JPH08294392A - 単純ヘルペスウイルスタンパク質をコードするｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のｇＤ糖タ
ンパク質またはその一部をコードする新規なＤＮＡ配列
を提供する。 【解決手段】 ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２のｇＤ糖タ
ンパク質遺伝子の位置確認および配列決定を行う。該遺
伝子を単離し、得られた遺伝子またはそのフラグメント
をプラスミドベクターに挿入して、生物学的に機能する
複製単位として働く組換えプラスミドを作製する。 【効果】 該組換えプラスミドで形質転換された単細胞
生物は、ＨＳＶに対するワクチンの免疫原として有用な
ｇＤ遺伝子産物を発現する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

１．発明の分野 本発明は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク
質に関係した新規なＤＮＡ配列に関する。本発明は、ウ
イルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはバクテリオファ
ージＤＮＡのようなＤＮＡベクター中に、糖タンパク質
Ｄ（ｇＤ）またはその一部をコードするＤＮＡ配列を挿
入する組換えＤＮＡ技術を利用するものであり、それに
より該ベクターが、バクテリア宿主あるいは他の単細胞
系中でｇＤ遺伝子を複製しかつその発現を誘導する能力
をもつようにするものである。得られた組換えＤＮＡ分
子を宿主細胞中に導入すると、宿主細胞によるｇＤまた
はその一部あるいは変異型分子の生産が可能となる。生
産されたタンパク質は、次に単離・精製され、そしてＨ
ＳＶタイプ１（ＨＳＶ−１）およびタイプ２（ＨＳＶ−
２）の両方の感染に対するワクチンの免疫原として用い
るために修飾される。

【０００２】

【従来の技術】

２．発明の背景技術 ２．１．組換えＤＮＡ技術および遺伝子発現 組換えＤＮＡ技術は、特定のＤＮＡ配列をＤＮＡベクタ
ー中に挿入して、宿主細胞中で複製することができる組
換えＤＮＡ分子を作製するものである。一般的に、挿入
されるＤＮＡ配列は受容ＤＮＡベクターに対して外来性
である。すなわち、挿入ＤＮＡ配列およびＤＮＡベクタ
ーは、自然界で遺伝情報の交換のない生物に由来するも
のであるか、あるいは挿入ＤＮＡ配列は、全体的にまた
は部分的に合成されたものである。近年、組換えＤＮＡ
分子の構築を可能とするいくつかの一般的方法が開発さ
れた。例えば、米国特許第４，２３７，２２４号（Ｃｏ
ｈｅｎ＆Ｂｏｙｅｒ）は、制限酵素およびライゲーショ
ン（連結）として知られる方法を用いて、このような組
換えプラスミド類を作製することを記述している。その
後、これらの組換えプラスミドは形質転換によって単細
胞生物中に導入され、複製される。米国特許第４，２３
７，２２４号に記載された技術の一般的な利用可能性の
ため、この特許は本明細書中へ参考として組み入れられ
る。

【０００３】組換えＤＮＡ分子を単細胞生物へ導入する
他の方法は、ＣｏｌｌｉｎｓおよびＨｏｈｎによって米
国特許第４，３０４，８６３号に記載されており、これ
も参考としてここに組み入れる。この方法は、バクテリ
オファージベクターを用いるパッケージング／形質導入
系を利用するものである。構築に用いる方法の如何にか
かわらず、組換えＤＮＡ分子は宿主細胞と適合すべきで
あり、すなわち、宿主細胞内で自律複製能をもつべきで
ある。組換えＤＮＡ分子はまた、組換えＤＮＡ分子によ
り形質転換された宿主細胞の選択を可能にするマーカー
機能をもつべきである。更に、適切な複製、転写および
翻訳シグナルの全てがプラスミド上に正確に配置される
場合には、外来遺伝子は形質転換細胞およびその子孫に
おいて適切に発現されるだろう。

【０００４】真核生物の細胞に感染するすべてのウイル
スに特徴的であるように、単純ヘルペスウイルスは真核
宿主細胞系を必要とし、その中でそのゲノムを複製する
ためにウイルス遺伝子が発現し、その子孫が生じる。真
核細胞中でのＤＮＡ複製のためのシグナルおよび調節要
素、遺伝子の発現およびウイルスの組立ては、原核細胞
のものとは異なる。これは、真核細胞中にのみ天然で発
現される遺伝子を、原核宿主細胞中で発現させようとす
る場合に非常に重要となる。

【０００５】これらの異なる遺伝子シグナルおよびプロ
セシング過程は、多くのレベルの遺伝子発現（例えば、
ＤＮＡ転写およびメッセンジャーＲＮＡ翻訳）を制御す
る。ＤＮＡの転写は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示
し、それによって転写を促進するＤＮＡ配列のプロモー
ターの存在に依存している。真核生物のプロモーターの
ＤＮＡ配列は原核生物プロモーターのものとは異なる。
更に、真核生物のプロモーターおよびそれに伴う遺伝子
シグナルは、原核生物系の中では認識されないものであ
るか、あるいは機能できないものである。

【０００６】同様に、原核生物中のメッセンジャーＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ）の翻訳は、真核生物とは異なる適切な原
核生物シグナルの存在に依存している。原核生物中のｍ
ＲＮＡの効率的な翻訳には、ｍＲＮＡ上のシャイン・ダ
ルガルノ（Ｓｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ；ＳＤ）配列
と称するリボソーム結合部位を必要とする。この配列は
ｍＲＮＡの短いヌクレオチド配列であり、タンパク質の
アミノ末端メチオニンをコードする開始コドン（ＡＵ
Ｇ）の前に位置している。ＳＤ配列は１６Ｓ ｒＲＮＡ
（リボソームＲＮＡ）の３’末端に対して相補的であ
り、多分ｒＲＮＡとの二重らせんを形成し、リボソーム
の正しい位置づけを可能にすることによって、ｍＲＮＡ
のリボソームへの結合を促進している。遺伝子発現を最
大とすることに関する考察のために、Ｒｏｂｅｒｔｓ
ａｎｄ Ｌａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ ６８：４７３（１９７９）を参照された
い。

【０００７】適切なシグナルが挿入されて、適切に位置
づけられた後でさえも、多くの因子が原核生物での真核
生物遺伝子の発現を複雑にしている。これらの因子の本
性および作用機構のはっきりとした理解が目下のところ
欠けている。こうした因子の１つは大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）および他のバクテリア中の活
性なタンパク質加水分解系の存在である。このタンパク
質分解系は、真核生物タンパク質のごとき「異常な」す
なわち外来のタンパク質を選択的に破壊するようであ
る。従って、バクテリア中で発現された真核生物タンパ
ク質を加水分解から保護する手段を開発することによっ
て多岐にわたる利用が可能となろう。１つの戦略は、真
核生物配列を原核生物遺伝子とｉｎ ｐｈａｓｅ（すな
わち、正しい読み枠）で連結することによって、融合タ
ンパク質産物（原核生物のアミノ酸配列と、外来すなわ
ち真核生物のアミノ酸配列とのハイブリッドであるタン
パク質）が得られるハイブリッド遺伝子を構築すること
である。

【０００８】ハイブリッド遺伝子の構築は、多くの真核
生物タンパク質（例えば、ソマトスタチン、ラットのプ
ロインシュリン、成長ホルモンおよび卵アルブミン様タ
ンパク質）をコードする遺伝子の分子クローニングにお
いて用いられた方法であった。更に、卵アルブミンおよ
びβ−グロビンの場合には、原核生物プロモーターがか
かる融合遺伝子配列に連結された（Ｇｕａｒｅｎｔｅ
ら，Ｃｅｌｌ ２０：５４３（１９８０））。Ｇｕａｒ
ｅｎｔｅらの系は、ＳＤ配列を含むｌａｃプロモーター
を、融合遺伝子のＡＴＧの前に異なる距離で挿入するこ
とを含むものである。幾つかの真核生物遺伝子の分子ク
ローニングおよび発現が達成されたが、これはｇＤ遺伝
子についてはこれまで行なわれていない。また、原核生
物宿主細胞中での外来すなわち真核生物遺伝子の発現は
日常的になし得るような技術状態にはない。

【０００９】２．２．ワクチン類 ウイルス感染の防御および治療には次の３つの基本的な
方法がある。すなわち、（１）能動免疫応答を引き出す
ワクチン、（２）ウイルス複製を抑制する化学療法剤、
および（３）インターフェロンの合成を導き出す薬剤で
ある。３つの方法全てを、感染を防ぐために用いること
ができるが、感染の初期に適用するときにより効果的で
ある。ワクチン注射、すなわち能動免疫感作は、感染が
始った後では通常効果がない。

【００１０】ワクチンは、一般に、免疫学的性質を破壊
することなく、ウイルスを無毒化することによって調製
される。伝統的には、これは不活化ワクチン用にウイル
スの感染性を不活化すること（すなわち、ホルムアルデ
ヒドのごとき種々の化学薬剤による処理によってウイル
スを「殺す」こと）、あるいは生ワクチン（弱毒化ワク
チン）用に無毒性あるいは弱毒化された（修飾された）
ウイルスを選択することによって達成される。弱毒化
は、ウイルスを普通でない状態（異なる動物宿主および
細胞培養物）に適応せしめることによって、または、大
きなウイルス接種材料を数多く継代させ、毒力を失った
ために徴候を全く現さないか、ほんの少しの徴候しか現
さない変異体を選択することによって得られる。獣医学
の分野でまだ用いられる少数のワクチンは、ウイルス増
殖がほとんど重大とならない部位に注射される完全に毒
力のある感染性ウイルスよりなるものである。この方法
はヒトに使用するには余りに危険であると考えられる。

【００１１】生ワクチンに用いる弱毒化ウイルスは、一
般的に優れた免疫原である。なぜならば、弱毒化ウイル
スは宿主中で増殖して、長く続く免疫性を引き出すから
である。弱毒化ワクチンは、全てのウイルス抗原（ウイ
ルス粒子の表面抗原と内部抗原の両方）に対する体液性
の抗体を誘導する。しかしながら、生ワクチンの使用に
は多くの問題が提起されており、例えばウイルスの不十
分な弱毒化、ウイルスの遺伝的不安定性、ワクチンウイ
ルスの増殖に用いた細胞培養物中の外部ウイルスによる
汚染、そして最後に、ワクチンの不安定性（例えば熱不
安定性）などがある。

【００１２】不活化ワクチン（増殖しない「死滅した」
あるいは不活化ウイルスを用いる）の使用は、生ワクチ
ンの使用に伴う難点を避けるものだが、死滅したウイル
スは、免疫化された動物の体内で増殖せず、通常、表面
成分に対する抗体のみをもたらす。しかし、不活化ワク
チンについての主な難点は、関連抗原の必要量を供給す
るのに十分なウイルスを生産することにある。不活化ワ
クチンの使用に伴う他の難点は、達成された免疫性が短
いためしばしば追加の免疫が必要となること、抗原部位
が不活化の化学的処理によって変えられるため免疫原性
が弱くなったり、あるいはウイルス感染を中和するのに
あまり効果的でない抗体を誘導すること、そして当該ワ
クチンがしばしば満足のゆくレベルのＩｇＡを誘導しな
いことである。

【００１３】サブユニットワクチンは、外被のない正二
十面体ウイルスのカプシドタンパク質または外被のある
ウイルスのペプロマー（糖タンパク質のスパイク）のご
とき、必要かつ適切な免疫原性物質のみを含むものであ
る。サブユニットワクチンは、高度に精製されたウイル
ス画分から関係のあるサブユニットを単離するか、ある
いは関係のあるポリペプチドを合成することによって作
ることができる。サブユニットワクチンの主な長所は、
ウイルス由来の遺伝物質の排除ならびに宿主またはドナ
ー由来の干渉性物質の排除にある。しかしながら、現在
のところ、これらの方法を用いてのサブユニットワクチ
ンの製造は、広く使われる商業用途には高価すぎる。組
換えＤＮＡ技術はサブユニットワクチンの製造に多くの
ものを提供し、ウイルスの関係のある免疫原性部分また
はそのタンパク質をコードするウイルス遺伝子の分子ク
ローニングおよび宿主細胞での発現が、サブユニットワ
クチンで使用するのに十分な量の免疫原をもたらすこと
ができる。

【００１４】ワクチンは、しばしば、種々のアジュバン
トを含む乳濁液として投与される。アジュバントは、免
疫原のみを投与した場合よりも少ない量の抗原を用い
て、少ない投与量で、持続する高レベルの免疫性を獲得
するのを助けるものである。アジュバントの作用機構は
複雑で、完全には理解されていない。しかしながら、そ
れは細網内皮系の食作用、他の活性の刺激、抗原の遅延
された放出および分解を含むかもしれない。アジュバン
トの例には、フロインドのアジュバント（完全または不
完全）、アジュバント６５（落下生油、マンニドモノオ
レエートおよびアルミニウムモノステアレートを含
む）、および水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム
またはミョウバンのごとき鉱物ゲルがある。フロインド
のアジュバントはヒトや食用動物のためのワクチンには
もはや用いられていない。なぜならば、それは非代謝性
鉱油を含み、しかも発癌物質の可能性があるからであ
る。しかし、鉱物ゲルは商業的動物用ワクチンに広く用
いられている。

【００１５】２．３．ヘルペスウイルス類 ヘルペスウイルス類（ヘルペトビリダエ：Ｈｅｒｐｅｒ
ｔｏｖｉｒｉｄａｅ）は大型のＤＮＡウイルスであり、
宿主の一生の間存続しうる潜在的感染を確立することで
有名である。表に現れない一次感染の後、ウイルスは、
照射または免疫抑制のごとき、いくつかの疑われる刺激
のどれかによって再活性化されるまで静止したままで残
存する。

【００１６】活動状態、つまり感染の急性形態は、増殖
感染または溶菌感染によって特徴づけられる。即ち、ウ
イルスが複製して、宿主細胞の機構を乗っ取り、感染性
の成熟ウイルス粒子を作り、そして細胞死を引き起こ
す。しかしながら、潜伏状態では、ウイルスは宿主の神
経節に潜んでいる。潜状中に感染性ウイルスが生産され
る証拠はほとんどない。

【００１７】大抵の一次感染は幼児期に起こり、表面に
現れない。感染は粘膜のウイルス接種から、あるいはウ
イルスが表皮の破れから皮膚の中に入ることにより生じ
る。従って、感染性ウイルスは密接な接触によって伝播
され得る。いったん獲得されると、ＨＳＶは生涯身体中
に保持され、そして患者は、無徴候であるか、あるいは
例えば口唇疱疹（通常「熱性疱疹」または「コールドソ
アス（ｃｏｌｄ ｓｏｒｅｓ）」と呼ばれる唇上の障
害）、歯肉口内炎（口および歯肉が小胞でおおわれ、そ
れが破れて潰瘍となる）、咽頭炎、扁桃炎、角結膜炎
（角膜炎または眼の角膜の炎症で、樹状潰瘍へと進行
し、最終的には角膜の瘢痕化をもたらし、盲目となる）
および陰部疱疹を含む粘膜皮膚病のごとき多くの臨床的
徴候をもたらす再発性の攻撃を受けやすい。稀には、Ｈ
ＳＶ感染は脳炎、疱疹性湿疹、外傷性疱疹、肝炎および
新生児疱疹を引き起こすことがある。

【００１８】活動的発生の間に、感染性ウイルスは病変
部位から、または周囲の体液、例えば口唇疱疹の場合に
は唾液から、単離することができる。これらの病変は、
特定の個体の身体の同じ部分に発生する傾向があり、月
経、日光または冷風への過剰暴露、下垂体または副腎ホ
ルモン、アレルギー反応、あるいは古典的には熱のごと
き多くの刺激によって引き起こされる。こうした発生の
間、患者はウイルスを放出しており、接触を介して他人
へ感染性ウイルスを伝播することができる。

【００１９】感染の潜状期の間、研究者らは、病変がそ
の後生じる部位以外の部位にこのウイルスが保持される
ことを実証した。この静止期の間、ウイルスは知覚神経
節のニューロン中に局在化され（顔の病変の場合には、
通常三叉神経節が関係する）、通常の患部から単離する
ことはできない。ほとんどの子供は一次感染から急速に
回復するが、時に、肝炎によって特徴づけられる播種性
新生児疱疹感染が冒された新生児を打ちのめすこととな
る。最も重症の感染は、感染している付添人から、より
一般的には感染母親から、誕生時に赤ん坊が産道で陰部
疱疹に出会うときに獲得される。女性および子供の外陰
部膣炎ならびにペニスの感染はＨＳＶ−２によって生じ
ると以前考えられていたが、最近の結果は、ＨＳＶ−１
またはＨＳＶ−２が原因となり得ることを示しており、
更に、女性の疱疹性の性病感染は子宮頚管の癌と関係し
ている。

【００２０】ヘルペス感染は今日の社会において頻発し
ている。現在、ＨＳＶ感染に対しての治療法はなく、最
近の治療はＤＮＡ合成を抑制する化合物を使用するもの
である。もちろん、これらの化合物はウイルスのＤＮＡ
合成ばかりでなく分裂している細胞のＤＮＡ合成をも抑
制するという点で非選択的である。更に、これらの化合
物は活動期の感染の間だけ有効であり、これまで、潜伏
期の効果については実証されていない。

【００２１】ヘルペスウイルスは真核生物のウイルスで
あり、大きさ８０×１０^６〜１５０×１０^６ダルトンの
範囲の線状の二本鎖ＤＮＡゲノムを含んでいる。各ウイ
ルス粒子は正二十面体のヌクレオカプシドと、成熟期お
よび出芽期に宿主細胞の脂質二重層から分離されること
により形成される膜エンベロープを有する。ウイルスエ
ンベロープは、一部は膜中に存在するが、膜エンベロー
プから外側に突き出ている多くのウイルス特異的タンパ
ク質を含む脂質二重層である。一次感染の間に、膜エン
ベロープはウイルス粒子が細胞中に効率的に侵入するた
めに必要である。脂質二重層の外側にあるウイルスタン
パク質と特異的に結合する抗体は、ウイルス感染を中和
する能力がある。ウイルスの細胞への侵入にとって最も
重要なウイルスタンパク質は糖タンパク質（糖分子が結
合しているタンパク質分子）である。単純ヘルペスウイ
ルスタイプ−１（ＨＳＶ−１）およびタイプ−２（ＨＳ
Ｖ−２）は、互いに抗原的に区別される少なくとも４つ
の異なる糖タンパク質を作る。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ
−２からのこれらのタンパク質のあるものは共通のエピ
トープ（即ち、抗原部位または抗体結合部位）を有す
る。このようなタンパク質の一例は４９，０００〜５
８，０００ダルトンの糖タンパク質であり、ｇＤと称さ
れる。ＨＳＶ−１ ｇＤに対する多価抗血清はＨＳＶ−
１とＨＳＶ−２の両方の感染を中和する能力がある
（Ｎｏｒｒｉｌｄ，１９７９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐ
ｉｃｓ ｉｎ ＭｉＣｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１９：６７）。

【００２２】

【発明が解決しようとする課題】

３．発明の概要 単細胞宿主生物中でのＨＳＶ糖タンパク質遺伝子のクロ
ーニングおよび発現のための方法ならびに組成物が提供
される。また、これらの新規な単細胞生物を培養してＨ
ＳＶ遺伝子産物を生産する方法およびその遺伝子産物を
精製する方法が記述される。ここに記述された組変えＤ
ＮＡ技術によって生産されたｇＤ関連タンパク質は、Ｈ
ＳＶ−１およびＨＳＶ−２感染を防御するためのワクチ
ンの免疫原として用いるために製剤化され得る。

【００２３】ＨＳＶ−１のｇＤ遺伝子（ＨＳＶ−１パッ
トン株から単離されたもの）は、タイプ間組換え分析と
ｍＲＮＡマッピングによって、ウイルスゲノムにおいて
同定された。いったん当該遺伝子がＤＮＡの特定セグメ
ント上に局在化されたら、そのヌクレオチド配列が決定
され、そしてｇＤタンパク質のアミノ酸配列が推定され
た。

【００２４】ＨＳＶ−２のｇＤ遺伝子（ＨＳＶ−２ Ｇ
株から単離されたもの）は、ＨＳＶ−１ゲノム中のｇＤ
の位置決定から類推して、また、ハイブリダイゼーショ
ン分析によってウイルスゲノムにおいて同定された。そ
の後、単離されたｇＤ遺伝子または遺伝子フラグメント
（タイプ１またはタイプ２）をプラスミドベクター中に
挿入して、生物学的に機能する複製単位として働く組換
えプラスミドを作製した。これらの組換えプラスミド
は、適合性の宿主細胞の形質転換の際にｇＤ遺伝子の複
製および発現を容易にするように構築された。更に、こ
れらのプラスミドはｇＤ遺伝子を活発に発現する形質転
換微生物の一段階同定を提供する。最後に、発現された
遺伝子産物を単離する方法およびワクチンの処方に用い
る方法が記述される。

【００２５】

【課題を解決するための手段】

４．図面の説明 本発明は、以下の本発明の詳細な説明、本発明の特定の
実施態様の例および添付の図面を参照することによって
より十分に理解されよう。図１ａは、ＨＳＶ−１ゲノム
を示し、ＨＳＶ−１のｇＤ遺伝子（以下ｇＤ−１遺伝子
と記す）のある短いユニーク領域（Ｕｓ）の位置を示
す。

【００２６】図１ｂは、ラムダｇｔＷＥＳ：：ＥＣｏＲ
Ｉ−ＨのＨＳＶ−１ＥＣｏＲＩ−Ｈフラグメント挿入物
の制限地図を示す。議論に関係のある制限部位のみを示
してある。制限酵素認識配列を次の略号で示す：Ｂａｍ
ＨＩ（Ｂａ４〜Ｂａ８）；ＢｇｌＩＩ（Ｂｇ２）；Ｂｓ
ｔＥＩＩ（Ｂｓ）；ＥｃｏＲＩ（ＲＩ）；ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ（Ｈ３）；ＫｐｎＩ（Ｋｐ）；ＰｖｕＩＩ（Ｐｖ）；
ＳａｃＩ（Ｓｃ）；ＳａｌＩ（Ｓａ）；およびＸｈｏＩ
（Ｘｈ）。

【００２７】図１ｃは、ｐＢＲ３２２へのラムダｇｔＷ
ＥＳ：ＥＣｏＲＩ−ＨのＢａｍＨＩ−８からＢａｍＨＩ
−７までのフラグメントの挿入を含むｐＲＷＦ６の構築
を示す。図１ｄは、ｐＳＣ３０−４のＨＳＶ−１ Ｓａ
ｃＩ ＤＮＡフラグメント挿入物の制限地図を示す。棒
線（拡大された領域）はｇＤ−１ｍＲＮＡコード配列の
局在および位置を示す。

