして次に２％ ＳＤＳを含む緩衝液中で煮沸し
た。そのプロティンＡ−セファロースを回転沈殿し、そ
して上清液中の翻訳されたタンパク質をポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（１２．５％ゲル）によって分析し
た。次にそのゲルを、ＡＭＰＬＩＦＹ（Amersham）と反
応せしめ、乾燥せしめ、そしてスクリーン（Dupont Cro
nex Lightening Plus AA）を強化することによりフジＲ
Ｘフィルムに露光した。
清、ウサギ抗−鶏ＩｇＧ及びプロティンＡ−セファロー
ス（Pharmacia ）と反応せしめた。そのプロティンＡ−
セファロース−抗原−抗体複合体を０．１％ ＮＰ−４
０を含むリン酸緩衝溶液により広範囲にわたって洗浄
し、そして次に２％ ＳＤＳを含む緩衝液中で煮沸し
た。そのプロティンＡ−セファロースを回転沈殿し、そ
して上清液中の翻訳されたタンパク質をポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（１２．５％ゲル）によって分析し
た。次にそのゲルを、ＡＭＰＬＩＦＹ（Amersham）と反
応せしめ、乾燥せしめ、そしてスクリーン（Dupont Cro
nex Lightening Plus AA）を強化することによりフジＲ
Ｘフィルムに露光した。
【００２３】二重鎖ＲＮＡから二重鎖ｃＤＮＡの合成
好ましくは５mMのリン酸緩衝液（pH６．８）９μｌ中Ｉ
ＢＤＶ ＲＮＡ ５μｇを、２分間１００℃で加熱し、
そして次にすぐに凍結せしめた。そのＲＮＡが融解した
後、１００mMの水酸化メチル水銀１μｌを添加し、そし
てその混合物を室温で１０分間放置した。次に、ＲＮア
ジン２μｌ（５０ユニット）及び７００mMのβ−メルカ
プトエタノール４μｌを添加し、そしてその混合物を室
温でさらに５分間放置した。
ＢＤＶ ＲＮＡ ５μｇを、２分間１００℃で加熱し、
そして次にすぐに凍結せしめた。そのＲＮＡが融解した
後、１００mMの水酸化メチル水銀１μｌを添加し、そし
てその混合物を室温で１０分間放置した。次に、ＲＮア
ジン２μｌ（５０ユニット）及び７００mMのβ−メルカ
プトエタノール４μｌを添加し、そしてその混合物を室
温でさらに５分間放置した。
【００２４】次に、煮沸及びすぐに冷却することによっ
て別々に変性されたランドムプライマー（５０μｇ）
を、その混合物に添加し、ｃＤＮＡ合成を始めた。その
混合物（１００μｌの最終体積）は、ＲＴアーゼ（５０
ユニット）及びｃＤＮＡ合成のために必要な他の反応体
を含んだ。４２℃で２時間のインキュベーションの後、
ＲＮＡ鋳型をＮａＯＨによる消化によって破壊し、そし
てｃＤＮＡをゲル濾過によって精製した。相補的ｃＤＮ
Ａフラグメントを、９０℃で３分間の初期加熱の後、６
５℃で２時間、０．３ＭのＮａＣｌ中でアニールした。
次に、その溶液を、１時間にわたって室温にしだいに冷
却した。そのアニールされたｃＤＮＡセグメントを、修
復し、そして鎖をＤＮＡポリマラーゼ１により延長し
た。その二重鎖ｃＤＮＡ鎖を、さらにＲＴアーゼにより
延長し、ＤＮＡリガーゼ及びＳ１ヌクレアーゼにより処
理し、そして最後にゲル濾過によって精製した。
て別々に変性されたランドムプライマー（５０μｇ）
を、その混合物に添加し、ｃＤＮＡ合成を始めた。その
混合物（１００μｌの最終体積）は、ＲＴアーゼ（５０
ユニット）及びｃＤＮＡ合成のために必要な他の反応体
を含んだ。４２℃で２時間のインキュベーションの後、
ＲＮＡ鋳型をＮａＯＨによる消化によって破壊し、そし
てｃＤＮＡをゲル濾過によって精製した。相補的ｃＤＮ
Ａフラグメントを、９０℃で３分間の初期加熱の後、６
５℃で２時間、０．３ＭのＮａＣｌ中でアニールした。
次に、その溶液を、１時間にわたって室温にしだいに冷
却した。そのアニールされたｃＤＮＡセグメントを、修
復し、そして鎖をＤＮＡポリマラーゼ１により延長し
た。その二重鎖ｃＤＮＡ鎖を、さらにＲＴアーゼにより
延長し、ＤＮＡリガーゼ及びＳ１ヌクレアーゼにより処
理し、そして最後にゲル濾過によって精製した。
【００２５】ＩＢＤＶ二重鎖ｃＤＮＡのクローニング
二重鎖ｃＤＮＡをターミナルトランスフェラーゼにより
Ｃ末端化し、Ｇ−末端化された、Ｐｓｔ−切断のｐＢＲ
３２２（New England Nuclear ）にアニールし、そして
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＲ１細胞中にク
ローン化した。その組換え体コロニィーを、ＩＢＤＶ
ＲＮＡセグメントから製造された放射性プローブと共に
ハイブリダイズし、そしてオートラジオグラフ処理し
た。Australian Recombinant DNA Monitoring Committe
e によって挙げられた生物学的汚染レベルを使用した。
Ｃ末端化し、Ｇ−末端化された、Ｐｓｔ−切断のｐＢＲ
３２２（New England Nuclear ）にアニールし、そして
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＲ１細胞中にク
ローン化した。その組換え体コロニィーを、ＩＢＤＶ
ＲＮＡセグメントから製造された放射性プローブと共に
ハイブリダイズし、そしてオートラジオグラフ処理し
た。Australian Recombinant DNA Monitoring Committe
e によって挙げられた生物学的汚染レベルを使用した。
【００２６】プラスミドＤＮＡの単離
プラスミドＤＮＡを、Birnboim及びDoly（1979）によっ
て記載された方法のIsh-Horowicz及びBurke （1981）の
変法、及びさらに次の変法によって本質的に単離した。
ＲＮアーゼ消化を、リゾチーム処理により同時に行な
い、そしてそのプラスミドＤＮＡを、ポリエチレングリ
コールからの沈殿によるＲＮＡ分解生成物から精製した
（６．５％ ＰＥＧ、０．８ＭのＮａＣｌ、０℃、１時
間）。
て記載された方法のIsh-Horowicz及びBurke （1981）の
変法、及びさらに次の変法によって本質的に単離した。
ＲＮアーゼ消化を、リゾチーム処理により同時に行な
い、そしてそのプラスミドＤＮＡを、ポリエチレングリ
コールからの沈殿によるＲＮＡ分解生成物から精製した
（６．５％ ＰＥＧ、０．８ＭのＮａＣｌ、０℃、１時
間）。
【００２７】コロニィーハイブリダイゼーション
組換え体コロニィーを、Grunstein 及びHogness （197
5）によって記載されたようにして放射性プローブと共
にハイブリダイズした。その溶液をプレハイブリダイゼ
ーションのために使用し、そしてハイブリダイゼーショ
ンは、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０mMのＨＥＰＥＳ
（pH７．０）、０．１％ ＳＤＳ、３×ＳＳＣ、１０μ
ｇ／mlのＥ．コリｔＲＮＡ及び１８μｇ／mlの、音波処
理され、そして変性されたニシンの精子ＤＮＡを含ん
だ。フィルターを、６５℃で２時間、プレハイブリダイ
ズし、そして次に、６５℃で１６〜２０時間、放射性プ
ローブと共にハイブリダイズした。そのフィルターを、
６５℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにより４×
３０分間、洗浄し、そして次に、フジＲＸフィルムを用
い、そしてスクリーンを強化することによりオートラジ
オグラフ処理した。
5）によって記載されたようにして放射性プローブと共
にハイブリダイズした。その溶液をプレハイブリダイゼ
ーションのために使用し、そしてハイブリダイゼーショ
ンは、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０mMのＨＥＰＥＳ
（pH７．０）、０．１％ ＳＤＳ、３×ＳＳＣ、１０μ
ｇ／mlのＥ．コリｔＲＮＡ及び１８μｇ／mlの、音波処
理され、そして変性されたニシンの精子ＤＮＡを含ん
だ。フィルターを、６５℃で２時間、プレハイブリダイ
ズし、そして次に、６５℃で１６〜２０時間、放射性プ
ローブと共にハイブリダイズした。そのフィルターを、
６５℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにより４×
３０分間、洗浄し、そして次に、フジＲＸフィルムを用
い、そしてスクリーンを強化することによりオートラジ
オグラフ処理した。
【００２８】結果
１．ＲＮＡの単離及び精製。上記のＲＮＡ単離法は、簡
単且つ速く、そして良好な品質のＲＮＡの高い収率をも
たらす。低速度回転の滑液包ホモジネート、次に４０％
スクロースクッションを通してのウィルス粒子の沈降
は、実質的にすべての細胞性ＤＮＡ及び９０％以上の細
胞性ＲＮＡの除去をもたらした。プロナーゼによる消化
及びフェノール及びクロロホルムによる抽出の後、合計
ＲＮＡを、示差塩沈殿法（Diaz-Ruiz and Kaper, 1978
）によって分別した。細胞性単離ＲＮＡを、２ＭのＬ
ｉＣｌから沈殿せしめ、そして上清液中ウィルスの二重
鎖ＲＮＡを、４ＭのＬｉＣｌからの沈殿による低ＭＷ汚
染物及びいづれかの汚染性ＤＮＡからさらに精製した。
単且つ速く、そして良好な品質のＲＮＡの高い収率をも
たらす。低速度回転の滑液包ホモジネート、次に４０％
スクロースクッションを通してのウィルス粒子の沈降
は、実質的にすべての細胞性ＤＮＡ及び９０％以上の細
胞性ＲＮＡの除去をもたらした。プロナーゼによる消化
及びフェノール及びクロロホルムによる抽出の後、合計
ＲＮＡを、示差塩沈殿法（Diaz-Ruiz and Kaper, 1978
）によって分別した。細胞性単離ＲＮＡを、２ＭのＬ
ｉＣｌから沈殿せしめ、そして上清液中ウィルスの二重
鎖ＲＮＡを、４ＭのＬｉＣｌからの沈殿による低ＭＷ汚
染物及びいづれかの汚染性ＤＮＡからさらに精製した。
【００２９】２．ウィルスゲノムの物理−化学的特性。
オーストラリアン単離物ＩＢＤＶ００２−７３のＲＮＡ
が二重鎖であるかどうかを決定するために、単一鎖の細
胞性ＲＮＡから完全に精製されなかったウィルスＲＮＡ
を、非変性条件下で電気泳動し、アクリジンオレンジに
より染色し、そしてその核酸バンドをｕｖトランスイル
ミネーター上で目に見えるようにした。ＤＮＡ標準、二
重鎖ＵＫウシロタウィルスＲＮＡセグメント及びゲルの
上層部中のＩＢＤＶ ＲＮＡの２つのセグメントは、二
重鎖核酸を予期する明るい緑色バンドらしく（Lerman,
1963）、ところがゲルの低層部近くの単一鎖細胞性ＲＮ
Ａは、明るい赤色のようであった（Blake and Reacock
e, 1986）。
オーストラリアン単離物ＩＢＤＶ００２−７３のＲＮＡ
が二重鎖であるかどうかを決定するために、単一鎖の細
胞性ＲＮＡから完全に精製されなかったウィルスＲＮＡ
を、非変性条件下で電気泳動し、アクリジンオレンジに
より染色し、そしてその核酸バンドをｕｖトランスイル
ミネーター上で目に見えるようにした。ＤＮＡ標準、二
重鎖ＵＫウシロタウィルスＲＮＡセグメント及びゲルの
上層部中のＩＢＤＶ ＲＮＡの２つのセグメントは、二
重鎖核酸を予期する明るい緑色バンドらしく（Lerman,
1963）、ところがゲルの低層部近くの単一鎖細胞性ＲＮ
Ａは、明るい赤色のようであった（Blake and Reacock
e, 1986）。
【００３０】さらに、２８Ｓ及び１８ＳのｒＲＮＡを完
全に破壊するＲＮアーゼＡ消化条件下で、ＩＢＤＶ Ｒ
ＮＡの２つのセグメントは、非変性条件下で電気泳動さ
れる場合、そのまま残った。従って、ＩＢＤＶ株００２
−７３のゲノムは、菌株Ｃｕ−１（Mullerなど、1979）
及びCentral Veterinary Laboratories, Weybridge,U.
K.で単離された菌株（Todd and McNulty, 1979）につい
ての場合に示されているように二重鎖ＲＮＡの２つのセ
グメントから成る。
全に破壊するＲＮアーゼＡ消化条件下で、ＩＢＤＶ Ｒ
ＮＡの２つのセグメントは、非変性条件下で電気泳動さ
れる場合、そのまま残った。従って、ＩＢＤＶ株００２
−７３のゲノムは、菌株Ｃｕ−１（Mullerなど、1979）
及びCentral Veterinary Laboratories, Weybridge,U.
K.で単離された菌株（Todd and McNulty, 1979）につい
ての場合に示されているように二重鎖ＲＮＡの２つのセ
グメントから成る。
【００３１】非変性条件下で電気泳動される場合、ＩＢ
ＤＶ ＲＮＡの２つのセグメントは、ＤＮＡ標準と比較
して、それぞれ３８２５及び３４００b.p.であると思わ
れる。これらの値は、２つのセグメントのために、それ
ぞれ２．５２×１０6 及び２．２×１０6 のＭＷに対応
する。非変性条件下でＵＫウシロータウィルスの二重鎖
セグメントと比較する場合〔このセグメントのサイズは
電子顕微鏡によって得られた（Rixon など、1984）〕、
ＩＢＤＶ二重鎖ＲＮＡの２つのセグメントは、それぞれ
約３４００b.p.（ＭＷ ２．０６×１０6 ）及び２９０
０b.p.（ＭＷ１．７６×１０6 ）であると思われる。
ＤＶ ＲＮＡの２つのセグメントは、ＤＮＡ標準と比較
して、それぞれ３８２５及び３４００b.p.であると思わ
れる。これらの値は、２つのセグメントのために、それ
ぞれ２．５２×１０6 及び２．２×１０6 のＭＷに対応
する。非変性条件下でＵＫウシロータウィルスの二重鎖
セグメントと比較する場合〔このセグメントのサイズは
電子顕微鏡によって得られた（Rixon など、1984）〕、
ＩＢＤＶ二重鎖ＲＮＡの２つのセグメントは、それぞれ
約３４００b.p.（ＭＷ ２．０６×１０6 ）及び２９０
０b.p.（ＭＷ１．７６×１０6 ）であると思われる。
【００３２】３．インビトロでのＩＢＤＶ ＲＮＡの翻
訳。インビトロでのタンパク質合成のために、二重鎖Ｒ
ＮＡを、広範囲にわたって変性すべきである。１００℃
での加熱の後、すぐにドライアイス／エタノール中で冷
却することは、十分でなく、そして９０％ジエチルスル
ホキシド中でそのＲＮＡを加熱することは、矛盾の多い
結果を与えた。最良の結果は、その加熱変性されたＲＮ
Ａが１０mMの水酸化メチル水銀中でさらに変性された場
合に得られた。これらの処置の後でさえ、ＴＣＡ−沈殿
性材料中に導入された放射能の量は、ロータウィルスの
単鎖ＲＮＡ又はグロビンｍＲＮＡの類似量を翻訳する場
合に得られた放射能の１０〜２０％のみであった。
訳。インビトロでのタンパク質合成のために、二重鎖Ｒ
ＮＡを、広範囲にわたって変性すべきである。１００℃
での加熱の後、すぐにドライアイス／エタノール中で冷
却することは、十分でなく、そして９０％ジエチルスル
ホキシド中でそのＲＮＡを加熱することは、矛盾の多い
結果を与えた。最良の結果は、その加熱変性されたＲＮ
Ａが１０mMの水酸化メチル水銀中でさらに変性された場
合に得られた。これらの処置の後でさえ、ＴＣＡ−沈殿
性材料中に導入された放射能の量は、ロータウィルスの
単鎖ＲＮＡ又はグロビンｍＲＮＡの類似量を翻訳する場
合に得られた放射能の１０〜２０％のみであった。
【００３３】翻訳生成物の免疫沈殿法は、合計のＩＢＤ
Ｖ ＲＮＡがおよそ９０Kd，５２Kd，４１Kd，３２Kd，
１８Kd及び１６KdのＭＷの６個のポリペプチド〔図１、
（ii）〕をコードすることを示す。ゲル電気泳動によっ
て精製された大ＲＮＡセグメントは、９０−Kdポリペプ
チド〔図１、（iii ）〕を除くすべての翻訳生成物を生
成する。ゲル電気泳動によって完全には精製され得なか
った小ＲＮＡセグメントがインビトロで翻訳される場
合、すべての微量翻訳生成物が見られるが、しかしその
９０−Kdタンパク質は、最とも顕著なタンパク質である
〔図１、（iv）〕。この９０−Kdタンパク質は、大ＲＮ
Ａセグメントの翻訳生成物の間で、一貫して不在である
ので、９０−Kdタンパク質を除くすべてのＩＢＤＶタン
パク質は、大ＲＮＡセグメントによってコードされてい
ると思われる。
Ｖ ＲＮＡがおよそ９０Kd，５２Kd，４１Kd，３２Kd，
１８Kd及び１６KdのＭＷの６個のポリペプチド〔図１、
（ii）〕をコードすることを示す。ゲル電気泳動によっ
て精製された大ＲＮＡセグメントは、９０−Kdポリペプ
チド〔図１、（iii ）〕を除くすべての翻訳生成物を生
成する。ゲル電気泳動によって完全には精製され得なか
った小ＲＮＡセグメントがインビトロで翻訳される場
合、すべての微量翻訳生成物が見られるが、しかしその
９０−Kdタンパク質は、最とも顕著なタンパク質である
〔図１、（iv）〕。この９０−Kdタンパク質は、大ＲＮ
Ａセグメントの翻訳生成物の間で、一貫して不在である
ので、９０−Kdタンパク質を除くすべてのＩＢＤＶタン
パク質は、大ＲＮＡセグメントによってコードされてい
ると思われる。
【００３４】４．ＩＢＤＶ二重鎖ＤＮＡの分子クローニ
ング。完全なＩＢＤＶゲノムを包含するｃＤＮＡの合成
において生じる問題を克服するためには、長い二重鎖分
子のクローニングのための他の方法が開発された。二重
鎖ＲＮＡが水酸化メチル水銀中で変性され、そしてラン
ドムプライマーが使用され、ＲＴアーゼの存在下で同時
にＲＮＡの両鎖上でｃＤＮＡ合成が開始された。次に、
そのＲＮＡを破壊し、そして相補的ｃＤＮＡ鎖を再アニ
ールした。ＤＮＡポリマラーゼ１を用いて修復し、そし
てｃＤＮＡ鎖を延長し、次にこれを、さらにＲＴアーゼ
により延長した。次に、二重鎖ｃＤＮＡ分子を、ＤＮＡ
リガーゼ、次にＳ１ヌクレアーゼにより処理した。その
二重鎖ｃＤＮＡ分子をＣ末端化し、そしてＧ−末端化さ
れたｐＢＲ３２２にアニールし、そしてＥ．コリＲＲ１
細胞を形質転換するために使用した。
ング。完全なＩＢＤＶゲノムを包含するｃＤＮＡの合成
において生じる問題を克服するためには、長い二重鎖分
子のクローニングのための他の方法が開発された。二重
鎖ＲＮＡが水酸化メチル水銀中で変性され、そしてラン
ドムプライマーが使用され、ＲＴアーゼの存在下で同時
にＲＮＡの両鎖上でｃＤＮＡ合成が開始された。次に、
そのＲＮＡを破壊し、そして相補的ｃＤＮＡ鎖を再アニ
ールした。ＤＮＡポリマラーゼ１を用いて修復し、そし
てｃＤＮＡ鎖を延長し、次にこれを、さらにＲＴアーゼ
により延長した。次に、二重鎖ｃＤＮＡ分子を、ＤＮＡ
リガーゼ、次にＳ１ヌクレアーゼにより処理した。その
二重鎖ｃＤＮＡ分子をＣ末端化し、そしてＧ−末端化さ
れたｐＢＲ３２２にアニールし、そしてＥ．コリＲＲ１
細胞を形質転換するために使用した。
【００３５】組換え体コロニィーを、ＩＢＤＶ ＲＮＡ
の大又は小セグメントから製造された放射性プローブと
共にハイブリダイズし、そしておのおののプローブに対
して陽性の２００コロニィーを、さらに特徴づけのため
にランダムに選択した。その陽性コロニィーを、アガロ
ースミニゲル上でコロニィー溶解物を電気泳動すること
によって、プラスミドサイズについてスクリーニングし
