KR20010081018A - 항원 유전자 서열의 동정 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 잠재적 백신 항원의 유전자 서열을 동정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에는 유전자 서열 및 이 유전자 서열로 암호화되는 폴리펩티드와, 동물에서 보호 면역 반응을 유도하기 위한 이러한 서열의 사용이 포함된다. 본 발명은 특히 마이코플라스마, 특히 마이코플라스마 하이오뉴모니아의 잠재적 유전자 서열 동정에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 발현 벡터의 뉴클레오티드 서열로부터 번역된 발현 단백질의 동정 방법이 제공되며, 상기 방법은 뉴클레오티드 서열로부터 번역된 단백질과 공동-발현되는 마커를 사용하는 것을 포함하여 이루어진다. 본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 뉴클레오티드 서열 시료로부터 치료 항원 단백질을 암호화하는 치료 항원 유전자 서열을 동정하는 방법이 제공된다. 마커는 폴리히스티딘 태그가 바람직하다.
Description
병원균에 대하여 백신이 성공을 거두기 위해서는, 숙주 면역계에 쉽게 접근할 수 있는 병원균의 적당한 항원을 동정해야 한다. 항원이 일단 동정되면, 병원균에 대한 보호의 기본을 형성할 수 있다.
최근 동물 건강 회사(Animal Health companies)를 통하여 다수의 백신이 상업화되고 있다. 많은 백신은 불활성화된 전체 세포 박테린에 기초한다. 이러한 백신이 합리적인 수준의 효능을 제공한다고 하더라도 개선의 여지가 상당하다. 따라서, 전체 세포 또는 전체 세포 단편에 기초하지 않는 백신을 개발함으로써 현재 이용가능한 백신을 개선할 수 있다.
병원균에 대한 백신을 생성하는 다른 방법에는 다양한 단백질의 미정제 불활성 항원 조혼합물을 사용하는 것이 포함된다. 그러나, 이러한 방법은 숙주에 다양한 항원을 제공하지만, 숙주 면역계에 쉽게 접근가능한 대부분의 단백질이 다른 항원에 의해 방해를 받으므로 이 중 어떤 방법도 적당한 총체적인 보호를 제공하지 못한다는 문제점이 있다. 또한, 일부 병원균은 까다로운 필요조건 때문에 증식하기 어렵거나 비용이 많이 든다. 어떤 병원균은 또한 취급하기 위험하다. 따라서, 세포 또는 박테리아의 증식 및 전체 세포 또는 전체 세포의 단편의 처리를 필요로 하지 않는 백신은 더 안전하고, 값싸고, 아마 더 효능있는 백신을 제공한다.
더 깨끗하고 더 특이적인 백신을 얻는 한 방법은 재조합 보호 항원을 사용하는 것이다. 특이적 항원을 제공함으로써, 숙주 면역계에 쉽게 접근할 수 있는 항원만을 사용할 수 있다.
문제는 잠재적 항원의 동정이다. 한 가지 방법은 유전자 라이브러리를 만드는 것이다. 그러나, 이 라이브러리로부터 잠재적 보호 항원을 포함할 수 있는 서열을 결정하는 것은 매우 많은 시간이 소모된다.
다수의 잠재적인 항원 유전자를 통해 질병으로부터 어떤 수준의 보호를 제공하는 이들의 효능을 효과적으로 선별하기 위해, 이들을 초기에 발현 클론으로서 클로닝하는 것이 유용하다. 이 방법에서는 지루하고 시간 낭비적인 클론 분석 및 이어지는 발현 서브클로닝이 불필요하다. 항원 발견의 전체 공정은 가속화된다. 이제 본 출원인들은, 처음 조사된 클론이 재조합 단백질을 발현하고 있었음을 확인하기 위한 신규한 방법을 제공한다.
먼저, 유용한 단백질에 특이적이거나 유용한 단백질이 풍부한 항체를 사용하여 특정 단백질의 전부 또는 일부를 발현하는 클론의 발현 라이브러리를 선별하였다.
또한, 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 동정함으로써, 적당한 발현 비히클을 사용하여 재조합 DNA 분자를 형성하고 이러한 재조합 DNA 분자를 사용하여 적당한 숙주(예를 들어, 원핵 또는 진핵 숙주)를 형질전환시킬 수 있다. 이어서, 형질전환된 숙주를 배양하여, 숙주가 DNA 서열을 발현하고 원하는 단백질을 생성하도록 할 수 있다.
생성 후 분리된 단백질, 활성 성분 또는 이의 조합물을 보호 면역 반응을 일으키기에 충분한 양으로 투여(예를 들어, 주사)하여 감염에 대한 면역성을 부여하는 수단을 제공한다.
마이코플라스마 하이오뉴모니아는, 동물 건강 회사에 의해 백신이 상업화된 병원균 중 하나이다. 이 병원균은 돼지에 동물지방병성 폐렴을 유발한다. 치사시키는 경우는 드물지만, 심각한 병적 상태를 일으키고, 돼지의 음식 전환 효율을 크게 감소시켜 중량 증가를 감소시킴으로써 능률을 저하시키는 경우가 많다. 동물은 기침과 열의 증세를 보이고, 기회성 미생물에 의해 종종 2차 감염되기 쉽다.
마이코플라스마 하이오뉴모니아에 대한 백신을 제공하기 위하여 많은 시도가 있었으나 성공을 거두지 못하였다. 특히, 열 불활성화된, 살아있는 마이코플라스마 또는 이의 추출물을 사용하면 보호를 제공함에 효과적이지 못한 것으로 판명되었다. 불활성화된 전체 세포 박테린에 기초한 백신 중 일부는 어느 수준의 효능을 보이지만 개선의 여지가 있다.
또한, 마이코플라스마 하이오뉴모니아는 까다로운 필요조건 때문에 증식시키기 어렵고 비용이 많이 든다. 따라서, 현재 사용할 수 있는 백신들은 전체 세포 또는 전체 세포의 단편을 기초로 하지 않는 백신을 개발함으로써 개선될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 종래 기술의 문제점의 일부를 극복하거나 적어도 완화시키는 것이다.
본 발명은 잠재적 백신 항원의 유전자 서열을 동정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 유전자 서열 및 이 유전자 서열로 암호화되는 폴리펩티드와, 동물에서 보호 면역 반응을 유도하기 위한 이러한 서열의 사용에 관한 것이다. 특히 본 발명은 마이코플라스마, 바람직하게는 마이코플라스마 하이오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumoniae)의 잠재적 항원 유전자 서열의 동정에 관한 것이다.
도 1a 내지 도 1b는 클론 pAD612로 표시된 마이코플라스마의 뉴클레오티드(SEQ ID NO:1) 및 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)을 나타내는 도이다.
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도 39는 클론 pAD763으로 표시된 마이코플라스마의 뉴클레오티드(SEQ ID NO:77) 및 아미노산 서열(SEQ ID NO:78)을 나타내는 도이다.
도 40은 클론 pAD766으로 표시된 마이코플라스마의 뉴클레오티드(SEQ IDNO:79) 및 아미노산 서열(SEQ ID NO:80)을 나타내는 도이다.
도 41은 클론 pAD957로 표시된 마이코플라스마의 뉴클레오티드(SEQ ID NO:81) 및 아미노산 서열(SEQ ID NO:82)을 나타내는 도이다.
도 42는 클론 pAD996으로 표시된 마이코플라스마의 뉴클레오티드(SEQ ID NO:83) 및 아미노산 서열(SEQ ID NO:84)을 나타내는 도이다.
도면 기호의 설명
아미노산을 나타내기 위해 사용한 문자는 하기와 같다.
알라닌 A
아르기닌 R
아스파라긴 N
아스파르트산 D
시스테인 C
글루탐산 E
글루타민 Q
글리신 G
히스티딘 H
이소류신 I
류신 L
리신 K
메티오닌 M
페닐알라닌 F
프롤린 P
세린 S
트레오닌 T
트립토판 W
티로신 Y
발린 V
마이코플라스마 유전자 코드는 UGA(TGA)는 일반적인 정지 신호와는 다른 트립토판을 암호화하기 때문에 보통 유전자 코드와는 다르다. 도 1a 내지 42 에서 나타낸 추정 번역에서 TGA는 트립토판 잔기에 대한 코드로 생각한다.
