JP2000236887A - 二重免疫反応を誘導することが可能なキャリヤーを含む融合タンパク質 - Google Patents

二重免疫反応を誘導することが可能なキャリヤーを含む融合タンパク質

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セルジュ・ルネ・マルティノ
Dororesu Yule Tereshita
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Abstract

(57)【要約】 【課題】二重免疫反応を誘導することが可能なキャリヤ
ーを含む融合タンパク質を提供すること。 【解決手段】脊椎動物において二重免疫反応を生じさせ
るための融合タンパク質であって： （a）該脊椎動物内で内因的に合成され、その活性が該
脊椎動物内で阻害されるべきである、ペプチドのすべて
または一部に対し類似の第一のタンパク質性部分であっ
て、それ自体で前記脊椎動物において有効な免疫阻害性
反応を引き出すことが不可能である、前記タンパク質性
部分；と連結している （b）該脊椎動物を病原的に感染させることが可能な病
原体由来の免疫原のすべてまたは一部に対し類似の第二
のタンパク質性部分を含み；該脊椎動物が該融合タンパ
ク質の有効量をワクチン投与されているときには、部分
（b）が該脊椎動物の免疫系に部分（a）を認識させ、そ
して次の反応： （i）該脊椎動物内で内因的に合成される該ペプチドの
活性を阻害し；そして（ii）該病原体による感染から該
脊椎動物を防御する該反応を生じさせる、前記融合タン
パク質。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、動物およびヒトの
健康の分野にあり、そしてワクチン組成物に有用な融合
タンパク質に関する。
【０００２】
【従来技術】脊椎動物の免疫系は、微生物、ウイルス、
毒素並びに他の病原体および刺激物による病原的感染か
ら生物を防御するための、細胞、分泌される因子、およ
び反応の複雑な系を含む。しかし、特定の分子はそれら
の小さいサイズのため、および／またはそれらが脊椎動
物内で内因的に合成され、そしてしたがって脊椎動物の
免疫系により「異物である（foreign）」と認められな
いため、脊椎動物において有効な免疫反応を誘導しない
エピトープを含む。通常、非免疫原性である、ホルモン
などの特定のペプチドに対する抗体を産生するための方
法は、それにより生物内のこうしたペプチドの活性の免
疫制御を達成することが可能であるため、望ましい。
【０００３】ホルモンペプチドは、生物が融合タンパク
質によりワクチン投与されている際、該ホルモンに対す
る有効な免疫反応を引き出すため、融合タンパク質中で
多様なキャリヤーペプチドと組み合わされてきている。
キャリヤー部分は生物の免疫系にホルモンペプチドを認
識させ、そしてそうでなければ生成されないであろう、
該ペプチドに対する抗体を生成させる。
【０００４】Russell-Jonesらによる米国特許第5,403,5
86号は、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHR
H）としても知られる、ゴナドトロピン放出ホルモン（G
nRH）の類似体（analog）と、TraTp類似体とを含む融合
タンパク質であって、該融合タンパク質におけるTraTp
類似体の存在が抗GnRH抗体の産生を誘発するのを補助す
る、前記融合タンパク質に関する。TraTpは、上記の米
国特許第5,403,586号に記載されるように、大腸菌（E.c
oli）の特定の株により産生される外膜リポタンパク質
である。
【０００５】Potterらによる米国特許第5,422,110号
は、選択される抗原に融合しているロイコトキシンポリ
ペプチドを含むキメラタンパク質を含むキャリヤー系に
関する。ロイコトキシンは抗原の免疫原性を増加させる
機能を果たす。該特許に開示される選択される抗原には
GnRH、ソマトスタチン（SRIF）、およびロタウイルスウ
イルスタンパク質4（VP4）が含まれる。
【０００６】WO 90/02187は、肝炎B表面抗原（HBsAg）
などの抗原性、親水性部分、および単独では実質的に抗
原性がないGnRHなどのペプチドを含む融合タンパク質に
関する。
【０００７】GnRHは、主に視床下部で、内因的に産生さ
れるデカペプチドである。該ペプチドは、脊椎動物種間
で非常によく保存されている。哺乳動物において、GnRH
遺伝子はデカペプチドglu-his-trp-ser-tyr-gly-leu-ar
g-pro-glyをコードし、NおよびC末端のそれぞれピログ
ルタミン酸およびグリシンアミドへの続く翻訳後修飾を
伴って、(pyro)-glu-his-trp-ser-tyr-gly-leu-arg-pro
-gly-NH2を産生する。GnRHは、脳下垂体からの卵胞刺激
ホルモン（FSH）および黄体形成ホルモン（LH）の産生
および放出を制御することにより、すべての主要な脊椎
動物において生殖機能の制御に重大な役割を果たすこと
が示されてきている。FSHおよびLHは、ステロイド産生
と共に精子形成および排卵に役割を果たしているため、
GnRHに対する抗体の産生を生じるワクチンは、男性およ
び女性の生殖機能（妊性（fertility））の抑制につな
がり、そしてまた性関連行動などの二次的性的特性も調
節するはずである。男性では、LHはライディッヒ細胞に
おけるステロイド産生を制御する。したがって、男性の
GnRHに対する能動免疫は、精巣萎縮並びにテストステロ
ン産生および精巣機能の減少につながる（Ladd, Aら, 1
994, Biol. Reprod.51:1076-1083；Ladd A, 1993, Am.
J. Reprod. Immunol. 29:189-194）。GnRHワクチンは、
米国食品医薬品局により、前立腺癌の治療のための研究
的新規薬剤として認可されている（Ladd A, 1993、上
記）。GnRH免疫避妊剤の開発は動物の外科的不妊に対す
る有用な代替物であり、そして単純に抗GnRH力価を下降
させることにより、精子形成および妊性を正常に戻すこ
とが可能であるため、可逆的であるというさらなる利点
を有する（Ladd, Aら, 1989, J. Reprod. Immunol. 15:
85-101）。しかし、GnRHは小さな自己ペプチドであり、
そして短い半減期を有する（WO 90/02187、1990年3月8
日）ため、該ペプチドは強力なアジュバントと共に注射
されたときでも弱い免疫原性しか持たない。例えば、動
物の大部分は、フロイント完全アジュバント中のものを
投与された際、GnRHに対する有効な抗体反応を上昇させ
ることができない。したがって、顕著な抗体反応を生成
するため、GnRHは化学的または組換え的にキャリヤータ
ンパク質に結合されていなければならない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかし、前述の参考文
献のいずれも、それ自体に対する免疫阻害性反応（immu
noinhibitory）を誘発するキャリヤーを用いることを解
説または示唆していない。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、脊椎動物にお
いて二重免疫反応を生じさせるための融合タンパク質で
あって：（a）該脊椎動物内で内因的に合成され、その
活性が該脊椎動物内で阻害されるべきである、ペプチド
のすべてまたは一部に対し類似の第一のタンパク質性部
分であって、それ自体で前記脊椎動物において有効な免
疫阻害性反応を引き出すことが不可能である、前記タン
パク質性部分；と連結している（b）該脊椎動物を病原
的に感染させることが可能な病原体由来の免疫原のすべ
てまたは一部に対し類似の第二のタンパク質性部分を含
み；該脊椎動物が該融合タンパク質の有効量をワクチン
投与されているときには、部分（b）が該脊椎動物の免
疫系に部分（a）を認識させ、そして次の反応：（i）該
脊椎動物内で内因的に合成される該ペプチドの活性を阻
害し；そして（ii）該病原体による感染から該脊椎動物
を防御する該反応を生じさせる、前記融合タンパク質を
提供する。
【００１０】本発明はさらに、第二の側面において、脊
椎動物において免疫反応を生じさせるための融合タンパ
ク質であって：（a）その活性が該脊椎動物内で阻害さ
れるべきである、ペプチドのすべてまたは一部に対し類
似の第一のタンパク質性部分であって、それ自体で前記
脊椎動物において有効な免疫阻害性反応を引き出すこと
が不可能である、前記タンパク質性部分；と連結してい
る（b）ウシヘルペスウイルス1型（BHV-1）抗原のすべ
てまたは一部に類似の第二のタンパク質性部分を含み；
該脊椎動物が該融合タンパク質の有効量をワクチン投与
されているときには、第二のタンパク質性部分（b）が
該脊椎動物の免疫系に第一のタンパク質性部分（a）を
認識させ、そして該脊椎動物内の該ペプチドの活性を阻
害することが可能な免疫反応を生じさせる、前記融合タ
ンパク質を提供する。
【００１１】本発明はさらに、組換え融合タンパク質で
ある、先の2つのパラグラフに列挙されるような融合タ
ンパク質を提供する。
【００１２】本発明はさらに、本発明の融合タンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
分子を提供する。
【００１３】本発明はさらに、本発明の融合タンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
分子を含むベクターを提供する。
【００１４】本発明はさらに、本発明の融合タンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
分子を含む形質転換細胞を提供する。
【００１５】本発明はさらに、前述のような融合タンパ
ク質を含む二重機能ワクチンであって、該融合タンパク
質が：（a）脊椎動物内で内因的に合成され、その活性
が該脊椎動物内で阻害されるべきである、ペプチドのす
べてまたは一部に対し類似の第一のタンパク質性部分で
あって、それ自体で前記脊椎動物において有効な免疫阻
害性反応を引き出すことが不可能である、前記タンパク
質性部分；と連結している（b）該脊椎動物を病原的に
感染させることが可能な病原体由来の免疫原のすべてま
たは一部に対し類似の第二のタンパク質性部分を含み；
部分（b）が該脊椎動物の免疫系に部分（a）を認識さ
せ、そして次の反応：（i）該脊椎動物内で内因的に合
成される該ペプチドの活性を阻害し；そして（ii）該病
原体による感染から該脊椎動物を防御する、該反応を生
じさせ、前記融合タンパク質が、部分（a）が由来する
該ペプチドの活性を阻害するのに、そして部分（b）が
由来する該病原体による感染から該脊椎動物を防御する
のに有効な量で、該二重機能ワクチンに存在し、前記二
重機能ワクチンがさらに薬学的または獣医学的使用に許
容されるキャリヤーを含む、前記二重機能ワクチンを提
供する。
【００１６】本発明はさらに、脊椎動物において内因的
に合成されるペプチドの活性を阻害し、そして病原的感
染から該脊椎動物を防御するための方法であって、該ペ
プチドの活性を阻害し、そして病原体による感染に対し
防御するのに有効な量の、先のパラグラフに列挙される
ようなワクチンで該脊椎動物を免疫することを含む、前
記方法を提供する。
【００１７】本発明はさらに、前述のような融合タンパ
ク質を含む、脊椎動物においてペプチドの活性を阻害す
るためのワクチンであって、該融合タンパク質が：
（a）その活性が該脊椎動物内で阻害されるべきであ
る、ペプチドのすべてまたは一部に対し類似の第一のタ
ンパク質性部分であって、それ自体で前記脊椎動物にお
いて有効な免疫阻害性反応を引き出すことが不可能であ
る、前記タンパク質性部分；と連結している（b）BHV-1
抗原のすべてまたは一部に対し類似の第二のタンパク質
性部分を含み；第二のタンパク質性部分（b）が該脊椎
動物の免疫系に第一のタンパク質性部分（a）を認識さ
せ、そして該脊椎動物内の該ペプチドの活性を阻害する
ことが可能な免疫反応を生じさせ、該融合タンパク質が
該脊椎動物において該ペプチドの活性を阻害するのに有
効な量で、該ワクチンに存在し、そして該ワクチンがさ
らに薬学的または獣医学的使用に許容されるキャリヤー
を含む、前記ワクチンを提供する。
【００１８】本発明はさらに、脊椎動物においてペプチ
ドの活性を阻害するための方法であって、該ペプチドを
阻害するのに有効な量の、先のパラグラフに列挙される
ようなワクチンで該脊椎動物を免疫することを含む、前
記方法を提供する。
【００１９】本発明はさらに、脊椎動物において内因的
に合成されるペプチドに対して向けられるポリクローナ
ル抗体を作成する方法であって、こうした脊椎動物に、
抗体を誘導する量の、本発明の融合タンパク質、あるい
はこうした融合タンパク質をコードするヌクレオチド配
列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターまたは形
質転換細胞をワクチン投与し、ここで該融合タンパク質
は該脊椎動物内で内因的に合成されるペプチドのすべて
または一部に対し類似の部分（a）を含み；ワクチン投
与した脊椎動物からポリクローナル抗体を含む血清を得
て；そして内因的に合成されるペプチドに結合するポリ
クローナル抗体を血清から単離し；それにより該ペプチ
ドに対して向けられるポリクローナル抗体を作成するこ
とを含む、前記方法を提供する。
【００２０】本発明はさらに、先のパラグラフに列挙さ
れる方法にしたがい作成される、内因的に合成されるペ
プチドに対して向けられるポリクローナル抗体を提供す
る。
【００２１】本発明はさらに、脊椎動物において内因的
に合成されるペプチドに対して向けられるモノクローナ
ル抗体を作成する方法であって、こうした脊椎動物に、
抗体を誘導する量の、本発明の融合タンパク質、あるい
はこうした融合タンパク質をコードするヌクレオチド配
列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターまたは形
質転換細胞をワクチン投与し、ここで該融合タンパク質
は該脊椎動物内で内因的に合成されるペプチドのすべて
または一部に対し類似の部分（a）を含み；そしてワク
チン投与した脊椎動物から、内因的に合成されるペプチ
ドに特異的に結合するモノクローナル抗体を分泌する脾
臓細胞を単離し；それにより該ペプチドに対して向けら
れるモノクローナル抗体を作成することを含む、前記方
法を提供する。
【００２２】本発明はさらに、先のパラグラフに列挙さ
れる方法にしたがい作成される、内因的に合成されるペ
プチドに対して向けられるモノクローナル抗体を提供す
る。
【発明の実施の形態】
【００２３】融合タンパク質 第一の側面において、本発明は、脊椎動物において、該
脊椎動物により内因的に合成されるペプチドの活性を阻
害し、そしてまた該脊椎動物における病原的感染も両方
とも阻害する、二重免疫反応を誘導する融合タンパク質
を提供する。内因的に合成されるペプチドの阻害は、内
因的に合成されるペプチドのすべてまたは一部に対し類
似の第一のタンパク質性部分を、該脊椎動物を病原的に
感染させることが可能な病原体由来の免疫原のすべてま
たは一部に対し類似のタンパク質性部分である、キャリ
ヤーに連結することにより得られる。キャリヤーとして
機能する（すなわち、内因的に合成されるペプチドまた
はその一部の類似体に対し免疫反応を高める）のに加
え、病原体由来の免疫原または免疫原部分に対し類似の
部分はまた、脊椎動物においてそれ自体に対する反応も
誘導し、そしてしたがって、該病原体による感染から該
脊椎動物を防御する。
【００２４】米国における飼育場（feedlot）ウシ（cat
tle）および全世界の放牧場飼育ウシにおける2つの主な
経済的損失の原因は、BHV-1感染により引き起こされる
ウシ呼吸疾患（BRD）並びに性的および攻撃的行動であ
るため、BRDを治療しそしてまた二次的性的特性、たと
えば攻撃性も同時に阻害するであろう製品は、ウシの産
生損失のこれらの感染性および内分泌性原因を除去しま
たは減少させることにより、屠殺体（carcass）品質お
よび生産性を改善するであろう。したがって、本発明の
1つの態様として、ウシにおいてGnRH活性を制御する一
方、同時にBRDに対する防御を提供するため、BHV-1由来
の免疫原である糖タンパク質D（gD）をキャリヤーとし
て選択し、融合タンパク質においてGnRHペプチドと組み
合わせた。
【００２５】本明細書に記載されるBHV-1糖タンパク質
類似体など、病原体由来の免疫原または病原体由来の免
疫原の一部に対する類似体である、特定のタンパク質性
部分は、以前には、キャリヤーとして開示され、または
示唆されてきていない。したがって、本発明の第二の側
面は、脊椎動物において免疫反応を産生するための融合
タンパク質であって、BHV-1抗原のすべてまたは一部に
対し類似のタンパク質性部分をキャリヤーとして含む、
前記融合タンパク質を提供する。この第二の側面におい
て、脊椎動物はBHV-1に病原的に感染することが可能な
脊椎動物である必要はなく；BHV-1抗原類似体は、単
に、タンパク質性部分（a）の活性を阻害する免疫反応
を誘導するキャリヤーとして作用する。
【００２６】したがって、もし本発明の融合タンパク質
が、例えばGnRHペプチドのすべてまたは一部に対し類似
の部分（a）、およびBHV-1抗原のすべてまたは一部に対
し類似の部分（b）を含むならば、こうした融合タンパ
ク質は、ウシにおいて二重免疫反応を産生するであろう
が、また、他の種はBHV-1に病原的に感染しないため、
他の脊椎動物種においてBHV-1感染に対し防御すること
なくGnRH活性を阻害するのにも有用であるであろう。
【００２７】本発明の目的のため、「融合タンパク質」
は、共に連結されている複数のタンパク質性部分を含む
分子を意味する。したがって、本発明の融合タンパク質
は化学結合体（化学連結されている部分（a）および
（b））および組換え融合タンパク質を含む。本発明に
したがった融合タンパク質は、タンパク質性部分（a）
およびタンパク質性部分（b）を含み、これは、分子が
少なくとも1つの部分（a）および少なくとも1つの部分
（b）を含んでもよいが、1つ以上の部分（a）および／
または1つ以上の部分（b）を含んでもよいことを意味す
る。部分（a）および（b）は直線状に連結されてもよ
い。（a）および／または（b）の多数の部分が存在する
場合、該部分は直線的に連結されていてもよいし、また
は分枝方式で連結されていてもよく、例えば部分（a）
または（b）の1つが分子の中心に位置し、そして該中心
部分に多数の他の部分（a）または（b）が連結していて
もよい。少なくとも1つの部分（a）および1つの部分
（b）が融合タンパク質に存在する限り、一般の当業者
により確定することが可能である、連結の他のパターン
が本発明に含まれる。
【００２８】部分（a）および部分（b）は、部分（a）
に対する、望ましいならば部分（b）にも対する有効な
免疫反応を最適にするように、互いに対して配置されて
もよい。こうした配置は、通常の当業者に知られる方法
により確定してもよい。例えば、本明細書に記載される
ような融合タンパク質を、（a）および／または（b）に
対する抗体を用いたウェスタンブロットにより試験し、
部分（a）および／または（b）が、それらに特異的な抗
体の結合を最適にするように配置されているか決定して
もよい。
【００２９】本融合タンパク質の部分は、化学連結およ
び組換え連結を含む手段により連結してもよい。「化学
連結」は、1つのタンパク質性部分から化学中間体を生
成し、そして該中間体を別のタンパク質性部分と反応さ
せることを伴う。例えば「化学連結」は、該部分が共有
結合を形成するのに適切な反応条件下で反応することが
可能な有機基を有しているならば、1つのタンパク質性
部分、例えば部分（a）の有機基、およびもう一方のタ
ンパク質性部分、例えば部分（b）の有機基の間に直接
共有結合を形成することを伴ってもよい。別の例とし
て、タンパク質性部分の1つ、例えば部分（a）を誘導体
化し、（b）部分と反応するであろう置換基を含む中間
体を形成してもよい。「組換え連結」は、1つのタンパ
ク質性部分をコードする核酸を、別のタンパク質性部分
をコードする核酸に連結し、そして適切な発現系でそこ
からタンパク質を発現させることを伴う。化学連結およ
び組換え連結は当業に知られ、そして本明細書にさらに
詳細に記載される。
【００３０】本明細書において「キャリヤー」という用
語は（「薬学的に許容されるキャリヤー」、「薬学的ま
たは獣医学的使用に許容されるキャリヤー」という句、
および匹敵する句におけるとき、または別に示されると
きを除く）、第二の分子に連結している際、該分子に対
する免疫反応を引き出すまたは高める分子を意味する。
【００３１】本明細書において融合タンパク質の部分を
説明するために用いられる「〜に対し類似」という用語
は、別に示されない限り、「〜と同一のまたは実質的に
同一の構造を有すること」、例えば同一のまたは実質的
に同一のアミノ酸配列を有することを意味する。例え
ば、脊椎動物により内因的に合成されるペプチドに対し
類似のタンパク質性部分は、内因的に合成されるペプチ
ドと同一のまたは実質的に同一のアミノ酸配列を有す
る。「実質的に同一のアミノ酸配列」は、そうでなけれ
ば内因的に合成されるペプチドのアミノ酸配列を有する
が、そのうち1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が除去
され、付加されまたは異なるアミノ酸残基で置換されて
おり、生じるポリアミノ酸分子が本発明の実施に有用で
ある、ポリアミノ酸配列を意味する。ポリアミノ酸分子
は、それが融合タンパク質産物にある際、特定の免疫反
応を生じることが可能ならば、本発明を実施するのに有
用である。アミノ酸置換は、好ましくは当業に周知の保
存的置換であるであろう。こうした置換を作成するため
の規則には、とりわけ、Dayhof, M.D., 1978, Nat. Bio
med. Res. Found., ワシントンD.C., Vol. 5, Sup. 3に
記載されるものが含まれる。
【００３２】本発明の融合タンパク質の部分（a）また
は部分（b）がペプチドまたは病原体「に由来する」と
本明細書で言及されるとき、これは該部分が、それぞれ
ペプチドのすべてまたは一部あるいは病原体由来の免疫
原（または抗原）のすべてまたは一部に対し類似である
ことを意味する。
【００３３】本発明の目的のためのペプチド、抗原、ま
たは免疫原「の一部」は、別に示されない限り、生じる
ポリアミノ酸分子が本発明の実施に有用である、いずれ
の部分でもよい。これは、該部分が、（b）が由来する
病原体および／または（a）が由来するペプチドに対す
る免疫反応を引き出すのに十分でなければならないこと
を意味する。こうした部分を確定するのは、通常の当業
の範囲内である。好ましい態様において、ペプチド、抗
原または免疫原の一部は、特定のペプチド、抗原または
免疫原のアミノ酸配列の少なくとも60％、より好ましく
は70％、そしてさらにより好ましくは少なくとも90％を
含む。ペプチド、抗原、または免疫原の実際のパーセン
テージは、（b）および／または（a）に対する免疫反応
を引き出すであろうアミノ酸残基の部分がその部分に含
まれていることより、重要でない。
【００３４】本明細書において「免疫原」および「抗
原」という用語は、特定の脊椎動物または脊椎動物種に
おいて、有効な免疫反応を誘発することが可能な分子を
意味する。本発明に有用な免疫原は、タンパク質性分
子、すなわちアミノ酸配列で構成される分子であるが、
非タンパク質基、例えば炭水化物部分などもまた含んで
もよい。
【００３５】本発明の目的のための「免疫反応」という
用語は、特定の1つのエピトープまたは特定の複数のエ
ピトープに対して特異的または間接的に向けられる、あ
るいは該エピトープの分解または阻害を補助する、抗体
および／または細胞（Tリンパ球など）の産生を意味す
る。「有効な免疫反応」は、部分（a）に関しては、ワ
クチン投与されている脊椎動物において内因的に合成さ
れるペプチドの活性を阻害するように、1つまたはそれ
以上のエピトープに対して向けられる；そして部分
（b）に関しては、ワクチン投与されている脊椎動物に
おいて、病原体に対して防御するように、該病原体の1
つまたはそれ以上のエピトープに対して向けられる、免
疫反応である。本明細書において「免疫反応を誘発する
こと」および匹敵する句は、ワクチン投与に反応し、脊
椎動物において免疫反応を誘導するおよび／または高め
ることを意味する。「感染の阻害」および「感染からの
防御」などの句は、感染の完全な防御だけでなく、ワク
チン投与されていない動物に比べ、ワクチン投与されて
いる動物における、こうした病原体による感染の度合い
または率（rate）のいかなる検出可能な減少、あるいは
病原体による感染から生じる疾患の重症度またはいかな
る症状または状態の、いかなる検出可能な減少も指す。
感染を阻害する反応は、以前該病原体に感染したことが
ない、および／またはワクチン投与時、該病原体に感染
していない動物で誘導してもよい。こうした句は、ワク
チン投与時、すでに該病原体に感染している動物におけ
る感染の率または度合いを阻害することも含むよう意図
される。
【００３６】本明細書において「二重免疫反応」という
用語は、1つ以上のペプチド、そして好ましくは2つの異
なるペプチド、例えば内因的に合成されるホルモンペプ
チドおよびウイルスペプチドの活性を阻害する、上記に
定義されるような有効な免疫反応を意味する。
【００３７】本明細書において「二重機能ワクチン」
は、脊椎動物内で、1つ以上のペプチド、そして好まし
くは2つの異なるペプチド、例えば該脊椎動物により内
因的に合成されるホルモンおよび該脊椎動物を病原的に
感染させるウイルスのウイルスペプチドに対して向けら
れる、それをワクチン投与された脊椎動物において免疫
反応を産生することが可能なワクチンを意味する。
【００３８】「内因的に合成されるペプチド」という句
は、本明細書において、そして別に示されない限り、脊
椎動物により、該脊椎動物の代謝機能の一部として合成
されるペプチドを意味する。内因的に合成されるペプチ
ドの例には、限定されるわけではないが、ホルモンおよ
び酵素が含まれる。
【００３９】本明細書において「ペプチド活性の阻害」
および匹敵する句は、正常な機能を果たすペプチドの能
力、例えば生化学反応を触媒する（ペプチドが酵素であ
る場合）、生物物理反応を誘発する（ペプチドがホルモ
ンである場合）、またはウイルス感染性または複製に関
与する（ペプチドがウイルスペプチドである場合）能力
に干渉することを意味する。「部分（a）が由来するペ
プチドの活性を阻害するのに有効な量」、「GnRH活性を
阻害するのに有効な量」、およびそれらに匹敵する句
は、機能を果たすペプチドの能力に干渉する、例えばGn
RHがLHまたはFSHの放出を刺激するのを妨げる、またはG
nRHが刺激する能力を減少させる、あるいはウイルスの
表面タンパク質に干渉し、細胞を感染させることを不可
能にし、それによりウイルスによる複製および感染を阻
害するのに、十分な免疫反応を誘導することが可能な融
合タンパク質の量を指す。有効量は、ワクチンの単回投
薬として、またはワクチンの複数回投薬として投与して
もよい。
【００４０】本明細書において「（b）が由来する病原
体による感染を阻害するのに有効な量」、「BHV-1感染
を阻害するのに有効な量」、「感染に対し防御するのに
有効な量」、およびそれらに匹敵する句は、上記に定義
されるように感染から脊椎動物を防御するのが可能な融
合タンパク質またはワクチンの量を指す。有効量は、ワ
クチンの単回投薬として、またはワクチンの複数回投薬
として投与してもよい。
【００４１】本明細書において「脊椎動物」は、背骨ま
たは脊柱を有するいかなる種も、すなわち魚類、両生
類、爬虫類、鳥類、および哺乳類を指す。本発明のワク
チンから利益を得ることが可能な脊椎動物の例には、限
定されるわけではないが、とりわけ、ヒト、ニワトリ、
ブタ、イヌ、ネコ、ウシ（乳牛（cow））、ヤギ、ヒツ
ジおよびウマが含まれる。好ましくは、脊椎動物は哺乳
動物である。
【００４２】本明細書において「病原的に感染させるこ
と」という用語は、病原体が脊椎動物を、該脊椎動物に
おける検出可能な疾患異常を生じる方式でまたは度合い
まで感染させる能力を指す。例えば、BHV-1はウシを病
原的に感染させるが、ヒトは病原的に感染させない。
【００４３】本発明の融合タンパク質の部分（a）を調
製するための供給源として用いてもよいペプチドには、
限定されるわけではないが、以下のものが含まれる：
1）コレシストキニン（cholecystokinen）（Eng, J.ら,
1990, Regul. Pept. 30(1):15-9）；コレシストキニン
のすべてまたは一部に対し類似の部分（a）を含む本発
明の融合タンパク質は、脊椎動物において食欲を促進す
るのに用いてもよい；2）血管作動性腸管ペプチド（Nil
sson, A., 1975, FEBS Lett. 60(2):322-6）、該ペプチ
ドの阻害はニワトリにおいてプロラクチン分泌の減少を
起こし、続いて抱卵（brooding）行動を妨げ、それによ
り卵産生の増加を生じる；3）成長ホルモンおよび成長
ホルモン断片（Seeburg, P.H.ら, 1983, DNA 2(1):37-4
5）；成長ホルモンの活性を高める融合タンパク質は、
動物において成長を促進することが可能である；4）成
長ホルモン放出ホルモンおよびその断片（Gubler, U.