た。大セグメントプローブに対して陽性の少々のこれら
のコロニィーを、プラスミドＤＮＡ単離のために５ml
Ｌブイヨン中で増殖した。
の大又は小セグメントから製造された放射性プローブと
共にハイブリダイズし、そしておのおののプローブに対
して陽性の２００コロニィーを、さらに特徴づけのため
にランダムに選択した。その陽性コロニィーを、アガロ
ースミニゲル上でコロニィー溶解物を電気泳動すること
によって、プラスミドサイズについてスクリーニングし
た。大セグメントプローブに対して陽性の少々のこれら
のコロニィーを、プラスミドＤＮＡ単離のために５ml
Ｌブイヨン中で増殖した。
【００３６】そのプラスミドをＰｓｔＩにより消化し、
そしてその挿入体のサイズを電気泳動によって決定し
た。定義されたサイズのこれらの挿入体は“ニック翻訳
され”、そして同一セットの陽性コロニィーをプローブ
するために別々に使用された。クローンＤ６（１１００
b.p.）、Ｌ６（１９００b.p.）及びＭ７（４５０b.p.）
からの挿入体は、根本的に３種の異なったセットのコロ
ニィーとハイブリダイズした。クローンＧ２（１６００
b.p.）からの挿入体は、Ｄ６又はＬ６プローブのいづれ
かにより（但し両者によらない）前もってハイブリッド
されたコロニィーにハイブリダイズした。
そしてその挿入体のサイズを電気泳動によって決定し
た。定義されたサイズのこれらの挿入体は“ニック翻訳
され”、そして同一セットの陽性コロニィーをプローブ
するために別々に使用された。クローンＤ６（１１００
b.p.）、Ｌ６（１９００b.p.）及びＭ７（４５０b.p.）
からの挿入体は、根本的に３種の異なったセットのコロ
ニィーとハイブリダイズした。クローンＧ２（１６００
b.p.）からの挿入体は、Ｄ６又はＬ６プローブのいづれ
かにより（但し両者によらない）前もってハイブリッド
されたコロニィーにハイブリダイズした。
【００３７】同様に、Ｎ９挿入体（９５０b.p.）は、Ｌ
６又はＭ２のいづれかに対して（但し両者に対してでは
ない）陽性であるコロニィーによりハイブリダイズし
た。その挿入体のサイズ及び大ＲＮＡセグメントに対し
て陽性のコロニィーとクロス−ハイブリダイズする程度
及び能力から、完全な大ＲＮＡセグメントを包含するオ
ーバーラップｃＤＮＡフラグメントがクローン化された
ことを示すために試験的な地図を構成することが可能で
あり、そしてすべての陽性コロニィーの相対的位置を、
この地図上で決定することができた。
６又はＭ２のいづれかに対して（但し両者に対してでは
ない）陽性であるコロニィーによりハイブリダイズし
た。その挿入体のサイズ及び大ＲＮＡセグメントに対し
て陽性のコロニィーとクロス−ハイブリダイズする程度
及び能力から、完全な大ＲＮＡセグメントを包含するオ
ーバーラップｃＤＮＡフラグメントがクローン化された
ことを示すために試験的な地図を構成することが可能で
あり、そしてすべての陽性コロニィーの相対的位置を、
この地図上で決定することができた。
【００３８】次の詳細な説明は、ＩＢＤＶの宿主保護性
抗原のための遺伝子をコードするｃＤＮＡフラグメント
のＥ．コリ中における発現に関する。添付図面におい
て、図３は、ＩＢＤＶの変性された３２Kdタンパク質と
反応するモノクローナル抗体（ＭＡｂ １７−８０）に
対して陽性のタンパク質を発現するいくつかのＥ．コリ
コロニィーを示す。図４は、電気泳動にゆだねられ、そ
して（ａ）クーマシーブルーにより染色され、又は
（ｂ）ウェスターンブロットされ、そしてＭＡｂ １７
−８０と反応するＥ．コリコロニィーからのタンパク質
を示す。矢印１及び２は、それぞれ融合タンパク質及び
β−ガラクトシダーゼの位置を示す。サンプルは、
（ｉ）ＨＢ１０１細胞、（ii）ｐＵＫ２９０を含むＨＢ
１０１、（iii ）〜（viii）ＭＡｂ１７−８０（図３）
との反応によって可能な陽性として同定されたいくつか
の組換え体クローンである。
抗原のための遺伝子をコードするｃＤＮＡフラグメント
のＥ．コリ中における発現に関する。添付図面におい
て、図３は、ＩＢＤＶの変性された３２Kdタンパク質と
反応するモノクローナル抗体（ＭＡｂ １７−８０）に
対して陽性のタンパク質を発現するいくつかのＥ．コリ
コロニィーを示す。図４は、電気泳動にゆだねられ、そ
して（ａ）クーマシーブルーにより染色され、又は
（ｂ）ウェスターンブロットされ、そしてＭＡｂ １７
−８０と反応するＥ．コリコロニィーからのタンパク質
を示す。矢印１及び２は、それぞれ融合タンパク質及び
β−ガラクトシダーゼの位置を示す。サンプルは、
（ｉ）ＨＢ１０１細胞、（ii）ｐＵＫ２９０を含むＨＢ
１０１、（iii ）〜（viii）ＭＡｂ１７−８０（図３）
との反応によって可能な陽性として同定されたいくつか
の組換え体クローンである。
【００３９】図５は、（ａ）ＩＢＤＶゲノムの大セグメ
ント上でのクローンＤ６からの挿入体の位置；（ｂ）ク
ローンＤ６及びＤ１からの挿入体の制限地図を示す。図
６は、融合タンパク質の発現のための最良条件の決定を
示す。細胞を、０．２のＯ．Ｄ．660 に増殖し、（ｉ）
次に１．５mMのＩＰＴＧによる誘導により又は誘導なし
で次のように：（ii）１．５時間、（iii ）１．５時間
＋ＩＰＴＧ、（iv）３時間、（ｖ）３時間＋ＩＰＴＧ、
（vi）４時間、（vii ）４時間＋ＩＰＴＧによりさらに
増殖せしめた。サンプルを電気泳動し、そしてクーマシ
ーブルーにより染色した。矢印は融合タンパク質の位置
を示す。
ント上でのクローンＤ６からの挿入体の位置；（ｂ）ク
ローンＤ６及びＤ１からの挿入体の制限地図を示す。図
６は、融合タンパク質の発現のための最良条件の決定を
示す。細胞を、０．２のＯ．Ｄ．660 に増殖し、（ｉ）
次に１．５mMのＩＰＴＧによる誘導により又は誘導なし
で次のように：（ii）１．５時間、（iii ）１．５時間
＋ＩＰＴＧ、（iv）３時間、（ｖ）３時間＋ＩＰＴＧ、
（vi）４時間、（vii ）４時間＋ＩＰＴＧによりさらに
増殖せしめた。サンプルを電気泳動し、そしてクーマシ
ーブルーにより染色した。矢印は融合タンパク質の位置
を示す。
【００４０】図７は、クローンＤ１からの融合タンパク
質のアフィニティ精製を示す。（ｉ）合計Ｅ．コリのタ
ンパク質；カラムから溶離された（ii）〜（vii ）画
分。図８は、クローンＤ１及びＤ６からのアフィニティ
精製されたタンパク質を示し、電気泳動され、そしてク
ーマシーブルーにより染色され（ａ）、抗−β−ガラク
トシダーゼと反応せしめられ（ｂ）そして抗−３２Kd−
モノクローナル抗体と反応せしめられた（ｃ）。図９
は、フロイトアジュバント中においてクローンＤ１又は
Ｄ６からの融合タンパク質により注入された、感作され
ていない（１0 ）又は感作された（２0 ）鶏からの血清
のウェスターンブロット分析を示す。ワクチン投与の前
に得られた血清（０）、融合タンパク質の注入の後、３
週間（３）、又は融合タンパク質の第２注入の後、４週
間（７）。
質のアフィニティ精製を示す。（ｉ）合計Ｅ．コリのタ
ンパク質；カラムから溶離された（ii）〜（vii ）画
分。図８は、クローンＤ１及びＤ６からのアフィニティ
精製されたタンパク質を示し、電気泳動され、そしてク
ーマシーブルーにより染色され（ａ）、抗−β−ガラク
トシダーゼと反応せしめられ（ｂ）そして抗−３２Kd−
モノクローナル抗体と反応せしめられた（ｃ）。図９
は、フロイトアジュバント中においてクローンＤ１又は
Ｄ６からの融合タンパク質により注入された、感作され
ていない（１0 ）又は感作された（２0 ）鶏からの血清
のウェスターンブロット分析を示す。ワクチン投与の前
に得られた血清（０）、融合タンパク質の注入の後、３
週間（３）、又は融合タンパク質の第２注入の後、４週
間（７）。
【００４１】材料及び方法
材料及びそれらの源は次のものである：ＤＮアーゼ１、
リゾチーム、アガロース、ＢＳＡ、イソプロピルβ−Ｄ
−チオ−ガラクトシド（１ＰＴＧ）及び１−エチル−３
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Sigm
a ）；ヤギ抗−マウスＩｇＧホースラディシュペルオキ
シダーゼ接合体（GAM HRP ）、ヤギ抗−ウサギＩｇＧホ
ースラディシュペルオキシダーゼ接合体（GAM HRP ）及
びＨＲＰ発色試薬（BioRad）；α〔32Ｐ〕ｄＡＴＰ、〔
125Ｉ〕プロティンＡ及びＰｓｔＩ（amersham）；ニト
ロセルロースフィルター及びＭＡ４５メンブランフィル
ター（Schleicher and Schuell）；ＣＨ−セファロース
４Ｂ（Pharmacia ）；ＤＮＡポリマラーゼ（Boehringe
r）；ウサギ抗−マウスＩｇＧ〔Dako免疫グロブリン（D
enmark ）〕。ＩＢＤＶに対するモノクローナル抗体
は、下記のようにして製造され、そして特性化された。
リゾチーム、アガロース、ＢＳＡ、イソプロピルβ−Ｄ
−チオ−ガラクトシド（１ＰＴＧ）及び１−エチル−３
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Sigm
a ）；ヤギ抗−マウスＩｇＧホースラディシュペルオキ
シダーゼ接合体（GAM HRP ）、ヤギ抗−ウサギＩｇＧホ
ースラディシュペルオキシダーゼ接合体（GAM HRP ）及
びＨＲＰ発色試薬（BioRad）；α〔32Ｐ〕ｄＡＴＰ、〔
125Ｉ〕プロティンＡ及びＰｓｔＩ（amersham）；ニト
ロセルロースフィルター及びＭＡ４５メンブランフィル
ター（Schleicher and Schuell）；ＣＨ−セファロース
４Ｂ（Pharmacia ）；ＤＮＡポリマラーゼ（Boehringe
r）；ウサギ抗−マウスＩｇＧ〔Dako免疫グロブリン（D
enmark ）〕。ＩＢＤＶに対するモノクローナル抗体
は、下記のようにして製造され、そして特性化された。
【００４２】ＩＢＤＶ株００２−７３は、前記のように
して増殖され、そして単離された。コロニィー及びサウ
ザーンブロットハイブリダイゼーション、プラスミドＤ
ＮＡの単離、ハイブリダイゼーションブローブの製造、
アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（Laemli）及びオートラジオグラフィーが前記のよ
うにして行なわれた。
して増殖され、そして単離された。コロニィー及びサウ
ザーンブロットハイブリダイゼーション、プラスミドＤ
ＮＡの単離、ハイブリダイゼーションブローブの製造、
アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（Laemli）及びオートラジオグラフィーが前記のよ
うにして行なわれた。
【００４３】組換え体コロニィーにおける発現したタン
パク質のイムノアッセイ：組換え体コロニィーを、３０
μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢプレート上のニトロ
セルロースフィルター上で増殖した（３７℃）。すべて
の次の段階は室温で行なわれた。そのニトロセルロース
フィルターを、１％ ＳＤＳにより飽和されたWhatman
No.3ペーパー上にクロロホルム雰囲気下で３０分〜１時
間、置いた。そのフィルターを、５０mMのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ＴＢＳ）に
よりすすぎ、細胞破片を除去し、そして次に３％ ＢＳ
Ａ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、１μｇ／mlのＤｎａｓｅ及び
４０μｇ／mlのリゾチームを含むＴＢＳ中で振盪しなが
ら１時間、インキュベートした。
パク質のイムノアッセイ：組換え体コロニィーを、３０
μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢプレート上のニトロ
セルロースフィルター上で増殖した（３７℃）。すべて
の次の段階は室温で行なわれた。そのニトロセルロース
フィルターを、１％ ＳＤＳにより飽和されたWhatman
No.3ペーパー上にクロロホルム雰囲気下で３０分〜１時
間、置いた。そのフィルターを、５０mMのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ＴＢＳ）に
よりすすぎ、細胞破片を除去し、そして次に３％ ＢＳ
Ａ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、１μｇ／mlのＤｎａｓｅ及び
４０μｇ／mlのリゾチームを含むＴＢＳ中で振盪しなが
ら１時間、インキュベートした。
【００４４】この後、モノクローナル抗体からの上清液
中で１時間、インキュベートした。次に、そのフィルタ
ーを、ＴＢＳ中で１０分間、ＴＢＳ−０．１％ ＮＰ４
０中で１０分間、そして最後にＴＢＳ中で１０分間洗浄
した。時々、そのフィルターを、３％ ＢＳＡを含むＴ
ＢＳ中で第２抗体（ウサギ抗−マウスＩｇＧ）と反応せ
しめ、そして前記のようにして洗浄した。初期実験にお
いて、目的とするタンパク質を発現する組換え体コロニ
ィーを、〔 125Ｉ〕プロティンＡを用いることによって
同定した。抗体との反応の後、そのフィルターを、３％
ＢＳＡを含むＴＢＳ中で〔 125Ｉ〕プロティンＡと共
にインキュベートした。
中で１時間、インキュベートした。次に、そのフィルタ
ーを、ＴＢＳ中で１０分間、ＴＢＳ−０．１％ ＮＰ４
０中で１０分間、そして最後にＴＢＳ中で１０分間洗浄
した。時々、そのフィルターを、３％ ＢＳＡを含むＴ
ＢＳ中で第２抗体（ウサギ抗−マウスＩｇＧ）と反応せ
しめ、そして前記のようにして洗浄した。初期実験にお
いて、目的とするタンパク質を発現する組換え体コロニ
ィーを、〔 125Ｉ〕プロティンＡを用いることによって
同定した。抗体との反応の後、そのフィルターを、３％
ＢＳＡを含むＴＢＳ中で〔 125Ｉ〕プロティンＡと共
にインキュベートした。
【００４５】次に、そのフィルターを、５ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥ
ＤＴＡ、０．２５％ゼラチン、０．４％ ＳａｒＫｏｓ
ｙｌ中で９０分間洗浄し、そして前記のようにしてオー
トラジオグラフ処理した。後の実験において、モノクロ
ーナル抗体との反応及び洗浄の後、そのフィルターを、
ヤギ抗−マウスＩｇＧホースラディシュペルオキシダー
ゼ接合体又はヤギ抗−ウサギＩｇＧホースラディシュペ
ルオキシダーゼ接合体（第２抗体により増幅される場
合）と、３％ ＢＳＡを含むＴＢＳ中で１時間、反応せ
しめた。次に、そのフィルターを、リン酸緩衝溶液中で
２０分間、洗浄し、次にＢｉｏＲａｄによって記載され
ているようにして、ＨＲＰ発色試薬を用いて発色せしめ
た。
ｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥ
ＤＴＡ、０．２５％ゼラチン、０．４％ ＳａｒＫｏｓ
ｙｌ中で９０分間洗浄し、そして前記のようにしてオー
トラジオグラフ処理した。後の実験において、モノクロ
ーナル抗体との反応及び洗浄の後、そのフィルターを、
ヤギ抗−マウスＩｇＧホースラディシュペルオキシダー
ゼ接合体又はヤギ抗−ウサギＩｇＧホースラディシュペ
ルオキシダーゼ接合体（第２抗体により増幅される場
合）と、３％ ＢＳＡを含むＴＢＳ中で１時間、反応せ
しめた。次に、そのフィルターを、リン酸緩衝溶液中で
２０分間、洗浄し、次にＢｉｏＲａｄによって記載され
ているようにして、ＨＲＰ発色試薬を用いて発色せしめ
た。
【００４６】Ｅ．コリ細胞から単離された小量のタンパ
ク質のアッセイ：Ｅ．コリ培養物（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
管中において０．８ml）を、アンピシリンを含むＬブイ
ヨン中で１〜２時間増殖せしめ、必要ならＩＰＴＧによ
り誘発し、そしてその細胞を遠心分離によって集めた。
タンパク質がポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
分析される場合、その細胞ペレットを６０ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、２％ ＳＤＳ、１０％グリセ
ロール、５％ β−メルカプトエタノール、０．００１
％プロモフェノールブルーを含む負荷緩衝液中に直接的
に懸濁し、そして２分間煮沸した。５０μｌアリコート
を、２つのゲル上に２通り負荷した。１つのゲル上のタ
ンパク質をクーマシーブルーにより染色し、そして同じ
ゲル上のタンパク質をニトロセルロースフィルター上に
移した。
ク質のアッセイ：Ｅ．コリ培養物（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
管中において０．８ml）を、アンピシリンを含むＬブイ
ヨン中で１〜２時間増殖せしめ、必要ならＩＰＴＧによ
り誘発し、そしてその細胞を遠心分離によって集めた。
タンパク質がポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
分析される場合、その細胞ペレットを６０ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、２％ ＳＤＳ、１０％グリセ
ロール、５％ β−メルカプトエタノール、０．００１
％プロモフェノールブルーを含む負荷緩衝液中に直接的
に懸濁し、そして２分間煮沸した。５０μｌアリコート
を、２つのゲル上に２通り負荷した。１つのゲル上のタ
ンパク質をクーマシーブルーにより染色し、そして同じ
ゲル上のタンパク質をニトロセルロースフィルター上に
移した。
【００４７】単離されたタンパク質の急速なイムノアッ
セイのためには、細胞ペレットを、４０μｇ／mlのリゾ
チームを含むＴＢＳ緩衝液３００μｌ中に懸濁し（０
℃、１５分）、そして次に１％ ＳＤＳを添加し、そし
てその溶液を室温で３０分間放置した。他方、その細胞
ペレットを、ＴＢＳ緩衝液３００μｌ中に懸濁し、そし
て音波処理した。両方の場合において、細胞破片を遠心
分離によって除去し、そしてその上清液１００μｌを、
Schleider and Schuell Manifold装置を用いてニトロセ
ルロースフィルター上に吸取った。次に、そのフィルタ
ーを、前記のようにして組換え体コロニィーについてイ
ムノアッセイした。
セイのためには、細胞ペレットを、４０μｇ／mlのリゾ
チームを含むＴＢＳ緩衝液３００μｌ中に懸濁し（０
℃、１５分）、そして次に１％ ＳＤＳを添加し、そし
てその溶液を室温で３０分間放置した。他方、その細胞
ペレットを、ＴＢＳ緩衝液３００μｌ中に懸濁し、そし
て音波処理した。両方の場合において、細胞破片を遠心
分離によって除去し、そしてその上清液１００μｌを、
