JPS6269991A - 牛下痢症ウイルス由来のワクチンと診断薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は感染症のワクチンと診断薬の分野に関する。特
に、本発明は牛下痢症ウィルス（ＢＤＶ）で起こる病気
症候ｍ１（ＤＶに伴うゲノム配列に由来する、ワクチン
治療薬及び診断薬に関する。

背端技術 乳牛、肉牛の群に牛下痢ウィルス（３ＤＶ＞によって起
こされる罹病と致死とは世界的に未解決な経済問題であ
る。高い罹病率と低い死亡率を特徴とする潜在型は風土
病性で、吐吸衰弱、新生児下痢及び消化管内潰瘍形成、
免疫不全、及び妊娠牛の流産、催奇形成を伴う。この病
気は仔牛で認められるが、保菌成牛の識別は困難である
。

木病の急性型は妊娠３力月未満の胎児の感染で起こる。

この型の病気経過は潜行性である。このような仔牛は最
初の感染では生きのびるであろうが、これで免疫不全に
なり、生ウィルスを排泄する。このような仔牛は再感染
で死亡する。これらの仔牛が保菌者である事を血清滴定
検査で検定由来ないので、これらが群から８Ｙへの伝染
の原因となる。

ＢＤＶは豚にも感染する。豚では、病豚が８ＤＶに感染
したのか豚コレラに感染したのかを識別する事が重要で
ある。それは、豚コレラが経済的に重要疾病であるのに
対して、牛Ｆ痢感染は一過性意義しか持たず、多くの場
合無視し得る為である。コレラに感染した豚は必ず層殺
しなければならないが、現在の豚での診断法ではこの２
つの型の感染を識別由来ない。それで実際土中下痢ウィ
ルスに感染したに過ぎない豚を又層殺しなければならな
い。

ＢＤＶ感染仔牛の現存方法による識別は同様に不十分で
、その方法は血清中の抗体の滴定に依存し、この滴定で
は免疫耐性化した仔牛を識別由来ない。従って新生仔で
慢性感染のウィルス存在を判別すると共に、豚コレラウ
ィルス感染と牛下痢ウィルス感染とを識別する診断法が
求められているが、未だ存在しない。かかる診断法はそ
のウィルス粒子と高度の親和性と選択性を示す抗体を用
いるか、ウィルスの配列と選択的に雑種化できる核酸オ
リゴマー検査を用いる事で成し遂げ得る。

進歩した診断の必要に加えて、ＢＤＶ感染による病気の
伝播を阻止するに有効なワクチンも同様に現存しない。

このようなワクチンが長期免疫を与えるものであり、接
種した動物の胎仔に感染する事なく、ウィルスに対して
の免疫耐性や免疫システムの衰退のような望ましくない
副作用の無いものが望まれる事は勿論である。このよう
な特性を弱毒化又は殺菌されたウィルスのワクチンに求
める事はもし不可能でないとしてら極めて困難である。

このようなワクチンは現在の最高技術を構成している。

（５ａｕｒａｔ、　Ｐ、その他、”　１．ａ　１４ａｌ
ａｄｉｅｄｅｓ　Ｈｕｑｕｅｕｓｅｓ”　＜１９７２）
　ｐｐ、　２２９−２５１　、Ｌ’Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ
　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｆｒａｎｃａｉｓｅＰａｒｉ
ｓ）　、最近Ｆｅｒｎｅｌ　ｉｕｓ、　Ａ、　Ｌ、　、
その他、（υＪＶｅｔＲｅｓ　　（１９７１）３２：１
９６３−１９７９）は牛胎児腎臓で生育した［３　Ｄ　
Ｖから密度勾酸遠心分離で得た高分子水溶性抗原から調
整したワクチンを報告している。

牛ウィルス性下痢症の検出と防御の技術に用いられた手
引は、主に経験的で、病気を起こず運搬者の性質に対す
る洗練された知識を未だ採用していない。しかし、牛下
痢ウィルスは、豚コレラ及び類縁病ウィルスと並んで、
Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科に属する病原ウィルスの一員
に分類される。

（Ｐｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ、Ｊ、Ｓ、　、　　”　Ｔｈ
ｅ　Ｔｏｇａｖｉｒｉｏｎｓ。

Ｂｉｏｌｏｇｙ、５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、ＲｅＰｌｉｃａ
ｔｉｏｎ　　Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、　Ｈ，、編（１
９８０）　、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　　ｐｐｌ
　　７−２４）　　。

他のトガウィルスから類推して、これらウィルスは外殻
蛋白質と２または３層の糖蛋白質を含むはずである。（
ｌｌｏｒｚｉｎｅｋ、Ｈｌ、　、　Ｎ０ｎａｒｔｈｒＯ
ｐＯｄ−ｂｏｒｎｅ　Ｔｏｇａｖｉｒｕｓｅｓ　（１９
８１）　、＾ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｌｏｎｄｏ
ｎ、　　感染に対して中和を防衛とに関連した抗体を生
産できるエピトープは膜蛋白質に含まれるものと期待さ
れる（例えば８０ｅｒ’θ、屍、、その他ＪＶｉｒｏ１
（１９８４）且：５７２−５８２を見よ）。その病原ウ
ィルスはその水溶性抗原が約８０ＫＤ　（キロダルトン
）蛋白であるという特性を持つ。実際に、７６ＫＤの蛋
白質は、実験的ワクチンとして使用されている。（Ｆｅ
ｒｎｅｌｉｖｓ、Ａ。

Ｅ、、その他、同上）。

発明の開示 本発明は、牛下痢ウィルスＲＮＡの全ゲノム配列のｃＤ
ＮＡ複写物を提供する。この事は、ウィルスが合成する
ペプチドの全レパートリ−の供給を可能にし、希望する
抗体を効率良く特定的に発生させるエピトープを含み、
又、その細胞を単クローン抗体生産に適したものにする
蛋白質の調製を可能にする。そのゲノムの一次構造も、
診断プローブとして有用なオリゴマー配列を構築するの
に必要な情報を提供する。

この蛋白質生産物は、このようにこのウィルスに感染す
る動物を、その後の発病から守るワクチンとして使用由
来る。全ゲノムに到達由来ると云う事は、［１ｎｔｓａ
ｔｔａ胞にウィルスを感染させて得るような、“自生“
生産技術では得られないウィルス粒子の主成分とその低
次単位の生産を提供する。

その故に、−面では、本発明は図２．に示すＢＤＶの全
ゲノムと実質的に同一のヌクレオチド配列に関する。本
発明の他の面は、ゲノムの部分に由来するＤＮＡ又はＲ
ＮＡ配列に関するものであり、該配列は必らずしも、隣
接部分を表示していない。これらは診断用プローブとし
て有用であると共に希望する蛋白質のコード配列として
有用である。

本発明の伯の面は、原核生物、酵母、及び哺乳類語細胞
のような適当な異種宿主でこのＤＮＡを発現させるに効
果的な、前述のＢＤＶ由来ＤＮＡの発現システムを含む
。ＶａＣＣｉｎｉａ　　のような生きたウィルス　ベク
ターは、運搬者としても用いる事ができ、運搬者自身の
蛋白質と共に希望の抗原を感染を受けた細胞で発現させ
る事が由来る。発明には、これら発現システムで形質転
換した宿主と、こうして生産された蛋白質も矢張り包含
される。このようにして生産された蛋白質、又は推断さ
れた配列に合うように化学合成されたものは、単独で、
又は免疫原性を高める運搬蛋白質と結合させて、ワクチ
ンとして使用されるであろう。更にこの蛋白質は、東独
又は運搬蛋白と結合させて、抗体生産の誘発に用いられ
、その抗体は、それに罹病したものの診断、又は、Ｅ’
、　Ｄ　Ｖ　Ｇ、、関連した他の免疫分析に用いられる
。

本発明は、ポリペプチドワクチン及び免疫グロブリンの
調製法にも関連し、このように生産された物質の使用法
にも関連する。

長を被う。ＣＤＮＡの重なり合った断片と、大腸菌発現
ベクターを構築するのに用いられた配列を示す。ｃＤＮ
Ａは、勿論、■の代わりに王を持つが、それ以外は完全
に同一の配列を持つ。

示しである推論アミノ酸配列は、オーブンリーディング
フレームに基づくもので、断片の発現で確認されたもの
である。

発明の実施態様 ＾、定義 ここに用いられているように、ヌクレオチド配列が例示
したＢＤＶゲノムと゛実質的に同一″であると云う事は
、例示したポリ　ヌクレオチドの本質的性質を保持して
いる配列を意味する。特定でしかし限定的でない実質的
同一の例は、同−又は実質的に同一のアミノ酸配列をコ
ードする配列ｒあるが、コドンの退化性の為に他の特定
のコドンを用いる配列によって表わさせる。

ヌクレオチドの諸変化は、実際、制限部位を作ったり、
けずったり、生成部位を作ったり、アミノ酸配列を、機
能に悪い影響を与えない諸手段で変更したりする為にし
ばしば望まれる。゛１ヌクレオチド配列″とは、リボヌ
クレオチドとデオキシリボヌクレオチド双方の配列を含
み、図示されているポジティブの意味のスｌ−ランドと
、その相補ストランドの両方を含む。