ら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80(14), 43
11-4314）；抗体もまた、成長ホルモン放出ホルモンの
成長促進活性を高める可能性がある；5）ガストリン（D
imaline, R.ら, 1986, FEBS Lett. 205(2):318-22；Ki
m, S.J.ら, 1991, DNA Seq. 1(3):181-7；Kariya, Y.
ら, 1986, Gene 40(1-3):345-52）およびガストリン放
出ペプチド（Spindel, E.R.ら, 1986, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 83(1):19-23）；ガストリンおよび／また
はガストリン放出ペプチド活性を阻害する融合タンパク
質は、とりわけ、胃の分泌を阻害し、そしてしたがって
潰瘍を治療するのに；胃、小腸および／または結腸癌を
治療するのに；そして食欲を促進するのに有用である；
6）IgEペプチド（Batista, F.D.ら, 1995, Nucleic Aci
ds Res.23(23):4805-11）；IgEを阻害する融合タンパク
質は、アレルギー、特にアレルギー性皮膚反応の軽減お
よび／または予防に有用である；7）アンギオテンシン
ペプチドI、II、III、およびIVを含むアンギオテンシン
ペプチド（Boydらによる米国特許第5,612,360号；Vaugh
anによる米国特許第5,599,663号；RodgersおよびDizere
gaによる米国特許第5,629,292号；BrunnerおよびNussbe
rgerによる米国特許第5,635,359号）；アンギオテンシ
ンペプチドの活性を阻害する融合タンパク質は、哺乳動
物において例えば高血圧を治療するのに有用である；
8）ミオスタチン（myostatin）（Kambadur, R.ら, 199
7, Genome Res. 7(9):910-6）；ミオスタチン活性の阻
害は動物において、肉品質を傷つけることなく骨格筋成
長を高め、そしてしたがって動物において肉産生を増加
させるのに望ましい可能性がある；9）インヒビンまた
はその断片（Kousoulasらによる米国特許第5,786,179
号；MasonおよびSeeburgによる米国特許第5,665,568
号）；インヒビンの活性を阻害する融合タンパク質は、
メス動物における卵胞刺激ホルモンの異常な産生による
不妊を治療するのに用いることが可能である；10）ソマ
トスタチン（米国特許第5,422,110号、上記；Shen, L.
P.ら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(15):4575
-9；Su, C.J.ら, 1988, Mol. Endocrinol. 2(3):209-1
6）；ソマトスタチンを阻害する融合タンパク質は、例
えば成長を刺激するのに有用である；および11）腫瘍壊
死因子（Aggarwalらによる米国特許第5,795,967号）お
よびインターロイキン−1（Masaaki, Y.ら, JP 1994073
095-A1（1994年3月15日））などのサイトカインペプチ
ド；動物におけるサイトカイン活性の阻害は、免疫に助
長される炎症、例えばアレルギーに関連する炎症を軽減
することが可能である。先のペプチド、そのアミノ酸配
列および生理学的作用は、当業に周知である。これらの
ペプチドを記載する前述の刊行物は、本明細書に完全に
援用される。
【００４４】部分（b）に有用であるタンパク質性部分
が誘導されることができる免疫原の例には、限定される
わけではないが、以下の免疫原が含まれる：1）OmpW（1
998年10月22日に提出された米国仮特許出願第60/105,28
5号；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（American Type Culture Collection）（またはATCCと
して知られる）（米国バージニア州マナセズ）に、ATCC
寄託番号98928下に寄託された、株Pz418の宿主細胞に存
在するプラスミドpER418によりコードされる；配列番号
44（OmpWの推定されるアミノ酸配列））；OmpA1（米国
仮特許出願第60/105,285号；ATCCに、ATCC寄託番号9892
9下に寄託された、株Pz419の宿主細胞に存在するプラス
ミドpER419によりコードされる；配列番号45（OmpA1の
推定されるアミノ酸配列））；OmpA2（米国仮特許出願
第60/105,285号；ATCCに、名称ATCC寄託番号98930下に
寄託された、宿主細胞Pz420に存在するプラスミドpER42
0によりコードされる；配列番号46（OmpA2の推定される
アミノ酸配列））；OmlA血清型1および血清型5（Gerlac
hらによる米国特許第5,441,736号）；すべてアクチノバ
チルス・プリューロニューモニア（Actinobacillus ple
uropneumonia）由来；OmpW、OmlA5またはOmpAのすべて
または一部に対し類似のタンパク質性部分を、本発明に
したがい融合タンパク質におけるキャリヤーとして用い
る一方、同時にブタ胸膜肺炎（A.プリューロニューモニ
ア感染により引き起こされる）に対する防御をブタに提
供することができる；2）肝炎B表面抗原（Hsiungら, 19
84,J. Mol. Appl. Gen. 2:497）；肝炎B表面抗原のすべ
てまたは一部に対し類似のタンパク質性部分を、本発明
の融合タンパク質におけるキャリヤーとして用いる一
方、同時に肝炎B感染に対しヒトにおける防御を提供す
ることができる；3）アクチノバチルス・プリューロニ
ューモニア由来のRTX（「毒素におけるリピート」）毒
素（Frey, J.ら, 1991, Infect. Immun. 59(9), 3026-3
2）；本発明の融合タンパク質におけるキャリヤーとし
ての、RTX毒素のすべてまたは一部に対し類似のタンパ
ク質性部分は、同時にブタおよびウシにおいてアクチノ
バチルス・プリューロニューモニアに対する免疫防御を
提供することも可能である；4）大腸菌（E.coli）熱不
安定性エンテロトキシンのβサブユニット（Leong, J.
ら, 1985, Infect. Immun. 48(1):73-7；Inoue, T.ら,1
993, FEMS Microbiol. Lett 108(2):157-61）；大腸菌
熱不安定性エンテロトキシンのβサブユニットのすべて
または一部に対し類似の部分は、キャリヤーとして働
き、またブタおよびウシにおいて大腸菌に対する免疫防
御を提供することも可能である；5）大腸菌抗原K88線毛
（pilus）またはK99線毛（Bakker, D.ら, 1992, J. Bac
teriol. 174(20):6350-8；Simons, B.L.ら, 1990, FEMS
Microbiol. Lett 55(102):107-12）；本発明の融合タ
ンパク質におけるキャリヤーとしての、K88線毛抗原ま
たはK99線毛抗原のすべてまたは一部に対し類似のタン
パク質性部分は、ブタおよびウシにおいて腸の大腸菌疾
患に対し防御を提供することも可能である；6）気管支
敗血症菌（B. bronchiseptica）のp68抗原（WO 9115571
-A5（1991年10月17日））；p68抗原のすべてまたは一部
に対し類似のタンパク質性部分を、本発明の融合タンパ
ク質におけるキャリヤーとして用いてもよく、そしてイ
ヌにおいてボルデテラ（bordetella）感染（「イヌの咽
頭炎（kennel cough）」疾患）に対する防御を提供する
ことも可能である；7）ウシウイルス性下痢（BVD）ウイ
ルス由来の糖タンパク質53（Fritzemeier, J.ら, 1997,
Arch. Virol. 14２(7):1335-50）；糖タンパク質53の
すべてまたは一部に対し類似の部分は、融合タンパク質
におけるキャリヤーとして働き、そしてまたウシにおい
て致死の粘膜疾患からの防御を提供することが可能であ
る；8）パルボウイルスのウイルスタンパク質1および2
（Xie,A.およびChapman, M.S., 1996, J. Mol. Biol. 2
64:497）；パルボウイルス由来のウイルスタンパク質1
または2のすべてまたは一部に対し類似のタンパク質性
部分は、本発明の融合タンパク質におけるキャリヤーと
して用い、そして同時にブタ、イヌおよびネコをパルボ
ウイルス感染から防御することが可能である；9）コロ
ナウイルス・スパイクタンパク質（Kokubu, T.ら, 199
8, Journal of the Japan Veterinary Medical Associa
tion 51:252-55；Lewis, E.L., 1996, Bristol Univers
ity Thesis（Bristol University（英国ブリストル、ク
リフトン））；Britton, P.ら, 1991, Virus Res. 21
(3):181-98）；コロナウイルス・スパイクタンパク質の
すべてまたは一部に対し類似の部分は、融合タンパク質
におけるキャリヤーとして働き、そしてまたウシ、ブ
タ、イヌおよびネコにおいてコロナウイルス感染に対し
防御を提供することが可能である；10）細菌鉄制御外膜
タンパク質（Gerlach, G.F.ら, 1992, Infect. Immuno
l. 60(8):3253-61；Thompson,S.A.ら, 1993, Mol. Micr
obiol. 9(1):85-96）；こうした膜タンパク質のすべて
または一部に対し類似の部分を、ブタ、ウシおよび家禽
においてアクチノバチルス・プリューロニューモニアお
よび／または髄膜炎に対する免疫防御をも提供する、キ
ャリヤーとして用いてもよい；11）狂犬病Gタンパク質
（Shinichi, S.ら, JP 1989171489-A1（1989年7月6
日））；狂犬病Gタンパク質のすべてまたは一部に対し
類似のタンパク質性部分は、融合タンパク質におけるキ
ャリヤーとして用いてもよく、そしてまた同時にネコ、
イヌおよび野生生物において狂犬病に対し防御を提供す
るであろう；12）ストレプトコッカス・ウベリス（Stre
ptococcus uberis）・プラスミノーゲン活性化タンパク
質（Leigh, J.A., 1993, WO 9314209）；ストレプトコ
ッカス・ウベリス・プラスミノーゲン活性化タンパク質
のすべてまたは一部に対し類似のタンパク質性部分は、
キャリヤーとして有用であり、そしてまた乳牛において
乳腺炎に対し治療および／または防御も提供するであろ
う；13）インフルエンザウイルス赤血球凝集素タンパク
質（Hovanec, D.L.およびAir, G.M., 1984, Virology 1
39(2):384-92）およびインフルエンザウイルス・ヌクレ
オキャプシドタンパク質（Lindstrom, S.E.ら, 1998,
J. Virol. 72(10):8021-31）；これらのタンパク質のど
ちらかのすべてまたは一部に対し類似の部分は、本発明
の融合タンパク質におけるキャリヤーとして用いてもよ
く、そして同時にヒト、ブタ、および家禽においてイン
フルエンザに対し免疫防御を提供するであろう；14）破
傷風トキソイド（Fairweather, N.F.ら, 1986, J. Bact
eriol. 165(1):21-7；Niemann, H., 1986, EMBO J. 5(1
0):2495-502）；破傷風トキソイドのすべてまたは一部
に対し類似のタンパク質性部分は、ヒト、ウマ、および
ウシにおいて破傷風に対し防御をも提供するであろう、
融合タンパク質におけるキャリヤーとして用いることが
できる；15）百日咳トキソイド（Nicosia, A.ら, 1986,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83(13):4631-5）；百日
咳トキソイドのすべてまたは一部に対し類似のタンパク
質性部分は、融合タンパク質におけるキャリヤーとして
働くことが可能であり、そしてヒトにおいて百日咳に対
し免疫防御を提供するであろう；16）ヘルペスウイルス
糖タンパク質（Gompels, U.A.ら, 1992, DNA Seq. 3
(1):25-39；Misra, V.ら, 1988, Virology 166:542-9；
Whitbeck, J.C.,ら, 1988, J. Virol. 62:3319-27；Fit
zpatrick, D.R.ら, 1989, Virology 173:46-57）；ヘル
ペスウイルス糖タンパク質のすべてまたは一部に対し類
似のタンパク質性部分は、本発明の融合タンパク質にお
けるキャリヤーとして働くことが可能であり、そしてま
た該融合タンパク質中でヒトおよびウシにおいてヘルペ
スからの免疫防御を提供するよう機能することが可能で
ある；17）腸管出血性大腸菌インティミンタンパク質
（Jerse, A.E.ら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87(20):7839-43）；腸管出血性大腸菌インティミンタン
パク質のすべてまたは一部に対し類似の部分は、キャリ
ヤーとして機能し、そしてまたヒトおよびウシを含む種
において出血性疾患に対し防御を提供することも可能で
ある；18）VP2（Cao, Y.C.ら, 1995, Ping Tu Hsueh Pa
o 11(3):234-41）；VP２のすべてまたは一部に対し類似
の部分は、キャリヤーとして機能することが可能であ
り、そしてまた家禽における感染性包（bursa）疾患に
対し免疫防御を提供することも可能である；19）RS（re
spiratory syncytial）ウイルスのFおよびGタンパク質
（Schrijver, R.S.ら, 1997, Archives of Virology 14
2(11):2195-2210；Furze, J.M.ら, 1997, Virology 231
(1):48-58）；Fタンパク質またはGタンパク質のすべて
または一部に対し類似のタンパク質性部分は、キャリヤ
ーとして作用することが可能であり、そしてまたウシに
おいてウシRSウイルスに対し免疫防御を提供するであろ
う。先の免疫原およびそのアミノ酸配列は当業に知られ
る。先の免疫原を記載する前述の刊行物は、本明細書に
完全に援用される。
【００４５】異なるタンパク質性部分（a）および（b）
は、各々先のパラグラフの1つに記載されるペプチドま
たは免疫原、あるいは別の既知のペプチドまたは免疫原
のすべてまたは一部に対し類似の部分であり、本発明に
したがい組み合わせて、特定の脊椎動物、例えば、ウシ
（乳牛）、ブタ、ニワトリ、またはヒト、あるいは特定
の種類の脊椎動物、例えば、哺乳動物または霊長類のた
めに特異的に設計された融合タンパク質を形成し、該脊
椎動物において特定のペプチドの活性を阻害する一方、
同時に該脊椎動物を特定の病原体による感染から防御す
ることが可能である。
【００４６】例として、GnRHはウシにより合成される生
殖系ホルモンである。GnRH活性をウシで阻害することに
より、攻撃的行動など性的特性の発現における有益な減
少が提供されるであろう。BHV-1はウシを病原的に感染
させるため、BHV-1由来の免疫原をGnRHと共にキャリヤ
ーとして用いてもよい。したがって、1つの態様におい
て、GnRHペプチドのすべてまたは一部に対し類似の部分
（a）およびBHV-1由来の免疫原のすべてまたは一部に対
し類似の部分（b）を連結し、GnRH活性を阻害し、そし
てそれと共にBHV-1感染に対し防御する、ウシにおける
二重免疫反応を誘導する融合タンパク質を提供する。
【００４７】別の限定されない例において、本発明は、
部分（a）が成長ホルモンのすべてまたは一部に対し類
似であり、そして部分（b）がBHV-1抗原のすべてまたは
一部に対し類似である、融合タンパク質を提供する。こ
うした融合タンパク質は、ウシにおいて成長を制御する
一方、BHV-1に対する防御的免疫反応を提供するのに有
用である。
【００４８】別の例において、部分（a）はIgEペプチド
のすべてまたは一部に対し類似であり、そして部分
（b）は気管支敗血症菌のp68抗原のすべてまたは一部に
対し類似である。生じる融合タンパク質は、イヌにおい
てアレルギー、特にアレルギー性皮膚反応を治療するま
たは予防する一方、ボルデテラに対する防御的免疫反応
を提供するのに有用である。
【００４９】さらに別の例において、部分（a）はコレ
シストキニンのすべてまたは一部に対し類似であり、そ
して部分（b）はアクチノバチルス・プリューロニュー
モニア由来のOmpW、OmlA血清型1、OmlA血清型5、Omp A
1、またはOmpA2のすべてまたは一部に対し類似である。
こうした融合タンパク質は、ブタにおいて食欲を促進す
る一方、同時にブタ胸膜肺炎に対する防御的免疫反応を
提供するのに有用である。
【００５０】本発明の融合タンパク質のためのタンパク
質性部分（a）および（b）は、当業に知られる方法にし
たがい、得てもよい。例えば、部分（a）または部分
（b）のいずれかまたは両方を、天然供給源からの精製
により得てもよい。あるいは、部分（a）または部分
（b）のいずれかまたは両方を、アミノ酸を合成的に共
に連結することにより得てもよい。あるいは、部分
（a）または部分（b）のいずれかまたは両方を、周知の
組換え技術を用い、部分（a）または部分（b）をコード
するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子か
ら、組換え的に合成してもよい。好ましくは、全融合タ
ンパク質が組換え的に合成されるように、部分（a）を
コードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分
子を、部分（b）をコードするヌクレオチド配列を含む
ポリヌクレオチド分子に連結する。
【００５１】通常の当業の範囲内の組換え技術を利用
し、本融合タンパク質の部分（a）および（b）をコード
するポリヌクレオチド分子を調製してもよい。こうした
技術は、特に、、Maniatis,ら, 1989, Molecular Cloni
ng, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora
tory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバ
ー；Ausubel,ら, 1989, Current Protocols in Molecul
ar Biology, Greene Publishing Associates & Wiley I
ntersciense, ニューヨーク；Sambrook,ら, 1989, Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold
Spring HarborLaboratory Press, ニューヨーク州コー
ルドスプリングハーバー；Innisら,（編集）, 1995, PC
R Strategies, Academic Press, Inc., サンディエゴ；
およびErlich（編集）, 1992, PCR Technology, Oxford
University Press, ニューヨークに記載されており、
これらはすべて本明細書に援用される。
【００５２】多くのホルモンペプチドのアミノ酸配列は
当業に周知である。いくつかの既知のホルモンペプチド
は上述である。別の例として、GnRHのアミノ酸配列が当
業に知られている（例えば、Ladd, A., 1993、上記を参
照されたい）。GnRHのアミノ酸配列はまた、本明細書に
も提供される（配列番号13）。また別に、ホルモンのア
ミノ酸配列が知られていない場合、標準的技術を用い、
例えば精製タンパク質分画に対し反復エドマン分解サイ
クルを行い、続いてHPLC（高圧液体クロマトグラフィ
ー）を用いたアミノ酸解析を行うことにより、決定して
もよい（例えば、米国特許第5,422,110号、上記を参照
されたい）。同様に、病原体由来の免疫原と同一または
実質的に同一のタンパク質性部分を、標準的技術にした
がい、既知のアミノ酸配列から、または上述のようにア
ミノ酸配列を確定することにより、得てもよい。病原体
由来の免疫原と実質的に同一のタンパク質性部分は、例
えば、既知の技術を用い、該タンパク質性部分のアミノ
酸内容を、免疫原の既知のアミノ酸内容と比較すること
により、または該タンパク質性部分を免疫原アミノ酸配
列と比較する配列並列を行うことにより、決定してもよ
い。
【００５３】タンパク質性部分（b）が由来することが
できるBHV-1抗原の例には、限定されるわけではない
が、BHV-1 gB、BHV-1 gC、BHV-1 gD（それぞれ当業に、
BHV-1gI、gIIIおよびgIVとしても知られる）が含まれ
る。こうした抗原のすべてまたは一部に対し類似のタン
パク質性部分を得るための方法は上述である。例えば、
Babiukらよる米国特許第5,151,267号は、BHV-1 gI、gII
I、およびgIVのヌクレオチド配列および推定されるアミ
ノ酸配列を開示する。Babiukらによる米国特許第5,585,
264号も参照されたい。さらに、Battらに対する米国特
許第5,545,523号は、BHV-1 gIおよびgIV遺伝子配列の増
幅に有用なBHV-1特異的オリゴヌクレオチドを開示す
る。さらに、ウイルス感染細胞培養からBHV-1糖タンパ
ク質を精製する方法が記載されてきている（Babiuk, L.