Schleider and Schuell Manifold装置を用いてニトロセ
ルロースフィルター上に吸取った。次に、そのフィルタ
ーを、前記のようにして組換え体コロニィーについてイ
ムノアッセイした。
【００４８】ウェスターンブロット
アクリルアミドゲル上で電気泳動されたタンパク質を、
Ｂｉｏ−Ｒａｄによって記載された緩衝液及び方法を用
いて、Bio-Rad Transblot 装置によりＮＣフィルターに
移した。前記のようにしてフィルターをイムノアッセイ
することによって、対象のタンパク質を検出した。発現された融合タンパク質の精製 融合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィー
によって精製した（Ullmann, 1984 ）。
Ｂｉｏ−Ｒａｄによって記載された緩衝液及び方法を用
いて、Bio-Rad Transblot 装置によりＮＣフィルターに
移した。前記のようにしてフィルターをイムノアッセイ
することによって、対象のタンパク質を検出した。発現された融合タンパク質の精製 融合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィー
によって精製した（Ullmann, 1984 ）。
【００４９】融合タンパク質による鶏へのワクチン投与
アフィニティー精製された融合タンパク質、Ｄ１及びＤ
６の調製物を、同体積の完全フロイントアジュバント中
に乳濁し、そしてその１mlを、一連の成熟White Leghor
n 鶏に筋肉注射した。そのワクチンを、ＳＰＦ鶏及び生
きているＩＢＤＶによる接種により前もって（＞８週
間）感作された鶏の両者に注射した。不完全フロイント
アジュバント中に乳濁されたそれぞれの融合タンパク質
により、３週間後、その鶏に再ワクチン投与し、そして
週ごとに採血した。
６の調製物を、同体積の完全フロイントアジュバント中
に乳濁し、そしてその１mlを、一連の成熟White Leghor
n 鶏に筋肉注射した。そのワクチンを、ＳＰＦ鶏及び生
きているＩＢＤＶによる接種により前もって（＞８週
間）感作された鶏の両者に注射した。不完全フロイント
アジュバント中に乳濁されたそれぞれの融合タンパク質
により、３週間後、その鶏に再ワクチン投与し、そして
週ごとに採血した。
【００５０】結果及び検討
１．ｐＵＲベクター中へのｃＤＮＡ挿入体のサブクロー
ニング： ＩＢＤＶ ＲＮＡの大セグメントは、３２Kd宿主保護性
抗原を含む３種の主要構造タンパク質をコードする。Ｉ
ＢＤＶ ＲＮＡの大セグメントにハイブリダイズできる
ｃＤＮＡ挿入体を、ＰｓｔＩによる“混合”プラスミド
の消化によってｃＤＮＡライブラリィから回収し、そし
てその“混合”挿入体を、ｐＵＲ発現ベクター２９０，
２９１及び２９２（Ruther and Muller-Hill, 1983）の
ＰｓｔＩ部位中にサブクローンし、そしてこれらを用い
てＥ．コリＨＢ１０１細胞を形質転換した。これらの３
種のベクターは共に、ｌａｃＺ遺伝子の３′末端ですべ
ての３種のフレーム中に制限部位を含む。正しいクロー
ニング部位へのｃＤＮＡの挿入は、活性β−ガラクトシ
ダーゼと外来性ｃＤＮＡによってコードされたペプチド
との融合タンパク質を導びく。
ニング： ＩＢＤＶ ＲＮＡの大セグメントは、３２Kd宿主保護性
抗原を含む３種の主要構造タンパク質をコードする。Ｉ
ＢＤＶ ＲＮＡの大セグメントにハイブリダイズできる
ｃＤＮＡ挿入体を、ＰｓｔＩによる“混合”プラスミド
の消化によってｃＤＮＡライブラリィから回収し、そし
てその“混合”挿入体を、ｐＵＲ発現ベクター２９０，
２９１及び２９２（Ruther and Muller-Hill, 1983）の
ＰｓｔＩ部位中にサブクローンし、そしてこれらを用い
てＥ．コリＨＢ１０１細胞を形質転換した。これらの３
種のベクターは共に、ｌａｃＺ遺伝子の３′末端ですべ
ての３種のフレーム中に制限部位を含む。正しいクロー
ニング部位へのｃＤＮＡの挿入は、活性β−ガラクトシ
ダーゼと外来性ｃＤＮＡによってコードされたペプチド
との融合タンパク質を導びく。
【００５１】２．３２Kdポリペプチド又はその一部を発
現するコロニィーの同定 ＩＢＤＶ ＲＮＡの大セグメントにハイブリダイズでき
るｃＤＮＡ挿入体を含む組換え体コロニィーを、アンピ
シリン（３０μｇ／ml）を含むＬＢプレート上のニトロ
セルロースフィルター上で増殖した。このコロニィー
を、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ
ＰＴＧ）により誘導し、そして次に１％ＳＤＳにより飽
和されたWhatman No.3ペーパー上にそのフィルターを置
くことによって、クロロホルム飽和雰囲気下で細胞溶解
した。
現するコロニィーの同定 ＩＢＤＶ ＲＮＡの大セグメントにハイブリダイズでき
るｃＤＮＡ挿入体を含む組換え体コロニィーを、アンピ
シリン（３０μｇ／ml）を含むＬＢプレート上のニトロ
セルロースフィルター上で増殖した。このコロニィー
を、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ
ＰＴＧ）により誘導し、そして次に１％ＳＤＳにより飽
和されたWhatman No.3ペーパー上にそのフィルターを置
くことによって、クロロホルム飽和雰囲気下で細胞溶解
した。
【００５２】ＢＳＡによるブロッキングの後、そのフィ
ルターを、ウェスターンブロットに基づいて、３２Kdポ
リペプチドを認識するモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ
１７−８０）と反応せしめた。次に、そのフィルター
を、ウサギ抗−マウスＩｇＧ、次に〔 125Ｉ〕プロティ
ンＡと反応せしめ、そしてオートラジオグラフ処理し
た。３２Kd構造タンパク質に対して特異的なモノクロー
ナル抗体と反応するタンパク質を発現する多くの可能な
陽性クローンを、オートラジオグラフ上で見ることがで
きた（図３）。その方法は、後の実験のために変えられ
た。モノクローナル抗体とのインキュベーションの後、
そのフィルターを、ヤギ抗−マウスＩｇＧホースラディ
シュペルオキシダーゼ（BioRad）と反応せしめ、そして
発色反応せしめた。
ルターを、ウェスターンブロットに基づいて、３２Kdポ
リペプチドを認識するモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ
１７−８０）と反応せしめた。次に、そのフィルター
を、ウサギ抗−マウスＩｇＧ、次に〔 125Ｉ〕プロティ
ンＡと反応せしめ、そしてオートラジオグラフ処理し
た。３２Kd構造タンパク質に対して特異的なモノクロー
ナル抗体と反応するタンパク質を発現する多くの可能な
陽性クローンを、オートラジオグラフ上で見ることがで
きた（図３）。その方法は、後の実験のために変えられ
た。モノクローナル抗体とのインキュベーションの後、
そのフィルターを、ヤギ抗−マウスＩｇＧホースラディ
シュペルオキシダーゼ（BioRad）と反応せしめ、そして
発色反応せしめた。
【００５３】合計２０の可能な陽性コロニィーを、さら
に特徴づけのために選択した。これらのコロニィーを、
ＬＢプレート上に広げ、そして得られた１０の個々のコ
ロニィーを、変性された３２Kdタンパク質に対して特異
的なモノクローナル抗体により再プローブした。初めの
可能な陽性コロニィーのうち３コロニィーのみが、モノ
クローナル抗体と反応したポリペプチドを発現した。
に特徴づけのために選択した。これらのコロニィーを、
ＬＢプレート上に広げ、そして得られた１０の個々のコ
ロニィーを、変性された３２Kdタンパク質に対して特異
的なモノクローナル抗体により再プローブした。初めの
可能な陽性コロニィーのうち３コロニィーのみが、モノ
クローナル抗体と反応したポリペプチドを発現した。
【００５４】３．発現されたタンパク質の特性
その発現されたタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動及びウェスターン法によって特徴づけた。Ｌブ
イヨンのＥｐｐｏｎｄｏｒｆ管中で増殖された細胞を回
転沈殿し、そして２％ ＳＤＳ中で２分間煮沸し、そし
て２つの別々のゲル上に２通り負荷した。電気泳動の
後、１つのゲルをクーマシーブルーにより染色し、そし
て他のゲルからのタンパク質を、ニトロセルロースフィ
ルター上で電気ブロットし、そして３２Kdポリペプチド
に対して特異的なモノクローナル抗体によりプローブし
た。
電気泳動及びウェスターン法によって特徴づけた。Ｌブ
イヨンのＥｐｐｏｎｄｏｒｆ管中で増殖された細胞を回
転沈殿し、そして２％ ＳＤＳ中で２分間煮沸し、そし
て２つの別々のゲル上に２通り負荷した。電気泳動の
後、１つのゲルをクーマシーブルーにより染色し、そし
て他のゲルからのタンパク質を、ニトロセルロースフィ
ルター上で電気ブロットし、そして３２Kdポリペプチド
に対して特異的なモノクローナル抗体によりプローブし
た。
【００５５】染色されたゲルの試験は、β−ガラクトシ
ダーゼよりも大きな顕著なポリペプチドバンドを示さな
いが（図４、ａ）、しかしその同じサンプルのウェスタ
ーンブロットは、β−ガラクトシダーゼよりも大きな、
ひじょうに目だったポリペプチドバンドを示した（図
４、ｂ）。すべての陽性クローンから発現された融合タ
ンパク質は、同じサイズのものであるが、しかしいくつ
かのクローンは、発現されたタンパク質を他よりも一層
産生し、そしてこれはより速く増殖し、そして融合タン
パク質を一層発現するクローンの同定を可能にした。
ダーゼよりも大きな顕著なポリペプチドバンドを示さな
いが（図４、ａ）、しかしその同じサンプルのウェスタ
ーンブロットは、β−ガラクトシダーゼよりも大きな、
ひじょうに目だったポリペプチドバンドを示した（図
４、ｂ）。すべての陽性クローンから発現された融合タ
ンパク質は、同じサイズのものであるが、しかしいくつ
かのクローンは、発現されたタンパク質を他よりも一層
産生し、そしてこれはより速く増殖し、そして融合タン
パク質を一層発現するクローンの同定を可能にした。
【００５６】３２Kd宿主保護性抗原をコードするＩＢＤ
Ｖゲノムの領域の同定 ＰｓｔＩによる消化によって得られた、すべての陽性ク
ローンからのｃＤＮＡ挿入体は、約４５０b.p.の同一の
サイズのものであった。これらの挿入体を、“ニック−
トランスレートし”、そしてＩＢＤＶゲノムの完全な大
セグメントを包含するオーバーラッピングフラグメント
網を含む一連のｃＤＮＡクローンとハイブリダイズし
た。あらゆる場合、発現性クローンからの挿入体は、Ｉ
ＢＤＶ ＲＮＡの大セグメントの３′末端を補うクロー
ンＤ６（図５、ａを参照のこと）及びＩＢＤＶゲノムの
同じ領域からの種々のサイズの挿入体を含む他のｃＤＮ
Ａクローンと特異的にハイブリダイズした。
Ｖゲノムの領域の同定 ＰｓｔＩによる消化によって得られた、すべての陽性ク
ローンからのｃＤＮＡ挿入体は、約４５０b.p.の同一の
サイズのものであった。これらの挿入体を、“ニック−
トランスレートし”、そしてＩＢＤＶゲノムの完全な大
セグメントを包含するオーバーラッピングフラグメント
網を含む一連のｃＤＮＡクローンとハイブリダイズし
た。あらゆる場合、発現性クローンからの挿入体は、Ｉ
ＢＤＶ ＲＮＡの大セグメントの３′末端を補うクロー
ンＤ６（図５、ａを参照のこと）及びＩＢＤＶゲノムの
同じ領域からの種々のサイズの挿入体を含む他のｃＤＮ
Ａクローンと特異的にハイブリダイズした。
【００５７】その発現性クローンからの挿入体は、同一
の制限地図を有し、そして同一のサイズのものであっ
た。従って、十分に増殖し、そして融合タンパク質を高
レベルに発現する１つのクローン、Ｄ１を、さらに研究
のために選択した。Ｄ１の挿入体は、ベクターｐＵＲ２
９０に存在する。クローンＤ１（４５０b.p.）及びＤ６
（１１００b.p.）からの挿入体の制限地図（図５、ｂ）
の比較は、Ｄ１挿入体がＤ６挿入体の３′末端の方に位
置することを示す。配列決定の研究は（後で参照のこ
と）、Ｄ１挿入体の位置を確認し、そしてそれが開始コ
ドン及び終止コドンを欠き、そして約５０％の３２Kd宿
主保護性抗原を構成することを示す。他方、クローンＤ
６の挿入体は、完全な３２Kdポリペプチドをコードする
のに十分に大きい。従って、クローンＤ６からの挿入体
を、ｐＵＲベクター中にサブクローンし、そしてクロー
ンＤ１からの融合タンパク質よりも大きな融合タンパク
質を発現するクローンを得た。
の制限地図を有し、そして同一のサイズのものであっ
た。従って、十分に増殖し、そして融合タンパク質を高
レベルに発現する１つのクローン、Ｄ１を、さらに研究
のために選択した。Ｄ１の挿入体は、ベクターｐＵＲ２
９０に存在する。クローンＤ１（４５０b.p.）及びＤ６
（１１００b.p.）からの挿入体の制限地図（図５、ｂ）
の比較は、Ｄ１挿入体がＤ６挿入体の３′末端の方に位
置することを示す。配列決定の研究は（後で参照のこ
と）、Ｄ１挿入体の位置を確認し、そしてそれが開始コ
ドン及び終止コドンを欠き、そして約５０％の３２Kd宿
主保護性抗原を構成することを示す。他方、クローンＤ
６の挿入体は、完全な３２Kdポリペプチドをコードする
のに十分に大きい。従って、クローンＤ６からの挿入体
を、ｐＵＲベクター中にサブクローンし、そしてクロー
ンＤ１からの融合タンパク質よりも大きな融合タンパク
質を発現するクローンを得た。
【００５８】十分に増殖し、そして高レベルに融合タン
パク質を発現する、ｐＵＲベクター２９１中にＤ６挿入
体を含むクローンを、さらに研究のために選択した。ク
ローンＤ１（４５０b.p.挿入体）及びクローンＤ６（１
１００b.p.挿入体）の両者は、融合タンパク質を産生
し、そしてここでβ−ガラクトシダーゼに融合されたＣ
−末端ポリペプチドは、３２Kd宿主保護性抗原に対して
特異的なモノクローナル抗体と強く反応する。クローン
Ｄ１及びＤ６は、次に続くすべての研究のために使用し
た。
パク質を発現する、ｐＵＲベクター２９１中にＤ６挿入
体を含むクローンを、さらに研究のために選択した。ク
ローンＤ１（４５０b.p.挿入体）及びクローンＤ６（１
１００b.p.挿入体）の両者は、融合タンパク質を産生
し、そしてここでβ−ガラクトシダーゼに融合されたＣ
−末端ポリペプチドは、３２Kd宿主保護性抗原に対して
特異的なモノクローナル抗体と強く反応する。クローン
Ｄ１及びＤ６は、次に続くすべての研究のために使用し
た。
【００５９】発現のための最適条件
融合されたタンパク質の発現のための最適条件は次の通
りであった（図６）。細胞を、アンピシリン（３０μｇ
／ml）の存在下でＬブイヨン中で０．２のＯ．Ｄ．６６
０に増殖し、そして次に、１．５ｍＭの１ＰＴＧにより
４時間、誘導した。誘導の開始後、３時間で融合タンパ
ク質の有意な合成は存在せず、そして誘導の４時間後、
融合タンパク質の合成が劇的に上昇した。一層長い期間
又はより高い細胞濃度での誘導は、高い収率の融合タン
パク質をもたらさなかった。
りであった（図６）。細胞を、アンピシリン（３０μｇ
／ml）の存在下でＬブイヨン中で０．２のＯ．Ｄ．６６
０に増殖し、そして次に、１．５ｍＭの１ＰＴＧにより
４時間、誘導した。誘導の開始後、３時間で融合タンパ
ク質の有意な合成は存在せず、そして誘導の４時間後、
融合タンパク質の合成が劇的に上昇した。一層長い期間
又はより高い細胞濃度での誘導は、高い収率の融合タン
パク質をもたらさなかった。
【００６０】融合タンパク質の精製
クローンＤ１及びＤ６からの融合タンパク質を、Ullman
n （1984）によって記載されているようにしてアフィニ
ティー精製した。ｐＵＲベクターを発現のために使用す
る場合、融合タンパク質のβ−ガラクトシダーゼ成分は
酵素的に活性であり、そしてβ−ガラクトシダーゼのた
めの基質に結合するであろう〔Ullmann（1984）〕。
n （1984）によって記載されているようにしてアフィニ
ティー精製した。ｐＵＲベクターを発現のために使用す
る場合、融合タンパク質のβ−ガラクトシダーゼ成分は
酵素的に活性であり、そしてβ−ガラクトシダーゼのた
めの基質に結合するであろう〔Ullmann（1984）〕。
【００６１】１．６ＭのＮａＣｌを含む緩衝液中、Ｅ．
コリ細胞溶解物を、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−チオ
ダラクトシドに結合されるＣＨセファロースを含むアフ
ィニティーカラムを含み、そして同じ緩衝液により平衡
化されたアフィニティーカラムに通した。それに融合さ
れるβ−ガラクトシダーゼ又はタンパク質のみが、これ
らの条件下でアフィニティーカラムに結合するであろ
う。その結合されたタンパク質を、１００ｍＭの硼酸塩
（pH１０）により量的に溶離した。クローンＤ１からの
融合タンパク質の精製を図７に示す。
コリ細胞溶解物を、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−チオ
ダラクトシドに結合されるＣＨセファロースを含むアフ
ィニティーカラムを含み、そして同じ緩衝液により平衡
化されたアフィニティーカラムに通した。それに融合さ
れるβ−ガラクトシダーゼ又はタンパク質のみが、これ
らの条件下でアフィニティーカラムに結合するであろ
う。その結合されたタンパク質を、１００ｍＭの硼酸塩
（pH１０）により量的に溶離した。クローンＤ１からの
融合タンパク質の精製を図７に示す。
【００６２】高く精製された融合むた（Ｄ１及びＤ６）
及び遊離β−ガラクトシダーゼ（図８、ａ）を、約１〜
２mg／mlのひじょうに高い濃度で回収し、そして培養リ
ッター当り２０mgまでのアフィニティー精製タンパク質
を得た。しかしながら、その融合タンパク質は、β−ガ
ラクトシダーゼに類似する又はそれよりも早い電気泳動
移動度を有する、実質的な量のポリペプチドの存在によ
って示されるように、タンパク質分解しやすかった。３
つのバンドが、クローンＤ６及びＤ１からのアフィニテ
ィー精製タンパク質に見られる。
及び遊離β−ガラクトシダーゼ（図８、ａ）を、約１〜
２mg／mlのひじょうに高い濃度で回収し、そして培養リ
ッター当り２０mgまでのアフィニティー精製タンパク質
を得た。しかしながら、その融合タンパク質は、β−ガ
ラクトシダーゼに類似する又はそれよりも早い電気泳動
移動度を有する、実質的な量のポリペプチドの存在によ
って示されるように、タンパク質分解しやすかった。３
つのバンドが、クローンＤ６及びＤ１からのアフィニテ
ィー精製タンパク質に見られる。
【００６３】そのバンドのすべては、抗−β−ガラクト
シダーゼＩｇＧと反応し（図８、ｂ）、ところがそれぞ
れＤ６及びＤ１からのバンド１ａ及び１ｂのみが、抗−
３２Kdモノクローナルと反応する（図８、ｃ）。しかし
ながら、それは、主に、実質的に分解されるＣ−末端の
ＩＢＤＶタンパク質である。ＩＢＤＶ発現タンパク質の