본 발명의 일실시형태는 발현 벡터에서 뉴클레오티드 서열로부터 번역된 발현 단백질을 동정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 뉴클레오티드 서열로부터 번역된 단백질과 공동-발현되는 마커를 사용하는 것을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시형태는 발현 벡터에서 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 발현 단백질을 동정하기 위한 폴리히스티딘 태그(polyHis tag)의 사용을 제공하며, 상기 폴리히스티딘 태그는 상기 단백질과 공동-발현된다.
본 발명의 다른 실시형태는 뉴클레오티드 서열의 혼합물로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 발현 단백질을 동정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
마커를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;
혼합물로부터 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터로 도입시키는 단계; 및
발현 단백질과 공동-발현되는 마커를 포함하는 융합 단백질의 존재 여부를 확인함으로써 발현 벡터에 의해 발현된 발현 단백질을 동정하는 단계를 포함하여 이루어진다.
바람직한 실시형태에서 마커는 폴리히스티딘 태그이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 발현 벡터는 발현 단백질을 포함하는 마커-융합 단백질을 발현하기 위해 숙주 세포로 유전자도입된다. 마커 융합 단백질은 폴리히스티딘 태그 및 발현 단백질을 포함하는 폴리히스티딘 태그-융합 단백질인 것이 바람직하다. 발현 벡터 집단을 숙주 세포로 도입시키면 선별될 수 있는 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 만들 수 있다.
이 방법의 다른 바람직한 실시형태는 융합 단백질에서 발현된 마커를 사용하여 발현 단백질을 정제하는 단계를 포함한다. 바람직한 마커는 폴리히스티딘 태그이다.
다른 실시형태는 상기 방법에 따라 동정된 정제된 재조합 단백질을 제공한다. 재조합 단백질은 발현 단백질인 것이 바람직하다.
다른 실시형태는 상기 방법에 따라 동정된 재조합 단백질을 암호화하는 정제된 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
본 발명의 다른 실시형태는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 발현 단백질을 동정하는데 사용하기 위해 마커, 바람직하게는 폴리히스티딘 태그를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 또다른 실시형태는 발현 단백질을 동정하는데 사용하기 위해 마커, 바람직하게는 폴리히스티딘 태그를 포함하는 발현 벡터를 포함한 숙주를 제공한다.
본 발명의 다른 실시형태는 뉴클레오티드 서열의 시료로부터 항원 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 동정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은:
마커를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;
시료로부터 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터로 도입시키는 단계;
뉴클레오티드 서열에 의해 번역된 발현 단백질과 공동-발현되는 마커를 포함하는 융합 단백질의 존재 여부를 확인함으로써 발현 벡터에 의해 발현된 항원 발현 단백질을 동정하는 단계; 및
항원 발현 단백질을 동정하는 단계를 포함하여 이루어진다.
바람직한 마커는 폴리히스티딘 태그이다.
바람직한 실시형태에서, 이 방법은 발현 벡터에 의해 암호화된 항원 단백질의 유전자 서열을 결정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는, 뉴클레오티드 서열의 라이브러리를 선별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
뉴클레오티드 서열의 공급원을 제공하는 단계;
마커를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;
뉴클레오티드 서열을 발현 벡터로 도입시킴으로써 라이브러리를 만드는 단계;
뉴클레오티드 서열에 의해 번역된 발현 단백질과 공동-발현되는 마커를 포함하는 융합 단백질의 존재 여부를 확인함으로써 발현 벡터에 의해 발현된 발현 단백질을 동정하는 단계; 및
발현 단백질의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계를 포함한다.
바람직한 마커는 폴리히스티딘 태그이다.
다른 실시형태는 발현 라이브러리에서 발현 클론들을 동정하기 위해 선별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
뉴클레오티드 서열의 공급원을 제공하는 단계;
마커를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;
뉴클레오티드 서열을 발현 벡터로 도입시키는 단계;
발현 벡터를 숙주속으로 형질전환시켜 발현 라이브러리를 만드는 단계; 및
발현 단백질과 공동-발현되는 마커, 바람직하게는 폴리히스티딘 태그를 포함하는 융합 단백질의 발현을 검출하여 발현 클론의 위치를 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는 뉴클레오티드 서열의 시료로부터 질병의 치료 항원 단백질을 암호화하는 치료 항원 유전자 서열을 동정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
마커를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;
시료로부터 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터로 도입시키는 단계;
뉴클레오티드 서열에 의해 번역된 발현 단백질과 공동-발현되는 마커를 포함하는 융합 단백질의 존재 여부를 확인함으로써 발현 벡터에 의해 발현된 항원 발현 단백질을 동정하는 단계;
항원 발현 단백질을 발현하는 발현 벡터를 동물에게 접종시키는 단계;
동물을 질병으로 감염시키는 단계;
백신접종에 의해 유도된 치료적 효과를 제공하는 발현 벡터 및 발현 단백질을 동정하는 단계; 및
발현 벡터에 의해 암호화된 항원 발현 단백질의 유전자 서열을 확인하는 단계를 포함하여 이루어진다.
바람직한 마커는 폴리히스티딘 태그이다.
본 발명의 다른 실시형태는 마이코플라스마, 바람직하게는 마이코플라스마 하이오뉴모니아의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대한 뉴클레오티드 서열의 라이브러리를 선별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
마이코플라스마 시료로부터 뉴클레오티드 서열의 공급원을 제공하는 단계;
마커를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;
뉴클레오티드 서열을 발현 벡터에 도입시키는 단계;
뉴클레오티드 서열에 의해 번역된 발현 단백질과 공동-발현되는 마커, 바람직하게는 폴리히스티딘 태그를 포함하는 융합 단백질의 존재 여부를 확인함으로써 발현 벡터에 의해 발현된 마이코플라스마 발현 단백질을 동정하는 단계; 및
마이코플라스마, 바람직하게는 마이코플라스마 하이오뉴모니아의 발현 단백질의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계를 포함하여 이루어진다.
바람직한 마커는 폴리히스티딘 태그이다.
바람직한 실시형태에서, 유전자 서열은 마이코플라스마, 바람직하게는 마이코플라스마 하이오뉴모니아의 항원 폴리펩티드를 암호화한다.
본 발명의 다른 실시형태는 마이코플라스마, 바람직하게는 마이코플라스마 하이오뉴모니아를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편을 제공하며, 상기 뉴클레오티드 서열은 상기 방법으로 동정된다. 뉴클레오티드 서열은 도 1a 내지 42 중의 어느 하나에 따른 서열, 및 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편을 포함하는 것이 바람직하다. 더 상세하게는, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81 또는 SEQ ID NO:83 또는 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편에 따른다.
본 발명의 또다른 실시형태는, 마이코플라스마, 바람직하게는 마이코플라스마 하이오뉴모니아의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편에 의해 암호화된 폴리펩티드를 제공하며, 상기 뉴클레오티드 서열은 상기 방법에 의해 동정된다. 폴리펩티드는 도 1a 내지 42 중의 어느 하나에 따른 서열, 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편에 의해 암호화된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것이 바람직하다. 더 상세하게는, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO 62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82 또는 SEQ ID NO:84에 따른 아미노산 서열 또는 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편을 가진다.
본 발명의 다른 실시형태는 상기 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 포함한다. 또한, 다른 실시형태는 상기 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열의 약제학적 조성물 및 백신 조성물을 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는 폴리펩티드에 대해 생성된 모노클로날 항체를 포함한다.
또한, 본 발명의 다른 실시형태는 마이코플라스마 감염을 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 상기 방법에 의해 동정된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드에 의해 암호화된 마이코플라스마의 항원 폴리펩티드를 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 항원 폴리펩티드는 도 1a 내지 42 중의 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편에 의해 암호화되는 것이 바람직하다. 더 상세하게는, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81 또는 SEQ ID NO:83 또는 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편에 따른다.
본 명세서의 상세한 설명 및 청구항 전체에서, "포함한다" 및 "포함하는" 및 "포함하여 이루어진다"와 같은 변형어는 다른 첨가체, 성분, 정수 또는 단계를 배제하는 의미가 아니다.
