JPS60210989A - 抗ａ型肝炎ウイルス抗体の合成をインビボにおいて誘導する能力を持つペプチドをコードするｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ型肝炎は、通常致死性のない肝臓病であ１、す、長期
にわたって、体を衰弱させ得る病気である。この病気は
、通常、感染個体との直接的接触または、Ａ型肝炎ウィ
ルス（ＨＡＶ）により汚染された飲料水または／および
食物よりひろめられる。

２゜　従来技術においては、このウィルスの中和抗体を
誘導するＨＡＶ　（Ａ型肝炎ウィルス）のたんばく質ま
たはたんばく質類を同定していない。ＨＡＶたんばく質
の防護的抗原性を試験するだめの障害となる主なものの
１つとして、ＨＡＶおよびそのポリペプチド成分の皿が
十分でないことが挙げられる。このウィルスは、細胞培
養において非常に少量作られ、動物宿主範囲が限定され
ており、感染細胞培養および感染動物組織からの精製が
むずかしい。最近、ＨＡ　Ｖからの単離により調整され
たそのウィルスのＶＰ−１構造たんばく質を特許請求の
範囲において主張した特許出願が、この出願の醸受入に
より提出され、現在、米国特許出願番号第５４１，８３
６号１９８３年ｌθ月１４日提出として同時係属出願と
されている。ｖｐ−ｉは、ＨＡＶの主な構造たんばく質
であることが我々の研究所において認識されており、従
って、本たんばく質は、ワクチン的利用に最も重要であ
る。適切な投与形態および投与部位は、本出願中に述べ
られ、参考文献により具体化されている。

ＨＡＶのゲノム材料のクローニングおよびその配列の可
能な分析は、最近以下の様な報告中に示されている。

■　フォノ・デル・ヘルム（Ｖｏｎ　Ｄｅｒ　Ｈｅｌ＋
ｎ）等、ジエー・ピロロジカル・メソソズ（Ｊ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　）　３．１
９８１．３７−４３、同様の研究は、ヨーロッパ特許庁
出願番号第００６１７４０号、優先権１９８１年３月２
８日、公開１９８２年ｌθ月６日においても開示されて
いる。

■　ティセハルスト（Ｔｉｃｅｈｕｒｓｔ　）等、ブロ
ク・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ニーニスア
イ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＡｃａｄｅｍｙＳ
ｃｉｅｎｃｅ　Ｕ　Ｓ　Ａ　）第８０巻、５８８５−５
８８９ページ、１９８３年１０月 フォン・デル・ヘルムの研究では、ｃＤＮ＾の調製およ
びそのｃＤＮＡのプラスミド中へのクローニングについ
て述べられているが、そのＤＮＡのヌクレオチド配列ま
たは、対応するたんばく質のアミノ酸配列については述
べられていないし、発現されたウィルスたんばく質のど
れについても同定されていない。実際、フォノ・デル・
ヘルム等によって得られたウィルスたんばく質の抗原応
答が弱いということが、ＨＡＶの重要な抗原たんばく質
をコードするＨＡＶゲノムの大部分が同定に成功してお
らず、またクローニング実験において使用されていない
ことを示唆していると言える。

テイセハルストは、ＨＡＶの３′未満からの部分ヌクレ
オチド配列を報告しているが、抗原部位をコードする配
列の部分の同定については明らかにしていない。我々の
実験から言えば、テイセハルストは、抗原部位を配列化
しておらず、その配列的研究は、抗体領域より非常に離
れた部位において行なわれたと思われる。

本発明の目的は、ＶＰ−１、ＶＰ−２、ＶＰ−３および
ＶＰ−４、特にＶＰ−１を含むＨＡＶの主な抗原たんば
く質をコードするＨＡＶのゲノムのクローニング法を提
供することにある。他の目的は、ＶＰ−１を含む抗原た
んばく質をコードするヌクレオチド配列を持つＨＡＶゲ
ノムのヌクレオチド配列を決定することにある。さらに
他の目的は、適切な宿主中でクローン化されたＤＮＡの
発現により、ｖｐ−ｉ、ＶＰ−２、ＶＰ−３、ｖｐ−４
またはそれの一部を生成するための方法を提供すること
にある。さらに他の目的は、ｖｐ−１遺伝子、ＶＰ−２
遺伝子、ＶＰ−３遺伝子またはＶＰ−４遺伝子を含有す
るベクターを提供することにあるが、特に、ｖＰ−１遺
伝子または、ＶＰ−１の一部をコードする遺伝子を含有
するベクターを提供することにある。さらに他の目的は
、ＶＰ−１遺伝子、ｖｐ−２遺伝子、ＶＰ−３遺伝子ま
たはｖｐ−４遺伝子を含有するベクターを包含し、上記
遺伝子またはその一部によりコードされるペプチドを発
現する能力を持つ形質転換宿主を提供することにある。

本発明におけるこれらの目的および他の目的は、以下の
記述により明らかとなるであろう。

抗Ａ型肝炎ウィルス抗体をインビボ（ｉｎｖｉｖｏ　）
において誘導する能力を持つ免疫原性ベプチｌ’ＶＰ−
１，ＶＰ−２、ＶＰ−３ａｎｄＶＰ−４をコードするＤ
ＮＡ断片が提供され、それらのヌクレオチド配列が決定
された。言い替えれば、本発明は、ＨＡＶのＲＮＡまた
ば、対応する二本鎖ｃＤＮＡにより通常コードされるペ
プチドにおける抗原決定基をコードするＤＮＡ断片に関
し、これらの抗原決定基は、自然ウィルスＲＮＡ発現生
成物の抗原特性にとって必須なものである。

ＲＮＡは精製されたＡ型肝炎ウィルス粒子から抽出され
、ｄＴ末端付加プラスミドヘアニーリングされ、相補的
ｃＤＮＡが合成された。この一本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡポ
リメラーゼを用いるその相補的鎖の合成のための鋳型と
して使用された。結果形成された二本鎖ｃＤＮＡは、少
なくともＨＡＶ抗原たんばく質遺転子の部位と一致した
。それを、付着末端を得るために変形させ、適切なベク
ター中に配置した。原核生物および真核生物を含む適切
な宿主を、得られたベクターにさらし、このベクターを
安定に取り込んだ宿主が同定され、単離された。

ベクターＤＮＡは、これら宿主から抽出され、この材料
の特性を調べた。クローンＨＡＶＤＮＡの少なくとも５
つの断片が配列化され、抗原ペプチドＶＰ−１、ＶＰ−
２、ＶＰ−３およびＶＰ−４をコードする領域のヌクレ
オチド配列が決定された。それによりコードされる対応
するアミノ酸配列が推定された。

これらペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列の知識は、それらの合成を可能にすると同様にサ
ブユニットおよびその相同物および相似物についても可
能にし、それにより、構造と機能の間の関係の決定を可
能にするものである。上記に示されたペプチドは、本発
明の一部を構成するものではなく、ワクチンを作るため
の薬剤組成物において使用され得る。

本発明のＨＡＶペプチドは、これら構成アミノ酸から、
以下に例示する様な、たんばく質合成の標準法により製
造され得る。

Ｏシュロエダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ　）等、ペプチド
（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）　、第１巻、アカデミツ
ク・プレス（＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　、１９
６５０　ポーダンズキ−（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ　）等、
ペプチド合成（Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）
　、インターサイエンス・パブリソシャーズ （Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　
）　１９６６０　マクオミー（１１ｃＯｍｉｅ）著、有
機化学における防護群（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏ
ｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａ？ｌ’＋ＣＣｈｅｍｉｓｔｒｙ
　）　、プレナム・プレス（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ）
１９７３ これら発表文献は、ここに参考として引用する。

ＨＡＶのペプチドは、例えば、適切な１）ＮＡ配列の単
離または調製および適切な宿主における、これら配列の
ベクターへの挿入および、それから所望のペプチドの発
現などによる組み換えＤＮＡ技術によっても製造され得
る。

組み換えＤＮＡ技術の使用は、以下に示される例をはじ
め、多（の発表論文において述べられている。

○　マニアティス（にａｎｉａｔｉｓ）等、分子クロー
ニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）　、
ラボラトリ−・マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−（
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　）　、、　ニュ
ーヨーク１９８２この発表文献は、ここに参考として引
用する。

既知の技術による、本発明のペプチドをコードするヌク
レオチドの修正は、本発明のペプチドの変更されたアミ
ノ酸配列を有するペプチドの製造を、組み換えＤＮＡ技
術により可能にする。これらアミノ酸のうち、いくつか
は２，１つ以上の二連ヌクレオチド配列によりコードさ
れ得る。示されたヌクレオチド配列が、同じアミノ酸を
コードする他のコドンを包含するものであることが理解
される。例えば、コドンＣＧＡおよびＡＧＡは、それぞ
れアルギニンをコードする。

ＨＡＶペプチドの発現のための適切な宿主として、原核
生物、例えば大腸菌およびビー・ザブティリス（Ｂ、　
５ｕｂｔｉｌｉｓ　＞および真核生物、例えば、サツカ
ロミセス・セレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およ
びチャイニーズハムスター卵巣細胞が挙げられる。これ
らのたんばく質が適切な発現ベクター、例えばワタシニ
ア、水痘帯状庖疹、アデノまたは単純ヘルペスの各ウィ
ルスを用いて、哺乳動物種において直接に発現され得る
ことも理解される。

以下に実施例を示し、本発明を説明する。

尖巖炎土 ウィルスＲＮＡの抽Ｊ ２゜１．Ｉ　Ｃ３Ｃ；！勾配遠心により、ウィルス感染
ＬＬＣ−ＭＫ２細胞（サル腎臓細胞系）がら精製された
Ａ型肝炎ウィルス粒子（ＣＲ３２６株）を、１％ＳＤＳ
、２０ｍＭＥＤＴＡおよび０．１　Ｍ　）リスｐＨ７，
４−飽和フェノールを用いたフェノール抽出により、６
５℃で破壊した。

１．２　抽出物を含む水相を、さらに２回、等１１　ｑ
ｕｃｔ、：イソアミル　アルコール（２４：１）で抽出
し、−２０℃で、０．２　Ｍ酢酸ナトリウムおよび２倍
量のエタノールを用いて沈澱させた。

１．３　エタノール沈澱を遠心により集め、水に溶解し
た。

大施炭Ｉ ウィルスゲノムの３′末端からｃＤＮＡクローンの製造 標題３’ｃＤＮＡクローンを、エッチ・オカヤマ（＋１
．　Ｏｋａｙａｍａおよびピー・ベルブ（Ｐ。

Ｂｅｒｇ）　（分子および細胞生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　２
．１６１−１７０（１９８２）　）の手法を用いて製造
した。要するに、ウィルスＲＮＡをｄＴ−末端付加プラ
スミド（ｐｓＶｏ、７１−０．８６から誘導）ヘアニー
リングし、ｃＤＮＡを、ｄＴ−末端イ］加リンカ−（ｐ
ｓＶｏ、１９−０．３２から銹Ｂ）を用いて、逆転写酵
素により合成した。

プライマーとしてのリンカ−を用いて、第２ｃＤＮＡ鎖
をＲＮＡ分解分解酵素上るＲＮＡの除去後、Ｉ）Ｎ　Ａ
ポリメラーゼにより合成した。ｃＤＮＡは結紮され、大
腸菌に挿入され、その大腸菌を形質転換させた。結果得
られたクローンを、アンピシリン耐性により選択し、ウ
ィルスＲＮＡから調製され、３Ｚｐで標識されたＨＡＶ
ｃＤＮＡヘハイブリダイゼーションすることにより、ふ
るいにかけた。

得られた最も大きいウィルス挿入物は、約２．３Ｋｂの
大きさであり、クローンα１８と命名した。このクロー
ンの制限酵素分析は、クローン化挿入物の５′末端付近
に、２つのＰｖｕ１１部位の存在を実証した。クローン
ＤＮＡをＰｖｕＩ［で制限分解し、２８０ｂｐ５’近位
分画を、アガロースゲル電気泳動により精製し、エチジ
ウムプロミド染色により視覚化し、以下に示すｃＤＮＡ
クローニングのためのプライマーとして使用するために
透析管において電気溶出した。

太施斑主 プライマー延長によるｃＤＮＡクローンの製造 ３．１　ｃＤＮＡクローンα１８の２８０ｂｐＰｖｕｌ
Ｉ制限分画を、１０分間沸騰により変性させ、氷水中で
急冷させ次いでＩＩＡＶ　ｃＤＮ＾合成のためのプライ
マーとして使用した。変性プライマーを、ウィルスＲＮ
Ａへ、アニーリングするかハイブリダイゼーションした
。アニーリングのために１６０ｎＨの変性プライマーを
、２０μｌの水中約１μｇの精製ＨＡＶＲＮＡへ加え、
７０℃で１０分間、次いで、３７℃で１５分間加熱した
。ハイブリダイゼーションのためには、１４０ｎｇの変
性プライマーを、８０％ホルムアミド、０．４　Ｍ　Ｎ
ａＣ１゜０、ＯＬＭＰ　Ｉ　ＰＥＳ、　ｐＨ６，４およ
び２ｍＭＥ　Ｄ　ＴＡ中１μｇの精製ＨＡＶＲＮＡへ加
え、４７℃で３．５時間培養した。ボルムアミドを、４
回の連続したエタノール沈澱により除去した。