この分解は、単離方法によって引き起こされるように思
われない。なぜならば、電気泳動の前、ＳＤＳ中で直接
的に煮沸された細胞がまた、完全な融合タンパク質の他
に実質的な量の遊離β−ガラクトシダーゼを含むからで
ある。
シダーゼＩｇＧと反応し（図８、ｂ）、ところがそれぞ
れＤ６及びＤ１からのバンド１ａ及び１ｂのみが、抗−
３２Kdモノクローナルと反応する（図８、ｃ）。しかし
ながら、それは、主に、実質的に分解されるＣ−末端の
ＩＢＤＶタンパク質である。ＩＢＤＶ発現タンパク質の
この分解は、単離方法によって引き起こされるように思
われない。なぜならば、電気泳動の前、ＳＤＳ中で直接
的に煮沸された細胞がまた、完全な融合タンパク質の他
に実質的な量の遊離β−ガラクトシダーゼを含むからで
ある。
【００６４】３２Kd宿主保護性抗原に対して特異的なモ
ノクローナル抗体と発現されたタンパク質との反応 ＩＢＤＶの３２Kd構造タンパク質を認識し、そして／又
はウィルスを中和する多くのモノクローナル抗体（ＭＡ
ｂ）が産生された（後で参照のこと）。これらは２種の
クラスに分かれる。１つのクラスのＭＡｂ（たとえば、
１７〜８０）は、ウェスターン法に基づいて３２Kdタン
パク質と反応するが、しかしウィルスを中和せず、とこ
ろが他のクラスのＭＡｂ（たとえば、１７〜８２）はウ
ィルスを中和するが、しかしウェスターン法に基づいて
３２Kdタンパク質と有意に反応しない。これは、ウィル
ス中和性モノクローナル抗体がコンホーメーショナルエ
ピトープを認識することを示す。
ノクローナル抗体と発現されたタンパク質との反応 ＩＢＤＶの３２Kd構造タンパク質を認識し、そして／又
はウィルスを中和する多くのモノクローナル抗体（ＭＡ
ｂ）が産生された（後で参照のこと）。これらは２種の
クラスに分かれる。１つのクラスのＭＡｂ（たとえば、
１７〜８０）は、ウェスターン法に基づいて３２Kdタン
パク質と反応するが、しかしウィルスを中和せず、とこ
ろが他のクラスのＭＡｂ（たとえば、１７〜８２）はウ
ィルスを中和するが、しかしウェスターン法に基づいて
３２Kdタンパク質と有意に反応しない。これは、ウィル
ス中和性モノクローナル抗体がコンホーメーショナルエ
ピトープを認識することを示す。
【００６５】ＳＤＳ中で煮沸される場合、クローンＤ１
及びＤ６中に発現される融合タンパク質は、ウェスター
ン法に基づいて３２Kd構造タンパク質を認識するモノク
ローナル抗体とひじょうに強く反応する。ＳＤＳにより
処理されない場合、発現された両融合タンパク質はま
た、ウィルスを中和するモノクローナル抗体と弱く但し
特異的に反応する。クローンＤ１中に発現されたＩＢＤ
Ｖポリペプチドは、１５０個のアミノ酸残基のみであ
り、そして３２Kdタンパク質の約半分を構成するが、し
かしウェスターン法に基づく３２Kdタンパク質に対して
特異的であるＭＡｂ（１７〜８０）によって認識される
エピトープ、及びウィルスを中和するＭＡｂ（１７〜８
２）によって認識されるエピトープの少なくとも一部を
含むことは有意義である。
及びＤ６中に発現される融合タンパク質は、ウェスター
ン法に基づいて３２Kd構造タンパク質を認識するモノク
ローナル抗体とひじょうに強く反応する。ＳＤＳにより
処理されない場合、発現された両融合タンパク質はま
た、ウィルスを中和するモノクローナル抗体と弱く但し
特異的に反応する。クローンＤ１中に発現されたＩＢＤ
Ｖポリペプチドは、１５０個のアミノ酸残基のみであ
り、そして３２Kdタンパク質の約半分を構成するが、し
かしウェスターン法に基づく３２Kdタンパク質に対して
特異的であるＭＡｂ（１７〜８０）によって認識される
エピトープ、及びウィルスを中和するＭＡｂ（１７〜８
２）によって認識されるエピトープの少なくとも一部を
含むことは有意義である。
【００６６】発現されたタンパク質の免疫性
クローンＤ１及びＤ６からの融合タンパク質を、材料及
び方法で記載したようにして、ＳＰＦ鶏及び前もって生
きたＩＢＤＶにより感作された鶏の両者に注射した。両
鶏の群から得られた血清における抗体の特異性を、電気
泳動にかける前、ＳＤＳ中で煮沸された全ＩＢＤＶ粒子
のウェスターンブロットによって分析した（図９）。
び方法で記載したようにして、ＳＰＦ鶏及び前もって生
きたＩＢＤＶにより感作された鶏の両者に注射した。両
鶏の群から得られた血清における抗体の特異性を、電気
泳動にかける前、ＳＤＳ中で煮沸された全ＩＢＤＶ粒子
のウェスターンブロットによって分析した（図９）。
【００６７】前もって感作された鶏は、融合タンパク質
によるワクチン投与の前、比較的低レベルでＩＢＤＶの
３２Kd，３７Kd及び４２Kd構造ポリペプチドに対する抗
体を有した。クローンＤ６及びＤ１からの融合タンパク
質は、すべてのこれらの鶏において、特定の抗−３２Kd
抗体反応を呼び戻したが、ところが他の構造タンパク質
への結合の強さは、変化されず残存した。感作されてい
ないＳＰＦ鶏においては、融合タンパク質は、いくつか
の鶏のみに抗体の合成を誘導した。しかしながら、抗体
が検出される場合、それらは、ＩＢＤＶの３２Kd構造ポ
リペプチドのためにウェスターン法によって特定され
た。従って、クローンＤ６及びＤ１中に発現された融合
タンパク質は、感作された及び感作されなかった両鶏に
おいて３２Kdポリペプチドに対して特異的な抗体を誘導
する。
によるワクチン投与の前、比較的低レベルでＩＢＤＶの
３２Kd，３７Kd及び４２Kd構造ポリペプチドに対する抗
体を有した。クローンＤ６及びＤ１からの融合タンパク
質は、すべてのこれらの鶏において、特定の抗−３２Kd
抗体反応を呼び戻したが、ところが他の構造タンパク質
への結合の強さは、変化されず残存した。感作されてい
ないＳＰＦ鶏においては、融合タンパク質は、いくつか
の鶏のみに抗体の合成を誘導した。しかしながら、抗体
が検出される場合、それらは、ＩＢＤＶの３２Kd構造ポ
リペプチドのためにウェスターン法によって特定され
た。従って、クローンＤ６及びＤ１中に発現された融合
タンパク質は、感作された及び感作されなかった両鶏に
おいて３２Kdポリペプチドに対して特異的な抗体を誘導
する。
【００６８】融合タンパク質により感作された鶏及びワ
クチン投与されたＳＰＦ鶏から得られた血清を、ＥＬＩ
ＳＡ及びその生来のコンホーメーションにおいて感染防
御免疫原を認識するように設計されたマイクロ−ウィル
ス中和アッセイによって検定した。ＥＬＩＳＡによって
検出できる抗体のレベルは、たとえそれらがウェスター
ンブロットされたウィルスタンパク質とひじょうに強く
反応したとしても、感作された鶏において前もって存在
するレベルよりも２〜４倍以上又はＳＰＦ鶏において
は、ベースラインレベル（＜１：１００）以上増大しな
かった。
クチン投与されたＳＰＦ鶏から得られた血清を、ＥＬＩ
ＳＡ及びその生来のコンホーメーションにおいて感染防
御免疫原を認識するように設計されたマイクロ−ウィル
ス中和アッセイによって検定した。ＥＬＩＳＡによって
検出できる抗体のレベルは、たとえそれらがウェスター
ンブロットされたウィルスタンパク質とひじょうに強く
反応したとしても、感作された鶏において前もって存在
するレベルよりも２〜４倍以上又はＳＰＦ鶏において
は、ベースラインレベル（＜１：１００）以上増大しな
かった。
【００６９】ウィルス中和アッセイはまた、前もって感
作された鶏における抗体のレベルにおいて劇的な上昇を
示さないが、しかしクローンＤ１からのアフィニティー
精製されたタンパク質によりワクチン投与された１又は
２種のＳＰＦ鶏においては、１：３２０〜１：１６０の
力価を検出した。その抗体の力価は、クローンＤ１から
のタンパク質の第２回目の注射の後、３〜４週間でピー
クに成り、そして６週間以上の間、持続した。ウェスタ
ーン法による、Ｄ１タンパク質に対するこの鶏の多クロ
ーン性反応は、ＩＢＤＶの３２Kdポリペプチドに対して
特異的であった。
作された鶏における抗体のレベルにおいて劇的な上昇を
示さないが、しかしクローンＤ１からのアフィニティー
精製されたタンパク質によりワクチン投与された１又は
２種のＳＰＦ鶏においては、１：３２０〜１：１６０の
力価を検出した。その抗体の力価は、クローンＤ１から
のタンパク質の第２回目の注射の後、３〜４週間でピー
クに成り、そして６週間以上の間、持続した。ウェスタ
ーン法による、Ｄ１タンパク質に対するこの鶏の多クロ
ーン性反応は、ＩＢＤＶの３２Kdポリペプチドに対して
特異的であった。
【００７０】従って、融合タンパク質に対して産生され
た抗体は、ウェスターンブロットされた、ＩＢＤＶの３
２Kd宿主保護性抗原とひじょうに特異的に且つ強く反応
するが、しかし比較的弱いＥＬＩＳＡ力価及び４匹の鶏
のうち１匹のみにおいて、ウィルス中和活性を有する。
さらに、発現されたタンパク質は、ウィルスを中和する
モノクローナル抗体とひじょうに弱く反応する。これら
の結果は、免疫原性ではあるが、β−ガラクトシダーゼ
に融合した、発現されたＩＢＤＶタンパク質が、ウィル
ス中和又は感染防御抗体の一貫した誘導のために必要な
正しいコンホーメーションを持たないことを強く示す。
正しいコンホーメーションを有する、非融合タンパク質
の発現は、たぶん、ＩＢＤＶに対する、より効果的なサ
ブユニットワクチンを産生するために必要とされるであ
ろう。
た抗体は、ウェスターンブロットされた、ＩＢＤＶの３
２Kd宿主保護性抗原とひじょうに特異的に且つ強く反応
するが、しかし比較的弱いＥＬＩＳＡ力価及び４匹の鶏
のうち１匹のみにおいて、ウィルス中和活性を有する。
さらに、発現されたタンパク質は、ウィルスを中和する
モノクローナル抗体とひじょうに弱く反応する。これら
の結果は、免疫原性ではあるが、β−ガラクトシダーゼ
に融合した、発現されたＩＢＤＶタンパク質が、ウィル
ス中和又は感染防御抗体の一貫した誘導のために必要な
正しいコンホーメーションを持たないことを強く示す。
正しいコンホーメーションを有する、非融合タンパク質
の発現は、たぶん、ＩＢＤＶに対する、より効果的なサ
ブユニットワクチンを産生するために必要とされるであ
ろう。
【００７１】このような関係においては、クローンＤ１
からの融合タンパク質により注射された１匹の鶏の血清
は、有意なウィルス中和活性を有したことがくり返され
るべきである。この場合、ＩＢＤＶタンパク質は、β−
ガラクトシダーゼをタンパク質分解的に切断し、そして
ウィルス中和性抗体反応を誘導するために必要とされる
コンホーメーションを仮定し得る。次の実験において、
非融合タンパク質を産生するベクター中に３２Kdタンパ
ク質のための遺伝子を発現することによって、非融合３
２Kdタンパク質を、産生された。
からの融合タンパク質により注射された１匹の鶏の血清
は、有意なウィルス中和活性を有したことがくり返され
るべきである。この場合、ＩＢＤＶタンパク質は、β−
ガラクトシダーゼをタンパク質分解的に切断し、そして
ウィルス中和性抗体反応を誘導するために必要とされる
コンホーメーションを仮定し得る。次の実験において、
非融合タンパク質を産生するベクター中に３２Kdタンパ
ク質のための遺伝子を発現することによって、非融合３
２Kdタンパク質を、産生された。
【００７２】この非融合タンパク質は、変性された３２
Kdタンパク質と殆んど反応するＭＡｂ １７〜８０とよ
りも少ない程度ではあるが、ウィルス中和性ＭＡｂ １
７〜８２と反応した。従って、正しい立体構造を有する
３２Kd抗原を産生するための１つの手段は、２つのタン
パク質の接合点で、化学的又は酵素的切断によってアフ
ィニティー精製された融合タンパク質からＩＢＤＶ抗原
を切断することである。この方法は、さらに再生段階を
必要とするが、非融合タンパク質と比べて、融合タンパ
ク質の発現のレベルはひじょうに高く、そしてその融合
タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによ
って容易に精製され得る。次の詳細な説明は、ＩＢＤＶ
ＲＮＡの大セグメントのヌクレオチド配列及びＩＢＤ
Ｖの３２Kd宿主保護性抗原をコードするｃＤＮＡクロー
ンのアミノ酸配列の決定に関する。添付図面において：
Kdタンパク質と殆んど反応するＭＡｂ １７〜８０とよ
りも少ない程度ではあるが、ウィルス中和性ＭＡｂ １
７〜８２と反応した。従って、正しい立体構造を有する
３２Kd抗原を産生するための１つの手段は、２つのタン
パク質の接合点で、化学的又は酵素的切断によってアフ
ィニティー精製された融合タンパク質からＩＢＤＶ抗原
を切断することである。この方法は、さらに再生段階を
必要とするが、非融合タンパク質と比べて、融合タンパ
ク質の発現のレベルはひじょうに高く、そしてその融合
タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによ
って容易に精製され得る。次の詳細な説明は、ＩＢＤＶ
ＲＮＡの大セグメントのヌクレオチド配列及びＩＢＤ
Ｖの３２Kd宿主保護性抗原をコードするｃＤＮＡクロー
ンのアミノ酸配列の決定に関する。添付図面において：
【００７３】図１０〜１５は、ＩＢＤＶの大ＲＮＡセグ
メントの配列分析を示す。予測されたアミノ酸配列は、
ｃＤＮＡクローンに由来されたヌクレオチド配列の上に
単一の文字コードで表わされる。他の広範な読み取り枠
は存在しない。アミノ酸配列は、位置１として３７Kdタ
ンパク質のＮ−末端から連続して番号をつけられてい
る。ｃＤＮＡクローンＭ７，Ｇ６，Ｌ６，Ｄ６及びＤ１
によって包含される領域が示されている。
メントの配列分析を示す。予測されたアミノ酸配列は、
ｃＤＮＡクローンに由来されたヌクレオチド配列の上に
単一の文字コードで表わされる。他の広範な読み取り枠
は存在しない。アミノ酸配列は、位置１として３７Kdタ
ンパク質のＮ−末端から連続して番号をつけられてい
る。ｃＤＮＡクローンＭ７，Ｇ６，Ｌ６，Ｄ６及びＤ１
によって包含される領域が示されている。
【００７４】二塩基性残基は箱に囲まれ、そして反復ユ
ニットＡ−Ｘ−Ａ−Ａ−Ｓは同様に、強調されている。
トリプシンペプチドに由来されたＮ−末端配列は、３７
Kdのために（−−−−＞）として、２８Kdのために（・
・・・＞）として及び３２Kdタンパク質のために（- -
- - ＞）として示されている。３７Kdタンパク質のＮ−
末端のみが、完全なタンパク質に基づく直接的な配列決
定によって得られ、そしてこれは残基１から示されてい
る。
ニットＡ−Ｘ−Ａ−Ａ−Ｓは同様に、強調されている。
トリプシンペプチドに由来されたＮ−末端配列は、３７
Kdのために（−−−−＞）として、２８Kdのために（・
・・・＞）として及び３２Kdタンパク質のために（- -
- - ＞）として示されている。３７Kdタンパク質のＮ−
末端のみが、完全なタンパク質に基づく直接的な配列決
定によって得られ、そしてこれは残基１から示されてい
る。
【００７５】結果及び討論 ランダムヌクレオチド配列決定
ＩＢＤＶの完全な大ＲＮＡセグメントを補うｃＤＮＡ挿
入体（３５０〜２０００b.p.）の混合集団を、選択され
たｃＤＮＡライブラリィのＰｓｔＩ消化の後、１％アガ
ロースゲルからＤＥＡＥ−セルロース上に回収した。Ｎ
ＡＣＳカラム（Schleicher & Schull ）上での精製の
後、両端から５０よりも少ないヌクレオチドを消化する
ようにされた制御反応（２ユニット、２０℃、１０分）
において、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼを用いてホモ
ポリマー性テールを、除去した。次に、そのフラグメン
トを、ＤＮＡポリマラーゼ（クレノウフラグメント）に
よりブラント末端化し、そしてＳｍａＩにより制限され
たＭ１３ｍｐ１０ベクター中に連結し、次にＥ．コリＪ
Ｍ１０１を形質転換した（Sangerなど., 1980 ）。
入体（３５０〜２０００b.p.）の混合集団を、選択され
たｃＤＮＡライブラリィのＰｓｔＩ消化の後、１％アガ
ロースゲルからＤＥＡＥ−セルロース上に回収した。Ｎ
ＡＣＳカラム（Schleicher & Schull ）上での精製の
後、両端から５０よりも少ないヌクレオチドを消化する
ようにされた制御反応（２ユニット、２０℃、１０分）
において、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼを用いてホモ
ポリマー性テールを、除去した。次に、そのフラグメン
トを、ＤＮＡポリマラーゼ（クレノウフラグメント）に
よりブラント末端化し、そしてＳｍａＩにより制限され
たＭ１３ｍｐ１０ベクター中に連結し、次にＥ．コリＪ
Ｍ１０１を形質転換した（Sangerなど., 1980 ）。
【００７６】単鎖の鋳型を、Ｍ１３−特異性プライマー
を用いる感作合成法（Sangerなど.,1980 ）によって、
但し、鋳型における二次構造の領域にわたっての転写忠
実度を改良する変法により配列決定した。これらは、逆
転写酵素及び最適比（１：３０Ａ；２：１５Ｃ；１：１
５Ｇ；２：３Ｔ）のジデオキシヌクレオチド：デオキシ
ヌクレオチドを用いて、そして３０℃又はそれよりも高
い温度で反応を行なうことにより、緩衝液からのＮａＣ
ｌの除去を包含した。配列は、Dr.T.Kyne による修飾を
含む、Staden（1982）のプログラムを用いるＶＡＸ／Ｕ
ＭＳコンピューターシステムを用いて、作られた。
を用いる感作合成法（Sangerなど.,1980 ）によって、
但し、鋳型における二次構造の領域にわたっての転写忠
実度を改良する変法により配列決定した。これらは、逆
転写酵素及び最適比（１：３０Ａ；２：１５Ｃ；１：１
５Ｇ；２：３Ｔ）のジデオキシヌクレオチド：デオキシ
ヌクレオチドを用いて、そして３０℃又はそれよりも高
い温度で反応を行なうことにより、緩衝液からのＮａＣ
ｌの除去を包含した。配列は、Dr.T.Kyne による修飾を
含む、Staden（1982）のプログラムを用いるＶＡＸ／Ｕ
ＭＳコンピューターシステムを用いて、作られた。
【００７７】指図された化学的配列決定
ｐＢＲ３２２又はｐＵＲ発現ベクターのいづれかの特異
的ｃＤＮＡフラグメントを、まず３７℃で１時間、逆転
写酵素及びα−32Ｐ−ｄＡＴＰ又はα−32Ｐ−ｄＣＴＰ
のいづれかによりラベルされた末端である制限部位を同
定した後、Maxam 及びGilbert （1977）の方法によって
配列決定した。この方法は、しばしば、一端のみで放射
性ラベルを有する分子を生成するために逆転写酵素段階
の後、第二制限消化を必要とした。
的ｃＤＮＡフラグメントを、まず３７℃で１時間、逆転
写酵素及びα−32Ｐ−ｄＡＴＰ又はα−32Ｐ−ｄＣＴＰ
のいづれかによりラベルされた末端である制限部位を同
定した後、Maxam 及びGilbert （1977）の方法によって
配列決定した。この方法は、しばしば、一端のみで放射
性ラベルを有する分子を生成するために逆転写酵素段階
の後、第二制限消化を必要とした。
