JPH08269092A - 大腸菌組換え狂犬病ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 人及び動物の狂犬病ウイルス感染を防御可能
な安全性及び有効性に優れ、かつ安価な狂犬病ワクチン
を提供する。 【構成】 狂犬病ウイルス糖蛋白をコードする遺伝子断
片を大腸菌に導入することにより発現された狂犬病ウイ
ルスＧ蛋白及びこれを含有する組換え狂犬病ワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、人及び動物の狂犬病感
染を防御できるワクチンに関するものである。さらに詳
細には、本発明は、狂犬病ウイルス糖蛋白をコードする
遺伝子断片を大腸菌に導入することにより発現された狂
犬病ウイルスＧ蛋白及びこれを含有する組換え狂犬病ワ
クチンに関するものである。

【０００２】

【発明の背景】狂犬病は古くから人類に知られていた病
気の一つであり、人を含む全ての温血動物に感染し、脳
炎を起こしてほぼ100％死に至らしめる人畜共通ウイル
ス病である。日本は島国であるという好条件に恵まれた
こと、また、狂犬病予防法が制定され、本病の人への主
たる伝播者である犬を対象に毎年予防注射が実施された
ことにより、1957年にはついに本病の根絶に成功した。
以来、今日まで約40年の長期間にわたり、日本は本病の
発生のない世界でも数少ない狂犬病清浄国となってい
る。

【０００３】しかしながら、日本のように狂犬病の根絶
された国は珍しく、アメリカ合衆国やヨーロッパの先進
国や中南米、アフリカ大陸やアジアの発展途上国諸国に
おいて狂犬病は広く流行している。たとえばタイからの
報告では、検査機関に持ち込まれる犬の59％、猫の23
％、牛の80％、水牛の50％、サルの18％、豚の67％が狂
犬病ウイルス陽性である。さらに、野ネズミ・家ネズミ
の7.9％、コウモリ(Cynopterus brachyootis) の3.5％
から狂犬病ウイルスが検出されている（Wide, H.et a
l.,(1991) :Rabies in Thailand:1990. Rev.Infect.Di
s.13:644-652）。また、日本においても狂犬病の問題が
完全になくなったわけではなく、東南アジアを中心とし
た海外渡航者等にとって、狂犬病に対するワクチン接種
は依然として重要な予防接種として取り扱われている。

【０００４】

【従来技術】狂犬病ワクチン開発の歩みを振り返ると、
フランスのパスツールの歴史的な業績をあげることがで
きる。それは、まず感染発症し死亡した人や動物の脳か
ら採取したウイルスをホルマリン、石炭酸などの薬剤で
不活化して作ったものであった。しかし、この脳乳剤由
来のワクチンは脳組織の夾雑による重篤な接種後脳炎の
副作用が避けられない。その後、脳組織由来ウイルスの
部分精製ワクチンがつくられ、さらに哺乳動物や鳥類の
培養細胞によるワクチンへと改善されてきている。

【０００５】今日、狂犬病流行諸外国でも狂犬病被疑動
物による咬傷後にワクチンを接種する、いわゆる「暴露
後ワクチン」とする使用法が圧倒的に多い。ところで、
脳組織を含まない組織培養ワクチンは安全で効果が高
く、暴露後はもちろんのこと、いわゆる「暴露前ワクチ
ン」としても、１９５７年以来狂犬病の発生のない我が
国では、流行諸外国への渡航者に対して予防用として使
用されている。しかし、組織培養狂犬病ワクチンはその
製造コストの点で、流行現地、特に発展途上諸外国での
普及の障害となっている。従って、安全性及び有効性に
優れ、かつ安価な狂犬病ワクチンの開発が強く望まれて
いる。