【００２８】図２は、ｇＤ−１遺伝子配列の配列決定戦
略と制限地図を示す。コード領域は棒線（拡大された領
域）によって示され、非コード領域は単線（細線）によ
って示される。フラグメントの単離、標識付けおよび二
次消化に用いる制限エンドヌクレアーゼ切断部位を示し
てある。水平の矢印は配列が決定されたＤＮＡの領域を
示し、制限地図の上のものは非コード鎖配列が決定され
たことを示し、制限地図の下のものは鋳型鎖配列が決定
されたことを示す。

【００２９】図３は、ｇＤ−１遺伝子のヌクレオチド配
列およびｇＤ−１タンパク質の推定されたアミノ酸配列
を示す。関係のある制限部位が示され、そしてｇＤ−１
のアミノコード末端における番号を付けた垂直の矢印
は、次の組換えプラスミド中のｐＪＳ４１３へのｇＤ−
１アミノコード末端の連結部位を示す：ｐＥＨ５１，ｐ
ＥＨ６０，ｐＥＨ６２，ｐＥＨ６６，ｐＥＨ７１，ｐＥ
Ｈ７３およびｐＥＨ７３（これらはｇＤ−１配列の残部
からその天然のＴＡＧまでを含む）；およびｐＥＨ４−
２，ｐＥＨ８２，ｐＥＨ３−２５およびｐＥＨ９０−Ｎ
系列（これらはＣｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラクトシダー
ゼ融合タンパク質をコードする）。ｇＤ−１のカルボキ
シコード末端における番号を付けた垂直の矢印は、
（１）次の組換えプラスミド：ｐＥＨ４−２、ｐＥＨ８
２、ｐＥＨ３−２５中のｐＪＳ４１３のβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子（ｚ遺伝子）；または（２）プラスミドの
ｐＥＨ９０−Ｎ系列中のｐＨＫ４１４のｚ遺伝子へのｇ
Ｄ−１カルボキシコード末端の連結部位を示す。

【００３０】図４（一定の比率で描かれていない）は、
ｇＤ−１遺伝子の一部および大腸菌の発現ベクターｐＪ
Ｓ４１３から誘導された組換えプラスミドｐＥＨ２５の
構築を示す。組換えプラスミドｐＥＨ２５は、発現ベク
ターに由来する「リーダー」配列（ｃｒｏ）に連結され
たｇＤ−１コード配列の約８７％によってコードされた
ＨＳＶ−１ｇＤ関連タンパク質の生産をもたらす。

【００３１】図５は、ｐＥＨ２５中のＣｒｏ／ｇＤ−１
接合部のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。図
６は、ＨＳＶ感染Ｈｅｌａ細胞の溶解液中に存在する競
合抗原を添加することによるｐＥＨ２５ｇＤ産物の免疫
沈降の阻害を示す。図７（一定の比率で描かれていな
い）は、ｐＥＨ２５から誘導されたｇＤ−１発現プラス
ミドｐＥＨ４−２の構築を示し、このプラスミドでは、
ｇＤ−１コード配列の３’末端の２０５ヌクレオチド
（６９アミノ酸）が欠失されて、大腸菌のβ−ガラクト
シダーゼタンパク質をコードする約３，０００ヌクレオ
チドで置換される。この組換えプラスミドは、ｇＤ−１
特定タンパク質の各末端に大腸菌関連ポリペプチド（即
ち、Ｃｒｏ及びβ−ガラクトシダーゼ）が融合された
「サンドイッチ」タンパク質（即ち、融合タンパク質）
の生産をもたらす。

【００３２】図８（一定の比率で描かれていない）は、
多くのｇＤ−１発現プラスミドｐＥＨ５０＋ｘ（それぞ
れがｇＤ遺伝子のアミノコード末端の可変部分を含む）
を作製する方法を示す。図９（一定の比率で描かれてい
ない）は、β−ガラクトシダーゼに融合されたｇＤ−１
タンパク質がｐＥＨ８２で形質転換された宿主細胞によ
って発現されるように、ｐＥＨ４−２中のｇＤ−１遺伝
子のアミノコード末端を再構築する方法を示す。

【００３３】図１０（一定の比率で描かれていない）
は、ｐＥＨ３−２５とｐＨＫ４１４から誘導されたｇＤ
−１発現プラスミドｐＥＨ９０−１０ａｍの構築を示
す。組換えプラスミドｐＥＨ９０−１０ａｍは、アンバ
ーサプレッサーｔＲＮＡを含む大腸菌形質転換体でのβ
−ガラクトシダーゼに融合されたまたは融合されていな
いｇＤ−１の両方の生産を可能とする。

【００３４】図１１ａは、ＨＳＶ−２ゲノムを表し、ま
たＨＳＶ−２のｇＤ遺伝子（以後、ｇＤ−２遺伝子と記
す）がある短いユニーク領域（Ｕｓ）内のＢｇｌＩＩフ
ラグメントの位置を示す。Ｌフラグメントを規定するＢ
ｇｌＩＩ制限部位はＢｇと示してある。図１１ｂは、ｐ
ＨＶ１のＢｇｌＩＩ Ｌフラグメント挿入物の制限地図
を示す。関係のある制限エンドヌクレアーゼ認識部位の
みを示す。制限酵素認識部位を次の略号で示す：Ｂａｍ
ＨＩ（Ｂａ）；ＢｇｌＩＩ（Ｂｇ）；ＣｌａＩ（Ｃ）；
ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ３）；ＰｖｕＩＩ（Ｐｖ）；Ｓａｌ
Ｉ（Ｓａ）；ＳａｃＩ（Ｓｃ）；ＳｐｈＩ（Ｓｐ）；お
よびＸｈｏＩ（Ｘｈ）。棒線（拡大された領域）はｇＤ
−２ ｍＲＮＡコード配列の局在および位置を示す。

【００３５】図１１ｃは、ｐＨＶ２のＨＳＶ−２ Ｘｈ
ｏＩ ＤＮＡフラグメント挿入物の制限地図を示す。図
１２は、ｇＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列およびｇＤ
−２タンパク質の推定アミノ酸配列を示す。関係のある
制限部位を示してあり、またｇＤ−２遺伝子のアミノコ
ード末端における番号を付けた垂直の矢印は、組換えプ
ラスミドｐＨＶ５（ｇＤ−２の全カルボキシコード末端
を含む）およびｐＨＶ６中のｐＪＳ４１３へのｇＤ−２
アミノコード末端の連結部位を示す。ＢａｍＨＩ部位
は、ｐＨＶ６中のｐＨＫ４１４のｚ遺伝子へのｇＤ−２
カルボキシコード末端の連結部位である。

【００３６】図１３は、ｇＤ−１とｇＤ−２の推定アミ
ノ酸配列の比較を示す。アミノ酸残基は一文字表記で表
してある。ｇＤ−１およびｇＤ−２において相同なアミ
ノ酸残基は、ｇＤ−２配列中のダッシュで示される。ｇ
Ｄ−２配列はｇＤ−１配列よりも１アミノ酸残基だけ短
い。ｇＤ−２中の「欠失している」アミノ酸には星印
（＊）が付けてある。

【００３７】図１４（一定の比率で描かれていない）
は、ｇＤ−２遺伝子の一部およびｐＪＳ４１３から誘導
された組換えプラスミドｐＨＶ５の構築を示す。組換え
プラスドｐＨＶ５は、発現ベクターに由来する「リーダ
ー」配列（ｃｒｏ）に連結されたｇＤ−２コード配列の
約９０％によってコードされたＨＳＶ−２ｇＤ関連タン
パク質の生産をもたらす。

【００３８】図１５は、ｐＨＶ５から誘導されたｇＤ−
２発現プラスミドｐＨＶ６の構築を示し、このプラスミ
ドでは、ｇＤ−２コード配列の３’末端の２５９ヌクレ
オチド（８６アミノ酸）が欠失されて、大腸菌のβ−ガ
ラクトシダーゼタンパク質をコードする発現プラスミド
ｐＨＫ４１４由来の約３，０００追加ヌクレオチドで置
換される。この組換えプラスミドｐＨＶ６は、ｇＤ−２
特定タンパク質の各末端に大腸菌関連ポリペプチド（即
ち、Ｃｒｏおよびβ−ガラクトシダーゼ）が融合された
「サンドイッチ］タンパク質（即ち、融合タンパク質）
の生産をもたらす。

【００３９】５．発明の説明 本発明は、組換えＤＮＡ技術を使用して、ワクチン製剤
において免疫原として用いることのできるＨＳＶタンパ
ク質に関連したポリペプチドを生産することに関する。
より詳細には、ｇＤ関連タンパク質の生産を記述する。
ＨＳＶ−１ｇＤに対する多価抗血清はＨＳＶ−１とＨＳ
Ｖ−２の両方を中和する能力を有するので、純粋なｇＤ
タンパク質またはその抗原的に重要な部分は、ＨＳＶ−
１およびＨＳＶ−２の両方の一次感染からレシピエント
を効率よく防御しうるサブユニットワクチンにおいて使
用できるかもしれない。

【００４０】ここに記載したごとく構築された組換えプ
ラスミドは、宿主細胞内での分解に抵抗して安定なｇＤ
関連ポリペプチドであるタンパク質の宿主細胞生産をも
たらす。こうしたプラスミドはｇＤの免疫学的抗原決定
基を含むｇＤ関連タンパク質または融合タンパク質を大
量に生産することを可能にする。しかしながら、ここに
記述したＤＮＡ組成物はｇＤ関連タンパク質の生産に限
定されず、ＨＳＶタンパク質に関連するポリペプチドの
生産に用いることができる。多種の免疫原およびワクチ
ン製剤を製造できることが容易に理解されよう。

【００４１】本発明の方法は、説明の目的で次の階段に
分けることができる。即ち、（１）ＨＳＶ糖タンパク質
遺伝子または遺伝子フラグメントの同定および単離、
（２）単細胞生物の形質転換に用いる組換えＤＮＡ分子
を作製するための、クローニング発現ベクターへの当該
遺伝子または遺伝子フラグメントの挿入、（３）当該遺
伝子を複製して発現することができる形質転換単細胞生
物の同定および増殖、（４）当該遺伝子産物の同定およ
び精製、そして（５）中和抗体の生産を引き出すその能
力を評価することによる遺伝子産物の免疫能の測定。明
確にする目的で、全方法をｇＤ遺伝子に関して論じる。
しかしながら、同じ技術を同様に使用して、ＨＳＶ糖タ
ンパク質に関連するポリペプチドを同様に生産すること
ができる。

【００４２】５．１．ＨＳＶ糖タンパク質遺伝子の同定
および単離 ＨＳＶ糖タンパク質（ｇＤ）は、ＨＳＶタイプ１または
タイプ２の株から得ることができる。ｇＤ遺伝子（また
はその部分）の単離は、まず、ＨＳＶのＤＮＡを単離す
ること、ＨＳＶのＤＮＡフラグメントを作製すること、
そして糖タンパク質遺伝子配列を含むフラグメントを同
定することを含む。同定の前に、ＨＳＶＤＮＡフラグメ
ントを、通常、クローニングベクターに連結し、そのベ
クターを宿主細胞の形質転換に用いる。これにより多重
コピー数のＨＳＶ ＤＮＡフラグメントの生成が可能と
なり、分析および同定の操作に十分な供給が可能とな
る。

【００４３】ＨＳＶのＤＮＡは、（１）ウイルスに感染
した真核生物細胞から精製されたウイルスよりＤＮＡを
直接単離することによって、あるいは（２）ｇＤ遺伝子
を含むウイルスゲノムの一部を含むバクテリオファージ
またはプラスミドから、得ることができる。ＨＳＶのＤ
ＮＡフラグメントを作るためには、当該ＤＮＡを特定の
位置で制限酵素により切断するか、マンガンの存在下で
ＤＮアーゼを用いてＤＮＡを断片化するか、またはＤＮ
Ａを例えば音波処理によって物理的に破砕する。その
後、線状ＤＮＡフラグメントは、アガロースまたはポリ
アクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィ
ーを含むがこれらに限らない標準的技術によって、大き
さにより分離することができる。

【００４４】任意の制限酵素または制限酵素の組合せを
用いて、ｇＤ配列を含むＨＳＶ ＤＮＡフラグメントを
作製することができるが、ただし、当該酵素はｇＤ遺伝
子産物の免疫能を破壊しないものである。例えば、タン
パク質の抗原部位は約７〜１４のアミノ酸から成り得
る。従って、ｇＤの大きさのタンパク質は多くの異なる
抗原部位をもつことができ、重複配列、２次構造、そし
てアセチル化、グリコシル化、リン酸化などのプロセシ
ング過程を考慮すると、おそらく数千の抗原部位がある
と思われる。従って、多くの部分ｇＤ遺伝子配列が抗原
部位をコードできよう。その結果、多数の制限酵素の組
合せを用いてＤＮＡフラグメントを作製することがで
き、当該ＤＮＡフラグメントは、適切なベクター中に挿
入されると、異なる抗原決定基を有するｇＤ特異的アミ
ノ酸配列を単細胞生物において産生させることができよ
う。

【００４５】ＨＳＶ ＤＮＡフラグメントを含むこれら
の組換えＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転換は多コピ
ー数のウイルスＤＮＡの生成を可能にし、その後、ウイ
ルスＤＮＡはｇＤ遺伝子配列を含むフラグメントを同定
するために分析され得る。クローニングベクターへのＨ
ＳＶ ＤＮＡ制限フラグメントの挿入は、クローニング
ベクターが相補的な接着末端を有する場合に、容易に達
成される。しかし、ＨＳＶ ＤＮＡの断片化に用いた相
補的制限部位がクローニングベクター中に存在しないと
きは、ＨＳＶ ＤＮＡまたはクローニングベクターの両
末端を修飾することができる。このような修飾には、一
本鎖のＤＮＡ末端を消化して平滑末端とすること、また
は平滑末端連結が可能なように一本鎖末端を修復するこ
とが含まれる。また、ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列
（リンカー）を連結することによって所望の末端を作る
こともでき、連結されるリンカーは制限酵素認識配列を
コードする化学的に合成された特定のオリゴヌクレオチ
ドを含み得る。他の方法に従って、開裂されたベクター
とＨＳＶ ＤＮＡフラグメントをホモポリマーテイリン
グによって修飾してもよい（Ｍｏｒｒｏｗ，１９７９，
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：３
を参照のこと）。

【００４６】ｇＤ遺伝子を含む特定ＤＮＡフラグメント
の同定は多くの方法によってなされ得る。第一に、ウイ
ルスＤＮＡフラグメントの配列を決定し（Ｍａｘａｍ
＆Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５：４９９）、次に推定され
たアミノ酸配列をｇＤタンパク質のアミノ酸配列と比較
することによりｇＤ遺伝子配列を含むフラグメントを同
定することが可能である。第二に、ｇＤ遺伝子を含むフ
ラグメントをｍＲＮＡ選択によって同定し得る。ＨＳＶ
ＤＮＡフラグメントはハイブリダイゼーションにより
相補的ｍＲＮＡを単離するために用いられる。単離され
たｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物の免疫沈降分析
によりｍＲＮＡを同定し、それゆえ、ｇＤ遺伝子配列を
含む相補的ＨＳＶ ＤＮＡフラグメントを同定する。最
後に、ｇＤ特異的ｍＲＮＡは、ＨＳＶ感染細胞から単離
されたポリソームを、ｇＤに対する固定化モノクローナ
ル抗体に吸着せしめることによって選択できる。放射性
標識されたｇＤｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、（吸着され
たポリソームから）選択されたｍＲＮＡを鋳型として用
いて合成することができる。その後、放射性標識された
ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡをプローブとして用いて、ｇＤ
配列を含むＨＳＶ ＤＮＡフラグメントを同定すること
ができる（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５，ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．９８：５０３；Ａｌｗｉｎｅら，１９７９，
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６８：２
２０）。

【００４７】ｇＤ遺伝子の別の単離法には、限定するも
のではないが、遺伝子配列そのものを化学的に合成する
こと（ただし、当該配列が知られているという条件
で）、またはｇＤ遺伝子をコードするｍＲＮＡに対する
ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）を作製することが含まれる。こ
れを達成するためには、ｇＤに特異的なｍＲＮＡをウイ
ルス感染細胞から単離する。次に、標準的技術によって
単離されたｍＲＮＡをｃＤＮＡコピーに変換し、そして
クローニングベクターに直接挿入する。

【００４８】単離した遺伝子、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮ
Ａ配列を含む組換えＤＮＡ分子により宿主細胞を形質転
換することは、多コピー数の遺伝子の生成を可能にす
る。従って、形質転換体を増殖させ、組換えＤＮＡ分子
をその形質転換体から単離し、単離された組換えＤＮＡ
から挿入遺伝子を回収することによって当該遺伝子をマ
イクログラムの量で得ることができる。また、マイクロ
グラム量のｇＤ遺伝子は、ｇＤ遺伝子供給源から、例え
ば、感染動物細胞中の単純ヘルペスウイルス、または組
換えプラスミド中にウイルス遺伝子を含むバクテリアも
しくはファージから得ることもできる。ウイルスあるい
はプラスミドＤＮＡは当該遺伝子の位置確認に用いられ
る方法と同じ方法で単離され、断片化され、そして大き
さにより分画化される。

【００４９】５．２．ＨＳＶ糖タンパク質遺伝子のクロ
ーニング発現ベクターへの挿入 いったん単離されたら、ｇＤ遺伝子または遺伝子フラグ
メントを適切な発現ベクター中へ、即ち、挿入された遺
伝子の転写および翻訳に必要な要素を含むベクター中へ
挿入する（Ｒｏｂｅｒｔｓ ＆ Ｌａｕｅｒ，１９７
９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６
８：４７３）。ｇＤ遺伝子（または当該遺伝子の一部）
を効率よく発現させるためには、プロモーターが発現ベ
クター中に存在しなければならない。ＲＮＡポリメラー
ゼは普通はプロモーターに結合して、遺伝子または連結
された遺伝子と調節要素の一群（オペロンと言う）の転
写を開始する。プロモーターはその「強度」、即ち、転
写を促進する能力がさまざまである。分子クローニング
のためには、高レベルの転写、ひいては、高レベルの遺
伝子発現を得るように強力なプロモーターを用いること
が望ましい。使用した宿主細胞系に応じて、多くの適当
なプロモーターのうちの一つを用いることができる。例
えば、大腸菌宿主細胞系にクローニングする場合は、大
陽菌、そのバクテリオファージまたはプラスミドから単
離されたプロモーターを用いることができる（例：ｌａ
ｃプロモーター）。更に、組換えＤＮＡまたは他の合成
ＤＮＡ技術によって作られた大腸菌プロモーターを用い
て、挿入された遺伝子の転写を促進させてもよい。より
詳細には、コリファージラムダのＰ_ＲおよびＰ_Ｌプロモ
ーターは隣接ＤＮＡセグメントの高レベル転写を支配す
る。更に、大腸菌由来のｒｅｃＡプロモーターは隣接フ
ラグメントの高レベルの遺伝子転写をもたらす。

【００５０】原核細胞および真核細胞内での効率的な遺
伝子転写および翻訳には、特定の開始シグナルも必要と
なる。これらの転写および翻訳開始シグナルは、遺伝子
特異的メッセンジャーＲＮＡおよび合成されたタンパク
質の量で測定したところ、「強度」がさまざまである。
プロモーターを含むＤＮＡ発現ベクターは、さらに、種
々の「強力」な転写および／または翻訳開始シグナルの
任意の組合せを含んでいてもよい。こうして、宿主細胞
リボソームにより利用され得るＳＤ−ＡＴＧの組合せが
用いられる。このような組合せには、コリファージラム
ダのｃｒｏ遺伝子またはＮ遺伝子由来の、または大腸菌
トリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ、ＢまたはＡ遺伝子由来のＳ
Ｄ−ＡＴＧの組合せがあるが、これらに限らない。更
に、組換えＤＮＡまたは他の合成技術によって作られた
ＳＤ−ＡＴＧの組合せも用いることができる。

【００５１】プロモーターと他の調節要素をベクター内
の特定の部位に連結させるには、ＤＮＡフラグメントを
ベクターに挿入するために上述した方法を用いることが
できる。かくして、ｇＤ遺伝子（またはその一部）は、
発現ベクターのプロモーターおよび調節要素に対して特
定の位置で連結され、それによりｇＤ遺伝子配列はベク
ターＡＴＧ配列に関して正しい翻訳リーディングフレー
ム（即ち、ｉｎ ｐｈａｓｅ）で存在するようになる。
これとは別に、ｇＤのＡＴＧや合成ＡＴＧを用いてもよ
い。得られた組換えＤＮＡ分子は、その後、（ベクター
／宿主細胞系に応じて）形質転換、形質導入またはトラ
ンスフェクションにより適切な宿主細胞内に導入され
る。形質転換体はベクター中に通常存在する適当な遺伝
子マーカーの発現に基づいて選択され、例えばｐＢＲ３
２２中のアンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐
性、あるいは真核生物宿主系におけるチミジンキナーゼ
活性などがある。このようなマーカータンパク質の発現
は、組換えＤＮＡ分子が無傷で、複製していることの指
標となる。発現ベクター（通常マーカー機能を含むも
の）としては次のベクターまたはその誘導体が挙げられ
る：ＳＶ４０およびアデノウイルスベクター、酵母ベク
ター、バクテリオファージベクター（例えば、ラムダｇ
ｔ−ＷＥＳ−ラムダＢ、Ｃｈａｒｏｎ ２８、Ｃｈａｒ
ｏｎ ４Ａ、ラムダｇｔ−１−ラムダＢｃ、ラムダｇｔ
−１−ラムダＢ、Ｍ１３ｍｐ７、Ｍ１３ｍｐ８、Ｍ１３
ｍｐ９）またはプラスミドＤＮＡベクター（例えば、ｐ
ＢＲ３２２、ｐＡＣ１０５、ｐＶＡ５１、ｐＡＣＹ１７
７、ｐＫＨ４７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＢ１１０、ｐ
ＭＢ９、ｐＢＲ３２５、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐ
ＢＲ３１３、ｐＭＬ２１、ＲＳＦ２１２４、ｐＣＲ１ま
たはＲＰ４）。本発明の実施例に用いた発現ベクターは
米国特許出願第４４９，１８７号（１９８２年１２月１
３日出願）に詳述されており、その教示内容を参考とし
てここに組み入れる。