본 발명의 일 실시형태는 발현 벡터의 뉴클레오티드 서열로부터 번역된 발현 단백질을 동정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 뉴클레오티드 서열로부터 번역된 단백질과 공동-발현되는 마커의 사용을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 마커는 검출될 수 있는 임의의 마커이다. 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항혈청으로 검출할 수 있다. 바람직한 마커는 작은, 바람직하게는 30 아미노산 이하인 것이 바람직하다. 가장 바람직한 마커는 폴리히스티딘 태그이다. 또한, 태그는 하기 태그들 중 하나일 수 있다:
(a) 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich Inc. USA)에서 입수가능한 8 아미노산태그 서열인 FLAG 태그,
(b) 암래드 코포레이션 주식회사(Amrad Corporation Ltd., Australia)에서 입수가능한 I-SPY 에피토프 6 아미노산 태그,
(c) 혈구응집소 에피토프 9 아미노산 태그(Clontech Laboratories Inc. USA); 및
(d) c-Myc 에피토프 12 아미노산 태그(Clontech Laboratories Inc. USA).
마커가 폴리히스티딘 태그인 경우, 히스티딘 잔기의 수는 바람직하게는 4 내지 8개인 것이 바람직하며, 6개인 것이 더 바람직하다. 4개 이상의 아미노산 잔기가 적어도 4 내지 8개의 연속적인 히스티딘 잔기를 가진 총 10개 이상의 아미노산을 제공하는 폴리히스티딘 태그 앞에 올 수 있다.
다수의 잠재적인 항원 유전자를 통해 질병으로부터 어느 수준의 보호를 제공하는 이들의 효능을 효과적으로 선별하기 위해, 이들을 초기에 발현 클론으로서 클로닝하는 것이 유용하다. 이 방법에서는 지루하고 시간 낭비적인 클론 분석 및 이어지는 발현 서브클로닝이 불필요하다. 항원 발견의 전체 공정은 가속화된다. 이제 본 출원인들은, 처음 조사된 클론이 재조합 단백질을 발현하고 있었음을 확인하기 위한 신규한 방법을 제공한다.
이것은 특히 유전자 라이브러리를 다루는 경우이다. 임의의 라이브러리에서 대부분의 클론들은 발현하기에 부정확한 방향에 존재하거나 또는 단백질을 발현하기에 잘못된 리딩 프레임에 존재한다. 발현 벡터에서 마커, 바람직하게는 폴리히스티딘 태그를 사용하면 마커, 바람직하게는 폴리히스티딘 태그 융합 단백질을 발현하는 클론의 발현을 효과적으로 동정할 수 있다.
재조합 마커-융합 단백질 또는 바람직하게는 폴리히스티딘 융합 단백질, 또는 짧은 재조합 단백질만을 생성하지 않는 클론, 또는 단지 짧은 재조합 단백질에서, 암호화된 작은 마커 또는 폴리히스티딘 단백질은 숙주 세포 안에서 신속하게 분해되고, 잔존하는 임의의 마커 또는 폴리히스티딘 단백질은 콜로니 스크리닝을 위해 사용되는 막에 매우 약하게 결합한다. 따라서, 비-생산적인 클론은 콜로니 스크리닝에 부정적인 결과를 낳는 반면, 더 길게 태그된 재조합 단백질을 생성하는 클론은 긍정적인 신호를 제공할 수 있다. 따라서, 일반적인 게놈 발현 라이브러리는 복잡성이 상당히 감소될 수 있으므로, 더 빠르고 효율적인 스크리닝 및 이어서 원하는 클론의 사용을 가능하게 한다.
단백질을 발현하는 이러한 클론들은 잠재적인 보호 항원으로 생각되고, 클론을 구성하고 선별하는데 사용되는 전략 때문에, 원래 분리된 클론은 즉시 유전자 백신 접종을 위한 정제된 플라스미드 DNA의 형태, 또는 정제된 마커-융합 재조합 단백질, 바람직하게는 폴리히스티딘 정제된 재조합 융합 단백질로서 백신 실험에서 사용될 수 있다.
마커가 폴리히스티딘 태그 영역인 경우, 이 영역을 포함한 임의의 공급원으로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 폴리히스티딘 태그를 암호화하는 벡터 pQE30, pQE31 및 pQE32(Qiagen Pty. Ltd. Australia)의 영역이 사용될 수 있다. 폴리히스티딘 태그의 다른 공급원은 노바겐사(Novagen Inc., USA(pET-1.9-33))로부터 또는 폴리히스티딘 태그를 합성 제조하여 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 뉴클레오티드 서열의 혼합물로부터의 뉴클레오티드 서열로부터 번역된 발현 단백질을 동정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은:
마커를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;
혼합물로부터 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터로 도입시키는 단계; 및
발현 단백질과 공동-발현되는 마커를 포함하는 융합 단백질의 존재 여부를 확인함으로써 발현 벡터에 의해 발현된 발현 단백질을 동정하는 단계를 포함하여 이루어진다.
바람직한 마커는 폴리히스티딘 태그이다. 하기 구체적인 실시예들은 폴리히스티딘 태그 마커 및 폴리히스티딘 태그 융합 단백질에 관한 것이다. 그러나, 검출될 수 있고, 발현 클론에서 단백질과 공동-발현될 수 있는 임의의 마커를 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 폴리히스티딘 태그에 한정되지 않는다. 이 마커는 단지 실례일 뿐 기재된 본 발명의 보편성을 제한하는 방식으로 받아들여서는 안된다.
상기한 바와 같이, 특히 유전자 라이브러리로부터 유도된 클론에서의 발현 단백질의 동정은 병원균에 대해 잠재적인 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 동정을 촉진시킨다.
뉴클레오티드 서열의 혼합물은 조직 시료, 미생물, 세포 또는 핵산을 함유하는 어떤 성분과 같은 임의의 공급원으로부터 유도될 수 있다. 바람직하게는, 핵산은 게놈, 미토콘드리아, 재조합 또는 mRNA이다. DNA의 시료는 우선 예를 들면, 초음파 또는 제한 효소 분해와 같은 효소 분해에 의해 DNA를 분해하는 어떤 방법으로 분해한다. 이와 달리, 뉴클레오티드 서열은 상기 DNA 서열의 일부의 PCR로부터 유도할 수 있다. 이러한 서열은 오픈 리딩 프레임(open reading frames: ORF)일 수 있다. 발현 벡터는 폴리히스티딘 태그를 포함하는 것이 바람직하다. 폴리히스티딘 태그는 상기와 같이 폴리히스티딘 태그를 포함하는 임의의 공급원으로부터 유도될 수 있다.
폴리히스티딘 태그는 pQE30, pQE31 및 pQE32(Qiagen Pty. Ltd. Australia)와 같은 표준 벡터로부터 유도될 수 있다. 이러한 벡터는 T5 프로모터, Lac 오퍼레이터 및 폴리히스티딘 태그 영역을 암호화할 수 있다. 이 영역은 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로 클로닝될 수 있다. 이와 달리, 폴리히스티딘 태그는 합성 제조될 수 있다.
바람직하게는 마커 또는 바람직하게는 폴리히스티딘 태그 영역이 진핵 세포 발현 벡터로 클로닝된다. 더 바람직하게는, 벡터는 pCI(Promega Corporation, Australia)이고, 클론 pCI30, pCI31 및 pCI32를 생성한다.
이러한 일련의 벡터들은 모든 세 개의 리딩 프레임에서 단편들을 폴리히스티딘 태그 영역의 하류에 클로닝하게 한다. 이 증폭된 클론에서 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시-초기 인헨서(enhancer)/프로모터, 키메라 인트론, 및 SV40 후기 폴리아데닐레이션 신호로 인해, 벡터는 정제된 플라스미드 DNA를 사용하는 유전자 면역화 및 세포 배양 시스템에서 진핵 세포 발현 벡터로 사용된다. T5 프로모터는 원핵세포에서 클로닝된 삽입물을 발현하게 한다. 이 벡터들의 구조는 중요한데, 그이유는 이들이 재조합 단백질을 발현하는 다수의 클론들을 동정하기 위한 라이브러리를 선별할 수 있기 때문이다.