【０００６】

【発明の解決しようとする課題】従来の狂犬病ワクチン
は、感染動物の脳乳剤あるいはウイルス感染培養細胞か
らウイルス粒子を回収し、不活化濃縮したものである。
この場合、ウイルスの増殖が不十分であった場合、生産
コストの上昇に反映する。また不活化が不十分であった
り、ウイルス、細菌及び培地に由来する、ワクチン抗原
としては不必要な成分が含まれる場合には、危篤な症状
を引き起こす可能性がある。その解決方法として、狂犬
病ウイルス蛋白の中で、ウイルス感染において必要な成
分のみを遺伝子工学により産生させ、得られる組換え蛋
白をワクチン抗原として使用する方法がある。

【０００７】ここで、狂犬病ウイルス粒子は５種類の蛋
白質からなり、そのうち糖蛋白（Glycoprotein；以下Ｇ
蛋白）はウイルスの感染に主要な役割を担っていること
が知られている。また、このＧ蛋白に対する抗体はウイ
ルスの感染性を打ち消す中和抗体と呼ばれ、また細胞性
免疫経由の感染防御機構も主にＧ蛋白が関与していてこ
とが知られている。

【０００８】これまでに、このＧ蛋白を遺伝子組換え技
術により発現させる試みが種々行なわれてきている。例
えば、Lawenceらは、狂犬病ウイルスＥＲＡ株のＧ蛋白
をコードするｃＤＮＡを大腸菌（Escherichia coli）の
発現系に導入してその発現に成功している。しかしなが
ら、そこで得られたＧ蛋白は免疫原性としての有効性が
認められなかったことを報告している［Vaccine 84, pp
203-208, コールドスプリングハーバー研究所編）。ま
た、同様に大腸菌を用いた狂犬病ウイルス糖蛋白発現実
験がYelbertonらによっても報告されている［Science,
Vol.219, pp614-620］。この報告においても、狂犬病Ｇ
蛋白を発現させることに成功はしているが、得られたＧ
蛋白を動物に免疫しても抗体を産生させることができな
かった旨記載されている。このことは、大腸菌を用いた
発現系においては、翻訳後の修飾機能がAuthenticなも
のと異なることが大きな原因であると推察される。

【０００９】その後、真核細胞である酵母や動物細胞を
用いてＧ蛋白の発現を行なった例が報告されている［Ar
ch. Virol., 128, p269 (1983)及び特許公表公報昭61-5
00949号］。前者の場合、発現したＧ蛋白ではワクチン
としての使用に十分な免疫原性を確認できなかった旨報
告されている。また後者においては、糖鎖が付加したＧ
蛋白が発現されたことが報告されているものの、実際に
動物を用いて免疫試験を行なった結果は示されておら
ず、その有用性を認めることはできない。また、一般に
真核細胞を用いた遺伝子組換え系は製造コストが高いた
め、狂犬病ワクチンのように発展途上国において特に流
行性の高い疾患に対するワクチンにとっては、その普及
の障害となりうる。このように、Ｇ蛋白を遺伝子組換え
手法による発現に関して、いくつかのグループが成功し
ているものの、実用化レベルにおける組換え蛋白を用い
た狂犬病ワクチンが開発された例はまだ報告されていな
い。

【００１０】

【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは鋭意探究を重ねた結果、Ｇ蛋白をコードする遺
伝子断片を大腸菌に導入して産生させた蛋白がワクチン
として有効であることを見いだし、本発明を完成するに
至った。従来、大腸菌で発現された蛋白は、翻訳後の修
飾、すなわち高次構造がAuthenticなものと異なるた
め、免疫原性がAuthenticな蛋白と免疫原性が異なると
報告されていた。しかし、本発明により特に大腸菌によ
り得られる有効なエピトープだけで、十分狂犬病ウイル
スによる感染を防御することが可能であることを見いだ
したものである。