３．２　プライマーの、ＲＮＡへのアニーリングまたは
ハイブリダイゼーションの後、ｃＤＮへの第１鎖を、５
０ｍＭ）リスｐ１１８．０．３４ｍＭｄ（：ＴＰ、１ｍ
ＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ。

ｄＴＴＰ、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０ｒ
ｎｌｖｌ酢酸マグネシウム、［３２Ｐ−α］ｄＣＴＰ　
（８，ＵＣｉ／１０．ｃｌり、ＲＮａｓｉｎ（７４１位
／１０μり、およびＡＭＶ逆転写酵素（１６単位／１０
μｌ）を用いて、４２℃で３０分間培養することにより
、合成した。

反応混合物をフェノールで２回抽出し、クロロボルムで
抽出し、エタノールで沈澱させた。

３．３　ｃＤＮＡの第２鎖を、次いで、２０ｍＭトリス
ｐｌ＋７．４．５ｍＭＭｇＣ１ｚ　、１０ｍＭ（Ｎ１１
ｔ）ｚｓ０４．１００　ｍＫｃＩ、１ｏｏ、ｕｇ、／ｍ
１ＢｓＡ、０．０４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。

ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、９単位／ｍ１ＲＮＡ分解酵素
１■、および１７５０車位／ｍ１ＤＮＡポリメラーゼＩ
を用い、１２℃で６０分間、次いで２２℃で６０分間培
養することにより合成した。反応混合物をフェノールお
よびクロロボルムで２回抽出し、エタノールで沈澱させ
た。

３．４　二本鎖ｃＤＮＡは、末端デオキシヌクレオチジ
ルトランスフェラーゼを用いてｄＣ−末端付加がなされ
、Ｐｓｔ１部位でｄＴ−末端付加がなされたｐＢＲ３２
２ＤＮＡヘアニーリングされ、要求にかなう大腸菌株Ｒ
Ｒ−■へ挿入され、そのＲＲ−１を形質転換させた。結
果得られたコロニーを、テトラサイクリン耐性、アンピ
シリン感受性生長について選択し、ＨＡ　Ｖ　ＲＮ　Ａ
から製造された３２Ｐ−標識ＣＤＮＡへのポジティブ（
ｐｏｓｉｔｉｖｅ）　ハイブリダイゼーションのために
ふるいにかけた。

Ａ型肝炎ウィルス遺伝情報から、ｃ　ＤＮＡ、　クロー
ンが生じたことを確かめるために、クローンを、二ツク
トランスレーションにより〔３２Ｐ−α）ｄＣＴＰで標
識し、ニトロセルロース膜フィルターに結合した非感染
およびＨＡＶ感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞ＲＮＡへ、ハ、。

　イブリダイゼーションした。ｃＤＮＡクローンは、Ｈ
ＡＶ感染細胞ＲＮＡへのみハイブリダイゼーションした
。

実施例５ クローンｃＤＮＡの相対位置の決定および１，１″′°
配列のノ析 ５つのクローン、Ｔ２Ｏ−１８、Ｔ２８−１２３、Ｔ２
Ｏ−９４，７２Ｂ−７１および７２Ｂ−７７の相対位置
を、図面に示されるように決定するために、クローン化
ｃ　ＤＮＡ、。を、制限酵素消化およびクローン相互の
交差ハイブリダイゼーションにより分析した。この分析
から、ウィルスゲノムの９０％にわたって、ゲノムの３
′末端で開始する重複ｃＤ、ＮＡクローンとしてクロー
ン化されたことが推定される。ＨＡＶゲノムの制限酵素
地図は、図面において、ｒＨＡＶＪと記した線がそれに
あたる。ポリオゲノム上の構造たんばく質の位置は、ポ
リオとＨＡＶが関連したウィルスであるがゆえに、ＨＡ
Ｖゲノム上の可能な予期される位置を示唆するために回
前にまた示される。

ＤＮＡの配列化を、２種の方法により行なった。

化学的ＤＮＡ配列化を、クローンＴ２８−１８．７２Ｂ
−１２３，７２Ｂ−７７，７２Ｂ−９４および７２８−
７１において、マキサム（Ｍａｘａｍ　）　’およびギ
ルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ　）の技術によって行なった
。

ＣＤＮＡクローン７２８−７７の断片のりブクローンを
、Ｍ１３ファージにおいて調製し、・サンガー（Ｓａｎ
ｇｅｒ）により述べられたジデオキシヌクレオチド　タ
ーミネーション（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　）法により
配列化した。

すべてにおいて、３０００の隣接する塩基の領域が配列
化された。この領域は、ＨＡＶの２つの構造たんばく質
ＶＰ−１および■Ｐ−３、および他のたんぽ（質ＶＰ−
２およびＶＰ−４をコードする配列を含む。たんばく質
ｖｐ−ｉおよびＶＰ−３ば、主な抗原たんばく質であり
ＶＰ−２およびＶＰ−４は、抗原としての価値が劣ると
思われる。

精製されたＶＰ−３たんばく質（同時係属米国特許出願
番号第５４１．８３６　、前掲、に記載されている。）
から生じた臭化シアン開裂断片の混合物のアミノ酸配列
は、ＤＮＡ配列の翻訳物と比較され、ＶＰ−３をコード
する領域が、より正確に位置ずけられた。

精製されたＶＰ−またんばく質（同時係属米国特許出願
番号第５４１，８３６　、前掲、に記載されている。）
から生じた臭化シアン開裂断片の混合物のアミノ酸配列
は、ＤＮＡ配列の翻訳物と比較され、ＶＰ−またんばく
質をコードする領域が、より正確に位置ずけられた。

図面に示される様に、ＨＡＹゲノムの制限地図は、以下
の４つの制限部位の位置を示す。

■　ＤＮＡ配列の塩基１６４３でのｌ１ｉｎｃＩ［開裂
部位、 ■　塩基１７４４での旧ｎｄｌ１１開裂部位、■　塩基
２０４９でのＢａｏ＋　Ｈｎ開裂部位および ■　塩基２７２２でのＰｖｕ　ｎ開裂部位これらのゲノ
ム地図位置は、ゲノムにおいて５′から３′の方向に示
される。たんばく質のための解読フレームとともに構造
たんぽ（質をコードする領域のヌクレオチド配列を以下
に示す。