게놈 DNA를 분해한 것과 같은 혼합물에서의 뉴클레오티드 서열(들)은 당업자들에게 공지된 임의의 방법에 의해 도입되거나 발현 벡터로 도입될 수 있다. 발현 벡터는 숙주 세포에서 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 폴리히스티딘 태그 및 발현 단백질을 포함하는 폴리히스티딘 융합 단백질의 발현 단백질을 발현하기 위해서 발현 벡터는 숙주 세포에 유전자도입된다. 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하면 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 만들 수 있다.
숙주 세포는 발현 벡터를 수용할 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 이 세포는 원핵세포인 것이 바람직하다. 대장균인 것이 가장 바람직하다. 단백질을 발현하는 발현 단백질(및 이어서 임의의 클론 또는 숙주 세포)의 동정은 폴리히스티딘 태그 융합 단백질 상의 폴리히스티딘 태그의 존재 여부에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 벡터는 폴리히스티딘 태그를 기초로 모든 발현 클론에 대한 일반적인 스크리닝을 할 수 있게 한다.
폴리히스티딘 태그는 폴리히스티딘 신호가 색원체 기질의 첨가에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는 니켈 수지와 같은 탐침과 결합된 금속 킬레이트로 또는 항-폴리히스티딘 항체를 사용하여 동정할 수 있다.
재조합 폴리히스티딘 융합 단백질, 또는 단지 짧은 재조합 단백질을 생성하지 않는 클론에서, 암호화된 작은 폴리히스티딘 단백질은 숙주 세포 안으로 신속하게 분해되고, 잔존하는 임의의 폴리히스티딘 단백질은 콜로니 스크리닝을 위해 사용되는 막에 매우 약하게 결합한다. 따라서, 비-생산적인 클론은 폴리히스티딘 콜로니 스크리닝에 부정적인 결과를 낳는 반면, 더 길게 폴리히스티딘 태그된 재조합 단백질을 생성하는 클론은 긍정적인 신호를 제공할 수 있다. 따라서, 일반적인 게놈 발현 라이브러리는 복잡성이 상당히 감소될 수 있으므로, 더 빠르고 더 효율적인 스크리닝 및 이어서 원하는 클론의 사용을 가능하게 한다.
이 방법의 다른 바람직한 실시형태에는 융합 단백질에서 발현되는 폴리히스티딘 태그를 사용하여 발현 단백질을 정제하는 단계가 포함된다.
폴리히스티딘 태그를 사용하여 발현 클론에 의해 발현된 발현 단백질을 동정한 후, 이 태그는 임의의 발현 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 정제 방법을 사용할 수 있다. 항-폴리히스티딘 항체를 사용한 친화성 크로마토그래피에서 친화성 컬럼을 사용할 수 있다. 일반적으로, 폴리히스티딘 태그에 의해 동정된 발현 단백질은 폴리히스티딘 태그의 사용에 의존하는 임의의 방법을 사용하여 분리할 수 있다.
다른 실시형태는 상기 방법에 따라 동정된 정제된 재조합 단백질을 제공한다.
일단 단백질이 분리되면, 정제된 단백질의 형태로 백신 실험을 포함한 어떤 다수의 방법에 사용될 수 있다. 이 단백질은 잠재적 항원으로서 즉시 동정될 수 있다. 이것은 보호 항원이 되는 것이 바람직하다.
다른 실시형태는 상기 방법에 따라 동정된 재조합 단백질을 암호화하는 정제된 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
상기 폴리히스티딘 방법에 의해 동정된 단백질은 분리된 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 재조합 서열에 의해 발현된다. 단백질을 동정함으로써, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단백질을 발현하는 클론을 동정할 수 있다.
이러한 클론은 정제된 플라스미드 DNA를 제공하며, 특히, 플라스미드 DNA는 잠재적 보호 항원을 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 발현 단백질을 동정하는데 사용하기 위해 마커, 바람직하게는 폴리히스티딘 태그를 포함하는 재조합 벡터 또는 발현 벡터를 제공한다.
발현 벡터는 발현 단백질의 발현을 생성하는 임의의 벡터일 수 있다. 플라스미드 또는 코스미드일 수 있다. 이것은 클론으로 도입되어 백신 접종 또는 동정 목적을 위한 단백질을 얻기 위한 목적으로 발현 단백질을 더 확대할 수 있다.
본 발명의 다른 형태는 발현 벡터를 포함하는 숙주를 제공하며, 상기 벡터는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 발현 단백질을 동정하는데 사용하기 위한 마커, 바람직하게는 폴리히스티딘 태그를 포함한다.
숙주 세포는 발현 벡터를 포함할 수 있는 어떤 수용 능력 있는 세포일 수 있다. 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 실시형태는 뉴클레오티드 서열의 시료로부터 항원 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 동정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
마커, 바람직하게는 폴리히스티딘 태그를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;
시료로부터 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터로 도입시키는 단계;
뉴클레오티드 서열에 의해 번역된 발현 단백질과 공동-발현되는 마커를 포함하는 융합 단백질의 존재 여부를 확인함으로써 발현 벡터에 의해 발현된 항원 발현 단백질을 동정하는 단계;
항원 단백질을 동정하는 단계; 및
발현 벡터에 의해 암호화된 항원 단백질 유전자의 뉴클레오티드 서열을 바람직하게 확인하는 단계를 포함하여 이루어진다.
항원 단백질의 동정은 폴리히스티딘 태그를 가진 융합 단백질을 동정 및 바람직하게는 분리하고, 융합 단백질이 폴리히스티딘 태그에 의해 생성되지 않는 면역 반응을 유도할 수 있는지를 결정하는 것을 포함한다. 면역 반응은 ELISA 또는 항체/항원 반응을 수행하는 면역 동물로부터의 항혈청을 사용하는 표준 시험관 내 면역학적 실험에 의해 결정할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 뉴클레오티드 서열의 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
뉴클레오티드 서열의 공급원을 제공하는 단계;
마커, 바람직하게는 폴리히스티딘 태그를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;
뉴클레오티드 서열을 발현 벡터로 도입함으로써 라이브러리를 만드는 단계;
뉴클레오티드 서열에 의해 번역된 발현 단백질과 공동-발현되는 마커를 포함하는 융합 단백질의 존재 여부를 확인함으로써 발현 벡터에 의해 발현된 발현 단백질을 동정하는 단계; 및
발현 단백질 유전자의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태는 라이브러리에서 발현 클론을 동정하기 위해 스크리닝하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
뉴클레오티드 서열의 공급원을 제공하는 단계;
마커, 바람직하게는 폴리히스티딘 태그를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;
뉴클레오티드 서열을 발현 벡터로 도입시키는 단계;
발현 벡터를 숙주로 유전자도입하여 발현 라이브러리를 만드는 단계; 및
발현 단백질과 공동-발현되는 마커, 바람직하게는 폴리히스티딘 태그를 포함하는 융합 단백질의 발현을 검출하여 발현 클론의 위치를 확인하는 단계를 포함한다.
발현 클론에 의해 전사된 폴리히스티딘 태그를 가진 발현 단백질의 동정은 오픈 리딩 프레임(ORF)을 발현하는 클론(숙주 세포)들을 더 동정한다.
따라서, 이 방법은 뉴클레오티드 서열의 혼합물에서 ORF를 동정한다. 잠재적으로 항원으로서 유용한 단백질을 암호화하는 유용한 뉴클레오티드 서열을 동정하는 과정을 효과적으로 가속화시킨다. 이것은 즉시 확대될 수 있는 클론을 신속하게 동정하여, 유전자 백신과 같은 용도를 위해 또는 재조합 단백질에 대한 항체를 개발하기 위해 충분한 뉴클레오티드 서열 또는 플라스미드 DNA 또는 재조합 단백질 시료를 제공한다.