A.ら, 1987, Virology 159:57-66）。Tikooら, 1990、
上記に公表されるような全長BHV-1 gDのアミノ酸配列
が、本明細書に提供される（図5および配列番号19を参
照されたい）。全長成熟BHV-1 gDの発現は、バキュロウ
イルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスおよび大
腸菌系で行われてきている（Van Drunen Littel-van de
n Hurk, S.ら, 1993, Vaccine11:25-35）。前述の特許
および刊行物の開示および解説は、本明細書に援用され
る。全体としてまたは部分的に、本発明の融合タンパク
質に有用なBHV-1 gD抗原の別の例は、クローンFlgD/Pot
s207nco（#79）にコードされるBHV-1 gDポリアミノ酸で
ある（図3および配列番号17を参照されたい）。
【００５４】部分（a）が由来するペプチドを阻害する
免疫反応、および本発明の第一の側面におけるような、
乳牛をBHV-1感染から防御する免疫反応を刺激すること
が可能ないかなる部分のBHV-1抗原を、本発明の融合タ
ンパク質に用いてもよいが、本発明に用いてもよいBHV-
1 gDの好ましい部分の例は、切頭（truncated）gD（tg
D）、成熟gD（mgD）、および切頭成熟gD（tmgD）であ
る。切頭gD（tgD）は、膜貫通ドメインが、所望により
下流および／または上流ヌクレオチドと共に、完全にま
たは部分的に除去されているgDタンパク質を指す。gDの
膜貫通ドメインは、概して高い疎水性アミノ酸のgDの特
定のポリアミノ酸領域として、当業に知られる。gD/Pot
s、クローンFlgD/Pots207nco（#79）にコードされるBHV
-1 gDの膜貫通ドメインを図3に示す。gD/Potsの膜貫通
ドメインは、アミノ酸364（バリン）で開始し、そして
アミノ酸389（チロシン）で終わる。成熟gDは、アミノ
末端にシグナル配列を持たないgDタンパク質を指す。全
長gD/Potsのシグナル配列を図3に示す。別の態様におい
て、本発明の融合タンパク質のタンパク質性部分（b）
は、該タンパク質のアミノ末端に結合している異種性シ
グナル配列を含んでもよい。あるいは、部分（b）はシ
グナル配列を含まなくてもよい。本発明の1つの態様に
おいて、部分（b）は、切頭され、そしてそれと共に成
熟でもあるBHV-1 gD（tmgD）に対し類似である。切頭成
熟gD抗原の例は、配列番号35に提供される。成熟でない
切頭gD抗原の例は、配列番号29に提供される。
【００５５】本明細書において「tgD」は、上述のよう
に切頭されているBHV-1 gDタンパク質を指し、「mgD」
は、上述のように成熟であるBHV-1 gDタンパク質を指
し、そして「tmgD」は、切頭され、そしてそれと共に成
熟でもあるBHV-1 gDタンパク質を指す。
【００５６】「GnRHペプチド」という用語は、別に示さ
れない限り、配列番号13のアミノ酸配列を有する分子を
意味する。1つの態様において、本融合タンパク質は、G
nRHペプチドに対し類似の多数の部分（a）を含む。好ま
しい態様において、本発明の融合タンパク質は、4つの
連続的に連結しているGnRHペプチドに対し類似の1つま
たはそれ以上の部分、すなわちGnRH四量体に対し類似の
1つまたはそれ以上の部分を含む。好ましい態様におい
て、本発明の融合タンパク質は4GnRH部分を含む。本明
細書において「4GnRH」は、同一のアミノ末端／カルボ
キシ末端方向で連続的に連結している4つのGnRHペプチ
ドを有するGnRH四量体を指す。好ましくは、本発明の融
合タンパク質は、1つまたはそれ以上のGnRH四量体を含
み、各四量体は配列番号15に示されるアミノ酸配列を有
する。
【００５７】本明細書に提供され、そして「4GnRH」、
「tmgD」、「tgD」、および「mgD」という用語（上記に
定義されるようなもの）を含むハイフン付きの表現は、
示される順に左から右へ連結している、用語に対応する
ポリアミノ酸部分を含む融合タンパク質を示し、左端は
融合タンパク質のアミノ末端に対応し、そして右端は融
合タンパク質のカルボキシ末端に対応する。ポリアミノ
酸部分は、互いに直接連結していてもよく、または間接
的に連結していても、すなわち該部分が1つまたはそれ
以上（例えば1から10、好ましくは1から3）のアミノ酸
により分離されていてもよい。したがって「tmgD-4GnR
H」は、直接または間接的に、4GnRH部分と連結している
切頭成熟gD部分を有し、切頭成熟gD部分のカルボキシ末
端が（直接または間接的に）4GnRHのアミノ末端に連結
している融合タンパク質を指す。別の例として、「tgD-
4GnRH」は、4GnRH部分のアミノ末端を、成熟でない切頭
gD抗原のカルボキシ末端に連結させている融合タンパク
質を指す。別の例として、「4GnRH-tmgD-4GnRH」は、tm
gD部分のアミノ末端に連結しているカルボキシ末端を有
する4GnRH部分であって、そのtmgD部分が今度はそのカ
ルボキシ末端により、第二の4GnRH部分のアミノ末端に
連結されている、前記4GnRH部分を指す。本発明の融合
タンパク質には、限定されるわけではないが、本パラグ
ラフに記載される融合タンパク質の例が含まれる。本発
明の融合タンパク質の別の例は、tmgD-4GnRHである。前
述の例のいかなるものにおいても、部分は直接または間
接的に連結させてもよい。
【００５８】上に論じられるように、タンパク質性部分
（a）および（b）は、化学リンカーおよび当業に周知の
技術により、化学的に連結してもよい。例として、部分
（a）または（b）上、例えばgD類似体（b）部分上の特
定のアミノ酸を、試薬、例えばヨードアセトアミドなど
で化学的に活性化してもよい。残りの部分（a）または
（b）、例えばGnRH単量体および／または多量体を添加
してもよい。本例において、GnRHの末端に取り込まれて
いるシステイン残基は、gD類似体上の活性化されたリジ
ン残基と反応する。本反応は、いくつかのリジン残基で
連結している多数のGnRH類似体を有する中心のgD類似体
部分を含む、本発明にしたがった融合タンパク質を生じ
る。別の例において、エチル−ジメチルアミノプロピル
カルボジイミド（EDAC）およびN−ヒドロキシスクシン
イミド（NHS）の存在下で、BHV-1抗原に対し類似の部分
（b）をGnRH単量体または多量体に対し類似の部分（a）
と共に組み合わせてもよい（Bernatowics, M.およびMat
sueda, G., 1986, Analytical Biochemistry 155:95-10
2を参照されたい）。本反応もまた、化学的に連結して
いるGnRH単量体または多量体に対し類似の多数の部分
（a）を含むBHV-1抗原のすべてまたは一部に対し類似の
中心部分（b）を生じる。本発明の化学的に合成された
融合タンパク質はまた、所望により、既知の技術を用
い、アミノ酸以外の置換基、例えば炭水化物置換基を含
むよう、化学的に修飾されてもよい。タンパク質性中心
への多数の結合またはタンパク質性部分の直線連結で、
タンパク質性部分を結合させる他の化学技術を用い、既
知の技術を用い、本発明の融合タンパク質を化学的に合
成してもよい。本発明の化学的に合成される融合タンパ
ク質を調製する技術は、特に、本明細書に援用されるDu
nnおよびPennington, 1994,Methods in Molecular Biol
ogy, Vol. 26, Chap. 10（Humana Press Inc.）に記載
される。
【００５９】本発明はまた、上述のような組換え融合タ
ンパク質も提供する。本発明にしたがった組換え融合タ
ンパク質の例には、プラスミドpCMV-gD:GnRH、プラスミ
ドpQE-gD:GnRHにコードされる組換え融合タンパク質、
プラスミドpQE-GnRH:gD:GnRHにコードされる組換え融合
タンパク質、およびプラスミドpQE-GnRH:gDにコードさ
れる組換え融合タンパク質が含まれる。これらのプラス
ミドを含む細胞がアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ATCC、米国バージニア州マナセズ）に寄託
されており；これらはそれぞれ寄託番号203370、9895
3、98955、および98954を割り当てられている。本発明
の組換え融合タンパク質の別の例は、バキュロウイルス
構築物Bac-gD:GnRHにより発現される組換え融合タンパ
ク質である。Bac-gD:GnRHもまた、ATCCに寄託されてお
り、そしてATCC寄託番号VR-2633を割り当てられてい
る。前述のpQEプラスミドおよびバキュロウイルス構築
物は、特に融合タンパク質のin vitro発現に有用であ
る。プラスミドpCMV-gD:GnRHは、特にin vivo発現に有
用である。
【００６０】本発明にしたがった組換え融合タンパク質
は、所望によりin vitro転写および翻訳に続いて反応培
地から融合タンパク質を精製するのを補助する部分を含
んでもよい。組換えタンパク質の培地からの精製を補助
することが可能なポリアミノ酸配列の例は、6XHISタグ
である。「6XHISタグ」という句は本出願において「6XH
ISリーダー」と交換可能に用いられる。ベクターpQE-31
にコードされる6XHISタグの配列は、配列番号37に提供
される。6XHISタグを含むタンパク質は、培地をニッケ
ルカラム、例えばQiagen（カリフォルニア州チャツワー
ス）のNi-NTAカラムを通過させることにより、培地から
精製することが可能である。in vitro発現に続いて本発
明の組換え融合タンパク質を精製するのを補助すること
が可能な部分の別の例は、親水性マーカーペプチドであ
るFLAGTMエピトープタグ（International Biotechnolog
ies Inc.、コネチカット州ニューヘブン）である。FLAG
TMエピトープタグをコードする遺伝子を、標準的技術に
より、例えば融合タンパク質のアミノまたはカルボキシ
末端に対応する点で、本発明の融合タンパク質をコード
するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に挿
入してもよい。そこから発現される融合タンパク質をそ
の後検出し、そして商業的に入手可能な抗FLAG TM抗体を
用いアフィニティー精製してもよい。
【００６１】in vitroで発現された組換えタンパク質を
精製する他の手段は、当業に周知であり、そして本発明
の組換え融合タンパク質を精製するのに用いてもよい。
こうした方法は、特に、Marshak, D.R.,ら, 1996, Stra
tegies for Protein Purification and Characterizati
on: a Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリン
グハーバーに記載されている。
【００６２】ひとたび本発明の融合タンパク質が得られ
れば、望ましいならば、SDS-PAGE、サイズ排除クロマト
グラフィー、アミノ酸配列解析などを含む、標準的方法
により、該タンパク質を性質決定してもよい。融合タン
パク質は、疎水性および親水性領域を同定するため、親
水性解析（例えばHoppおよびWoods, 1981, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 78:3824を参照されたい）、または類
似のソフトウェアアルゴリズムを用い、さらに性質決定
してもよい。構造解析を行い、特定の二次構造を呈する
融合タンパク質の領域を同定してもよい。X線結晶学（E
ngstrom, 1974,Biochem. Exp. Biol. 11:7-13）、コン
ピューターモデリング（FletterickおよびZoller（編
集）, 1986, Current Communications in Molecular Bi
ology, Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク
州コールドスプリングハーバー）、および核磁気共鳴
（NMR）などの生物物理学的方法を用い、ポリペプチド
および他の推定上の相互作用するタンパク質／受容体／
分子、例えば抗体の間の潜在的な相互作用部位をマップ
し、そして研究してもよい。
【００６３】融合タンパク質をコードするポリヌクレオ
チド分子およびベクター 本発明はさらに、本発明の融合タンパク質をコードする
ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供す
る。こうしたポリヌクレオチド分子の例には、限定され
るわけではないが、4GnRH-tmgD融合タンパク質をコード
する、配列番号34に示されるヌクレオチド配列を含むポ
リヌクレオチド分子；4GnRH-tmgD-4GnRH融合タンパク質
をコードする、配列番号40に示されるヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド分子；およびtmgD-4GnRH融合タ
ンパク質をコードする、配列番号41に示されるヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチド分子が含まれる。
【００６４】本発明はまた、本発明の融合タンパク質を
コードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分
子を含むクローニングおよび発現ベクターも提供する。
本明細書において「ベクター」は、（ポリヌクレオチド
配列の形で）遺伝的情報を含む単位であって、該情報
が、適切な条件および供給源（例えば、アミノ酸、ヌク
レオチド、および転写因子）が存在するとき、ポリアミ
ノ酸を発現するおよび／または該単位の複製をプログラ
ムすることが可能である、前記単位を意味する。こうし
た単位の例には、ウイルス、プラスミド、およびコスミ
ドが含まれる。
【００６５】本明細書において「ヌクレオチド配列」、
「コード配列」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレ
オチド配列」、およびそれらに匹敵する用語は、一本鎖
であっても二本鎖であってもよく、そして1つまたはそ
れ以上の原核配列、真核配列、cDNA配列、エクソンおよ
びイントロンを含むゲノムDNA配列、並びに化学的に合
成されたDNAおよびRNA配列を含んでもよい、DNAおよびR
NA配列を両方指す。
【００６６】本融合タンパク質の部分（a）および（b）
をコードするヌクレオチド配列を含む本発明のポリヌク
レオチド分子の産生および操作は、通常の当業の範囲内
であり、そして特に、Maniatisら、上記；Ausubelら、
上記；Sambrookら、上記；Innisら、上記；およびErlic
hら、上記に記載される組換え技術に従い行うことも可
能である。多くのホルモンペプチドおよびウイルス抗原
ペプチドをコードするヌクレオチド配列が当業に知ら
れ、そしてこうした情報を用い、タンパク質性部分
（a）および（b）のコード領域を調製してもよい。こう
した配列は、特に、、本発明に有用な免疫原およびペプ
チドを記載する、上に引用された参考文献に提供されて
いる。あるいは、ペプチドおよびウイルス抗原のヌクレ
オチド配列は、分子生物学の既知の方法を用い、推定す
ることも可能である。
【００６７】部分（a）および／または部分（b）をコー
ドするヌクレオチド配列を、合成的に調製してもよい。
望ましい配列を、重複するオリゴヌクレオチドから調製
してもよい。例えば、Edge, 1981, Nature 292:756；Na
mbairら, 1984 Science 223:1299；Jayら, 1984, J. Bi
ol. Chem. 259:6311；および米国特許第5,422,110号、
上記を参照されたい。
【００６８】別の例として、ペプチドまたは抗原のアミ
ノ酸配列を用い、ゲノムライブラリーにおいてペプチド
または抗原をコードする遺伝子を同定するためのプロー
ブを設計してもよい。本方法において、ペプチドまたは
抗原のアミノ酸配列の一部をコードするオリゴヌクレオ
チドプローブを調製する。オリゴヌクレオチドプローブ
を用い、ペプチドまたは抗原をコードする遺伝子に関
し、適切なDNAライブラリーをスクリーニングする。一
般的に、スクリーニングされるDNAライブラリーは、適
切な供給源由来の、例えば、該ペプチドを発現する細胞
または組織由来の、あるいは該抗原をコードするウイル
ス由来の、ゲノムDNAまたはゲノムRNA（cDNA）から調製
されるライブラリーである。本方式で遺伝子を単離する
ための技術は、当業に周知である。
【００６９】免疫原またはペプチドをコードする、本明
細書に記載されるように得られる配列に相同なヌクレオ
チド配列もまた、本発明に利用してもよい。本発明の目
的のため、第二のヌクレオチド配列が、第一のヌクレオ
チド配列と同一のタンパク質、ペプチド、または他のポ
リアミノ酸をコードするとき、あるいは本発明を実施す
るのに有用であるように、第一のヌクレオチド配列にコ
ードされるポリアミノ酸に十分に類似であるポリアミノ
酸をコードするとき、第二のヌクレオチド配列は第一の
ヌクレオチド配列に「相同」である。遺伝暗号は縮重し
ているため、相同ヌクレオチド配列は、いかなる数の
「サイレント」塩基変化、すなわちそれにも関わらず同
一のポリアミノ酸をコードするヌクレオチド置換を含ん
でもよい。相同ヌクレオチド配列はさらに、該ポリアミ
ノ酸配列が、本発明を実施するのに有用であり続ける限
り、非サイレント突然変異、すなわちコードされるポリ
アミノ酸のアミノ酸相違を生じる塩基置換、欠失、また
は付加を含んでもよい。第一のヌクレオチド配列に相同
な第二のヌクレオチド配列は、好ましくは、中程度に厳
密な（stringent）条件下、すなわち0.5 M NaHPO4、7％
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1 mM EDTA中、65℃で
のフィルター結合DNAに対するハイブリダイゼーショ
ン、および0.2 x SSC／0.1％ SDS中、42℃での洗浄で、
第一のヌクレオチド配列の相補体（complement）にハイ
ブリダイズするものである（Ausubelら、上記を参照さ
れたい）。より好ましくは、相同なヌクレオチド配列
は、非常に厳密な条件下、すなわち0.5 M NaHPO4、7％
SDS、1 mM EDTA中、65℃でのフィルター結合DNAに対す
るハイブリダイゼーション、および0.1 x SSC／0.1％ S
DS中、68℃での洗浄で、互いにハイブリダイズする（Au
subelら、上記）。
【００７０】部分（a）および（b）をコードするヌクレ
オチド配列を含むポリヌクレオチド分子を得た後、これ
らのポリヌクレオチド分子を、適切な酵素および既知の
技術を用い、共に連結し、本発明の融合タンパク質をコ
ードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子
を形成してもよい。
【００７１】本発明の融合タンパク質をコードする配列
を含むポリヌクレオチド分子を構築するのに有用なコー
ド配列、およびこうしたポリヌクレオチド分子を含むベ
クターの例には、限定されるわけではないが、配列番号
17に示される、クローンFlgD/Pots207nco（#79）に発現
されるBHV-1 gD抗原FlgD/Potsをコードする、配列番号1
6に示される配列；配列番号19に示される、M59846 BHV-
1 gDをコードする、配列番号18に示される配列；配列番
号29に示される、成熟でない切頭gD抗原をコードする、
配列番号28に示される配列；および配列番号35に示され
る、切頭成熟gDをコードする、配列番号36に示される配
列が含まれる。GnRH単量体をコードするヌクレオチド配
列の例は、配列番号33に示される。GnRH四量体をコード
する配列の例、すなわち配列番号15に示されるアミノ酸
配列を有するGnRH四量体は、配列番号32に示される。
【００７２】1つの態様において、本発明のベクター
は、融合タンパク質のin vitro発現に適しており、例え
ば細菌細胞などの宿主細胞をトランスフェクションし、
そして該細菌細胞において該融合タンパク質を発現する
ことが可能なプラスミドである。プラスミドベクターの
例には、細菌をトランスフェクションし、そして本発明
の融合タンパク質を発現することが可能な、組換えpQE
プラスミドなどの、プラスミドが含まれる。本発明の融
合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリ
ヌクレオチド分子を挿入してもよい、原核発現ベクター
プラスミドのいくつかの例には、pQE-50およびpQE-31
（Qiagen、カリフォルニア州チャツワース）、pUC8、pU
C9、pBR322およびpBR239（Biorad Laboratories、カリ
フォルニア州リッチモンド）、pPLおよびpKK223（Pharm
acia、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が含まれ
る。当業に知られる他のプラスミドもまた、本発明の融
合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリ
ヌクレオチド分子を含むベクターを調製するのに用いて
もよく、そしてこうしたプラスミドは、通常の当業者に
より確定することが可能である。本発明の融合タンパク
質をin vitroで発現することが可能な、好ましいプラス
ミドには、pQE-gD:GnRH（ATCC寄託番号98953）、pQE-Gn
RH:gD:GnRH（ATCC寄託番号98955）、およびpQE-GnRH:gD
（ATCC寄託番号98954）が含まれる。これらのプラスミ
ドは、大腸菌細菌において、本発明の融合タンパク質を
発現することが可能である。
【００７３】別の態様において、本発明のベクターは、
融合タンパク質のin vivo発現に適したプラスミドであ
る。真核細胞をトランスフェクションすることが可能で
あり、そして本発明のベクターを構築するのに用いても
よいプラスミドは、通常の当業者により確定することが
可能である。こうしたプラスミドは、ワクチン投与され
た脊椎動物における融合タンパク質のin vivo発現およ
びプロセシングを補助する配列を含み、そして要素をコ
ードする。例えば、本発明のプラスミドは、真核プロモ
ーター配列を含んでもよい。別の例として、本発明のプ
ラスミドは、発現される融合タンパク質に結合している
シグナルをコードする配列を含んでもよく、前記シグナ
ルは発現された融合タンパク質の細胞膜への輸送、およ
び細胞からワクチン投与された脊椎動物の循環系への融
合タンパク質の排出を生じる。融合タンパク質をin viv
oで発現することが可能な、本発明のベクターを構築す
るのに用いてもよいプラスミドの例は、pCMV（Clontec
h, Inc.、カリフォルニア州パロアルト）である。本発
明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含
むポリヌクレオチド分子を含むよう工作してもよい、他
の典型的な真核発現プラスミドには、誘導可能哺乳動物
発現系およびサイトメガロウイルス・プロモーター−エ
ンハンサーに基づく系（Promega、ＷＥ、マディソン；S
tratagene、カリフォルニア州ラホヤ；Invitrogen）が
含まれる。本発明の融合タンパク質をinvivoで発現する
ベクターを調製するのに有用な他のプラスミドは、通常
の当業者により確定することが可能である。融合タンパ
ク質のin vivo発現が可能な、本発明のプラスミドの好
ましい例は、ATCCに寄託されているpCMV-gD:GnRH（ATCC
寄託番号203370）である。
【００７４】本発明のベクターはまた、本発明の融合タ
ンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌク
レオチド分子を含む、組換えウイルスを含む。こうした
ウイルスは、当業に知られる技術にしたがい、調製して
もよい。これらは、例えばバクテリオファージから調製
してもよく、生じた組換えバクテリオファージは、細菌
において、本融合タンパク質をin vitroで発現しそして
産生するのに有用である。本発明のベクターを調製する
のに用いてもよいバクテリオファージの例には、T4、T
7、φX174、G4、M13、およびfdが含まれる。本発明に有
用な他のバクテリオファージは、通常の当業者により確
定することが可能である。
【００７５】昆虫細胞または酵母細胞をトランスフェク
ションすることが可能な組換えウイルスもまた、それぞ
れ昆虫細胞および酵母細胞において、本発明の融合タン
パク質のin vitro発現および産生のため、構築すること
が可能である。この点について、本発明の融合タンパク
質のin vitro産生に用いてもよいベクターの別の例は、
バキュロウイルスに基づく組換えウイルスである。好ま
しい態様において、本発明は、tmgD-4GnRH、4GnRH-tmgD
-4GnRH、または4GnRH-tmgDを発現するバキュロウイルス
ベクターを提供する。本発明の好ましい態様において、
ベクターは、tmgD-4GnRH融合タンパク質を発現する、バ
キュロウイルスベクターBac-gD:GnRHである。Bac-gD:Gn
RHはATCCに寄託されている（ATCC寄託番号VR-2633）。
【００７６】真核細胞、例えば鳥類または哺乳動物細胞
を感染させそして本融合タンパク質を発現させることが
可能な組換えウイルスは、真核細胞における融合タンパ
ク質のin vitroおよびin vivo発現のためのウイルスを
両方含み、また、当業に周知の技術にしたがい構築する
ことが可能である。こうした組換えウイルスを調製する
ことが可能なウイルスの例には、ワクシニアウイルスな
どのポックスウイルス、およびアデノウイルスが含まれ
る。組換えワクシニアウイルスおよび組換えアデノウイ
ルスはどちらも、in vitroまたはin vivo発現いずれに
も用いることが可能である。真核細胞における発現に適
した他のウイルスは、通常の当業者により確定すること
が可能である。
【００７７】別の態様において、本発明のベクターは、
本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド分子を含む、「トランスファー
ベクター」である。トランスファーベクターは、ペプチ
ドをコードする配列を含むプラスミドであり、前記プラ
スミドは、ウイルスと共にin vitro共感染過程におい
て、適切な昆虫または哺乳動物細胞などの、適切な宿主
細胞を感染させることが可能であり、宿主細胞に組換え
ウイルスを産生させ、前記組換えウイルスはそれ自体、
適切な発現系においてプラスミドにコードされるペプチ
ドを発現することが可能なベクターである。組換えウイ
ルスのin vitro産生のためのトランスファーベクターの
調製は当業に周知であり、そして本発明にしたがったト
ランスファーベクターを調製するのに有用なプラスミド
は、通常の当業者により確定することが可能である。ト
ランスファーベクターを調製するのに適したプラスミド
の例には、限定されるわけではないが、pBacPAK8および
pBacPAK9（Clontech, Inc.）が含まれる。本発明の融合
タンパク質をコードするウイルスベクターを調製するた
めの、好ましいトランスファーベクターは、トランスフ
ァーベクターpBacHISgD:GnRHである。
【００７８】本発明の融合タンパク質をコードするヌク
レオチド配列を、シグナル配列、誘導可能および非誘導
可能プロモーター、細菌発現のためのリボソーム結合部
位、およびオペレーターなどの、多様なヌクレオチド要
素にライゲートして、それらの制御下におくこともでき
る。こうした要素は、in vivoまたはin vitroで、該ポ
リヌクレオチド分子を含むベクターでトランスフェクシ
ョンされた宿主細胞において、該ヌクレオチド配列が転
写され、そしてそれにしたがい宿主細胞においてクロー
ンされそして発現されるのを可能にする。制御配列およ
びエンハンサー配列もまた、本発明のポリヌクレオチド
分子に含まれてもよい。コード配列は、ポリヌクレオチ
ド分子に含まれる要素と「機能可能な関連」に置かれ、
これはこの配置および方向が、コード配列の転写が起こ
ることが可能であるようなものであることを意味する。
こうした配置は、通常の当業の範囲内である。
【００７９】本発明のポリヌクレオチド分子の制御要素
は、その強度および特異性において異なる可能性があ
る。利用されるべき宿主／ベクター系に依存し、いくつ
かの適切な転写および翻訳要素のいずれを用いてもよ
い。例えば、哺乳動物細胞系におけるクローニングの
際、マウスメタロチオネインプロモーターなど哺乳動物
細胞のゲノムから単離されたプロモーター、または、こ
れらの細胞で増殖するウイルスから単離されたプロモー
ター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーターまたはモロ
ニーネズミ肉腫ウイルス（Moloney murine sarcoma vir
us）末端反復配列（long terminal repeat）を用いても
よい。組換えDNAまたは合成技術により得られたプロモ
ーターもまた、挿入配列の転写を提供するのに用いても
よい。さらに、特定のプロモーターからの発現を、特定
の誘導剤、例えばメタロチオネインプロモーターでは、
亜鉛およびカドミウムイオンなどの存在下で上昇させて
もよい。転写制御領域またはプロモーターの限定されな
い例には、細菌では、β−galプロモーター、T7プロモ
ーター、T5プロモーター、TACプロモーター、λ左およ
び右プロモーター、trpおよびlacプロモーター、trp-la
c融合プロモーターなど；酵母では、解糖酵素プロモー
ター、例えばADH-Iおよび-IIプロモーター、GPKプロモ
ーター、PGIプロモーター、TRPプロモーターなど；そし
て哺乳動物細胞では、とりわけ、SV40初期および後期プ
ロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーターが含
まれる。
【００８０】特定の開始シグナルを、挿入コード配列の
翻訳に用いてもよい。これらのシグナルは、典型的に
は、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。本発明のポ