【００１１】

【発明の構成】本発明に用いる狂犬病ウイルス株はＣＶ
Ｓ株である。ＣＶＳ株のＧ蛋白をコードする遺伝子断片
（Ｇ−ｃＤＮＡ）は、配列表配列番号１に示した塩基配
列のうち、翻訳開始コドンであるATGから終止コドンで
あるTGAまでの1575塩基対を有する遺伝子断片もしくは
これと等価の遺伝子配列を有する遺伝子断片、またはこ
れらの遺伝子断片のうち、実質的に抗原決定部位をコー
ドする一部の遺伝子を含む遺伝子である。当該Ｇ−ｃＤ
ＮＡは、狂犬病ウイルスＣＶＳ株から、通常の遺伝子ク
ローニング技術［例えば、ファルマシア社製ｃＤＮＡ合
成キット並びに添付のプロトコール参照］を用いること
によりクローニングすることができる。また、このよう
なＧ−ｃＤＮＡは、配列表配列番号１記載のの塩基配列
を基にＤＮＡ合成機［例；アプライドバイオシステム社
製タイプ381A］を用いて目的の1575塩基対もしくはその
一部の必要な遺伝子を合成することによって得ることも
できる。

【００１２】クローニングされたｃＤＮＡから翻訳され
るＧ蛋白のＮ末端から19番目のアミノ酸までは、自然界
の宿主中でのウイルス感染増殖過程で切り離される分泌
シグナルである。この分泌シグナルは大腸菌体では機能
しないことが考えられる。従って、Ｇ−ｃＤＮＡをベク
ターに導入する際、当該分泌シグナルを除去し、新たに
翻訳開始コドンATGを有する合成ヌクレオチドリンカー
を付加することが好ましい。例えば、本来のＧ蛋白の分
泌シグナルに相当するアミノ酸配列をコードする塩基配
列（配列表配列番号１の１〜57番目の塩基配列）を除去
し、新たに６個のアミノ酸に相当する合成ヌクレオチド
リンカーを付加したものが使用される（配列表配列番号
２に記載）。

【００１３】このようにして得られるＧ−ｃＤＮＡを発
現させる場合、その発現宿主として大腸菌が用いられ
る。使用される大腸菌としては、SURE（フナコシ社製）
などのような市販のものが挙げられる。発現系の構築方
法としては、まず、Ｇ−ｃＤＮＡを大腸菌用発現ベクタ
ーに組み込む必要がある。当該大腸菌用発現ベクターと
しては、pTre99A（ファルマシア社製）などのように市
販のものを使用することができる。得られる発現ベクタ
ーを大腸菌に導入することにより目的の狂犬病ウイルス
蛋白発現形質転換体が得られる。大腸菌への導入は、上
記のような市販の宿主大腸菌SURE（フナコシ社製）に添
付のプロトコールに記載の方法に準じて行うことができ
る。

【００１４】このようにして得られた形質転換体を適当
な条件のもとに培養することにより、目的の狂犬病ウイ
ルス蛋白を発現させることができる。形質転換した大腸
菌から大量にプラスミドを抽出、精製する場合は、常
法、例えば、Molecular cloning［J.Sambrook et al,
(1989)］に記載のアルカリ法に従って行なうことができ
る。

【００１５】当該形質転換体より目的の狂犬病ウイルス
蛋白が発現されていることが、狂犬病ウイルスＧ蛋白に
対してウイルス中和活性を有するモノクローナル抗体を
用いたウェスタンブロッティング法により確認された。
すなわち、この結果から、本発明の大腸菌組換え狂犬病
Ｇ蛋白がウイルス中和活性を持つ抗体を産生できること
が示唆された。

【００１６】更に、実際にマウスを用いた免疫試験とし
て、本発明の大腸菌由来Ｇ蛋白をマウスに接種し、得ら
れた血清を用いて中和試験を行なった。その結果、免疫
対照群と比較して、本発明の組換え菌体免疫群は約１０
倍の中和抗体価が得られた。さらに、当該免疫マウスに
対して、狂犬病ウイルス野性株を用いた攻撃試験を行な
った結果、本発明の組換え菌体免疫マウスは、攻撃後22
日以上においても生存率が85％（免疫対照群では13％）
と極めて高いことが確認された。