본 발명의 다른 실시형태는 뉴클레오티드 서열의 시료에서, 치료 항원 단백질을 암호화하는 치료 항원 유전자 서열을 동정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
마커를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;
시료로부터 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터로 도입시키는 단계;
뉴클레오티드 서열에 의해 번역된 발현 단백질과 공동-발현되는 마커를 포함하는 융합 단백질의 존재 여부를 확인함으로써 발현 벡터에 의해 발현된 항원 발현 단백질을 동정하는 단계;
항원 발현 단백질을 발현하는 발현 벡터를 동물에게 접종시키는 단계;
동물을 질병으로 감염시키는 단계;
백신접종에 의해 유도된 치료적 효과를 제공하는 발현 벡터 및 발현 단백질을 동정하는 단계; 및
발현 벡터에 의해 암호화된 항원 발현 단백질의 유전자 서열을 확인하는 단계를 포함하여 이루어진다.
본 발명은 클론의 백신 가능성을 즉시 평가하기 위해, 뉴클레오티드 서열의 라이브러리를 스크리닝하고, DNA 백신 접종 실험에 동정된 클론을 사용하는 효과적인 방법을 제공한다는 점에서 유리하다. 백신 실험을 하기 위해 동정된 클론을 용이하게 사용하는 이 실시형태는 현재 사용가능한 방법을 더 개선한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태는, 마이코플라스마, 바람직하게는 마이코플라스마 하이오뉴모니아의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대한 뉴클레오티드 서열의 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
마이코플라스마 시료로부터 뉴클레오티드 서열의 공급원을 제공하는 단계;
마커, 바람직하게는 폴리히스티딘 태그를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;
뉴클레오티드 서열을 발현 벡터에 도입시키는 단계;
뉴클레오티드 서열에 의해 번역된 발현 단백질과 공동-발현되는 마커, 바람직하게는 폴리히스티딘 태그를 포함하는 융합 단백질의 존재 여부를 확인함으로써 발현 벡터에 의해 발현된 마이코플라스마 발현 단백질을 동정하는 단계; 및
마이코플라스마, 바람직하게는 마이코플라스마 하이오뉴모니아의 발현 단백질 유전자의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계를 포함하여 이루어진다.
마이코플라스마의 시료로부터의 뉴클레오티드 서열의 공급원은 게놈, 미토콘드리아, 재조합 또는 mRNA 기원일 수 있다. 공급원이 게놈인 경우, 게놈 DNA는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 마이코플라스마로부터 분리될 수 있다.
마이코플라스마는 마이코플라스마 하이오뉴모니아인 것이 바람직하다. 폴리히스티딘 태그-마이코플라스마 융합 단백질의 동정 방법은 상기한 바와 같다.
바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 항원 단백질을 암호화한다. 따라서, 단백질이 면역 반응을 유도하는지를 확인하는 단계가 더 있다. 바람직하게는, 항원 단백질은 마이코플라스마 항원 단백질이다. 더 바람직하게는, 마이코플라스마 하이오뉴모니아 항원 단백질이다.
"면역 반응"이라는 용어는 일반적으로 미생물, 기생충, 이식조직, 단백질 또는 항원과 같은 외부 성분의 침입에 대한 특이적 항체 및/또는 세포독성 세포가 생성되는 면역계에 의해 개시된 선택적 반응을 의미한다.
"면역계"라는 용어는 감염으로부터 신체를 보호하기 위해 또는 재감염에 대해 오래 지속되는 특이적 면역을 제공하기 위해, 일반적으로 미생물, 기생충, 이식조직, 단백질 또는 항원과 같은 외부 성분의 침입에 대한 특이적 보호 반응을 개시할 수 있는 임의의 세포 또는 조직을 의미한다.
본 발명의 다른 실시형태는, 마이코플라스마, 바람직하게는 마이코플라스마 하이오뉴모니아를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편을 제공하며, 상기 뉴클레오티드 서열은 상기 방법에 의해 동정된다. 뉴클레오티드 서열은 도 1a 내지 42 중의 어느 하나에 따른 서열, 및 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편을 포함하는 것이 바람직하다. 더 상세하게는, 이것은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81또는 SEQ ID NO:83 또는 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편을 포함한다.
다른 실시형태에서, 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터, 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편이 제공된다. 뉴클레오티드 서열은 도 1a 내지 42 중의 어느 하나에 따르는 서열, 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편이 바람직하다. 더욱 구체적으로, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81 또는 SEQ ID NO:83 또는 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편을 포함하여 이루어진다.
"돌연변이체, 유사체, 또는 유도체"라는 용어는 그 서열의 결손, 첨가 또는 치환을 포함할 수 있는 서열을 의미한다. 이러한 용어가 단백질과 관련되는 경우, 상기 변화는 단백질의 활성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 변화된 핵산 분자와 관련되는 경우, 상기 변화는 단백질 암호화 영역의 리딩 프레임에 변화를 일으키지 않으며, 바람직하게는 변화가 없는 단백질을 암호화하고, 생물학적 기능을 약간 감소시키거나 증가시킬 뿐이다.
"단편"이라는 용어는, 전체 길이보다 짧으나 전장 서열과 보합결합할 수 있고, 전장 서열의 일부인 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 핵산 서열의 일부로서 인식되는 핵산 또는 아미노산 서열 일부를 의미한다.
유전 코드의 축퇴로 인해 동일하거나 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 암호화하는 다른 핵산 서열도 본 발명의 범위에 포함된다. 뉴클레오티드 서열의 이러한 변형은, 동일하거나 기능적으로 동등한 유전자 산물을 얻는 다른 뉴클레오티드의 치환을 포함할 수 있다. 본 발명의 범위에는 또한 결손 및/또는 첨가가 일어난, 기능적으로 동등한 유전자 산물을 얻는 핵산 서열이 포함된다. 또한, 유전자 산물은, 기능적으로 활성인 산물을 생성하는 변화를 일으키는 서열의 아미노산 잔기가 결손, 첨가 또는 치환된 것을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포는 재조합 벡터를 수용할 수 있는 어떤 세포가 가능하다. 숙주 세포는 원핵 세포가 바람직하고, 대장균이 더욱 바람직하다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 상기 방법으로 동정된 폴리펩티드를 암호화하는 아미노산 서열이 제공된다. 폴리펩티드는 발현 벡터의 산물일 수 있으며, 또는 마커, 바람직하게는 폴리히스티딘 마커와 공동-발현된 단백질로서 동정된 발현 단백질이다. 아미노산 서열이 상기 방법으로 동정된 뉴클레오티드 서열로부터 번역되는 것이 바람직하다.
바람직한 실시형태에서, 이 아미노산 서열은 마이코플라스마, 바람직하게는마이코플라스마 하이오뉴모니아의 폴리펩티드를 암호화한다. 더욱 바람직하게는 이 아미노산 서열은 도 1a 내지 42 중의 어느 하나에 따른 서열, 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편을 포함하여 이루어진다. 더욱 구체적으로 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO 62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82 또는 SEQ ID NO:84 또는 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 상기와 같은 아미노산 서열, 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편으로 암호화되는 폴리펩티드가 제공된다. 이 서열은 마이코플라스마, 바람직하게는 마이코플라스마 하이오뉴모니아의 폴리펩티드를 암호화하고, 상기 아미노산 서열은 상기 방법으로 동정되는 것이 바람직하다. 이 폴리펩티드는 도 1a 내지 42 중의 어느 하나에 따른 아미노산 서열, 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편으로 암호화되는 것이 바람직하다. 더욱 구체적으로 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ IDNO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO 62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82 또는 SEQ ID NO:84 또는 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편을 포함하여 이루어진다.
이 폴리펩티드는 당업자에게 어떤 공지된 방법으로 분리 및 정제될 수 있다. 분리 방법은 뉴클레오티드 서열 라이브러리로부터 발현 단백질 또는 발현 클론을 동정하기 위해 사용되었던 폴리히스티딘 태그를 사용하는 것이 바람직하다.
다른 실시형태에서, 상기한 바와 같은 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 조성물이 제공된다. 이 조성물은 상기와 같은 하나 이상의 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하여 이루어지는 약제학적 조성물일 수 있다. 이 조성물은 또한 상기한 하나 이상의 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 백신 조성물일 수 있다. 폴리펩티드가 바람직하게는 마이코플라스마, 더욱 바람직하게는 마이코플라스마 하이오뉴모니아의 뉴클레오티드 서열 또는 항원 단백질인 이 백신 조성물은 면역 반응을 일으킬 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 상기되거나 상기된 방법에 따라 동정된 폴리펩티드에 대한 항체가 제공된다. 이 항체는 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.