リヌクレオチド分子がそれ自体の開始コドンを含み、隣
接配列が適切な発現ベクターに挿入される場合、さらな
る翻訳調節シグナルは必要とされない可能性がある。し
かし、コード配列の部分のみが挿入される場合、ATG開
始コドンを含む外因性翻訳調節シグナルが必要とされる
可能性がある。これらの外因性翻訳調節シグナルおよび
開始コドンは、天然および合成両方の、多様な供給源か
ら得てもよい。さらに、開始コドンは、全挿入物のイン
フレーム翻訳を確実にするため、コード領域の読み枠と
一致していなければならない。
【００８１】本発明のベクターはまた、mRNAの転写を制
御するリプレッサー遺伝子およびオペレーターも含んで
もよい。本ベクターに含まれてもよいオペレーターの例
には、lacオペレーター配列が含まれる。他のオペレー
ターが当業に知られ、そして本発明のベクターに含まれ
てもよい。
【００８２】発現ベクターはまた、特定のプロテアーゼ
での処理により、発現された融合タンパク質が発現され
たベクター配列から放出されることが可能であるよう
に、特定のプロテアーゼ切断部位をコードするポリリン
カー配列を含むよう、さらに工作されている、本発明の
ポリヌクレオチド分子も含むことができる。例えば、融
合タンパク質ベクターは、とりわけ、トロンビンまたは
因子Xa切断部位をコードするヌクレオチド配列を含んで
もよい。
【００８３】本発明の発現ベクターはまた、発現に続く
培地からの融合タンパク質の精製を補助することが可能
なポリアミノ酸をコードするヌクレオチド配列も含んで
もよい。こうしたヌクレオチド配列の例は、配列番号38
に示されるヌクレオチド配列など、6XHISタグをコード
するヌクレオチド配列である。
【００８４】融合タンパク質を発現するための形質転換
細胞 本発明は、本明細書に記載されるような融合タンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
分子を含む形質転換細胞もまた提供する。本発明の形質
転換に有用な細胞には、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物
細胞、昆虫細胞、および植物細胞が含まれる。本発明の
形質転換細胞は、上述のような融合タンパク質をコード
するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含
むベクターで細胞をトランスフェクションすることによ
り、調製してもよい。
【００８５】本発明の実施に有用な宿主細胞は、真核で
も原核でもよい。こうした形質転換宿主細胞には、必ず
しも限定されるわけではないが、組換えバクテリオファ
ージまたはプラスミドで形質転換されている細菌などの
微生物；組換えベクターで形質転換されている酵母；組
換えウイルスベクター、例えば、とりわけ、アデノウイ
ルスまたはワクシニアウイルスに感染している哺乳動物
細胞などの動物細胞；および組換えウイルスベクター、
例えばバキュロウイルスベクターで形質転換されている
昆虫細胞が含まれる。
【００８６】融合タンパク質のin vitroでの発現および
採取のため、細菌細胞を宿主細胞として用いてもよい。
例えば、大腸菌株、例えばATCC、米国、ＭＤ、ロックビ
ル（ATCC寄託番号31343）またはStratagene（カリフォ
ルニア州ラホヤ）から入手可能なDH5α株、あるいはATC
Cなどの微生物寄託機関から入手可能なBL21株を用いて
もよい。酵母細胞および脊椎動物細胞、例えば、とりわ
け、マウス、ハムスター、ウシ（乳牛）、サル、または
ヒト細胞株由来のものを含む、真核宿主細胞もまた、有
効に利用することが可能である。本発明の融合タンパク
質を発現するのに用いてもよい真核宿主細胞の例には、
チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞（例えば、ATC
C寄託番号CCL-61）、NIHスイスマウス胚細胞NIH/3T3
（例えば、ATCC寄託番号CRL-1658）、およびマディン−
ダービー（Madin-Darby）ウシ腎臓（MDBK）細胞（ATCC
寄託番号CCL-22）が含まれる。
【００８７】本発明の融合タンパク質のin vitro発現お
よび採取に特に有用な他の細胞は、タンパク質のアミノ
酸の糖鎖付加のための系を有する細胞である。糖鎖付加
系を有する細胞のいくつかの例は、昆虫細胞、哺乳動物
細胞および酵母細胞である。異なる細胞種由来の系は、
本発明の融合タンパク質に、異なるパターンの糖鎖付加
を提供することができる。
【００８８】本発明の組換えベクターは、好ましくは、
実質的に均質の細胞培養の1つまたはそれ以上の宿主細
胞に形質転換またはトランスフェクションされる。ベク
ターは、例えば、とりわけ、プロトプラスト形質転換、
リン酸カルシウム沈澱、塩化カルシウム処理、微量注
入、エレクトロポレーション、組換えウイルスとの接触
によるトランスフェクション、リポソーム仲介トランス
フェクション、DEAE-デキストラントランスフェクショ
ン、形質導入、接合、または微粒子銃（microprojectil
e bombardment）によるなど、既知の技術にしたがい、
宿主細胞に導入してもよい。
【００８９】ひとたび発現ベクターが宿主細胞に導入さ
れれば、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌク
レオチド配列の、宿主細胞ゲノム内のまたはエピソーム
内(episomally) での組込みおよび維持は、標準的技術
により、例えばサザンハイブリダイゼーション解析、制
限酵素解析、逆転写酵素PCR（rt-PCR）を含むPCR解析に
より、または期待される融合タンパク質産物を検出する
免疫学的アッセイにより、確認することが可能である。
ポリヌクレオチドコード配列を含むおよび／または本発
明の融合タンパク質を発現する宿主細胞は、当業に周知
の少なくとも4つの一般的なアプローチのいずれにより
同定することも可能であり、これらには：（i）DNA-DN
A、DNA-RNA、またはRNA-アンチセンスRNAハイブリダイ
ゼーション；（ii）「マーカー」遺伝子機能の存在を検
出すること；（iii）宿主細胞における特定のmRNA転写
物の発現により測定されるような転写レベルを評価する
こと；または（iv）当業に知られるように、イムノアッ
セイによるなど、成熟ポリペプチド産物の存在を検出す
ることが含まれる。
【００９０】ひとたび本発明の融合タンパク質をコード
するポリヌクレオチド配列が適切な細胞に安定して導入
されれば、形質転換細胞をクローンとして増殖させても
よく、そして生じた細胞を、コードされる融合タンパク
質の最大の産生を行う条件下で増殖させてもよい。こう
した条件は、典型的には、形質転換細胞を高密度に増殖
させることを含む。発現ベクターが誘導可能プロモータ
ーを含む場合、適切な誘導条件、例えば、温度シフト、
栄養素の消耗、無償性の（gratuitous）誘導剤（例え
ば、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド（I
PTG）などの炭水化物の類似体）の添加、過剰な代謝副
産物の蓄積、またはそれらに匹敵するものを、発現を誘
導するのに必要とされるように、使用する。
【００９１】組換え発現融合タンパク質が宿主細胞内部
に保持される場合、細胞を採取し、そして溶解し、そし
て例えば4℃で、またはプロテアーゼ阻害剤の存在下
で、あるいは両方を伴う、タンパク質分解を最小にする
ための当業に知られる抽出条件下で、溶解物から産物を
精製する。組換え発現融合タンパク質が宿主細胞から分
泌される場合、消耗した栄養培地を単純に集め、そして
そこから融合タンパク質を単離することができる。
【００９２】組換え発現融合タンパク質は、細胞溶解物
または培地から、必要に応じ、標準的方法を用い精製し
てもよく、前記方法には、限定されるわけではないが、
以下の方法の1つまたはそれ以上が含まれる：硫酸アン
モニウム沈澱、サイズ分画、イオン交換クロマトグラフ
ィー、HPLC、密度遠心分離、およびアフィニティークロ
マトグラフィー。組換え発現融合タンパク質は、例えば
大きさ、融合タンパク質特異的抗体との反応性に基づ
き、または融合タグ、例えば6XHISタグの存在により、
検出してもよい。本発明は、培養液中に分泌されるよう
に、または細胞溶解物に存在するように、非精製状態に
ある組換え発現融合タンパク質と共に、部分的にまたは
実質的に精製された組換え融合タンパク質を含み、すべ
て本発明の実施に有用である。
【００９３】二重機能ワクチンを含む、ワクチン、およ
び該ワクチンを用いる方法 本発明の融合タンパク質、ベクター、および形質転換細
胞を用い、二重機能ワクチンを調製し、脊椎動物におい
て本融合タンパク質の部分（a）が類似であるペプチド
に対し免疫阻害性反応を誘導する一方、同時に部分
（b）が由来する病原体による感染に対し防御してもよ
い。こうしたワクチンはまた、脊椎動物において単に部
分（a）が類似であるペプチドを阻害するのにも有用で
ある。
【００９４】したがって、1つの側面において、本発明
は、上述のような融合タンパク質、あるいはこうした融
合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリ
ヌクレオチド分子を含むベクターまたは形質転換細胞
を、部分（a）が由来するペプチドを内因的に合成し、
そして部分（b）が由来する病原体により病原的に感染
することが可能である脊椎動物において、該ペプチドの
活性を阻害し、そして該病原体による感染に対し防御す
るのに有効な量で、薬学的または獣医学的使用に許容さ
れるキャリヤーと共に含む、二重機能ワクチンを提供す
る。
【００９５】好ましい態様において、本発明は、ウシに
おいてGnRH活性を阻害する一方、同時にBHV-1感染から
ウシを防御するための二重機能ワクチンであって、本発
明にしたがった融合タンパク質、あるいはこうした融合
タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌ
クレオチド分子を含むベクターまたは形質転換細胞を、
獣医学的使用に許容されるキャリヤーと共に含み、該融
合タンパク質の部分（ａ）がGnRHペプチドのすべてまた
は一部に対し類似しており、部分（ｂ）がＢＨＶ−１抗
原のすべてまたは一部に対し類似しており、該融合タン
パク質がウシにおけるGnRH活性を阻害するのに、そして
またBHV-1感染からウシを防御するのに有効な量で存在
する、前記ワクチンを提供する。
【００９６】本発明はまた、脊椎動物において内因的に
合成されるペプチドの活性を阻害し、そして該脊椎動物
を病原的感染から防御するための方法であって、上述の
ような二重機能ワクチンの、該ペプチドの活性を阻害
し、そして該病原体による感染に対し防御するのに有効
である量で該脊椎動物を免疫することを含む、前記方法
も提供する。好ましい態様において、本発明は、乳牛に
おいて性的特性を阻害し、そしてBHV-1感染に対し防御
するための方法であって、GnRHペプチドのすべてまたは
一部に対し類似の部分（a）およびBHV-1抗原のすべてま
たは一部に対し類似の部分（b）を含む融合タンパク
質、あるいはこうした融合タンパク質をコードするヌク
レオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクタ
ーまたは形質転換細胞を含む上述のような二重機能ワク
チンを、性的特性を阻害し、そしてBHV-1感染に対し防
御するのに有効な量で、乳牛にワクチン投与することを
含む、前記方法を提供する。
【００９７】部分（b）がBHV-1抗原のすべてまたは一部
に対し類似である融合タンパク質を含むワクチンでは、
ワクチン投与されている脊椎動物は、BHV-1が病原的に
感染させることが可能な脊椎動物である必要はない。こ
うした脊椎動物において、部分（b）は単にそれが連結
しているペプチドを阻害する免疫反応を誘導するキャリ
ヤーとして作用する。
【００９８】したがって、本発明はまた、脊椎動物にお
いてペプチドの活性を阻害するためのワクチンであっ
て、部分（a）がペプチドのすべてまたは一部に対し類
似であり、そして部分（b）がBHV-1抗原のすべてまたは
一部に対し類似である、本発明の融合タンパク質、ある
いはこうした融合タンパク質をコードするヌクレオチド
配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターまたは
形質転換細胞を、該ペプチドの活性を阻害するのに有効
な量で、薬学的または獣医学的使用に許容されるキャリ
ヤーと共に含む、前記ワクチンも提供する。
【００９９】好ましい態様において、本発明は、脊椎動
物においてGnRHの活性を阻害するためのワクチンであっ
て、部分（a）がGnRHペプチドのすべてまたは一部に対
し類似であり、そして部分（b）がBHV-1抗原のすべてま
たは一部に対し類似である融合タンパク質、あるいはこ
うした融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を
含むポリヌクレオチド分子を含むベクターまたは形質転
換細胞を、GnRH活性を阻害するのに有効な量で、薬学的
または獣医学的使用に許容されるキャリヤーと共に含
む、前記ワクチンを提供する。
【０１００】本発明はまた、脊椎動物において、限定さ
れるわけではないがホルモンGnRHを含むペプチドの活性
を阻害するための方法であって、融合タンパク質、ある
いはこうした融合タンパク質をコードするヌクレオチド
配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターまたは
形質転換細胞を含む上述のワクチンの、該ペプチドの活
性を阻害するのに有効である量で該脊椎動物を免疫する
ことを含み、前記融合タンパク質がキャリヤーとしてBH
V-1抗原のすべてまたは一部に対し類似のタンパク質性
部分を含む、前記方法も提供する。
【０１０１】本発明はまた、脊椎動物、好ましくは哺乳
動物において、性的特性を阻害するための方法であっ
て、GnRHペプチドのすべてまたは一部に対し類似の部分
（a）およびBHV-1抗原のすべてまたは一部に対し類似の
部分（b）を含む融合タンパク質、あるいはこうした融
合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリ
ヌクレオチド分子を含むベクターまたは形質転換細胞を
含むワクチンの、性的特性を阻害するのに有効量で、該
脊椎動物を免疫することを含む、前記方法も提供する。
該脊椎動物は、ウシ種の一員である必要はなく、GnRHを
内因的に合成するいかなる脊椎動物、例えば、ヒツジ、
ブタ、ウマ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはヒトなどであっ
てもよい。
【０１０２】「性的特性」は、脊椎動物の性および／ま
たは脊椎動物の生殖能力に関連する、該脊椎動物におけ
る特性であり、該特性は、全体的にまたは部分的に、直
接または間接的に、GnRHにより誘導される。こうした特
性は、通常の当業者により確定可能である。オスのウシ
において、こうした性的特性の阻害の例には、攻撃的行
動の抑圧、テストステロン産生の抑制、性欲（libido）
減少、補助的性腺（前立腺および精嚢を含む）の退化、
精巣体積の減少、および精子形成の減少または停止が含
まれる。メスのウシにおいて、こうした性的特性の阻害
には、排卵の停止および不妊、生殖管の退化、および流
産が含まれる。1つの態様において、オスまたはメスの
脊椎動物において、阻害される性的特性が機能的生殖系
を含むよう、GnRHが阻害され、したがって、本発明は避
妊の形式を提供する。
【０１０３】本発明はまた、オス脊椎動物において、好
ましくは哺乳動物において、前立腺組織における異常な
細胞の増殖を阻害するための方法であって、融合タンパ
ク質、あるいはこうした融合タンパク質をコードするヌ
クレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベク
ターまたは形質転換細胞を含むワクチンの、異常な前立
腺細胞増殖を阻害するのに有効である量で該脊椎動物を
免疫することを含み、前記融合タンパク質はGnRHペプチ
ドのすべてまたは一部に対し類似の部分（a）およびBHV
-1抗原のすべてまたは一部に対し類似の部分（b）を含
む、前記方法も提供する。
【０１０４】本発明のワクチンは、許容される慣例にし
たがい、ヒトを含む動物に対し許容されるキャリヤー、
例えば標準的緩衝剤、安定剤、希釈剤、保存剤および／
または可溶化剤を含むよう処方してもよく、そしてまた
持続放出を容易にするよう処方してもよい。希釈剤に
は、水、生理的食塩水、デキストロース、エタノール、
グリセロール、およびそれらに匹敵するものが含まれ
る。等張性のための添加剤には、とりわけ、塩化ナトリ
ウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、
およびラクトースが含まれる。安定化剤はとりわけアル
ブミンを含む。他の適切なワクチン賦形剤（vehicle）
および添加剤には、修飾生ワクチンを処方するのに特に
有用なものが含まれ、これは当業者に知られ、または当
業者に明らかであろう。例えば、本明細書に援用され
る、Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed.,
1990, Mack Publishingを参照されたい。
【０１０５】本発明のワクチンはさらに、１つまたはそ
れ以上の付加的な免疫調節構成要素、例えば、とりわ
け、アジュバントまたはサイトカイン、コレラ毒素（C
T）あるいは熱不安定性毒素（LT）などを含んでもよ
い。本発明のワクチンに用いてもよい、限定されないア
ジュバントの例には、RIBIアジュバント系（Ribi In
c.、モンタナ州ハミルトン）、ミョウバン、水酸化アル
ミニウムゲルなどのミネラルゲル、水中油エマルジョ
ン、油中水エマルジョン、例えば、フロイント完全およ
び不完全アジュバント、Blockコポリマー（CytRx、ジョ
ージア州アトランタ）、QS-21（Cambridge Biotech In
c.、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、SAF-M（Chiro
n、カリフォルニア州エメリビル）、AMPHIGEN（登録商
標）アジュバント、サポニン、Quil Aまたは他のサポニ
ン分画、モノホスホリル脂質A、およびAvridine脂質−
アミンアジュバントが含まれる。本発明のワクチンに有
用な水中油エマルジョンの非限定的例には、修飾SEAM62
およびSEAM1/2処方が含まれる。修飾SEAM62は、5％（v/
v）スクアレン（Sigma）、1％（v/v）SPAN（登録商標）
85界面活性剤（ICI Surfactants）、0.7％（v/v）TWEEN
（登録商標）80界面活性剤（ICISurfactants）、2.5％
（v/v）エタノール、200μg/ml Quil A、100μg/mlコレ
ステロール、および0.5％（v/v）レシチンを含む、水中
油エマルジョンである。修飾SEAM1/2は、5％（v/v）ス
クアレン、1％（v/v）SPAN（登録商標）85界面活性剤、
0.7％（v/v）TWEEN 80界面活性剤、2.5％（v/v）エタノ
ール、100μg/ml Quil A、および50μg/mlコレステロー
ルを含む、水中油エマルジョンである。ワクチンに含ま
れてもよい他の免疫調節剤には、例えば、1つまたはそ
れ以上のインターロイキン類、インターフェロン類、ま
たは他の既知のサイトカインが含まれる。ワクチンが生
存形質転換細胞を含む場合、アジュバントは、好ましく
は、生じるワクチン処方が該生存形質転換細胞の生存可
能性を少なくともある程度維持する能力に基づき選択さ
れる。
【０１０６】本発明の形質転換細胞を含むワクチンは、
標準的技術により、例えば、患者に直接、または濃縮型
で投与してもよい、培地に遊離の、または哺乳動物宿主
細胞に宿する、あるいはその両方の、前記形質転換細胞
を含む培養液のアリコートを用い、調製してもよい。あ
るいは、修飾生存形質転換細胞を、当業者により選択さ
れ、そして選択された投与経路に適している、免疫調節
剤の存在下または非存在下に、薬学的または獣医学的使
用に許容されるキャリヤーと、組み合わせてもよく、こ
こでワクチン組成物における生存細胞の生存可能性は少
なくともある程度維持される。こうした方法は当業に知
られる。
【０１０７】本発明のワクチンが生存形質転換細胞を含
む場合、ワクチンを低温または冷凍で貯蔵してもよい。
ワクチン組成物が、本発明の融合タンパク質、ベクタ
ー、または不活性化形質転換細胞を含む場合、ワクチン
は冷凍、または投与前に適切な希釈剤を用い、再水和さ
せる、凍結乾燥型で貯蔵してもよい。
【０１０８】本発明のワクチンは、所望により、融合タ
ンパク質の持続放出のため処方してもよい。こうした持
続放出処方の例には、生体適合性ポリマー、例えば、ポ
リ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、メチル
セルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンおよびそれらに
匹敵するものなどの複合物（composite）と組み合わせ
た融合タンパク質が含まれる。薬剤搬送ビヒクル（vehi
cle）における分解可能ポリマーの構造、選択、および
使用は、いくつかの刊行物に概説されており、本明細書
に援用される、A. Dombら, 1992, Polymers for Advanc
ed Technologies 3:279-292が含まれる。薬剤処方にお
けるポリマーの選択および使用のさらなる手引きは、や
はり本明細書に援用される、Drugs and the Pharmaceut
ical Sciences, Vol. 45, M. Dekker, ニューヨーク中
の：M. ChasinおよびR. Langer（編集）, 1990, "Biode
gradable Polymers as Drug Delivery Systems"による
テキストに見出すことが可能である。あるいは、または
さらに、融合タンパク質、ベクター、または形質転換細
胞を、投与および効能を改善するため、マイクロカプセ
ル化してもよい。抗原をマイクロカプセル化する方法
は、当業に周知であり、そして例えばすべて本明細書に
援用される、米国特許第3,137,631号；米国特許第3,95
9,457号；米国特許第4,205,060号；米国特許第4,606,94
0号；米国特許第4,744,933号；米国特許第5,132,117
号；および国際特許公報WO 95/28227に記載される技術
が含まれる。
【０１０９】リポソームもまた、融合タンパク質、ベク
ター、または形質転換細胞の持続放出を提供するのに用
いてもよい。リポソーム処方をどのように作成し、そし
て用いるかに関する詳細は、特に、すべて本明細書に援
用される、米国特許第4,016,100号；米国特許第4,452,7
47号；米国特許第4,921,706号；米国特許第4,927,637
号；米国特許第4,944,948号；米国特許第5,008,050号；
および米国特許第5,009,956号に見出すことが可能であ
る。
【０１１０】上述のいかなるワクチンの有効量も、慣用
的手段により、融合タンパク質、ベクター、または形質
転換細胞の低用量で開始し、そしてその後効果をモニタ
ーしながら投薬量を増加させ、決定してもよい。有効量
は、ワクチンの単回投与後またはワクチンの多数の投与
後に得られてもよい。動物当たりの最適用量を決定する
際、既知の要因を考慮に入れてもよい。これらには、動
物の種、大きさ、年齢および一般的な状態、動物におけ
る他の薬剤の存在、並びにそれらに匹敵するものが含ま
れる。実際の投薬は、好ましくは、他の動物研究の結果
を考慮した後、決定する。
【０１１１】適切な免疫反応が達成されているかを検出
する1つの方法は、ワクチン投与後の動物におけるセロ
コンバーション（seroconversion）および抗体力価を測
定することである。ワクチン投与の時期、およびもしあ
れば追加免疫の数が、好ましくは、いくつかが上述であ
る、すべての関係する要因の解析に基づき、適格な科学
者または獣医師により決定されるであろう。
【０１１２】本発明の融合タンパク質、ベクター、およ
び形質転換細胞の有効投薬量は、既知の技術を用い、ワ
クチン投与されている動物の重量など、通常の当業者に
より測定されることが可能な要因を考慮に入れ、決定す
ることが可能である。本発明の融合タンパク質の、本発
明のワクチンにおける投薬量は、好ましくは約1μgから
約10 mgの範囲であり、より好ましくは約50μgから約1
mgの範囲であり、そして最も好ましくは約100μgから約
0.5mgの範囲である。本発明のベクターの、本発明のワ
クチンにおける投薬量は、好ましくは約50μgから約1 m
gの範囲である。本発明の形質転換細胞の、本発明のワ
クチンにおける投薬量は、好ましくは約1 x 103から約1
x 108細胞／mlの範囲であり、そしてより好ましくは約
1 x 105から約1 x 107細胞／mlの範囲である。適切な投
薬サイズは、約0.5 mlから約10mlの範囲であり、そして
より好ましくは約1 mlから約5 mlの範囲である。
【０１１３】前立腺における異常な細胞増殖の阻害が問
題となるとき、いかなる上述のワクチンの有効量も、慣
用的手段により、融合タンパク質、ベクター、または形
質転換細胞の低用量で開始し、そしてその後効果をモニ
ターしながら投薬量を増加させ、決定してもよい。動物
当たりの最適用量を決定する際、既知の要因を考慮に入
れてもよい。いくつかの要因は上述である。
【０１１４】「異常細胞増殖」は、正常制御機構から独
立した細胞増殖を意味する（例えば接触阻害の欠失）。
これには：（1）悪性前立腺腫瘍細胞、例えば前立腺癌
腫細胞、（2）前立腺組織における他の増殖性異常の良
性細胞、および（3）GnRH活性と関連する、前立腺組織
におけるいかなる他の制御されない細胞増殖の異常増殖
も含まれる。「前立腺癌腫増殖の阻害」および匹敵する
句は、本明細書において、前立腺組織における異常な細
胞増殖を遅くする、停止する、および／または逆転させ
ることを意味する。
【０１１５】本発明はさらに、上述のような融合タンパ
ク質を含むワクチンを調製する方法であって、本発明の
融合タンパク質の有効量を、薬学的または獣医学的使用
に許容されるキャリヤーと組み合わせることを含む、前
記方法を提供する。
【０１１６】抗体 本発明はさらに、脊椎動物において内因的に合成される
ペプチドに対して向けられるポリクローナル抗体を作成
する方法であって、こうした脊椎動物に、抗体を誘導す
る量の本発明の融合タンパク質、あるいはこうした融合
タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌ
クレオチド分子を含むベクターまたは形質転換細胞をワ
クチン投与し、ここで該融合タンパク質は該脊椎動物内
で内因的に合成されるペプチドのすべてまたは一部に対
し類似の部分（a）を含む；ワクチン投与した脊椎動物
からポリクローナル抗体を含む血清を得て；そして内因
的に合成されるペプチドに結合するポリクローナル抗体
を血清から単離し；それにより該ペプチドに対して向け
られるポリクローナル抗体を作成することを含む、前記
方法を提供する。ワクチン投与した脊椎動物から血清を
得、およびそこから特定のポリクローナル抗体を単離す
るための方法は、当業に知られる。好ましい態様におい
て、融合タンパク質は、GnRHペプチドのすべてまたは一
部に対し類似の部分（a）を含み、そしてそれに向けて
ポリクローナル抗体が作成されるペプチドはGnRHであ
る。本発明はさらに、本方法にしたがい作成される、内
因的に合成されるペプチドに対して向けられるポリクロ
ーナル抗体を提供する。好ましい態様において、ポリク
ローナル抗体はGnRHに対して向けられる。
【０１１７】本発明はさらに、脊椎動物において内因的
に合成されるペプチドに対して向けられるモノクローナ
ル抗体を作成する方法であって、こうした脊椎動物に、
抗体を誘導する量の、本発明の融合タンパク質、あるい
はこうした融合タンパク質をコードするヌクレオチド配
列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターまたは形
質転換細胞をワクチン投与し、ここで該融合タンパク質
は該脊椎動物内で内因的に合成されるペプチドのすべて
または一部に対し類似の部分（a）を含む；そしてワク
チン投与した脊椎動物から、内因的に合成されるペプチ
ドに特異的に結合するモノクローナル抗体を分泌する脾
臓細胞を単離し；それにより該ペプチドに対して向けら
れるモノクローナル抗体を作成することを含む、前記方
法を提供する。好ましい態様において、融合タンパク質
は、GnRHペプチドのすべてまたは一部に対し類似の部分
（a）を含み、そしてそれに向けてモノクローナル抗体
が作成されるペプチドはGnRHである。本発明はさらに、
本方法にしたがい作成される、内因的に合成されるペプ
チドに対して向けられるモノクローナル抗体を提供す
る。好ましい態様において、モノクローナル抗体はGnRH
に対して向けられる。
【０１１８】モノクローナル抗体を作成する目的で、特
定のモノクローナル抗体を分泌する脾臓細胞を、ワクチ
ン投与した動物から単離する方法が、当業に知られる。
こうした方法には、限定されるわけではないが、元々Ko
hlerおよびMilstein（Nature, 1975, 256:495-497）に
記載されたハイブリドーマ技術；ヒトB細胞ハイブリド
ーマ技術（Kosborら, 1983, Immunology Today 4:72；C
oteら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-20
30）；およびEBV−ハイブリドーマ技術（Coleら,1985,
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.
Liss, Inc., pp.77-96）が含まれる。これらの刊行物は
本明細書に援用される。
【０１１９】モノクローナル抗体および抗体断片を産生
するための技術は、さらに、特に、本明細書に援用され
る、HarlowおよびLane, 1988, Antibodies: A Laborato
ry Manual, Cole Spring Harbor LaboratoryおよびJ.