ＢＤＶゲノムを為すヌクレオチド配列゛に由来するＤ　
ＶΔ配列は、そのゲノムヌクレオチド配列領域又はその
配列の領域の組合せより成るものを意味する。これらの
領域は、勿論、物理的に遺伝子の持つヌクレオチド配列
から由来するとは限らない。むしろどんな方法であれそ
の領域と同じか、゛実質的に同一″の、そのヌクレオチ
ドが由来する塩３；を配列によって作られたものを意味
する。

例えば、ＢＬ）Ｖ　　ゲノムに゛由来する″典型的ＤＮ
Ａ　　配列は、特定のエピトープをコードした断片、ウ
ィルスのポリペプチドの部分をコードした断片、外殻蛋
白質をコードした配列、欠失した１ウィルス粒子をコー
ドした配列及び他の有用な、ウィルス遺伝子をコードし
た配列を含む。

゛組換宿主細胞″、゛宿主１胞″、゛細胞″、゛細胞系
統″及び他のそのような用語は、微生物又は高等真核生
物細胞系を中細胞状態で培養したものに与えられ、互換
的に用いられて、組換ベクターや伯の移転ＤＮＡの受容
体を意味する事が由来ると共に、そのように用いられて
来たものであり、最初の感染導入細胞の子孫も含まれる
。１つの親細胞の子孫が自然又は人為的突然変異の為に
、形態的にも、ゲノムとしても、又全Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆｆ
ｉでも親と同じであるとは限らないと理解されている。

親細胞と充分に相似である子孫で、例えば、必要なペブ
チツドを］−ド」ノだヌクレオチド配列があるなどの特
徴を持つものは、この定義の中で強く望むもので、それ
に上記のＤｎが当てはめられる。

゛制御配列“とは、それが結合されたコード配列を発現
するのに必要なりＮＡ配列の事を意味する。宿主の違い
によってそのような制御配列の性質が異なる。：原核生
物では、それら制御配列は、一般に、調節部のプロモー
ターを１つとりボゾーム接着部及び停止信号を具える。

：真核生物では一般に、制御配列にはプロモーター、停
止信号、及び場合によっては転写促進諸因子を含む事が
ある。゛制御配列″の語は、最少、発現に必要な成分を
ずへて含み、更に存在すれば右利である成分も含む事が
ある。

゛可働の連結″は並列を意味し、そこでそう描写される
構成物は、既定の様式で機能できる情況にあるものを云
う。１つの制御配列の、１つのコード配列との゛可動連
結″とは、コード配列の発現が制御扉ｊ１との親和性の
ある條ｆ［で結合が達成されている事を指す。

Ｂ、一般的記載 本発明の中心に位置するものは、牛下痢症ウィルスのゲ
ノム全体のヌクレオチド配列を促供する事である。この
全域ヌクレオチドの供給可能性は、診断用オリゴマープ
ローブ、ＢＤＶに利くｒツクチン及び中和抗体生産に有
用な蛋白質などの設計と生産を可能にする。ゲノムにあ
る配列情報は、推断しようとするポリペプチドのアミノ
酸配列の決定を可能にすると共に好都合なエピトープの
位置の推測をも可能にする。更に、一度希望の配列を選
択すれば、ゲノムの適切な断片を（り、個別に発現させ
る事が由来る。短いポリペプチド石片は、化学合成ぐも
作る事が由来、免疫原として用いる為に運Ｗ１名諸蛋白
質と結合由来る。＠１換えし発現するポリペプチドも、
例えば、細胞又は人］：膜につけてエピト−プ位置にな
り、病源ウィルスを用いる不利を持たないような加工の
適切な備付でもたらす事が由来る。哺乳類や酵母の細胞
はそのような発現に適した環境をもたらす。更に、この
諸エピトープは、粒子形成蛋白と結合した形で生産由来
る。

上記のようにｑ産された蛋白質は、それ自体ワクチンと
して用い、或は、免疫能の高い宿主の中のＢ細胞に含有
させるのに用い、それでＢ　Ｉ！Ｉ　胞が受動的免疫治
療と診断に有用な抗体を分泌由来るようになる。

Ｂ、１．ＢＤＶゲノムのヌクレオチ゛配】１８ＤＶのゲ
ノム配列は、相互に重複する切片でルスのＲＮＡは牛の
胎児腎臓細胞で生育したウィルスから分離した。ウィル
ス　ＲＮＡは庶糖１ｍｆ？勾配で分別し、無傷のゲノム
を包含するに充分の長さを持ったＲＮＡを含むフラクシ
ョンを合併し、エタノールで沈澱させ、ｃＤＮＡライブ
ラリーを作るのに用いた。ｃＤＮＡ挿入物は先ず（十／
−）システムを用いてふるい分けた。そのポジティブの
方の交雑は感染細胞を溶解した後ウィルスからＩＩｉ離
したＲＮＡに対して行い、ネガティブの方の交雑は実感
染の細胞から単離したＲＮＡに対して行った。１つの挿
入物でふざわしい＋／−反応をしたものは、そのライブ
ラリーの残余の地図位置例げに、参照クローンとして用
いた。ポジティブの挿入物と交雑する幾つかのコロニー
は、ウィルス　ゲノムの新しい部分を、゛ウオーキング
（ｗａｌｋｉｎａ　）　”技法を使ってｃＤＮＡライブ
ラリーから入手する為に用いられた。１０個のうに入手
由来た。そしてそれらは制限酵素による地図位ｎ付けと
、配列決定に用いられた。ゲノム図示したＤＮＡ配列と
その部分は直接、診断具として、感染諸動物でのＢＤＶ
存在の検出に有用である。これらは、ＢＤＶ感染を、豚
コレラ　ウィルスと識別する点でとり分は有用である。

ＤＮＡ交雑を用いて診断をする諸方法は、Ｆａ　Ｉ　ｋ
ｏｗの米国特許Ｎｏ、４．３５８．５３５で公表されて
いる。それに示されたように、適切なプローブを用いて
サブシブ０ツテイング法を達成するために、生物材料を
直接に用いる事が由来る。ＢＤＶゲノムは豚コレラウィ
ルスのものと違うので、ＢＤＶ配列の特定の部分は感染
を疑われる動物の生物材料中にあり、それに対応する相
補配列を検出するのに利用由来る。

Ｂ、２．　　　菌で　イルス　ポリペ１　゛　１の全ゲ
ノムの配列が既知である事は、ウィルス粒子蛋白質の、
抗原活性部位と思われる部分をコードした発現ベクター
の構築を可能にする。希望の蛋白質をコードした断片は
ｃＤＮＡクローンから、旧来の制限酵素消化と、可能な
総ての読み取り枠にポリリンカー位置を持つベクターの
組に連結して、β−ガラクトシダーゼのＣ−末端に融合
蛋白質を発生させて得られる。ＢＤＶゲノムの１１種の
蛋白質が、この方法で、β−ガラクトシダーぜ結合体と
して大腸菌で発現され、図１．に概略が示しである。こ
れら蛋白質は、元来の１０クローンの制限酵素消化及び
／又は結合で得られたか、又は元のクローン化した配列
が直接用いられた。

このようにして生産した融合蛋白質は、免疫原であり得
る。

Ｂ、３．抗原性ポリペプチドの調製と運搬体ｔ＼の接合 エピトープを表わすベブヂツド領域は化学的又は組換法
を用いて合成由来る。そして例えば、中性の運搬蛋白質
への連結手段を与えるＣ−末端のシスティン残りでも得
られる。そのような連結獲得法が既知の技法に属し、そ
の中には通常の試薬であり、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｏ＋Ｂ＋
ａｎｙ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　。

から入手のプロピオン化Ｎ−サクシンイミデール−３−
（２−ビリチール２チオ）（ＳＰＤＰ）やサクシンイミ
ヂールー４−　（Ｎ−マレイミド−メチル）シフ０ヘキ
サンー１−カルホキシル化物（ＳＭＣＣ）を使ったジス
ルフィド結合形成が含まれる。これら試薬は、それ自身
中に、及び１つの蛋白質ペブヂドのシスティン残基間及
びリジンのＣ−アミノ又はアミノ酸の自由アミノ基を通
じたアミド結合を通じてジスルフィド結合を作る。

このような種々のジスルフィド／アミド形成試剤が知ら
れテイル。例えばＴｍｍｕｎ　Ｒｅｖ　　（１９８２）
昼２：１８５を見よ。他の２官能性カツプリング剤は、
ジスルフィド結合の代りにチオエーテルを作る。多くの
これらチオエーテル生成試薬は市販されていて、その中
には、反応性の強いエステルである６−マレイミドカプ
ロン酸、２−プロを酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−
マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カ耐シボン
酎及びこれらと類似のものがある。そのカルボキシル基
は、コハク酸イミド又は１−ヒドロキシ−２−二トロー
４−スルホン酸す１〜リウム塩と結合して活性化する事
が由来る。前述のリストは完全なものではなく、該化合
物を修正しても明らかに使用可能である。

目的物に有害な抗体生成をそれ自身が誘起しない運搬茜
が利用されうるかもしれない。

例えば種々の血清、アルブミン、破傷風毒素、カギ穴青
貝ヘモシアニン（ＫＬト（）のようなもの以外の運搬者
ならば何でも使用可能である。

適切な対象物に注入された場合に、その接合物は抗血清
の生産を起こし、それはこの接合物に対してのみならず
、配列近似の蛋白質を持った融合蛋白質に対しても、更
に全ＢＤＶにも特異に反応する免疫グロブリンを含んで
いる。