당해 기술 분야에서 상기 폴리펩티드의 에피토프에 대한 항체를 제조하기 위하여 사용가능한 다양한 방법은 공지되어 있다. 토끼, 마우스, 염소 등을 포함하며 이에 한정되지 않는 다양한 숙주 동물을, 폴리펩티드를 사용하여 면역화시킨 후 이들 항체를 제조하는데 사용할 수 있다. 숙주 종에 따라 면역 반응을 증가시키기 위하여 보강제를 사용할 수 있으며, 프로인트(Freunds)(완전 및 불완전)를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 모노클로날 항체는 시험관 내에서 세포주로 항체 분자를 연속 제조할 수 있는 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 이는 히브리도마 기술(Kohler and Milstein, Nature 256, 495, (1975))을 포함할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 폴리펩티드에 대한 항체는 다양한 조직, 체액 및 세포주에서 항원 폴리펩티드의 검출, 예를 들어 항원의 스크리닝 분석 및 폴리펩티드(바람직하게는 항원 폴리펩티드)의 친화 정제에 사용할 수 있다.
백신 조성물은 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 정제된 플라스미드 DNA를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에서 아미노산 서열에 의해 암호화되고 상기된 방법에 의해 동정되는 항원 폴리펩티드를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 감염 치료 방법이 제공된다. 감염은 마이코플라스마 감염이 바람직하다. 감염이 마이코플라스마 하이오뉴모니아 감염인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 이 폴리펩티드는 도 1a 내지 42 중의 어느 하나에 따른 아미노산 서열, 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편에 의해 암호화되는 것이 바람직하다. 더욱 구체적으로 이 서열은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81 또는 SEQ ID NO:83 또는 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편을 포함하여 이루어진다.
이 폴리펩티드는 도 1a 내지 42 중의 어느 하나에 따른 아미노산 서열, 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편을 갖는 것이 또한 바람직하다. 더욱 구체적으로는, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO 62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82 또는 SEQ IDNO:84, 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 필요한 동물에 상기 방법에 의해 동정된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유효량의 DNA 분자를 투여하는 것을 포함하는 감염 치료 방법이 제공된다. 이 감염은 마이코플라스마 감염이 바람직하다. 이 감염은 마이코플라스마 하이오뉴모니아 감염인 것이 더욱 바람직하다.
이 뉴클레오티드 서열은 도 1a 내지 42 중의 어느 하나에 따른 서열, 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편, 또는 더욱 구체적으로는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81 또는 SEQ ID NO:83 또는 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편이다.
DNA는 세포가 DNA를 포함할 수 있도록 하는 주사를 통하여 투여하거나, 국부적으로 적용할 수 있다. DNA를 피하 또는 근육 내에 피부층 속으로 주사하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 상기된 방법에 의하여 동정된 폴리펩티드에 특이적인 항체를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 감염의 치료 방법이 제공된다.
이 감염은 마이코플라스마 감염이 바람직하다. 이 감염은 마이코플라스마 하이오뉴모니아 감염인 것이 더욱 바람직하다.
이 폴리펩티드 서열은 도 1a 내지 42 중의 어느 하나에 따른 아미노산 서열, 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편, 또는 더욱 구체적으로는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO 62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82 또는 SEQ ID NO:84 또는 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편에 의하여 암호화된다.
이제 실시예 및 도면을 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 다음 상세한 설명은 설명을 위한 것으로, 이에 본 발명의 일반적인 사항이 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: pCI30, pCI31 및 pCI32 게놈 라이브러리 구성
마이코플라스마 하이오뉴모니아에서 분리된 게놈 DNA를 초음파 처리 또는 부분 제한 효소 분해를 통하여 적당한 크기의 단편으로 분해하였다. 그리고나서, DNA를 아가로오스 겔 상에 이동시켜서, 크기가 선택된 단편을 이 겔에서 잘라내어 회수하였다. 벡터 DNA(pCI30, pCI31 및 pCI32)를 새우 알칼린 포스파타아제로 처리된 적당한 제한 효소(Sma I 또는 BamHI)로 분해하여 말단의 포스페이트를 제거한 후, 아가로오스 겔에 이동시켰다. 일직선 형태의 밴드를 잘라내어 DNA를 회수하였다. 게놈 DNA 단편과 절단 벡터 DNA를 1:1 내지 5:1의 몰비로 혼합하고, 표준 결찰 조건을 사용하여 결찰하였다. 결찰 혼합물을 사용하여 수용능력있는 대장균 세포를 형질전환시킨 후, 다수의 별개의 게놈 라이브러리를 얻었다.
실시예 2: 게놈 라이브러리의 스크리닝
게놈 라이브러리를 암피실린(100㎍/ml) 함유 루리아-베르토니(Luria-Bertoni; LB) 브로스 아가 상에 도포하고 밤새 37℃로 성장시켰다. 건조된 멸균 니트로셀룰로오스 막을 콜로니 상부에 위치시키고, 이어서 즉시 이를 제거하여 암피실린 및 IPTG(1mM) 함유 LB 플레이트 상에 콜로니 쪽을 위로하여 위치시키고, 4시간동안 37℃에서 배양시킴으로써 이 플레이트의 필터 리프트 레플리카(filter lift replicas)를 만들었다. 그리고나서, 막을 표준 방법으로 처리하여 박테리아를 용해시키고, 막을 중화시키고, 단백질을 막에 결합시켰다. 이어서, 건조막을 항-폴리히스티딘 항체 또는 결합된 니켈 수지를 사용하여 조사하고, 색원체 기질을 첨가하여 폴리히스티딘 신호를 발현시켰다. 발현된 막을 원래의 플레이트에 다시 위치시키고, 양성 콜로니를 암피실린을 보충한 풍부한 성장 배지를 함유하는 96조, 깊은 조 플레이트에 놓았다. 이어서, 클론을 37℃에서 성장시켰다. 이러한 플레이트의 레플리카를 얻어 장기간 저장을 위하여 -70℃로 유지시켰다.
실시예 3: 선택된 클론의 서열 분석
각 라이브러리로부터 폴리히스티딘 양성 클론의 집합체를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 제조하고, 벡터에 삽입된 영역의 바로 상류 영역와 상동인 프라이머를 사용한 자동화 디데옥시 서열확인법에 의해 삽입된 단편으로부터의 DNA 서열 정보를 얻었다. 얻어진 서열 데이터를 공개적으로 이용가능한 진뱅크(GenBank) 데이터베이스와 비교하였다. 본 출원인의 양성 서열 및 데이터베이스 엔트리 간의 상동 관계를 검토하였으며, 많은 경우에 있어 이러한 정보를 통해 클로닝된 유전자 단편의 가능한 기능 중 몇가지를 알게 되었다. 이러한 상동관계에 대한 정보에 기초하여, 마이코플라스마 하이오뉴모니아 감염동안 숙주의 면역계에 쉽게 접근가능하거나 다른 이유로 어느 수준의 보호를 제공할 것으로 생각되는 단백질을 암호화하는 유전자를 나타낼 것으로 보이는 양성 클론의 하부 그룹을 선택하였다. 이러한 선택된 양성 클론은 가능성이 있는 보호 항원을 암호화한다.
추가 연구를 위하여 선택된 클론 중 일부는 동일 유전자의 다른 부분을 나타낸다.