【００７８】次に、そのフラグメントを、８％ポリアク
リルアミドゲルから電気溶離によって精製した。化学的
な分解の後、配列決定サンプルを、９０％ホルムアミド
を含む、変性ポリアクリルアミドゲル（Sanger and Cou
lson, 1978）上に負荷した。これらの条件下で、５０℃
以上の温度を保持する装置により２５Ｗで２０cm×４０
cmのゲルを行なう場合、その二次構造が完全に破壊され
た。
リルアミドゲルから電気溶離によって精製した。化学的
な分解の後、配列決定サンプルを、９０％ホルムアミド
を含む、変性ポリアクリルアミドゲル（Sanger and Cou
lson, 1978）上に負荷した。これらの条件下で、５０℃
以上の温度を保持する装置により２５Ｗで２０cm×４０
cmのゲルを行なう場合、その二次構造が完全に破壊され
た。
【００７９】ＩＢＤＶの大ＲＮＡセグメントのヌクレオ
チド配列分析 ｃＤＮＡライブラリィーは、平均長さ２０〜３０個のヌ
クレオチドのＧ／Ｃホモポリマーテールにより構成され
ているので、Ｍ１３ベクター中へのＰｓｔＩフラグメン
トの簡単なサブクローニングによって、直接的にこれら
のテールにわたる明確な配列を得ることはできなかっ
た。その代わりに、テールを除去し、そして次にＳｍａ
Ｉにより消化されたＭ１３ｍｐ１０中にブラント末端連
結によりＩＢＤＶゲノムのランドムｃＤＮＡフラグメン
トをサブクローンするために、Ｂａｌ３１エキソヌクレ
アーゼを用いる方法を採用した。
チド配列分析 ｃＤＮＡライブラリィーは、平均長さ２０〜３０個のヌ
クレオチドのＧ／Ｃホモポリマーテールにより構成され
ているので、Ｍ１３ベクター中へのＰｓｔＩフラグメン
トの簡単なサブクローニングによって、直接的にこれら
のテールにわたる明確な配列を得ることはできなかっ
た。その代わりに、テールを除去し、そして次にＳｍａ
Ｉにより消化されたＭ１３ｍｐ１０中にブラント末端連
結によりＩＢＤＶゲノムのランドムｃＤＮＡフラグメン
トをサブクローンするために、Ｂａｌ３１エキソヌクレ
アーゼを用いる方法を採用した。
【００８０】大ＲＮＡセグメントに由来した場合、その
ｃＤＮＡフラグメントを、最初に、特定のプローブとの
コロニィーハイブリダイゼーションによって選択した。
ランダムヌクレオチド配列をすぐに選別し、そしてコン
ピュータープログラムの助けにより一致した配列中にオ
ーバーラップした。最終配列は２９５０b.p.を含み、そ
して６０以上のオーバーラッピング配列から構成され
た。点突然変異又は転位は、ランダムにプライムされた
転写、次に再アニーリング及びポリマラーゼ延長により
元のライブラリィ構成体が著しくエラーを持たないこと
を確認するオーバーラッピング配列中には見つけられな
かった。
ｃＤＮＡフラグメントを、最初に、特定のプローブとの
コロニィーハイブリダイゼーションによって選択した。
ランダムヌクレオチド配列をすぐに選別し、そしてコン
ピュータープログラムの助けにより一致した配列中にオ
ーバーラップした。最終配列は２９５０b.p.を含み、そ
して６０以上のオーバーラッピング配列から構成され
た。点突然変異又は転位は、ランダムにプライムされた
転写、次に再アニーリング及びポリマラーゼ延長により
元のライブラリィ構成体が著しくエラーを持たないこと
を確認するオーバーラッピング配列中には見つけられな
かった。
【００８１】しかしながら、２つの問題がこのアプロー
チから現われた。第１に、サブクローニングが明確にラ
ンダムでない；いくつかの領域に何度も配列され、とこ
ろがヌクレオチド２２５０〜２６００からの領域を含む
ｃＤＮＡフラグメントはＭ１３中にサブクローンされ得
なかった。第２に、Sangerなど．（1980）の鎖終結方法
によって得られたヌクレオチド配列の一般的性質が、転
写酵素反応における未成熟終結を引き起こす二次構造の
多領域により不十分であった。
チから現われた。第１に、サブクローニングが明確にラ
ンダムでない；いくつかの領域に何度も配列され、とこ
ろがヌクレオチド２２５０〜２６００からの領域を含む
ｃＤＮＡフラグメントはＭ１３中にサブクローンされ得
なかった。第２に、Sangerなど．（1980）の鎖終結方法
によって得られたヌクレオチド配列の一般的性質が、転
写酵素反応における未成熟終結を引き起こす二次構造の
多領域により不十分であった。
【００８２】この後者の問題は、標準のＤＮＡポリマラ
ーゼ（クレノウフラグメント）よりもむしろ最適な条件
下での逆転写酵素の使用によって一部克服した。これら
の二次構造問題は、他の遺伝子が同時に配列決定される
ので（Hudsonなど., 1984 ；McIntyreなど., 1985 ）、
この二重鎖ＲＮＡウィルスに関して特にひどいように思
われる。これらの問題を克服するために、二次構造及び
配列決定序列を決定するために、変性ホルムアミドゲル
の使用によってほとんど影響を受けない、Maxam and Gi
lbert （1977）の化学的分解技法に頼った。
ーゼ（クレノウフラグメント）よりもむしろ最適な条件
下での逆転写酵素の使用によって一部克服した。これら
の二次構造問題は、他の遺伝子が同時に配列決定される
ので（Hudsonなど., 1984 ；McIntyreなど., 1985 ）、
この二重鎖ＲＮＡウィルスに関して特にひどいように思
われる。これらの問題を克服するために、二次構造及び
配列決定序列を決定するために、変性ホルムアミドゲル
の使用によってほとんど影響を受けない、Maxam and Gi
lbert （1977）の化学的分解技法に頼った。
【００８３】興味深いことには、最ともひどい第二構造
問題を有する領域（ヌクレオチド２５４０〜２５６５）
が、Ｍ１３中にサブクローンされ得なかったフラグメン
ト内に得られた。Ｍ１３に対して致死的であるこの構造
の重要性は、さらに特徴づけられてはいない；それは３
２Kdタンパク質生成物のコード領域内に得られる。
問題を有する領域（ヌクレオチド２５４０〜２５６５）
が、Ｍ１３中にサブクローンされ得なかったフラグメン
ト内に得られた。Ｍ１３に対して致死的であるこの構造
の重要性は、さらに特徴づけられてはいない；それは３
２Kdタンパク質生成物のコード領域内に得られる。
【００８４】３２Kd宿主保護性免疫原をコードする遺伝
子の同定 ２つの方法が平行して試みられた；トリプシンペプチド
のタンパク質配列決定は、精製された３２Kdタンパク質
及び融合タンパク質として３２Kd抗原のフラグメントを
発現するｃＤＮＡクローンのイムノブロットアッセイに
よる同定に由来した。発現研究のためには、ベクターが
最近、記載されている。ここでｃＤＮＡフラグメント
は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の３′末端中に連結さ
れ得る（Ruther and Muller-Hill, 1983；Stanley and
Luzio, 1984 ）。
子の同定 ２つの方法が平行して試みられた；トリプシンペプチド
のタンパク質配列決定は、精製された３２Kdタンパク質
及び融合タンパク質として３２Kd抗原のフラグメントを
発現するｃＤＮＡクローンのイムノブロットアッセイに
よる同定に由来した。発現研究のためには、ベクターが
最近、記載されている。ここでｃＤＮＡフラグメント
は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の３′末端中に連結さ
れ得る（Ruther and Muller-Hill, 1983；Stanley and
Luzio, 1984 ）。
【００８５】これらの構成法によって産生された融合タ
ンパク質は、特に安定しているようであり、そして宿主
細胞タンパク質の３０％までのハイブリッド−タンパク
質合成の要求を導びいた。適切な誘導可能プロモーター
に関しては、十分なタンパク質が、封入体として現われ
る非晶形細胞塊を形成するために産生される。ｃＤＮＡ
によってコードされる遺伝子のみを発現するようにされ
たプラスミドベクター（ｐＵＣ，ｐＣＱＶ）は、そのよ
うな高レベルの発現タンパク質を産生するように思われ
ない。
ンパク質は、特に安定しているようであり、そして宿主
細胞タンパク質の３０％までのハイブリッド−タンパク
質合成の要求を導びいた。適切な誘導可能プロモーター
に関しては、十分なタンパク質が、封入体として現われ
る非晶形細胞塊を形成するために産生される。ｃＤＮＡ
によってコードされる遺伝子のみを発現するようにされ
たプラスミドベクター（ｐＵＣ，ｐＣＱＶ）は、そのよ
うな高レベルの発現タンパク質を産生するように思われ
ない。
【００８６】これらの理由のために、まだホモポリマー
テールを含む、完全なＩＢＤＶゲノムを補うｃＤＮＡフ
ラグメントの混合集団を、ベクター、ｐＵＲ２９０，ｐ
ＵＲ２９１，ｐＵＲ２９２のＰｓｔＩ部位中にサブクロ
ーンし、すべての３つの読み枠に翻訳を確保する。組換
え体コロニィーを、変性された３２Kdタンパク質に対し
て生じさせられたモノクローナル抗血清を用いるイムノ
ブロットアッセイ（後を参照のこと）、次に 125Ｉ−プ
ロティンＡを用いるオートラジオグラフィ又はペルオキ
シダーゼ接合の第二抗血清による目での検出のいづれか
によってスクリーンした。２つのコロニィーが抗−３２
Kd抗血清によって認識されたエピトープを発現した；１
つは前に記載された１１００b.p.フラグメントＤ６の直
接的サブクローンであり、そして他は、Ｄ６内に完全に
含まれる、短い４５０b.p.のｃＤＮＡフラグメントＤ１
であった（図１０〜１５）。
テールを含む、完全なＩＢＤＶゲノムを補うｃＤＮＡフ
ラグメントの混合集団を、ベクター、ｐＵＲ２９０，ｐ
ＵＲ２９１，ｐＵＲ２９２のＰｓｔＩ部位中にサブクロ
ーンし、すべての３つの読み枠に翻訳を確保する。組換
え体コロニィーを、変性された３２Kdタンパク質に対し
て生じさせられたモノクローナル抗血清を用いるイムノ
ブロットアッセイ（後を参照のこと）、次に 125Ｉ−プ
ロティンＡを用いるオートラジオグラフィ又はペルオキ
シダーゼ接合の第二抗血清による目での検出のいづれか
によってスクリーンした。２つのコロニィーが抗−３２
Kd抗血清によって認識されたエピトープを発現した；１
つは前に記載された１１００b.p.フラグメントＤ６の直
接的サブクローンであり、そして他は、Ｄ６内に完全に
含まれる、短い４５０b.p.のｃＤＮＡフラグメントＤ１
であった（図１０〜１５）。
【００８７】ｐＵＲベクターにおいてＥｃｏＲＩ部位か
らホモポリマーテールにわたって配列決定する、指図さ
れたヌクレオチドは、クローニングベクター（Ｄ１のた
めにはｐＵＲ２９０；Ｄ６のためにはｐＵＲ２９１）及
び組換え体生成物の翻訳相の両者を容易に同定した。Ｄ
６及びＤ１の完全なヌクレオチド配列を、適切な末端を
ラベルされたフラグメント上にMaxam 及びGilbert 技法
によって得た。この配列は、ランダム配列決定アプロー
チによって生成されたコンセンサスをオーバラップし、
従って、Ｍ１３中にサブクローンされ得なかった領域を
補足し、そして図１０〜１５に示されている３１２９b.
p.ゲノムを完結した。
らホモポリマーテールにわたって配列決定する、指図さ
れたヌクレオチドは、クローニングベクター（Ｄ１のた
めにはｐＵＲ２９０；Ｄ６のためにはｐＵＲ２９１）及
び組換え体生成物の翻訳相の両者を容易に同定した。Ｄ
６及びＤ１の完全なヌクレオチド配列を、適切な末端を
ラベルされたフラグメント上にMaxam 及びGilbert 技法
によって得た。この配列は、ランダム配列決定アプロー
チによって生成されたコンセンサスをオーバラップし、
従って、Ｍ１３中にサブクローンされ得なかった領域を
補足し、そして図１０〜１５に示されている３１２９b.
p.ゲノムを完結した。
【００８８】Ｄ６領域の例外に関して、ゲノム配列の残
余を、多数の独立ｃＤＮＡクローンから集めた。このラ
ンダムアプローチは、ｃＤＮＡライブラリィーの元の構
成が著しくエラーを持たないことを示したが、Ｄ６中に
二次構造を有する領域が間違って転写されたことに関心
が持たれた。この点を克服するために、それぞれ１２５
０〜２７５０及び２２１０〜３１５０の残基を補う、さ
らに２種のクローン（Ｇ２及びＮ１）を、直接的化学方
法によって完全に配列決定した。Ｄ６とＩＢＤＶゲノム
の転写が正しかったことを示すこれらのクローンとの間
に不明瞭さは見出されなかった。
余を、多数の独立ｃＤＮＡクローンから集めた。このラ
ンダムアプローチは、ｃＤＮＡライブラリィーの元の構
成が著しくエラーを持たないことを示したが、Ｄ６中に
二次構造を有する領域が間違って転写されたことに関心
が持たれた。この点を克服するために、それぞれ１２５
０〜２７５０及び２２１０〜３１５０の残基を補う、さ
らに２種のクローン（Ｇ２及びＮ１）を、直接的化学方
法によって完全に配列決定した。Ｄ６とＩＢＤＶゲノム
の転写が正しかったことを示すこれらのクローンとの間
に不明瞭さは見出されなかった。
【００８９】ｃＤＮＡクローンの間に観察された相違の
みが、ホモポリマーテールに隣接する最後の１０個のヌ
クレオチドに常に存在した。これらの配列が、ＤＮＡポ
リマラーゼフィル−イン反応（Hudsonなど., 1984 ）に
よって発生される潜在的エラーを含むことが知られてい
て、そして従って、コンセンサスに含まれなかった。ラ
ンダム配列決定アプローチに影響を及ぼす二次構造によ
る潜在的な不明瞭さの領域を、一緒になって図１０〜１
５に示されている全配列にわたるＭ７，Ａ３，Ｌ６，Ｇ
２又はＤ６のｃＤＮＡ挿入体内の適切な制限部位から直
接的な化学的配列決定によって解決した。コンセンサス
の５′及び３′末端配列を、それぞれＭ７及びＤ６の末
端によって定義する。
みが、ホモポリマーテールに隣接する最後の１０個のヌ
クレオチドに常に存在した。これらの配列が、ＤＮＡポ
リマラーゼフィル−イン反応（Hudsonなど., 1984 ）に
よって発生される潜在的エラーを含むことが知られてい
て、そして従って、コンセンサスに含まれなかった。ラ
ンダム配列決定アプローチに影響を及ぼす二次構造によ
る潜在的な不明瞭さの領域を、一緒になって図１０〜１
５に示されている全配列にわたるＭ７，Ａ３，Ｌ６，Ｇ
２又はＤ６のｃＤＮＡ挿入体内の適切な制限部位から直
接的な化学的配列決定によって解決した。コンセンサス
の５′及び３′末端配列を、それぞれＭ７及びＤ６の末
端によって定義する。
【００９０】３２Kd抗原の構造
図１０〜１５上の矢印は、ホモポリマーテールに隣接す
る初期残基が含まれていないことを示す、Ｄ６及びＤ１
のｐＵＲサブクローン中の翻訳相を示す。残基３０６５
での終止コドンは明確であるが、３２Ｋ抗原のＮ−末端
残基は明確でない。関連したＩＰＮＶ又はＤｒｏｓｐｈ
ｉｌａ Ｘウィルスを包含する場合、そのタンパク質が
ポリシストロニックＲＮＡ鋳型から生成されるなら、サ
イズ見積と一致する、２９Kdの生成物を与えるＭＥＴ２
２８７での開始を予期できるであろう。しかしながら、
３２Kdタンパク質が前駆体のプロセシングによって生成
されるなら、Ｃ−末端が完全であることを仮定して、Ｍ
ＥＴ残基の前のどこかでタンパク質分解による切断を予
期できるであろう。
る初期残基が含まれていないことを示す、Ｄ６及びＤ１
のｐＵＲサブクローン中の翻訳相を示す。残基３０６５
での終止コドンは明確であるが、３２Ｋ抗原のＮ−末端
残基は明確でない。関連したＩＰＮＶ又はＤｒｏｓｐｈ
ｉｌａ Ｘウィルスを包含する場合、そのタンパク質が
ポリシストロニックＲＮＡ鋳型から生成されるなら、サ
イズ見積と一致する、２９Kdの生成物を与えるＭＥＴ２
２８７での開始を予期できるであろう。しかしながら、
３２Kdタンパク質が前駆体のプロセシングによって生成
されるなら、Ｃ−末端が完全であることを仮定して、Ｍ
ＥＴ残基の前のどこかでタンパク質分解による切断を予
期できるであろう。
【００９１】トリプシンフラグメントのペプチド配列決
定は、Ｄ６及びＤ１発現ベクターから予測されるリーデ
ィング相及び３２Kdタンパク質が残基２３７２〜３００
８を補足することの両者を確認した。現在までに配列決
定されたすべての９個のペプチドは、領域３′〜ＭＥＴ
２２８７に位置する。しかしながら、完全な３２Kd抗原
は、タンパク質分解の後、Ｎ−末端残基としてＧｌｎ２
２７４をたぶん示す、ブロックされたＮ−末端を有す
る。
定は、Ｄ６及びＤ１発現ベクターから予測されるリーデ
ィング相及び３２Kdタンパク質が残基２３７２〜３００
８を補足することの両者を確認した。現在までに配列決
定されたすべての９個のペプチドは、領域３′〜ＭＥＴ
２２８７に位置する。しかしながら、完全な３２Kd抗原
は、タンパク質分解の後、Ｎ−末端残基としてＧｌｎ２
２７４をたぶん示す、ブロックされたＮ−末端を有す
る。
【００９２】ＩＢＤＶゲノムの大セグメントの完全なヌ
クレオチド配列に由来するアミノ酸配列を、図１０〜１
５に示す。精製されたウィルスタンパク質の一部のペプ
チド配列決定は、これらの配列を確認し、そしてゲノム
の大セグメント上にウィルスタンパク質のコード領域の
位置決定を可能にした。ゲノムＲＮＡの３′末端で、た
った１つの翻訳終結コドンが存在し、そしてその安全な
ゲノムは、単一のポリタンパク質として発現され、ここ
でウィルスタンパク質は、次の順序：Ｎ−４１／３７Kd
−２８Kd−３２Kd−Ｃで配列されているらしい。
クレオチド配列に由来するアミノ酸配列を、図１０〜１
５に示す。精製されたウィルスタンパク質の一部のペプ
チド配列決定は、これらの配列を確認し、そしてゲノム
の大セグメント上にウィルスタンパク質のコード領域の
位置決定を可能にした。ゲノムＲＮＡの３′末端で、た
った１つの翻訳終結コドンが存在し、そしてその安全な
ゲノムは、単一のポリタンパク質として発現され、ここ
でウィルスタンパク質は、次の順序：Ｎ−４１／３７Kd
−２８Kd−３２Kd−Ｃで配列されているらしい。
【００９３】ウィルスタンパク質に対するこの大きな前
駆体の正確なプロセシングメカニズムはまだ定義されて
いない。真核性前駆体タンパク質のためにたびたび目標
である二塩基性残基は、残基４５１〜４５２及び７２１
〜７２２で便利に位置し、そしてこれらの部位での切断
は、予測される２８．２Kdタンパク質を切り出すであろ
う。その切断部位は、３７Kdタンパク質が少なくとも塩
基残基３２〜１３１６にわたり、２８Kdタンパク質が少
なくとも塩基残基１１６０〜１８７０にわたり、そして
３２Kdタンパク質が少なくとも塩基残基２３１０〜３０
３０にわたることを確認するペプチド配列決定データと
一致する。
駆体の正確なプロセシングメカニズムはまだ定義されて
いない。真核性前駆体タンパク質のためにたびたび目標
である二塩基性残基は、残基４５１〜４５２及び７２１
〜７２２で便利に位置し、そしてこれらの部位での切断
は、予測される２８．２Kdタンパク質を切り出すであろ
う。その切断部位は、３７Kdタンパク質が少なくとも塩