W. Goding, 1986, MonoclonalAntibodies: Principles
and Practice, Academic Press, Londonに記載される。
【０１２０】以下の実施例は、単に本発明の側面を例示
するために提供される。これらは、請求項に示され、そ
して本明細書にさらに十分に説明される本発明を限定す
ることを意図せず、そして限定すると見なされてはなら
ない。
【０１２１】
【実施例】実施例1：gD/GnRH融合タンパク質を発現する
プラスミド pQE-tmgDの構築：プラスミドFlgD/Pots207nco（#79）
（全長gDをコードする、以下「gD/Pots」）をNcoI/XbaI
で消化し、そして生じた1.26 kb断片をpUC21の対応する
部位にクローンし、プラスミドpUC-FLgDを生成した。プ
ラスミドpUC-FLgDにおけるNcoI/XbaI断片の全配列を、
サンガー蛍光ジデオキシ鎖終結配列決定技術を用い、両
方のDNA鎖に関し決定した。図3は、配列結果および特性
を示す。gD/Potsをコードするヌクレオチド配列は、配
列番号16に含まれる。
【０１２２】gD/Potsおよび公表されているBHV-1gD（Ge
nBank寄託番号M59846）の間のDNA並列は、94.7％の相同
性を示し、ミスマッチの大部分は、膜貫通ドメインの3'
で起こっている（図4）。
【０１２３】gD/PotsおよびM59846の間のアミノ酸並列
は、4つのアミノ酸相違を示し、そのうち1つはシグナル
配列内に位置し、そして他の3つは膜貫通ドメイン内ま
たはその付近に位置する（図5）。
【０１２４】gDタンパク質のシグナル配列は、該タンパ
ク質の大腸菌での発現を容易にするため、除去された。
シグナル配列の除去は、pUC-FLgDプラスミドDNAをNco I
/Hind IIIで消化し、そして末端をDNAポリメラーゼIの
クレノウ断片で埋めることにより、行った。生じたDNA
断片をゲル精製し、そして連結した。50 bp断片の欠失
を示すであろう、Sph I/Sac I断片の移動度におけるシ
フトに関し、コロニーをスクリーニングした。2つの陽
性クローンを選択し、そしてNco I/Hind III欠失領域を
はさんで配列決定した。すべてのクローンは、正しい配
列を有することが示された。クローン#1をpUC-MgDと名
付け、さらなる操作のため選択した。
【０１２５】大規模のタンパク質産生のため、成熟gD配
列を大腸菌発現ベクターにサブクローンした。この目的
に向け、成熟gD配列を含むpUC-MgD由来の1.07 kb Sph I
/SacI断片（膜貫通ドメインを除くため、3'末端で切頭
されている）をpQE-31（Qiagen）の対応する部位にサブ
クローンした。（pQE-31はファージT5プロモーター、お
よびIPTGによる発現誘導前に、より強く抑制するための
2つのlacオペレーター配列を用いる。pQE-31はまた、精
製目的のため、N末端6XHISタグ融合も含む。）生じたク
ローンを、1.07 kb SphI/SacI断片に関しスクリーニン
グした。1つの陽性クローンをpQE-tmgDと名付け、以
下、さらなるプラスミドを調製するのに選択した。pQE-
tmgDは、切頭成熟gD（tmgD）配列に融合しているN末端6
XHISタグをコードし、Sac I部位に続く、ベクターがコ
ードする終止コドンにより終結する。gD配列の連結領域
およびプラスミド骨格を配列決定し、挿入物の完全性
（integrity）を確認し、そして正しいことが見出され
た。pQE-tmgDにおいてtmgDをコードする配列（6XHISタ
グを含まない）は、配列番号36に示される。pQE-tmgDに
コードされるtmgDのアミノ酸配列（6XHISタグを含まな
い）は、配列番号35に示される。
【０１２６】GnRH四量体クローンの構築：異なる末端DN
A配列を有するGnRH（単量体および二量体）をコードす
る12の異なるオリゴヌクレオチド（センスおよび相補
（逆）鎖）を調製した。これらの12のオリゴヌクレオチ
ドは配列番号1−12に提供される。
【０１２７】オリゴヌクレオチド9および10をアニーリ
ングし、そしてpBS KS+（Stratagene）のBamHI/XhoI部
位にクローンし、p98BS/GnRHを生成した。アニーリング
したオリゴヌクレオチド7および8をSma I/Xho I部位に
付加することにより、GnRH四量体をコードするプラスミ
ドをプラスミドp98BS/GnRHから構築した。5つの別個の
クローンの配列解析により、すべて合成プライマー領域
に塩基変化を有することが示されたため、全長四量体の
再構築が必要であった。1つの突然変異クローン由来の1
06 bp Eag I断片を、この領域に塩基変化を持たないク
ローン由来の対応する断片で置き換えることにより、正
しい配列の全長四量体を含むクローンを構築した。生じ
た再構築クローンの1つを配列決定し、そしてGnRH四量
体をコードする正しいDNA配列を有することを見出し
た。本クローンはGnRH四量体構築物に関し予測されるヌ
クレオチド配列とは異なる1つの配列を含んだ。該変化
は、3'でそしてGnRHコード領域外の付加的なGであり、
そしてしたがって、GnRHのコード領域に影響しない。
（この付加的なGは、再構築に用いたクローンに存在し
ており、そして合成プライマー配列のエラーによる可能
性がある。）本クローンはp9897-Rと名付けられた。GnR
H四量体をコードする配列を含むp9897-Rの一部は、図2
に示される。GnRH四量体をコードする配列は配列番号32
に示される。p9897-RにコードされるGnRH四量体のアミ
ノ酸配列は配列番号33に示される。
【０１２８】プライマーP14-S1（配列番号42）およびP1
4-A138（配列番号43）をプラスミドp9897-R由来のテン
プレートDNAと共に用い、PCRを行い、3'終止コドンおよ
び合成5' Sac Iおよび3' Hind III末端を有するGnRH四
量体PCR断片を含む138bp断片を生成した。該PCR断片をp
GEM-T EASYベクター（Promega、ウィスコンシン州マデ
ィソン）にクローンし、p9897 S/d3を生成した。該クロ
ーンを配列決定し、そして正しい配列を有することを見
出した。該クローン、p9897 S/d3は、後のpQEベクター
へのクローニングのため、Sac IおよびHind IIIを含むG
nRH四量体コード配列の供給源を提供する。
【０１２９】pQE-gD:GnRHの構築：p9897 S/d3由来のGnR
H四量体を含む126 bp SacI/HindIII断片を、プラスミド
pQE-tmgDの対応する部位にクローンした。126 bp SacI/
HindIII断片および挿入物の適切な方向を示す1165 bp B
amHI/HindIII断片の存在に関し、コロニーをスクリーニ
ングした。クローニング部位に隣接する連結領域を、DN
A配列決定により解析し、そして正しいことを見出し
た。6XHISタグを含むtmgD-4GnRHをコードするヌクレオ
チド配列、およびプラスミド隣接配列は配列番号24に示
される。pQE-gD:GnRHにコードされるtmgD-4GnRHのアミ
ノ酸配列は配列番号25に示される。上述のように、tmgD
-4GnRHは融合構築物であり、ここでGnRH四量体は切頭成
熟gDのカルボキシ末端に融合している。
【０１３０】pQE-GnRH:gDの構築：p9897-RにおけるGnRH
四量体コード配列を、BamHI/NcoIで切断し、末端をクレ
ノウで埋め平滑にし、そして132 bp断片をゲル精製し
た。pUC-FLgDからNcoI/HindIIIで切断し、クレノウで埋
めることにより末端を平滑にし、そして4.4 kb断片をゲ
ル精製することにより、成熟gDベクター断片（すなわち
シグナル配列を含まないもの）を調製した。p9897-R由
来の132 bp断片と連結しそして形質転換した後、正しい
方向での連結から生じる5' BamHIおよびNco I部位の再
生成に関し、クローンをスクリーニングした。〜400 bp
Nde I断片の生成に関するさらなるスクリーニングによ
り、正しい構造を確認した。該構築物をGnRH/gD連結を
はさんで配列決定し、正しい配列を確認した。本構築物
はpUC-GnRH:gDと名付けられ、pUCベクターにおける成熟
全長gD配列のアミノ末端に融合しているGnRH四量体配列
を含む。
【０１３１】1161 bp GnRH四量体／切頭成熟gD融合タン
パク質を、pUC-GnRH:gDをSph IおよびSac I制限酵素で
消化することにより得た。この1161 bp断片をpQE-31の
対応する部位にクローンし、pQE-GnRH:gDを生成した。1
161 bp Sph I/Sac I断片、およびNde I断片の正しいパ
ターン（380 bp、2.0、2.2 kb）に関し、クローンをス
クリーニングした。
【０１３２】6XHISタグを含む4GnRH-tmgDをコードする
ヌクレオチド配列、およびプラスミド隣接配列は、配列
番号22に示される。pQE-GnRH:gDにコードされる4GnRH-t
mgDのアミノ酸配列は配列番号23に示される。
【０１３３】pQE-GnRH:gD:GnRHの構築：p9897 S/d3由来
の126 bp Sac I/Hind III断片をプラスミドpQE-GnRH:gD
の対応する部位にサブクローンし、pQE-GnRH:gD:GnRHを
生成した。126 bp Sac I/Hind III断片と共にNde I断片
の正しいパターンに関し、クローンをスクリーニングし
た。
【０１３４】pQE-GnRH:gD:GnRHは4GnRH-tmgD-4GnRH融合
タンパク質をコードする。上述のように、4GnRH-tmgD-4
GnRHはアミノおよびカルボキシ末端両方に融合している
GnRH四量体を有する切頭成熟gDを含む。pQE-GnRH:gD:Gn
RH由来のヌクレオチドコード配列および隣接配列は、配
列番号26に提供される。6XHISタグを含む、pQE-GnRH:g
D:GnRHにコードされる4GnRH-tmgD-4GnRHのアミノ酸配列
は、配列番号27に示される。
【０１３５】細菌発現ベクターpQE構築物由来の発現産
物の比較：4つの構築物はすべて、クローンFlgD/Pots20
7nco（#79）のアミノ酸19から358を含む、FlgD/Pots207
nco（#79）由来のtmgDを含んだ。4つの構築物はすべ
て、アミノ酸指定：MRGSHHHHHHTDPHA（配列番号37）に
示されるアミノ末端pQE-HISリーダー配列（6XHISタグ）
を含んだ。6XHISタグのコード配列は、配列番号38に示
される。4つの構築物はすべて、6XHISリーダー配列の後
に2または3アミノ酸リンカーを有した。すべてのGnRH産
物はGnRH四量体クローンp9897-Rに由来した。 pQE-GnRH:gDおよびpQE-GnRH:gD:GnRHクローンは、アミ
ノ末端GnRH四量体およびtmgD配列の間に3つのアミノ酸
リンカー（SMS）を含んだ。 pQE-gDおよびpQE-GnRH:gDクローンは、クローニングか
ら生じる人工物として、tmgDのカルボキシ末端にベクタ
ー配列由来の余分の10アミノ酸を含んだ。 pQE-gD:GnRHおよびpQE-GnRH:gD:GnRHクローンは、tmgD
およびGnRHカルボキシ融合の間に1つのアミノ酸（プロ
リン）リンカーを含んだ。 各pQE構築物の図解には図10を参照されたい。
【０１３６】実施例2：形質転換細菌細胞によるGnRH/gD
融合タンパク質の発現 上記実施例1に記載されるpQE構築物はすべて、発現のた
め、大腸菌DH5α-F'lQ細胞に形質転換された。発現の誘
導のため、細胞を2リットルバッフル付き（baffled）培
養フラスコ中の100μg/mlアンピシリンおよび25μg/ml
カナマイシンを含む2 x YTブロス中で0.7−0.9のOD600
まで増殖させ、その後1−2 mM IPTGで誘導し、そして摂
氏37度で4時間インキュベーションした。採取時の平均O
D600読み取り値は、1.3であった。4つの構築物すべての
発現を、ウェスタンブロット解析により確認した。
【０１３７】実施例3：融合タンパク質ワクチンの処方
およびマウスの免疫感作 ワクチンアセンブリ：9％ポリアクリルアミドゲル上で
の分離用（preparative）電気泳動により、pQE-tmgD
（コントロールとして）、pQE-GnRH:gD、pQE-GnRH:gD:G
nRH、およびpQE-gD:GnRH由来の融合タンパク質を封入体
調製から濃縮した。SDS PAGEゲルから切り出したバンド
を25 mM Tris、pH 8.3、192 mMグリシンおよび0.1% SDS
（w/v）に溶解した。10μgと同等のgD／マウス用量を、
SEAM1（スクアレンエマルジョンアジュバント代謝可
能）エマルジョン（10μg QuilA/100μl用量）でアジュ
バント化した。ワクチン製剤は4℃で保存した。SEAM1
は、5％スクアレン、0.1％ビタミンE酢酸、1％ Span 8
5、0.70％ Tween 80、2 mg/ml QuilA、および400μl/ml
コレステロールである。
【０１３８】マウス：本研究において、8週令以降のBAL
B/cオスを用いた（10匹／群）。マウスをまず、10匹の
群で飼育したが、けんかを防ぐため、コントロールはそ
の後、個別のケージに移した。
【０１３９】免疫感作：上述のような、100μlアジュバ
ント中の10μg融合タンパク質で皮下的にマウスを免疫
した。研究第0、20、および41日目に、3回の免疫感作を
与えた。
【０１４０】ELISAによる抗GnRH抗体：研究第0、20、3
1、41、55、62、69、および146日目に血清試料を収集
し、そしてペプチドELISA（酵素結合免疫吸着アッセ
イ）において抗GnRH抗体力価に関し評価した。逆相カラ
ム上でHPLCにより精製された、天然配列に加え4アミノ
酸リンカー（CAGAEHWSYGLRPG）からなるビオチン化GnRH
ペプチド（ビオチン−GnRH）（pH 7.6の25 mM Tris、0.
15 M NaCl中、0.1μg/ml）をアビジン被覆プレートに吸
着させ、そして室温で2時間インキュベーションした。
洗浄緩衝液（25 mM Tris、0.15 M NaCl、0.05％ Tween-
20および0.05％ BSA（ウシ血清アルブミン）フラクショ
ンV）でプレートを4回洗浄することにより、過剰なペプ
チドを除去した。その後、希釈剤（25 mM Tris、0.15 M
NaCl、0.05％ BSA）中の陽性コントロール、陰性およ
び未知のマウス血清の5倍連続希釈物（100μl／ウェ
ル）をペプチド被覆ウェルに添加し、そして室温で30分
インキュベーションした。プレートを洗浄緩衝液中で4
回洗浄し、そしてその後、ウサギ抗マウスIgG（IgG特異
的）−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Zymed、カリフォ
ルニア）を各ウェルに添加した（1:4,000、100μl／ウ
ェル）。室温で30分インキュベーションした後、結合し
た抗体を3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン基質（Kie
rkegaard & Perry、カタログ#50-76-04）（100μl／ウ
ェル、暗所で15分）で検出し、そして50μl／ウェルの
0.18 M H2SO4の添加により反応を停止した。Molecular
Devicesマイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を
測定した。抗体力価を計算するため、陽性コントロール
曲線を生成し、そして未知の試料の力価を、コンピュー
ターソフトウェアを用い、曲線から推定した。
【０１４１】BHV-1 gD ELISA：研究第0、20、31、41、5
5、62、69、および146日目で血清試料を収集し、そして
ELISAにより抗gD BHV-1抗体力価に関し評価した。MDBK
（マディン・ダービーウシ腎臓）細胞（ダルベッコのPB
S＋0.01％チメロサル（thimerosol）中1μg/ml、100μl
／ウェル）から発現された精製組換えgD BHV-1を4℃で1
8−24時間、マイクロタイタープレート上に吸着させ
た。過剰なタンパク質をウェルから洗い流した後、0.01
％チメロサルを含むDPBS（ダルベッコのリン酸緩衝生理
的食塩水）中の1％ PVA（ポリビニル酢酸）300μlで、3
7℃で2時間インキュベーションすることにより、ウェル
の非結合部位をブロッキングした。血清試料（陽性およ
び陰性コントロール並びに未知の血清）を1:50に希釈
し、その後、0.01％チメロサルを含むDPBS中の1％ PVA
で連続的に4倍希釈し、そして100μlを各ウェルに添加
した。該アッセイを37℃で45分インキュベーションし
た。プレートを蒸留H2Oで4回洗浄し、その後HRP（西洋
ワサビペルオキシダーゼ）ヤギ抗マウス（0.01％チメロ
サルを含むDPBS中の1％ PVA中で1:10000、100μl／ウェ
ル、KP+L）を添加し、そしてプレートを37℃で30分イン
キュベーションした。ウェルを蒸留H2Oで4回洗浄し、そ
の後該アッセイをABTS（2,2'−アジノ−ジ[3−エチル−
ベンズチアゾリンスルホネート（6））基質で発現させ
た（100μl／ウェル、RT、15分）。反応をELISAリーダ
ー上で405／490 nmで読み取った。0.5 ODを切り離し値
（cutoff）として用い、そして0.5より上は2希釈を、お
よび0.5 ODより下は1希釈を力価の推定に用い、EXCELTM
（Microsoft、ワシントン州レッドモンド）の予測法を
用い、力価を計算した。
【０１４２】テストステロン濃度：研究第0、41および6
9日目の血清試料をテストステロン濃度に関し評価し
た。該アッセイは、ネズミテストステロンと交差反応す
る抗体を用いる、ヒトテストステロン・ラジオイムノア
ッセイであった。ヒトテストステロン標準をアッセイ中
に用いる。ネズミ試料はヒトテストステロン標準曲線の
低い端の値を示す傾向にあり、正常値のより広い可変性
につながる。アッセイの感度は0.02 ng/mlである。
【０１４３】剖検および組織病理：動物は研究第146日
目に屠殺した。精巣、精巣上体および精嚢を含む前立腺
を除去し、そして組織をブワン固定液（75 mlピクリン
酸（飽和溶液）；25 mlホルマリン（37％）；5 ml酢酸
（4.76％））中で固定する前に重量測定した。組織を48
時間固定し、その後50％エタノール：H2Oでリンスし
た。組織を解析まで新鮮な50％エタノールに保存した。
組織を加工し、そしてパラフィンに包埋し、そして5μm
の切片を切りそしてヘマトキシリンおよびエオジンで染
色した。各器官を、炎症、萎縮、および精原細胞変性に
関し評価した。精子形成欠如、萎縮、または他の損傷の
レベルに基づき、スコアを割り当てた。正常コントロー
ル群の平均体重のパーセンテージとして、重量をスコア
化した。累積スコアを各動物に割り当てた。
【０１４４】結果：抗gD抗体反応：gDまたはgD含有融合
タンパク質で免疫されたマウスはすべて、gDが原核（す
なわち大腸菌発現カルボキシル、アミノまたはカルボキ
シル−アミノ融合タンパク質）または真核発現系（すな
わちMDBK発現タンパク質）で発現されたかに関わらず、
抗gD ELISA抗体を生成した。
【０１４５】抗GnRH抗体反応：抗GnRH力価の階層（hier
archy）が異なる融合タンパク質により誘導された：tmg
D-4GnRH（すなわちタンパク質のカルボキシ末端にGnRH
四量体を有するもの）は最も高い力価を生成し、その後
4GnRH-tmgD-4GnRHが続き、4GnRH-tmgDで免疫されたもの
では最も低い力価が誘導された。すべての群において、
抗GnRH力価は第二の免疫感作後にピークとなり、そして
2ヶ月より長い間プラトー（plateau）のままであった。
【０１４６】tmgD-4GnRHで免疫感作されたすべて（9匹
のうち9匹）のマウスが、ペプチドELISAで測定した際、
GnRHに対する抗体反応を起こしたが、2／9のマウスは低
反応であった。4GnRH-tmgD群は3／10が無反応であり、
そして4GnRH-tmgD-4GnRHでは1／9が無反応であった。Gn
RHで無反応であったマウスはすべて、gDに反応した。
【０１４７】オス生殖系に対する抗GnRH抗体の影響：抗
GnRH抗体の誘導がGnRH機能を停止させるであろうかどう
かを決定するため、我々はGnRH免疫感作前および後のテ
ストステロンレベルを評価した。剖検時、生殖管組織を
重量測定し、その後、総体的（gross）および組織学的
検査に供した。マウスのテストステロン濃度の正常範囲
は、ヒトテストステロン・ラジオイムノアッセイを用い
て測定されるように、広く異なった。しかし、tmgD-4Gn
RHで免疫感作されたマウスは、正常コントロールまたは
他の処置群と比較すると、有意に低い平均テストステロ
ン濃度を有した。tmgD-4GnRHで免疫感作したマウスの前
立腺、精巣および精巣上体は、総体的組織重量および精
子発達の組織学的検査を評価したとき、有意に萎縮して
いた。4GnRH-tmgD-4GnRHで免疫したマウスは、正常コン
トロールと比較した際、より影響が少なかった。
【０１４８】実施例4：gD/GnRH融合タンパク質をコード
するバキュロウイルス構築物 pBacHISgD:LHおよびbac-gD:GnRHの構築：pQE-gD:GnRH
（実施例1を参照されたい）をHind IIIで消化し、該部
位をクレノウ処理により平滑末端化し、そして続いてEc
oRIで消化した。tmgD-4GnRHコード配列を含むおよそ1.2
kbの断片をゲル精製し、そしてSTUI/EcoRIで消化した
トランスファーベクターpBacPAK9プラスミド（Clontec
h, Inc.）にクローンし、pBacHISgD:LHを形成した。
（該トランスファーベクターは複製不全バキュロウイル
スにおいて複製不全を相殺する(compensate）配列を含
む。）
【０１４９】Sf21昆虫細胞を、pBacHISgD:LHおよび複製
不全バキュロウイルスウイルスDNAでコトランスフェク
ションした。これらのトランスフェクションされたSf21
細胞は、tmgD-4GnRH融合タンパク質をコードする、組換
えバキュロウイルス（bac-gD:GnRHと称す）（ATCC寄託
番号VR-2633）を生成する。トランスファーベクターpBa
cHISgD:LHおよび複製不全バキュロウイルスウイルスDNA
の間の組換え（DNAの交換）は、pBacHISgD:LHからウイ
ルスDNAへ、複製不全を補足する1つまたは複数の遺伝子
と共に、全発現カセット（tmgD-4GnRHをコードする配
列）を、有効にトランスファーすることを可能にする、
pBacPAK9に存在する、相同な隣接ウイルス配列により仲
介される。
【０１５０】組換えウイルスを、プラークアッセイによ
り感染Sf21細胞から精製してもよい。Sf21細胞感染およ
びプラークアッセイ精製の反復サイクルを行い、融合タ
ンパク質の大規模産生のため、組換えウイルス発現融合
タンパク質のより高い濃度を得てもよい。組換え構築物
の発現をウェスタンブロットにより確認した。感染Sf21
細胞を遠心分離により収集し、そして組換えバキュロウ
イルスのため処理するまで-80℃に移してもよい。
【０１５１】bac-gD:GnRH中の6XHISタグ、切頭成熟gDお
よびGnRH四量体のORFをコードするヌクレオチド配列
は、配列番号39に示される。ヌクレオチド#1‐45は6XHI
Sタグをコードし、ヌクレオチド#46−1074は切頭成熟BH
V-1 gDをコードし、ヌクレオチド#1075−1194はGnRH四
量体をコードし、そしてヌクレオチド#1195−1197は終
止コドンである。bac-gD:GnRHにコードされる融合タン
パク質のアミノ酸配列は、配列番号25に示される配列と
同一である。
【０１５２】pBacHISMgDの構築：gDを含む組換えバキュ
ロウイルス構築物をコントロールとして生成した。プラ
スミドpCMV-MgD（実施例5、以下を参照されたい）をPac
IおよびApaIで消化し、5'末端を欠くgD遺伝子の大部分
を含む950 bp断片の単離を可能にした。プラスミドpBac
HISgD:LHはPacIおよびApaIの消化を経て、プラスミド骨
格およびgDの5'部分を含む5.6 kb断片の単離が可能にな
った。5.6 kb断片を950 bp断片と連結し、トランスファ
ーベクターpBacPAC9中に切頭成熟gDを含むプラスミドpB
acHISMgDを生成した。
【０１５３】Sf21細胞をpBacHISMgDおよび複製不全ウイ
ルスでコトランスフェクションした。これらの形質転換
Sf21細胞はtmgDをコードする組換えバキュロウイルス
（Bac-MgDと称す）を生成する。組換えウイルスを精製
し、上述のように保存した。
【０１５４】発現：組換えバキュロウイルスを感染Sf21
細胞の溶解物から得てもよい。溶解物はまた、組換えウ
イルスに発現される融合タンパク質も含み、そして融合
タンパク質を溶解物から精製してもよい。例えば、細胞
ペレットを界面活性剤で溶解した後、前述の例の溶解物
ペレットを8 M尿素、50 mM Tris、pH 7.5中で可溶化
し、そしてNi NTAカラムに装填した；tmgD-4GnRHはpH段
階勾配において溶出させた。組換えバキュロウイルスお
よび融合タンパク質を両方含む溶解物は、例えば-80℃
で保存してもよい。
【０１５５】実施例5：gD/GnRH融合タンパク質のin viv
o発現に適したプラスミド pCMVβベクター（Clontech, Inc）由来のβ−Gal遺伝子
をEcoRV/NotI制限消化により除去し、そして生じたNotI
ベクター断片をゲル電気泳動により単離した。NotI末端
を含む多数クローニング部位（MC）を含む合成リンカー
をこのNotIベクター断片にクローンし、pCMV-MCを生成
した。
【０１５６】5'末端にEcoRV部位を導入し、第二のコド
ンをGluでなくGlnをコードするよう修復し、コード配列
のPro 337の後に終止コドンを付加し、そして3'末端にK
pnI部位を付加するプライマーを用い、シグナル配列を
含む切頭gD遺伝子を、FlgD/Pots207nco（#79）からPCR
増幅した。この1083 bp PCR断片をEcoRV/KpnI消化したp
GEM-T EASYベクター（Promega、ウィスコンシン州マデ
ィソン）にクローンし、pGEM-T-EASY/gDを生成し、そし
て続いてPCR産物の完全性を確実にするため蛍光ジデオ
キシ終結化学反応により両方向で配列決定した。切頭gD
断片を、EcoRV/KpnI消化によりpGEM-T-EASY/gDクローン
から単離し、そしてpCMV-MCにサブクローンした。生じ
たクローンをpCMV-gDと名付け、制限酵素解析により確
認した。
【０１５７】pCMV-gD:GnRH（ATCC寄託番号203370）を構
築するため、pQE-gD:GnRHをHindIIIで切断し、クレノウ
で平滑末端にし、そしてその後ApaIで消化した。tmgDお
よびGnRH四量体を含む、生じた平滑末端／ApaIの1.05 k
b断片を単離した。クローンpCMV-gDをSmaI、続いてApaI
で切断し、切頭gDコード領域を除いた。gDのシグナル配
列を含む、残った3.7 kb pCMVベクター断片を単離し、
そしてtmgDおよびGnRH四量体を含む1.05 kb断片との連
結反応に使用した。生じたクローンをpCMV-gD:GnRHと名
付けた。pCMV-gD:GnRH由来の、シグナル配列を含む、tg
D-4GnRHをコードするORFは、配列番号28に示される。pC
MV-gD:GnRHにコードされる、シグナル配列を含む、tgD-
4GnRHのアミノ酸配列は、配列番号29に示される。
【０１５８】上に引用される、すべての特許、特許出
願、および刊行物は、完全に本明細書に援用される。
【０１５９】本発明は、本発明の個々の側面の単なる例
示として意図される、本明細書に記載される特定の態様
により、範囲を制限されるものではなく、そして機能的
に同等な方法および構成要素は本発明の範囲内である。
実際、本発明の多様な修飾は、本明細書に示されそして
記載されるものに加え、前述の説明および付随する図表
により、当業者に明らかになるであろう。こうした修飾
は、付随する請求項の範囲内に属するよう意図される。
【０１６０】生物学的材料の寄託 以下の生物学的材料は10801 University Blvd., Manass
as, Virginia, 20110-2209, USAのアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（ATCC）に、1998年10月22
日に寄託され、そして以下の寄託番号を割り当てられ
た。
【０１６１】プラスミド 寄託番号 プラスミドpQE-gD:GnRH 98953 プラスミドpCMV-gD:GnRH 203370 プラスミドpQE-GnRH:gD 98954 プラスミドpQE-GnRH:gD:GnRH 98955
【０１６２】ベクター 寄託番号 バキュロウイルスbac-gD:GnRH VR-2633
【０１６３】上に引用される、すべての特許、特許出
願、および刊行物は、完全に本明細書に援用される。
【０１６４】本発明は、本発明の個々の側面の単なる例
示として意図される、本明細書に記載される特定の態様
により、範囲を制限されるものではなく、そして機能的
に同等な方法および構成要素は本発明の範囲内である。
実際、本発明の多様な修飾は、本明細書に示されそして
記載されるものに加え、前述の説明および付随する図表
により、当業者に明らかになるであろう。こうした修飾
は、付随する請求項の範囲内に属するよう意図される。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Products Inc <120> FUSION PROTEINS COMPRISING CARRIERS THAT CAN INDUCE A DUAL IMMUNE RESPONSE <130> PC10202A <140> <141> <150> N/A <151> 1999-02-17 <160> 46 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING GNRH CODING SEQUENCE AND CLONING ENDS <400> 1 catggaacac tggtcttatg gtctgcgtcc ggg 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING GNRH CODING SEQUENCE AND CLONING ENDS <400> 2 catggaacac tggtcttatg gtctgcgtcc ggg 33 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING GNRH CODING SEQUENCE AND CLONING ENDS <400> 3 gatctggaac actggtctta tggtctgcgt ccgggc 36 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING GNRH CODING SEQUENCE AND CLONING ENDS <400> 4 gatcgcccgg acgcagacca taagaccagt gttcca 36 <210> 5 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING GNRH CODING SEQUENCE AND CLONING ENDS <400> 5 gatccatgga gcactggtca tatggtctgc gtccgggtga acattggagc tacggtctac 60 gccccgggtc catggc 76 <210> 6 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING GNRH CODING SEQUENCE AND CLONING ENDS <400> 6 tcgagccatg gacccggggc gtagaccgta gctccaatgt tcacccggac gcagaccata 60 tgaccagtgc tccatg 76 <210> 7 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING GNRH CODING SEQUENCE AND CLONING ENDS <400> 7 ggggaacact ggtcttatgg cttacggccg ggagagcatt ggagttacgg cctccgtcca 60 ggttccatgg c 71 <210> 8 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING GNRH CODING SEQUENCE AND CLONING ENDS <400> 8 tcgagccatg gaacctggac ggaggccgta actccaatgc tctcccggcc gtaagccata 60 agaccagtgt tcccc 75 <210> 9 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING GNRH CODING SEQUENCE AND CLONING ENDS <400> 9 gatccagagc actggtcata tggtctgcgt ccgggtgaac attggagcta cggtctacgc 60 cccggggatc c 71 <210> 10 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING GNRH CODING SEQUENCE AND CLONING ENDS <400> 10 tcgaggatcc ccggggcgta gaccgtagct ccaatgttca cccggacgca gaccatatga 60 ccagtgctct g 71 <210> 11 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE COMPRISING GNRH CODING SEQUENCE AND CLONING ENDS <400> 11 ggggaacact ggtcttatgg cttacggccg ggagagcatt ggagttacgg 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Description of Artificial Sequence: GnRH tetramer <400> 15 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His 20 25 30 Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 35 40 <210> 16 <211> 1259 <212> DNA <213> Bovine herpesvirus 1 <220> <221> gene <222> (1)..