【００５２】更に、宿主細胞株は、特に誘導するとき以
外は、プロモーターの作用を抑制するものが選択され
る。この方法において、９５％以上のベクタープロモー
ターの有効性が非誘導細胞において抑制され得る。ある
オペロンでは、挿入ＤＮＡの効率的な転写および翻訳の
ために、特定の誘導物質を添加することが必要であり、
例えば、ｌａｃオペロンはラクトースまたはＩＰＴＧ
（即ち、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）の
添加によって誘導される。種々の他のオペロン、例えば
ｔｒｐ、ｐｒｏなどは異なる制御下にある。ｔｒｐオペ
ロンはトリプトファンが増殖培地中に存在しない場合に
誘導され、そしてラムダのＰ_Ｌプロモーターは、温度感
受性のラムダリプレッサータンパク質（例：ＣＩ８５
７）を含む宿主細胞における温度の上昇により誘導され
る。こうして、遺伝子工学的に操作されたｇＤタンパク
質の発現が制御され得る。このことは、クローン化され
た遺伝子のタンパク質産物が宿主細胞に致死的である場
合に重要となる。このような場合には、外来遺伝子が複
製されるものの、形質転換体の増殖中には発現されな
い。細胞が増殖培地中で適当な密度に達した後に、プロ
モーターはタンパク質の生産のために誘導され得る。

【００５３】上記のように構築されたプラスミド（即
ち、天然ｇＤ翻訳終止シグナルで終止し、そしてベクタ
ー、ｇＤ遺伝子または合成配列によって提供されるＡＴ
Ｇで開始する、ｇＤ−関連タンパク質の発現を誘導する
プラスミド）で形質転換された細胞により産生されるｇ
Ｄ−関連タンパク質は、以後、非融合ｇＤタンパク質ま
たは非融合ｇＤ−関連タンパク質と称する。

【００５４】５．３．融合タンパク質の生産 特定の形質転換体による遺伝子発現のレベルを最大にす
るために、目的の遺伝子を、宿主細胞タンパク質の如き
他のタンパク質をコードする遺伝子に連結することが望
ましい。宿主細胞タンパク質がもともと検出可能な機能
を含む場合には、更なる利点が得られる。連結された遺
伝子の発現により、融合タンパク質産物（以後、ｇＤ融
合タンパク質という）が得られ、これはその大きな分子
量および検出可能な機能に基づいて同定できる。例え
ば、ｇＤ／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の生産
は、大腸菌宿主内でのｇＤのクローニングおよび発現に
対しいくつかの利点を提供する。第一に、Ｍｉｌｌｅｒ
の方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．
１９７２，ｐｐ．４７−５５および３５２−３５５）に
従ってβ−ガラクトシダーゼ活性に特異的な比色定量ア
ッセイを用いて、ベクターによって誘導されたタンパク
質生産（それゆえ、発現）のレベルを概算することが可
能となる。第二に、融合タンパク質の生産が該タンパク
質産物の同定および単離を単純化する。大腸菌形質転換
体により産生された非融合ｇＤタンパク質はｇＤ／β−
ガラクトシダーゼ融合タンパク質よりも小さく、このた
めＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析
されたいくつかの他の宿主タンパク質と共泳動する。し
かしながら、産生された融合タンパク質は、その独特な
大きな分子量のために、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）によって容易に検出および
同定できる。

【００５５】本発明は、β−ガラクトシダーゼ融合タン
パク質の生産に限るものではない。真核生物または原核
生物由来の任意の遺伝子をｇＤ遺伝子（またはＨＳＶタ
ンパク質遺伝子）と同一のリーディングフレーム（ｉｎ
Ｐｈａｓｅ）で連結させて、β−ガラクトシダーゼ融
合タンパク質産物と同様の利点を得ることができる。そ
の例として、ガラクトキナーゼ；ｔｒｐＤ、Ｅまたはリ
ーダー；ピリ（線毛）遺伝子；それに真核生物の遺伝
子、例えば、チミジンキナーゼ、β−グロビン、ＳＶ−
４０Ｔ−抗原あるいはラウス肉腫ウイルス形質転換遺伝
子を挙げることができるが、これらに限らない。

【００５６】融合タンパク質をコードする遺伝子を構築
するためには、２つの遺伝子を、翻訳リーディングフレ
ームが維持されかつ終止シグナルによって妨害されない
ように、それらのコード配列内で接合する必要がある。
また、先に説明したように、宿主細胞がプロモーターの
作用を抑制する株である場合には、融合タンパク質は誘
導に応答したときのみ生産される。

【００５７】５．４．遺伝子産物の同定 ひとたび正しいＤＮＡ構築物を含む形質転換体が同定さ
れると、組換えＤＮＡｇＤ遺伝子産物の免疫反応性およ
び抗原性の分析が必要となる。宿主細胞が天然に存在す
るＨＳＶ−ｇＤと同じパターンでｇＤ遺伝子産物をグリ
コシル化する能力がない場合は、ｇＤ遺伝子産物は天然
のｇＤ糖タンパク質と異なるだろう。それゆえ、免疫学
的分析がｇＤ遺伝子産物にとって特に重要となる。なん
となれば、最終目標がこのように生産されたｇＤ関連タ
ンパク質をワクチン製剤中で用いることにあるからであ
る。免疫反応性の分析は、ＨＳＶ感染細胞のｇＤ糖タン
パク質に対する抗血清を用いて行うのが最も簡単である
が、抗原性はｇＤ遺伝子産物による免疫感作に応答して
生じる試験動物の抗血清力価およびＨＳＶ感染を中和す
る該抗血清の能力を測定することにより評価することが
できる。

【００５８】免疫反応性を分析するにあたっては、全ウ
イルスまたは特にｇＤに対して誘導された多価抗体調製
物を含め、さまざまな抗血清を利用することができる。
ｇＤタンパク質分子上のたった１つの抗原部位を認識す
るモノクローナル抗体を用いることにより、より高い特
異性が得られる。ｇＤに対するモノクローナル抗体は多
々存在し、その一部はＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のｇ
Ｄ遺伝子産物を特異的に免疫沈降させるばかりか、どち
らのウイルスの感染性も中和するものである。

【００５９】したがって、本発明で述べたタンパク質の
同定は２つの要件に基づく。第一に、ｇＤ−関連タンパ
ク質はプロモーターの誘導に応答してのみ産生されるべ
きである。第二に、ｇＤ−関連タンパク質は、ＨＳＶに
対する種々のポリクローナル抗体あるいはｇＤに対する
モノクローナル抗体と免疫反応性であるべきであり、該
タンパク質が全遺伝子配列から、遺伝子配列の一部か
ら、または融合タンパク質の生産をもたらすように連結
された２以上の遺伝子配列から生じたものであろうと、
免疫反応性であるべきである。この反応性は、標準的な
免疫学的技術により、例えば免疫沈降、免疫拡散、放射
性免疫競合、免疫電気泳動、またはポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分離され、次にニトロセルロース上
に移行されたタンパク質の免疫学的検出により検出され
得る。

【００６０】５．５．遺伝子産物の精製 ｇＤ遺伝子（または任意のＨＳＶ糖タンパク質遺伝子）
を含む細胞は大容量で増殖させ、そしてプロモーターの
誘導後に産生されたタンパク質はかかる細胞から、ま
た、タンパク質が分泌されるのであれば、その培養培地
から単離される。タンパク質は、イオン交換、アフィニ
ティーまたはサイジング樹脂を含む標準的クロマトグラ
フィーにより、遠心分離により、あるいはタンパク質精
製のための他の任意の標準的技術によって単離・精製す
ることができる。

【００６１】ある種の融合タンパク質は、細胞で過剰に
生産されるときや溶液中で生産されるとき、凝集物を形
成するので、凝集物形成タンパク質の単離方法が本発明
で生産された融合タンパク質の単離に特に有用である。
これらの融合タンパク質は次にワクチン製剤において用
いることができる。融合タンパク質の精製（以後、凝集
物の精製と称する）は、細胞の破砕による細胞培養物の
溶解産物のようなタンパク質混合物からの凝集物形成タ
ンパク質の抽出、分離および／または精製を含むもので
ある。更に、凝集物は、強い水素受容体と強い水素供与
体の両方である溶媒（または各溶媒がこれらの性質の一
方を有する混合溶媒）を添加することによって可溶化
し、その後凝集物形成タンパク質を適切なバッファーで
希釈して沈降させることができる。適当なタンパク質溶
媒には、尿素（約４〜８Ｍ）、ホルムアミド（少なくと
も約８０％、容量／容量基準）およびグアニジン塩酸
（約４〜８Ｍ）があるが、これらに限らない。凝集物形
成タンパク質を可溶化しうる溶媒、例えば、ＳＤＳ（ド
デシル硫酸ナトリウム）、７０％蟻酸はこの手順におい
て用いるには不適切である。なぜならば、可溶化された
凝集物形成タンパク質のその後の沈降が不十分であると
分かったからである。グアニジン塩酸および他の同様な
試薬は変性剤であるが、実験によると、この変性は不可
逆的ではなく、変性剤の除去（例えば、透析による）ま
たは希釈の際に復元再生が起こって、免疫学的および／
または生物学的に活性なタンパク質の再形成を可能にす
ることが判明した。

【００６２】融合タンパク質単離技術の１つの実施態様
は次の如く概略される（以後、非変性凝集物精製法とい
う）。細胞ペレットを、ドライアイス／メタノールを用
いてすばやく凍結し、計量し、そして３〜４ｇの細胞を
少なくとも２５ｍｌのバッファー溶液〔例えば、５０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ（トリスヒドロキシメチルアミノメタ
ン塩酸塩）、ｐＨ８．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレン
ジアミン四酢酸）および２００ｍＭ ＮａＣｌ〕中に再
懸濁する。即ち、細胞はバッファー溶液中に約１００〜
２００ｇ細胞／Ｌの概算濃度で懸濁される。約１６０ｇ
／Ｌ以下の濃度が好適である。この懸濁体に、リゾチー
ムを約１３０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、得られた
混合物を４℃で２０分間、時々振とうしながら、静置す
る。膜を可溶化するために用いる非イオン性界面活性剤
である、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ＮＰ−４０、Ｓｈｅ
ｌｌの登録商標、ポリオキシエチレン（９）ｐ−ｔｅｒ
ｔ−オクチルフェノール）を約０．１％の最終濃度で添
加し、その後溶液を混合する。次に、懸濁体をＰｏｌｙ
ｔｒｏｎ粉砕機（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，Ｎ．Ｙ．）または同等の装
置を用いて約１分間粉砕する。

【００６３】懸濁体を８，０００×ｇで３０分間遠心分
離し、そしてペレットを洗浄バッファー〔例えば、２ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２％トリトン−Ｘ１００
（ポリオキシエチレン（９−１０）ｐ−ｔｅｒｔ−オク
チルフェノール、非イオン性界面活性剤）〕中に再懸濁
し、そして、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ粉砕機によって粉砕す
る。遠心分離、洗浄および粉砕の工程は、ペレットをさ
らに洗浄して、出来るだけ多くの細胞破片を除くために
繰り返すことができる。

【００６４】また、凝集物ペレットは変性剤の添加によ
って以下の如くさらに処理することができる（以後、変
性凝集物精製法という）。懸濁物を遠心分離し、上澄み
を完全に除き、そしてペレットを約１／５容量の６Ｍグ
アニジン塩酸（蒸留水中）に再懸濁する。例えば、２５
ｍｌのバッファーで洗浄した３ｇの細胞を、この段階で
５ｍｌの６Ｍグアニジン塩酸溶液中に再懸濁すべきであ
る。この段階でペレットを再懸濁することは困難であ
り、音波処理あるいはホモジナイゼーションが均質な溶
液を得るために必要であろう。溶液を２２℃で２０分間
放置し、次に８０００×ｇで３０分間遠心分離して破片
を除き、この時点で融合タンパク質凝集物を含む上澄み
を得る。

【００６５】融合タンパク質は、約４倍容量の水性バッ
ファーの添加によってグアニジン塩酸上澄みから沈殿せ
しめる。ほぼあらゆる水性バッファーをこの段階で使う
ことができるが、少量の非イオン性界面活性剤〔例：
０．５％ ＮＰ−４０またはトリトンＸ−１００〕を添
加することが役立つだろう。この懸濁体を４℃で３０分
間放置し、次に８，０００×ｇで１０分間遠心分離す
る。上澄みを捨て、ペレット（融合タンパク質沈殿物を
含む）を適当な容量の適切なバッファー、例えばリン酸
緩衝溶液（ＰＢＳ）中に再懸濁する。短期間の音波処理
またはホモジナイゼーションが均質な懸濁体もしくはス
ラリーを得るのに役立つだろう（なんとなれば、凝集物
形成タンパク質は水に不溶性であるからである）。

【００６６】５．６．非融合ｇＤタンパク質の生産 ワクチン製剤では融合タンパク質を用いることが望まし
いだろう。しかしながら、前に説明したように、非融合
ｇＤタンパク質を産生する形質転換体は、ｇＤ融合タン
パク質を産生する形質転換体よりも少ない量で該タンパ
ク質を産生し、このことは、非融合タンパク質の遺伝子
配列が誘導性のプロモーターの制御下にあるときでさえ
もそうである。更に、バクテリア形質転換体によって作
られた非融合ｇＤタンパク質はｇＤ融合タンパク質と比
べて安定性の面で劣るかもしれない。

【００６７】本発明の別の実施態様において、宿主細胞
形質転換体は、共凝集して容易に精製しうる融合および
非融合の両方のｇＤ関連タンパク質を大量に産生するよ
うに操作することができる。この実施態様によると、ｇ
Ｄ融合タンパク質をコードする組換えプラスミドは、ｇ
Ｄ遺伝子配列と宿主細胞タンパク質遺伝子配列（例え
ば、β−ガラクトシダーゼｚ遺伝子配列）との接合点
で、ナンセンスコドン配列、即ちアンバー（ａｍｂｅ
ｒ）（ＴＡＧ）、オーカー（ｏｃｈｒｅ）（ＴＡＡ）ま
たはオパール（ｏｐａｌ）（ＴＧＡ）のごときチェーン
ターミネーターが２つの遺伝子配列の間に位置するよう
に変更される。このチェーンターミネーターはｇＤ配列
と宿主細胞遺伝子配列の両方の翻訳リーディングフレー
ムとｉｎ ｐｈａｓｅで配置されねばならない。このよ
うな変更は、２つの遺伝子配列の間に位置する制限部位
においてプラスミドを開裂し、次に、アンバー、オーカ
ーまたはオパールのごときチェーンターミネーターをコ
ードするＤＮＡリンカー配列をプラスミドの開裂部位に
連結して、チェーンターミネーターが両方の遺伝子配列
の翻訳リーディングフレームとｉｎ ｐｈａｓｅで配置
されるようにすることによって達成される。

【００６８】これらのアンバー、オーカーまたはオパー
ル修飾プラスミドを、適切なｔＲＮＡサプレッサーを含
む宿主細胞中に導入すると、非融合ｇＤ関連タンパク質
並びにｇＤ融合タンパク質の両方の合成が得られる。ア
ンバー、オーカーまたはオパール修飾プラスミドが非サ
プレッサー細胞系の形質転換に用いられる場合は、主と
して非融合ｇＤ−関連タンパク質が産生されるだろう。

【００６９】アンバー、オーカーまたはオパール修飾プ
ラスミドをサプレッサー細胞のバックグラウンドに導入
するために少なくとも２つの方法がある。つまり、
（１）形質転換体（即ち、アンバー、オーカーまたはオ
パール修飾プラスミドにより形質転換された宿主細胞）
に、適切なサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子をもつ溶原性形
質導入ファージ（例えば、φ８０ｐＳＵ３はアンバー変
異のｓｕｐＦサプレッサーを保有する）を感染させるこ
とができる。または、（２）アンバー、オーカーまたは
オパール修飾プラスミドを用いて、それぞれアンバー、
オーカーまたはオパールのサプレッサーｔＲＮＡを含む
細胞系を形質転換することができる。このような菌株の
例には、ＬＥ３９２（アンバー変異のｓｕｐＥおよびｓ
ｕｐＦサプレッサーを含む）、ＹＭＣ（ｓｕｐＦを含
む）およびＣ６００（ｓｕｐＥ）があるが、これらに限
らない。大腸菌中の種々のアンバーサプレッサーｔＲＮ
Ａ遺伝子としては、ｓｕｐＢ、ｓｕｐＣ、ｓｕｐＤ、ｓ
ｕｐＥ、ｓｕｐＦ、ｓｕｐＧ、ｓｕｐＬ、ｓｕｐＭ、ｓ
ｕｐＮ、ｓｕｐＯ、ｓｕｐＰ、ｓｕｐＵ、ｓｕｐＶがあ
るが、これらに限らない。大腸菌中の種々のオーカーサ
プレッサーｔＲＮＡ遺伝子には、ｓｕｐＢ、ｓｕｐＣ、
ｓｕｐＧ、ｓｕｐＬ、ｓｕｐＭ、ｓｕｐＮ、ｓｕｐＯ、
ｓｕｐＶがあるが、これらに限らない。大腸菌中の種々
のオパールサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子にはｓｕｐＫが
あるが、これに限らない（ＢａｃｋｍａｎｎおよびＬｏ
ｗ，１９８０，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅ
ｖｉｅｗｓ４４（１）：１−５６）。

【００７０】アンバー、オーカーまたはオパール修飾プ
ラスミドによって形質転換された、適切なサプレッサー
ｔＲＮＡ遺伝子を含む宿主細胞は、融合タンパク質と非
融合タンパク質の両方としてｇＤ関連タンパク質を産生
することができる（産生された融合ｇＤと非融合ｇＤタ
ンパク質の比率は宿主細胞中の抑制の程度に依存す
る）。両タンパク質はＨＳＶに対する抗血清と免疫反応
する。第５．５節で述べた非変性凝集物精製法（この場
合の方法は非変性共凝集物精製法である）を用いると
き、非融合ｇＤとｇＤ融合タンパク質の両方が共精製さ
れる。可溶化後、非融合ｇＤは、大きさまたは電荷に基
づいて、ｇＤ融合タンパク質から分離できる。結果的
に、宿主細胞形質転換体により産生された、大量の非融
合ｇＤ−関連タンパク質が容易に精製でき、ワクチンと
して使用するために製剤化される。

【００７１】５．７．ワクチンの製造 本発明の目的は、組換えＤＮＡ技術によって、ＨＳＶ−
１および／またはＨＳＶ−２感染を防御するためのワク
チンの免疫原として使用しうる、ｇＤ−関連タンパク質
のようなＨＳＶ糖タンパク質−関連ポリペプチドを生産
することである。生産されたｇＤ−関連タンパク質が特
異的なＨＳＶ−１および／またはＨＳＶ−２中和抗体と
免疫反応するのであれば、そのｇＤ−関連タンパク質は
生体内の関連ウイルスを中和し得る免疫応答を引き出す
ことが期待されるだろう。遺伝子工学的に操作された免
疫原から作られたワクチンは、弱毒化ウイルスから作ら
れた通常のワクチンよりも安全なはずである。なぜなら
ば、レシピエントの感染の危険が全くなくなるからであ
る。また、遺伝子工学的に操作されたｇＤ産物は受身免
疫治療に有用な抗体を作るのに用いることができる。

【００７２】ｇＤ／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク
質産物自体はワクチン製剤において有用でありうるが、
最初にβ−ガラクトシダーゼ部分を除く必要があろう。
また、ｇＤ遺伝子のアミノコード末端の再構成が該タン
パク質の免疫原性にとって重要であるかもしれない。と
いうのは、アミノ末端が更なる重要な抗原部位を含みう
るためである。ｇＤ遺伝子のアミノコード末端は、ｇＤ
のアミノ末端をコードするＤＮＡ配列を、組換えＤＮＡ
分子のｇＤコード領域内の適当な部位に連結することに
よって再構成することができる。組換えＤＮＡ分子は全
ての必要な発現制御要素を保持するので、全長の（また
はほぼ全長の）ｇＤ−関連タンパク質は、再構成された
遺伝子を含むＤＮＡ分子で形質転換された細胞によって
産生される。

【００７３】最後に、遺伝子工学的に操作されたｇＤ−
関連タンパク質は、標準的なタンパク質単離技術を用い
て、または、ここに述べた凝集物精製法によって宿主細
胞から単離・精製され得る。その後、最終精製産物は適
当な濃度に希釈され、適当なワクチンアジュバントを用
いて製剤化され、そして使用に供するために包装され
る。適当なアジュバントとして、表面活性物質、例え
ば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレ
シチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、
Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’−Ｎ−ビス（２−ヒドロ
キシエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシ
ルグリセロールおよびプルロニックポリオール類；ポリ
アニオン類、例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリ
ＩＣ、ポリアクリル酸、カルボポール；ペプチド類、例
えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフト
シン；オイルエマルジョン；およびミョウバンが挙げら
れるが、これらに限らない。最後に、タンパク質産物は
ワクチン製剤用のリポソーム中に保持させても、また、
多糖類や他のポリマーとの複合体を形成させてもよい。

【００７４】ここに述べた遺伝子工学的に操作されたＤ
ＮＡ分子は、ワクチン製造に大きな融通性を提供する。
例えば、ｇＤ遺伝子配列の任意の部分またはｇＤ遺伝子
（またはその一部）の多重コピーをタンデムで含む組換
えＤＮＡ分子を含む形質転換体により産生されたｇＤ−
関連タンパク質を用いてワクチンを製剤化することがで
きる。ｇＤ遺伝子配列（またはその一部）を、他の免疫
原をコードする遺伝子に連結させて、その融合タンパク
質産物を多価ワクチンの製造に使用してもよい。更に、
ｇＤ遺伝子配列（またはその一部）を、任意の組合せ
で、他のＨＳＶ糖タンパク質配列（またはその一部）に
連結させることもできよう。最後に、ワクチンの免疫原
性を増強するために、ｇＤ配列を再構成してもよい。例
えば、タンパク質産物が免疫系に特定のエピトープを提
示する（例えば、通常、露出されないｇＤの抗原部位が
免疫系に提示される）ように遺伝子配列を変更する。あ
るいは、タンパク質の免疫抑制部分をコードするｇＤ遺
伝子配列の領域を欠失することができる。

【００７５】

【発明の実施の形態】

６．実施例：ＨＳＶ−１ｇＤ 本発明の方法によれば、ＨＳＶ−１ゲノムのＵｓ部分の
ＤＮＡフラグメント（図１ａ参照）をベクターｐＢＲ３
２２中に挿入して、それぞれＨＳＶ−１ゲノムの異なる
フラグメントを含む組換えプラスミドを作製することに
よって、ｇＤ−１遺伝子を局在化し、同定した。ｇＤ−
１遺伝子を含むプラスミドは次の３つの技術（必ずしも
示した順序どおりではない）によって同定した。すなわ
ち、（１）ＤＮＡ配列決定、（２）ｇＤ−１特異的ｍＲ
ＮＡハイブリダイゼーション実験、および（３）組換え
プラスミドにハイブリダイズするｍＲＮＡのｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ翻訳。