基残基３２〜１３１６にわたり、２８Kdタンパク質が少
なくとも塩基残基１１６０〜１８７０にわたり、そして
３２Kdタンパク質が少なくとも塩基残基２３１０〜３０
３０にわたることを確認するペプチド配列決定データと
一致する。
【００９４】３７Kdタンパク質をコードする領域はま
た、３７Kdタンパク質よりもより大きな５２Kd及び４１
Kd前駆体をコードすると思われる。他方の切断部位は、
残基４８３〜５０３の間で３回くり返えされ、そしてま
た残基７５２〜７５６で現われるペプチド配列、Ａ−Ｘ
−Ａ−Ａ−Ｓであることができる。次の詳細な説明は、
ＩＢＤＶに対するモノクローナル抗体の産生及びこれら
のモノクローナル抗体を用いて、ＩＢＤＶ上の中和性エ
ピトープの同定に関する。添付図面において：図１６
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、完全なウィルスに対する抗
−ＩＢＤＶ ＭＡｂのウェスターン法分析を示す。図１
７は、抗−ＩＢＤＶ ＭＡｂとＩＢＤＶに対する鶏抗−
３２Kd特異性抗血清との間のコンペティティブＥＬＩＳ
Ａを示す。
た、３７Kdタンパク質よりもより大きな５２Kd及び４１
Kd前駆体をコードすると思われる。他方の切断部位は、
残基４８３〜５０３の間で３回くり返えされ、そしてま
た残基７５２〜７５６で現われるペプチド配列、Ａ−Ｘ
−Ａ−Ａ−Ｓであることができる。次の詳細な説明は、
ＩＢＤＶに対するモノクローナル抗体の産生及びこれら
のモノクローナル抗体を用いて、ＩＢＤＶ上の中和性エ
ピトープの同定に関する。添付図面において：図１６
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、完全なウィルスに対する抗
−ＩＢＤＶ ＭＡｂのウェスターン法分析を示す。図１
７は、抗−ＩＢＤＶ ＭＡｂとＩＢＤＶに対する鶏抗−
３２Kd特異性抗血清との間のコンペティティブＥＬＩＳ
Ａを示す。
【００９５】結果及び討論
ＩＢＶウィルスに対するマウスモノクローナル抗体（Ｍ
Ａｂ）を、精製されたウィルスによりＢａｌｂ／Ｃマウ
スを高度免疫化し、そしてHewishなど（1984）の方法に
従って、ＳＰ２／０骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞とを融合
することによって調製した。抗体分泌性コロニィーを、
完全なウィルスに基づいてのイムノドットアッセイ（Bi
o Rad ）によって、及びヤギ抗−マウスＩｇ−ＨＲＰ
（Bio Rad）を用いることによってマウス抗体を検出す
るために改良された、国際特許ＰＣＴ／ＡＵ８４／００
２５６明細書に記載されているＩＢＤウィルスＥＬＩＳ
Ａによって検出した。陽性コロニィーを、少なくとも３
回、限界希釈することによってクローン化し、おのおの
のクローニングで上のアッセイによって陽性コロニィー
を選択した。
Ａｂ）を、精製されたウィルスによりＢａｌｂ／Ｃマウ
スを高度免疫化し、そしてHewishなど（1984）の方法に
従って、ＳＰ２／０骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞とを融合
することによって調製した。抗体分泌性コロニィーを、
完全なウィルスに基づいてのイムノドットアッセイ（Bi
o Rad ）によって、及びヤギ抗−マウスＩｇ−ＨＲＰ
（Bio Rad）を用いることによってマウス抗体を検出す
るために改良された、国際特許ＰＣＴ／ＡＵ８４／００
２５６明細書に記載されているＩＢＤウィルスＥＬＩＳ
Ａによって検出した。陽性コロニィーを、少なくとも３
回、限界希釈することによってクローン化し、おのおの
のクローニングで上のアッセイによって陽性コロニィー
を選択した。
【００９６】ＭＡｂの特異性を、ウサギ抗−マウスＩｇ
（Sera-Lab）を用いることによってマウス抗体を検出す
るために再び改良された、完全なウィルスに基づくウェ
スターン法（特許ＰＣＴ／ＡＵ８４／００２５６明細
書）によって査定した。大多数のＭＡｂは、図１６に示
されているシリーズ１及び１７のＭＡｂによって例示さ
れているように、ＩＢＤウィルスの３２Kd構造ポリペプ
チドに対して特異的であった。１つのシリーズのＭＡ
ｂ、すなわちシリーズ６のみが４２Kdポリペプチドを認
識し（図１６）、そして３７Kdポリペプチドと特異的に
反応するものはまだ得られていない。
（Sera-Lab）を用いることによってマウス抗体を検出す
るために再び改良された、完全なウィルスに基づくウェ
スターン法（特許ＰＣＴ／ＡＵ８４／００２５６明細
書）によって査定した。大多数のＭＡｂは、図１６に示
されているシリーズ１及び１７のＭＡｂによって例示さ
れているように、ＩＢＤウィルスの３２Kd構造ポリペプ
チドに対して特異的であった。１つのシリーズのＭＡ
ｂ、すなわちシリーズ６のみが４２Kdポリペプチドを認
識し（図１６）、そして３７Kdポリペプチドと特異的に
反応するものはまだ得られていない。
【００９７】シリーズ１７ＭＡｂのサブクローン（１７
−８２と名づけられている）は、ＳＤＳにより変性され
たＩＢＤウィルスポリペプチドに結合しなかった（図１
６）。ウェスターン法に基づいて、ウィルスポリペプチ
ドに対して陽性であるすべてのＭＡｂはまた、ＩＢＤウ
ィルスの既知構造タンパク質よりも低い分子量のもので
あるブロット上の物質に結合し（Dobos, 1979 ；特許Ｐ
ＣＴ／ＡＵ８４／００２５６明細書）、そして従って、
変性されたウィルスタンパク質を表わすことができる。
特に１７−８０及び１７−８３系の抗−３２Kdモノクロ
ーンは、約５５Kdの分子量を有する大きな分子に結合
し、そして前記のプロセスされていない前駆体分子を表
わすことができる。
−８２と名づけられている）は、ＳＤＳにより変性され
たＩＢＤウィルスポリペプチドに結合しなかった（図１
６）。ウェスターン法に基づいて、ウィルスポリペプチ
ドに対して陽性であるすべてのＭＡｂはまた、ＩＢＤウ
ィルスの既知構造タンパク質よりも低い分子量のもので
あるブロット上の物質に結合し（Dobos, 1979 ；特許Ｐ
ＣＴ／ＡＵ８４／００２５６明細書）、そして従って、
変性されたウィルスタンパク質を表わすことができる。
特に１７−８０及び１７−８３系の抗−３２Kdモノクロ
ーンは、約５５Kdの分子量を有する大きな分子に結合
し、そして前記のプロセスされていない前駆体分子を表
わすことができる。
【００９８】ＭＡｂの相対的抗体活性は、ＥＬＩＳＡ及
びイムノドットアッセイによって査定され；後者は、変
性された及び変性されていないウィルスの両者に基づく
（第１表）。シリーズ１及び１７の骨髄腫細胞により接
種されたマウスからの腹水は、１７−８２系のイムノド
ット反応性がＳＤＳ及び煮沸することによるウィルスの
処置によって止められたけれども、天然ウィルスに基づ
いて行なわれたＥＬＩＳＡ及びイムノドットアッセイ
（２ 14 ２19）によって高い抗体の力価をすべて有し
た。この時、イムノドットアッセイにおけるＭＡｂの反
応性は、ＳＤＳ及び煮沸することによりウィルスを処置
することによって増強されるけれども、シリーズ６のＭ
Ａｂは、両アッセイにおいて弱く反応した（第１表）。
びイムノドットアッセイによって査定され；後者は、変
性された及び変性されていないウィルスの両者に基づく
（第１表）。シリーズ１及び１７の骨髄腫細胞により接
種されたマウスからの腹水は、１７−８２系のイムノド
ット反応性がＳＤＳ及び煮沸することによるウィルスの
処置によって止められたけれども、天然ウィルスに基づ
いて行なわれたＥＬＩＳＡ及びイムノドットアッセイ
（２ 14 ２19）によって高い抗体の力価をすべて有し
た。この時、イムノドットアッセイにおけるＭＡｂの反
応性は、ＳＤＳ及び煮沸することによりウィルスを処置
することによって増強されるけれども、シリーズ６のＭ
Ａｂは、両アッセイにおいて弱く反応した（第１表）。
【００９９】
【表１】
【０１００】ＭＡｂのウィルス中和活性を、ミクロ−ウ
ィルス中和アッセイ（特許ＰＣＴ／ＡＵ８４／００２５
６明細書）により査定する場合、１７−８２系のＭＡｂ
のみがウィルスの伝染性を中和した。その腹水は２14の
力価を有した。シリーズ１及び６並びに１７−８０系の
ＭＡｂはすべて陰性（＜２4 ）であった。
ィルス中和アッセイ（特許ＰＣＴ／ＡＵ８４／００２５
６明細書）により査定する場合、１７−８２系のＭＡｂ
のみがウィルスの伝染性を中和した。その腹水は２14の
力価を有した。シリーズ１及び６並びに１７−８０系の
ＭＡｂはすべて陰性（＜２4 ）であった。
【０１０１】１７−８２ＭＡｂの特異性は、ウェスター
ン法によるＩＢＤウィルスの３２Kdポリペプチドに対し
て特異的な鶏抗血清に対してのコンペティティブ阻害Ｅ
ＬＩＳＡにより調べられた。１７−８２ＭＡｂは、鶏抗
−３２Kd抗体と効果的に競争し（図１７）、ところが１
７−８０ＭＡｂ及びシリーズ６ＭＡｂはそれよりも効果
的でない（図１７）。１７−８２ＭＡｂはまた、多特異
的な鶏抗血清と競争し、そしてそれはウェスターン法に
基づいて３２Kd，３７Kd及び４２Kdのウィルスポリペプ
チドを認識し（データーは示されていない）、１７−８
２ＭＡｂがウィルスに基づく優性の免疫原に対してであ
ることを指摘した。
ン法によるＩＢＤウィルスの３２Kdポリペプチドに対し
て特異的な鶏抗血清に対してのコンペティティブ阻害Ｅ
ＬＩＳＡにより調べられた。１７−８２ＭＡｂは、鶏抗
−３２Kd抗体と効果的に競争し（図１７）、ところが１
７−８０ＭＡｂ及びシリーズ６ＭＡｂはそれよりも効果
的でない（図１７）。１７−８２ＭＡｂはまた、多特異
的な鶏抗血清と競争し、そしてそれはウェスターン法に
基づいて３２Kd，３７Kd及び４２Kdのウィルスポリペプ
チドを認識し（データーは示されていない）、１７−８
２ＭＡｂがウィルスに基づく優性の免疫原に対してであ
ることを指摘した。
【０１０２】抗−ＩＢＤウィルスＭＡｂのイソタイプ
を、第２段階の試薬として抗−マウスλ鎖、ＩｇＭ，Ｉ
ｇＧ１，ＩｇＧ２ａ＋２ｂ，ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３の
いづれかを用いるＥＬＩＳＡによって決定した。すべて
のＭＡｂは、マウスＩｇＧ１のクラスのものであり、但
し１７−８２系ＭＡｂはＩｇＧ２ｂクラスのものであっ
た。
を、第２段階の試薬として抗−マウスλ鎖、ＩｇＭ，Ｉ
ｇＧ１，ＩｇＧ２ａ＋２ｂ，ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３の
いづれかを用いるＥＬＩＳＡによって決定した。すべて
のＭＡｂは、マウスＩｇＧ１のクラスのものであり、但
し１７−８２系ＭＡｂはＩｇＧ２ｂクラスのものであっ
た。
【０１０３】シリーズ６ＭＡｂは、３７Kd及び４２Kdポ
リペプチド（後者は、前者の前駆体である）のトリプシ
ン及びクロモトリプシン消化物のＨＰＬＣ分析から明ら
かなように、特に興味の対象であった。従って、シリー
ズ６ＭＡｂは、オーストラリアンタイプ−１ＩＢＤウィ
ルスの主な３７Kd構造ポリペプチドの形成の間、切断さ
れたペプチド配列を確認するように思われる。ＳＤＳに
より変性された、ＩＢＤウィルスの３２Kdポリペプチプ
を認識するそれらの能力により、１７−８０系のＭＡｂ
を用いて、上記のようにして３２Kdポリペプチドの一部
又はすべてを発現する組換え体細菌コロニィーを選択し
た。次の詳しい説明は、その非配合形での３２Kd構造タ
ンパク質の産生に関する。
リペプチド（後者は、前者の前駆体である）のトリプシ
ン及びクロモトリプシン消化物のＨＰＬＣ分析から明ら
かなように、特に興味の対象であった。従って、シリー
ズ６ＭＡｂは、オーストラリアンタイプ−１ＩＢＤウィ
ルスの主な３７Kd構造ポリペプチドの形成の間、切断さ
れたペプチド配列を確認するように思われる。ＳＤＳに
より変性された、ＩＢＤウィルスの３２Kdポリペプチプ
を認識するそれらの能力により、１７−８０系のＭＡｂ
を用いて、上記のようにして３２Kdポリペプチドの一部
又はすべてを発現する組換え体細菌コロニィーを選択し
た。次の詳しい説明は、その非配合形での３２Kd構造タ
ンパク質の産生に関する。
【０１０４】添付図面において：図１８は、クローンＤ
６，Ｄ１及びＰ１において発現されたタンパク質及びＩ
ＢＤＶタンパク質を示し、これらは、ウェスターンブロ
ットされ、そしてＭＡｂ１７−８０と反応した。クロー
ンＰ１の挿入体を、ＡｐａＩ制限部位を通してＬ６及び
Ｄ６挿入体を連結することによって構成し、この領域に
わたる生来のＩＢＤＶの正確なゲノム配列を保持した。
図１９は、種々の処置によって溶解されたクローンＤ
１，Ｄ６及びＰ１、並びにニトロセルロースフィルター
上にブロットされ、次にＭＡｂ １７−８０又はＭＡｂ
１７−８２のいづれかと反応せしめられたタンパク質
を示す。その発現されたタンパク質は、〔 125Ｉ〕プロ
ティンＡとの反応によって、次にオートラジオグラフィ
ー処理によって目に見えるようにした。
６，Ｄ１及びＰ１において発現されたタンパク質及びＩ
ＢＤＶタンパク質を示し、これらは、ウェスターンブロ
ットされ、そしてＭＡｂ１７−８０と反応した。クロー
ンＰ１の挿入体を、ＡｐａＩ制限部位を通してＬ６及び
Ｄ６挿入体を連結することによって構成し、この領域に
わたる生来のＩＢＤＶの正確なゲノム配列を保持した。
図１９は、種々の処置によって溶解されたクローンＤ
１，Ｄ６及びＰ１、並びにニトロセルロースフィルター
上にブロットされ、次にＭＡｂ １７−８０又はＭＡｂ
１７−８２のいづれかと反応せしめられたタンパク質
を示す。その発現されたタンパク質は、〔 125Ｉ〕プロ
ティンＡとの反応によって、次にオートラジオグラフィ
ー処理によって目に見えるようにした。
【０１０５】図２０は、３２Kd抗原の正しいプロセシン
グのために発現されるべき前駆体ポリペプチドの最小サ
イズを示す。ＩＢＤＶゲノムの大セグメントの完全なコ
ード領域を含む、クローンＰ０の挿入体を、特定の制限
部位での５′末端で漸進的に短くし、そしてその得られ
たフラグメントを、Ｅ．コリ中のｐＰＬベクターに発現
した。発現された遺伝子生成物を、ウェスターンブロッ
トし、そしてＭＡｂ１７−８０と反応せしめた。図２１
は、ウィルス中和性モノクローナルＭＡｂ １７−８２
によって認識される抗原決定基となることができる前駆
体ポリペプチドの領域を示す。種々のサイズの前駆体を
含むクローンからの非変性タンパク質を、ニトロセルロ
ースフィルター上にブロットし、そしてＭＡｂ １７−
８０又はＭＡｂ １７−８２と反応せしめた。
グのために発現されるべき前駆体ポリペプチドの最小サ
イズを示す。ＩＢＤＶゲノムの大セグメントの完全なコ
ード領域を含む、クローンＰ０の挿入体を、特定の制限
部位での５′末端で漸進的に短くし、そしてその得られ
たフラグメントを、Ｅ．コリ中のｐＰＬベクターに発現
した。発現された遺伝子生成物を、ウェスターンブロッ
トし、そしてＭＡｂ１７−８０と反応せしめた。図２１
は、ウィルス中和性モノクローナルＭＡｂ １７−８２
によって認識される抗原決定基となることができる前駆
体ポリペプチドの領域を示す。種々のサイズの前駆体を
含むクローンからの非変性タンパク質を、ニトロセルロ
ースフィルター上にブロットし、そしてＭＡｂ １７−
８０又はＭＡｂ １７−８２と反応せしめた。
【０１０６】塩基４２５〜３１４５を補う大きな組換え
体分子を、クローンＤ６（３２Kdタンパク質をコードす
る）及びクローンＬ６（２８Kdタンパク質及び４１／３
７Kdタンパク質の主要部分をコードする）の挿入体を連
結することによって構成した−これらの両クローンの詳
しい説明は上に示されている。Ｌ６及びＤ６挿入体を、
ＡｐａＩ制限部位を通して連結し、この領域にわたる生
来のＩＢＤＶの正確なゲノム配列を保持した。
体分子を、クローンＤ６（３２Kdタンパク質をコードす
る）及びクローンＬ６（２８Kdタンパク質及び４１／３
７Kdタンパク質の主要部分をコードする）の挿入体を連
結することによって構成した−これらの両クローンの詳
しい説明は上に示されている。Ｌ６及びＤ６挿入体を、
ＡｐａＩ制限部位を通して連結し、この領域にわたる生
来のＩＢＤＶの正確なゲノム配列を保持した。
【０１０７】この大きな組換え体分子（ＰＩ）を、Ｅ．
コリ中のｐＵＲプラスミドに発現し、そしてその発現さ
れたタンパク質を、ウェスターンブロット及びＭＡｂ
１７−８０との反応によって分析した（図１８）。その
大きな挿入体は、Ｍ＞８０Kd（又は融合タンパク質とし
て〜１９０Kd）のウィルス性ポリタンパク質を発現する
ように思われるが、しかし代わりに、ＭＡｂ １７−８
０と特異的に反応する別々の３２Kdタンパク質を産生し
た。
コリ中のｐＵＲプラスミドに発現し、そしてその発現さ
れたタンパク質を、ウェスターンブロット及びＭＡｂ
１７−８０との反応によって分析した（図１８）。その
大きな挿入体は、Ｍ＞８０Kd（又は融合タンパク質とし
て〜１９０Kd）のウィルス性ポリタンパク質を発現する
ように思われるが、しかし代わりに、ＭＡｂ １７−８
０と特異的に反応する別々の３２Kdタンパク質を産生し
た。
【０１０８】発現されたポリペプチドの正しいプロセシ
ングがそれらの正しい折りたたみを導びくかどうかを見
るために、クローンＰ１中に発現されたタンパク質を、
ウィルスを中和するが、しかし変性された３２Kdウィル
スタンパク質とは反応しないモノクローナル抗体（ＭＡ
ｂ １７−８２）を用いて、イムノブロットアッセイ
（図１９）によって分析した。その発現されたタンパク
質は、ＭＡｂ １７−８２とひじょうに強く反応する
が、しかしこの反応は、その発現されたタンパク質が最
初にＳＤＳにより変性される場合、完全に止められた。
ＳＤＳによる変性の後、その発現されたタンパク質は、
変性された３２Kdタンパク質を認識するＭＡｂ １７−
８０と強く反応した。従って、遺伝子工学的に製造され
たポリペプチドは、ＭＡｂ １７−８２及びＭＡｂ １
７−８０に対する完全なウィルス粒子の免疫反応をまね
る。
ングがそれらの正しい折りたたみを導びくかどうかを見
るために、クローンＰ１中に発現されたタンパク質を、
ウィルスを中和するが、しかし変性された３２Kdウィル
スタンパク質とは反応しないモノクローナル抗体（ＭＡ
ｂ １７−８２）を用いて、イムノブロットアッセイ
（図１９）によって分析した。その発現されたタンパク
質は、ＭＡｂ １７−８２とひじょうに強く反応する
が、しかしこの反応は、その発現されたタンパク質が最
初にＳＤＳにより変性される場合、完全に止められた。
ＳＤＳによる変性の後、その発現されたタンパク質は、
変性された３２Kdタンパク質を認識するＭＡｂ １７−
８０と強く反応した。従って、遺伝子工学的に製造され
たポリペプチドは、ＭＡｂ １７−８２及びＭＡｂ １
７−８０に対する完全なウィルス粒子の免疫反応をまね