Ｂ、　４．３　Ｄ　Ｖのエピ１ヘーブを含む噛ｔし類細
胞膜Ｂ　Ｄ　ＶゲノムのＣＤＮΔライブラリーの蛋白質
は哺乳類の組換宿主細胞と親和性のある発現ベクターに
リガーゼ接合される：下の文献では哺乳類／バクテリア
往復ベクターで、ＳＶ４０の９期プロモーターの下流配
列を持ち、その少に、同じくＳＶ４０のポリへ配列が来
るしのを用いている。

この特定宿主ベクター、ＰＳＶ７ｄ、の代わりになるベ
クターは、勿論の車使用可能である。希望するポリベブ
ヂドの配列のコードを持つこの吐乳類親和性ベクターは
、次に適当な噛７１．類細胞にその配列発現の為に形質
転換され、そして表面糖蛋白質の場合には、その生産さ
れた蛋白質を膜に輸送する。そのＩＩＩ！１１を最終的
に収穫し、全細胞をワクチン生産に用いるか、膜を阻害
して、ｌｌ！、！蛋白質を適宜に使用し、又は、その蛋
白質を純化して、ワクチンに発展させる。

Ｂ、５．ＢＤＶのエピトープを含む免疫原交雑粒子の調
製 ＢＤＶエピトープの免疫原性は、哺乳類又は酵母細胞で
作り得る。例えば、Ｂ−肝炎ウィルス（ＨＢＶ）表面抗
体（ＨＢ　ＳΔ０）と関連した粒子形成蛋白質とを結合
させる事でも又促進される。

ＢＤＶエピトープを１つを持ち、それが直接粒子形成蛋
白をコードする配グ１につながった構成物は、ＢＤＶエ
ピトープと１＋　Ｂ　Ｖエビ１−一プと両方に免疫原を
示す雑種を作る。Ｂ肝炎表層抗原は、辷ｃｃｒｃｖｉｓ
ｉａｅで作られ、組立てられる事が示されている（　Ｖ
ａ　ｌ　ｅｎｚｕｅ　ｌ　ａ　　その他　Ｎａｔｕｒｅ
　（１９８２）２０８　：３４４−３５０、そのような
粒子、原人層（１）　ｒ　ｅ　−Ｓ　）部分を含む構成
物から、成熟した表層抗原からの外にも形成される。

ｐｒｅ−ｓ部は免疫顕性１１８　Ｖエピトープの］−ド
を持ち、これら蛋白質は８母で発現される。

（Ｎｅｕｒａｔｈその俵、５ｃｉｅｎｃｅ　　（１９８
４）　２２４　：３９２−３９４）、Ｐｒｅ−ｓ部をコ
ードするものと、粒子形成蛋白質とを融合した構築物の
発現は、米国特許出願用６２１．７５６号、１９８４年
６月１８日出願に開示されている。ＨＢＳＡｇと異質エ
ピトープを含む雑種粒子のコード配列の発現は、米国特
許出願用６５０，３２３．１９８４年９月１３日出願に
開示されている。これら＋ＦＴ述の諸出願は、ｍｍ受領
者に譲渡され、証明Ｊ１により具体化されている。これ
ら構築物は、５Ｖ４０−ジヒドｆ」フオレートリダクタ
−ぜベクターを用い、チセイニーズハムスター卵巣細胞
など１４１ｉ　７Ｌ類細胞でも発現由来るだろう。（Ｈ
ｉｃｈｃｌ　ｌｃ　　その他、ｒｎｔ　　Ｓｙｍｐ　　
ｏｎ　　Ｖｉｒａｌ　　１ｌｅｐａｊｉｔｉｓ　　（１
９８４）　　）　　。

加えて、粒子形成蛋白質のコード配列部位それ自身、Ｂ
ＤＶのエピトープのコドンで入れ換える事が由来る。こ
の入れ換えの場合、中位の集合を仲介して免疫原粒子を
作るＩＪ、１合にＰＩ９母や哺乳類細胞では不必要な部
分は除去し１εする。こうして、余分なり一肝炎抗原部
が８［）Ｖエピトープと競争する事を避ける事が由来る
。

Ｂ、　６．１　　　　ワクシニア 大型で寄主範囲の広い運搬役ウィルスに、希望の免疫原
のエピトープ領域を組み入れてワクチンを処方する事が
行４つれて来た。特に、ＶａＣＣｉｎｉａウィルスはこ
の目的に用いられて来た。例えば、５１ｔｈ、Ｇ、Ｌ、
その伯、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（Ｕ
Ｓ＾）（１９８３）且ニア１５５−７１５９．はヘマグ
ルチニン遺伝子をインフルエンザ　ウィルスからワクシ
ニア　ゲノムに統合し、その組換ウィルスをワクチンと
して用いる事を公表した。同様に、スからチミジン　キ
ナーゼ遺伝子を、ワクシニアでクローニングした。Ｂ’
Ｄ　Ｖゲノムをこの発明で利用可能にした事は同様の機
会を提供する。その組換は一般に、ワクシニア　ウィル
スと希望のコード配列を持つキメラ　プラスミドを、転
写調整信号とワクシニア　ウィルス遺伝子で転写開始点
／外来蛋白質の隣にあるＲＮＡ出発点の支配下で共感染
させて起さゼる。感染中、外来ＤＮＡ配列とワクシニア
ＤＮＡとの両脇配列の類似性の為に、キメラ　プラスミ
ドの希望する部位の、ワクシニア　ゲノムへの組入れが
起こる。由来た組換ワクシニアは、感染細胞から収穫さ
れ、ワクチンの考案に使用由来る。ワクシニア　ウィル
スはＶｉ１端に大きなゲノムを持ち（１２０ｘ１０６ダ
ルトン）培養で極めて容易に生育する。故に、安い免疫
原ワクチンの人聞生産が容易に行える。

Ｂ、　７．　’７欠工之ＪＩ 活性成分として、ペプチド配列を持つワクチンの調製は
、また良（知られた技法である。典型的に、このような
ワクチンは溶液又は懸濁の注射薬として調製される：注
射前に溶解か懸濁させるに適した固望剤にも作れる。そ
の調製品は、エマルジョンにづる事も、脂質人工膜にカ
プセルする蛋白質にする事も由来る。調剤上受入れ可能
で、活性成分と親和性のある賦形剤と活性免疫原である
成分は、混合される事が多い。適した賦型剤は、例えば
、水、食塩水、ブドー糖、グリセリン、エタノール、或
は類似のものと、それらの混合物である。加えて、もし
必要ならば湿潤剤、乳化剤、ｐＨＷ　部用のような補助
物質を少量入れる事もある。

このワクチンは、従来、例えば皮下、筋肉的注射により
非経口的投与され、他の投与様式として適している補足
的調剤には座薬や、場合によっては経口投与剤がある。

座薬としては、伝統的結合剤と保持剤、例えばポリアル
カリン　グリコールやトリグリセライドが含まれる；そ
のような座薬は、活性成分を０．５％から１０％、なる
べくは１〜２％を含むように成形する。杼口用の処方に
は従来の賦形剤である例えば、薬局方純度のマニトール
、ラフ１〜−ス、デンプン、ステアリン酸マグネシウム
、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウ
ム及び類似のものを含む。このような線成分は、水溶液
、懸濁剤、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤又は粉ｎ
１の形状をとり、１０〜９５％の有効成分を含むが、２
５〜７０％が望ましい。

その蛋白質は中性又は塩の形でワクチンとして調剤でき
る。医薬として使用可能な塩には酸添加＠（ペプチドの
フリーアミノ基の間で形成）と、例えば塩酸、リン酸の
ような無機酸、酢酸、蓚酸、酒石酸、マンゾリン酸、等
のような有価酸で生成された塩が含まれる。遊離のカル
ボキシル基で生成される塩は、ナトリウム、カリウム、
アンモニウム、カルシウム及び鉄の水酸化物等のような
無Ｉ　ＦＡｉ、を及びイソプロピルアミン、１−リメチ
ルアミン、２−エチルアミノ　エタノール、ヒスチヂン
、プロ力イン、及びその近縁物のような１１機塩Ｕから
誘導される。

ワクチンは投与ω規格に合う方法で、治療上有効で免疫
原性のあるｔ４を投与づる。投嬰；ｄは治療する対象物
に依存し、対象物の免疫シスツムの抗体形成能とどの程
度の防護が望まれるかによる。

投与に必要な活性成分の正確な吊は、開業医の判断に依
り、夫々の対象物により特有である。

Ｂ、８．　ＢＤ　Ｖエピトープに対するＭａｂｓ（７）
調製 上述の免疫原蛋白質又は免疫接合体は周辺血液リンパ球
と牌臓細胞を注射した哺乳類から取って、これら諸エピ
トープに対しての甲クローン抗体を作るのに用いられる
。（７られた甲クローン抗体は、診断に特にｈ用で、中
和性のあるものは、受動的免疫治療に有用である。