吊こ　：：　：　：ｆ５　：：　冨計　＝＝　８二　＝
：占ロ　ω−く−ロＩｊＬ＋＜　＜＜　ロ＜ククＣＤＩ
！　：３　Ｃ１←　＆ｔ　Ｉｄｅ　ＯコＣ５＞　ＣＪ［
−＋ａｌ　Ｃ０ＩＪｌｔｌ　（Ｍｆｆｉｅ　Ｗ＋ｍｃｏ
ｄ＋＋　＋ｆ＜＞　■く−寸Ｃ−ロ←−りυ−−く−■
←弓寸口Ｌ５　膿←←　喰ω＠　ωＣロ　ト←−トロく
　■ωロ　■口〉←ｌ−，１＋ω　←−←ＯＬ＋（社）
　−■　←０　ロ（２）りぶ　←−Ｆ＋Φ　υし　Ｏ−
ヒー　Ｑ　１＋　ＬＩ　Ｌ−く←　く−　じ〉　Ｑ叫　
くシ　と−〇−くくＣコ　＜ｌｔｌ　ｌｌｊ　ｅ　ｔ−
＋−”　！＋Ｉ：　−ｅｅ　ｋ　ＬＩ　ｌｌｊ　＜＞←
ω　Ｏ＋＋　イー　８句　くの　υ＝　く＾　Ｃ−〇−
■ｄ　ＯＬ）　Ｃｊン　くく　べ←　く−　リロ←Ｉ＋
　←仁　■←　ｔｊＬ−ＩＪ：ｊ　Ｃｊ−’　（ｊ−←
のり＞＜の　ＬＩ（ホ）　υ０　←■　←づ　０−　←
−←←　く＜　ヒー　←（１）　Ｌ）−■ン　べ←　く
−−「−＋＋Ｉ＋ｕｕ＋ｕｕ＋Ｌ＆（、）ｌ−１＋＋−
＋Ｉ／Ｊこの全体の配列の範囲内において、ＨＡ　Ｖの
抗原たんばく質を作るために必要な情報がコードされる
。構造たんばく質をコードする配列は、塩５４０３で始
まる。ＶＰ−３たんばく質は、およそ地図位置１１４９
で開始してコードされる。ｖｐ−ｉたんばく質は、およ
そ地図位Ｗ１８８２で開始してコードされ北。ｖｐ−１
中の重要なサブユニット配列、ずなわぢ、［■、■、■
および■と称する配列は、それぞれ１８８２．１９６３
．１９９９．２Ｉ４６．２３４７で開始する。

有効なワクチンは、これらのサブユニットのどれか１つ
またはそれ以上を含み得るものであり、またゲノム配列
の範囲内でコードする他の有効なペプチドサブユニット
のどれか１つまたはそれ以下を含み得るものである。

活性ペプチドまたはペプチド断片をコードする特別なヌ
クレオチドが合成され得、所望の特別なペプチドまたは
サブユニットを生成するために発現システムにクローン
化されることから、ヌクレオチド配列の価値は、当業者
に容易に明らかとなるであろう。これらのヌクレオチド
配列は、全合成、すなわち、既知の技術による塩基の連
結によるか、または、ウィルスＲＮＡまたはｃＤＮＡか
らの直接単離により作成され得る。所望のヌクレオチド
配列の開始点が特別なペプチドと一致しない場合、ヌク
レオチド鎖に対して特別な塩基を酵素的に加えるか、取
り除くかする既知の技術が、ヌクレオチド配列を正確に
作成するために使用し得る。

抗原たんばく質をコードするために価値のある他のヌク
レオチド配列は、塩１１７４９から塩基２７２２までの
配列、塩基１４８７から塩５２９８０までの配列および
塩基１６４４から塩基２７２２までの配列、および上記
配列の範囲に含まれるすべての配列である。塩基１７４
９から塩基２７２２までの配列は、特に抗原たんばく質
を生成するためのヘクターとして価値がある。（以下の
実施例を参照） 発現における研究を開始するために単一挿入においてＶ
Ｐ−３およびｖｐ−ｉをコードする配列領域を含むＤＮ
Ａクローンが最初に構成された。クローン２８−９４の
ＤＮＡがＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌ制限酵素で開裂され
、ウィルス構造たんばく質遺転子の５′部分を含むＤＮ
Ａの５．７６ｋｂ結合物が、アガロースゲル電気泳動お
よび電気的溶離により精製された。同様にクローン２８
−７７のウィルス構造遺伝子の３′部分を含む２．３　
ｋｂＥｃｏＲＩＸｂａｌ結合物が精製された。これら２
つの、断片は、完全非再配列ウィルス構造遺伝子配列を
含む、再形式ｐＢＲ３２２ベクター分子へ、ともに結紮
された。結紮された混合物は大腸菌株ＲＲ−１へ挿入さ
れ、そのＲＲ−１を形質転換させた。それにより、完全
なＶＰ−３からＶＰ−１までの情報を持つ挿入物を含む
プラスミドを、ともなうクローン５７−５が生じた。

抗ＨＡＶ抗体に対する抗原反応性を含み持つＨＡ　Ｖ特
異的たんばく質の発現は、細菌性細胞、イースト、およ
び高等真核細胞において行なわれ得る。たんばく質また
はポリペプチド生成物へのｃＤＮＡクローンの発現を得
るためのいくつかの可能な方法を以下に述べる。

初めの例において、ＨＡＶｃＤＮＡ断片ば、細菌性β−
ガラクトシダーゼのＮ−末端アミノ酸を用いて融解生成
物を作成する細菌性ラクトースプロモーターより下流方
向に挿入され、ＨＡ　Ｖポリペプチドを発現する。Ｉ１
ｇβ■またはＢａｍＨｒまたはＨｉｎｄｌｌｌまたはＰ
ｓｉＩまたはＴａｑｌまたは５ａｕ３ＡまたはＮｃｏｌ
により生した束部を持つ、使用されたＨ　Ａ　ＶｃＤＮ
Ａ断片は、既知の発現プラスミドｐＵＣ７，８、または
９、またはｐＣＱＶ２の適切な部位へ結紮される。夫々
のＨＡＶＤＮＡ断片をともなう、使用された発現プラス
ミドは、ＤＮＡ挿入後の翻訳のための解読フレームを得
るために選択される。組み換え発現プラスミドは、大腸
菌中に挿入され、その大腸菌を形質転換させ、適切なり
ローンが選択され波長５５０での光学濃度０．８へ生長
され、溶解分離される。細胞抽出物は、次いで、ＨＡ　
Ｖ特異抗原ペプチドの検出のために使用される。