(1259) <223> sequence encoding BHV-1 gD from clone FlgD/Pots207(#79) <400> 16 ccatggaggg gccgacattg gccgtgctgg gcgcgctgct cgccgttgcg gtaagcttgc 60 ctacacccgc gccgcgggtg acggtatacg tcgacccgcc ggcgtacccg atgccgcgat 120 acaactacac tgaacgctgg cacactaccg ggcccatacc gtcgcccttc gcagacggcc 180 gcgagcagcc cgtcgaggtg cgctacgcga cgagcgcggc ggcgtgcgac atgctggcgc 240 tgatcgcaga cccgcaggtg gggcgcacgc tgtgggaagc ggtacgccgg cacgcgcgcg 300 cgtacaacgc cacggtcata tggtacaaga tcgagagcgg gtgcgcccgg ccgctgtact 360 acatggagta caccgagtgc gagcccagga agcactttgg gtactgccgc taccgcacac 420 ccccgttttg ggacagcttc ctggcgggct tcgcctaccc cacggacgac gagctgggac 480 tgattatggc ggcgcccgcg cggctcgtcg agggccagta ccgacgcgcg ctgtacatcg 540 acggcacggt cgcctataca gatttcatgg tttcgctgcc ggccggggac tgctggttct 600 cgaaactcgg cgcggctcgc gggtacacct ttggcgcgtg cttcccggcc cgggattacg 660 agcaaaagaa ggttctgcgc ctgacgtatc tcacgcagta ctacccgcag gaggcacaca 720 aggccatagt cgactactgg ttcatgcgcc acgggggcgt cgttccgccg tattttgagg 780 agtcgaaggg ctacgagccg ccgcctgccg ccgatggggg ttcccccgcg ccacccggcg 840 acgacgaggc ccgcgaggat gaaggggaga ccgaggacgg ggcagccggg cgggagggca 900 acggcggccc cccaggaccc gaaggcgacg gcgagagtca gacccccgaa gccaacggag 960 gcgccgaggg cgagccgaaa cccggcccca gccccgacgc cgaccgcccc gaaggctggc 1020 cgagcctcga agccatcacg caccccccgc ccgcccccgc tacgcccgct cgagctccgg 1080 acgctgtttc ggtttctgtt ggtatcggta tcgctgctgc tgctatcgct tgcgttgctg 1140 ctgctgctgc tggtgcttac ttcgtttata ttcgtcgtcg tggtgctggt ccgctgccgc 1200 gtaaaccgaa aaaactgccg gctttcggta acgttaacta cagtgctctg ccgggttga 1259 <210> 17 <211> 418 <212> PRT <213> Bovine herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(418) <223> BHV-1gD encoded by clone FlgD/Pots207nco(#79) <400> 17 Met Glu Gly Pro Thr Leu Ala Val Leu Gly Ala Leu Leu Ala Val Ala 1 5 10 15 Val Ser Leu Pro Thr Pro Ala Pro Arg Val Thr Val Tyr Val Asp Pro 20 25 30 Pro Ala Tyr Pro Met Pro Arg Tyr Asn Tyr Thr Glu Arg Trp His Thr 35 40 45 Thr Gly Pro Ile Pro Ser Pro Phe Ala Asp Gly Arg Glu Gln Pro Val 50 55 60 Glu Val Arg Tyr Ala Thr Ser Ala Ala Ala Cys Asp Met Leu Ala Leu 65 70 75 80 Ile Ala Asp Pro Gln Val Gly Arg Thr Leu Trp Glu Ala Val Arg Arg 85 90 95 His Ala Arg Ala Tyr Asn Ala Thr Val Ile Trp Tyr Lys Ile Glu Ser 100 105 110 Gly Cys Ala Arg Pro Leu Tyr Tyr Met Glu Tyr Thr Glu Cys Glu Pro 115 120 125 Arg Lys His Phe Gly Tyr Cys Arg Tyr Arg Thr Pro Pro Phe Trp Asp 130 135 140 Ser Phe Leu Ala Gly Phe Ala Tyr Pro Thr Asp Asp Glu Leu Gly Leu 145 150 155 160 Ile Met Ala Ala Pro Ala Arg Leu Val Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Ala 165 170 175 Leu Tyr Ile Asp Gly Thr Val Ala Tyr Thr Asp Phe Met Val Ser Leu 180 185 190 Pro Ala Gly Asp Cys Trp Phe Ser Lys Leu Gly Ala Ala Arg Gly Tyr 195 200 205 Thr Phe Gly Ala Cys Phe Pro Ala Arg Asp Tyr Glu Gln Lys Lys Val 210 215 220 Leu Arg Leu Thr Tyr Leu Thr Gln Tyr Tyr Pro Gln Glu Ala His Lys 225 230 235 240 Ala Ile Val Asp Tyr Trp Phe Met Arg His Gly Gly Val Val Pro Pro 245 250 255 Tyr Phe Glu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Pro Pro Pro Ala Ala Asp Gly 260 265 270 Gly Ser Pro Ala Pro Pro Gly Asp Asp Glu Ala Arg Glu Asp Glu Gly 275 280 285 Glu Thr Glu Asp Gly Ala Ala Gly Arg Glu Gly Asn Gly Gly Pro Pro 290 295 300 Gly Pro Glu Gly Asp Gly Glu Ser Gln Thr Pro Glu Ala Asn Gly Gly 305 310 315 320 Ala Glu Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro Ser Pro Asp Ala Asp Arg Pro 325 330 335 Glu Gly Trp Pro Ser Leu Glu Ala Ile Thr His Pro Pro Pro Ala Pro 340 345 350 Ala Thr Pro Ala Arg Ala Pro Asp Ala Val Ser Val Ser Val Gly Ile 355 360 365 Gly Ile Ala Ala Ala Ala Ile Ala Cys Val Ala Ala Ala Ala Ala Gly 370 375 380 Ala Tyr Phe Val Tyr Ile Arg Arg Arg Gly Ala Gly Pro Leu Pro Arg 385 390 395 400 Lys Pro Lys Lys Leu Pro Ala Phe Gly Asn Val Asn Tyr Ser Ala 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ctttggcgcg 720 tgcttcccgg cccgggatta cgagcaaaag aaggttctgc gcctgacgta tctcacgcag 780 tactacccgc aggaggcaca caaggccata gtcgactact ggttcatgcg ccacgggggc 840 gtcgttccgc cgtattttga ggagtcgaag ggctacgagc cgccgcctgc cgccgatggg 900 ggttcccccg cgccacccgg cgacgacgag gcccgcgagg atgaagggga gaccgaggac 960 ggggcagccg ggcgggaggg caacggcggc cccccaggac ccgaaggcga cggcgagagt 1020 cagacccccg aagccaacgg aggcgccgag ggcgagccga aacccggccc cagccccgac 1080 gccgaccgcc ccgaaggctg gccgagcctc gaagccatca cgcacccccc gcccgccccc 1140 gctacgcccg cggcccccga cgccgtgccg gtcagcgtcg ggatcggcat tgcggctgcg 1200 gcgatcgcgt gcgtggccgc cgccgccgcc ggcgcgtact tcgtctatac gcgccggcgc 1260 ggtgcgggtc cgctgcccag aaagccaaaa aagctgccgg cctttggcaa cgtcaactac 1320 agcgcgctgc ccgggtgagc ggcctaggcc ctcccccgac cgcccccttt gctcctagcc 1380 ccggctcctg ccgagccgcg cgggg 1405 <210> 19 <211> 417 <212> PRT <213> Bovine herpesvirus 1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(417) <223> BHV-1 gD encoded by GenBank Accession No. M59846. <400> 19 Met Gln Gly Pro Thr Leu Ala Val Leu Gly Ala Leu Leu Ala Val Ala 1 5 10 15 Val Ser Leu Pro Thr Pro Ala Pro Arg Val Thr Val Tyr Val Asp Pro 20 25 30 Pro Ala Tyr Pro Met Pro Arg Tyr Asn Tyr Thr Glu Arg Trp His Thr 35 40 45 Thr Gly Pro Ile Pro Ser Pro Phe Ala Asp Gly Arg Glu Gln Pro Val 50 55 60 Glu Val Arg Tyr Ala Thr Ser Ala Ala Ala Cys Asp Met Leu Ala Leu 65 70 75 80 Ile Ala Asp Pro Gln Val Gly Arg Thr Leu Trp Glu Ala Val Arg Arg 85 90 95 His Ala Arg Ala Tyr Asn Ala Thr Val Ile Trp Tyr Lys Ile Glu Ser 100 105 110 Gly Cys Ala Arg Pro Leu Tyr Tyr Met Glu Tyr Thr Glu Cys Glu Pro 115 120 125 Arg Lys His Phe Gly Tyr Cys Arg Tyr Arg Thr Pro Pro Phe Trp Asp 130 135 140 Ser Phe Leu Ala Gly Phe Ala Tyr Pro Thr Asp Asp Glu Leu Gly Leu 145 150 155 160 Ile Met Ala Ala Pro Ala Arg Leu Val Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Ala 165 170 175 Leu Tyr Ile Asp Gly Thr Val Ala Tyr Thr Asp Phe Met Val Ser Leu 180 185 190 Pro Ala Gly Asp Cys Trp Phe Ser Lys Leu Gly Ala Ala Arg Gly Tyr 195 200 205 Thr Phe Gly Ala Cys Phe Pro Ala Arg Asp Tyr Glu Gln Lys Lys Val 210 215 220 Leu Arg Leu Thr Tyr Leu Thr Gln Tyr Tyr Pro Gln Glu Ala His Lys 225 230 235 240 Ala Ile Val Asp Tyr Trp Phe Met Arg His Gly Gly Val Val Pro Pro 245 250 255 Tyr Phe Glu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Pro Pro Pro Ala Ala Asp Gly 260 265 270 Gly Ser Pro Ala Pro Pro Gly Asp Asp Glu Ala Arg Glu Asp Glu Gly 275 280 285 Glu Thr Glu Asp Gly Ala Ala Gly Arg Glu Gly Asn Gly Gly Pro Pro 290 295 300 Gly Pro Glu Gly Asp Gly Glu Ser Gln Thr Pro Glu Ala Asn Gly Gly 305 310 315 320 Ala Glu Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro Ser Pro Asp Ala Asp Arg Pro 325 330 335 Glu Gly Trp Pro Ser Leu Glu Ala Ile Thr His Pro Pro Pro Ala Pro 340 345 350 Ala Thr Pro Ala Ala Pro Asp Ala Val Pro Val Ser Val Gly Ile Gly 355 360 365 Ile Ala Ala Ala Ala Ile Ala Cys Val Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala 370 375 380 Tyr Phe Val Tyr Thr Arg Arg Arg Gly Ala Gly Pro Leu Pro Arg Lys 385 390 395 400 Pro Lys Lys Leu Pro Ala Phe Gly Asn Val Asn Tyr Ser Ala Leu Pro 405 410 415 Gly <210> 20 <211> 1218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Sequence from pQE-tmgD encoding a tmgD. <400> 20 ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60 attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aactatgaga 120 ggatctcacc atcaccatca ccatacggat ccgcatgcca tgagcttgcc tacacccgcg 180 ccgcgggtga cggtatacgt cgacccgccg gcgtacccga tgccgcgata caactacact 240 gaacgctggc acactaccgg gcccataccg tcgcccttcg cagacggccg cgagcagccc 300 gtcgaggtgc gctacgcgac gagcgcggcg gcgtgcgaca tgctggcgct gatcgcagac 360 ccgcaggtgg ggcgcacgct gtgggaagcg gtacgccggc acgcgcgcgc gtacaacgcc 420 acggtcatat ggtacaagat cgagagcggg tgcgcccggc cgctgtacta catggagtac 480 accgagtgcg agcccaggaa gcactttggg tactgccgct accgcacacc cccgttttgg 540 gacagcttcc tggcgggctt cgcctacccc acggacgacg agctgggact gattatggcg 600 gcgcccgcgc ggctcgtcga gggccagtac cgacgcgcgc tgtacatcga cggcacggtc 660 gcctatacag atttcatggt ttcgctgccg gccggggact gctggttctc gaaactcggc 720 gcggctcgcg ggtacacctt tggcgcgtgc ttcccggccc gggattacga gcaaaagaag 780 gttctgcgcc tgacgtatct cacgcagtac tacccgcagg aggcacacaa ggccatagtc 840 gactactggt tcatgcgcca cgggggcgtc gttccgccgt attttgagga gtcgaagggc 900 tacgagccgc cgcctgccgc cgatgggggt tcccccgcgc cacccggcga cgacgaggcc 960 cgcgaggatg aaggggagac cgaggacggg gcagccgggc gggagggcaa cggcggcccc 1020 ccaggacccg aaggcgacgg cgagagtcag acccccgaag ccaacggagg cgccgagggc 1080 gagccgaaac ccggccccag ccccgacgcc gaccgccccg aaggctggcc gagcctcgaa 1140 gccatcacgc accccccgcc cgcccccgct acgcccgctc gagctcggta ccccgggtcg 1200 acctgcagcc aagcttaa 1218 <210> 21 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: tmgD encoded by pQE-tmgD. <400> 21 Met Arg Gly Ser His His His His His His Thr Asp Pro His Ala Met 1 5 10 15 Ser Leu Pro Thr Pro Ala Pro Arg Val Thr Val Tyr Val Asp Pro Pro 20 25 30 Ala Tyr Pro Met Pro Arg Tyr Asn Tyr Thr Glu Arg Trp His Thr Thr 35 40 45 Gly Pro Ile Pro Ser Pro Phe Ala Asp Gly Arg Glu Gln Pro Val Glu 50 55 60 Val Arg Tyr Ala Thr Ser Ala Ala Ala Cys Asp Met Leu Ala Leu Ile 65 70 75 80 Ala Asp Pro Gln Val Gly Arg Thr Leu Trp Glu Ala Val Arg Arg His 85 90 95 Ala Arg Ala Tyr Asn Ala Thr Val Ile Trp Tyr Lys Ile Glu Ser Gly 100 105 110 Cys Ala Arg Pro Leu Tyr Tyr Met Glu Tyr Thr Glu Cys Glu Pro Arg 115 120 125 Lys His Phe Gly Tyr Cys Arg Tyr Arg Thr Pro Pro Phe Trp Asp Ser 130 135 140 Phe Leu Ala Gly Phe Ala Tyr Pro Thr Asp Asp Glu Leu Gly Leu Ile 145 150 155 160 Met Ala Ala Pro Ala Arg Leu Val Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Ala Leu 165 170 175 Tyr Ile Asp Gly Thr Val Ala Tyr Thr Asp Phe Met Val Ser Leu Pro 180 185 190 Ala Gly Asp Cys Trp Phe Ser Lys Leu Gly Ala Ala Arg Gly Tyr Thr 195 200 205 Phe Gly Ala Cys Phe Pro Ala Arg Asp Tyr Glu Gln Lys Lys Val Leu 210 215 220 Arg Leu Thr Tyr Leu Thr Gln Tyr Tyr Pro Gln Glu Ala His Lys Ala 225 230 235 240 Ile Val Asp Tyr Trp Phe Met Arg His Gly Gly Val Val Pro Pro Tyr 245 250 255 Phe Glu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Pro Pro Pro Ala Ala Asp Gly Gly 260 265 270 Ser Pro Ala Pro Pro Gly Asp Asp Glu Ala Arg Glu Asp Glu Gly Glu 275 280 285 Thr Glu Asp Gly Ala Ala Gly Arg Glu Gly Asn Gly Gly Pro Pro Gly 290 295 300 Pro Glu Gly Asp Gly Glu Ser Gln Thr Pro Glu Ala Asn Gly Gly Ala 305 310 315 320 Glu Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro Ser Pro Asp Ala Asp Arg Pro Glu 325 330 335 Gly Trp Pro Ser Leu Glu Ala Ile Thr His Pro Pro Pro Ala Pro Ala 340 345 350 Thr Pro Ala Arg Ala Arg Tyr Pro Gly Ser Thr Cys Ser Gln Ala 355 360 365 <210> 22 <211> 1360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: portion of pQE-GnRH:gD, including sequence encoding 4GnRH-tmgD. <400> 22 ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60 attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aactatgaga 120 ggatctcacc atcaccatca ccatacggat ccgcatgcca tggatccaga gcactggtca 180 tatggtctgc gtccgggtga acattggagc tacggtctac gccccgggga acactggtct 240 tatggcttac ggccgggaga gcattggagt tacggcctcc gtccaggttc catgagcttg 300 cctacacccg cgccgcgggt gacggtatac gtcgacccgc cggcgtaccc gatgccgcga 360 tacaactaca ctgaacgctg gcacactacc gggcccatac cgtcgccctt cgcagacggc 420 cgcgagcagc ccgtcgaggt gcgctacgcg acgagcgcgg cggcgtgcga catgctggcg 480 ctgatcgcag acccgcaggt ggggcgcacg ctgtgggaag cggtacgccg gcacgcgcgc 540 gcgtacaacg ccacggtcat atggtacaag atcgagagcg ggtgcgcccg gccgctgtac 600 tacatggagt acaccgagtg cgagcccagg aagcactttg ggtactgccg ctaccgcaca 660 cccccgtttt gggacagctt cctggcgggc ttcgcctacc ccacggacga cgagctggga 720 ctgattatgg cggcgcccgc gcggctcgtc gagggccagt accgacgcgc gctgtacatc 780 gacggcacgg tcgcctatac agatttcatg gtttcgctgc cggccgggga ctgctggttc 840 tcgaaactcg gcgcggctcg cgggtacacc tttggcgcgt gcttcccggc ccgggattac 900 gagcaaaaga aggttctgcg cctgacgtat ctcacgcagt actacccgca ggaggcacac 960 aaggccatag tcgactactg gttcatgcgc cacgggggcg tcgttccgcc gtattttgag 1020 gagtcgaagg gctacgagcc gccgcctgcc gccgatgggg gttcccccgc gccacccggc 1080 gacgacgagg cccgcgagga tgaaggggag accgaggacg gggcagccgg gcgggagggc 1140 aacggcggcc ccccaggacc cgaaggcgac ggcgagagtc agacccccga agccaacgga 1200 ggcgccgagg gcgagccgaa acccggcccc agccccgacg ccgaccgccc cgaaggctgg 1260 ccgagcctcg aagccatcac gcaccccccg cccgcccccg ctacgcccgc tcgagctcgg 1320 taccccgggt cgacctgcag ccaagcttaa ttagctgagc 1360 <210> 23 <211> 411 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 4GnRH-tmgD encoded by pQE-GnRH:gD. <400> 23 Met Arg Gly Ser His His His His His His Thr Asp Pro His Ala Met 1 5 10 15 Asp Pro Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser 20 25 30 Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 35 40 45 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Met Ser Leu Pro Thr 50 55 60 Pro Ala Pro Arg Val Thr Val Tyr Val Asp Pro Pro Ala Tyr Pro Met 65 70 75 80 Pro Arg Tyr Asn Tyr Thr Glu Arg Trp His Thr Thr Gly Pro Ile Pro 85 90 95 Ser Pro Phe Ala Asp Gly Arg Glu Gln Pro Val Glu Val Arg Tyr Ala 100 105 110 Thr Ser Ala Ala Ala Cys Asp Met Leu Ala Leu Ile Ala Asp Pro Gln 115 120 125 Val Gly Arg Thr Leu Trp Glu Ala Val Arg Arg His Ala Arg Ala Tyr 130 135 140 Asn Ala Thr Val Ile Trp Tyr Lys Ile Glu Ser Gly Cys Ala Arg Pro 145 150 155 160 Leu Tyr Tyr Met Glu Tyr Thr Glu Cys Glu Pro Arg Lys His Phe Gly 165 170 175 Tyr Cys Arg Tyr Arg Thr Pro Pro Phe Trp Asp Ser Phe Leu Ala Gly 180 185 190 Phe Ala Tyr Pro Thr Asp Asp Glu Leu Gly Leu Ile Met Ala Ala Pro 195 200 205 Ala Arg Leu Val Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Ala Leu Tyr Ile Asp Gly 210 215 220 Thr Val Ala Tyr Thr Asp Phe Met Val Ser Leu Pro Ala Gly Asp Cys 225 230 235 240 Trp Phe Ser Lys Leu Gly Ala Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Gly Ala Cys 245 250 255 Phe Pro Ala Arg Asp Tyr Glu Gln Lys Lys Val Leu Arg Leu Thr Tyr 260 265 270 Leu Thr Gln Tyr Tyr Pro Gln Glu Ala His Lys Ala Ile Val Asp Tyr 275 280 285 Trp Phe Met Arg His Gly Gly Val Val Pro Pro Tyr Phe Glu Glu Ser 290 295 300 Lys Gly Tyr Glu Pro Pro Pro Ala Ala Asp Gly Gly Ser Pro Ala Pro 305 310 315 320 Pro Gly Asp Asp Glu Ala Arg Glu Asp Glu Gly Glu Thr Glu Asp Gly 325 330 335 Ala Ala Gly Arg Glu Gly Asn Gly Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly Asp 340 345 350 Gly Glu Ser Gln Thr Pro Glu Ala Asn Gly Gly Ala Glu Gly Glu Pro 355 360 365 Lys Pro Gly Pro Ser Pro Asp Ala Asp Arg Pro Glu Gly Trp Pro Ser 370 375 380 Leu Glu Ala Ile Thr His Pro Pro Pro Ala Pro Ala Thr Pro Ala Arg 385 390 395 400 Ala Arg Tyr Pro Gly Ser Thr Cys Ser Gln Ala 405 410 <210> 24 <211> 1360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: portion of pQE-gD:GnRH, including sequence coding tmgD-4GnRH. <400> 24 ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60 attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aactatgaga 120 ggatctcacc atcaccatca ccatacggat ccgcatgcca tgagcttgcc tacacccgcg 180 ccgcgggtga cggtatacgt cgacccgccg gcgtacccga tgccgcgata caactacact 240 gaacgctggc acactaccgg gcccataccg tcgcccttcg cagacggccg cgagcagccc 300 gtcgaggtgc gctacgcgac gagcgcggcg gcgtgcgaca tgctggcgct gatcgcagac 360 ccgcaggtgg ggcgcacgct gtgggaagcg gtacgccggc acgcgcgcgc gtacaacgcc 420 acggtcatat ggtacaagat cgagagcggg tgcgcccggc cgctgtacta catggagtac 480 accgagtgcg agcccaggaa gcactttggg tactgccgct accgcacacc cccgttttgg 540 gacagcttcc tggcgggctt cgcctacccc acggacgacg agctgggact gattatggcg 600 gcgcccgcgc ggctcgtcga gggccagtac cgacgcgcgc tgtacatcga cggcacggtc 660 gcctatacag atttcatggt ttcgctgccg gccggggact gctggttctc gaaactcggc 720 gcggctcgcg ggtacacctt tggcgcgtgc ttcccggccc gggattacga gcaaaagaag 780 gttctgcgcc tgacgtatct cacgcagtac tacccgcagg aggcacacaa ggccatagtc 840 gactactggt tcatgcgcca cgggggcgtc gttccgccgt attttgagga gtcgaagggc 900 tacgagccgc cgcctgccgc cgatgggggt tcccccgcgc cacccggcga cgacgaggcc 960 cgcgaggatg aaggggagac cgaggacggg gcagccgggc gggagggcaa cggcggcccc 1020 ccaggacccg aaggcgacgg cgagagtcag acccccgaag ccaacggagg cgccgagggc 1080 gagccgaaac ccggccccag ccccgacgcc gaccgccccg aaggctggcc gagcctcgaa 1140 gccatcacgc accccccgcc cgcccccgct acgcccgctc gagctccaga gcactggtca 1200 tatggtctgc gtccgggtga acattggagc tacggtctac gccccgggga acactggtct 1260 tatggcttac ggccgggaga gcattggagt tacggcctcc gtccaggttg aagcttaatt 1320 agctgagctt ggactcctgt tgatagatcc agtaatgacc 1360 <210> 25 <211> 398 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: tmgD-4GmRH encoded by pQE-gD:GnRH. <400> 25 Met Arg Gly Ser His His His His His His Thr Asp Pro His Ala Met 1 5 10 15 Ser Leu Pro Thr Pro Ala Pro Arg Val Thr Val Tyr Val Asp Pro Pro 20 25 30 Ala Tyr Pro Met Pro Arg Tyr Asn Tyr Thr Glu Arg Trp His Thr Thr 35 40 45 Gly Pro Ile Pro Ser Pro Phe Ala Asp Gly Arg Glu Gln Pro Val Glu 50 55 60 Val Arg Tyr Ala Thr Ser Ala Ala Ala Cys Asp Met Leu Ala Leu Ile 65 70 75 80 Ala Asp Pro Gln Val Gly Arg Thr Leu Trp Glu Ala Val Arg Arg His 85 90 95 Ala Arg Ala Tyr Asn Ala Thr Val Ile Trp Tyr Lys Ile Glu Ser Gly 100 105 110 Cys Ala Arg Pro Leu Tyr Tyr Met Glu Tyr Thr Glu Cys Glu Pro Arg 115 120 125 Lys His Phe Gly Tyr Cys Arg Tyr Arg Thr Pro Pro Phe Trp Asp Ser 130 135 140 Phe Leu Ala Gly Phe Ala Tyr Pro Thr Asp Asp Glu Leu Gly Leu Ile 145 150 155 160 Met Ala Ala Pro Ala Arg Leu Val Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Ala Leu 165 170 175 Tyr Ile Asp Gly Thr Val Ala Tyr Thr Asp Phe Met Val Ser Leu Pro 180 185 190 Ala Gly Asp Cys Trp Phe Ser Lys Leu Gly Ala Ala Arg Gly Tyr Thr 195 200 205 Phe Gly Ala Cys Phe Pro Ala Arg Asp Tyr Glu Gln Lys Lys Val Leu 210 215 220 Arg Leu Thr Tyr Leu Thr Gln Tyr Tyr Pro Gln Glu Ala His Lys Ala 225 230 235 240 Ile Val Asp Tyr Trp Phe Met Arg His Gly Gly Val Val Pro Pro Tyr 245 250 255 Phe Glu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Pro Pro Pro Ala Ala Asp Gly Gly 260 265 270 Ser Pro Ala Pro Pro Gly Asp Asp Glu Ala Arg Glu Asp Glu Gly Glu 275 280 285 Thr Glu Asp Gly Ala Ala Gly Arg Glu Gly Asn Gly Gly Pro Pro Gly 290 295 300 Pro Glu Gly Asp Gly Glu Ser Gln Thr Pro Glu Ala Asn Gly Gly Ala 305 310 315 320 Glu Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro Ser Pro Asp Ala Asp Arg Pro Glu 325 330 335 Gly Trp Pro Ser Leu Glu Ala Ile Thr His Pro Pro Pro Ala Pro Ala 340 345 350 Thr Pro Ala Arg Ala Pro Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 355 360 365 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly 370 375 380 Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 385 390 395 <210> 26 <211> 1441 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: portion of pQE-GnRH:gD:GnRH, including encoding 4GnRH-tmgD-4GnRH <400> 26 ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60 attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aactatgaga 120 ggatctcacc