【００７６】ひとたびｇＤ−１遺伝子を含むプラスミド
が同定されたら、ＤＮＡ配列決定により、また、組換え
プラスミド内のｇＤ−１遺伝子末端の位置確認を行うこ
とにより、該遺伝子の特性付けを行った。コード配列の
最初の１５６個のヌクレオチドを欠くｇＤ−１遺伝子を
含むＤＮＡフラグメントを、同定されたプラスミドから
単離した。このＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡベクター
ｐＪＳ４１３に連結して、大腸菌での該遺伝子のクロー
ニングおよび発現のために用いられたｐＥＨ２５を作製
した。誘導された形質転換体から単離された遺伝子産物
は、ｇＤ−１に対するモノクローナル抗体およびＨＳＶ
−１に対する多価抗体による免疫沈降によって、ｇＤ−
１に特有のタンパク質として同定された。

【００７７】最後に、ｇＤ−１遺伝子フラグメントを、
特定部位で制限エンドヌクレアーゼ切断によりｐＥＨ２
５から単離し、それによりｇＤ−１コード配列の終止配
列（ＴＡＧ）を欠失させた。ｇＤ−１遺伝子の一部およ
びプラスミドプロモーターおよび制御要素（例えば、Ｓ
Ｄ−ＡＴＧ）を含むこのＤＮＡフラグメントを、β−ガ
ラクトシダーゼコード配列を含むベクターに連結させ
た。得られたプラスミドｐＥＨ４−２は、ｃｒｏＳＤ−
ＡＴＧをもつプラスミドのｌａｃプロモーターとβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子との間に挟まれたｇＤ−１コード
配列を含んでおり、誘導された大腸菌形質転換体におい
て融合タンパク質を発現させた。次に、この融合タンパ
ク質を宿主細胞溶解産物から単離し、そして免疫原とし
て用いるために製剤化した。また、ｇＤ−１遺伝子のア
ミノコード末端を再構成し、得られたｇＤ−１タンパク
質を、動物への注入および予備臨床試験のために製剤化
した。構築の各工程の詳細については以下の分節で述べ
る。

【００７８】ここで生産されたｇＤ−１関連タンパク質
および融合タンパク質はグリコシル化されておず、従っ
て天然にあるＨＳＶ−１ｇＤ糖タンパク質とは異なるも
のである。しかしながら、ｇＤ−１関連タンパク質はＨ
ＳＶ−１およびＨＳＶ−２のｇＤに対する抗体との免疫
反応性を有する。 ６．１．プラスミド作製に用いられる一般的手順 次の分節は、ＤＮＡ単離、酵素反応および連結反応に用
いる一般的手順および材料を記述するものである。

【００７９】６．１．１．プラスミドＤＮＡ単離 宿主細胞バクテリア大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）を形質転換し（Ｇａｕｔｉｅｒ ＆ Ｂｏｎ
ｅｗａｌｄ，１９８０，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．１７８：３７５）、そしてＭ−９ブロス中で増殖さ
せた大腸菌形質転換体の培養物から大量（マイクログラ
ム）のプラスミドＤＮＡを単離した（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９７
２，ｐ．４３１）。プラスミドは、Ｇｕｅｒｒｙらの方
法（１９７３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１６：１０
６３）の変法を用いて、後期対数増殖期の細胞から単離
した。

【００８０】６．１．２．制限酵素消化のための条件 本発明で用いた制限酵素は、特に他に表示しない限り、
マサチューセッツ州ベバリーのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｄｓ，Ｉｎｃ．から得られたものである。
酵素単位は、５０μｌの全反応混合物中で１．０μｇの
ラムダＤＮＡを１５分間に３７℃で消化するのに要する
量として定義される。

【００８１】全ての制限酵素による完全消化は次のよう
な条件下で行った。各１μｇのＤＮＡを酵素０．５単位
と共に３７℃で６０分間、２０μｌのバッファー中でイ
ンキュベートした。部分消化は完全消化に用いた条件を
次のように変更することによって行った。各１μｇのＤ
ＮＡを０．１単位の酵素と共に３７℃で１５分間インキ
ュベートした。０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）の添加によって反応を停止させた。こうして、ＤＮ
Ａ１分子あたり平均１回の切断が起こるように反応条件
を調整した。

【００８２】６．１．３．制限酵素バッファー ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩまたはＳｍａＩ消化に用いたバッ
ファーは６．６ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、
６．６ｍＭ ＭｇＣｌ_２および６．６ｍＭ β−ＭＥ
（β−メルカプトエタノール）より成るものであった。
ＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ、ＮｒｕＩ、ＰｓｔＩまたはＰｖｕＩＩ消化に用いた
バッファーは６０ｍＭ ＮａＣｌ、６．６ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ_２および
６．６ｍＭβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）より
成るものであった。

【００８３】ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩまたはＸｂａＩ消化
に用いたバッファーは１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ_２および６．６ｍＭ
β−ＭＥより成るものであった。２以上の制限エンドヌ
クレアーゼ反応がＤＮＡに対してなされる場合には、低
塩バッファー中での反応を高塩バッファー中での反応の
前に行うことに注意すべきである。２つの酵素が同じバ
ッファーを必要とするのであれば、反応を同時に行って
もよい。

【００８４】６．１．４．ＤＮＡの修飾 Ｂａｌ ３１ヌクレアーゼは高度に特異的な一本鎖エン
ドデオキシリボヌクレアーゼ活性および前進型エキソヌ
クレアーゼ活性を含む多機能性酵素であり、二本鎖ＤＮ
Ａ（ｄｓＤＮＡ）の３’−および５’−末端の両方を同
時に分解する。ヌクレアーゼＢａｌ ３１ （Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅ
ｒｌｙ，Ｍａ．）の１単位は、変性ウシ胸腺ＤＮＡ（６
５０μｇ／ｍｌ）から１．０μｇの酸可溶性ヌクレオチ
ドを１分間、３０℃で放出させるのに要する量として定
義される。Ｂａｌ ３１消化に用いた反応バッファーは
２０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６００ｍＭ
ＮａＣｌ、１２ｍ ＭｇＣｌ_２、１２ｍＭ ＣａＣ
ｌ_２、１．０ｍＭ ＥＤＴＡおよびＤＮＡより成るもの
であった。インキュベーションは３０℃で行った。Ｂａ
ｌ ３１消化は、３０μｇのＤＮＡを０．５単位のＢａ
ｌ ３１とともに１、２、４、６、８および１０分間イ
ンキュベートすることによって行った。ＥＤＴＡを添加
して５０ｍＭとするか、またはＢａｌ ３１の熱不活性
化（例えば、６５℃で１０分）によって反応を停止させ
た。

【００８５】Ｓ１ヌクレアーゼはＲＮＡまたは変性ＤＮ
Ａ（即ち、一本鎖ＤＮＡ）をモノヌクレオチドに分解す
るが、二本鎖ＤＮＡやＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは
（適当な条件下で）分解しない。Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎ
ａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）の１単位は、１μｇの変性ウ
シ胸腺ＤＮＡを３７℃、３０分間で酸可溶化するのに要
する酵素の量として定義される。Ｓ１ヌクレアーゼのた
めに用いた反応バッファーは、３０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐＨ４．６）、２５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳ
Ｏ_４および５％グリセロールより成るものであった。Ｓ
１消化は、２０００単位の酵素を０．１μｇのＤＮＡお
よび２０μｇのＲＮＡと共に４５℃で３０分間インキュ
ベートすることにより行った。

【００８６】エキソヌクレアーゼＶＩＩ（Ｅｘｏ ＶＩ
Ｉ）は一本鎖のＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を分解する。Ｅｘ
ｏ ＶＩＩの作用機構は前進型エキソヌクレアーゼのも
のであるらしい。Ｅｘｏ ＶＩＩ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）の１単位は、基質として線状の
変性〔^３Ｈ〕−ＳＶ４０ ＤＮＡを用いて３７℃、３０
分で１ｎｍｏｌのヌクレオチドモノマーをもたらす酵素
の量として定義される。Ｅｘｏ ＶＩＩのために用いた
反応バッファーは、１０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．
９）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ β−ＭＥおよ
び８ｍＭ ＥＤＴＡより成るものであった。Ｅｘｏ Ｖ
ＩＩ消化は、２５０μｌの反応容量中で０．１μｇのＤ
ＮＡあたり４単位のＥｘｏ ＶＩＩを用いて４５℃で１
時間行った。

【００８７】６．１．５．ＤＮＡポリメラーゼ反応 ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ鎖の段階的伸長を触媒す
る。鎖の成長は５’から３’の方向であり（即ち、ヌク
レオチドの付加が３’末端で生じ）、そしてポリマーの
配列が鋳型の配列によって決まる。なせならば、入って
くるヌクレオチドはその鋳型に対して相補的でなければ
ならず、即ち、鋳型鎖との正しい塩基対を形成しなけれ
ばならないからである。既知のＤＮＡポリメラーゼは鎖
合成を開始することができない。従って、ＤＮＡ合成に
は、鋳型鎖にアニーリングされる遊離３’−ヒドロキシ
末端をもつプライマーが必要となる。鎖伸長は、入って
くるヌクレオチドの５’−リン酸へのプライマーの３’
−ヒドロキシ末端の求核的攻撃により進行する。新しい
鎖は塩基対合され、鋳型鎖に対してアンチパラレルであ
る。ＤＮＡポリメラーゼ反応の結果として、一本鎖の鋳
型鎖は「修復」されるか、または二本鎖のＤＮＡ分子に
変換される。

【００８８】ＤＮＡポリメラーゼの第二の重要な特徴は
「プルーフ−リーディング（ｐｒｏｏｆ−ｒｅａｄｉｎ
ｇ）」機能である。ＤＮＡポリメラーゼＩに関連した
３’−５’のエキソヌクレアーゼ活性は塩基対合してい
ない末端に働き、そして一本鎖および二本鎖の両ＤＮＡ
を３’から５’の方向で分解してモノヌクレオチドを生
成する。従って、間違って付加されたヌクレオチドは重
合が継続して行われる前に除去され、酵素の忠実度が更
に高まる。また、ＤＮＡポリメラーゼＩは二本鎖ＤＮＡ
に特異的な５’−３’エキソヌクレアーゼ活性も有して
おり（５’−モノヌクレオチドとオリゴヌクレオチドを
生じる）、これはＤＮＡのミスマッチ領域を切除するこ
とができる。

【００８９】Ｋｌｅｎｏｗの方法（Ｋｌｅｎｏｗら，１
９７１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：３７１）
によるＤＮＡポリメラーゼＩの加水分解処理は２つのフ
ラグメント、つまり大きいものと小さいものを与える。
大きなフラグメント、即ちＫｌｅｎｏｗフラグメント
（７６，０００ダルトン）はポリメラーゼ活性と３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を保持し、一方、小さいフ
ラグメントは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を保持
する。ＤＮＡポリメラーゼＩまたはＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ−大フラグメントの１単位（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍ
ａ．）は、１０ｎｍｏｌｅのデオキシリボヌクレオチド
を酸不溶性形態に３７℃、３０分で変換する量として定
義される。両酵素のアッセイ条件は同じであるが、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩに対する反応混合物は６．６ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ_２、１．０ｍＭ β−ＭＥ、２ｍＭ ｄＡＴコポ
リマー、３３μＭ ｄＡＴＰ、３３μＭ ^３Ｈ−ｄＴＴ
Ｐおよび酵素から成るバッファー中に６７ｍＭ ＫＰＯ
_４（ｐＨ７．５）を含み、一方、Ｋｌｅｎｏｗフラグメ
ントの反応混合物は４０ｍＭ ＫＰＯ_４（ｐＨ７．５）
を含んでいた。

【００９０】本出願において、一本鎖ＤＮＡまたは制限
酵素切断より生じる付着末端を修復するためにＤＮＡポ
リメラーゼ大（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントを用いる場
合は、次の手順を用いた。制限酵素反応を６８℃で１０
分間加熱することによって停止させた。同一反応混合物
に、各デオキシヌクレオシド三リン酸を５０μＭの最終
濃度で加え、反応混合物中のＤＮＡ１マイクログラムあ
たり１０〜１００単位のＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏ
ｗフラグメントを添加した。換言すると、一本鎖末端の
完全修復を確実にするために、過剰のＤＮＡポリメラー
ゼＫｌｅｎｏｗフラグメントが用いられた。

【００９１】６．１．６．ＤＮＡフラグメントのゲル精
製 制限酵素またはヌクレアーゼ処理の後に、種々の大きさ
のＤＮＡフラグメントを、アガロースまたはポリアクリ
ルアミドスラブゲルを用いて低電圧（アガロースゲルに
おいては約２ボルト／ｃｍ、ポリアクリルアミドゲルに
おいては１０ボルト／ｃｍ）でゲル電気泳動を行って分
離し、エチジウムブロミドで染色し、そして、紫外線の
もとで可視化した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７９，Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：１５
２）。

【００９２】ゲルから特定のＤＮＡフラグメントを回収
するために、適当なバンドをゲルから切り出し、透析チ
ューブへＤＮＡを電気溶出した。次に、ＤＮＡをＤＥＡ
Ｅ−セルロース上で単離するか、またはエタノール沈澱
させ、そして適当なバッファー中に再懸濁した（Ｓｍｉ
ｔｈ，１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ ６５：３７１）。 ６．１．７．ＤＮＡの連結 全ての連結反応はＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて行った
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａ．）。Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼの１単位は、２０μｌのリガーゼバッファーおよび
０．１２μＭ（３００μｇ／ｍｌ）の５’−ＤＮＡ末端
濃度においてバクテリオファージラムダＤＮＡのＨｉｎ
ｄＩＩＩフラグメントの５０％連結を１６℃、３０分で
もたらすのに要する量として定義される。

【００９３】ＤＮＡ連結は、６０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭジチ
オトレイトール（ＤＴＴ）、１．０ｍＭ ＡＴＰおよび
１５〜５０μｇ／ｍｌの範囲のＤＮＡ濃度から成るリガ
ーゼバッファー中で行った。連結反応は、１０μｌの反
応容量あたり約３００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを用
いて室温で４〜２４時間インキュベートした。

【００９４】６．２．ｇＤ−１遺伝子の位置確認および
単離 ＨＳＶ−１×ＨＳＶ−２組換え体により特定されたタン
パク質を分析すると、それはｇＤ−１遺伝子がＤＮＡの
Ｕｓ領域内の０．９〜０．９４５のゲノムマップ単位の
間に存在することを示した（Ｒｕｙｅｃｈａｎら，１９
７９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２９：６６７）。図１ａおよび
図１ｂ参照。Ｕｓ領域を制限酵素によって断片化し、こ
れらのフラグメントをクローニングベクターに挿入し
て、種々の組換えプラスミドを作製した。各プラスミド
はＵｓ領域の特定部分を含んでいた。次に、Ｕｓ領域内
にｇＤ−１遺伝子を位置付けるためにこれらの組換えプ
ラスミドを分析した。ＨＳＶ−１中のｇＤ−１のマップ
位置は、最近、Ｌｅｅら（１９８２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
４３：４１）によって報告された。

【００９５】６．２．１．ＨＳＶ−１のＵｓ領域の特定
部分を含む組換えＤＮＡプラスミド ベクターｐＢＲ３２２およびＨＳＶ−１（パットン株）
のＵｓ領域の種々のフラグメントを用いて、数種の組換
えプラスミドを作製した。これらのプラスミドのうちの
１つ、ｐＲＷＦ６は全ｇＤ−１遺伝子を含むことが判明
した。ｐＲＷＦ６について以下で説明する。

【００９６】組換えプラスミドｐＲＷＦ６のＨＳＶ−１
挿入部（図１ｃ）はラムダｇｔＷＥＳ：ＥｃｏＲＩ−Ｈ
クローンのＵｓ領域から得られた（Ｕｍｅｎｅ ＆ Ｅ
ｎｇｕｉｓｔ，１９８１，Ｇｅｎｅ １３：２５１）。
ラムダｇｔＷＥＳ：ＥｃｏＲＩ−ＨクローンをＥｃｍＲ
Ｉで完全に消化した。ラムダｇｔＷＥＳ：ＥｃｏＲＩ−
ＨクローンのＥｃｏＲＩ−Ｈフラグメント、約１５〜１
６ｋｂ（キロ塩基）はＨＳＶ−１の全Ｕｓ領域を含んで
いる。

【００９７】プラスミドｐＢＲ３２２およびＨＳＶ−１
のＥｃｏＲＩ−Ｈフラグメント（上で単離したもの）
を、各々ＢａｍＨＩで完全に消化した。得られたｐＢＲ
３２２の４．４ｋｂフラグメントとＨＳＶ−１の６．４
ｋｂフラグメントをアニーリングし、そして１：１の比
率で連結してｐＲＷＦ６を得た。 ６．２．２．ｇＤ−１に特有のｍＲＮＡコード配列の位
置確認 ｐＲＷＦ６内のｇＤ−１に特有のコード配列を位置付け
し、そして選択するために、ウイルスＤＮＡ挿入部を再
びｐＢＲ３２２にサブクローニングした。サブクローン
ｐＳＣ３０−４の変性ウイルスＤＮＡ制限フラグメント
（図１ｄおよび下記の説明）をニトロセルロース上に固
定し、そしてＨＳＶ−１感染細胞の細胞質ＲＮＡ抽出物
からｍＲＮＡを（相補的塩基対ハイブリダイゼーション
により）単離するために用いた。２つのｍＲＮＡ種
（３．０ｋｂおよび１．７ｋｂ）がｐＳＣ３０−４とハ
イブリダイズした。これらのｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ翻訳により、３．０ｋｂまたは１．７ｋｂのｍＲＮＡ
がｇＤ−１タンパク質をコードすることが分かった。こ
の手順の詳細を以下で説明し、また、図１に示す。

【００９８】プラスミドｐＲＷＦ６を大腸菌形質転換体
より単離し、制限酵素ＳａｃＩによって消化した。これ
により３つのフラグメントが得られた。即ち、全ｐＢＲ
３２２ベクターとＨＳＶ−１ ＤＮＡ配列の一部を含む
６．２ｋｂのフラグメント、２．９ｋｂのＨＳＶ−１
ＤＮＡフラグメント、および１．７ｋｂのＨＳＶ−１Ｄ
ＮＡフラグメントである。

【００９９】２．９ｋｂのＨＳＶ−１ ＤＮＡフラグメ
ント（図１ｄ参照）をサブクローニングするために、ｐ
ＢＲ３２２をＰｖｕＩＩ（ｐＢＲ３２２を線状化する）
によって切断し、そしてＳａｃＩリンカー（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒ
ｌｙ，Ｍａ．）の存在下にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用い
て連結させた。従って、ｐＢＲ３２２のユニークＰｖｕ
ＩＩ部位がユニークＳａｃＩ部位に変換された〔Ｓａｃ
Ｉ（Ｐｖｕ ＩＩ^（−））と称す〕。ＳａｃＩ酵素で修
飾ｐＢＲ３２２ベクターを切断した後、このベクターを
２．９ｋｂのＨＳＶ−１ ＳａｃＩ ＤＮＡフラグメン
トと連結させてｐＳＣ３０−４を得た。この組換えプラ
スミドを用いて大腸菌を形質転換させた。形質転換体を
スクリーニングし、微量溶解物技術（ｍｉｎｉ−ｌｙｓ
ａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；Ｃｌｅｗｅｌｌ ＆ Ｈ
ｅｌｉｎｓｋｉ，１９７０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．９：４４
２８）を用いる制限マッピングにより選択した。

【０１００】サブクローンｐＳＣ３０−４を、ｍＲＮＡ
ハイブリダイゼーション選択のために次の如く用いた
（Ｒｉｃｃｉａｒｄｏら，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：４９２
７）。プラスミドｐＳＣ３０−４を大腸菌形質転換体よ
り単離し、２００μｇのｐＳＣ３０−４ＤＮＡをＳａｃ
Ｉで消化してＨＳＶ−１ ＤＮＡ挿入部を切り出した。
切断プラスミドをクロロホルム／フェノール（１：１）
で抽出し、そしてエタノール沈澱させた。沈澱物を２ｍ
ｌの０．３Ｍ ＮａＯＨ中に再懸濁し、室温で１０分間
インキュベートしてＤＮＡを変性した。次に、この懸濁
物を４．４ｍｌの蒸留水、０．２ｍｌの３ＭＨＣｌ、
０．２ｍｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および
３ｍｌの２０×ＳＳＣ（ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）の添加に
より中和した。指示紙によって測ったｐＨは６〜８の間
であった。変性して、中和したＤＮＡは、蒸留水、次に
６×ＳＳＣで前もって浸漬しておいた２５ｍｍニトロセ
ルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ
Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，Ｎ．Ｈ．）を通して真空
濾過した。真空濾過後、ニトロセルロースフィルターを
６×ＳＳＣで洗浄し、乾燥し、そして８０℃で２時間焼
成した。２分の１のニトロセルロースフィルターをハイ
ブリダイゼーション法で使用した。これについて以下で
簡単に述べる。

【０１０１】ウイルスＤＮＡを含むニトロセルロースを
小片に切って、全細胞質ＲＮＡとともにインキュベート
した。そのＲＮＡは次のように調製されたＨＳＶ感染Ｖ
ｅｒｏ細胞の溶解産物から単離したものであった。Ｖｅ
ｒｏ細胞に１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞を感
染させ、そしてＤＮＡの複製を阻止するために５０μｇ
／ｍｌのシタラビン（β−シトシンアラビノシド）を加
えたダルベッコ培地中３７℃で７時間インキュベートし
た。細胞を０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ
_２および０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）中の
０．６５％ＮＰ−４０で溶解した。３０００×ｇ、２分
間の遠心分離により核を沈降せしめ、上澄みを１ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．９）および０．５％ ＳＤＳの最終
濃度に調整した。この溶液をクロロホルム／フェノール
（１：１）で２回抽出し、更にクロロホルムで１回抽出
した。細胞質ＲＮＡをエタノール沈殿させ（Ｖｅｒｏ細
胞の１つの集密的ローラーボトルは約１．５ｍｇのＲＮ
Ａをもたらした）、そして部分的に乾燥した。ＲＮＡ沈
殿物（約０．４〜０．８ｍｇのＲＮＡ）を４００μｌの
ハイブリダイゼーションバッファー（５０％ホルムアミ
ド、０．４ＭＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ
６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ＳＤＳ）中に溶解
し、そして細断ニトロセルロースフィルターに添加し
た。ハイブリダイゼーションは振とう水浴にて５５℃で
３時間行った。