Ｃ１一般的方法 ウィルスからＲＮＡを抽出する一般技術、Ｃ］つＮＡラ
イブラリーの作成と検索、クローンの配列決定、発現ベ
クターの構築、細胞の形質転換、及び近似の事々は既知
の技法であり、これら技法を記述した実験室手引書があ
る。しかし一般指針として、これらの手順と実行に際し
有用な材料のために近頃用われた帰らかの資料を下に示
す。

Ｃ１，宿主と発現制御配列 適切な制御配列が、予定の宿主と親和性を持って使用さ
れる時、原核生物細胞でも真核生物細胞でも、希望のコ
ード配列の発現に用い得る。クローン化には原核ｌｔ物
がより有用である：発現には原核、真核のいずれでも用
いる事が由来る。原核宿主の中では通常大腸菌が便利さ
の為に最もしばしば用いられる。原核生物の発現制御配
列には、プロモーター、選択的に含まれるオペレータ一
部分及びリポソームイ・１４位置などが含まれる。原核
宿主に親和性のある転移諸ベクターは、通常、例えば、
増幅およびアンピシリン及びテトラサイクリン６４竹を
与えろオペロンを含むプラスミド、ＰＢＲ３２２，及び
種々のＰ　ＬＪ　Ｃ諸ベクターが用いられ、それは同様
に抗生物質耐性を与える諸配列を持つ。前述の諸オペロ
ンは選別により形質転換に成功したものを１５するため
に標識として用い得る。通常用いられる原核生物の制御
配列には、βラクタマーピ（ベニシリナーゼ）及びラク
トースプロモーター諸シス７１＼が含まれる（　Ｃｈａ
ｎｇ、その他、り四駐（１９７７）１９８：１０５６．
　　トリプトファン（ｔｒｐ）プロし一ター　システム
（Ｇｏｅｄｄｅ　ｌ、その他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ　　（１９８０）旦：４０５７）及びλ由
来のＰ、プロモーター及びＮｕ伝子リすソーム附着位置
（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ　。

その他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）が
ある。前述のシステムは、１？ｉに大腸菌と親和性があ
る；若し希望なら、バヂルス又はシュードモナス株のよ
うな他の原核宿主を対応した制御配列で使用由来る。

真核宿主としては、酵母と吐乳類培養細胞があン酵母、
及び５ａｃｃｈａｒｏｎ　ｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒ　
ｅｎｓｉｓが最も含油に用いられる酵母宿主で、矢張り
便宜上の理由である。＾■１和のベクターは成功した形
質転換体を選別し４！する諸マーカーを持ら、そしてそ
れにより原栄養体から非栄養体への変異をもたらすもの
であったり、野牛型系統に抗生物質耐性や重金属耐性を
与えるものである。酵母親和性のベクターとしては、２
ミクロンの増殖起点（Ｂｒｏａｃｈ。

Ｊ、その伯、Ｈｅｊｈｒｎｚ　　（１９８３＞　１０１
　：３０７）と云うＣＥＮ３とＡＲ３Ｉの複合体、又は
他の方法で増殖を確保するもの、例えば、適切な断片を
宿主細胞ゲノムに挿入するようなものが用いられる。酵
母ベクターの制御配列には、糖分解酵素の合成用プロモ
ーター（ｆｌｏｓｓ、その他、Ｌ４９００）、及び３−
フオスフオグリセレー１〜ギナーゼのプロモーター（Ｉ
Ｉ　ｉ　ｔＺＱＩＩｌａｎ、ぞの他、ＬＢｉｌｌ　Ｃｈ
ｅＩＩｌ（１９８０）　２５５　：　２０７３）などが
含まれる。酵母での発現に（よ、エノラーぜ遺伝子由来
のもの（ｌｌｏｌｌａｎｄ、Ｈ，Ｊ、、　Ｊ　Ｂｉｏｌ
　Ｃｈｅｍ　　（１９８１）２５６　：　１３８５）の
ような停止信号も含まれるだろう。特に有用な制御シス
テムには、こ）に特に説明するものが含まれ、それはグ
リセルアルデハイド−３リン酸脱水酵素（Ｇ　Ａ　Ｐ　
Ｄ　Ｈ）のプロ［−ター又は、アルコール脱水酵素（Ａ
　Ｄ　＋−１）調節プロモーター、Ｇ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｈ
由来の停止信号、及び、若し選択を９Ｊむ時には、酵母
アルファ因子のリーダー配列である。これらのシステム
の詳細は、Ｕ、Ｓ特許出願第４６８，５８９号、１９８
３年８月２２日出願及び５２２．９０９弓、１９８３年
８月１２日出Ｋｉにあり、同一の被護渡者に譲渡され、
ここに引用１−る。

宿主として発現に利用由来ろ噛゛ソＬ類細胞系統には、
多くの不変化した細胞系でＡｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙＤｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｃｃｔｉｏｒ＋から利用［■
能のもので１−１　ｅ　Ｌ　ａ細胞、チャイニーズハム
スター卵巣（Ｃ１〜１０）細胞、幼ハムスター腎臓（Ｂ
　ｌ−Ｉ　Ｋ　）細胞、及び多くの他の細胞系が含まれ
る。吐乳類細胞用プロモーターでウイルスブ［」モータ
ーが群をｊ友いて良く用いられ、それらはシミアン　ウ
ィルス４０　（ＳＶ４０）からのもの（Ｆｉｅｒｓ　、
その他。

Ｍａｔｕｒｅ（１９７８）２７３　：１１３）又は他の
ウィルスプロモーター叩らＲｏｕＳ肉腫ウィルス（Ｒ８
Ｖ）　、アデノウィルス、及び牛乳頭腫（８Ｐ　Ｖ　）
である。吐乳類１胞は更に、停止信号の配列を要求する
だろう。哺乳類細胞で増殖するに適したベクターは、ウ
ィルスのレプリコンを持つか、或は適切な配列の宿主ゲ
ノムの挿入を確保する配列を持つだろう。

Ｃ，２，ＶｉＬｉ！ 使用される形質転換の手順は、形質転換を受ける宿主に
依って決まる。バクテリアの形質転換は、一般に、カル
シウムかルビジウム塩酸塩での処理を行う（Ｃｏｈｅｎ
、Ｓ、Ｎ、、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ
　（ＵＳＡ）（１９７２）６９．：２１１０．　Ｈａｎ
ｉａｔｉｓ、その他、Ｈｃｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：＾７　Ｈａｎｕａｌ　　（１９８２）　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　！ｔａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｐ、
２５４　）　、　１ｌＩｙ母の形質転換は、旧ｎｎＱｎ
、Ａ、その他、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌへ３≧ａｄ−一多コ
≧１（ＩＩｓ八　）　　　（１９７８）７二−」う、：
１９２９−１９３　：３．の方法を用いて行える。吐乳
類の形質転換はリン酸化カルシウム沈′Ｉ２法、ｃｒａ
ｈａｍ　ａｎｄｖａｎ　ｄａｒ　［ｂ、　講江虹皿Ｌ（
１９７８）　ｕ：　５４６、又はそれの神々の改良型を
用いる事が由来る。

Ｃ１３，ベクターの構築 ベクターの構築には既に充分熟知された方法を用いる。

位置特定のＤＮＡ分断は適当な制限酵素を、通常市販酵
素製造者が指定する条件で行われる（例えば、Ｔｈｅ　
Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｐｒｏｄｕ
ｃｔＣａｔａｌＯ（ｌを見よ）。一般的には約１μ９の
プラスミド又はＤＮＡ配列は、２０μｍの緩衝液に１！
１１位の酵素を入れたしので分断し、保温時間（よ約１
−２時間で温度３７℃を用いる。制限ＶＩ水素中保温後
、蛋白質はフェノール／クロロホルム抽出で除去し、Ｄ
ＮＡは、エタノールで再沈殿して収穫する。その分断断
片はポリアクリルアミド又はアガロースゲルの電気泳動
技術で分別され、そねはＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｒｎ　　（１９８０）　６５　：　４９９−
５６０、の一般手順による。

接着性末端のある分断新断ハは大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼ１（にＩｅｎｏｗ）を用い適切なデオキシヌクレオチ
ド三リン１Ｉｉ（ｄＮＴＰＳ）の存在下で、ポリメラー
ゼに適した保温でプラント末端に仕上げる。そのポリメ
ラーゼは、突出した３′単鎖を消化し、逆に５′突出部
を充填する。それは混合物中のｄＮＴＰｓに依って決ま
る。Ｓ１ヌクレアーぜによる処理も用いられ、それで総
ての単鎖ＤＮＡ部分は加水分解される事となる。

リガーゼ接着は標準緩衝液を用いて行いＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを使用しての温度条件下でＡＴＰを用いる；接着性
末端接着には、整末端の場合より少ないＡＴＰと少ない
リガーゼで充分である。

ベクターの断片がリガーゼ接着の混合物の一部として使
用され、この断片はバクテリアのアルカリリン酸化酵素
（ＢＡＰ）で処理され、ベクターがリガーゼ接着するの
を防ぐ為の５′　リン酸除去を受ける場合か多い；代わ
りに、不必要な断片を制限酵素で消化除去して、接着を
予防する事も由来る。　リガーゼ接着の混合物は、適当
なりローン化宿主、例えば大腸菌に、形質転換されるつ
そして形質転換に成功した転換物は、例えば抗生物質耐
性などで選別され、正しい構築物をふるい分ける。　　
Ｃ１４，希望するＤＮＡ配列の構築合成したオリゴヌク
レオチドは、自動オリゴヌクレオチド合成礪で、Ｗａｒ
ｎｅｒ、　Ｂ、　Ｄ　　その他、ＤＮＡ　（１９８４）
旦：４０１−４１１、に説明されるように合成される。