atcaccatca ccatacggat ccgcatgcca tggatccaga gcactggtca 180 tatggtctgc gtccgggtga acattggagc tacggtctac gccccgggga acactggtct 240 tatggcttac ggccgggaga gcattggagt tacggcctcc gtccaggttc catgagcttg 300 cctacacccg cgccgcgggt gacggtatac gtcgacccgc cggcgtaccc gatgccgcga 360 tacaactaca ctgaacgctg gcacactacc gggcccatac cgtcgccctt cgcagacggc 420 cgcgagcagc ccgtcgaggt gcgctacgcg acgagcgcgg cggcgtgcga catgctggcg 480 ctgatcgcag acccgcaggt ggggcgcacg ctgtgggaag cggtacgccg gcacgcgcgc 540 gcgtacaacg ccacggtcat atggtacaag atcgagagcg ggtgcgcccg gccgctgtac 600 tacatggagt acaccgagtg cgagcccagg aagcactttg ggtactgccg ctaccgcaca 660 cccccgtttt gggacagctt cctggcgggc ttcgcctacc ccacggacga cgagctggga 720 ctgattatgg cggcgcccgc gcggctcgtc gagggccagt accgacgcgc gctgtacatc 780 gacggcacgg tcgcctatac agatttcatg gtttcgctgc cggccgggga ctgctggttc 840 tcgaaactcg gcgcggctcg cgggtacacc tttggcgcgt gcttcccggc ccgggattac 900 gagcaaaaga aggttctgcg cctgacgtat ctcacgcagt actacccgca ggaggcacac 960 aaggccatag tcgactactg gttcatgcgc cacgggggcg tcgttccgcc gtattttgag 1020 gagtcgaagg gctacgagcc gccgcctgcc gccgatgggg gttcccccgc gccacccggc 1080 gacgacgagg cccgcgagga tgaaggggag accgaggacg gggcagccgg gcgggagggc 1140 aacggcggcc ccccaggacc cgaaggcgac ggcgagagtc agacccccga agccaacgga 1200 ggcgccgagg gcgagccgaa acccggcccc agccccgacg ccgaccgccc cgaaggctgg 1260 ccgagcctcg aagccatcac gcaccccccg cccgcccccg ctacgcccgc tcgagctcca 1320 gagcactggt catatggtct gcgtccgggt gaacattgga gctacggtct acgccccggg 1380 gaacactggt cttatggctt acggccggga gagcattgga gttacggcct ccgtccaggt 1440 t 1441 <210> 27 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 4GnRH-tmgD-4GnRH encoded by pQE-GnRH:gD:GnRH <400> 27 Met Arg Gly Ser His His His His His His Thr Asp Pro His Ala Met 1 5 10 15 Asp Pro Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser 20 25 30 Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 35 40 45 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ser Met Ser Leu Pro Thr 50 55 60 Pro Ala Pro Arg Val Thr Val Tyr Val Asp Pro Pro Ala Tyr Pro Met 65 70 75 80 Pro Arg Tyr Asn Tyr Thr Glu Arg Trp His Thr Thr Gly Pro Ile Pro 85 90 95 Ser Pro Phe Ala Asp Gly Arg Glu Gln Pro Val Glu Val Arg Tyr Ala 100 105 110 Thr Ser Ala Ala Ala Cys Asp Met Leu Ala Leu Ile Ala Asp Pro Gln 115 120 125 Val Gly Arg Thr Leu Trp Glu Ala Val Arg Arg His Ala Arg Ala Tyr 130 135 140 Asn Ala Thr Val Ile Trp Tyr Lys Ile Glu Ser Gly Cys Ala Arg Pro 145 150 155 160 Leu Tyr Tyr Met Glu Tyr Thr Glu Cys Glu Pro Arg Lys His Phe Gly 165 170 175 Tyr Cys Arg Tyr Arg Thr Pro Pro Phe Trp Asp Ser Phe Leu Ala Gly 180 185 190 Phe Ala Tyr Pro Thr Asp Asp Glu Leu Gly Leu Ile Met Ala Ala Pro 195 200 205 Ala Arg Leu Val Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Ala Leu Tyr Ile Asp Gly 210 215 220 Thr Val Ala Tyr Thr Asp Phe Met Val Ser Leu Pro Ala Gly Asp Cys 225 230 235 240 Trp Phe Ser Lys Leu Gly Ala Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Gly Ala Cys 245 250 255 Phe Pro Ala Arg Asp Tyr Glu Gln Lys Lys Val Leu Arg Leu Thr Tyr 260 265 270 Leu Thr Gln Tyr Tyr Pro Gln Glu Ala His Lys Ala Ile Val Asp Tyr 275 280 285 Trp Phe Met Arg His Gly Gly Val Val Pro Pro Tyr Phe Glu Glu Ser 290 295 300 Lys Gly Tyr Glu Pro Pro Pro Ala Ala Asp Gly Gly Ser Pro Ala Pro 305 310 315 320 Pro Gly Asp Asp Glu Ala Arg Glu Asp Glu Gly Glu Thr Glu Asp Gly 325 330 335 Ala Ala Gly Arg Glu Gly Asn Gly Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly Asp 340 345 350 Gly Glu Ser Gln Thr Pro Glu Ala Asn Gly Gly Ala Glu Gly Glu Pro 355 360 365 Lys Pro Gly Pro Ser Pro Asp Ala Asp Arg Pro Glu Gly Trp Pro Ser 370 375 380 Leu Glu Ala Ile Thr His Pro Pro Pro Ala Pro Ala Thr Pro Ala Arg 385 390 395 400 Ala Pro Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser 405 410 415 Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 420 425 430 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 435 440 <210> 28 <211> 1079 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: portion of pCMV-tgD, including sequence encoding a truncated gD <400> 28 gatatcatgc aggggccgac attggccgtg ctgggcgcgc tgctcgccgt tgcggtaagc 60 ttgcctacac ccgcgccgcg ggtgacggta tacgtcgacc cgccggcgta cccgatgccg 120 cgatacaact acactgaacg ctggcacact accgggccca taccgtcgcc cttcgcagac 180 ggccgcgagc agcccgtcga ggtgcgctac gcgacgagcg cggcggcgtg cgacatgctg 240 gcgctgatcg cagacccgca ggtggggcgc acgctgtggg aagcggtacg ccggcacgcg 300 cgcgcgtaca acgccacggt catatggtac aagatcgaga gcgggtgcgc ccggccgctg 360 tactacatgg agtacaccga gtgcgagccc aggaagcact ttgggtactg ccgctaccgc 420 acacccccgt tttgggacag cttcctggcg ggcttcgcct accccacgga cgacgagctg 480 ggactgatta tggcggcgcc cgcgcggctc gtcgagggcc agtaccgacg cgcgctgtac 540 atcgacggca cggtcgccta tacagatttc atggtttcgc tgccggccgg ggactgctgg 600 ttctcgaaac tcggcgcggc tcgcgggtac acctttggcg cgtgcttccc ggcccgggat 660 tacgagcaaa agaaggttct gcgcctgacg tatctcacgc agtactaccc gcaggaggca 720 cacaaggcca tagtcgacta ctggttcatg cgccacgggg gcgtcgttcc gccgtatttt 780 gaggagtcga agggctacga gccgccgcct gccgccgatg ggggttcccc cgcgccaccc 840 ggcgacgacg aggcccgcga ggatgaaggg gagaccgagg acggggcagc cgggcgggag 900 ggcaacggcg gccccccagg acccgaaggc gacggcgaga gtcagacccc cgaagccaac 960 ggaggcgccg agggcgagcc gaaacccggc cccagccccg acgccgaccg ccccgaggct 1020 ggccgagcct cgaagccatc acgcaccccc cgcccgcccc cgctacgccc tgaggtacc 1079 <210> 29 <211> 353 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: truncated gD encoded by pCMV-tgD <400> 29 Met Gln Gly Pro Thr Leu Ala Val Leu Gly Ala Leu Leu Ala Val Ser 1 5 10 15 Leu Pro Thr Pro Ala Pro Arg Val Thr Val Tyr Val Asp Pro Pro Ala 20 25 30 Tyr Pro Met Pro Arg Tyr Asn Tyr Thr Glu Arg Trp His Thr Thr Gly 35 40 45 Pro Ile Pro Ser Pro Phe Ala Asp Gly Arg Glu Gln Pro Val Glu Val 50 55 60 Arg Tyr Ala Thr Ser Ala Ala Ala Cys Asp Met Leu Ala Leu Ile Ala 65 70 75 80 Asp Pro Gln Val Gly Arg Thr Leu Trp Glu Ala Val Arg Arg His Ala 85 90 95 Arg Ala Tyr Asn Ala Thr Val Ile Trp Tyr Lys Ile Glu Ser Gly Cys 100 105 110 Ala Arg Pro Leu Tyr Tyr Met Glu Tyr Thr Glu Cys Glu Pro Arg Lys 115 120 125 His Phe Gly Tyr Cys Arg Tyr Arg Thr Pro Pro Phe Trp Asp Ser Phe 130 135 140 Leu Ala Gly Phe Ala Tyr Pro Thr Asp Asp Glu Leu Gly Leu Ile Met 145 150 155 160 Ala Ala Pro Ala Arg Leu Val Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Ala Leu Tyr 165 170 175 Ile Asp Gly Thr Val Ala Tyr Thr Asp Phe Met Val Ser Leu Pro Ala 180 185 190 Gly Asp Cys Trp Phe Ser Lys Leu Gly Ala Ala Arg Gly Tyr Thr Phe 195 200 205 Gly Ala Cys Phe Pro Ala Arg Asp Tyr Glu Gln Lys Lys Val Leu Arg 210 215 220 Leu Thr Tyr Leu Thr Gln Tyr Tyr Pro Gln Glu Ala His Lys Ala Ile 225 230 235 240 Val Asp Tyr Trp Phe Met Arg His Gly Gly Val Val Pro Pro Tyr Phe 245 250 255 Glu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Pro Pro Pro Ala Ala Asp Gly Gly Ser 260 265 270 Pro Ala Pro Pro Gly Asp Asp Glu Ala Arg Glu Asp Glu Gly Glu Thr 275 280 285 Glu Asp Gly Ala Ala Gly Arg Glu Gly Asn Gly Gly Pro Pro Gly Pro 290 295 300 Glu Gly Asp Gly Glu Ser Gln Thr Pro Glu Ala Asn Gly Gly Ala Glu 305 310 315 320 Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro Ser Pro Asp Ala Asp Arg Pro Glu Gly 325 330 335 Trp Pro Ser Leu Glu Ala Ile Thr His Pro Pro Pro Ala Pro Ala Thr 340 345 350 Pro <210> 30 <211> 1241 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: portion of pCMV-gD:GnRH, including sequence encoding a tgD-4GnRH fusion protein <400> 30 gcggccgcaa gatatcatgc aggggccgac attggccgtg ctgggcgcgc tgctcgccgt 60 tgcggtaagc ttgcctacac ccgcgccgcg ggtgacggta tacgtcgacc cgccggcgta 120 cccgatgccg cgatacaact acactgaacg ctggcacact accgggccca taccgtcgcc 180 cttcgcagac ggccgcgagc agcccgtcga ggtgcgctac gcgacgagcg cggcggcgtg 240 cgacatgctg gcgctgatcg cagacccgca ggtggggcgc acgctgtggg aagcggtacg 300 ccggcacgcg cgcgcgtaca acgccacggt catatggtac aagatcgaga gcgggtgcgc 360 ccggccgctg tactacatgg agtacaccga gtgcgagccc aggaagcact ttgggtactg 420 ccgctaccgc acacccccgt tttgggacag cttcctggcg ggcttcgcct accccacgga 480 cgacgagctg ggactgatta tggcggcgcc cgcgcggctc gtcgagggcc agtaccgacg 540 cgcgctgtac atcgacggca cggtcgccta tacagatttc atggtttcgc tgccggccgg 600 ggactgctgg ttctcgaaac tcggcgcggc tcgcgggtac acctttggcg cgtgcttccc 660 ggcccgggat tacgagcaaa agaaggttct gcgcctgacg tatctcacgc agtactaccc 720 gcaggaggca cacaaggcca tagtcgacta ctggttcatg cgccacgggg gcgtcgttcc 780 gccgtatttt gaggagtcga agggctacga gccgccgcct gccgccgatg ggggttcccc 840 cgcgccaccc ggcgacgacg aggcccgcga ggatgaaggg gagaccgagg acggggcagc 900 cgggcgggag ggcaacggcg gccccccagg acccgaaggc gacggcgaga gtcagacccc 960 cgaagccaac ggaggcgccg agggcgagcc gaaacccggc cccagccccg acgccgaccg 1020 ccccgaaggc tggccgagcc tcgaagccat cacgcacccc ccgcccgccc ccgctacgcc 1080 cgctcgagct ccagagcact ggtcatatgg tctgcgtccg ggtgaacatt ggagctacgg 1140 tctacgcccc ggggaacact ggtcttatgg cttacggccg ggagagcatt ggagttacgg 1200 cctccgtcca ggttgaagct gggatactag tgagcggccg c 1241 <210> 31 <211> 397 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: tgD-4GnRH fusion protein encoded by pCMV-gD:GnRH <400> 31 Met Gln Gly Pro Thr Leu Ala Val Leu Gly Ala Leu Leu Ala Val Ser 1 5 10 15 Leu Pro Thr Pro Ala Pro Arg Val Thr Val Tyr Val Asp Pro Pro Ala 20 25 30 Tyr Pro Met Pro Arg Tyr Asn Tyr Thr Glu Arg Trp His Thr Thr Gly 35 40 45 Pro Ile Pro Ser Pro Phe Ala Asp Gly Arg Glu Gln Pro Val Glu Val 50 55 60 Arg Tyr Ala Thr Ser Ala Ala Ala Cys Asp Met Leu Ala Leu Ile Ala 65 70 75 80 Asp Pro Gln Val Gly Arg Thr Leu Trp Glu Ala Val Arg Arg His Ala 85 90 95 Arg Ala Tyr Asn Ala Thr Val Ile Trp Tyr Lys Ile Glu Ser Gly Cys 100 105 110 Ala Arg Pro Leu Tyr Tyr Met Glu Tyr Thr Glu Cys Glu Pro Arg Lys 115 120 125 His Phe Gly Tyr Cys Arg Tyr Arg Thr Pro Pro Phe Trp Asp Ser Phe 130 135 140 Leu Ala Gly Phe Ala Tyr Pro Thr Asp Asp Glu Leu Gly Leu Ile Met 145 150 155 160 Ala Ala Pro Ala Arg Leu Val Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Ala Leu Tyr 165 170 175 Ile Asp Gly Thr Val Ala Tyr Thr Asp Phe Met Val Ser Leu Pro Ala 180 185 190 Gly Asp Cys Trp Phe Ser Lys Leu Gly Ala Ala Arg Gly Tyr Thr Phe 195 200 205 Gly Ala Cys Phe Pro Ala Arg Asp Tyr Glu Gln Lys Lys Val Leu Arg 210 215 220 Leu Thr Tyr Leu Thr Gln Tyr Tyr Pro Gln Glu Ala His Lys Ala Ile 225 230 235 240 Val Asp Tyr Trp Phe Met Arg His Gly Gly Val Val Pro Pro Tyr Phe 245 250 255 Glu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Pro Pro Pro Ala Ala Asp Gly Gly Ser 260 265 270 Pro Ala Pro Pro Gly Asp Asp Glu Ala Arg Glu Asp Glu Gly Glu Thr 275 280 285 Glu Asp Gly Ala Ala Gly Arg Glu Gly Asn Gly Gly Pro Pro Gly Pro 290 295 300 Glu Gly Asp Gly Glu Ser Gln Thr Pro Glu Ala Asn Gly Gly Ala Glu 305 310 315 320 Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro Ser Pro Asp Ala Asp Arg Pro Glu Gly 325 330 335 Trp Pro Ser Leu Glu Ala Ile Thr His Pro Pro Pro Ala Pro Ala Thr 340 345 350 Pro Ala Arg Ala Pro Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu 355 360 365 His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu 370 375 380 Arg Pro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 385 390 395 <210> 32 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence encoding a GnRH tetramer <400> 32 gagcactggt catatggtct gcgtccgggt gaacattgga gctacggtct acgccccggg 60 gaacactggt cttatggctt acggccggga gagcattgga gttacggcct ccgtccaggt 120 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence encoding a GnRH monomer <400> 33 gagcactggt catatggtct gcgtccgggt 30 <210> 34 <211> 1179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence encoding a 4GnRH-tmgD fusion protein <400> 34 gagcactggt catatggtct gcgtccgggt gaacattgga gctacggtct acgccccggg 60 gaacactggt cttatggctt acggccggga gagcattgga gttacggcct ccgtccaggt 120 tccatgagct tgcctacacc cgcgccgcgg gtgacggtat acgtcgaccc gccggcgtac 180 ccgatgccgc gatacaacta cactgaacgc tggcacacta ccgggcccat accgtcgccc 240 ttcgcagacg gccgcgagca gcccgtcgag gtgcgctacg cgacgagcgc ggcggcgtgc 300 gacatgctgg cgctgatcgc agacccgcag gtggggcgca cgctgtggga agcggtacgc 360 cggcacgcgc gcgcgtacaa cgccacggtc atatggtaca agatcgagag cgggtgcgcc 420 cggccgctgt actacatgga gtacaccgag tgcgagccca ggaagcactt tgggtactgc 480 cgctaccgca cacccccgtt ttgggacagc ttcctggcgg gcttcgccta ccccacggac 540 gacgagctgg gactgattat ggcggcgccc gcgcggctcg tcgagggcca gtaccgacgc 600 gcgctgtaca tcgacggcac ggtcgcctat acagatttca tggtttcgct gccggccggg 660 gactgctggt tctcgaaact cggcgcggct cgcgggtaca cctttggcgc gtgcttcccg 720 gcccgggatt acgagcaaaa gaaggttctg cgcctgacgt atctcacgca gtactacccg 780 caggaggcac acaaggccat agtcgactac tggttcatgc gccacggggg cgtcgttccg 840 ccgtattttg aggagtcgaa gggctacgag ccgccgcctg ccgccgatgg gggttccccc 900 gcgccacccg gcgacgacga ggcccgcgag gatgaagggg agaccgagga cggggcagcc 960 gggcgggagg gcaacggcgg ccccccagga cccgaaggcg acggcgagag tcagaccccc 1020 gaagccaacg gaggcgccga gggcgagccg aaacccggcc ccagccccga cgccgaccgc 1080 cccgaaggct ggccgagcct cgaagccatc acgcaccccc cgcccgcccc cgctacgccc 1140 gctcgagctc ggtaccccgg gtcgacctgc agccaagct 1179 <210> 35 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: a truncated mature BHV-1 gD <400> 35 Leu Pro Thr Pro Ala Pro Arg Val Thr Val Tyr Val Asp Pro Pro Ala 1 5 10 15 Tyr Pro Met Pro Arg Tyr Asn Tyr Thr Glu Arg Trp His Thr Thr Gly 20 25 30 Pro Ile Pro Ser Pro Phe Ala Asp Gly Arg Glu Gln Pro Val Glu Val 35 40 45 Arg Tyr Ala Thr Ser Ala Ala Ala Cys Asp Met Leu Ala Leu Ile Ala 50 55 60 Asp Pro Gln Val Gly Arg Thr Leu Trp Glu Ala Val Arg Arg His Ala 65 70 75 80 Arg Ala Tyr Asn Ala Thr Val Ile Trp Tyr Lys Ile Glu Ser Gly Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Leu Tyr Tyr Met Glu Tyr Thr Glu Cys Glu Pro Arg Lys 100 105 110 His Phe Gly Tyr Cys Arg Tyr Arg Thr Pro Pro Phe Trp Asp Ser Phe 115 120 125 Leu Ala Gly Phe Ala Tyr Pro Thr Asp Asp Glu Leu Gly Leu Ile Met 130 135 140 Ala Ala Pro Ala Arg Leu Val Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Ala Leu Tyr 145 150 155 160 Ile Asp Gly Thr Val Ala Tyr Thr Asp Phe Met Val Ser Leu Pro Ala 165 170 175 Gly Asp Cys Trp Phe Ser Lys Leu Gly Ala Ala Arg Gly Tyr Thr Phe 180 185 190 Gly Ala Cys Phe Pro Ala Arg Asp Tyr Glu Gln Lys Lys Val Leu Arg 195 200 205 Leu Thr Tyr Leu Thr Gln Tyr Tyr Pro Gln Glu Ala His Lys Ala Ile 210 215 220 Val Asp Tyr Trp Phe Met Arg His Gly Gly Val Val Pro Pro Tyr Phe 225 230 235 240 Glu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Pro Pro Pro Ala Ala Asp Gly Gly Ser 245 250 255 Pro Ala Pro Pro Gly Asp Asp Glu Ala Arg Glu Asp Glu Gly Glu Thr 260 265 270 Glu Asp Gly Ala Ala Gly Arg Glu Gly Asn Gly Gly Pro Pro Gly Pro 275 280 285 Glu Gly Asp Gly Glu Ser Gln Thr Pro Glu Ala Asn Gly Gly Ala Glu 290 295 300 Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro Ser Pro Asp Ala Asp Arg Pro Glu Gly 305 310 315 320 Trp Pro Ser Leu Glu Ala Ile Thr His Pro Pro Pro Ala Pro Ala Thr 325 330 335 Pro Ala Arg Ala 340 <210> 36 <211> 1020 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence encoding a truncated mature BHV-1 gD <400> 36 ttgcctacac ccgcgccgcg ggtgacggta tacgtcgacc cgccggcgta cccgatgccg 60 cgatacaact acactgaacg ctggcacact accgggccca taccgtcgcc cttcgcagac 120 ggccgcgagc agcccgtcga ggtgcgctac gcgacgagcg cggcggcgtg cgacatgctg 180 gcgctgatcg cagacccgca ggtggggcgc acgctgtggg aagcggtacg ccggcacgcg 240 cgcgcgtaca acgccacggt catatggtac aagatcgaga gcgggtgcgc ccggccgctg 300 tactacatgg agtacaccga gtgcgagccc aggaagcact ttgggtactg ccgctaccgc 360 acacccccgt tttgggacag cttcctggcg ggcttcgcct accccacgga cgacgagctg 420 ggactgatta tggcggcgcc cgcgcggctc gtcgagggcc agtaccgacg cgcgctgtac 480 atcgacggca cggtcgccta tacagatttc atggtttcgc tgccggccgg ggactgctgg 540 ttctcgaaac tcggcgcggc tcgcgggtac acctttggcg cgtgcttccc ggcccgggat 600 tacgagcaaa agaaggttct gcgcctgacg tatctcacgc agtactaccc gcaggaggca 660 cacaaggcca tagtcgacta ctggttcatg cgccacgggg gcgtcgttcc gccgtatttt 720 gaggagtcga agggctacga gccgccgcct gccgccgatg ggggttcccc cgcgccaccc 780 ggcgacgacg aggcccgcga ggatgaaggg gagaccgagg acggggcagc cgggcgggag 840 ggcaacggcg gccccccagg acccgaaggc gacggcgaga gtcagacccc cgaagccaac 900 ggaggcgccg agggcgagcc gaaacccggc cccagccccg acgccgaccg ccccgaaggc 960 tggccgagcc tcgaagccat cacgcacccc ccgcccgccc ccgctacgcc cgctcgagct 1020 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 6XHIS leader <400> 37 Met Arg Gly Ser His His His His His His Thr Asp Pro His Ala 1 5 10 15 <210> 38 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence encoding 6XHIS leader <400> 38 atgagaggat ctcaccatca ccatcaccat acggatccgc atgcc 45 <210> 39 <211> 1017 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: open reading frame for the 6XHIS leader, truncated mature gD, and GnRH tetramer encoded by bac-gD:GnRH <400> 39 atgagcttgc ctacacccgc gccgcgggtg acggtatacg tcgacccgcc ggcgtacccg 60 atgccgcgat acaactacac tgaacgctgg cacactaccg ggcccatacc gtcgcccttc 120 gcagacggcc gcgagcagcc cgtcgaggtg cgctacgcga cgagcgcggc ggcgtgcgac 180 atgctggcgc tgatcgcaga cccgcaggtg gggcgcacgc tgtgggaagc ggtacgccgg 240 cacgcgcgcg cgtacaacgc cacggtcata tggtacaaga tcgagagcgg gtgcgcccgg 300 ccgctgtact acatggagta caccgagtgc gagcccagga agcactttgg gtactgccgc 360 taccgcacac ccccgttttg ggacagcttc ctggcgggct tcgcctaccc cacggacgac 420 gagctgggac tgattatggc ggcgcccgcg cggctcgtcg agggccagta ccgacgcgcg 480 ctgtacatcg acggcacggt cgcctataca gatttcatgg tttcgctgcc ggccggggac 540 tgctggttct