別法として、ＨＡＶｃＤＮＡ断片は、プラスミド中の単
純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモータ
ーの下流方向に挿入され、大腸菌においてクローン化さ
れる。結果得られたクローン化組み換えプラスミドは、
培養マウスＬ細胞、培養マウス３Ｔ３細胞、または他の
培養真核細胞へ挿入され、各細胞を形質転換させる。Ｂ
ｇε■またはＢａｍＨｌまたはＨｉｎｄｌｌｌまたはＢ
ｃＬｊ！３Ｉ酵素により生じた持つ使用されたＨＡＶｃ
ＤＮＡ断片ば、ＤＮＡの適切な連結分子を用いて、Ｒｓ
ａ１部位で、チミジンキナーゼＡＴＧ翻訳開始コドンの
後方に結紮され、翻訳に関して、フレームにおける接続
物を作成する。組み換え発現プラスミドによりトランス
フェクションされた真核細胞を、完全ヘルペスチミジン
キナーゼ遺伝子での相互感染および、その後のＩＩＡＶ
選択メジューム中で培養により選択する。選択された細
胞コロニーを培養し、細胞抽出物をＨＡＶ特異抗原ペプ
チドの検出のために調製した。

尖施炭工 発現されたＨ　Ａ　Ｖたんばく質およびポリペプチドの
検出 ＨＡ　Ｖたんばく質またはポリペプチドを発現する細胞
を３５３で標識したメチオニンまたはＩ４Ｃで標識した
ロイシンの存在下で培養し、標識する。細胞抽出物を次
いで調製し、抗ＨＡ　Ｖ抗血清または抗ＨＡＶモノクロ
ナール抗体と反応させる。抗原−抗体複合体を、スタフ
（Ｓｔａｐｈ　）　Ａを固定したホルマリンを用いての
沈澱により集め、５ＤＳ−ＥＤＴＡ中で沸騰させること
により解離し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離する。このたんばく質は、次いでオートラ
ジオグラフィーにより視覚化される。

別法として、発現されたＨＡＶたんばく質またはポリペ
プチドをコンペティション（ｃｏ＋ａｐｅｔｉｔｉｏｎ
　）ラジオイムノアッセイにより検出する。ＩＩ製され
たＨＡＶピリオン粒子はｌ　ｔＳｌを用いてインビトロ
において標識し、抗ＨＡ　Ｖ抗血清または抗ＨＡ　Ｖモ
ノクロナール抗体で沈澱させる。この沈澱反応は、発現
細胞から調製された非標識抽出の増加量の存在下で行な
われる。抗原−抗体複合体をフィルター上に集め、ガン
マ−カウンター中でカウントする。発現細胞における発
現ＨＡＶ生成物の存在は、細胞抽出物の量がアッセイに
おいて増加されるに従ったカウント数の減少により示さ
れる。

去施Ｍ度 発現プラスミドを構成した大腸菌における１１Δ■配ｒ
りのへ （１１約０．５μｇのｐｃＱＶ２　（キャリークウィー
ン（Ｃａｒｙ　Ｑｕｅｅｎ）　）　ＤＮＡを、ＢａｍＨ
ＩおよびＰｖｕｌで開裂させ、フォスフェートで処理し
、Ｂａｎ＋ＨＩおよびＰｖｕＩＩでの開裂によりクロー
ンＴ２８−１２３から誘導された、ゲル精製６７５ｂｐ
鎖長断片の２μｇへ結紮した。結紮混合物をＨＢＩＯＩ
細胞中に挿入し、その細胞を形質転換させた。アンピシ
リン耐性クローンは、精製されたニック翻訳化６７５塩
晶対断片を持つ挿入物の存在により、ふるいにかりられ
た。ｐ）ＩＡＶ−６と称する１つのポジティブクローン
は、ＨＡ　Ｖ特異的たんばく質の生成のためにアッセイ
された。

ｐＣＱＶ２および挿入物の間の接合点配列は、適切な断
片を切り離したＢａｍＨＩおよびｐｖｕ■を用いた開裂
により確認された。

（２）　クローン５７−５（ｃＤＮＡクローン２８−７
７とｃＤＮＡクローン２８−９４を結ぎ合わずことによ
り調製された。）は、完全ＶＰ−１遺伝子およびＶＰ−
３のＣ末端領域の大部分を発現させるために使用された
。

プラスミド５７−５からのＤＮＡを、Ｂｇｌｌ■および
Ｐｖｕｌ［で開裂し、１．１２ｋｂｐ断片がゲル電気泳
動により精製された。約２μｇの断片が０．５　ｐ　ｇ
のＢａｍＨＩ　−ＰｖｕＩＩ開裂ｐＣＱＶ２ＤＮＡへ結
紮され、結紮混合物ば、ＨＢＩＯＩ細胞を形質転換する
ために使用された。アンピシリン耐性クローンは、ニッ
ク翻訳化ＢａｍＨＩ　−Ｐｖｕｌｌ開裂断片へのハイブ
リダイゼーションによりふるいにかけられた。

ポジティブであるクローンの１つはｐＨＡＶ−５７−１
１と称され、ＶＰ−３または／およびＶＰ−１の発現の
ためにアッセイされた。

これらの構成物はどちらも、ｐＣＱＶ２における開始Ａ
ＵＧコドンからの解読を認め、終結コドンに出会う前に
５０のアミノ酸のために、ｐＣＱＶ２配列へ、挿入物の
末端の向う側で連結する。ｐ　ＨＡ　Ｖ　−５の予期さ
れる解読フレームは、従って２７５のアミノ酸残基であ
り、ｐＨＡＶ５７−１１のそれは、４６４のアミノ酸残
基である。プラスミドＨＡＶ５７−１１は、以下の核酸
配列を含む。

１、　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＡＴＴ　ＴＴ
Ｔ　ＣＡＧ　ＧＴＴ　ＴＴＴ。

２、　ＧＴＴ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＴＣＡ　ＧＧ
Ａ　ＧＧＴ　ＴＴＴ　ＴＣＡ＾Ｃ＾　へＣへ。

３、　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＧ
　ＡＡＡ　ＧＣＣＡＡＴＡＣＣＧＧＡ　ＡＡＧ。

４、　ＡＴＧ　ＧＡＴ　ＧＴＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＧＴ
Ｇ　ＣＡＡ　ＧＣＡ　ＣＣＴＧＴＧ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　
ＡＴＣＡＣＡ　ＡＣＡ　ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣ
ＡＧＣＡ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＧＴＡ　
ＣＣＴ　ＧＡＡ　ＡＣＧ　ＴＴＴ。

５、　ＡＴＧ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＣＡＴ　ＴＴ
Ｔ　ＴＴＧ　ＴＧＴ　ＡＣＴＴＴＴ　ＡＣＣＴＴＣＡＡ
Ｔ　ＴＣＡ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＴＡＣ
。