【０１０２】次に、フィルター片を６０℃の０．５％Ｓ
ＤＳを含むＳＳＣで１０回洗浄し、続いて６０℃のＳＳ
Ｃ中の１ｍｌの２ｍＭ ＥＤＴＡで２回洗浄した。最後
に、フィルター片を２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を用
いて６０℃で５分間洗浄した。溶液を除去し、フィルタ
ー片をコットンスワブにより十分に乾燥させた。ハイブ
リダイズしたｍＲＮＡはホルムアミドおよび熱を用いて
次の如くニトロセルロース片から溶出した。１２０μｌ
の９５％ホルムアミド／１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ
６．５）をフィルターに添加し、５分間６５℃でインキ
ュベートした。溶出液を微量遠心管に移し、氷上に保持
した。２回目の１２０μｌの溶出バッファーをニトロセ
ルロース片に添加し、再び６５℃で５分間インキュベー
トした。この溶出液を第２の微量遠心管に移し、氷上に
保持した。滅菌蒸留水の７２０μｌアリコートをフィル
ターに添加し、次に撹拌した。溶出液を含む各微量遠心
管に約３６０μｌを移した。微量遠心管中の溶出ＲＮＡ
に、２０μｌの５ＭＮａＣｌ、５μｇの適当なキャリア
ー（例えば、ウサギ肝ｔＲＮＡ）および１ｍｌの無水エ
タノールを添加した。この混合物を−７０℃で１時間イ
ンキュベートするか、または遠心管をドライアイス／Ｅ
ｔＯＨのスラリーに２０分間浸すことにより、ＲＮＡを
沈殿させた。沈殿したＲＮＡは微量遠心機でペレット化
し（１２，０００×ｇで１０分）、そして１つの管の沈
降物を１ｍｌのバッファー（０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０
ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）および０．５％Ｓ
ＤＳ）中に再懸濁してＲＮＡを溶解した。アリコートを
合わせかつ全ての沈殿ＲＮＡを溶解するために、溶解し
たＲＮＡを同型の管に加えた。ポリアデニル化ＲＮＡ
〔ポリ（Ａ）ＲＮＡ〕を、オリゴ（ｄＴ）セルロース
（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）
を用いるクロマトグラフィーにより溶解ＲＮＡから単離
した。ポリ（Ａ）ＲＮＡは、溶出バッファーとして１０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．９）および０．１％ＳＤＳ
を用いてオリゴ（ｄＴ）セルロースから溶出し、次にポ
リ（Ａ）ＲＮＡを上述したようにエタノール沈殿させ
た。

【０１０３】ｐＳＣ３０−４ ＤＮＡとハイブリダイズ
したｍＲＮＡを２種類、つまり３．０ｋｂおよび１．７
ｋｂのｍＲＮＡを単離した。これら２種類を、ウサギ網
状赤血球細胞フリーの系（^３５Ｓ−メチオニンを含む）
を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳せしめた（Ｐｅｌｈａ
ｍ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ，１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．６７：２４７）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳抽
出物は、ｇＤ−１に対して誘導されたモノクローナル抗
体４Ｓ（米国立衛生研究所のＭ．Ｚｗｅｉｇにより寄
贈）により免疫沈降され、そして前に記載したようにＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥのために調製した。細胞フリーの翻訳系
の免疫沈降タンパク質産物を電気泳動分析にかけたとこ
ろ、これらの選択されたｍＲＮＡは５０，０００ダルト
ンのｇＤ−１特異的タンパク質を特定化することが実証
された。ｇＤ−１タンパク質の大きさに従うと、最小の
ｍＲＮＡコード配列はおよそ１．６ｋｂとなろう。それ
ゆえ、ｍＲＮＡリーダー配列およびポリ（Ａ）尾部を考
慮すると、大きい方の（３．０ｋｂ）ｍＲＮＡがｇＤ−
１ポリペプチドをコードしていると予想された。

【０１０４】６．２．３．ｇＤ−１ ｍＲＮＡの特性決
定 ｐＳＣ３０−４に含まれる３．０ｋｂのｍＲＮＡ配列の
位置をマッピングすること、さらにｍＲＮＡを特性付け
ることは、Ｓ１マッピング、即ち、一本鎖特異的ヌクレ
アーゼＳ１とエキソヌクレアーゼＶＩＩ を用いて相補
的ｍＲＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡプローブの
領域をマッピングすることにより（Ｂｅｒｋ＆Ｓｈａｒ
ｐ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：１２７４）、そして、ｇＤ−
１遺伝子コード領域のＤＮＡの配列決定を行うことによ
り（Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９８０，Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９
９）実施した。

【０１０５】Ｓ１マッピング技法により、３．０ｋｂお
よび１．７ｋｂのｍＲＮＡ種の両方がスプライシングさ
れていない（即ち、介在配列またはイントロンを含んで
いない）こと、そしてそれらは異なる５’末端と共通の
３’末端を持つことが判明した。３．０ｋｂのｍＲＮＡ
の５’末端のコード領域を含む１０６８ヌクレオチドの
ＤＮＡ配列が決定され、そして、５’末端に最も近い開
始コドン（ＡＴＧ）を位置付けることによって翻訳のリ
ーディングフレームを推定した。

【０１０６】Ｓ１マッピング技法の原理は、ＲＮＡと放
射性標識した一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）プローブ（例
えば、ｐＳＣ３０−４から得られたもの）の間で二本鎖
を形成させることである。ＲＮＡがスプライスされた成
熟ｍＲＮＡであるならば、イントロンがｓｓＤＮＡルー
プを形成するだろう。酵素ヌクレアーゼＳ１は、ＲＮＡ
との二本鎖形成により保護されない放射性標識ＤＮＡの
全てのｓｓＤＮＡ領域を消化する。一方、エキソヌクレ
アーゼＶＩＩは末端のみのｓｓＤＮＡを消化し、従って
ｓｓＤＮＡループを消化しないだろう。（ＲＮＡとのハ
イブリダイゼーションによって）これらのヌクレアーゼ
に感受性でないＤＮＡの大きさを比較することにより、
スプライスされたｍＲＮＡの転写物の検出が可能であ
る。

【０１０７】本発明において、３．０ｋｂのｍＲＮＡの
５’末端を位置付けるために用いた放射性標識ＤＮＡ
は、ＢａｍＨＩで切断する前にそのＢｓｔＥＩＩ５’末
端において（ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて、
Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔの方法により）^３２Ｐ
で標識したｐＲＷＦ６の３．８ｋｂのＢａｍＨＩ−８／
ＢｓｔＥＩＩフラグメントであった。３．０ｋｂのｍＲ
ＮＡの３’末端を位置付けるために用いた放射性標識Ｄ
ＮＡは、ＳａｌＩで切断する前にそのＨｉｎｄＩＩＩ
３’末端において（ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ
フラグメントを用いて、Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒ
ｔの方法により）^３２Ｐで標識したｐＳＣ３０−４の
４．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩフラグメントで
あった。細胞質ｍＲＮＡは、上記の如くシタラビンの存
在下で７時間増殖させたＨＳＶ−１感染Ｖｅｒｏ細胞か
ら単離した。用いたＳ１マッピング技法はＢｅｒｋ ＆
Ｓｈａｒｐの方法の変法（Ｗａｔｓｏｎら，１９８
１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：４３１）であった。ｇＤ−
１ ｍＲＮＡの５’末端はｐＳＣ３０−４のＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位の近傍にマッピングされ、一方、３’末端は約
２．８ｋｂ下流にマッピングされた（図１ｄ）。

【０１０８】最後に、ｐＳＣ３０−４のＨＳＶ−１ Ｄ
ＮＡをＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔの方法を用いて配列
決定した。図２はＨＳＶ−１ｇＤ遺伝子コード領域のた
めの配列決定戦略を示す。コード鎖と非コード鎖の両方
の配列を決定した。図３は、ＨＳＶ−１ｇＤ遺伝子の得
られたＤＮＡ配列を示す。このＤＮＡ配列は、２４１位
のＡＴＧから伸びている３９４のコドンのオープンリー
ディングフレームを含むことが明らかであった。この部
位はｇＤ−１遺伝子のイニシエーターであると推定さ
れ、この推定ｇＤ−１遺伝子を発現ベクターｐＪＳ４１
３にクローニングすることよって、そのとおりであるこ
とが分かった（第６．３節参照）。

【０１０９】６．３．ｇＤ−１遺伝子のクローニングと
発現 ｇＤ−１コード配列はｌａｃプロモーターの制御下に置
かれた。このために、開始配列ＡＴＧおよびアミノコー
ド末端（該遺伝子の５’末端）の最初の１５６ヌクレオ
チドを欠いた推定ｇＤ−１遺伝子の一部（以後、ｇＤ−
１遺伝子と記す）を、ＤＮＡクローニング発現ベクター
ｐＪＳ４１３に連結してｐＥＨ２５を作製した（図４参
照）。部分ｇＤ−１遺伝子は、タンパク質コード配列が
ベクターの開始ＡＴＧに対して正しいオープンリーディ
ングフレームとなるように挿入した。その結果、転写さ
れたｍＲＮＡの翻訳がベクターの開始配列（ＡＴＧ）で
開始され、ｇＤ−１遺伝子（それ自体の開始ＡＴＧおよ
びｇＤ−１コード配列の最初の１５６ヌクレオチドを欠
く）を通って、ｇＤ−１の天然の終止シグナルまで行
く。

【０１１０】ｇＤ−１遺伝子を含むｐＥＨ２５プラスミ
ドは大腸菌宿主株の形質転換に用いられたが、その際、
ｌａｃオペロンからのＤＮＡの転写はプロモーターが特
別に誘導されない限り抑制されている。一次形質転換体
を薬剤耐性（ベクターがアンピシリン耐性遺伝子を担
う）についてアッセイし、耐性クローンをさらに分析し
た。得られた組換えプラスミドｐＥＨ２５の構造は、制
限分析およびＤＮＡ配列決定によって確かめた。ｐＥＨ
２５形質転換体の誘導によって、４６，０００ダルトン
のポリペプチドが産生され、これはＨＳＶに対する抗血
清またはｇＤに対するモノクローナル抗体のいずれによ
っても免疫沈降された。これらの手順を以下の分節で詳
しく述べることにする。

【０１１１】６．３．１．発現ベクターｐＪＳ４１３ 発現ベクターｐＪＳ４１３（図４）は、ａｍｐ^ｒ（β−
ラクタマーゼ）遺伝子、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａ
ｃ）、ｌａｃおよびｃｒｏリボソーム結合部位（ＳＤ
^ＬａｃＺおよびＳＤ^ｃｒｏは全ての図面でそれぞれＳＤ
^ＺおよびＳＤ^ＣＲＯとして表わされる）、ｃｒｏの６９
ヌクレオチドをもつ連鎖開始ＡＴＧおよび修飾β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子（ｌａｃ ｉ−ｚ遺伝子、以後、ｚ
−遺伝子と記す）を含むｐＢＲ３２２誘導体である。ｐ
ＪＳ４１３のｃｒｏ開始ＡＴＧとｚ−遺伝子の間（即
ち、ｐＪＳ４１３のＢｇｌＩＩ、ＳｍａＩまたはＢａｍ
ＨＩクローニング部位内）に正しいリーディングフレー
ムで遺伝子を挿入すると、形質転換細胞による融合タン
パク質の発現が可能となる。しかしながら、この実施例
では、ｚ−遺伝子を欠失し、そして部分ｇＤ−１遺伝子
をｐＪＳ４１３のｃｒｏ開始ＡＴＧおよびｃｒｏヌクレ
オチドとｉｎ ｐｈａｓｅで連結させた。

【０１１２】ｇＤ−１遺伝子を挿入するためのｐＪＳ４
１３を作製するため（図４参照）、ｐＪＳ４１３をＳｍ
ａＩ（平滑末端を生じる）およびＳａｃＩ（ＳａｃＩ
３’付着末端を生じる）で消化した。プロモーター、Ｓ
Ｄ配列、開始ＡＴＧおよび部分ｃｒｏ配列を含む４．７
ｋｂのフラグメントを、ゲル電気泳動によって単離し
た。ｚ−遺伝子の５’末端を含む１．８ｋｂのフラグメ
ントが欠失された。

【０１１３】６．３．２．ｇＤ−１遺伝子のｐＪＳ４１
３への挿入 ｐＳＣ３０−４内のｇＤ−１遺伝子をマッピングした後
（第６．２．３節）、ｇＤ−１遺伝子のカルボキシ−コ
ード末端の最後の１０２６ｂｐ（塩基対）を含む２．２
ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＰｖｕＩＩ（平滑末端を
生じる）およびＳａｃＩ（ＳａｃＩ３’付着末端を生じ
る）で消化することによってｐＳＣ３０−４から選択的
に単離した（図４）。

【０１１４】２．２ｋｂのＰｖｕＩＩ／ＳａｃＩｐＳＣ
３０−４フラグメントおよび４．７ｋｂのＳｍａＩ／Ｓ
ａｃＩｐＪＳ４１３フラグメントを１：１の比率でＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて連結させた（図４）。得られ
た組換えプラスミドを用いて大腸菌ＮＦ１８２９株を形
質転換した。大腸菌ＮＦ１８２９株は、ｌａｃリプレッ
サー過剰生産のためのｌａｃＩ^Ｑ変異を伴うＦ’−ｌａ
ｃエピソームを保有するＫ−１２ ＭＣ１０００誘導体
である。Ｆ’−ｌａｃエピソーム上に存在するβ−ガラ
クトシダーゼをコードするｌａｃｚ−遺伝子は、Ｔｎ５
（トランスポゾン）挿入によって不活性化されている。
従って、ＮＦ１８２９株では、ｐＪＳ４１３プラスミド
に挿入された遺伝子の発現を得るためにｌａｃプロモー
ターを誘導しなければならない。

【０１１５】６．３．３．ｇＤ−１遺伝子を発現する形
質転換体の同定 アンピシリン耐性大腸菌形質転換体から単離されたプラ
スミドは、制限酵素マッピングにより、さらにｐＪＳ４
１３ベクターとｇＤ−１遺伝子挿入物の間の接合部のＤ
ＮＡ配列決定によって分析された。プラスミドｐＥＨ２
５（図４）は、Ｃｒｏ−ｇＤ−１接合部に沿って正しい
ヌクレオチド配列を有し（図５に示す）、そしてｇＤ−
１関連ポリペプチドを発現させるその能力を調べた。ｌ
ａｃプロモーターはＮＦ１８２９では（ｌａｃリプレッ
サーの過剰生産のために）転写的に不活性であるから、
ｇＤ−１タンパク質は１ｍＭ ＩＰＴＧまたは１〜１０
ｍＭラクトースのいずれかでプロモーターを誘導した後
にだけ検出できた。

【０１１６】ｐＥＨ２５により形質転換されたクローン
を、ｇＤ−１関連タンパク質のＩＰＴＧ特異的誘導につ
いて試験したところ、ｃｒｏタンパク質の２３アミノ酸
（ｐＪＳ４１３内にコードされる）およびｇＤ−１タン
パク質の３４２アミノ酸（即ち、ｇＤ−１の最初の５２
アミノ酸が消失している）からなる４６，０００ダルト
ンのタンパク質の生産が確認された。このタンパク質
は、ＨＳＶ−１に対する全ウサギ抗血清（ＤＡＫＯ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ，
Ｎ．Ｙ．）およびＨＳＶ−１のｇＤに対して特異的なモ
ノクローナル抗体（１Ｓ、４Ｓ、５５Ｓおよび５７Ｓ）
（Ｓｈｏｗａｌｔｅｒら，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３４：６８４）により
免疫沈降された。

【０１１７】モノクローナル抗体１Ｓ、４Ｓ、５５Ｓお
よび５７ＳはｇＤ−１分子上の多くの異なる部位を認識
する（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９８２，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．４１：４７８）。注目すべきことは、モノクローナ
ル抗体４Ｓが、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の感染性を
中和する能力があり、そして両方のウイルスによって産
生されたｇＤタンパク質を免疫沈降せしめる能力がある
ことである。ｐＥＨ２５によって産生されたタンパク質
は４Ｓ抗体によって免疫沈降され、このことはｐＥＨ２
５のｇＤ−１関連タンパク質がＨＳＶ−１とＨＳＶ−２
の両ｇＤタンパク質によって共有される抗原決定基を発
現していることを実証した。さらに、ｐＥＨ２５のｇＤ
−１関連タンパク質は、ＨＳＶ−１のみを中和する１Ｓ
モノクローナル抗体によっても免疫沈降された。また、
ｐＥＨ２５ｇＤ−１関連タンパク質は、ＨＳＶ−１とＨ
ＳＶ−２のいずれの感染性も中和しない５５Ｓおよび５
７Ｓモノクローナル抗体によって免疫沈降された。各免
疫沈降物をＳＰＳ−ＰＡＧＥによって分析した。全手順
の詳細を以下で説明する。

【０１１８】すべてのｐＥＨ２５形質転換体は、Ｌブロ
ス中３７℃での一夜培養物のアリコートを取り出し、Ｍ
−９ブロスで２０倍に希釈し、そして３７℃で９０分間
振とうすることにより増殖させた（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｒｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９７
２）。ｇＤ−１タンパク質の発現についてのこれら培養
物のアッセイでは、１ｍＭのＩＰＴＧおよび２５μＣｉ
／ｍｌの^３５Ｓ−メチオニンを培養物に添加した（対照
は^３５Ｓ−メチオニンで標識したが、誘導を行わなかっ
た）。３７℃で６０分後、培養物を遠心分離によってペ
レット化した。細胞を溶解して細胞内容物を放出させる
ために、細胞の各ペレットを等量の溶解バッファーＩＰ
−３（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、１００
ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、
１％デオキシコール酸および０．１％ＳＰＳ）中に再懸
濁し、直ちに液体窒素中で凍結し、音波処理した。細胞
溶解産物を５，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、
上澄みをアリコートに分けた。対照血清（非免疫あるい
は免疫前血清）または試験抗血清（ＨＳＶ−１に対する
多価抗血清またはｇＤに対するモノクローナル抗血清）
を各アリコートに添加し、その後４℃で６０分間インキ
ュベートした。（抗血清の添加量は、既知量の抗原を用
いて抗血清の連続希釈物を試験することにより抗血清力
価を較正することによって決定される。） 免疫複合体は、洗浄したパンソルビン（Ｐａｎｓｏｒｂ
ｉｎ）（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
プロテインＡ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ
Ｃｏｒｐ．，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌ．）を添加し、
遠心分離（特にことわらない限り、この手順での全ての
遠心分離は５，０００×ｇで４℃、５分間行った）する
ことにより回収した。ペレット化免疫沈降物をＩＰ−２
（ＩＰ−３と同じだが、非特異的吸着を排除するために
２０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンＢＳＡを加えてあ
る）に再懸濁して洗い、ＩＰ−３で２回洗い、そしてＩ
Ｐ−１〔２０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．１）、１０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡおよび１％ＮＰ−４
０〕中に再懸濁した。この懸濁体を新しいチューブに移
し、それを遠心分離にかけ、ペレットをＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル・サンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌ
ｉ，１９７０，Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０）中に再
懸濁した。９５℃で３分間加熱した後、サンプルを微量
遠心機により１２，０００×ｇで２分間遠心分離し、不
溶性成分を除いた。上澄みを取り出し、そしてＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル（１０％）上にのせた。電気泳動
後、タンパク質をクーマシーブルー染料で染色し、サル
チル酸ナトリウムで処理し、フルオログラフィーのため
に乾燥した（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，１９７９，Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８：１３２）。ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果
は、誘導後にｐＥＨ２５から産生された４６，０００ダ
ルトンのｇＤ−１関連タンパク質が、ＨＳＶ−１に対す
る全ウサギ抗血清およびモノクローナル抗体１Ｓ、４
Ｓ、５５Ｓおよび５７Ｓにより免疫沈降されたことを明
らかに示していた。

【０１１９】最後に、ｐＥＨ２５で形質転換された大腸
菌ＮＦ１８２９から発現された誘導ｇＤ−１関連タンパ
ク質の免疫沈降に及ぼすＨＳＶ−１感染Ｈｅｌａ細胞の
溶解産物の効果を調べるために、競合実験を行った（図
６参照）。対照（非感染）およびＨＳＶ−１感染Ｈｅｌ
ａ細胞（感染はＶｅｒｏ細胞について前に記載したとお
りに行った）の溶解産物から連続希釈物を調製した。モ
ノクローナル５５Ｓ腹水（ｇＤ−１特異的モノクローナ
ル抗体）の１００倍希釈物の５μｌアリコートを、Ｈｅ
ｌａ細胞溶解産物の連続希釈物の各アリコートに加え
た。４℃で３０分間インキュベーション後、誘導したｐ
ＥＨ２５形質転換体の溶解産物からの^３５Ｓ−メチオニ
ン標識タンパク質を等量、Ｈｅｌａ細胞溶解産物に添加
し、そして更に６０分間４℃でインキュベートした。免
疫複合体を免疫沈降によって回収し、前述のごとくＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥおよびフルオログラフィーによって分析し
た。特異的に免疫沈降されたタンパク質バンドをゲルか
ら切り出し、そして放射活性をシンチレーション計数に
よって測定した。図６はこれらの実験の結果を示す。各
サンプルの放射活性は、ｐＥＨ２５の免疫沈降された標
識タンパク質産物を表すものであり、対照に対する％と
してプロットした。円は連続希釈された対照（非感染）
Ｈｅｌａ細胞溶解産物を表す。四角は連続希釈されたＨ
ＳＶ−１感染Ｈｅｌａ細胞溶解産物を示す。これは、明
らかに、ＨＳＶ−１タンパク質が５５Ｓモノクローナル
抗体との免疫複合体の形成についてｐＥＨ２５からの放
射性標識タンパク質と競合することを示している。

【０１２０】６．４．Ｃｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラクト
シダーゼ融合タンパク質の生産をもたらすｐＥＨ４−２
の作製 ｇＤ−１遺伝子をｐＥＨ２５から単離し、その終止シグ
ナルを欠失させた。このために、ｇＤ−１遺伝子配列を
含むＤＮＡフラグメントを、ｇＤ−１終止配列ＴＡＧを
越えた制限部位で切断した。次に、ＤＮＡヌクレアーゼ
のＢａｌ ３１による末端の前進型消化によってＴＡＧ
を除いた。その後、このｇＤ−１遺伝子フラグメント
は、融合タンパク質：Ｃｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラクト
シダーゼをコードするようにｐＪＳ４１３に挿入した。
この手順を以下に記載し、図７に示す。