必要ならば、過剰のポリヌクレオヂドキナーゼを用いて
ラベルしたＡＴＰを使い通常のギナーピ条件下で合成ス
トランドを３２ｐでラベル由来る。

ゲノムの又はｃＤＮΔライブラリー中から取り出したも
のを含め、ＤＮＡの配列は、定位置突然変異で、ｌｏｌ
　Ｉｅｒ、Ｈ，その他、Ｎｕｃｌｃｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅ５（１９８２）旦：　６４８７−６４９９に述べら
れたように修飾する事が由来る。容易に、修篩寸べきＤ
ＮＡはファージ中に、ゲノム！Ｊｌ　ｌの形で入れられ
て、それを、ブライマーとして合成ＡリゴヌクレＡヂド
で、修飾を受【ノる部分に相捕的なしのを用いて、ＤＮ
Ａポリメラーぜで２本鎖ＤＮへとし、それ自体の配列を
含む希望の修飾をする。

由来た複鎖ＤＮ△はファージを保持由来る宿主バクテリ
ウムに形質転換し、ファージの２本鎖の増殖物を含む形
質転換バクテリア培養物は、プラークを作らせる為に寒
天に接種される。理論上、５０％の新プラークは、変異
型を単鎖としてもて５０％は本来の配列を持つプラーク
を含有する。プラークの複製物は、合成したプローブと
キナーゼで、正しい単鎖と交雑由来るが、未修飾のもの
とは由来ない温度と条件下で交雑する。こうして識別し
た求める修飾諸配列を、次に再生しクローン化し、求め
るｌ）　Ｎ　Ａの原材料として用いる。

Ｃ５，プローブとの交雑 ＤＮＡのライブラリーは、ＧｒｌＪｎＳｔｅｉｎ及び１
１ｍｇｎｃｓｓ　　（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　
Ｓｃｉ　（ＵＳＡ　）　　（１９７５）７３　：３９６
１）の手順を用いて確認する。

短連すれば、この手順に於ては、確認されるべきＤＮＡ
は、ニトロセルロース濾紙に固定する、変性させる、次
に予交雄を０−５０％のボルムアミド、０．６ＭのＮａ
Ｃｊ！、６０ｍ）４のクエン酸ナトリウム、各０．０２
％（ｗｔ／ｖ　）の生血消アルブミン、ポリビニールビ
ロリヂンおよびフィコール、５ＱｍＨのリン酸ナトリウ
ム（ｐＨ６、５）　、１％のグリシン及び１００μｇ／
ｄの変性した運搬体ＤＮＡで行う。緩衝液中のホルムア
ミドのパーセンテージは時間、湿度の予交雑での条ｆ１
及びその後の交雑手順と共に厳格さが要望される。オリ
ゴマープローブでそれ程厳密条件の要求されないもので
は、一般にボルムアミドの濃度を低くし、低温で長時間
の交雑をする。ｃＤＮＡ又はゲノムの配列に由来の３Ｃ
）−４０以上のヌクレオチドを持つプローブでは、一般
に４０−４２℃の高温を用い、例えば５０％の高濃度ホ
ルムアミドを採用する。予備交配に続いて、同一の緩衝
液に、今回はキナーゼで３２Ｐを入れたオリゴヌクレオ
チドプローブを含んだものを加え、雑種ＤＮＡを作った
。

これで処理した濾紙にラジオオートグラフをかけると、
交雑したプローブの位置がわかり、ｇ識されていないレ
プリカ濾紙上の対応づ−る位置を、希望する［）Ｎへの
原料とし″（用いる。

Ｃ，６，Ｍ４築の２価と　　゛ 慣行のベクター溝築では、リゲース接着をした湿合物は
、大腸菌系統１−４　Ｂ　１０１又は別の適当な宿主に
形質転換され、転換成功体は、抗生物質耐性又は他のマ
ーカーで選別される。形質転換体からのプラスミドは、
Ｃｌｅｗｅｌｌ、Ｄ、Ｂ、、その他、ＰｒｏｃＮａｔｌ
＾ｃａｄ　５ｃｉ（ＵＳＡ　）　　（１９６９）　６２
　：　１１５９の方法で、通常はクロラムフェニコール
での増幅後（Ｃｌｅｗｅ１１．Ｄ、Ｂ、、　Ｊ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ　　（１９７２）１１０：６６７）に調整
される。このように分離されたＤＮＡは、夫々に分けて
制限酵素分析を受け、又は配列分析がＳａｎｇｅｒ、　
Ｆ、　、その他、Ｐｒｏｃデ、４キシ法で行なって配列
決定をするか、又はＨａＸａｌｌ　、その他、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｑＶ　　（１９８０）
昼５：／１９９の方法でなされる。

Ｄ″Ｌ！！ｉ 次の例は、光明を明示する為であって、制限する目的で
はない。ここに述べる手順は、例えば、に基いて希望す
るヌクレオチドの配列を構築する技術が利用由来るので
、若し望むなら繰返すが、必要はないだろう。発現は大
腸菌と酵母に例証されるが、このシステムは　Ｃ１，に
もつと詳しく示しである。ゲノム構造から由来の追加エ
ピトープは同様に生産由来、そして、抗体を下記するよ
うに発生させ得る。

Ｄ、１．ｃ　　　　（７）”　Ｉ Ｄ、１．ａ、ＢＤＶウィルスの生産 牛胚腎細、胞（［３ＥＫ　］　）を、０．８５９／ｊ！
Ｎ　ａ　ｌ−Ｉ　Ｇ　Ｏ３と１０％の照射済の牛胎児血
清を含むＭＥＭ（［：ａｒドＳ）で生育させた。生物学
的にクローン化したＢＤｖウィルスの０ｓｌｏｓｓ系を
ＢＥＫ　Ｉ細胞に増殖率０．１で５回継代した。細胞が
結集し、次に空胞化し、更に、細胞溶解する細胞変性効
果は、最初の１回目からは容易に観察された。最終力価
（〜１０８ｐｆｕ　／ｍｅ）は感染細胞の凍結凍解によ
るウィルス回収＜’Ｄ　Ｉ！Ｉられた。

ウィルスの生産には、１７５７７１２人りプラステイッ
ク　フラスコの半癒合ＢＥＫ　Ｉ細胞を用いた。

これら細胞は感染性緩衝液（ｆｖｌＥＭ　（Ｅａｒｌ’
ｓ）　＋２．２ｇ／Ｉ　　Ｎａ１（ＣＯ２、！１１１１
７　、６　）で３回洗い、そして感染性緩衝液２ｄ中の
ＢＤＶで、増殖率０．０５ｐｆｕ／細胞で感染させた。

３５℃に１時間保温後、１８ｄの感染性緩衝液を加え、
３５℃で４−５日保温し、その後で細胞変性効果（空胞
化とその後の溶解）は８０％以上と観察された。典型的
生産の場合、１５０フラスコの細胞を感染させた。その
培地（約３リツトル）を集め４℃で貯えた。残余の細胞
は２ａｅの感染性緩衝液入りフラスコ中で破壊し、３回
凍結、解凍を繰返し、そして、最終懸濁液を感染性培地
加えた。３０分の１０．０００ｇ遠心分離の後、上澄み
を超遠心の１２０．００（ｌで、４時間４０分、４℃に
おいて１０倍に濃縮した。

感染し得るウィルスは蔗糖密度勾配の等密度点バンドで
はかつて、１．１２９／ｄ！の濃度であり、４５−５５
ｎ■の球状粒子として電子顕微鏡で観察された。このウ
ィルス標品を牛からのウィルスを注射した兎の抗ＢＤＶ
抗血清で中和した。

ｏ、ｉ、ｂ、ウィルスＲＮΔの抽出と純化Ｃｈｉｒｇｗ
ｉｎその他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９７９）
　１８：３２９４で述べられたＲＮＡはウィルスの遠心
団塊からＣ３Ｃｊ！／グアニデイウム　チオシアネート
法で分離し、そして純化したＲＮＡを７０％エタノール
中で一２０℃に貯えた。このＲＮＡ標品は、大けの分子
量の小さい細胞ＲＮＡの混入物と、無傷のウィルスＲＮ
Ａとを含んでいた。ウィルスＲＮＡは下記の蔗糖密度勾
配で更に純化した。

推定５μ９のＢＤＶ−ＲＮＡを含む１分液を１０．００
０！７で１５分、４℃で遠心分離した。その遠心団塊８
０％エタノールで洗浄し、３７５μｌの９９％ＤＭＳＯ
（９９％）　、５ｍＨＴｒｉｓ　−ＨＣｊ！　（ｐＨ１
７，５＞で変性させ、５分間３７℃に保温した。１．１
２５ａｅの５ｍＨＴｒｉｓ−ＨＣｆ（ｐＨ７，５＞　、
１＋１４のＥＤＴＡ、１％の５ａｒｋｏｓｙｌの添加後
、その溶液を７０℃２分間加熱し氷上急冷した。この溶
液は５Ｘ１５−３０％の蔗糖勾配で、５ｍＨのＴｒｉｓ
ＨＣｌ（ｐＨ１７，５）　、１０１ＨのＥＤＴＡ、０．
１ＭのＮａＣｊ！、１％５ａｒｋｏｓｙｌ（無菌、硅酸
化ベックマン５Ｗ４０管の中で）中で分配した。６番目
の傾斜は、３′末端をラベルしたＲＮＡをマーカーとし
て填めた（下記を見よ）。１６時間１９．０００回転／
分（２０℃）の遠心分離の後、その傾斜を分割した（１
１ｄの分割）。