６、ＡＴＧ　ＧＣＣＴＧＧ　Ｔ”ｒＴ　ＡＣＴ　ＣＣＡ
　ＧＴＡ　ＧＧＣＣＴＴＧＣＴ　ＧＴＴ　ＧＡＣＡＣＣ
ＣＣＡ。

プラスミドＨＡＶ−６は上記５および６番によって確認
される核酸配列を含むが、１．２．３および４番によっ
てｉｎ認される核酸配列を含まない。

入　されたたんばく　の 発現プラス、：　ＦｐＨＡＶ−６およびｐ　ＨＡＶ５７
−１１を対数の状態までＬ−ブイヨン中で培養し、４２
℃での熱衝撃により誘導した。

ｐＣＱＶ２発現ベクターは、λライトワード（ｒｉｇｈ
ＬＨａｒｄ　）プロモーター（λＰＲ）でのたんばく質
合成を抑制する温度感受性λ抑制体を持つ。４２℃での
加熱により、この抑制体を不活化させ、λＰ、から下流
方向に位置する遺伝子の発現を可能にした。１ｍｌの細
胞が誘導前および誘導後３０分でペレット化され、ＳＤ
Ｓメルカプトエタノールでの沸騰により溶離され、たん
ばく質は、不連続ゲル電気泳動により分離された。たん
ばく質は、エレクトロブロッティング（ｅｌｅｃｔｒｏ
ｂｌｏｔｔｉｎｇ）ニヨリニトロセルロース（ＢＡ−８
５）’＜−パーかまたは、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ　）フィルター（グレードＨＡＨＹ）へ移された。移
されたたんばく質は、５ＤＳ−熱変性ウィルスをウサギ
に接種することにより増加したＣ−１４９およびＤＢ−
２と称する２つのポリクローナル抗Ａ型肝炎抗血清（抗
ＨＡＶ）を用いてプローブ化された。

抗血清は、ＩＺｓＩで標識されたたんばく質Ａにより順
に検出された。以下の２つの基準がＨＡＶ特異たんばく
質の発現の決定のために使用された。

（１１熱誘導性 （２）　免疫後の血清でプローブ化した場合の、ちとの
ベクターｐＣＱＶ２におりる新バンド（ｂａｎｄ）の不
在状態。

プラスミドＨＡＶ−６はＤＢ−２血清でプローブ化した
場合、〜３０および２０ｋｄで独特なバンドを示し、Ｃ
−１４９免疫後血清でプローブ化した場合、３０ｋｄで
バンドを示した。

ｐＨＡＶ−６がＶＰ−１コード領域の範囲に完全に挿入
物を含むために大腸菌におけるＶＰ−１断片の発現が達
成された。

プラスミドＨＡＶ５７−１１は、ＤＢ−２血清でプロー
ブ化した場合、６つの顕著なバンドを示す。それらは、
大きさの減少順に、〜５０ｋｄ、　３５ｋｄ、　２３ｋ
ｄ、　２０ｋｄ、　１６ｋｄ。

および１４ｋｄである。推定上、小さいペプチドは、〜
５０ｋｄたんばく質の減成生成物を表わす。この状態は
、使用されたプローブがＣ−１４９である場合、絶対的
である。５０ｋｄバンドは、３０ｋｄ周辺の２つの弱い
バンド同様明らかに見ることができた。少ない分子量の
たんばく質バンドは、推定上、減成生成物であった。ｐ
ＨＡＶ５７−１１が、Ｃ−末端から〜３０アミノ酸を取
り除いたＶＰ−１配列の大部分同様Ｃ−末端を表わすＶ
Ｐ−３の１３３のアミノ酸をコードするＤＮＡ挿入物を
含むがゆえに、ＶＰ−１断片とＶＰ−３断片の発現は、
大腸菌において達成された。

マーモセット血清を用いたふるいわけ 天然のウィルスで感染したマーモセットがらの、免疫前
および免疫後の血清を、たんぽく質プロットをふるいに
かけるために使用した。免疫前血清は、ｐＨＡＶ−６お
よびｐＨＡＶ５７−１１どちらにおいても誘導された新
たんばく質についてそのどれに対しても反応しなかった
。これに対して免疫後血清は、誘導ｐＨＡＶ５７−１１
細胞において生成した、〜５０ｋｄの大きさのたんばく
質および他の〜１８ｋｄの大きさのたんばく質と反応し
た。ｐＨＡＶ５７−１１における〜５０ｋｄたんばく質
の検出は、天然ウィルスにおいて見られる同じ抗原決定
基またはエピトープの内生なくともいくつかが、また５
０ｋｄたんばく質における抗体との相互作用にとって有
用であることを示唆する。ＶＰ−１のＮ−末端でのＶＰ
−３配列の〜１３３のアミノ酸残Ｗの存在は、天然のウ
ィルスにおいて、標準的に示される抗原決定基の内の少
なくともいくつかを表わす、ＶＰ−またんばく質の第三
次構造を推定させる。従って、大腸菌中で作られた５０
ｋｄたんばく質および、おそらく〜１８ｋｄたんばく質
ば、正常免疫応答を導びく能力を持ち得る可能性を有す
る免疫原である。