【０１２１】プラスミドｐＥＨ２５をＮｒｕＩで完全に
消化し、Ｂａｌ ３１ヌクレアーゼで前進的に消化し
た。次に、得られた種々の長さのＤＮＡを制限酵素Ｐｓ
ｔＩで切断して広範囲のフラグメントを生成し、その多
くはｇＤ−１終止コドンを欠いていたが、大部分のｇＤ
−１遺伝子配列を保有していた。適当なＤＮＡフラグメ
ント（１．５〜１．９ｋｂ）をゲル電気泳動によって分
離し、前に記載したように溶出した。ベクターｐＪＳ４
１３をＰｓｔＩおよびＳｍａＩで完全に消化し、適当な
５．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを単離した（図７）。
ｐＥＨ２５フラグメントおよびｐＪＳ４１３フラグメン
トを１：１の比率で連結しし、大腸菌ＮＦ１８２９の形
質転換に用いた。アンピシリン耐性コロニーは、指示寒
天平板にてβ−ガラクトシダーゼ活性をアッセイするこ
とにより融合タンパク質の生産について調べた（Ｍｉｌ
ｌｅｒ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．
Ｙ．，１９７２）。陽性コロニーは、ＩＰＴＧで誘導さ
れた形質転換体の全溶解産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に
よってＣｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラクトシダーゼ融合タ
ンパク質の存在について試験した。Ｃｒｏ／ｇＤ−１／
β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を発現するこれら
のクローンから１６０，０００ダルトンの融合タンパク
質の高レベル生産体を単離した。このクローンに含まれ
るプラスミドをｐＥＨ４−２と命名した（図７）。ｐＥ
Ｈ４−２で形質転換された大腸菌クローンにより産生さ
れた融合タンパク質は、ＩＰＴＧにより誘導可能であ
り、しかもＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方と交差免
疫反応性であることが分かった。ｐＥＨ４−２プラスミ
ドを単離して、制限マッピングとＤＮＡ配列決定により
分析した。ｐＥＨ４−２はｐＪＳ４１３のＢａｍＨＩ部
位を含まない（図８参照）。

【０１２２】ｐＥＨ３−２５と命名したプラスミドで形
質転換された他の大腸菌単離物は、ｐＥＨ４−２形質転
換体よりも少ない量のＣｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラクト
シダーゼ融合タンパク質を産生した。ｐＥＨ３−２５形
質転換体については本文中で後述する（第６．５節参
照）。 ６．４．１．ｐＥＨ４−２融合タンパク質は抗ＨＳＶ−
１血清と免疫反応する ｐＥＨ４−２で形質転換された大腸菌から産生された融
合タンパク質は、ＨＳＶ−１に対するウサギ抗血清と特
異的に相互作用した（データは示してない）。ｐＥＨ４
−２およびｐＥＨ２５のＩＰＴＧ−誘導タンパク質をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースに移
行させた（即ち、タンパク質「ブロット」を行った）。
誘導しなかったｐＥＨ４−２およびｐＥＨ２５形質転換
体の溶解産物を対照として同じ手順で処理した。次に、
ニトロセルロースをＨＳＶ−１に対するウサギ抗血清で
処理し、続いてプローブとしてのウサギ免疫グロブリン
に対する^１２５Ｉ標識ヤギ抗血清で処理した（Ｔｏｗｂ
ｉｎら，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：４３５０）。

【０１２３】タンパク質ブロットのオートラジオグラム
は、１６０，０００ダルトンのｐＥＨ４−２由来の融合
タンパク質がＨＳＶ−１に対するウサギ抗血清と免疫反
応すること、そして４６，０００ダルトンのｐＥＨ２５
由来のｇＤ−１関連タンパク質がＨＳＶ−１に対するウ
サギ抗血清と免疫反応することを実証した。 ６．４．２．ｐＥＨ４−２融合タンパク質に対する抗血
清はＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２タンパク質を免疫沈降
させる ｐＥＨ４−２融合タンパク質に対する抗血清は、ＨＳＶ
−１ｇＤおよびＨＳＶ−２ｇＤと免疫反応することが分
かり、かくして、ｐＥＨ４−２融合タンパク質はｇＤ特
異的抗原決定基を含むことが実証された。これは、ｐＥ
Ｈ４−２融合タンパク質に対する抗血清により免疫沈降
されたＨＳＶ−１タンパク質およびＨＳＶ−２タンパク
質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により示された。以下の考察
を参照されたい。

【０１２４】ｐＥＨ４−２融合タンパク質に対するウサ
ギ抗血清は次のように作製した。ｐＥＨ４−２で形質転
換された大腸菌クローンを中間対数期まで増殖させ、１
ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。誘導の４時間後に、
バクテリアを遠心分離により沈澱させ、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅサンプルバッファーで溶菌し、そして分離用ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル上に置いた。電気泳動後、外側
レーンをクーマシーブルー染料で染色してタンパク質を
可視化した。次に、１６０，０００ダルトンの融合タン
パク質バンドをゲルから切り出した。ゲル切片を液体窒
素に浸し、粉砕し、そしてＰＢＳ中に再懸濁した。等量
のフロインド完全アジュバントを加えた。よく混合した
後に、この溶液を２匹のニュージーランドウサギ（０１
８および０１９）に皮下注射した。各ウサギに２５〜５
０μｇのタンパク質を注射した。２８日後、不完全フロ
インドアジュバント中に懸濁した融合タンパク質同量で
ウサギに追加免疫を施した。１０日ごとに２回以上の追
加免疫を実施した。最初の注射より５５日後、耳から採
血して血清を回収し、免疫沈降分析に供した。

【０１２５】免疫沈降は次のように行った。集密的培養
細胞にＨＳＶを１０ｐｆｕ／細胞（１０プラーク形成単
位／細胞）で感染させ、感染後^３５Ｓ−メチオニンで１
６時間標識した。〔ＧＢＫ（ジョージアウシ腎）細胞に
ＨＳＶ−１を感染させ、一方、ＨｅＬａ細胞にはＨＳＶ
−２を感染させた。Ｖｅｒｏ細胞にはＨＳＶ−１または
ＨＳＶ−２のいずれかを感染させた。〕^３５Ｓ−メチオ
ニンで標識したＨＳＶ−感染細胞の溶解産物を、１０μ
ｌの免疫前ウサギ血清、ｐＥＨ４−２融合タンパク質に
対するウサギ抗血清（例：０１８または０１９抗血
清）、または１μｌのモノクローナル抗体４Ｓとともに
インキュベートした。免疫複合体を第６．３．３節に述
べたようにパンソルビンを用いて回収し、免疫沈降した
放射性標識タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離
し、そしてフルオログラフィーにかけた。ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの結果は、（１）ＨＳＶ−１に感染させたＧＢＫ細
胞またはＶｅｒｏ細胞から産生された５２，０００ダル
トンのｇＤタンパク質は、ｐＥＨ４−２形質転換体から
産生された融合タンパク質に対する抗血清と、さらに４
Ｓモノクローナル抗体と免疫反応性であること、（２）
ＨＳＶ−２に感染させたＨｅＬａ細胞またはＶｅｒｏ細
胞から産生された５０，０００ダルトンのｇＤタンパク
質は、ｐＥＨ４−２融合タンパク質に対する抗血清およ
び４Ｓモノクローナル抗体と免疫反応性であることを示
した。ＨＳＶ−１由来のｇＤと比べたときのＨＳＶ−２
由来のｇＤの見かけ低分子量は、発表された観察と合致
する（Ｒｕｙｅｃｈａｎら，１９７９，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．２９：６７７）。フルオログラフィーの結果は、Ｈ
ＳＶ−１またはＨＳＶ−２感染細胞により産生されたｇ
Ｄタンパク質がｐＥＨ４−２形質転換体から産生された
融合タンパク質に対する抗血清と免疫反応性であること
を示していた。

【０１２６】６．４．３．ｐＥＨ４−２に対する抗血清
はｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２感染
を中和する ｐＥＨ４−２融合タンパク質に対するウサギ抗血清は、
ウイルスの感染力を中和するその能力についても分析さ
れた。ウイルスの中和は、組織培養物中の感染細胞のプ
ラーク数の減少によって検定した（Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ
ら，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕ
ｎｉｔｙ３４：６８４）。このために、５０〜１００ｐ
ｆｕのＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を、免疫前血清（対
照）、免疫抗血清（０１８または０１９）またはモノク
ローナル抗体４Ｓの希釈物とともに活性血清補体
（Ｃ’）の存在下または不在下でプレインキュベートし
た。Ｖｅｒｏ細胞にＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２の調製
物を感染させた。３〜４日後、ＨＳＶプラークを数え
て、プラーク数の減少に及ぼす抗血清の効果を調べた。
表１に示す結果は、各ウサギから得られた抗血清がｉｎ
ｖｉｔｒｏでＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２を中和する
能力があることを示している。中和は活性補体の不在下
でも証明されたが、補体は中和活性を著しく増大させ
た。中和はＨＳＶ−２よりもＨＳＶ−１に対してより一
層効果的であった。

【０１２７】

【表１】 ^１ウサギ由来の血清０１８および０１９を、５％熱不活
性化補体（５６℃で３０分、−Ｃ’）または活性モルモ
ット補体（＋Ｃ’）の存在下にＶｅｒｏ細胞単層上でウ
イルス中和について試験した。数字は、プラーク数を５
０％減少させた血清希釈率の逆数としての抗体価を示
す。^２これらの試験では、Ｖｅｒｏ細胞の代わりにＧＢ
Ｋ細胞を用いた。表示した結果は、ＨＳＶ−１およびＨ
ＳＶ−２に対するサブユニットワクチンとしてのｐＥＨ
４−２融合タンパク質の利用可能性を示している。

【０１２８】６．４．４．ｐＥＨ４−２中のｇＤ−１遺
伝子の再構築 プラスミドｐＪＳ４１３およびｐＲＷＦ６を用いて、ｇ
Ｄ−１遺伝子を再構築した（図８）。かくして、ｐＲＷ
Ｆ６をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｌ３１で消化して、ラ
ンダムな大きさの平滑末端フラグメントを生成した。こ
れらのフラグメントをＳａｃＩで消化した後、２．２〜
２．４ｋｂの平滑末端化／ＳａｃＩフラグメントを単離
した。これらのフラグメントは、さまざまな長さのｇＤ
−１遺伝子のアミノコード末端を含んでいた（図８参
照）。

【０１２９】ｇＤ−１フラグメントをｐＪＳ４１３にサ
ブクローニングした。このために、ｐＪＳ４１３をＳｍ
ａＩ（平滑末端をもたらす）およびＳａｃＩ（ＳａｃＩ
３’付着末端をもたらす）で消化した。４．７ｋｂのＳ
ｍａＩ／ＳａｃＩ ｐＪＳ４１３フラグメントを平滑末
端化／ＳａｃＩ ｐＲＷＦ６フラグメント（２．２〜
２．４ｋｂ）と１：１の比率で連結し、大腸菌ＮＦ１８
２９株を形質転換するために用いた。これは、アミノコ
ード末端でランダムに「欠失された」ｇＤ−１遺伝子を
含むプラスミドにより形質転換されたクローンの集団を
もたらした（図８）。ｐＥＨ５０＋ｘ（ここでｘは１〜
２４を意味する）と命名された、全部で２４のプラスミ
ド（それぞれ約７ｋｂ）は制限酵素認識部位のマッピン
グにより分析した。ｇＤ−１遺伝子内にＰｖｕＩＩ部位
を含むもの（２４の形質転換体のうち１９）をさらに分
析して、ｇＤ−１のアミノコード末端の最長部分を含む
クローンを同定した。

【０１３０】完全なｇＤ−１遺伝子配列において、ｇＤ
開始ＡＴＧと内部ＰｖｕＩＩ部位の間の距離は１５６塩
基対である。従って、１９のｐＥＨ５０＋ｘプラスミド
のそれぞれをＢｇｌＩＩおよびＰｖｕＩＩで消化した。
得られたフラグメントをゲル電気泳動で分離して、Ｂｇ
ｌＩＩ／ＰｖｕＩＩフラグメントの大きさを調べた。１
６０塩基対より小さいＢｇｌＩＩ／ＰｖｕＩＩフラグメ
ントをもつ１５のｐＥＨ５０＋ｘプラスミドを同定し
た。即ち、図８に示すＢａｌ３１消化の終点は、ｇＤ−
１開始ＡＴＧとＰｖｕＩＩ部位の間のどこかにあった。
これら１５の配列を解析して、ｐＪＳ４１３プラスミド
への連結部位を正確に決めた。７つのプラスミド、ｐＥ
Ｈ５１、ｐＥＨ６０、ｐＥＨ６２、ｐＥＨ６６、ｐＥＨ
７１、ｐＥＨ７３およびｐＥＨ７４は、ｐＪＳ４１３の
ｃｒｏＡＴＧの翻訳リーディングフレームとｉｎ ｐｈ
ａｓｅで連結されたｇＤ−１配列を含んでいた（図３参
照、そこには、これらの連結部位を対応するｐＥＨの数
字と垂直な矢印で示してある）。事実、ｐＥＨ５１はｇ
Ｄ−１アミノ末端の最初の６個のアミノ酸を除いた全部
をコードする。

【０１３１】ｐＥＨ５１、ｐＥＨ６０、ｐＥＨ６２およ
びｐＥＨ７１の形質転換体は、ＩＰＴＧ誘導を行ってま
たは行わないで、^３５Ｓ−メチオニンで標識し、細胞溶
解産物をモノクローナル抗体５５Ｓで処理した。免疫沈
降物を前記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ｐＥ
Ｈ５１、ｐＥＨ６０、ｐＥＨ６２またはｐＥＨ７１を含
む形質転換体は、それぞれ、モノクローナル５５Ｓによ
り沈降される４６，０００ダルトンの誘導可能なタンパ
ク質を産生した（データは示してない）。

【０１３２】最後に、融合タンパク質をコードする組換
えプラスミドは、ｐＥＨ４−２中に存在するｇＤ−１遺
伝子配列のアミノコード末端を再構築するために、ｐＥ
Ｈ５１のアミノコード末端を用いて作製した（図９参
照）。プラスミドｐＥＨ４−２をＰｓｔＩおよびＳａｃ
ＩＩで消化し、部分ｇＤ−１／β−ガラクトシダーゼ遺
伝子を含む６．２ｋｂのフラグメントを単離した。プラ
スミドｐＥＨ５１をＰｓｔＩで完全に消化し、ＳａｃＩ
Ｉで部分的に消化した。ｐＥＨ５１の１．２５ｋｂのＰ
ｓｔＩ／ＳａｃＩＩフラグメントをｐＥＨ４−２の６．
２ｋｂのＰｓｔＩ／ＳａｃＩＩフラグメントと１：１の
比率で連結させてｐＥＨ８２を作製した。形質転換体は
前記のごとくβ−ガラクトシダーゼ活性についてスクリ
ーニングして同定した。ｐＥＨ５１プラスミドを担う大
腸菌形質転換体を大腸菌ＷＷ５１株と命名し、ｐＥＨ８
２プラスミドを含有する形質転換体を大腸菌ＷＷ８２株
と命名する。

【０１３３】我々は、ＨＳＶ ｇＤ−１融合タンパク質
を大腸菌において大量に生産できることを明らかにし
た。融合タンパク質は、おそらく、融合タンパク質の構
成自体のために、または密で不溶性の封入体中への融合
タンパク質の隔離のために、非常に安定している。我々
は、融合タンパク質を大腸菌から抽出して、動物の免疫
感作に用いることができることを示した。得られた抗血
清はｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の
両方のプラーク形成を中和することができる。

【０１３４】６．５．Ｃｒｏ／ｇＤ−１およびＣｒｏ／
ｇＤ−１／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を産生
するｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ３９２の作製 適当な宿主細胞において融合および非融合の両方のｇＤ
−１関連タンパク質を産生させることができる組換えプ
ラスミドｐＥＨ９０−１０ａｍを構築した（図１０参
照）。

【０１３５】ｐＥＨ９０−１０ａｍプラスミドは、Ｃｒ
ｏ／ｇＤ−１／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を
コードするｐＥＨ３−２５（第６．４節参照）から誘導
された、一連の組換えプラスミドｐＥＨ−９０−Ｎに由
来するものであった（図３および図１０参照）。ｐＥＨ
−９０−Ｎ系列は、ｃｒｏ、ｇＤ−１およびｚ−遺伝子
の翻訳リーディングフレームが合致する（ｉｎ ｐｈａ
ｓｅである）という点でｐＥＨ４−２（第６．４節）に
類似するが、ｐＥＨ−９０−Ｎ系列はｇＤ−１遺伝子と
ｚ−遺伝子の接合部に追加のユニークな制限エンドヌク
レアーゼ認識配列を含んでいる。

【０１３６】ｐＥＨ−９０−Ｎ系列の１つの形質転換体
から単離された、ｐＥＨ−９０−１０と命名された組換
えプラスミドは、さらに次のように修飾された。（１）
ｐＥＨ−９０−１０を、ｇＤ−１遺伝子配列とｚ−遺伝
子配列の接合部で切断し、（２）次に、ｐＥＨ−９０−
１０を、アンバー連鎖終止配列ＴＡＧを含むＤＮＡリン
カー配列の存在下で連結させた。得られた組換えプラス
ミドｐＥＨ−９０−１０ａｍは、ｇＤ−１遺伝子とｚ−
遺伝子の両方の翻訳リーディングフレームに合致するア
ンバー連鎖終止配列ＴＡＧを含んでいる。

【０１３７】ｐＥＨ９０−１０ａｍを大腸菌ＮＦ１８２
９の形質転換に用いた場合、アンピシリン耐性形質転換
体は検出可能な融合タンパク質をまったく合成しなかっ
た。ところが、ｐＥＨ−９０−１０ａｍ形質転換体にア
ンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を含む溶原性の形質
導入ファージφ８０ ＳｕＩＩＩを感染させたときに
は、誘導された形質転換体はＣｒｏ／ｇＤ−１／β−ガ
ラクトシダーゼ融合タンパク質を産生した。この溶原を
ｐＥＨ９０−１０ａｍ ＳｕＩＩＩと命名する。

【０１３８】また、ｐＥＨ９０−１０ａｍプラスミドを
用いて、２つのアンバーサプレッサー変異（ＳｕｐＥお
よびＳｕｐＦ）をもつ大腸菌ＬＥ３９２を形質転換させ
た。ｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ３９２形質転換体は誘導
および非誘導の両条件下でＣｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラ
クトシダーゼ融合タンパク質を産生した（ＬＥ３９２細
胞は、ｌａｃリプレッサーの過剰生産をもたらすＮＦ１
８２９のｌａｃＩ^Ｑ変異をもたない）。ｐＥＨ９０−１
０ａｍＬＥ３９２形質転換体により産生されたタンパク
質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、融合タンパク質（約
１６０，０００ダルトン）および非融合ｇＤ−１関連タ
ンパク質（約３８，０００ダルトン）の両方が産生され
たことが確認された。両方のタンパク質はウサギ抗ＨＳ
Ｖ−１血清と免疫反応する。ｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ
３９２形質転換体はほぼ等モル量で両方のタンパク質を
産生するらしく、２つのタンパク質は第５．５節に記載
した非変性共凝集物精製法で単離したとき共精製され
る。この手順の詳細については以下の分節で述べる。

【０１３９】６．５．１．ｐＥＨ９０−Ｎ系列の作製 第６．４節で前に説明したように、ｐＥＨ３−２５形質
転換体はＣｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラクトシダーゼ融合
タンパク質を産生するが、その生産量はｐＥＨ４−２形
質転換体より少ない。ｐＥＨ３−２５組換えプラスミド
は、ｇＤ−１の膜貫通配列をもつ以外は、ｐＥＨ４−２
に類似している（図３参照）。膜貫通配列が宿主細胞形
質転換体による融合タンパク質の効率の悪い発現に関与
しているのかもしれない。

【０１４０】発現ベクターｐＨＫ４１４（図１０）はｐ
ＪＳ４１３誘導体である。事実、ｐＨＫ４１４はｐＪＳ
４１３の全要素を含むが、ｃｒｏ−ｚ接合部を横切るそ
のユニークなクローニング部位をもつ点で相違する。ｐ
ＨＫ４１４のクローニング部位は、ＢｇｌＩＩ、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩである。ｚ−遺伝子は
ｃｒｏＡＴＧとリーディングフレームが合致しておら
ず、従って、無傷のプラスミドはβ−ガラクトシダーゼ
の生産を支配していない。しかし、適切な長さ（３ｎ＋
２）のＤＮＡフラグメントが該プラスミドのこれらクロ
ーニング部位のいずれかに挿入されると、ｚ−遺伝子の
リーディングフレームがｃｒｏＡＴＧに対して再調節さ
れ、そして、挿入されたＤＮＡ配列がｃｒｏＡＴＧまた
はｚ−遺伝子とｉｎ ｐｈａｓｅにある終止シグナル
（例：ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）を含まないという
条件で、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質が宿主細
胞形質転換体により産生されるだろう。

【０１４１】ｐＥＨ９０−Ｎ系列は次のように構築した
（図１０参照）。まず、ｐＥＨ３−２５をＢａｍＨＩで
消化し、次に、カルボキシ−コード末端のｇＤ−１膜貫
通配列を除くために、切断したプラスミドをＢａｌ３１
で処理した。Ｂａｌ３１消化の後に、ｐＥＨ３−２５を
ＰｓｔＩで切断して、ＰｓｔＩ付着末端、ａｍｐ^ｒ遺伝
子のアミノコード末端、ｌａｃプロモーターおよび翻訳
調節要素、膜貫通配列の全部または一部が欠失されてい
るｇＤ−１遺伝子、および平滑末端（ＢａｍＨ
Ｉ^（−））により特徴づけられる１．７〜１．９ｋｂの
ＤＮＡフラグメントの集団をアガロースゲル電気泳動に
よって単離した。

【０１４２】発現プラスミドｐＥＫ４１４は、まず、Ｂ
ｇｌＩＩで切断し、ＢｇｌＩＩ付着末端をＤＮＡポリメ
ラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いて修復した。
次に、線状の平滑末端化ｐＨＫ４１４をＰｓｔＩで消化
して、平滑末端（ＢｇｌＩＩ^（−１））、ｚ遺伝子、ａ
ｍｐ^ｒ遺伝子のカルボキシコード末端、およびＰｓｔＩ
付着末端により特徴づけられる５．５ｋｂのＤＮＡフラ
グメントをアガロースゲル電気泳動によって単離した。

【０１４３】ｐＥＨ３−２５の１．７〜１．９ｋｂのＰ
ｓｔＩ／ＢａｍＨＩ^（−１）ＤＮＡフラグメントとｐＨ
Ｋ４１４の５．５ｋｂのＢｇｌＩＩ^（−１）／ＰｓｔＩ
ＤＮＡフラグメントを１：１のモル比で、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結させた。ｐＥＨ９０−Ｎと命名し
た、得られたプラスミドの集団は指示寒天平板で増殖さ
せた大腸菌ＮＦ１８２９を形質転換するために用いた。