실시예 4: 가능성이 있는 보호 항원의 스크리닝
동정된 유전자의 치료 적용을 조사하기 위하여 일련의 동물 실험을 행하였다. 모든 실험은 유사한 프로토콜을 따랐다. M. 하이오뉴모니아가 없는 돼지 떼로부터의 돼지를 6주령에서 시작하여 2주 간격으로 3회 백신접종하였다. 500㎍의 플라스미드 DNA를 균등하게 둘로 나누어 2번 주사기가 설치된 바이오젝터 2000(Biojector 2000) 불필요 주입장치를 사용하여, 각 귓등의 기부조직에 하나씩 백신접종하였다. 3차 백신접종하고 1-2 주 후에, 활성 M. 하이오뉴모니아 감염된 돼지에서 유래한 0.45μM의 여과된 폐 균등액 5ml 투여량을 기관내 주입하여 돼지를 감염시켰다. 감염 3-4주 후에 돼지를 안락사시키고, 폐를 분리하여 폐렴 병변을 평가하였다. 폐렴 병변은 영향을 받은 폐엽(lung lobe)의 수를 세어 병에 걸린 각 폐엽의 퍼센트를 측정하여 평가하였다. 이러한 평가 시스템은 질병 상태에 대한 두 가지 기준, 엽 스코어(lobe score) 및 병변 스코어를 제공한다. 각 실험에서, 각 그룹의 평균 결과를 나타낸다. 양성 치료 효과를 가졌던 클론 그룹의 실험 결과를 나타낸다. 클론의 다른 그룹은 양성 치료 효과를 나타내지 않았으며, 이러한 결과는 나타내지 않는다.
실험 1
클론 pA612-789를 포함한 클론 그룹으로 백신 접종
처리
엽 스코어
병변 스코어
백신 비접종, 비감염 0 0
백신 비접종, 감염 4.4 120
백신 접종, 감염 3.25 72.5
클론 pAD612-789를 함유하는 백신은 치료 효과를 나타냈다. 백신접종된 돼지의 엽 스코어는 대조구보다 26% 낮았고, 병변 스코어는 40% 낮았다.
실험 2
두가지 다른 클론 그룹을 백신으로 실험하였다.
그룹 1: pAD's 662, 774, 784, 922 및 964
그룹 2: pAD's 612, 633, 639, 640, 641, 653, 657, 659, 681, 700, 711, 721, 727, 742, 760, 789, 908, 910, 911, 913, 920, 923, 925, 950, 951, 966, 967, 977, 981, 983, 984, 994, 1001, 1005, 1013, 1016, 1020, 1027, 1033, 1037, 1038, 1040 및 1049.
처리
엽 스코어
병변 스코어
백신 비접종, 비감염 0 0
벡터 백신 접종, 감염 3.4 67
그룹 1 백신 접종, 감염 1.6 38
그룹 2 백신 접종, 감염 2.2 51
실험 2에서 유도된 질병의 총 심각도는 이보다 약하게 감염된 실험 1보다 낮았다. 클론의 두 그룹 모두 치료 효과를 나타냈다.
그룹 1의 백신은 엽 스코어를 53% 감소시켰고, 병변 스코어를 43% 감소시켰다. 그룹 2의 백신은, 빈 벡터 플라스미드 DNA를 사용하여 백신 접종한 그룹과 비교하여 엽 스코어를 35% 감소시켰고, 병변 스코어를 24% 감소시켰다.
실험 3
그룹 1: 실험 2의 그룹 1과 동일한 클론
바이오젝터에 대하여 설명한 바와 같은 표준 방법으로 또는 유전자총(genegun)을 사용하여 DNA를 전달하였다. 유전자 총으로 전달하기 위하여 돼지 각각에 1.6 미크론의 금 입자를 사용하여, 3회의 각 백신 접종 시점에서 각각 1.25㎍ DNA씩 4개로 접종하였다. 백신 접종은 각 귀의 뒤와 각 뒷다리 안쪽에 실시하였다. 전달 압력은 500psi였다.
처리
엽 스코어
병변 스코어
백신 비접종, 비감염 0 0
벡터 백신 접종, 감염 4.2 109
그룹 1 바이오젝터 백신 접종, 감염 2.5 67
그룹 1 유전자총 백신 접종, 감염 2.2 48.5
이 실험을 통하여, 노출(naked) DNA로 전달되는 경우에 그룹 1 중 5개 클론이 치료 효과를 갖는다는 것이 다시 증명되었다. 바이오젝터 전달된 백신은 엽 스코어를 40% 감소시켰으며, 병변 스코어를 39% 감소시켰다. 유전자총에 의하여 전달된 클론의 동일한 수집물은 엽 스코어를 48% 감소시켰고, 병변 스코어를 56% 감소시켰다.
실험 4
실험 2에 사용된 클론의 다른 조합물을 이 실험에 사용하였다.
그룹 3: pAD's 653, 711, 727, 920, 951, 및 965
그룹 4: pAD's 612, 639, 640, 1005, 1020, 및 1038
그룹 5: pAD's 742, 760, 923, 925, 994, 984, 및 1037
이전 실험에 사용되지 않았던 다른 5개 클론의 그룹을 또한 포함시켰다.
그룹 6: pAD's 702, 763, 766, 957, 및 996
처리
엽 스코어
병변 스코어
백신 비접종, 비감염 0 0
벡터 백신 접종, 감염 5.0 106
그룹 3 백신 접종, 감염 2.8 54
그룹 3 유전자 총 백신접종, 감염 2.6 87
그룹 4 백신접종, 감염 3.0 79
그룹 5 백신접종, 감염 3.6 74
그룹 6 백신접종, 감염 2.75 42.5
이들 클론 그룹은 모두 폐렴 병변의 심각도를 감소시킨다는 점에서 치료 효과를 가졌다. 그룹 3 클론은 엽 스코어를 바이오젝터로 전달되는 경우에 44% 감소시켰고, 유전자총으로 전달되는 경우에 48% 감소시켰으며, 병변 스코어를 바이오젝터로 전달되는 경우에 49%, 유전자 총으로 전달되는 경우에 18% 감소시켰다. 다른 3가지 실험백신은 바이오젝터로만 전달하였다. 그룹 4의 백신은 엽 스코어를 40%, 병변 스코어를 25% 감소시켰다. 그룹 5의 백신은 엽 스코어를 45%, 병변 스코어를 60% 감소시켰다.
이러한 종류의 실험을 통하여, 백신 비접종 또는 빈 벡터 백신 접종된 돼지와 비교하여, 본 특허에 상세히 설명한 클론된 유전자 수집물은, 재조합 플라스미드의 다양한 조합물로 백신 접종된 그룹에서 폐 병변의 심각도를 낮춤으로써 치료 효과를 갖는다는 것이 증명된다. 이러한 치료 효과의 증명에 기초하여, 본 발명에서는 42가지 유전자 수집물을 청구한다.
실시예 5: 완전한 유전자를 회수하기 위한 게놈 라이브러리의 스크리닝
실시예 4에 기재된 클론은 일부 유전자 서열만을 포함한다. 완전한 유전자의 뉴클레오티드 서열을 동정하는 것이 바람직한데, 이들이 백신 설계에 유용할 추가의 에피토프를 암호화할 것으로 생각되기 때문이다. 실시예 4의 클론으로 나타낸 유전자의 완전한 암호화 영역을, 두 게놈 라이브러리를 스크리닝하여 회수하였다. 제한 효소 EcoRI 및 BGIII로 분해시켜 만든 단편을 EcoRI 및 BamHI로 각각 분해된 pUC18 벡터에 결찰시킴으로써 게놈 라이브러리를 구성하였다. 결찰된 생성물을 XL2-BlueMRF' 수용능력있는 세포(Stratagene)에 결찰 혼합하여 형질전환시키고,100㎍/ml의 암피실린을 함유하는 루리아-베르토니 아가 플레이트 상에 도포하여 회수시켰다. 풍부한 성장 배지를 함유하는 96조 플레이트에 콜로니를 넣고, 밤새 성장시킨 후 각각에 대하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. 각각으로부터의 플라스미드 DNA를 변성시켜 나이론막에 찍었다. 이어서, 대표적인 막을 실시예 4에 기재된 각 클론에 존재하는 삽입된 DNA로부터 얻은 디고시제닌 표지된 PCR 산물로 조사하였다. 제한효소 분해, 유전자 특이적 프라이머를 사용하는 PCR 및 뉴클레오티드 서열확인을 통하여 보합결합된 클론을 동정 및 분석하였다. 얻어진 유전자 서열은 도 1a 내지 42에 상세히 나타낸다. 다수의 이러한 서열은 유전자의 완전한 암호화 서열을 나타내지만, 많은 유전자들은 일부 서열만으로 이용가능하다.