【図面の簡単な説明】

図面ば ポリオゲノム上の構造たんばく質の位置、ＨＡＶの制限
酵素地図および ＨＡＶの各ｃ’　Ｄ　Ｎ　Ａクローンの相対制限酵素地
図を示す。 出願人　メルク　エンド　カムパニー インコーボレーテッド 手続補正書 昭和６０年４月２６日 特許庁長官　志賀　学殿 １、事件の表示昭和６０年　特許願第４０３４４　号す
る能力を持つペプチドをコードするＤＮＡ断片３、補正
をする者 事件との関係　特許出願人 氏名 （名称）　メルク　エンド　カムパニー　インコーボレ
ーテツド４代理人 ５、補正の対象　（１）「明細書」 ｆｉ＋　” 別紙の通り、明細書１通を提出致します。 別紙の通り、正式図面１通を提出致します。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、配列 １４９０　１５００　１５１０　１５２０　１５３０Ｇ
   ＡＧＡＴＣＴＴＧＴ　ＴＴＴＴＧＡＴＴＴＴ　ＣＡＧＧ
   ＴＴＴＴＴＣＣＡＡＣＣ＾＾＾ＴＡ　ＴＣＡＴＴＣＡＧ
   ＧＴ１５４０　１５５０　１５６Ｇ　１５７０　１５Ｂ
   ０ＡにＧＴＴＧＴＴＧＴ　ＴＴＴＧＣＴＴＴＧＴ　ＴＣ
   ＣＴＧＧＧＡＡＴ　ＧＡＧＴＴＧＡＴＡＧ　ＡＴＧＴＴ
   ＡＣＴＧＧ１５９０　１６００　１６１０　１６２０　
   １６３０＾ＡＴＣＡＣＡＴＴ＾＾ＡＡＣＡＧＧＣＡＡ　
   ＣＣＡＣＴＧＣＴＣＣＴＴＧＴＧＣＡＧＴＧ　ＡＴＧＧ
   ＾ＣＡＴＴ＾１Ｇ４０　１６５０　１６６０　１６７０
   　１６８０ＣＡＧＧＡＧＴＧＣＡ　ＧＴＣＡＡＣＣＴＴ
   Ｇ　ＡＧＡＴＴＴＣＧＴＧ　ＴＴＣＣＴＴＧＧＡＴ　Ｔ
   ＴＣＴＧＡＴＡＣＡ１６９０　１７００　１７１０　１
   ７２０　１７３０ＣＣＣＴＡＴＣＧＡＧ　ＴＧＡＡＴＡ
   ＧＧＴＡ　ＣＡＣＧＡＡＧＴＣＡ　ＧＣＡＣＡＴＣ＾＾
   八　＾ＡＧＧＴＧＡＧＴ＾１７９０　１８００　１８１
   ０　１８２０　１８３０ＣＴＴＣＴ＾＾ＴＧＴ　ＴＧＣ
   ＴＴＣＴＣＩＬＴ　ＧｆｆＡＧＡＧＴＴＡ　ＡＴにＴＴ
   丁＾ＴＣＴ　ＴＴＣＡＧＣＡＡＴＴ１Ｂ４０　１８５０
   　１８６０　１８７０　１８８０＾八ＴＴＴＧＧＡＡＴ
   　ＧＴＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＴＴＴＡＴＣＡＴ　ＧＣＴ
   ＡＴＧＧＡＴＧ　ＴＴＡＣＣＡＣＡＣＡ２５９０　２６
   ００　２６１０　２６２０　２６３０ＧＧ八八八ＴＴＡ
   ＣＡ　ＡＣＣＡＣＴＣＴＧＡ　ＴＧＡＡＴＡＴＴＴＧ　
   ＴＣ（１，ＴＴＴＡＧＴＴ　ＧＴＴＡＴＴＴＧＴＣ２６
   ４０２６５０２６ｓｏ　２６７０　２６８０ＴＧＴＣＡ
   ＣＡＣＡＡ　ＣＡＡＴＣＡＧＡＧＴ　ＴＣＴＡＴＴＴＴ
   ＣＣＴＡＧＡＧＣＴＣＣＡ　ＴＴＡＡＡＴＴＣＡΔ２６
   ９０　２７００　２７１０　２７２０　２７３０ＡＴＧ
   ＣＴＡＴＧＴＴ　ＧＴＣＣＡＣＴＧＡＧ　ＴＣＴＡＴＧ
   ＡＴＧＡ　ＧＴＡＧＡＡＴＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣ
   ２７４０２７５０２７６０２７７０２７８０ＴＴＧＧＡ
   ＧＴＣＡＴ　ＣＡＧＴＧＧＡＴＧＡ　ＴＣＣＴＡＧＡＴ
   ＣＡ　ＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡ　ＧＡＡＧＡＴＴＴＧＡ２
   ８４０　２８５０　２８６０　２８７０　２８８０ＧＧ
   ＾八八Ｃ＾Δ八Ｇ　ＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴ　ＧＣＴＣＡ
   ＧＧＡＡＧ　ＡＧＴＴＧＴＣＡＡＡ　ＴＧ八へへＴＧＣ
   ＴＴ２８９０　２９００　２９１０　２９２０　２９３
   ０ＣＣＡＣＣＴＣＣＴＡ　ＧＧ八へへＡＴＧΔ八へＧＧ
   ＧＧＴＴＡＴＴＴ　ＴＣＡＣＡＡＧＣＣ八　ΔＡＡＴＴ
   ＴＣＴＣＴを有し、また同じペプチドをコードする少な
   くとも１つの異なるコドンを含む他のヌクレオチド配列
   を有する、ＨＡ　Ｖ抗原たんばく質またはサブユニット
   たんばく質をコードするヌクレオチド配列。 ２、配列 ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＡＴＴ　ＴＴＴ　Ｃ
   ＡＧ　ＧＴＴ　ＴＴＴ。 ＧＴＴ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　Ｇ
   ＧＴ　ＴＴＴ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ。 八ＴＧ　＾へＧ　’ＧＡＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＧ　へ
   Δへ　ＧＣＧ　八＾Ｔ　ＡＧＧ　ＧＧ八　＾＾Ｇ。 ＡＴＣＧＡＴ　ＧＴＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　Ｃへ
   ＾　ＧＣＡ　ＣＣＴ　Ｇ’ＴＧ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＡＴ
   Ｃ。 へＣへ　八ＣＡ　ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　Ｇ
   ＣＡ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＧＴＡ　ＣＣ
   Ｔ。 ＧＡＡ　ＡＣＧ　ＴＴＴ。 ＡＴＧ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＣＡＴ　ＴＴＴ　Ｔ
   ＴＧ　ＴＧｔＡＣＴ　ＴＴＴ　ＡＣＣＴＴＣＡＡＴ。 ＴＣＡ　ＡＡＴ　へへＴＡへへ　ＧＡＧ　ＴＡＣおよび
   八ＴＧ　ＧＣＣＴＧＧ　ＴＴＴ　ＡＣＴ　ＣＣ：Ａ　Ｇ
   ＴＡ　ＧＧＣＣＴＴ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＧＡＣＡＣＣ。 ＣＣＡ が含まれていることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載のヌクレオチド配列。 ３、配列 を有し、また同しペプチドをコードする少なくとも１つ
   の異なるコドンを含む他のヌクレオチド配列を有する、
   ＨＡＶ抗原たんばく質またはサブユニットたんばく質を
   コードするヌクレオチド配列であり、それに、配列ＧＡ
   Ｔ　ＣＴＴ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＡＴＴ　ＴＴＴ　ＣＡＧ
   　ＧＴＴ　ＴＴＴ。 ＧＴＴ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　Ｇ
   ＧＴ　ＴＴＴ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ。 八ＴＧ　＾へＧ　ＧＡＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＧ　ＡＡ
   Ａ　ＧＣＣＡＡＴ　ＡＧＧ　ＧＧＡ　へへＧ。 ＡＴＧ　ＧＡＴ　ＧＴＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　Ｃ
   へへ　ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＧＴＧ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＡＴ
   Ｃ。 ＾Ｃ＾　＾ＣＡ　ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣ＾　Ｇ
   ＣＡ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　ＡＡＧ　へへＡ　ＧＴＡ　ＣＣ
   Ｔ。 ＧＡＡ　ＡＣＧ　ＴＴＴ。 ＡＴＧ　ＧＧ＾　八ＧＧ　ＴＣＴ　ＣＡＴ　ＴＴＴ　Ｔ
   ＴＧ　ＴＧＴ　ＡＣＴ　ＴＴＴ　ＡＣＣＴＴＣ＾＾Ｔ。 ＴＣＡ　ＡＡＴ　へへＴ　へへ＾　ＧＡＧ　ＴＡＣおよ
   び八ＴＧ　ＧＣＣＴＧＧ　ＴＴＴ　ＡＣＴ　Ｃ（１：Ａ
   　ＧＴＡ　ＧＧＣＣＴＴ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＧＡＣＡＣ
   Ｃ。 ＣＣΔ １、が含まれるヌクレオチド配列の全部または１部を含
   み、適切な宿主中で上記ヌクレオチド配列によりコード
   されるペプチドを発現するのに適合したベクター。 ４、宿主が原核生物または真核生物であるこ２゜　とを
   特徴とする特許請求の範囲第３項記載の５、配列 ２７４０　２７５０　２７６０　２７７０　２７８０Ｔ
   ＴＧＧＡＧＴＣＡＴ　Ｃ；ＡＧＴＧＧＡＴＧＡ　ＴＣＣ
   ＴＡＧＡＴＣＡ　ＧＡＧＧ八八ＧへへＡ　ＧＡＡＧＡＴ
   ＴＴＧ八２７９０　へ　２８００　２８１０　２８２Ｇ
   　２８３０ＧＡＧＴＣＡＴＡＴＡ　ＧＡＡＴＧＴＡＧＧ
   Ａ　ＡＡＣＣＡＴＡＴＡＡ　ＡＧＡＡＴＴＧＡＧＡ　Ｔ
   ＴＧＧＡＧＧＴＴＧ２８４０　２８５０　２８６０　２
   ８７０　２８８０ＧにＡＡＡＣＡ八八Ｇ　へへＴＴＡＡ
   ＡＴＡＴ　ＧＣＴＣ：ＡＧＧＡＡＧ　ＡＧＴＴＧＴＣＡ
   ＡＡ　ＴＧＡＡＧＴＧＣＴＴ２８９０　’　２９００　
   、２９１０　２９２０　２９３０ＣＣＡＣＣＴＣＣＴＡ
   　ＧＧＡＡＡＡＴＧＡＡ　ＧＧＧＧＴＴＡＴＴＴ　ＴＣ
   ＡＣ八＾ＧへＣＡ　ＡＡＡＴＴＴＣＴＣＴを有し、また
   同じペプチドをコードする少なくとも１つの異なるコド
   ンを含む他のヌクレオチド配列を有する、ＨＡＶ抗原た
   んばく質またはサブユニットたんばく質をコードするヌ
   クレオチド配列であり、それに、配列ＧＡＴ　ＣＴｊ　
   ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＡＴＴ　ＴＴＴ　ＣＡＧ　ＧＴＴ　Ｔ
   ＴＴ。 ＧＴＴ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　Ｇ
   ＧＴ　ＴＴＴ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ。 ＾ＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＧ　ＡＡ
   Ａ　Ｇ（１：ＣＡＡＴ　ＡＧＧ　ＧＧＡ　ＡＡＧ。 ＡＴＧ　ＧＡＴ　ＧＴＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　Ｃ
   ＡＡ　ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＧＴＧ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＡＴ
   Ｃ。 ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　Ｃ（：Ａ　
   ＧＣＡ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　ＡＡＧ　へ＾へ　ＧＴＡ　Ｃ
   ＣＴ。 ＧＡＡ　ＡＣＧ　ＴＴＴ。 ＾ＴＧ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＣＡＴ　ＴＴＴ　Ｔ
   ＴＧ　ＴＧＴ　ＡＣＴ　ＴＴＴ　ＡＣＣＴＴＣＡＡＴ。 ＴＣＡ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＴＡＣおよ
   びＡＴＧ　ＧＣＣＴＧＧ　ＴＴＴ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　Ｇ
   ＴＡ　ＧＧ（１：　ＣＴＴ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＧＡＣＡ
   ＣＣ。 ＣＣＡ が含まれるヌクレオチド配列の全部または１部を含み、
   適切な宿主中で上記ヌクレオチド配列によりコードされ
   るペプチドを発現するのに適合したヘクターであり、そ
   の宿主が原核生物または真核生物である上記ヘクターを
   一含有し、上記ヌクレオチド配列によってコードされる
   ペプチドの少なくとも一部を発現するのに適合した適切
   な原核宿主または真核宿主。 ６、核酸配列 ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＡＴＴ　ＴＴＴ　Ｃ
   Ａ゛Ｇ　ＧＴＴ　ＴＴＴ。 ＧＴＴ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　Ｇ
   ＧＴ　ＴＴＴ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ。 ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＧ　ＡＡ
   Ａ　ＧＣＣＡＡＴ　ＡＧＧ　ＧＧＡ　ＡＡＧ。 ＡＴＧ　ＧＡＴ　ＧＴＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　Ｃ
   ＾＾　ＧＣＡ　Ｃ１ｌ：Ｔ　ＧＴＧ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　
   ＡＴＣ。 ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　Ｇ
   ＣＡ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＧＴＡ　ＣＣ
   Ｔ。 Ｇ＾＾ＡＣＧ　ＴＴＴ。 ＡＴＧ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＣＡＴ　ＴＴＴ　Ｔ
   ＴＧ　ＴＧＴ　ＡＣＴ　ＴＴＴ　ＡＣＣＴＴＣＡＡＴ。 ＴＣＡ　八ＡＴ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＴＡＣおよ
   びＡＴＧ　ＧＣＣＴＧＧ　ＴＴＴ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　Ｇ
   ＴＡ　ＧＧＣＣＴＴ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＧＡＣＡＣＣ。 ＣＣＡ が含まれることを特徴とする、プラスミドＨＡＶ５７−
   １１゜ ７、核酸配列 ＡＴＧ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＣＡＴ　ＴＴＴ　Ｔ
   ＴＧ　ＴＧＴ　ＡＣＴ　ＴＴＴ　ＡＣ；ＣＴＴＣ＾＾Ｔ
   。 ＴＣＡ　ＡＡＴ＾＾Ｔ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＴＡＣおよび
   ＡＴＧ　ＧＣＣＴＧＧ　ＴＴＴ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＧＴ
   Ａ　ＧＧＣＣＴＴ　ＧＣ：Ｔ　ＧＴＴ　ＧＡＣＡＣＣ。 ＣＣＡ が含まれることを特徴とする、プラスミドＨＡＶ＝６゜