る。
【０１０９】これらの結果は、３２Kdタンパク質、２８
Kdタンパク質及び４１／３７Kdタンパク質の主要部分を
コードする大ｃＤＮＡフラグメントの発現が、ＩＢＤＶ
の変性された３２Kd宿主保護性抗原と反応するモノクロ
ーナル抗体（ＭＡｂ １７−８０）によって認識される
非融合３２Kdタンパク質の合成をもたらすことを明らか
に例示する。“生来”形において、遺伝子工学的に製造
されたポリペプチドは、ウィルス中和性モノクローナル
抗体（ＭＡｂ １７−８２）と特異的に反応し、それら
が生来のウィルス抗原と同じコンホーメーションで折り
たたまれ得ることを提案する。
Kdタンパク質及び４１／３７Kdタンパク質の主要部分を
コードする大ｃＤＮＡフラグメントの発現が、ＩＢＤＶ
の変性された３２Kd宿主保護性抗原と反応するモノクロ
ーナル抗体（ＭＡｂ １７−８０）によって認識される
非融合３２Kdタンパク質の合成をもたらすことを明らか
に例示する。“生来”形において、遺伝子工学的に製造
されたポリペプチドは、ウィルス中和性モノクローナル
抗体（ＭＡｂ １７−８２）と特異的に反応し、それら
が生来のウィルス抗原と同じコンホーメーションで折り
たたまれ得ることを提案する。
【０１１０】ＩＢＤＶの大ＲＮＡセグメントの完全なコ
ード領域を含む大きな組換え体分子（Ｐ０）を、通常の
Ｎｄｅｌ制限部位を通して、クローンＰ１の挿入体をも
う１つのクローンＧ６の挿入体に連結することによって
構成した。Ｐ０を、Ｅ．コリのｐＥＸベクター〔Stanle
y and Luzio, (1984) 〕に発現した。Ｐ１の場合、これ
は、ＭＡｂ１７−８０と反応する、正しくプロセスされ
た３２Kdポリペプチドの産生をもたらした。
ード領域を含む大きな組換え体分子（Ｐ０）を、通常の
Ｎｄｅｌ制限部位を通して、クローンＰ１の挿入体をも
う１つのクローンＧ６の挿入体に連結することによって
構成した。Ｐ０を、Ｅ．コリのｐＥＸベクター〔Stanle
y and Luzio, (1984) 〕に発現した。Ｐ１の場合、これ
は、ＭＡｂ１７−８０と反応する、正しくプロセスされ
た３２Kdポリペプチドの産生をもたらした。
【０１１１】クローンＰ１及びＰ０に産生された３２Kd
タンパク質は、ウィルス特異性のプロテアーゼによって
プロセスされ得る。他方、Ｅ．コリのリボソ−ムによっ
て認識される翻訳開始部位は、32Kdタンパク質のために
遺伝子内又はそのすぐ前に存在することができる。次
に、この場合、２８Kdタンパク質内でのフレームシフト
の導入が、クローンＰ０の３２Kdタンパク質の産生に影
響を及ぼすべきでない。２８Kdタンパク質のために遺伝
子内のＥｃｏＲＩ又はＢａｍＨＩ部位に１．３KdＫｍR
フラグメント（Vieira and Messing, 1982）を挿入し、
又はＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを欠失するこ
とによって、フレームシフトを導入した。これらの場
合、ウェスターンブロットに基づいてＭＡｂ １７−８
０と反応した、３２Kd又はそれよりも高い分子量のタン
パク質が産生されなかった。これは、３２Kdタンパク質
が独立した翻訳開始部位から発現される可能性を規定し
た。
タンパク質は、ウィルス特異性のプロテアーゼによって
プロセスされ得る。他方、Ｅ．コリのリボソ−ムによっ
て認識される翻訳開始部位は、32Kdタンパク質のために
遺伝子内又はそのすぐ前に存在することができる。次
に、この場合、２８Kdタンパク質内でのフレームシフト
の導入が、クローンＰ０の３２Kdタンパク質の産生に影
響を及ぼすべきでない。２８Kdタンパク質のために遺伝
子内のＥｃｏＲＩ又はＢａｍＨＩ部位に１．３KdＫｍR
フラグメント（Vieira and Messing, 1982）を挿入し、
又はＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを欠失するこ
とによって、フレームシフトを導入した。これらの場
合、ウェスターンブロットに基づいてＭＡｂ １７−８
０と反応した、３２Kd又はそれよりも高い分子量のタン
パク質が産生されなかった。これは、３２Kdタンパク質
が独立した翻訳開始部位から発現される可能性を規定し
た。
【０１１２】推定上のウィルス特異性のプロテアーゼを
配置するために、クローンＰ０からの挿入体を、特定の
制限部位で５′末端から漸進的に短くし（図２０）、そ
して得られた異なったサイズのフラグメントを、融合タ
ンパク質又は非融合タンパク質のいづれかを産生するベ
クター中に挿入し、そしてその同じ結果を、使用したベ
クターのタイプに関係なく得た。Ｅ．コリ中に発現され
たタンパク質を、ウェスターンブロットし、そして３２
Kdポリペプチドの他に、いかに多くのコード配列が、正
しくプロセスされた３２Kdタンパク質を産生するため
に、発現されるべきかを知るために、ＭＡｂ １７−８
０と反応せしめた（図２０）。図２０は、発現されたタ
ンパク質に約７KdのＸＮ遺伝子生成物を付加する融合ベ
クター（ｐＰＬ）中に発現によって得られた結果を示
す。
配置するために、クローンＰ０からの挿入体を、特定の
制限部位で５′末端から漸進的に短くし（図２０）、そ
して得られた異なったサイズのフラグメントを、融合タ
ンパク質又は非融合タンパク質のいづれかを産生するベ
クター中に挿入し、そしてその同じ結果を、使用したベ
クターのタイプに関係なく得た。Ｅ．コリ中に発現され
たタンパク質を、ウェスターンブロットし、そして３２
Kdポリペプチドの他に、いかに多くのコード配列が、正
しくプロセスされた３２Kdタンパク質を産生するため
に、発現されるべきかを知るために、ＭＡｂ １７−８
０と反応せしめた（図２０）。図２０は、発現されたタ
ンパク質に約７KdのＸＮ遺伝子生成物を付加する融合ベ
クター（ｐＰＬ）中に発現によって得られた結果を示
す。
【０１１３】３７Kdタンパク質の５２Kd前駆体又は２８
Kdタンパク質のＮ−末端部分をコードする遺伝子の一部
又は全部の欠失は、３２Kdポリペプチドの産生を決して
妨げなかった。しかしながら、２８Kdタンパク質をコー
ドする遺伝子のさらに先の部分（ＢａｍＨＩ及びＨｉｎ
ｄIII 制限部位）の除去は、たとえ、３２Kd及び２８Kd
タンパク質の間のおおよその接合点で、二塩基性残基が
今までどおり存在したとしても、３２Kdタンパク質のプ
ロセシングを阻害した。類似した結果を、Ｋｍカセット
を用いての部位特異的挿入突然変異生成研究によって得
た〔Vieira andMessing, (1982)〕。
Kdタンパク質のＮ−末端部分をコードする遺伝子の一部
又は全部の欠失は、３２Kdポリペプチドの産生を決して
妨げなかった。しかしながら、２８Kdタンパク質をコー
ドする遺伝子のさらに先の部分（ＢａｍＨＩ及びＨｉｎ
ｄIII 制限部位）の除去は、たとえ、３２Kd及び２８Kd
タンパク質の間のおおよその接合点で、二塩基性残基が
今までどおり存在したとしても、３２Kdタンパク質のプ
ロセシングを阻害した。類似した結果を、Ｋｍカセット
を用いての部位特異的挿入突然変異生成研究によって得
た〔Vieira andMessing, (1982)〕。
【０１１４】２８Kdタンパク質の５′末端の近くのＥｃ
ｏＲＩ部位への１０個のコドンの‘イン−フェース（in
-phase）’挿入は、正しくプロセスされた３２Kdタンパ
ク質の産生に影響を及ぼさず、ところが２８Kdタンパク
質の中間のＢａｍＨＩ部位への４個のコドンの‘イン−
フェース’挿入は、３２Kdタンパク質のプロセシングを
阻害し、そしてより大きな前駆体分子が産生される。２
８Kdタンパク質が成熟したウィルス粒子中にひじょうに
少量且つ種々の量で存在する事実と共にこれらの結果
は、２８Kdタンパク質が大きな前駆体ポリペプチドのプ
ロセシングに関与するＩＢＤＶ特異的プロテアーゼであ
ることを示すであろう。
ｏＲＩ部位への１０個のコドンの‘イン−フェース（in
-phase）’挿入は、正しくプロセスされた３２Kdタンパ
ク質の産生に影響を及ぼさず、ところが２８Kdタンパク
質の中間のＢａｍＨＩ部位への４個のコドンの‘イン−
フェース’挿入は、３２Kdタンパク質のプロセシングを
阻害し、そしてより大きな前駆体分子が産生される。２
８Kdタンパク質が成熟したウィルス粒子中にひじょうに
少量且つ種々の量で存在する事実と共にこれらの結果
は、２８Kdタンパク質が大きな前駆体ポリペプチドのプ
ロセシングに関与するＩＢＤＶ特異的プロテアーゼであ
ることを示すであろう。
【０１１５】クローンＰ１及びＰ０中に発現されたタン
パク質は、ウィルス中和性ＭＡｂ１７−８２と強く反応
する。クローンＰ１及びＰ０は正しくプロセスされた３
２Kdタンパク質及び大セグメントによってコードされた
他のタンパク質を産生するので、大きな前駆体分子の発
現から得られたタンパク質の正しいプロセシングが、ウ
ィルス中和性ＭＡｂ １７−８２によって認識される正
しい立体構造を取る、発現されたポリペプチドを導びく
かどうかを知ることが重要であった。
パク質は、ウィルス中和性ＭＡｂ１７−８２と強く反応
する。クローンＰ１及びＰ０は正しくプロセスされた３
２Kdタンパク質及び大セグメントによってコードされた
他のタンパク質を産生するので、大きな前駆体分子の発
現から得られたタンパク質の正しいプロセシングが、ウ
ィルス中和性ＭＡｂ １７−８２によって認識される正
しい立体構造を取る、発現されたポリペプチドを導びく
かどうかを知ることが重要であった。
【０１１６】３２Kdタンパク質のための遺伝子及び２８
Kd及び５２Kdタンパク質のための遺伝子の一部又は全部
を含む、種々のサイズの組換え体分子は、Ｅ．コリ中に
発現された。変性されていない、発現されたタンパク質
を、ニトロセルロースフィルター上にブロットし、そし
てＭＡｂ １７−８０又はＭＡｂ １７−８２と反応せ
しめた（図２１）。ＭＡｂ １７−８０は、すべての構
造体に発現されたタンパク質と反応するのに対して、ウ
ィルス中和性ＭＡｂ １７−８２のみは、３７Kdタンパ
ク質の５２Kd前駆体の実質的部分を保持するクローンに
発現されたタンパク質と反応した（図２１）。
Kd及び５２Kdタンパク質のための遺伝子の一部又は全部
を含む、種々のサイズの組換え体分子は、Ｅ．コリ中に
発現された。変性されていない、発現されたタンパク質
を、ニトロセルロースフィルター上にブロットし、そし
てＭＡｂ １７−８０又はＭＡｂ １７−８２と反応せ
しめた（図２１）。ＭＡｂ １７−８０は、すべての構
造体に発現されたタンパク質と反応するのに対して、ウ
ィルス中和性ＭＡｂ １７−８２のみは、３７Kdタンパ
ク質の５２Kd前駆体の実質的部分を保持するクローンに
発現されたタンパク質と反応した（図２１）。
【０１１７】他方、図２０は、３２Kdタンパク質の正し
いプロセシングが５２Kdタンパク質のいづれの部分又は
２８Kdタンパク質の最極端のＮ−末端部分でさえ必要と
しないことを明らかに示す。従って、３２Kdタンパク質
の正しいプロセシングのみがＭＡｂ １７−８２による
認識を確保し、そして５２Kd前駆体タンパク質の一部
は、直接的に又は間接的にそのプロセスに関与され得
る。ウィルス中和性ＭＡｂ １７−８２によって認識さ
れる抗原性決定基は、３２Kd及び４１／３７Kdタンパク
質の両者からの領域を与えることから成る不連続エピト
ープから成ることができる。非変性状態のクローンＤ６
及びＤ１からの融合タンパク質は、ウィルス中和性ＭＡ
ｂ １７−８２と弱く、但しひじょうに特異的に反応す
る。３２Kd遺伝子のＡｈａII−ＰｓｔＩフラグメントの
発現によって産生された非融合タンパク質はまた、ＭＡ
ｂ １７−８２と反応する。
いプロセシングが５２Kdタンパク質のいづれの部分又は
２８Kdタンパク質の最極端のＮ−末端部分でさえ必要と
しないことを明らかに示す。従って、３２Kdタンパク質
の正しいプロセシングのみがＭＡｂ １７−８２による
認識を確保し、そして５２Kd前駆体タンパク質の一部
は、直接的に又は間接的にそのプロセスに関与され得
る。ウィルス中和性ＭＡｂ １７−８２によって認識さ
れる抗原性決定基は、３２Kd及び４１／３７Kdタンパク
質の両者からの領域を与えることから成る不連続エピト
ープから成ることができる。非変性状態のクローンＤ６
及びＤ１からの融合タンパク質は、ウィルス中和性ＭＡ
ｂ １７−８２と弱く、但しひじょうに特異的に反応す
る。３２Kd遺伝子のＡｈａII−ＰｓｔＩフラグメントの
発現によって産生された非融合タンパク質はまた、ＭＡ
ｂ １７−８２と反応する。
【０１１８】従って、３２Kdタンパク質又はその一部
は、ＭＡｂ １７−８２によって弱く認識される。ＭＡ
ｂ １７−８２がまた、４１及び３７Kd構造タンパク質
の５２Kd前駆体タンパク質と反応したかどうかを見るた
めに、２８Kd及び３２Kd構造タンパク質をコードするこ
れらの遺伝子なしに、この領域をコードする遺伝子を、
Ｅ．コリ中のｐＥＸベクターに発現した。変性されてい
ない、発現されたタンパク質はＭＡｂ １７−８２と強
く反応し、そして５２Kd前駆体はまた、ウィルス中和性
ＭＡｂによって認識されるエピトープを含んだことを指
摘した。３２Kd構造タンパク質と４１／３７Kd構造タン
パク質との間の相互作用が、ウィルス中和性及び／又は
保護性抗体を誘導するエピトープの形成に関与されるこ
とは可能である。
は、ＭＡｂ １７−８２によって弱く認識される。ＭＡ
ｂ １７−８２がまた、４１及び３７Kd構造タンパク質
の５２Kd前駆体タンパク質と反応したかどうかを見るた
めに、２８Kd及び３２Kd構造タンパク質をコードするこ
れらの遺伝子なしに、この領域をコードする遺伝子を、
Ｅ．コリ中のｐＥＸベクターに発現した。変性されてい
ない、発現されたタンパク質はＭＡｂ １７−８２と強
く反応し、そして５２Kd前駆体はまた、ウィルス中和性
ＭＡｂによって認識されるエピトープを含んだことを指
摘した。３２Kd構造タンパク質と４１／３７Kd構造タン
パク質との間の相互作用が、ウィルス中和性及び／又は
保護性抗体を誘導するエピトープの形成に関与されるこ
とは可能である。
【０１１９】従って、正しくプロセスされ及び折りたた
まれた抗原を産生することへの１つの効果的なアプロー
チは、３２Kd，２８Kd及び５２Kd前駆体タンパク質の実
質的な部分を保持する完全なコード領域又は前駆体を発
現することである。この方法によって産生された抗原
は、モノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマ
トグラフィーによって、又は発現された抗原の末端で特
異的な配列を製造することによって容易に精製され得
る。
まれた抗原を産生することへの１つの効果的なアプロー
チは、３２Kd，２８Kd及び５２Kd前駆体タンパク質の実
質的な部分を保持する完全なコード領域又は前駆体を発
現することである。この方法によって産生された抗原
は、モノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマ
トグラフィーによって、又は発現された抗原の末端で特
異的な配列を製造することによって容易に精製され得
る。
【０１２０】もう１つのアプローチは、３２Kd及び／又
は５２Kdタンパク質のための完全な遺伝子又はそのフラ
グメントを発現することである。続く再生段階は、必要
とされても、又は必要とされなくても良い。このアプロ
ーチは完全に実行できる。なぜならばＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルから単離されたウィルス３２Kdタンパク
質が再生され得、そして鶏に注射される場合、ウィルス
中和性及び保護性抗体を産生し得ることが前に例示され
たからである（国際特許ＰＣＴ／ＡＵ８４／００２５６
明細書）。
は５２Kdタンパク質のための完全な遺伝子又はそのフラ
グメントを発現することである。続く再生段階は、必要
とされても、又は必要とされなくても良い。このアプロ
ーチは完全に実行できる。なぜならばＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルから単離されたウィルス３２Kdタンパク
質が再生され得、そして鶏に注射される場合、ウィルス
中和性及び保護性抗体を産生し得ることが前に例示され
たからである（国際特許ＰＣＴ／ＡＵ８４／００２５６
明細書）。
【０１２１】さらに、ｐＣＡＶ２ベクター中の３２Kd遺
伝子のＡｈａII−ＰｓｔＩフラグメントの発現によって
産生された３０Kdの非融合タンパク質は、ウィルス中和
性ＭＡｂ １７−８２と反応する。４１Kd及び３７Kd構
造タンパク質の５２Kd前駆体のための遺伝子から発現さ
れたタンパク質もまた、ウィルス中和性ＭＡｂ １７−
８２と反応する。Ｅ．コリ中にウィルスタンパク質を産
生するための３番目のアプローチは、酵素又は化学的切
断部位がＩＢＤＶ及び宿主タンパク質の間の接合点で作
られている融合タンパク質を産生することである。融合
タンパク質の発現のレベルは、ひじょうに高く、そして
その発現されたタンパク質は、アフィニティークロマト
グラフィーによって容易に精製され得る。そのＩＢＤＶ
タンパク質は、その精製された融合タンパク質の酵素又
は化学的切断によって回収され得る。
伝子のＡｈａII−ＰｓｔＩフラグメントの発現によって
産生された３０Kdの非融合タンパク質は、ウィルス中和
性ＭＡｂ １７−８２と反応する。４１Kd及び３７Kd構
造タンパク質の５２Kd前駆体のための遺伝子から発現さ
れたタンパク質もまた、ウィルス中和性ＭＡｂ １７−
８２と反応する。Ｅ．コリ中にウィルスタンパク質を産
生するための３番目のアプローチは、酵素又は化学的切
断部位がＩＢＤＶ及び宿主タンパク質の間の接合点で作
られている融合タンパク質を産生することである。融合
タンパク質の発現のレベルは、ひじょうに高く、そして
その発現されたタンパク質は、アフィニティークロマト
グラフィーによって容易に精製され得る。そのＩＢＤＶ
タンパク質は、その精製された融合タンパク質の酵素又
は化学的切断によって回収され得る。
【０１２２】参考文献
１．BIRNBOIM, H.D., and DOLY, J. (1979) Nucl.Acids
Res. 7, 1513-1523. ２．BLAKE, A. and PEACOCKE, A.R. (1968). Biopolyme
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Biochem. 8, 1-17. ４．DOBOS, P. (1979). J.Viroloqy, 32, 1046-1050. ５．FIRTH, G.A., (1974). Aust.Vet.J. 50, 128-130. ６．GOLDBACH, R.W., BORST, P., BOLLEN-DE BOER, J.