마지막으로, 본 명세서의 정신을 벗어나지 않는 한 다양한 다른 변경 및/또는 변화가 가능한 것으로 이해해야 한다.
Claims (40)
- 마커가 뉴클레오티드 서열로부터 번역된 단백질과 공동-발현되는 단계를 포함하는, 발현 벡터에서 뉴클레오티드 서열로부터 번역된 발현 단백질을 동정하는 방법.
- 마커를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;혼합물로부터 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터로 도입시키는 단계; 및발현 단백질과 공동-발현되는 마커를 포함하는 융합 단백질의 존재 여부를 확인함으로써 발현 벡터에 의해 발현된 발현 단백질을 동정하는 단계를 포함하는, 뉴클레오티드 서열의 혼합물로부터의 뉴클레오티드 서열로부터 번역된 발현 단백질을 동정하는 방법.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서,상기 마커가 검출가능한 마커임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서,상기 마커가 30 아미노산 이하이고,(a) 폴리히스티딘 태그;(b) FLAG 태그;(c) I-SPY 에피토프 태그;(d) 혈구응집소 태그; 및(e) c-Myc 에피토프 태그를 포함하는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서,상기 마커가 폴리히스티딘 태그인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항에 있어서,상기 폴리히스티딘 태그가 4 내지 8개의 연속적인 히스티딘 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항에 있어서,상기 폴리히스티딘 태그가 6개의 연속적인 히스티딘 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항 내지 제 7항에 있어서,상기 발현 벡터가 진핵 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항 내지 제 8항에 있어서,상기 발현 벡터가 발현 단백질의 발현을 위해 숙주 세포로 더 유전자도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 9항에 있어서,상기 발현 단백질이 항-마커 항체 또는 금속 킬레이트-킬레이트 결합된 탐식자에 의해 동정되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서,상기 항-마커 항체가 항-폴리히스티딘 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 11항 중의 어느 한 항에 있어서,마커를 통해 발현 단백질을 선택하는 단계를 포함하는 상기 방법이, 발현 단백질과 공동-발현되는 마커를 사용하여 발현 단백질을 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 12항 중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 동정된 정제된 재조합 단백질.
- 제 13항에 따른 재조합 단백질을 암호화하는 정제된 뉴클레오티드 서열.
- 뉴클레오티드 서열의 공급원을 제공하는 단계;마커를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;뉴클레오티드 서열을 발현 벡터로 도입시키는 단계;발현 벡터를 숙주 세포로 형질전환하여 발현 라이브러리를 만드는 단계; 및발현 단백질과 공동-발현되는 마커를 포함하는 융합 단백질의 발현을 검출하여 발현 클론의 위치를 확인하는 단계를 포함하는, 라이브러리에서 발현 클론을 동정하기 위한 스크리닝 방법.
- 뉴클레오티드 서열의 공급원을 제공하는 단계;마커를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;뉴클레오티드 서열을 발현 벡터로 도입하여 라이브러리를 만드는 단계;뉴클레오티드 서열에 의해 번역된 발현 단백질과 공동-발현되는 마커를 포함하는 융합 단백질의 존재 여부를 확인함으로써 발현 벡터에 의해 발현된 발현 단백질을 동정하는 단계; 및발현 단백질의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계를 포함하는, 발현된 뉴클레오티드 서열을 동정하기 위한 뉴클레오티드 서열 라이브러리의 스크리닝 방법.
- 마커를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;시료로부터 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터로 도입시키는 단계;뉴클레오티드 서열에 의해 번역된 발현 단백질과 공동-발현되는 마커를 포함하는 융합 단백질의 존재 여부를 확인함으로써 발현 벡터에 의해 발현된 항원 발현 단백질을 동정하는 단계;항원 발현 단백질을 동정하는 단계;발현 벡터에 의해 암호화된 항원 발현 단백질의 유전자 서열을 확인하는 단계를 포함하는, 뉴클레오티드 서열의 시료로부터 항원 유전자 서열을 동정하는 방법.
- 마커를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;시료로부터 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터로 도입시키는 단계;뉴클레오티드 서열에 의해 번역된 발현 단백질과 공동-발현되는 마커를 포함하는 융합 단백질의 존재 여부를 확인함으로써 발현 벡터에 의해 발현된 항원 발현 단백질을 동정하는 단계;항원 발현 단백질을 발현하는 발현 벡터로 동물을 접종시키는 단계;동물을 질병으로 감염시키는 단계;백신 접종에 의해 유도된 치료 효과를 제공하는 발현 벡터 및 발현 단백질을 동정하는 단계; 및발현 벡터에 의해 암호화된 항원 발현 단백질의 유전자 서열을 확인하는 단계를 포함하는, 뉴클레오티드 서열의 시료로부터 질병의 치료 항원 단백질을 암호화하는 치료 항원 유전자 서열을 동정하는 방법.
- 제 15항 내지 제 18항에 있어서,상기 라이브러리가 마이코플라스마의 폴리펩티드로 번역하는 뉴클레오티드 서열의 라이브러리이고, 상기 방법이마이코플라스마의 시료로부터 뉴클레오티드 서열의 공급원을 제공하는 단계;마커를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 단계;뉴클레오티드 서열을 발현 벡터로 도입시키는 단계;뉴클레오티드 서열에 의해 번역된 발현 단백질과 공동-발현되는 마커를 포함하는 융합 단백질의 존재 여부를 확인함으로써 발현 벡터에 의해 발현된 마이코플라스마 발현 단백질을 동정하는 단계; 및마이코플라스마의 발현 단백질의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19항에 있어서,상기 마이코플라스마가 마이코플라스마 하이오뉴모니아인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15항 내지 제 20항 중의 어느 한 항에 있어서,상기 마커가 폴리히스티딘 태그인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 16항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 동정된 뉴클레오티드 서열.
- 도 1a 내지 42 중의 어느 하나에 따른 서열, 또는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81 또는 SEQ ID NO:83 또는 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편을 가지는 마이코플라스마의 뉴클레오티드 서열.
- 제 22항 또는 제 23항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
- 제 24항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 12항에 따른 방법에 의해 동정된 단백질을 암호화하는 아미노산 서열.
- 도 1a 내지 42 중의 어느 하나에 따른 서열, 또는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO 62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82 또는 SEQ ID NO:84 또는 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편을 가지는 마이코플라스마의 아미노산 서열.
- 제 26항에 따른 아미노산 서열에 의해 암호화된 분리 및 정제된 폴리펩티드.
- 제 27항에 따른 아미노산 서열에 의해 암호화된 분리 및 정제된 폴리펩티드.
- 제 22항 또는 제 23항에 따른 뉴클레오티드 서열로부터 번역된 분리 및 정제된 폴리펩티드.
- 제 13항, 제 28항, 제 29항 또는 제 30항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드에 특이적인 항체.
- 제 31항에 있어서,상기 항체가 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
- 제 28항 내지 제 30항 중의 어느 한 항에 따른 항원 폴리펩티드를 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 감염 치료 방법.
- 필요한 동물에게 제 22항 또는 제 23항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 감염 치료 방법.
- 제 34항에 있어서,상기 DNA 분자가 제 24항에 따른 재조합 벡터를 통하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31항 또는 제 32항에 따른 폴리펩티드에 특이적인 항체를 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 감염 치료 방법.
- 제 33항 내지 제 36항에 있어서,상기 감염이 마이코플라스마 감염인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 37항에 있어서,상기 감염이 마이코플라스마 하이오뉴모니아 감염인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 34항 또는 제 35항에 있어서,상기 뉴클레오티드 서열이 도 1a 내지 42 중의 어느 하나에 따른 서열, 또는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81 또는 SEQ ID NO:83 또는 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 33항 내지 제 36항에 있어서,상기 폴리펩티드가 도 1a 내지 42 중의 어느 하나에 따른 아미노산 서열, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ IDNO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO 62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82 또는 SEQ ID NO:84 또는 돌연변이체, 유사체, 유도체 또는 기능적으로 활성인 이의 단편에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 방법.
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