cgaaactcgg cgcggctcgc gggtacacct ttggcgcgtg cttcccggcc 600 cgggattacg agcaaaagaa ggttctgcgc ctgacgtatc tcacgcagta ctacccgcag 660 gaggcacaca aggccatagt cgactactgg ttcatgcgcc acgggggcgt cgttccgccg 720 tattttgagg agtcgaaggg ctacgagccg ccgcctgccg ccgatggggg ttcccccgcg 780 ccacccggcg acgacgaggc ccgcgaggat gaaggggaga ccgaggacgg ggcagccggg 840 cgggagggca acggcggccc cccaggaccc gaaggcgacg gcgagagtca gacccccgaa 900 gccaacggag gcgccgaggg cgagccgaaa cccggcccca gccccgacgc cgaccgcccc 960 gaaggctggc cgagcctcga agccatcacg caccccccgc ccgcccccgc tacgccc 1017 <210> 40 <211> 1272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence encoding a 4GnRH-tmgD-4GnRH fusion protein <400> 40 gagcactggt catatggtct gcgtccgggt gaacattgga gctacggtct acgccccggg 60 gaacactggt cttatggctt acggccggga gagcattgga gttacggcct ccgtccaggt 120 tccatgagct tgcctacacc cgcgccgcgg gtgacggtat acgtcgaccc gccggcgtac 180 ccgatgccgc gatacaacta cactgaacgc tggcacacta ccgggcccat accgtcgccc 240 ttcgcagacg gccgcgagca gcccgtcgag gtgcgctacg cgacgagcgc ggcggcgtgc 300 gacatgctgg cgctgatcgc agacccgcag gtggggcgca cgctgtggga agcggtacgc 360 cggcacgcgc gcgcgtacaa cgccacggtc atatggtaca agatcgagag cgggtgcgcc 420 cggccgctgt actacatgga gtacaccgag tgcgagccca ggaagcactt tgggtactgc 480 cgctaccgca cacccccgtt ttgggacagc ttcctggcgg gcttcgccta ccccacggac 540 gacgagctgg gactgattat ggcggcgccc gcgcggctcg tcgagggcca gtaccgacgc 600 gcgctgtaca tcgacggcac ggtcgcctat acagatttca tggtttcgct gccggccggg 660 gactgctggt tctcgaaact cggcgcggct cgcgggtaca cctttggcgc gtgcttcccg 720 gcccgggatt acgagcaaaa gaaggttctg cgcctgacgt atctcacgca gtactacccg 780 caggaggcac acaaggccat agtcgactac tggttcatgc gccacggggg cgtcgttccg 840 ccgtattttg aggagtcgaa gggctacgag ccgccgcctg ccgccgatgg gggttccccc 900 gcgccacccg gcgacgacga ggcccgcgag gatgaagggg agaccgagga cggggcagcc 960 gggcgggagg gcaacggcgg ccccccagga cccgaaggcg acggcgagag tcagaccccc 1020 gaagccaacg gaggcgccga gggcgagccg aaacccggcc ccagccccga cgccgaccgc 1080 cccgaaggct ggccgagcct cgaagccatc acgcaccccc cgcccgcccc cgctacgccc 1140 gctcgagctc cagagcactg gtcatatggt ctgcgtccgg gtgaacattg gagctacggt 1200 ctacgccccg gggaacactg gtcttatggc ttacggccgg gagagcattg gagttacggc 1260 ctccgtccag gt 1272 <210> 41 <211> 1144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence encoding a tmgD-4GnRH fusion protein <400> 41 cttgcctaca cccgcgccgc gggtgacggt atacgtcgac ccgccggcgt acccgatgcc 60 gcgatacaac tacactgaac gctggcacac taccgggccc ataccgtcgc ccttcgcaga 120 cggccgcgag cagcccgtcg aggtgcgcta cgcgacgagc gcggcggcgt gcgacatgct 180 ggcgctgatc gcagacccgc aggtggggcg cacgctgtgg gaagcggtac gccggcacgc 240 gcgcgcgtac aacgccacgg tcatatggta caagatcgag agcgggtgcg cccggccgct 300 gtactacatg gagtacaccg agtgcgagcc caggaagcac tttgggtact gccgctaccg 360 cacacccccg ttttgggaca gcttcctggc gggcttcgcc taccccacgg acgacgagct 420 gggactgatt atggcggcgc ccgcgcggct cgtcgagggc cagtaccgac gcgcgctgta 480 catcgacggc acggtcgcct atacagattt catggtttcg ctgccggccg gggactgctg 540 gttctcgaaa ctcggcgcgg ctcgcgggta cacctttggc gcgtgcttcc cggcccggga 600 ttacgagcaa aagaaggttc tgcgcctgac gtatctcacg cagtactacc cgcaggaggc 660 acacaaggcc atagtcgact actggttcat gcgccacggg ggcgtcgttc cgccgtattt 720 tgaggagtcg aagggctacg agccgccgcc tgccgccgat gggggttccc ccgcgccacc 780 cggcgacgac gaggcccgcg aggatgaagg ggagaccgag gacggggcag ccgggcggga 840 gggcaacggc ggccccccag gacccgaagg cgacggcgag agtcagaccc ccgaagccaa 900 cggaggcgcc gagggcgagc cgaaacccgg ccccagcccc gacgccgacc gccccgaagg 960 ctggccgagc ctcgaagcca tcacgcaccc cccgcccgcc cccgctacgc ccgctcgagc 1020 tccagagcac tggtcatatg gtctgcgtcc gggtgaacat tggagctacg gtctacgccc 1080 cggggaacac tggtcttatg gcttacggcc gggagagcat tggagttacg gcctccgtcc 1140 aggt 1144 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P14-S1 <400> 42 ggagctccag agcactggtc ata 23 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer P14-A138 <400> 43 aaagcttcaa cctggacgga ggcc 24 <210> 44 <211> 215 <212> PRT <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <400> 44 Met Lys Lys Ala Val Leu Ala Ala Val Leu Gly Gly Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ser Ala Met Ala His Gln Ala Gly Asp Val Ile Phe Arg Ala Gly 20 25 30 Ala Ile Gly Val Ile Ala Asn Ser Ser Ser Asp Tyr Gln Thr Gly Ala 35 40 45 Asp Val Asn Leu Asp Val Asn Asn Asn Ile Gln Leu Gly Leu Thr Gly 50 55 60 Thr Tyr Met Leu Ser Asp Asn Leu Gly Leu Glu Leu Leu Ala Ala Thr 65 70 75 80 Pro Phe Ser His Lys Ile Thr Gly Lys Leu Gly Ala Thr Asp Leu Gly 85 90 95 Glu Val Ala Lys Val Lys His Leu Pro Pro Ser Leu Tyr Leu Gln Tyr 100 105 110 Tyr Phe Phe Asp Ser Asn Ala Thr Val Arg Pro Tyr Val Gly Ala Gly 115 120 125 Leu Asn Tyr Thr Arg Phe Phe Ser Ala Glu Ser Leu Lys Pro Gln Leu 130 135 140 Val Gln Asn Leu Arg Val Lys Lys His Ser Val Ala Pro Ile Ala Asn 145 150 155 160 Leu Gly Val Asp Val Lys Leu Thr Asp Asn Leu Ser Phe Asn Ala Ala 165 170 175 Ala Trp Tyr Thr Arg Ile Lys Thr Thr Ala Asp Tyr Asp Val Pro Gly 180 185 190 Leu Gly His Val Ser Thr Pro Ile Thr Leu Asp Pro Val Val Leu Phe 195 200 205 Ser Gly Ile Ser Tyr Lys Phe 210 215 <210> 45 <211> 364 <212> PRT <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <400> 45 Met Lys Lys Ser Leu Val Ala Leu Thr Val Leu Ser Ala Ala Ala Val 1 5 10 15 Ala Gln Ala Ala Pro Gln Gln Asn Thr Phe Tyr Ala Gly Ala Lys Ala 20 25 30 Gly Trp Ala Ser Phe His Asp Gly Ile Glu Gln Leu Asp Ser Ala Lys 35 40 45 Asn Thr Asp Arg Gly Thr Lys Tyr Gly Ile Asn Arg Asn Ser Val Thr 50 55 60 Tyr Gly Val Phe Gly Gly Tyr Gln Ile Leu Asn Gln Asp Lys Leu Gly 65 70 75 80 Leu Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Asp Tyr Phe Gly Arg Val Arg Gly Ser 85 90 95 Glu Lys Pro Asn Gly Lys Ala Asp Lys Lys Thr Phe Arg His Ala Ala 100 105 110 His Gly Ala Thr Ile Ala Leu Lys Pro Ser Tyr Glu Val Leu Pro Asp 115 120 125 Leu Asp Val Tyr Gly Lys Val Gly Ile Ala Leu Val Asn Asn Thr Tyr 130 135 140 Lys Thr Phe Asn Ala Ala Gln Glu Lys Val Lys Thr Arg Arg Phe Gln 145 150 155 160 Ser Ser Leu Ile Leu Gly Ala Gly Val Glu Tyr Ala Ile Leu Pro Glu 165 170 175 Leu Ala Ala Arg Val Glu Tyr Gln Trp Leu Asn Asn Ala Gly Lys Ala 180 185 190 Ser Tyr Ser Thr Leu Asn Arg Met Gly Ala Thr Asp Tyr Arg Ser Asp 195 200 205 Ile Ser Ser Val Ser Ala Gly Leu Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Gly Ala 210 215 220 Val Pro Val Ala Ala Pro Ala Val Glu Thr Lys Asn Phe Ala Phe Ser 225 230 235 240 Ser Asp Val Leu Phe Ala Phe Gly Lys Ser Asn Leu Lys Pro Ala Ala 245 250 255 Ala Thr Ala Leu Asp Ala Met Gln Thr Glu Ile Asn Asn Ala Gly Leu 260 265 270 Ser Asn Ala Ala Ile Gln Val Asn Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Lys 275 280 285 Glu Ala Ser Asn Leu Lys Leu Ser Gln Arg Arg Ala Glu Thr Val Ala 290 295 300 Asn Tyr Ile Val Ser Lys Gly Ala Pro Ala Ala Asn Val Thr Ala Val 305 310 315 320 Gly Tyr Gly Glu Ala Asn Pro Val Thr Gly Ala Thr Cys Asp Lys Val 325 330 335 Lys Gly Arg Lys Ala Leu Ile Ala Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val 340 345 350 Glu Val Gln Val Gln Gly Thr Lys Glu Val Thr Met 355 360 <210> 46 <211> 369 <212> PRT <213> Actinobacillus pleuropneumoniae <400> 46 Met Lys Lys Ser Leu Val Ala Leu Ala Val Leu Ser Ala Ala Ala Val 1 5 10 15 Ala Gln Ala Ala Pro Gln Gln Asn Thr Phe Tyr Ala Gly Ala Lys Val 20 25 30 Gly Gln Ser Ser Phe His His Gly Val Asn Gln Leu Lys Ser Gly His 35 40 45 Asp Asp Arg Tyr Asn Asp Lys Thr Arg Lys Tyr Gly Ile Asn Arg Asn 50 55 60 Ser Val Thr Tyr Gly Val Phe Gly Gly Tyr Gln Ile Leu Asn Gln Asn 65 70 75 80 Asn Phe Gly Leu Ala Thr Glu Leu Gly Tyr Asp Tyr Tyr Gly Arg Val 85 90 95 Arg Gly Asn Asp Gly Glu Phe Arg Ala Met Lys His Ser Ala His Gly 100 105 110 Leu Asn Phe Ala Leu Lys Pro Ser Tyr Glu Val Leu Pro Asp Leu Asp 115 120 125 Val Tyr Gly Lys Val Gly Val Ala Val Val Arg Asn Asp Tyr Lys Ser 130 135 140 Tyr Gly Ala Glu Asn Thr Asn Glu Pro Thr Glu Lys Phe His Lys Leu 145 150 155 160 Lys Ala Ser Thr Ile Leu Gly Ala Gly Val Glu Tyr Ala Ile Leu Pro 165 170 175 Glu Leu Ala Ala Arg Val Glu Tyr Gln Tyr Leu Asn Lys Ala Gly Asn 180 185 190 Leu Asn Lys Ala Leu Val Arg Ser Gly Thr Gln Asp Val Asp Phe Gln 195 200 205 Tyr Ala Pro Asp Ile His Ser Val Thr Ala Gly Leu Ser Tyr Arg Phe 210 215 220 Gly Gln Gly Ala Val Ala Pro Val Val Glu Pro Glu Val Val Thr Lys 225 230 235 240 Asn Phe Ala Phe Ser Ser Asp Val Leu Phe Asp Phe Gly Lys Ser Ser 245 250 255 Leu Lys Pro Ala Ala Ala Thr Ala Leu Asp Ala Ala Asn Thr Glu Ile 260 265 270 Ala Asn Leu Gly Leu Ala Thr Pro Ala Ile Gln Val Asn Gly Tyr Thr 275 280 285 Asp Arg Ile Gly Lys Glu Ala Ser Asn Leu Lys Leu Ser Gln Arg Arg 290 295 300 Ala Glu Thr Val Ala Asn Tyr Leu Val Ser Lys Gly Gln Asn Pro Ala 305 310 315 320 Asn Val Thr Ala Val Gly Tyr Gly Glu Ala Asn Pro Val Thr Gly Ala 325 330 335 Thr Cys Asp Lys Val Lys Gly Arg Lys Ala Leu Ile Ala Cys Leu Ala 340 345 350 Pro Asp Arg Arg Val Glu Val Gln Val Gln Gly Ala Lys Asn Val Ala 355 360 365 Met
【図面の簡単な説明】
【図１】 （図１）：gD/GnRH融合の構築物：本発明に
したがい構築される融合タンパク質を示す。これらの構
築物中のgDは成熟しており（シグナル配列が除去されて
いる）切頭（膜貫通ドメインおよび残存3'配列が除去さ
れている）されている。GnRHは四量体型である。
【図２】 （図２）：GnRH四量体クローン、アニーリン
グしたGnRHオリゴヌクレオチド（配列番号7および8に示
される）のC末端を、二量体クローン98BS/GnR中のGnRH
配列（配列番号9および10に示されるオリゴヌクレオチ
ドをアニーリングしたもの）に融合することにより構築
されている。プラスミドpBS KS+（Stratagene）由来の
隣接配列およびその中のクローニング部位もまた、示し
ている。本ヌクレオチド配列は、配列番号14に示され
る。コードされるアミノ酸配列（配列番号15）もまた、
示している。
【図３】 （図3Ａ）：クローンFlgD/Pots207nco（#7
9）内のBHV-1 gDをコードするヌクレオチド配列（配列
番号16）並びに、コードされるポリアミノ酸gD配列（配
列番号17）。ヌクレオチド3−56はシグナル配列をコー
ドし；ヌクレオチド1092−1169は膜貫通ドメインをコー
ドする。ヌクレオチド57−1259は成熟gDをコードし、そ
してヌクレオチド57−1076は、切頭成熟gDをコードす
る。「Gly」は、グリコシル化領域を表す。gDコード配
列に隣接するベクター配列を示す。
【図４】 （図3Ｂ）：クローンFlgD/Pots207nco（#7
9）内のBHV-1 gDをコードするヌクレオチド配列（配列
番号16）並びに、コードされるポリアミノ酸gD配列（配
列番号17）。ヌクレオチド3−56はシグナル配列をコー
ドし；ヌクレオチド1092−1169は膜貫通ドメインをコー
ドする。ヌクレオチド57−1259は成熟gDをコードし、そ
してヌクレオチド57−1076は、切頭成熟gDをコードす
る。「Gly」は、グリコシル化領域を表す。gDコード配
列に隣接するベクター配列を示す。
【図５】 （図3Ｃ）：クローンFlgD/Pots207nco（#7
9）内のBHV-1 gDをコードするヌクレオチド配列（配列
番号16）並びに、コードされるポリアミノ酸gD配列（配
列番号17）。ヌクレオチド3−56はシグナル配列をコー
ドし；ヌクレオチド1092−1169は膜貫通ドメインをコー
ドする。ヌクレオチド57−1259は成熟gDをコードし、そ
してヌクレオチド57−1076は、切頭成熟gDをコードす
る。「Gly」は、グリコシル化領域を表す。gDコード配
列に隣接するベクター配列を示す。
【図６】 （図４Ａ）：クローンFlgD/Pots207nco（#7
9）由来のBHV-1 gD（gD/Pots、上段配列）およびGenBan
k寄託番号M59846を有するBHV-1 gD（下段配列）（Tikoo
ら, 1990、上記）（米国バイオテクノロジー情報センタ
ー（NCBI、メリーランド州ベセスダ）のGenBank DNA配
列データベース）を比較する並列レポート（DNA並
列）。本レポートには、加重残基重表を用いるクラスタ
ー法（clustal method）を用いた。「TM」は膜貫通ドメ
インを表す。FlgD/Pots207nco（#79）クローン中の囲ん
だ残基は、M59846中の残基と異なるものである。M59846
DNAは配列番号18である。
【図７】 （図４Ｂ）：クローンFlgD/Pots207nco（#7
9）由来のBHV-1 gD（gD/Pots、上段配列）およびGenBan
k寄託番号M59846を有するBHV-1 gD（下段配列）（Tikoo
ら, 1990、上記）（米国バイオテクノロジー情報センタ
ー（NCBI、メリーランド州ベセスダ）のGenBank DNA配
列データベース）を比較する並列レポート（DNA並
列）。本レポートには、加重残基重表を用いるクラスタ
ー法（clustal method）を用いた。「TM」は膜貫通ドメ
インを表す。FlgD/Pots207nco（#79）クローン中の囲ん
だ残基は、M59846中の残基と異なるものである。M59846
DNAは配列番号18である。
【図８】 （図４Ｃ）：クローンFlgD/Pots207nco（#7
9）由来のBHV-1 gD（gD/Pots、上段配列）およびGenBan
k寄託番号M59846を有するBHV-1 gD（下段配列）（Tikoo
ら, 1990、上記）（米国バイオテクノロジー情報センタ
ー（NCBI、メリーランド州ベセスダ）のGenBank DNA配
列データベース）を比較する並列レポート（DNA並
列）。本レポートには、加重残基重表を用いるクラスタ
ー法（clustal method）を用いた。「TM」は膜貫通ドメ
インを表す。FlgD/Pots207nco（#79）クローン中の囲ん
だ残基は、M59846中の残基と異なるものである。M59846
DNAは配列番号18である。
【図９】 （図５）：gD/Pots（下段配列）およびM5984
6（上段配列）の間のアミノ酸並列。PAM250残基重表を
用いるクラスター法を用いた。M59846中の残基と異なる
gD/Pots中の残基を囲んでいる。M59846は配列番号19で
ある。
【図１０】 （図６Ａ）：pQE-tmgD。tmgDの配列をコー
ドするヌクレオチド配列で、プラスミドpQE-31が隣接
し、tmgD（配列番号20）に連結して発現される6XHISタ
グをコードする配列を含む。連結している6XHISタグを
含むtmgDのアミノ酸配列もまた示す（配列番号21）。
【図１１】 （図６Ｂ）：pQE-tmgD。tmgDの配列をコー
ドするヌクレオチド配列で、プラスミドpQE-31が隣接
し、tmgD（配列番号20）に連結して発現される6XHISタ
グをコードする配列を含む。連結している6XHISタグを
含むtmgDのアミノ酸配列もまた示す（配列番号21）。
【図１２】 （図６Ｃ）：pQE-tmgD。tmgDの配列をコー
ドするヌクレオチド配列で、プラスミドpQE-31が隣接
し、tmgD（配列番号20）に連結して発現される6XHISタ
グをコードする配列を含む。連結している6XHISタグを
含むtmgDのアミノ酸配列もまた示す（配列番号21）。
【図１３】 （図６Ｄ）：pQE-tmgD。tmgDの配列をコー
ドするヌクレオチド配列で、プラスミドpQE-31が隣接
し、tmgD（配列番号20）に連結して発現される6XHISタ
グをコードする配列を含む。連結している6XHISタグを
含むtmgDのアミノ酸配列もまた示す（配列番号21）。
【図１４】 （図７Ａ）：プラスミドpQE-GnRH:gDのヌ
クレオチドコード配列および隣接配列（配列番号22）。
6XHISタグを含む4GnRH-tmgD融合タンパク質のアミノ酸
配列もまた示す（配列番号23）。
【図１５】 （図７Ｂ）：プラスミドpQE-GnRH:gDのヌ
クレオチドコード配列および隣接配列（配列番号22）。
6XHISタグを含む4GnRH-tmgD融合タンパク質のアミノ酸
配列もまた示す（配列番号23）。
【図１６】 （図７Ｃ）：プラスミドpQE-GnRH:gDのヌ
クレオチドコード配列および隣接配列（配列番号22）。
6XHISタグを含む4GnRH-tmgD融合タンパク質のアミノ酸
配列もまた示す（配列番号23）。
【図１７】 （図７Ｄ）：プラスミドpQE-GnRH:gDのヌ
クレオチドコード配列および隣接配列（配列番号22）。
6XHISタグを含む4GnRH-tmgD融合タンパク質のアミノ酸
配列もまた示す（配列番号23）。
【図１８】 （図８Ａ）：pQE-gD:GnRH。ヌクレオチド
コード配列およびプラスミド隣接配列を示す（配列番号
24）。6XHISタグを含むtmgD-4GnRHのアミノ酸配列もま
た示す（配列番号25）。
【図１９】 （図８Ｂ）：pQE-gD:GnRH。ヌクレオチド
コード配列およびプラスミド隣接配列を示す（配列番号
24）。6XHISタグを含むtmgD-4GnRHのアミノ酸配列もま
た示す（配列番号25）。
【図２０】 （図８Ｃ）：pQE-gD:GnRH。ヌクレオチド
コード配列およびプラスミド隣接配列を示す（配列番号
24）。6XHISタグを含むtmgD-4GnRHのアミノ酸配列もま
た示す（配列番号25）。
【図２１】 （図８Ｄ）：pQE-gD:GnRH。ヌクレオチド
コード配列およびプラスミド隣接配列を示す（配列番号
24）。6XHISタグを含むtmgD-4GnRHのアミノ酸配列もま
た示す（配列番号25）。
【図２２】 （図９Ａ）：pQE-GnRH:gD:GnRH。ヌクレオ
チドコード配列およびプラスミド隣接配列を示す（配列
番号26）。6XHISタグを含む4GnRH-tmgD-4GnRHのアミノ
酸配列もまた示す（配列番号27）。
【図２３】 （図９Ｂ）：pQE-GnRH:gD:GnRH。ヌクレオ
チドコード配列およびプラスミド隣接配列を示す（配列
番号26）。6XHISタグを含む4GnRH-tmgD-4GnRHのアミノ
酸配列もまた示す（配列番号27）。
【図２４】 （図９Ｃ）：pQE-GnRH:gD:GnRH。ヌクレオ
チドコード配列およびプラスミド隣接配列を示す（配列
番号26）。6XHISタグを含む4GnRH-tmgD-4GnRHのアミノ
酸配列もまた示す（配列番号27）。
【図２５】 （図９Ｄ）：pQE-GnRH:gD:GnRH。ヌクレオ
チドコード配列およびプラスミド隣接配列を示す（配列
番号26）。6XHISタグを含む4GnRH-tmgD-4GnRHのアミノ
酸配列もまた示す（配列番号27）。
【図２６】 （図１０）細菌ベクターpQE構築物由来の
発現産物の比較。「A」はpQE-tmgDであり、「B」はpQE-
gD:GnRHであり、「C」はpQE-GnRH:gDであり、そして
「D」はpQE-GnRH:gD:GnRHである。gD部分、GnRH四量
体、および6XHISタグを連結するアミノ酸を本図中に示
す。
【図２７】 （図１１Ａ）：切頭gDをコードするプラス
ミドpCMV-tgD由来のヌクレオチド配列（配列番号28）、
およびシグナル配列を含む切頭gD発現産物の推定される
アミノ酸配列（配列番号29）。
【図２８】 （図１１Ｂ）：切頭gDをコードするプラス
ミドpCMV-tgD由来のヌクレオチド配列（配列番号28）、
およびシグナル配列を含む切頭gD発現産物の推定される
アミノ酸配列（配列番号29）。
【図２９】 （図１１Ｃ）：切頭gDをコードするプラス
ミドpCMV-tgD由来のヌクレオチド配列（配列番号28）、
およびシグナル配列を含む切頭gD発現産物の推定される
アミノ酸配列（配列番号29）。
【図３０】 （図１２Ａ）：tgD-4GnRH融合タンパク質
をコードするプラスミドpCMV-gD:GnRH（ATCC寄託番号20
3370）由来のヌクレオチド配列（配列番号30）と共に、
シグナル配列を含む融合タンパク質産物の推定されるア
ミノ酸配列（配列番号31）。
【図３１】 （図１２Ｂ）：tgD-4GnRH融合タンパク質
をコードするプラスミドpCMV-gD:GnRH（ATCC寄託番号20
3370）由来のヌクレオチド配列（配列番号30）と共に、
シグナル配列を含む融合タンパク質産物の推定されるア
ミノ酸配列（配列番号31）。
【図３２】 （図１２Ｃ）：tgD-4GnRH融合タンパク質
をコードするプラスミドpCMV-gD:GnRH（ATCC寄託番号20
3370）由来のヌクレオチド配列（配列番号30）と共に、
シグナル配列を含む融合タンパク質産物の推定されるア
ミノ酸配列（配列番号31）。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年３月２日（２０００．３．２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/566 // Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 セルジュ・ルネ・マルティノ アメリカ合衆国コネチカット州06355，ミ スティク，メイソンズ・アイランド・ロー ド ７ (72)発明者 テレシタ・ドロレス・ユール アメリカ合衆国コネチカット州06360，ノ ーウィッチ，イースト・アベニュー １

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 脊椎動物において二重免疫反応を生じ
    させるための融合タンパク質であって： （a）該脊椎動物内で内因的に合成され、その活性が該
    脊椎動物内で阻害されるべきである、ペプチドのすべて
    または一部に対し類似の第一のタンパク質性部分であっ
    て、それ自体で前記脊椎動物において有効な免疫阻害性
    反応を引き出すことが不可能である、前記タンパク質性
    部分；と連結している （b）該脊椎動物を病原的に感染させることが可能な病
    原体由来の免疫原のすべてまたは一部に対し類似の第二
    のタンパク質性部分を含み；該脊椎動物が該融合タンパ
    ク質の有効量をワクチン投与されているときには、部分
    （b）が該脊椎動物の免疫系に部分（a）を認識させ、そ
    して次の反応： （i）該脊椎動物内で内因的に合成される該ペプチドの
    活性を阻害し；そして（ii）該病原体による感染から該
    脊椎動物を防御する該反応を生じさせる、前記融合タン
    パク質。
  2. 【請求項２】 GnRHペプチドのすべてまたは一部に対
    し類似の部分（a）およびBHV-1抗原のすべてまたは一部
    に対し類似の部分（b）を含む、請求項1の融合タンパク
    質。
  3. 【請求項３】 脊椎動物において免疫反応を生じさせ
    るための融合タンパク質であって； （a）その活性が該脊椎動物内で阻害されるべきであ
    る、ペプチドのすべてまたは一部に対し類似の第一のタ
    ンパク質性部分であって、それ自体で前記脊椎動物にお
    いて有効な免疫阻害性反応を引き出すことが不可能であ
    る、前記タンパク質性部分；と連結している （b）BHV-1抗原のすべてまたは一部に対し類似の第二の
    タンパク質性部分を含み；該脊椎動物が該融合タンパク
    質の有効量をワクチン投与されているときには、第二の
    タンパク質性部分（b）が該脊椎動物の免疫系に第一の
    タンパク質性部分（a）を認識させ、そして該脊椎動物
    内の該ペプチドの活性を阻害することが可能な免疫反応
    を生じさせる、前記融合タンパク質。
  4. 【請求項４】 GnRHペプチドのすべてまたは一部に対
    し類似の部分（a）を含む、請求項3の融合タンパク質。
  5. 【請求項５】 部分（b）がBHV-1 gDのすべてまたは
    一部に対し類似である、請求項3の融合タンパク質。
  6. 【請求項６】 請求項1または3の融合タンパク質をコ
    ードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド分
    子。
  7. 【請求項７】 請求項6のポリヌクレオチド分子を含
    むベクター。
  8. 【請求項８】 融合タンパク質のin vitro発現に適し
    た、請求項7のベクター。
  9. 【請求項９】 融合タンパク質のin vivo発現に適し
    た、請求項7のベクター。
  10. 【請求項１０】 請求項1または4の融合タンパク質を
    コードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分
    子を含む、形質転換細胞。
  11. 【請求項１１】 請求項1の融合タンパク質、請求項7
    のベクター、または請求項10の形質転換細胞を、融合タ
    ンパク質の部分（a）が由来するペプチドを内因的に合
    成し、そして融合タンパク質の部分（b）が由来する病
    原体により病原的に感染することが可能である脊椎動物
    において、該ペプチドの活性を阻害し、そして該病原体
    による感染に対し防御するのに有効な量で、薬学的また
    は獣医学的使用に許容されるキャリヤーと共に含む、二
    重機能ワクチン。
  12. 【請求項１２】 ウシにおいてGnRH活性を阻害し、そ
    してBHV-1感染に対しウシを防御するための二重機能ワ
    クチンであって、請求項2の融合タンパク質、請求項7の
    ベクター、または請求項10の形質転換細胞を、GnRH活性
    を阻害し、そしてBHV-1感染に対しウシを防御する量
    で、薬学的または獣医学的使用に許容されるキャリヤー
    と共に含む、前記二重機能ワクチン。
  13. 【請求項１３】 脊椎動物においてペプチド活性を阻
    害するためのワクチンであって、請求項3の融合タンパ
    ク質、請求項7のベクター、または請求項10の形質転換
    細胞を、ペプチド活性を阻害するのに有効な量で、薬学
    的または獣医学的使用に許容されるキャリヤーと共に含
    む、前記ワクチン。
  14. 【請求項１４】 脊椎動物において内因的に合成され
    るペプチドの活性を阻害し、そして病原的感染から該脊
    椎動物を防御するための方法であって、該脊椎動物を請
    求項11のワクチンの、該ペプチドの活性を阻害し、そし
    て該病原体による感染に対し防御するのに有効である量
    で免疫することを含む、前記方法。
  15. 【請求項１５】 乳牛において性的特性を阻害し、そ
    してBHV-1感染に対し乳牛を防御するための方法であっ
    て、乳牛を請求項12のワクチンの、性的特性を阻害し、
    そしてBHV-1感染に対し防御するのに有効である量で免
    疫することを含む、前記方法。
  16. 【請求項１６】 脊椎動物においてペプチドの活性を
    阻害するための方法であって、該脊椎動物を請求項13の
    ワクチンの、該ペプチドの活性を阻害するのに有効であ
    る量で免疫することを含む、前記方法。
  17. 【請求項１７】 脊椎動物において性的特性を阻害す
    るための方法であって、該脊椎動物を、請求項13のワク
    チンであって、前記ワクチンにおける融合タンパク質、
    ベクター、または形質転換細胞が、GnRHペプチドのすべ
    てまたは一部に対し類似のアミノ酸配列を含むまたは該
    アミノ酸配列をコードする、該ワクチンの、性的特性を
    阻害するのに有効である量で免疫することを含む、前記
    方法。
JP2000039532A 1999-02-17 2000-02-17 二重免疫反応を誘導することが可能なキャリヤーを含む融合タンパク質 Pending JP2000236887A (ja)

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