マーカーラベルしたＲＮＡを含むものに相当する各フラ
クションのＲＮＡは２．５容鼓のエタノールで、運ｉ１
Ｍ母ＲＮΔの存在下に沈殿させ、ホルムアルデヒドアガ
ロースゲルで電気泳動し、どの分割がＢＤＶ−ＲＮＡバ
ンドを持つかを調べたＬｅｈｒａｃｈ　、その他、Ｂｉ
ｏｃｈｅｎｉｓｔｒｙ　（１９７７）　１６：４７４３
゜ＢＤＶ−ＲＮＡのものに相当する諸分割は、平行傾斜
から集めて２．５容８のエタノールで沈殿、８０％エタ
ノールで洗って７０％エタノール中で一２０℃に貯蔵し
た。

その純化ＲＮＡは３２Ｐ−ＤＣＤ　（３０００Ｃｉ／ｎ
１ｌ１０＋）で、Ｅｎｇｌａｎｄ　、その他、唾Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ　　（１９８０）　６５　：　６５−７４、に
従って標識し、２．２Ｍホルムアルデヒド存在下でアガ
ロースゲル電気泳動で、ＬＣ４ｈｒａＣｈ　、その他、
（同上）の述べるように分析した。蛍光グラフィを生産
者の推奨するように３ト１−増強剤（ＮＥＮ）存在下で
行った。

大部分の放射能は分子量の低いＲＮＡ　（２キロベース
以下）に阻隔していたが、小部分が大分子量のバンドの
約１２．５にｂに見出され、それはＲＮＡリガーピによ
る標識能があり、ＲＮＡＳｅとアルカリに感受性強く、
ＤＮＡ５ｅとブロテイナーゼＫに耐性である事が認めら
れた。ワラビウイルス群のトガウィルスのその他のデー
タに符合して、Ｂ　Ｄ　Ｖ　−ＲＮ　Ａ　ハｌｒ　’）
　＝ｆ　ｄ　Ｔ　ｔ？／Ｌ／　ｏ　−スニ添着せず、３
′末端にポリへの伸展部が無いか又は、若しあれば、極
端に短い事を示した。コントロールに使った５ｉｎｄｂ
ｉｓウイルスＲＮＡは、同一のカラムの中で正規に保持
されていた。

これらの１２．５にｂバンドの特性は、下記に生育した
ＢＥＫ　Ｉ細「包から抽出したＲＮＡが示したものと同
一であった： Ｂ　Ｅ　Ｋ　ｌは２５ｃｍ”のプラスティックフラスコ
中で生育、３度感染性緩函液で洗い、５Ｏ−１００ｐｆ
ｕ　／１ｌＪＪ胞（ＤＮｒｌＩＵ率ｒ１ｄ（７）ＢＤＶ
溶液中で感染させた。３５℃で１時間保温の後、感染性
緩衝液４ｒｄを加えて、保温を続けた。１２．１５．１
８．２１及び３６時間後（３６時間はＢＤＶ生活環の１
巡に当る）、新しく生成したＲＮＡを３日−ウリジン（
１００ｕＣｉ／シヤーレ）で標識した。無感染で１８時
間保温した後収穫した細胞ＲＮＡム分析した。３０分の
標識後、細胞のＲＮ　Ａ　ｌ、ｔ　Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、
その他、１９７９（上記参照）のＣ３ＣＪ２／グアニジ
ウムチオシアネート法で抽出した。５．７Ｍ　　Ｃ５（
、ｊ！をクッションにした超遠心分離でｖまたＲＮΔベ
レットは直接ホルムアルデヒドアガロースゲル電気１）
ＫｖＪで分析し、ゲルは乾燥して蛍光グラフィにかけた
。上記の総てのテストした保温時間で、無感染区にはな
い１２．５にｂのバンドが見られ、それは上述したＲＮ
Ａと同一の物理−化学的特性を示した。

Ｄ、ＬＣ，ＣＤＮＡの調製 り、　Ｌ　ｂでウィルスから分離したウィルスＲＮ△ハ
５ｉｐｐｅ１．Ｆｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｃｍ　　（１９
７３）　、　２Ｌｌ：３１−４０゜の方法でボリアデニ
ール化した。手短かに云えば、推定ｆｆ１０．７μ３の
純化ＢＤＶＲＮＡを５−の５ｎ＋Ｈ水酸化メチル水銀で
１０分間室温で保温し、次に２０ｔｌｉ位のポリＡポリ
メラーゼ（ＢＲＬ）と５００μＣｉの”Ｈ−ＡＴＰ（３
６Ｃｉ　／ｒｅ　ｍｏｌ　、＾ｍｃｒｓｈａｍ　）を５
０ｃｌ、５０ｍＨｌ−１（１（ｔ＋ｌＩ７．５）に入れ
たもの、ＩＯＭのＭｇｃｌ２．２．５１１ＩＨのＭｎＣ
ｌ２．０．３ＭのＮａ（、Ｊ！、　１．５ｎｔ４の２−
メルカプトエタノール及び２．５μ９のＲ　Ｎ　Ａを含
まないＢＳＡと５単位の人胎盤のりボヌクレアーｔｌ’
ｌＸｆｌ害剤（ＢＲＬ）の諸量と共に３７℃で６分間保
温した。フェノール／クロロフォルム抽出の後、このＲ
ＮＡはＳｅｐｈａｄｃｘＱ　５　Ｑ上のクロマ１〜グラ
フイーで純化し、２、５容吊のエタノールで沈殿させた
。このポリＡ　　ＲＮＡは検査調製用にすると共にＣＤ
ＮＡライブラリーの鋳型としても用いた。

二重のためには１μ９のポリＡＩＩＮＡを５ｕ　１　（
１）　１　０吐水酸化メチル水銀中で１０分間室温に保
温、その後４０ｊｔｉ位の逆転写酵素を１０〇−の５０
ｍＨ　　Ｔｒｉｓ−１−ＩＣｊ！　（ｐＨ８．３＞に入
れたちの、１ＯｍＨのＭｇｃｌ　、１．５ｒａＨ（１）
２−＃ールｈブトエタ／　−　ル、１ｍＨのｄＡＴＰ，
ｄＱＴＰ及びｄＴＴＰ、１０ｍＨのｄＣＴＰ、０．　２
ｔｎｙ／ｙｔｆｌのアクヂノマイシンＤ、５単位の人胎
盤リボヌクレアーぜ阻害剤、５００μＣｉのアルファ３
２Ｐ−ｄｃＴＰ＜３０００Ｃｉ／ｍｃｏｏｌ　、＾ｍｅ
ｒｓｈａｍ）及び２０Ｉｉ９の１−η腺ＤＮΔ（不特定
ブライマー）のＤ　Ｎ　Ａ　ｓ　ｅ　Ｉで部分消化して
１ｑたＡリゴヌクレＡヂドと杖に４５分間３７°Ｃ　ｔ
−保温した。

１５分から３０分後に、更に″ＩＯ単位以−Ｆの逆転写
酵素を添加した。フェノール／クロロホルム抽出と、Ｓ
ｅｐｈａｄｃｘ　　Ｇ　５　０カラムクロマトグラフイ
にかけた後、王のＲ　Ｎ　Ａを０　、　　１Ｍ　　Ｎ　
ａ　Ｏ　ｔ−４（１時間、６５℃）で加水分解し、単鎖
のｃＤＮΔ箱を１ワた。その溶液は０．１Ｍ酢酸で中和
し、直接交鉗緩雨液に入れた。

ｃＤＮ△ＤＮＡラリーの為に、ｄＴ　（１　２−１８）
ブライマーを含むものと不特定（仔牛＠腺）の三方法が
取られ、ＤＮＡ−由来オリゴヌクレオブードブライマー
を用いた。上述のインビトロでポリアデニンを付Ｇ−Ｊ
たＲＮＡを用いた。概略１μ７のポリアデニン付ＲＮＡ
は１０ｍＨの水酸化メチル水銀１０μｌ容最で１０分間
Ｖ温に置き、過剰妬剤は１μ！の３Ｍ２−メルカプトエ
タノール７８＆で滴定した。この変性ポリＡ　　ＲＮへ
は直ぐに５ＯｍＨの１ｒｉｓｐＨ８，　　Ｑ、１　ｍＨ
のｄＡＴＰ．ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄ　Ｔ　Ｔ　Ｐ、
２．５μび／雇のｄＴ１２−１８：１．を仔′ト胸腺不
特定オリゴヌクレオチドプライン−、１０ｎ＋ＨのＭＱ
Ｃｊ！２　、１　０ｕ’：ｉ／ｍのアクヂノマイシンＤ
、１００１′￥ｉ位の１犬Ｎ　Ａ　Ｓ　ｅ阻害剤（　Ｂ
　Ｒ　Ｌ　）及び６０単位の逆転写酵素の総雀１００μ
ｍ中で用いた。