【０１４４】融合タンパク質を産生した２４の形質転換
体のうちの１０から誘導された次の組換えプラスミド
を、ｇＤ−１／ｚ−遺伝子接合部（図３参照）を通るＤ
ＮＡ配列決定により分析した。すなわち、ｐＥＨ９０−
２、ｐＥＨ９０−３、ｐＥＨ９０−４、ｐＥＨ９０−
５、ｐＥＨ９０−６、ｐＥＨ９０−７、ｐＥＨ９０−
９、ｐＥＨ９０−１０、ｐＥＨ９０−１１およびｐＥＨ
９０−１２であった。ｐＥＨ９０−１２以外は全て、膜
貫通配列の全部または一部の欠失を含む。ｐＥＨ９０−
４およびｐＥＨ９０−５はほぼ半分の膜貫通配列を含
む。ｐＥＨ９０−１２を除いて、これらのプラスミド
は、ｐＥＨ４−２によりもたらされた高レベルでのＣｒ
ｏ／ｇＤ−１／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の
生産へと導いた。この手順の次の工程のためにプラスミ
ドｐＥＨ９０−１０が選択された（ｐＥＨ９０−１０形
質転換体により産生されたｇＤ−１融合タンパク質は、
ｐＥＨ４−２形質転換体により産生されたものと同じで
ある。但し、ｐＥＨ４−２形質転換体により産生された
ｇＤ−１の最後の４つのアミノ酸が、ｐＥＨ９０−１０
形質転換体により産生された融合タンパク質からは失わ
れている）。

【０１４５】６．５．２．ｐＥＨ９０−１０ａｍの作製 ｐＥＨ９０−１０プラスミドのｇＤ−１配列とｚ−遺伝
子の間にアンバー連鎖終止配列を導入するために、次の
手順を用いた（図１０参照）。ｐＥＨ９０−１０をＨｉ
ｎｄＩＩＩで切断し、次にＢａｍＨＩで切断して、ｇＤ
−１遺伝子とｚ−遺伝子の間の接合部に存在するそのユ
ニークな制限エンドヌクレアーゼ部位で該プラスミドを
切断した（下記参照）。

【０１４６】

【化３】

【０１４７】７．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ
切断プラスミドをアガロース ゲル電気泳動により単離
し、（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて）ＨｉｎｄＩＩＩ
／ＢｇｌＩＩ付着末端および内部ＸｂａＩ部位およびア
ンバー配列（ＴＡＧ）によって特徴づけられる次のＤＮ
Ａリンカーと連結させた。

【０１４８】

【化４】

【０１４９】ＤＮＡリンカーの各相補鎖は、Ｃｈｏｗ
ら，１９８１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
９（１２）：２８０７−２８１７に報告される固相法に
よって合成した。リンカーを切断プラスミドに連結した
後、得られた組換えプラスミドをＸｂａＩによって切断
し、線状の７．３ｋｂのＤＮＡフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動によって単離し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
で連結して再環状化した（これは、実際、プラスミド上
の単一のＸｂａＩ部位の存在によって示される、ｇＤ−
１／ｚ接合部でＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩＩ部位の間
に連結されたリンカー配列を含むｐＥＨ９０−１０プラ
スミドを選択した）。連結の結果として、ＤＮＡリンカ
ーのアンバー配列は、ｇＤ−１およびｚ−遺伝子と翻訳
リーディングフレームが合致していた（下記参照）。

【０１５０】

【化５】

【０１５１】得られたプラスミドはｐＥＨ９０−１０ａ
ｍと命名された。 ６．５．３．ｐＥＨ９０−１０ａｍ形質転換体 ｐＥＨ９０−１０ａｍを大腸菌ＮＦ１８２９の形質転換
に用いた。ＩＰＴＧで誘導したとき、アンピシリン耐性
形質転換体は融合タンパク質を検出可能なレベルで合成
しなかった（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ指示寒天平板上に赤色
コロニーがない）。次に、形質転換体にアンバーサプレ
ッサーｔＲＮＡ遺伝子を保有する溶原性の形質導入ファ
ージφ８０ ＳｕＩＩＩを感染させた。ＩＰＴＧで誘導
された溶原化形質転換体は、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ指示寒
天平板上に赤色コロニーを形成し、これは融合タンパク
質の生産を示す。これらの溶原体をｐＥＨ９０−１０ａ
ｍＳｕＩＩＩと名づけた。

【０１５２】さらに、ｐＥＨ９０−１０ａｍプラスミド
は、２つのアンバーサプレッサー（ｓｕｐＥおよびｓｕ
ｐＦ）を有するがＮＦ１８２９のｌａｃＩ^Ｑ変異をもた
ないためｌａｃリプレッサーを過剰に合成しない大腸菌
ＬＥ３９２を形質転換するために用いた。これらの形質
転換体は、ｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ３９２と命名され
たものであるが、ＩＰＴＧで誘導しようとしまいと融合
タンパク質を産生した。

【０１５３】６．５．４．ｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ３
９２形質転換体により産生されたタンパク質の分析 融合タンパク質（約１６０，０００ダルトン）および３
８，０００ダルトンのタンパク質が、ほぼ等モル量でｐ
ＥＨ９０−１０ａｍＬＥ３９２形質転換体から産生され
た。各タンパク質はＨＳＶ−１に対するウサギ抗血清と
免疫反応することが分かった。このために、細胞タンパ
ク質をミニ凝集物法（以下で説明）によって単離し、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに移行さ
せ、次にＨＳＶ−１に対するウサギ抗血清で処理し、さ
らにプローブとしてのウサギ免疫グロブリンに対する
^１２５Ｉ−標識ヤギ抗血清で処理した（Ｔｏｗｂｉｎ
ら，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：４３５０）。

【０１５４】スクリーニング分析用の宿主細胞凝集物を
単離するにあたって、次のミニ凝集物法を採用した。 （１）１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む新鮮なＬ
ｕｒｉａブロス５ｍｌを入れた重複する培養チューブ
に、一夜培養物から得られた２００μｌの細胞を接種
し、３７℃で９０分間増殖させた。各重複物の一方は１
ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）の添加により誘導した。次
に、接種物を撹拌しながら３７℃でさらに５時間増殖さ
せた。

【０１５５】（２）培養物の３ｍｌアリコート中に含ま
れる細胞を、微量遠心分離機（１２，０００×ｇ）で２
分間遠心してペレット化した。（注意：微量遠心管の全
容量は１．５ｍｌである。従って、最初に１．５ｍｌア
リコートをペレット化し、上澄みを抜き取った。同一の
微量遠心管に別の１．５ｍｌアリコートを加え、同一の
遠心管でペレット化した。） （３）細胞ペレットを５０μｌの２５％スクロース含有
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８に懸濁し、ドライアイ
ス／エタノール浴中に遠心管を入れることによってこの
懸濁体を凍結した。

【０１５６】（４）凍結懸濁体を解凍し、０．２５Ｍト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ８中の１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム
５０μｌを添加し、そして懸濁体を氷上で１０〜１５分
間インキュベートした。 （５）１０〜１５分間のインキュベーション後、４００
μｌのＴＥＴバッファー（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ
ｐＨ８、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％トリトンＸ−１０
０；トリトンＸ−１００は非イオン性界面活性剤ポリオ
キシエチレン（９，１０）ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェ
ノールである）を添加し、懸濁体を穏やかに混合し、氷
上で５分間インキュベートした。次に、５００μｌの２
×ＲＩＰＡ（２×ＲＩＰＡは２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２％デオキシコー
ル酸ナトリウム、２％ＮＰ−４０、０．２％ＳＰＳであ
る）を添加し、懸濁体を穏やかに混合し、氷上で５分間
インキュベートした。

【０１５７】（６）次に、懸濁体中の細胞を、マイクロ
プローブを用いて１０秒間音波処理し、懸濁体をＳｏｒ
ｖａｌｌ ＳＳ３４ローターで２０，０００ｒｐｍ（４
７，８００×ｇ）、３０分間遠心して清澄化した。 （７）上澄みをデカントし、共凝集物タンパク質を含む
ペレットを５０μｌの蒸留水に再懸濁し、これに５０μ
ｌの２×サンプルバッファー（２×サンプルバッファー
は１０％ＳＤＳ、４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．
８、２％β−ＭＥおよびブロモフェノールブルーの０．
０２容飽和溶液よりなる）を添加し、そしてよく混合し
た。混合物を５分間煮沸し、２５μｌアリコートを電気
泳動のために１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに
アプライした。

【０１５８】タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した
後に、それらをニトロセルロースに移行させた（即ち、
タンパク質「ブロット」を行った）。次に、ニトロセル
ロースを、ＨＳＶ−１に対するウサギ抗血清で処理し、
次にプローブとしてのウサギ免疫グロブリンに対する
^１２５Ｉ−標識ヤギ抗血清で処理した（Ｔｏｗｂｉｎ，
１９７９ 前掲）。タンパク質ブロットのオートラジオ
グラムは、２つのバンドが抗ＨＳＶ−１抗体と免疫反応
したことをはっきりと示した。即ち、１６０，０００ダ
ルトンの融合タンパク質（Ｃｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラ
クトシダーゼ）、および３８，０００ダルトンのｇＤ−
１関連タンパク質（Ｃｒｏ／ｇＤ−１）または非融合ｇ
Ｄタンパク質（β−ガラクトシダーゼに融合してない）
である。従って、タンパク質を単離するために共凝集物
単離法を用いるとき、非融合タンパク質が融合タンパク
質とともに共精製される。そして、非融合ｇＤ（Ｃｒｏ
／ｇＤ−１）とｇＤ融合タンパク質（Ｃｒｏ／ｇＤ−１
／β−ガラクトシダーゼ）は共に抗ＨＳＶ血清と免疫反
応する。 ７．実施例：ＨＳＶ−２ｇＤ ＨＳＶ−１のゲノムマップを、ＨＳＶ−２のものと比較
した。ＨＳＶ−２ゲノム内のｇＤコード配列の位置は、
ＨＳＶ−１ゲノム内のｇＤの位置および大きさから類推
して決定された。ＨＳＶ−２のＵｓ領域のＢｇｌＩＩ
ＬフラグメントをｐＢＲ３２２に挿入して、組換えプラ
スミドｐＨＶ１を作製した。ｐＨＶ１中に含まれるｇＤ
−２コード配列は、ハイブリダイゼーションプローブと
してｐＳＣ３０−４から得られたｇＤ−１ＤＮＡの一部
を用いてハイブリダイゼーションを行うことにより、そ
の位置を決定した。ｇＤ−２コード配列を含むｐＨＶ１
の部分を、次に、ｐＢＲ３２２にサブクローニングし
て、組換えプラスミドｐＨＶ２を作製した。ｐＨＶ２内
のｇＤ−２遺伝子のＤＮＡ配列を決定し、そして、ｇＤ
−２の配列をｇＤ−１のものと比較した。ｇＤ−２のＤ
ＮＡ配列はｇＤ−１のＤＮＡ配列よりも１コドン短い
が、これら２配列の間にはかなりの相同性がある。

【０１５９】ｇＤ−２遺伝子をｌａｃプロモーターの制
御下に置くために、タンパク質コード配列の最初の１２
０ヌクレオチドを欠くｇＤ−２遺伝子配列の一部を、ｐ
ＨＶ２から単離した。このＤＮＡフラグメントを、ｌａ
ｃプロモーターおよび翻訳調節要素をコードする小さな
ＤＮＡフラグメントに連結させた。得られた組換えプラ
スミドｐＨＶ５は、宿主細胞形質転換体からｇＤ−２関
連タンパク質を生産させた。

【０１６０】最後に、特定部位での制限エンドヌクレア
ーゼ切断によってｇＤ−２遺伝子フラグメントをｐＨＶ
５から単離し、それによって、ｇＤ−２コード配列の終
止配列（ＴＡＧ）を欠失させた。このＤＮＡフラグメン
トはｇＤ−２遺伝子の一部と、発現プラスミドのプロモ
ーターおよび調節要素を含んでおり、β−ガラクトシダ
ーゼコード配列を含むベクターｐＨＫ４１４に連結させ
た。得られた組換えプラスミドｐＨＶ６は、ｃｒｏＳＤ
−ＡＴＧをもつプラスミドｌａｃプロモーターとβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子の間に挟まれたｇＤ−２コード配
列を含んでおり、誘導された大腸菌形質転換体において
融合タンパク質を発現させた。ｐＨＶ６融合タンパク質
を宿主細胞の溶解産物から単離して、免疫原として使用
するために製剤化した。各構築工程についての詳細は以
下の分節で説明する。

【０１６１】７．１．プラスミド作製に用いた一般的手
順 特にことわらない限り、ＤＮＡ単離、酵素反応および連
結反応について第６節およびその分節で説明した一般的
方法が、ｇＤ−２のクローニングにおいて利用された。 ７．１．１．制限酵素バッファー ＳｍａＩ消化に用いたバッファーは６．６ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ_２および
６．６ｍＭ β−ＭＥよりなる。

【０１６２】ＢｇｌＩＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩまたは
ＰｓｔＩ消化に用いたバッファーは６０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、６．６ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、６．６
ｍＭＭｇＣｌ_２および６．６ｍＭ β−ＭＥよりなる。
ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩまたはＸｈｏＩ消化に用いたバッ
ファーは１５０ｍＭＮａＣｌ、６．６ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ_２および６．
６ｍＭ β−ＭＥよりなる。

【０１６３】２以上の制限エンドヌクレアーゼ反応がＤ
ＮＡに対して行われるときは、低塩バッファー中での反
応を高塩バッファー中での反応の前に行うことに注意す
べきである。２つの酵素が同じバッファーを必要とする
場合は、その反応を同時に行ってもよい。 ７．２．ｇＤ−２遺伝子の位置確認および単離 前に述べたように、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２のゲノムマ
ップを比較して、ＨＳＶ−２ゲノム内のｇＤのおよその
位置および大きさを決定した。ｇＤ−２遺伝子は、８．
５ｋｂのＢｇｌＩＩ Ｌフラグメント内に含まれるＵｓ
領域内の０．９〜０．９４５ゲノムマップ単位の間にマ
ッピングされた。ＢｇｌＩＩ ＬフラグメントをＨＳＶ
−２ＤＮＡから切り出し、更なる分析のためにｐＢＲ３
２２中に挿入した。

【０１６４】７．２．１．ｇＤ−２遺伝子を含むｐＨＶ
１の構築 ＨＳＶ−２（Ｇ株）ゲノムＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化
し、ｇＤ−２遺伝子を含む約８．５ｋｂのＤＮＡフラグ
メントをアガロースゲル電気泳動によって単離した。プ
ラスミドｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩで完全に消化し、得
られた４．４ｋｂのｐＢＲ３２２ ＤＮＡとＨＳＶ−２
の８．５ｋｂのＢｇｌＩＩ Ｌ ＤＮＡフラグメントを
アニーリングし（ＢａｍＨＩ付着末端およびＢｇｌＩＩ
付着末端が相補的である）、１：１の比率で連結させて
ｐＨＶ１を得た（図１１ｂ）。

【０１６５】７．２．２．ｇＤ−２特異的ｍＲＮＡコー
ド配列の位置確認 ｇＤ−２ ｍＲＮＡコード配列は、ハイブリダイゼーシ
ョンプローブとしてｐＳＣ−３０−４から得られたｇＤ
−１ ＤＮＡの一部を用いるハイブリダイゼーション
（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．９８：５０３）によりｐＨＶ１内で局在化された
（サザントランスファーに用いたプロトコールについて
は、Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐｐ．３８２−３８９を参照のこ
と）。

【０１６６】かくして、ｐＨＶ１をＸｈｏＩで切断し、
得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動
によって分離した。次に、ゲル中のＤＮＡフラグメント
をアルカリ中で変性し、中和し、ニトロセルロースフィ
ルターに移行させた。その後、フィルターに付着したＤ
ＮＡフラグメントを^３２Ｐ標識ｇＤ−１プローブにハイ
ブリダイズさせた。

【０１６７】^３２Ｐ標識ｇＤ−１プローブは次のように
作製した。ｐＳＣ３０−４（図１ｄおよび図４）をＰｖ
ｕＩＩで切断し、ｇＤ−１の最初の５２のコドン（１５
６ヌクレオチド）を含む５００ｂｐのＤＮＡフラグメン
トをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって単離し
た。ｇＤ−１ ＤＮＡをニックトランスレーションで放
射性標識した（ＢＲＬ Ｋｉｔ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。ニックトラ
ンスレーションは二本鎖ＤＮＡを高い放射能比活性へｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ標識するための好適な方法である。この
方法は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの数種の活性のうち
の２つを利用するものである。即ち、５’−３’エキソ
ヌクレアーゼ活性と５’−３’ポリメラーゼ活性であ
る。ニックトランスレーションにおいて、この酵素は二
本鎖ＤＮＡの一方の鎖のニックに結合する。次いで、前
進するポリメラーゼより先で、５’−３’エキソヌクレ
アーゼ活性がニックの入った鎖のヌクレオチドを加水分
解する。かくして、ニックが鎖に沿って移動される（翻
訳される）。加水分解の速度は重合の速度と等しいの
で、正味の合成はない。しかし、この交換反応の進行中
に、反応混合物中に存在する放射性デオキシヌクレオシ
ド三リン酸がＤＮＡに取り込まれる（Ｋｅｌｌｙら，１
９７０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：３９）。そ
の後、^３２Ｐ標識ｇＤ−１二本鎖ＤＮＡを、一本鎖プロ
ーブとして使用するために変性した（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｐｐ．１
０９〜１１２参照）。

【０１６８】オートラジオグラフィーにより、ｐＨＶ１
の約２．３ｋｂのＸｈｏＩ／ＸｈｏＩ ＤＮＡフラグメ
ントは放射性ｇＤ−１プローブに対して相補的であるこ
とが実証され、それゆえに、ｇＤ−２コード配列を含ん
でいた。次に、ｇＤ−２コード配列をさらに特徴付ける
ために、ｐＨＶ１のＸｈｏＩ／ＸｈｏＩ ＤＮＡフラグ
メントをｐＢＲ３２２にサブクローニングした。そのた
めに、ｐＨＶ１をＸｈｏｌで消化し、ｇＤ−２コード配
列を含む２．３ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＳａｌＩ
（ＳａｌＩにより生成された付着末端はＸｈｏＩにより
生成された付着末端に相補的である）で予め切断してお
いた線状ｐＢＲ３２２にアニーリングし、１：１の比で
連結させてｐＨＶ２を作製した（図１１ｃ）。

【０１６９】７．２．３．ｇＤ−２ ｍＲＮＡコード配
列の特徴づけ ｐＨＶ２のＨＳＶ−ＤＮＡはＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒ
ｔの方法（１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９）を用いて配列決定を行っ
た。図１２は、ＨＳＶ−２ ｇＤ遺伝子の得られたＤＮ
Ａ配列を示す。このＤＮＡ配列は３９３のコドン（ｇＤ
−１のＤＮＡコード配列よりも１コドン少ない）のオー
プンリーディングフレームを含み、２６７位のＡＴＧか
ら伸びていた。この部位はｇＤ−２遺伝子のイニシエー
ターであると推定されるところから、この推定ｇＤ−２
遺伝子配列を発現ベクターｐＪＳ４１３およびｐＨＫ４
１３（下記参照）にクローニングすることによって、そ
うであることを確かめた。

【０１７０】ｇＤ−２タンパク質の予想されたアミノ酸
配列を、ｇＤ−１タンパク質の予想されたアミノ酸配列
と比較した（図１３）。２つの配列は約８２％相同であ
り、非相同領域が次の３つの領域に存在するようであ
る。つまり、リーダー配列、膜貫通領域、そして推定上
のアンカー領域である。ｇＤ−２タンパク質はｇＤ−１
タンパク質よりも１アミノ酸残基だけ短い。

【０１７１】７．３．ｇＤ−２遺伝子のクローニングお
よび発現 ｇＤ−２遺伝子をｌａｃプロモーターの制御下に置くた
めに、アミノコード末端（遺伝子の５’末端）の最初の
１２０ヌクレオチドを欠いた推定遺伝子配列の部分をｐ
ＨＶ２から単離した。ｐＨＶ２ ＤＮＡフラグメント
を、ｌａｃプロモーター、翻訳調節要素、ｃｒｏＡＴＧ
およびｃｒｏの６９ヌクレオチドを含む小さなｐＪＳ４
１３ ＤＮＡフラグメント（約２００ｂｐ）に連結させ
た。得られた組換えプラスミドｐＨＶ５（図１４）は、
ｇＤ−２配列の最初の４０コドンを除いた全部を含んで
いる。事実、ｐＨＶ５は実際に成熟ｇＤ−２タンパク質
の１５のアミノ酸を除いた全部をコードしている。通
常、ｇＤ−２の最初の２５のアミノ酸残基（シグナル配
列）は、天然ｇＤ−２タンパク質がプロセシングされる
際に切断される。ｐＨＶ５の構築を以下で説明する。

【０１７２】７．３．１．ｐＨＶ５の構築 組換えプラスミドｐＨＶ２をＣｌａＩで消化し（図１４
参照）、生じた付着末端をＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅ
ｎｏｗフラグメントで修復した。次に、平滑末端化した
線状ｐＨＶ２をＥｃｏＲＩで切断した。ａｍｐ^ｒ遺伝子
およびｇＤ−２コード配列の１２０のヌクレオチドを除
いた全部を含む５．４ｋｂのＣｌａＩ^（−）／ＥｃｏＲ
Ｉ ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動に
よって単離した。

【０１７３】発現ベクターｐＪＳ４１３（第６．３．１
節に記載）をＳｍａＩとＥｃｏＲＩで切断した。ｌａｃ
プロモーター、ＳＤ^ｚ、ＳＤ^ｃｒｏ、ｃｒｏＡＴＧおよ
びｃｒｏの６９ヌクレオチドをコードする２００ｂｐ
（０．２ｋｂ）のフラグメントをポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動によって単離した。５．４ｋｂのＣｌａＩ
^（−）／ＥｃｏＲＩ ｐＨＶ２ ＤＮＡフラグメントと
０．２ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ ｐＪＳ４１３ Ｄ
ＮＡフラグメントを１：１のモル比で、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結させた。得られた組換えプラスミドｐ
ＨＶ５は大腸菌ＮＦ１８２９株の形質転換に用いた。

【０１７４】７．３．２．ｇＤ−２遺伝子を発現する形
質転換体の同定 アンピシリン耐性の大腸菌形質転換体から単離されたプ
ラスミドは、制限エンドヌクレアーゼマッピングにより
分析し、さらにｇＤ−２関連ポリペプチドを発現させる
その能力について調べた。ＮＦ１８２９においては（ｌ
ａｃリプレッサーの過剰生産のために）ｌａｃプロモー
ターは転写的に不活性であるから、ｇＤ−２関連タンパ
ク質は１ｍＭ ＩＰＴＧまたは１〜１０ｍＭラクトース
のいずれかでプロモーターを誘導した後にのみ検出でき
るだろう。