E. and VAN BRUGGEN, E.F.J. (1978). Biochem, Biophy
s.Acta 521, 169-186.
Res. 7, 1513-1523. ２．BLAKE, A. and PEACOCKE, A.R. (1968). Biopolyme
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Biochem. 8, 1-17. ４．DOBOS, P. (1979). J.Viroloqy, 32, 1046-1050. ５．FIRTH, G.A., (1974). Aust.Vet.J. 50, 128-130. ６．GOLDBACH, R.W., BORST, P., BOLLEN-DE BOER, J.
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s.Acta 521, 169-186.
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975). Proc.Natl.Acad.Sci. USA 72,3961-3965. ８．HEWISH, D.R., ROBINSON, C.P. and SPARROW, L.G.
(1984). Aust.J.Biol.Sci., 37, 17-23. ９．HUDSON, P., JOHN, M., CRAWFORD, R., HARALAMBID
IS, J., SCANLON, D., GORMAN, J., TREGEAR, G., SHIN
E, J., and NIALL, H.(1984) EMBO J.３, 2333-2339. 10．ISH-HOROWICZ, D., and BURKE, J.F. (1981). Nuc
l.Acids Res. 9, 2989-2998. 11．LERMAN, L.S. (1963). Proc.Natl.Acad.Sci. USA 4
9, 94-102. 12．MARGLIN, A., and MERRIFIELD, R.B. (1970) Auno.
Rev.Biochem., 39, 841.
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IS, J., SCANLON, D., GORMAN, J., TREGEAR, G., SHIN
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【０１２４】13．MAXAM, A.M. and GILBERT, W.(1977)
Proc.Natl.Acad.Sci. 74, 5463-5467. 14．McINTYRE, P., GRAF, L., MERCER, J., WAKE, S.,
HUDSON, P. and HOOGENRAAD, N.(1985) DNA ４, in pre
ss. 15．MULLER, H., SCHOLTISSEK, C. and BECHT, H. (197
9). J.Virol. 31, 584-589. 16．RIGBY, P.W.J., DIECKMANN, M., RHODES, C., and
BERG, P. (1977). J.Mol.Biol. 113, 237-251. 17．RIXON, F., TAYLOR, P., and DESSELBERGER, U. (1
984). J.Gen.Virol. 65,233-239. 18．RUTHER, U. and MULLER-HILL, B. (1983) EMBO J.
２, 1791-1794.
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【０１２５】19．SANGER, F., COULSON, A.R., BARREL
L, B.G., SMITH, A.J.H. and ROE, B.A.(1980) J.Mole
c.Biol. 143 , 161-178. 20．SANGER, F. and COULSON, A.R.(1978) FEBS Lett.
87, 107-110. 21．STADEN, R.Nucleic Acids Res. (1982) 10, 4731-4
751. 22．STANLEY, K.K. and LUZIO, J.P.(1984) EMBO J.
３, 1429-1434. 23．TAYLOR, J.M., ILLMENSEE, R., and SUMMERS, J.
(1976). Biochem.Biophys.Acta 442, 324-330. 24．TODD, D., and McNULTY, M.S. (1979). Arch.Viro
l. 60, 265-277. 25．ULLMANN, A. (1984). Gene. 29, 27-31. 26．VIEIRA, J., and MESSING, J. (1982). Gene. 19,
259-268.
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c.Biol. 143 , 161-178. 20．SANGER, F. and COULSON, A.R.(1978) FEBS Lett.
87, 107-110. 21．STADEN, R.Nucleic Acids Res. (1982) 10, 4731-4
751. 22．STANLEY, K.K. and LUZIO, J.P.(1984) EMBO J.
３, 1429-1434. 23．TAYLOR, J.M., ILLMENSEE, R., and SUMMERS, J.
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l. 60, 265-277. 25．ULLMANN, A. (1984). Gene. 29, 27-31. 26．VIEIRA, J., and MESSING, J. (1982). Gene. 19,
259-268.
【図１】図１は、ウサギの網状赤血球溶解物中に合成さ
れたＩＢＤＶ ＲＮＡ翻訳生成物の電気泳動図であり、
翻訳生成物のＭＷ及びＩＢＤＶ ＲＮＡセグメントのコ
ード割当て（ｉ）ＭＷ標準；（ｉｉ）画分化されていな
いＩＢＤＶ ＲＮＡ；（ｉｉｉ）ＩＢＤＶ ＲＮＡの大
セグメント；（ｉｖ）ＩＢＤＶ ＲＮＡの小セグメント
を示す。
れたＩＢＤＶ ＲＮＡ翻訳生成物の電気泳動図であり、
翻訳生成物のＭＷ及びＩＢＤＶ ＲＮＡセグメントのコ
ード割当て（ｉ）ＭＷ標準；（ｉｉ）画分化されていな
いＩＢＤＶ ＲＮＡ；（ｉｉｉ）ＩＢＤＶ ＲＮＡの大
セグメント；（ｉｖ）ＩＢＤＶ ＲＮＡの小セグメント
を示す。
【図２】図２は、ＩＢＤＶの完全な大ＲＮＡセグメント
を包含するクローン化された挿入体のマップであり、生
物の形態を示す図面代用写真である。
を包含するクローン化された挿入体のマップであり、生
物の形態を示す図面代用写真である。
【図３】図３は、ＩＢＤＶの変性された３２Ｋｄタンパ
ク質と反応するモノクローナル抗体（ＭＡｂ １７−８
０）に対して陽性のタンパク質を発現するいくつかの
Ｅ．コリのコロニィーを示し、生物の形態を表わす図面
代用写真である。
ク質と反応するモノクローナル抗体（ＭＡｂ １７−８
０）に対して陽性のタンパク質を発現するいくつかの
Ｅ．コリのコロニィーを示し、生物の形態を表わす図面
代用写真である。
【図４】図４は、電気泳動にゆだねられ、そして（ａ）
クーマシーブルーにより染色され、又は（ｂ）ウェスタ
ーンブロットされ、そしてＭＡｂ １７−８０と反応す
るＥ．コリコロニィーからのタンパク質を示し、電気泳
動図を示す図面代用写真である。矢印１及び２は、それ
ぞれ融合タンパク質及びβ−ガラクトシダーゼの位置を
示す。サンプルは、（ｉ）ＨＢ１０１細胞、（ｉｉ）ｐ
ＵＫ２９０を含むＨＢ１０１、（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉ
ｉ）ＭＡｂ １７−８０（図３）との反応によって可能
な陽性として同定されたいくつかの組換え体クローンで
ある。
クーマシーブルーにより染色され、又は（ｂ）ウェスタ
ーンブロットされ、そしてＭＡｂ １７−８０と反応す
るＥ．コリコロニィーからのタンパク質を示し、電気泳
動図を示す図面代用写真である。矢印１及び２は、それ
ぞれ融合タンパク質及びβ−ガラクトシダーゼの位置を
示す。サンプルは、（ｉ）ＨＢ１０１細胞、（ｉｉ）ｐ
ＵＫ２９０を含むＨＢ１０１、（ｉｉｉ）〜（ｖｉｉ
ｉ）ＭＡｂ １７−８０（図３）との反応によって可能
な陽性として同定されたいくつかの組換え体クローンで
ある。
【図５】図５は、ＩＢＤＶ ＲＮＡの大セグメントと、
種々のｃＤＮＡクローンの関係を示す図である。
種々のｃＤＮＡクローンの関係を示す図である。
【図６】図６は発現した融合タンパク質の電気泳動図で
あり、図面代用写真である。
あり、図面代用写真である。
【図７】図７はクローンＤ１からの融合タンパク質精製
の電気泳動図であり図面代用写真である。
の電気泳動図であり図面代用写真である。
【図８】図８は、クローンＤ１及びＤ６の融合タンパク
質精製物並びに遊離のβ−ガラクトシダーゼ電気泳動図
であり、図面代用写真である。
質精製物並びに遊離のβ−ガラクトシダーゼ電気泳動図
であり、図面代用写真である。
【図９】図９は、クローンＤ１及びＤ６からの融合タン
パク質により免疫した鶏の血清中の抗体を、全ＩＢＤＶ
粒を使用するウェスタンブロットにより検出した結果を
示す電気泳動図であり、図面代用写真である。
パク質により免疫した鶏の血清中の抗体を、全ＩＢＤＶ
粒を使用するウェスタンブロットにより検出した結果を
示す電気泳動図であり、図面代用写真である。
【図１０】図１０は、ＩＢＤＶの大セグメントのヌクレ
オチド配列及び対応するアミノ酸配列の１部分を示す図
である。
オチド配列及び対応するアミノ酸配列の１部分を示す図
である。
【図１１】図１１は、ＩＢＤＶの大セグメントのヌクレ
オチド配列及び対応するアミノ酸配列の１部分を示す図
である。
オチド配列及び対応するアミノ酸配列の１部分を示す図
である。
【図１２】図１２は、ＩＢＤＶの大セグメントのヌクレ
オチド配列及び対応するアミノ酸配列の１部分を示す図
である。
オチド配列及び対応するアミノ酸配列の１部分を示す図
である。
【図１３】図１３は、ＩＢＤＶの大セグメントのヌクレ
オチド配列及び対応するアミノ酸配列の１部分を示す図
である。
オチド配列及び対応するアミノ酸配列の１部分を示す図
である。
【図１４】図１４は、ＩＢＤＶの大セグメントのヌクレ
オチド配列及び対応するアミノ酸配列の１部分を示す図
である。
オチド配列及び対応するアミノ酸配列の１部分を示す図
である。
【図１５】図１５は、ＩＢＤＶの大セグメントのヌクレ
オチド配列及び対応するアミノ酸配列の１部分を示す図
である。
オチド配列及び対応するアミノ酸配列の１部分を示す図
である。
【図１６】図１６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、完全なウ
ィルスに対する抗−ＩＢＤＶ ＭＡｂのウェスターン法
分析を示す電気泳動図であり図面代用写真である。
ィルスに対する抗−ＩＢＤＶ ＭＡｂのウェスターン法
分析を示す電気泳動図であり図面代用写真である。
【図１７】図１７は、抗−ＩＢＤＶ ＭＡｂとＩＢＤＶ
に対する鶏抗−３２Ｋｄ特異性抗血清との間のコンペテ
ィティブＥＬＩＳＡを示すグラフである。
に対する鶏抗−３２Ｋｄ特異性抗血清との間のコンペテ
ィティブＥＬＩＳＡを示すグラフである。
【図１８】図１８は、クローンＤ６，Ｄ１及びＰ１にお
いて発現されたタンパク質及びＩＢＤＶタンパク質を示
す電気泳動図であり、図面代用写真である。
いて発現されたタンパク質及びＩＢＤＶタンパク質を示
す電気泳動図であり、図面代用写真である。
【図１９】図１９は、種々の処置によって溶解されたク
ローンＤ１，Ｄ６及びＰ１、並びにニトロセルロースフ
ィルター上にブロットされ、次にＭＡｂ １７−８０又
はＭＡｂ １７−８２のいづれかと反応せしめられたタ
ンパク質を示す電気泳動図であり、図面代用写真であ
る。
ローンＤ１，Ｄ６及びＰ１、並びにニトロセルロースフ
ィルター上にブロットされ、次にＭＡｂ １７−８０又
はＭＡｂ １７−８２のいづれかと反応せしめられたタ
ンパク質を示す電気泳動図であり、図面代用写真であ
る。
【図２０】図２０は、３２Ｋｄ抗原の正しいプロセシン
グのために発現されるべき前駆体ポリペプチドの最小サ
イズを示す電気泳動図であり、図面代用写真である。
グのために発現されるべき前駆体ポリペプチドの最小サ
イズを示す電気泳動図であり、図面代用写真である。
【図２１】図２１は、ウィルス中和性モノクローナルＭ
Ａｂ １７−８２によって認識される抗原決定基となる
ことができる前駆体ポリペプチドの領域を示す図であ
る。
Ａｂ １７−８２によって認識される抗原決定基となる
ことができる前駆体ポリペプチドの領域を示す図であ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 アザド，アーメド アブダラー
オーストラリア国，3107，ビクトリア,
ロウワー テンプルストー，バレリー
ストリート 11
(72)発明者 ハドソン，ピーター ジョン
オーストラリア国，3108，ビクトリア,
ドンカスター，グレンファーン アベニ
ュ 28
(72)発明者 ファエイ，ケビン ジョン
オーストラリア国，3106，ビクトリア,
テンプルストー ラワンナ アベニュ
24
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．次のアミノ酸配列（Ａ）： 【化１】 を含んで成るポリペプチドと他のポリペプチドとの融合
蛋白質あるいは前記アミノ酸配列（Ａ）において１個〜
複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修
飾されているアミノ酸配列を含むポリペプチドと他のポ
リペプチドとの融合蛋白質であって、鳥類において、上
記アミノ酸配列（Ａ）を含んで成るポリペプチドと他の
ポリペプチドとの融合蛋白質が伝染性滑液包病ウイルス
（ＩＢＤＶ）中和抗体を生じさせる免疫原性を有する融
合蛋白質。 ２．次のアミノ酸配列（Ｂ）： 【化２】 を含んで成るポリペプチドと他のポリペプチドとの融合
蛋白質あるいは前記アミノ酸配列（Ｂ）において１個〜
複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修
飾されているアミノ酸配列を含むポリペプチドと他のポ
リペプチドとの融合蛋白質であって、鳥類において、上
記アミノ酸配列（Ｂ）を含んで成るポリペプチドと他の
ポリペプチドとの融合蛋白質がＩＢＤＶ中和抗体を生じ
させる免疫原性を有する請求項１に記載の融合蛋白質。 ３．次のアミノ酸配列（Ａ）： 【化３】 を含んで成るポリペプチドと他のポリペプチドとの融合
蛋白質あるいは前記アミノ酸配列（Ａ）において１個〜
複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修
飾されているアミノ酸配列を含むポリペプチドと他のポ
リペプチドとの融合蛋白質であって、鳥類において、上
記アミノ酸配列（Ａ）を含んで成るポリペプチドと他の
ポリペプチドとの融合蛋白質がＩＢＤＶ中和抗体を生じ
させる免疫原性を有する融合蛋白質の製造方法におい
て、該融合蛋白質をコードするＤＮＡを含んで成る発現
ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、該培
養物から前記融合蛋白質を採取することを特徴とする方
法。 ４．前記融合蛋白質が、次のアミノ酸配列（Ｂ）： 【化４】 を含んで成るポリペプチドと他のポリペプチドとの融合
蛋白質あるいは前記アミノ酸配列（Ｂ）において１個〜
複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修
飾されているアミノ酸配列を含むポリペプチドと他のポ
リペプチドとの融合蛋白質であって、鳥類において、上
記アミノ酸配列（Ｂ）を含んで成るポリペプチドと他の
ポリペプチドとの融合蛋白質がＩＢＤＶ中和抗体を生じ
させる免疫原性を有する融合蛋白質である、請求項３に
記載の方法。 ５．次のアミノ酸配列（Ａ）： 【化５】 を含んで成るポリペプチドと他のポリペプチドとの融合
蛋白質あるいは前記アミノ酸配列（Ａ）において１個〜
複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修
飾されているアミノ酸配列を含むポリペプチドと他のポ
リペプチドとの融合蛋白質であって、鳥類において、上
記アミノ酸配列（Ａ）を含んで成るポリペプチドと他の
ポリペプチドとの融合蛋白質がＩＢＤＶ中和抗体を生じ
させる免疫原性を有する融合蛋白質を含んで成る鳥類に
おいてＩＢＤＶに対する免疫応答を刺激するための組成
物。 ６．前記融合蛋白質が、次のアミノ酸配列（Ｂ）： 【化６】 を含んで成るポリペプチドと他のポリペプチドとの融合
蛋白質あるいは前記アミノ酸配列（Ｂ）において１個〜
複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修
飾されているアミノ酸配列を含むポリペプチドと他のポ
リペプチドとの融合蛋白質であって、鳥類において、上
記アミノ酸配列（Ｂ）を含んで成るポリペプチドと他の
ポリペプチドとの融合蛋白質がＩＢＤＶ中和抗体を生じ
させる免疫原性を有する融合蛋白質である、請求項５に
記載の組成物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPH081585 | 1985-05-30 | ||
| AUPH211885 | 1985-08-23 | ||
| AU2118/85 | 1985-08-23 | ||
| AU0815/85 | 1985-08-23 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61503341A Division JP2796287B2 (ja) | 1985-05-30 | 1986-05-30 | Ｉｂｄｖの宿主保護性免疫原のクローニング及び発現 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09316094A JPH09316094A (ja) | 1997-12-09 |
| JP2988622B2 true JP2988622B2 (ja) | 1999-12-13 |
Family
ID=25642952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9017817A Expired - Lifetime JP2988622B2 (ja) | 1985-05-30 | 1997-01-16 | Ｉｂｄｖ抗原蛋白質 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6054126A (ja) |
| EP (1) | EP0222842B1 (ja) |
| JP (1) | JP2988622B2 (ja) |
| CA (1) | CA1334941C (ja) |
| DE (2) | DE3650319T2 (ja) |
| NL (1) | NL300114I2 (ja) |
| WO (1) | WO1986007060A1 (ja) |
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-
1986
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