この資料を４００μｆに１０ｍ）ｌのＥＤＴΔと０、２
％ＳＤＳを含む緩衝液で希釈し、フェノール／クロロフ
ォルムで抽出し、Ｓｃｐｈａｄｃｘ　　Ｇ　５　０クロ
マトグラフを行ってｄＮ丁Ｐｓから分離し、そしてエタ
ノールで沈殿させた。

沈殿したＲＮＡおよびＣＤＮＡ諸雑種の混合物（１０μ
ｍ）は５０＃Ｉｌ！のＳ１緩衝液（５００ｍＨのＮａＣ
１，５ｑｍＨの酢酸ソーダｐＨ４，５及び１１ＨのＺｎ
Ｃ１２）で希釈し、イして１５分間室温で２０単位の８
１ヌクレアーゼで消化した。その反応は資料を５ｑｍＨ
のＮａＣｊ！、１０ｍＨのＥＤＴＡ及び５ｑｍＨのＴｒ
ｉｓ　　ｐ１１７．　Ｏの緩衝液５００ａｅで希釈する
事で停止させ、そして消化は１５分間室温で２０μｇ／
ＩｄのＲＮＡ５ｅ　　Ａを添加して継続させた。フェノ
ールとクロロフォルムによる抽出の後、ＲＮＡ　：　Ｄ
ＮＡ諸雑種は、エタノール沈殿で濃縮し、１＃ｌｉ！の
プラスティックピペットに５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　
４　Ｂで準備したカラムを通して分割した。８００塩基
対より大きい分子を含むピークの取出したものは集め、
エタノールで沈澱させ、５０ｎｓの雑種をｄＴ選択を持
つ為に、２００ｎｇの雑種を不特定に仔牛胸腺断片でプ
ライム付する反応に用いた。

両試料は、ＤＮＡ又はＲＮＡ１分子毎に１５〜２２の残
）、（を作る条例下でｄｃ残１［付りをし、ｄＧの尾の
Ｐ［３Ｒ３２２ベクターでＰｓｔｌ制限位買（ＮＥＮ）
で線状化しであるものと、ベクター濃度０．１μｇ／ｍ
ｆｌで相補結合させた。そのアニーリングしたプラスミ
ドはｃＤＮ△ライブラリーを１ｑる為に大腸菌Ｈ［３１
０１内ＡｍｐＲ＋、：形質転換で入れた。

０．２．　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーの篩別ふるい分
けは、＋１−法を採用し、無感染ＢＥＫ１１１１胞（−
プローブ）から分離のＲＮＡと、細胞の完全溶解（＋プ
ローブ）後に取り出したウィルスから分離のＲＮＡから
調製した標識付ｃＤＮＡを用いて行った。ｃ　、Ｄ　Ｎ
　Ａライブラリーを内蔵した大腸菌は生育さｔ！（二つ
のレプリカで）ニトロセルロースフィルター上で溶解し
て、鑑識を行った。＋プローブ用に用いた交配［ｉ液は
、同様に無感染のＢＥＫ　ＩＩＩ胞（１０＃１９／ｄ）
から分離した細ＷａＲＮ　Ａを過剰に含んでいた。＋プ
ローブの明確な信号を発し、−プローブには応じないコ
ロニーを選抜した。この方法で９５０オリゴｄＴ−プラ
イム付及び１８５の不特定プライマーをプライムしたク
ローンが選別した。ｐｓｔｌで消化した後の諸挿入物の
長さは、４００から４゜ＯＯＯ塩基対と多様であった。

全長に亘るウィルス特異のＣＤＮＡは得られなかった。

諸クローンの一つ、ｐＤＴ２８、で８８０塩基対の挿入
を持つものを更に分析する為に選んだ。

プラスミドＤＮＡのＰｓｔｌ消化物であるこの断片はア
クリルアミドゲル電気泳動で純化し、Ｄｄｅ［とＭｂｏ
　Ｉで消化し、次にＤＮＡポリメラーゼ１（７）Ｋｌｅ
ｎｏｗ断片と、４つの３２ＰｄＮＴＰとでラベルし、１
０　−１０’　ＣＤＩＩＩ　／Ｒｇ（７）ｔｒｆｌヲ１
た。ラベルした挿入部は、ホルムアルデヒドの存在下で
０．９％のアガロースゲル電気泳動（Ｓｍｉｌｅｙ、そ
の他、Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　（１９８３）　１３
１　：３６５−３７２）で分別したウィルスＲＮＡとの
交雑でｖｌｉ認した。厳格な交雑条件を用いた：予交雑
と交雑とは、１夜４２℃で行い、交雑には５０％のホル
ムアルデヒドを用いた。洗浄は６５℃で行い、第一回は
２（７ａＳＳＣと０．１％ＳＯ８で、次に０．２倍ＳＳ
Ｃと０．１％ＳＤＳとで行った。

前記の確認作業で無感染細胞からのＲＮＡが、ネガティ
ブのコントロールとして用いられた。細胞のゲノム中に
外来のウィルス配列が存在しない事がすＩＪ’ンブロツ
テイング分析でのｐＤＴ２８プローブと、［３μｍｌ−
１１とＥＣ０ＲＩとで消化した細胞ＤＮＡとが結合でき
なかった事で立証された。

増殖率１以上で２４時間感染培養し、完全細胞溶解後の
ウィルス遠沈団塊から得たＲＮＡは、ポジティブとして
用いた。無感染細胞からのＲＮＡとの交１４ま認められ
なかった、しかしその挿入部は、感染細胞又はウィルス
の遠沈団塊から分離した、約１３にｂのバンドのＲＮＡ
と交雑を示した。

ウィルスＲＮＡと結合するＰｓｔｌ挿人体を含むと立証
されたプラスミドｐＤＴ２８は、追加諸クローンの為の
ＣＤＮＡライブラリーを鑑識する為に使用され、その全
配列は゛歩き（ｗａｌｋｉｎＱ　）　”諸技法で入手し
た。このようにしてそのウィルスのゲノム全長の１２．
５にｂに亘る、８個のプラスに示すように、ｐＤＴ２８
クローンは、ゲノムのほぼ中央の位置を占める。上記し
たものと相似であるが、プローブとして、適切な重なり
合う部分を含んだ配列のクローンを用いたｃＤＮＡライ
ブラリーから追加入手した８つの諸プラスミドは、大腸
菌内でＱで、そのプラスミドＤＮＡを分離した。この諸
挿入物は、塩基配列決定をして、虫なに、両配向で二次
り［コーンし、由来たファージをラベルし、そのラベル
付ファージを、正の配向である事が既知であるＲＮＡに
対しプローブとして用いて決定した。これは、照感染細
胞ＲＮＡ、感染１１１１１１１ＲＮＡ及び鋳型のウィル
スＲＮΔを用いてニトロセルロース濾紙上で、点交雑に
より行った。

感染細Ｉｌｌ　ＲＮ　ＡとＦＥ望ＲＮＡとは正の配向で
なければなら！よい。

従って、感染細胞ＲＮ△及びウィルスＲＮ△と雑種化す
るＭ１３の配向は９配向の有意性鎖を含み、この情報か
ら、ｏｃＴ６３からｐＣＴ１８５迄の挿入部の５′から
３′に向かう配列を推断する事ができた。

この結論は、ｐＴＣ６３の塩基配列決定によって確認さ
れ、それはこれが５′未喘部に予期通りにヘアピン構造
を作る１止力がある事を示す、又ｃＤＮＡライブラリー
の中にｐＴＣ６３の追加５′配列を示すものが無い事か
らもｖｆ１認された。

Ｄ、３、大腸菌内でのβＧａ　１−ＢＤＶ諸融金融合体
配列現 ＢＤＶゲノムの１２の部分が次のように入手できた：　
ｔｌｌ　０　Ｄ　ＮＡの全配列それ自体、（２）前述路
ＤＮＡの制限酵素分断産物（Ｐｓｔｌ又は３　ａ　ｍ　
ｌ−１１による又は両方による）、及び（３）ｐｃＴ１
８５　　ｃＤＮＡと伯のものの断片とのりガーゼ接合で
得た接合配列。（下の表参照のこと）これらの部分は、
融合蛋白質のＢＤＶ部分をコードするのに用いられた。

これら１１のＢＤＶ蛋白質をコードした配列はＢａｍＨ
Ｉ及びＰｓｔｌの制限酵素位置をβ−Ｑａ１コドンの三
種の読み取り枠金部に持つｏ　（Ｊ　Ｒ２９０，１ＪＲ
２９１及びＤ　Ｕ　Ｒ２９２の１つ又は混合物にクロー
ン化して入れて、融合蛋白質をβ−ガラクトシダーぜ蛋
白質の〇−未喘部にコードされているようにした（Ｒｔ
ｌｔｈＱｒ、ｌＩ　　その曲、Ｉ’：ｍｂＯＪ（１９８
０）　２　：　１７９１−１７９４）。