【０１７５】ｐＨＶ５と称する組換えプラスミドによっ
て形質転換されたクローンは、誘導性のｇＤ−２関連タ
ンパク質を産生することが見いだされた。誘導性タンパ
ク質はＨＳＶ−２に対するウサギ抗血清により免疫沈降
されることが分かった。 ７．４．Ｃｒｏ／ｇＤ−２／β−ガラクトシダーゼ融合
タンパク質を産生させるｐＨＶ６の作製 融合タンパク質を作るために、翻訳リーディングフレー
ムが終止シグナルによって途切れないようにｇＤ−２配
列をバクテリア宿主遺伝子配列に連結させた。そのため
に、ｇＤ−２終止シグナル（ＴＡＧ）が欠失されるよう
にｐＨＶ５のｇＤ−２コード配列を切断した。ｌａｃプ
ロモーター、翻訳調節要素およびＣｒｏ／ｇＤ−２配列
を含むｐＨＶ５ ＤＮＡフラグメントを、ｚ−遺伝子を
含むｐＨＫ４１４ ＤＮＡフラグメントに連結させた。
得られた組換えプラスミドｐＨＶ６（図１５）はＣｒｏ
／ｇＤ−２／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質をコ
ードしている。

【０１７６】７．４．１．ｐＨＶ６の構築 プラスミドｐＨＶ５をＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化
した（図１５参照）。ａｍｐ^ｒ遺伝子のアミノコード末
端の一部、ｌａｃプロモーター、ＳＤ^ｚＳＤ^ｃｒｏ、ｃ
ｒｏＡＴＧおよびｃｒｏ／ｇＤ−２をコードする１．７
５ｋｂのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ ｐＨＶ５ ＤＮＡフラ
グメントをアガロースゲル電気泳動によって単離した。

【０１７７】発現ベクターｐＨＫ４１４をＰｓｔＩとＢ
ａｍＨＩで消化した。ｚ遺伝子およびａｍｐ^ｒ遺伝子の
カルボキシコード末端の一部をコードする５．５４ｋｂ
のＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ ｐＨＫ４１４ ＤＮＡフラグ
メントをアガロースゲル電気泳動によって単離した。
１．７５ｋｂのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ ｐＨＶ５ ＤＮ
Ａフラグメントと５．５４ｋｂのＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ
ｐＨＫ４１４ ＤＮＡフラグメントをアニーリング
し、１：１のモル比で連結させ、そして、大腸菌ＮＦ１
８２９の形質転換に用いた。指示寒天平板上でβ−ガラ
クトシダーゼ活性を検定することによって、アンピシリ
ン耐性コロニーの融合タンパク質産生能を調べた。陽性
コロニーは、ＩＰＴＧにより誘導された形質転換体の全
溶解産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、Ｃｒｏ／ｇＤ
−２／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の存在を試
験した。１６０，０００ダルトンの融合タンパク質の高
レベル生産体を単離し、この形質転換体から得られたプ
ラスミドをｐＨＶ６と命名した。

【０１７８】ｐＨＶ６によって形質転換された大腸菌ク
ローンから産生された融合タンパク質は、ＩＰＴＧによ
り誘導可能であり、また、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２
の両方と交差免疫反応性であることが分かった。産生さ
れた融合タンパク質はｇＤ−２タンパク質の２６５個の
アミノ酸残基を含んでいる。 ７．４．２．ｐＨＶ６融合タンパク質に対する抗血清の
免疫沈降分析 ｐＨＶ６融合タンパク質は第６．４．２節で述べた変性
プロトコールを用いて精製し、３匹のウサギ（Ｒ１５
９、Ｒ１６０、Ｒ１６１）に抗血清を作らせるべく次の
ごとく用いた。ｐＨＶ６で形質転換された大腸菌クロー
ンを中間対数期まで増殖させ、そして１ｍＭ ＩＰＴＧ
によって誘導した。誘導の４時間後、バクテリアを遠心
分離によってペレット化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル
バッファーを用いて溶菌し、そして分離用ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲルの上に置いた。電気泳動後、外側レ
ーンをクーマシーブルー染料で染色してタンパク質を可
視化した。次に、１６０，０００ダルトンの融合タンパ
ク質バンドをゲルから切り出した。ゲル切片を液体窒素
の中に浸し、粉砕した後でＰＢＳ中に懸濁した。次い
で、等容量のフロインド完全アジュバントを加えた。十
分に混合した後、この溶液を３匹のニュージーランドウ
サギ（Ｒ１５９、Ｒ１６０、Ｒ１６１）に皮下注射し
た。各ウサギに１００〜２００μｇのタンパク質を注射
した。２８日後、不完全フロインドアジュバント中に懸
濁した同量の融合タンパク質を用いてウサギに追加免疫
を施した。動物は１０日ごとに合計５回の追加免疫を受
け取った。最初の注射の４８日後（即ち、２回の追加免
疫後）に採取した血清を免疫沈降分析に用いた。

【０１７９】免疫沈降は次のように行った。集密的に増
殖させた細胞にＨＳＶを１０ｐｆｕ／細胞で感染させた
（Ｖｅｒｏ細胞にＨＳＶ−１を感染させ、一方Ｈｅｌａ
細胞にはＨＳＶ−２を感染させた）。感染後^３５Ｓ−メ
チオニンで１６時間細胞を標識した。^３５Ｓ−メチオニ
ン−標識ＨＳＶ−１感染Ｖｅｒｏ細胞またはＨＳＶ−２
感染Ｈｅｌａ細胞の溶解産物を、免疫前ウサギ血清また
はｐＨＶ６融合タンパク質に対するウサギ抗血清（即
ち、Ｒ１５９、Ｒ１６０またはＲ１６１抗血清）１０μ
ｌとともにインキュベートした。第６．３．３節に述べ
たようにパンソルビンを用いて免疫複合体を回収し、得
られた放射性標識した免疫沈降タンパク質をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで分離し、フルオログラフィーにかけた。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥの結果によれば、ＨＳＶ−２感染Ｈｅｌａ細
胞によって産生された５０，０００ダルトンのｇＤタン
パク質は、形質転換体から産生された融合タンパク質に
対する抗血清と免疫反応した。Ｒ１５９およびＲ１６１
抗血清はｇＤ−２に対して特異的であり、一方Ｒ１６０
抗血清はｇＤ−１（ＨＳＶ−１感染Ｖｅｒｏ細胞により
産生された５２，０００ダルトンのｇＤタンパク質）お
よびｇＤ−２の両方を免疫沈降させる。従って、Ｒ１６
０は「タイプ−共通」である。ｐＥＨ４−２によってコ
ードされるｇＤ−１融合タンパク質に対して誘導された
０１８（第６．４．２節）もタイプ−共通であることに
注目すべきである。

【０１８０】７．４．３．単純ヘルペスウイルスのｉｎ
ｖｉｔｒｏ中和 ｐＨＶ６融合タンパク質に対する上記のウサギ抗血清
を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＳＶ感染を中和するその能力
を調べるために使用した。そのために、プラークアッセ
イを用いるウイルス中和実験を前記のように行った。集
密細胞の各皿（３５ｍｍ）に、対照（免疫前血清）また
は被験抗血清希釈物（次の抗血清を試験した：０１８、
Ｒ１５９、Ｒ１６０、Ｒ１６１）とプレインキュベート
しておいた５０ｐｆｕのＨＳＶを感染させた（Ｖｅｒｏ
細胞にＨＳＶ−１を感染させ、一方Ｈｅｌａ細胞にはＨ
ＳＶ−２を感染させた）。３日後、細胞を固定し、染色
して、プラークを数えた。表２はこのような２つの実験
の結果を示す。中和は、プラーク数を５０％減少させる
のに要する血清希釈率として表される。表２からは、ｐ
ＨＶ６融合タンパク質に対する抗血清（Ｒ１５９、Ｒ１
６０、Ｒ１６１）がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＳＶ−２感染
を中和でき、一方ｐＥＨ４−２融合タンパク質に対する
抗血清（０１８）はｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＳＶ−１感染
を中和できることが明らかである。０１８とＲ１６０は
（第７．４．２節の免疫沈降データに基づいて）タイプ
−共通であるが、０１８（抗ｇＤ−１融合タンパク質）
はｉｎｖｉｔｒｏでＨＳＶ−１の中和により効果的であ
り、そしてＲ１６０（抗ｇＤ−２融合タンパク質）はｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでＨＳＶ−２感染の中和により効果的で
ある。

【０１８１】

【表２】

【０１８２】^１数字はプラーク数を５０％低減させた血
清希釈率の逆数としての抗体価を表す。アッセイは血清
補体の存在下で行った。 ７．４．４．ｐＨＶ６融合タンパク質に対する抗血清の
免疫蛍光分析 免疫蛍光検定を次のように行った。集密的細胞にヘルペ
スウイルスを０．１ｐｆｕ／細胞で３７℃、２０時間感
染させた（Ｖｅｒｏ細胞にＨＳＶ−１を感染させ、一方
Ｈｅｌａ細胞にはＨＳＶ−２を感染させた）。細胞をＰ
ＢＳで洗い、次にアセトン：メタノール（１：１）を用
いて室温で９０秒間固定させた。固定液を除去し、細胞
を自然乾燥させた。次に、ＰＢＳで１：２０に希釈した
各ウサギ抗血清（０１８、Ｒ１５９、Ｒ１６０およびＲ
１６１）の２０μｌアリコートを、印を付けた位置に別
個の液滴としてプレート上の細胞に加えた。３７℃、３
０分のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗い、自
然乾燥させた。次に、フルオロセイン−結合ブタ抗ウサ
ギ血清の２０μｌアリコートを印を付けた位置に加え
た。３７℃、３０分のインキュベーション後に細胞を洗
い、自然乾燥し、グリセロールで固定し、紫外顕微鏡を
用いて紫外線のもとで観察した。蛍光の存在は、ウサギ
抗血清がＨＳＶ感染細胞と免疫反応性であることを示
す。結果を表３に示してある。

【０１８３】

【表３】

【０１８４】^１抗血清は１：２０の希釈率で加えた。^２ ＋＋＋は最も強い細胞染色 ＋＋は中程度の細胞染色 ＋は陽性であるが弱い染色 ８．実施例：ワクチン接種 ８．１．ワクチン製剤中のｇＤ−１融合タンパク質を用
いたｉｎ ｖｉｖｏ ＨＳＶ−２感染からの防御 １群１０匹のＢａｌｂ Ｃ マウスの３群に、次の調製
物を腹腔内（ＩＰ）に注射した。グループ１（非ワクチ
ン接種の対照）は生理食塩水を受け取り、グループ２は
完全フロインドアジュバント中の天然ＨＳＶ−１ｇＤタ
ンパク質３μｇを受け取り、そしてグループ３は生理食
塩水中のｐＥＨ４−２融合タンパク質（第５．５節に記
載した変性凝集物精製法によって単離したもの）３０μ
ｇを受け取った。全てのグループは４回のＩＰ注射を受
け取り、各注射を２週間の間隔で投与し、そして追加免
疫は１μｇのｇＤ（グループ２）または１０μｇの融合
タンパク質を含んでいた。

【０１８５】４回目の注射後、眼窩後方でマウスから採
血し、第６．４．３節および第７．４．２節で前に記載
したプラークアッセイを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（補
体の不在下）でヘルペスウイルス中和について血清を試
験した。４回目の接種を行ってから１週間目に、１０Ｌ
Ｄ_５０のＨＳＶ−２株１８６を用いてマウスをチャレン
ジした。ＨＳＶ−２を０．５ｍｌ中に懸濁し、腹腔内注
射した。チャレンジされたマウスの生存が防御を示す。
結果を表４に示す。

【０１８６】

【表４】

【０１８７】８．２．ワクチン製剤中のｇＤ−２融合タ
ンパク質を用いたｉｎ ｖｉｖｏ ＨＳＶ−２感染から
の防御 １群１０匹のマウスの４群に、次の調製物をワクチン接
種した。グループ１（対照）はｐＮＢ９−１ウシ成長ホ
ルモン／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を受け取
り、グループ２はｐＥＨ４−２ Ｃｒｏ／ｇＤ−１／β
−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（第６．４節）を受
け取り、グループ３はｐＥＨ８２再構築Ｃｒｏ／ｇＤ−
１／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（第６．５節
参照）を受け取り、そしてグループ４はｐＨＶ６Ｃｒｏ
／ｇＤ−２／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（第
７．４節参照）を受け取った。

【０１８８】融合タンパク質は、誘導された形質転換体
をリゾチーム／界面活性剤で破壊し、続いて凝集物をペ
レット化する（第５．５節に記載されるように非変性凝
集物精製法）ことによって、種々の大腸菌形質転換体か
ら単離した。免疫感作のスケジュールは次のとおりであ
った。Ｂａｌｂ Ｃマウス（６〜７週齢）に０．２ｍｌ
の生理食塩水中の非変性融合タンパク質１５０〜２００
μｇを腹腔内接種した。マウスに７５〜１００μｇ融合
タンパク質を２週間おきに３回以上腹腔内に再接種（追
加免疫）した（全部で４回の接種）。４回目の注射後、
眼窩後方でマウスから採血し、第６．４．３節および第
７．４．２節で前に記載したプラークアッセイを用い
て、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（補体の不在下）でヘルペスウイ
ルス中和について血清を試験した。

【０１８９】４回目の接種を行ってから１週間目に、１
７ＬＤ_５０のＨＳＶ−２株１８６を用いてマウスをチャ
レンジした。ＨＳＶ−２を０．５ｍｌ中に懸濁し、腹腔
内注射した。チャレンジされたマウスの生存が防御を示
す。結果を表５に示す。

【０１９０】

【表５】

【０１９１】^１生理食塩水に懸濁させた融合タンパク質
をＩＰ接種した。^２補体の不在下でＨＳＶ−１またはＨ
ＳＶ−２中和について血清 を試験した。数字はプラー
ク数を５０％減じた血清希釈率の逆 数として表される
抗体価を表す。 ８．８．ワクチン製剤の比較 ｐＥＨ４−２およびｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ３９２形
質転換体から産生された融合タンパク質調製物と、後述
する異なるアジュバントとの混合物でマウスを免疫処置
した。得られた抗血清は、培養下のＨＳＶ−１感染細胞
に由来するタンパク質を免疫沈降させるその能力によっ
て評価した。

【０１９２】第８．２節に記載した非変性技法によっ
て、ｐＥＨ４−２およびｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ３９
２形質転換体から融合タンパク質を単離した。凝集物を
音波処理により再懸濁し（スラリーを形成し）、次のよ
うに熱アルカリ中で処理して可溶化した。０．５ＭＮａ
ＯＨを５０ｍＭの最終濃度で凝集物のペレットに添加し
た。凝集物は６５℃で１５分間加熱することによって可
溶化した。次に、溶液を冷却し、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）を添加した（最終濃度：１００ｍＭ トリス−
ＨＣｌ）。

【０１９３】融合タンパク質調製物（スラリーまたは熱
アルカリ調製物）を、接種前に次のアジュバントと混合
した。（１）Ｌ１２１（Ｈｕｎｔｅｒら，１９８１，
Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（３）：１２４４−
１２５０；ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ，Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ，Ｍｉｃｈ．）プル
ロニックポリオール（動物当り２．５ｍｇを投与し
た）、または（２）水酸化アルミニウムゲル（Ｒｅｈｅ
ｉｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｅｒｋｅ
ｌｅｙ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｎ．Ｊ．）０．２％の最終濃
度。

【０１９４】これらの調製物を用いて、次のスケジュー
ルに従ってマウス（ＣＤ−１株）を免疫処置した。各マ
ウスに１００μｇの融合タンパク質の一次注射を施し、
２２日後５０μｇの融合タンパク質を再注射した。融合
タンパク質を全容量０．２ｍｌ中に懸濁し、腿に筋肉内
注射した。最後の注射の７日後にマウスの眼窩後方から
採血した。

【０１９５】採取した血清は次のような免疫沈降によっ
て分析した。^３５Ｓ−メチオニン標識ＨＳＶ−１感染Ｖ
ｅｒｏ細胞の溶解産物を、５μｌのマウス血清（抗ｐＥ
Ｈ４−２または抗ｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ３９２）、
免疫前血清（陰性対照）またはモノクローナル４Ｓ（陽
性対照）とともに４℃で２時間インキュベートし、５μ
ｌのウサギ抗マウス血清（Ｄａｋｏ、４℃で３０分）と
インキュベートした。免疫複合体を第６．３．３節に記
載したようにパンソルビンを用いて回収し、免疫沈降し
た放射性標識タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分
離し、フルオログラフィーにかけた。フルオログラフィ
ーの結果から、Ｌ１２１アジュバントを加えたアルカリ
可溶化融合タンパク質（ｐＥＨ４−２とｐＥＨ９０−１
０ａｍＬＥ３９２の両方）で免疫処置した全てのマウス
は強い免疫反応を有することが明らかになった。水酸化
アルミニウムと一緒に投与したアルカリ可溶化ｐＥＨ４
−２融合タンパク質では、より弱い免疫反応が観察され
た。この試験法で判定したところでは、他のマウスは免
疫反応を示さないようであった。 ９．微生物の寄託 ヌクレオチドに与えられた全ての塩基対のサイズは概算
値であり、説明のために用いられることを理解すべきで
ある。更に、以上に示された本発明の多くの修飾および
変更が、その精神および範囲を逸脱することなく、なさ
れ得ることが明らかである。記載された特定の実施態様
は単なる例示であって、本発明は特許請求の範囲によっ
てのみ規定されるものである。

【０１９６】表示したプラスミドを担う次の大腸菌株は
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍ
ｄ．）に寄託され、以下の受託番号を指定された。 表示したプラスミドを担う次の大腸菌株はアグリカルチ
ュラル・リサーチ・カルチャー・コレクション（Ａｇｒ
ｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＮＲＲＬ）（Ｐｅｏｒｉ
ａ，Ｉｌｌ．）に寄託され、次の受託番号を指定され
た。 本発明は寄託微生物によってその範囲を限定されない。
なんとなれば、寄託された実施態様は本発明のいくつか
の態様を例示するものであるからである。実際、ここに
記載したものに加えて、本発明の各種変更が上記の説明
と添付図面から当業者には明らかとなろう。このような
変更も特許請求の範囲に含まれるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】（ａ）ＨＳＶ−１ゲノムを示し、（ｂ）ラムダ
ｇｔＷＥＳ：：ＥｃｏＲＩ−ＨのＨＳＶ−１ＥｃｏＲＩ
−Ｈフラグメント挿入物の制限地図を示し、（ｃ）ｐＲ
ＷＦ６の構築を示し、そして（ｄ）ｐＳＣ３０−４のＨ
ＳＶ−１ ＳａｃＩ ＤＮＡフラグメント挿入物の制限
地図を示した図である。

【図２】ｇＤ−１遺伝子配列の配列決定戦略と制限地図
を示した図である。

【図３】ｇＤ−１遺伝子のヌクレオチド配列およびｇＤ
−１タンパク質の推定アミノ酸配列を示した図である。

【図４】ｇＤ−１遺伝子の一部と大腸菌の発現ベクター
ｐＪＳ４１３から誘導された組換えプラスミドｐＥＨ２
５の構築を示した図である。

【図５】ｐＥＨ２５中のＣｒｏ／ｇＤ−１接合部のＤＮ
Ａ配列および推定アミノ酸配列を示した図である。

【図６】ＨＳＶ感染Ｈｅｌａ細胞の溶解産物中に存在す
る競合抗原を添加することによるｐＥＨ２５ｇＤ産物の
免疫沈降の阻害を示した図である。

【図７】ｐＥＨ２５から誘導されたｇＤ−１発現プラス
ミドｐＥＨ４−２の構築を示した図である。

【図８】多くのｇＤ−１発現プラスミドｐＥＨ５０＋ｘ
を作製する方法を示した図である。

【図９】ｐＥＨ４−２中のｇＤ−１遺伝子のアミノコー
ド末端を再構築する方法を示した図である。

【図１０】ｐＥＨ３−２５とｐＨＫ４１４から誘導され
たｇＤ−１発現プラスミドｐＥＨ９０−１０ａｍの構築
を示した図である。

【図１１】（ａ）ＨＳＶ−２ゲノムを示し、（ｂ）ｐＨ
Ｖ１のＢｇｌＩＩ Ｌフラグメント挿入物の制限地図を
示し、そして（ｃ）ｐＨＶ２のＨＳＶ−２ ＸｈｏＩ
ＤＮＡフラグメント挿入物の制限地図を示した図であ
る。

【図１２】ｇＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列およびｇ
Ｄ−２タンパク質の推定アミノ酸配列を示した図であ
る。

【図１３】ｇＤ−１とｇＤ−２の推定アミノ酸配列の比
較を示した図である。

【図１４】ｇＤ−２遺伝子の一部とｐＪＳ４１３から誘
導された組換えプラスミドｐＨＶ５の構築を示した図で
ある。

【図１５】ｐＨＶ５から誘導されたｇＤ−２発現プラス
ミドｐＨＶ６の構築を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/245 ＡＤＹ Ａ６１Ｋ 39/245 ＡＤＹ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジョン・ヘインズ・ワイス アメリカ合衆国 01246 マサチューセッ ツ州ブリックリン・ポンド・アベニュー 33アパート・ビー 606 (72)発明者 リン・ウィリアム・エンキスト アメリカ合衆国 55331 ミネソタ州エク セルシア・サンブラ・ドライブ 5691

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次のＤＮＡ配列： 【化１】 からなる単純ヘルペスウイルスタイプ１（ＨＳＶ−１）
   のｇＤ糖タンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチ
   ドをコードするＤＮＡ；該ｇＤ糖タンパク質の少なくと
   も１つの免疫学的抗原決定基を有するポリペプチドをコ
   ードするＨＳＶ−１ＤＮＡの配列の部分配列；次のＤＮ
   Ａ配列： 【化２】 からなる単純ヘルペスウイルスタイプ２（ＨＳＶ−２）
   のｇＤ糖タンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチ
   ドをコードするＤＮＡ配列；および該ｇＤ糖タンパク質
   の少なくとも１つの免疫学的抗原決定基を有するポリペ
   プチドをコードするＨＳＶ−２ＤＮＡの配列の部分配
   列；より成る群から選ばれるＤＮＡ配列またはその破片
   とハイブリドイズし、かつ単純ヘルペスウイルスｇＤ糖
   タンパク質の少なくとも１つの免疫学的抗原決定基を有
   するポリペプチドをコードする発現可能なＤＮＡ配列。
2. 【請求項２】 ｇＤ−２をコードするＤＮＡ配列および
   その部分配列より成る群から選ばれる、請求項１に記載
   の発現可能なＤＮＡ配列。