可能な三（某の読み取り枠は全部用いる制限酵素位置に
！２Ｕｔされるので、少くとも１つの融合蛋白質用語ベ
クターの正しい読み取り枠は確保される必要がある。

表、１．は調製されたベクターと、そのおのおのに３ま
れるＢＤＶ配列を要約したものである。

ヌクレオチド数は、図、２．に示しである。

表、１ ｆｉｌ　名称（２１Ｅ　ＩＩＱ　（７）　ｐＵ　Ｒ（３
１Ｂ　Ｄ　Ｖ挿入物の由来’ＩＱ　　ｆ４１　ｐ　Ｕ　
［３Ｖ　Ｄ　ベクター　ニ含マレルＢ　Ｄ　Ｖ　ヌクレ
オチド（番号は図、２．に示す） この１２個のＣＤＮＡ配列のおのおのは、ｐｓｔｌ消化
のｐＵＲ２９０，２９１及び２９２の混合物（又は若し
正しい読み取り枠が推断される場合にはこれらの１つ）
の存在下で■４リガーゼと混合し、この結合混合物は大
腸菌Ｄ１２１０系（ＨＢｌｏｌのＬａＣ１−変異体）に
ＡｍｐＲの形質転換を行なった。

形質転換に成功したものは、標識を付けた挿入物で交配
して確認し、そして分離したプラスミドＤＮＡは正し・
い配向について制限ｌｉ？素での分析を行った。形質転
換を成就し、正しい配向の諸挿入物を持つものの発現は
、４０μ９／ｄのアンピシリンを含むし一肉汁上でＩＰ
ＴＧ（１ａＮ）処理して誘起した。誘起３時間後、細胞
を収穫し、ＭＡ音波で溶菌した。融合蛋白質は、封入体
として生産され、それら封入体はにＩｅｍｐｎａｕｅｒ
、その他、Ｃｅ１ｌ（１９８３）３３　：３４５−３５
５の方法で収穫し、１０ａＨＴｒｉｓ　　（ｔ）１１８
．０）　、１ｇ＋ＨＥＤＴＡに懸濁し、−２０℃で貯蔵
した。

約１０〜３０ＷＪの封入体蛋白質が培養物１ｍｌ当りか
らＩＩｌられた。

０．４．融合蛋白質の特質検定 融合蛋白質は、それらの抗原諸特性につき、不溶、可溶
の両型について検定した。

１％ＳＤＳ又は７Ｍ尿素で可溶化し、最終濃度を１■／
−になるように透析にかけた１・１人体諸蛋白質は感染
仔牛の血清又は純化したウィルスで感染した兎血清に反
応しなかった。

抗血清の調製　可溶性にした封入体及び不溶性の封入体
をリンパ結節免疫を用い、５００μ９のＦｒｅｕｎｄの
完全アジュバントで乳濁化した蛋白質と兎に注射し、４
週間毎に従動投与を行った（５００μシをアジュバント
で乳濁化したものを１Ｍ注射）、そして従動投与１０日
後に採血した。コントロールの抗血清は、感染仔牛から
、または純化したウィルスを注射した兎から調製した。

その抗血清は、免疫活性についてＥＬＩＳＡと免疫蛍光
について、およびｗｅｓｔｅｒｎプロットと免疫沈殿に
よってテストした。

ウェスタンプロットと免疫沈殿とは反応性に関して相補
的情報を提供した。免疫沈殿においては、本来の蛋白質
混合物はデスｌ−血清と反応し、免疫沈殿物は５ＤＳ−
ＰＡＧＥにかりた。従って免疫沈殿物は本来の蛋白質と
の免疫反応性を査定するものである。

しかし、ウェスタンＳＤＳプロット手順では、ＰＡＧＥ
は、高血清をゲル上の蛋白質との沈殿反応を検査する前
に、実施される。従ってウェスタンプロット法は変性蛋
白との反応性を評価する。

これら手順の結宋を下に示す。

監」　　コントロールの抗血清は、ＢＥＫ　１１１１胞
で生育したウィルスの遠沈団塊から抽出した諸蛋白質に
ついて免疫反応性があった、そして主な抗原成分と思わ
れる７６ＫＤ蛋白質と免疫沈殿を示した、同時に、少く
とも部分的に副次的成分と思われるウィルス粒子蛋白質
で分子量が３６．４３．４７．５１及び５６ＫＤの諸蛋
白質と免疫沈殿を示した。コントロール抗血清は感染に
対して、木Ｕ蛋白質の中にある抗原と反応するが、変性
後は反応しない。

免疫沈殿とウェスタンプロット　融合諸蛋白に反応して
形成された抗血清の多くは、免疫沈殿による検定にも、
ウェスタンプロットにも、コントロール血清と同様にネ
ガティブであった。

しかし語例外があった。融合蛋白質７によって生成した
抗血清は、ＢＥＫ　Ｉ内で増殖したウィルスからの３６
ＫＤを沈殿させ、そしてウェスタンプロットで７６ＫＤ
と５１ＫＤの２バンドに反応する。融合５からの抗血清
は、６４．９８及び１０５ＫＤの三つの大きさの諸蛋白
質を免疫沈殿させるが、これらはコントロール抗血清で
は沈殿しない大きさである。融合９からの抗血清は、５
８ＫＯのバンド１つを沈殿させたが、これも又コント［
１−ル抗血清では沈殿しない。口の物質の分子ｍの意義
は、これらのうちどの蛋白質が、若しあるとして、分子
量の変化に応じた糖結合物であるか不明であるので、明
らかにできない。

Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　（Ｂａｒｔｌｅｔｔ、その他、Ｐ
ｒ０ｔｉｄＱＳ　　ｏｆｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　Ｆｌｕｉｄｓ、　　Ｉｔ、　Ｐｅｃｔｅｒｓ編、Ｐｅ
ｒｏａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ、１９７６、
２４　：　７６７−７７Ｏ）は部分的に純化したウィル
スを抗原として用いた。融合蛋白質７に対して調製した
抗血清だけが１：４０の滴定濃度でポジティブであった
：融合蛋白質５と１１は、滴定濃度で友々１：４と１：
８であった。無免疫の血精はネガティブであった。

免疫蛍光は標識した生存又は固定後の感染細胞を用いて
実施した。融合蛋白質１１に対して調製された抗血清は
、免疫活性で生存細胞について微弱にポジティブＣあっ
た：メタノール、アセトン又はホルムアルデヒドでの固
定ｍ　胞、Ｊ：、では融合蛋白質７で調製した自消は、
感染動物からのコンＩ〜ロール抗血清と同程度の強さの
反応を示したが、一方抗血清５と３とはＢＦＫＩＩ胞上
で生じたウィルスの遠心団塊から抽出した補張白質に対
して微弱にポジティブであった。

ＢＤｖゲノム全体が解析され、抗原作【戊された様子を
示す模式図である。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）図２、に示した如くＢＤＶゲノムの配列と実質的
   に同一であるヌクレオチド配列。
2. （２）図２、に示したＢＤＶゲノム配列にコードされた
   ものと実質的に同一のウィルス　ポリペプチドの、少く
   とも１つをコードするヌクレオチド配列。
3. （３）図２、に示したＢＤＶゲノム配列の１つの部分に
   由来するヌクレオチド配列。
4. （４）特許請求の範囲第１項のヌクレオチド配列に由来
   するＤＮＡ配列より成るもので、親和性のある宿主細胞
   の中で、ＢＤＶ関連蛋白質生産を果たし得る組換発現の
   システム。
5. （５）希望の宿主と親和性のあるコントロール配列に操
   作上リンクする特許請求の範囲第１項の配列に由来する
   コード部分より成る、組換発現システム。
6. （６）特許請求の範囲第４項の発現システムより成る組
   換ベクター。
7. （７）特許請求の範囲第５項の発現システムより成る組
   換ベクター。
8. （８）特許請求の範囲第６項のベクターにより形質転換
   された組換宿主細胞。
9. （９）特許請求の範囲第８項の細胞により生産された蛋
   白質。
10. （１０）特許請求の範囲第５項のシステムで、更に該Ｄ
    ＮＡ配列の上流を含み、その中の読み取り枠に宿主の蛋
    白質又はその一部をコードする融合ヌクレオチド配列を
    含むもの。
11. （１１）融合ＤＮＡ配列が、β−ガラクトシダーゼのＮ
    −末端部分をコードする、特許請求の範囲第１０項に記
    載のシステム。
12. （１２）特許請求の範囲第１０項のシステムから成るベ
    クターで形質転換された組換宿主細胞。
13. （１３）特許請求の範囲第１２項の細胞が生産した蛋白
    質。
14. （１４）アミノ酸配列が真核生物宿主によりつくられる
    場合、粒子を形成しうるアミノ酸配列を持つポリペプチ
    ドおよびＢＤＶの中和エピトープより成るＢＤＶ感染に
    免疫原である粒子。
15. （１５）粒子を形成するアミノ酸配列がＢ型肝炎ウィル
    スに由来する特許請求の範囲第１４項に記載の粒子。
16. （１６）粒子を形成するアミノ酸配列がＨＢｓＡｇに由
    来する特許請求の範囲第１５項に記載の粒子。
17. （１７）特許請求の範囲第９項のポリペプチドより成る
    牛下痢ウィルスに効果のあるワクチン。
18. （１８）特許請求の範囲第８項に記載の細胞を培養し、
    組換ペプチドを採取する事から成る抗ＢＤＶワクチンの
    製造法。