【００１７】

【実施例】以下、実施例に従って、本発明をさらに詳細
に説明する。《酵素及び化学物質》 制限酵素及び修飾酵素は宝酒造株
式会社及び東洋紡株式会社のものを使用した。その使用
方法に関しては、添付のプロトコールの指示する方法に
より行なった。

【００１８】《参考１．ＤＮＡの切断、修飾及びライゲ
ーション》各酵素の使用条件はパンフレット「TAKARA B
IOTECHOLOGY GUIDE protocols &Applications(1992/199
3)」、「TAKARA BIOTECH CATALOG 1993」及び「TOYOBO
BIOCHEMICALS FOR LIFESCIENCE '94」の指定する条件に
従った。各酵素の反応終了後は、Molecular cloning
［J.Sambrook et al,1989］に従い、フェノール処理並
びにクロロホルム処理を行ない、エタノール沈殿により
ＤＮＡを回収した。ＤＮＡライゲーション反応は、タカ
ラライゲーションキット（宝酒造、カタログ番号6021）
を使用し、それに添付のプロトコールに従い行なった。
また、ＤＮＡ末端へのリンカーの添加もこのキットを使
用し、それに添付のプロトコールの指示する方法により
行なった。

【００１９】《参考２．アガロース電気泳動によるＤＮ
Ａ断片の回収》ＤＮＡアガロース電気泳動はMolecular
cloning［J.Sambrook et al,(1989)］に従い行なった。
特にアガロースゲルより特定のＤＮＡ断片を抽出したい
時は、ローメルティングアガロース（バイオラッド社）
を使用し、その回収はMolecular cloning［J.Sambrook
et al, (1989)］に従い行なった。

【００２０】《参考３．プラスミドの抽出及び精製》形
質転換した大腸菌から大量にプラスミドを抽出、精製す
る場合はMolecularcloning［J.Sambrook et al, (198
9)］に記載のアルカリ法に従い行なった。

【００２１】《実施例１．狂犬病ウイルスＧ蛋白ｃＤＮ
Ａのクローニング》狂犬病ウイルスＣＶＳ株を感染させ
たマウス神経芽種細胞C1300NA（以下、ＮＡ細胞）か
ら、Molecular Cloning［J. Sambrook et al., 7.12-7.
15 (1989)］に記載されている方法に従ってメッセンジ
ャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出した。得られたｍＲＮＡ
を鋳型にし、ＧｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア社
製）を使用し、ｃＤＮＡ合成を行なった。その手順はキ
ットに添付のプロトコールに従った。EcoRＩAdaptorの
付加により、両端をEcoRＩ部位に変換した上記ｃＤＮＡ
とEcoRＩで切断したクローニングベクターλZAP Vector
（ストラタジーン社）をライゲーションさせた。次に、
Gigapack Kit（ストラタジーン社）を用いたインビトロ
パッケージを行ない、それを宿主菌XL1-Blueに感染させ
た。得られた数多くのプラックの中から、特にＧｃＤＮ
Ａクローンを得るために、ＨＥＰ株ＧｃＤＮＡ断片［Mo
rimoto, K. et al., Virology, 173, pp465-477, (198
9)］をプローブとしたプラークハイブリダイゼーション
を行ない、所望のＣＶＳ株ＧｃＤＮＡを得た。

【００２２】《実施例２．大腸菌での発現ベクターの構
築》AuthenticなＧ蛋白は、そのＮ末端から19番目まで
のアミノ酸配列（配列標配列番号１の-19〜-1のアミノ
酸配列に相当）は、自然界の宿主中でのウイルス感染増
殖過程で切り離される、いわゆる分泌シグナルである。
今回、クローニングされたＧ蛋白のｃＤＮＡはこの分泌
シグナルをコードする配列をその5'末端に持つが、この
分泌シグナルは、大腸菌体で機能しないことが考えられ
る。そこで、この分泌シグナルを削除し、かつ翻訳の開
始コドンであるATG並びにEcoRＩ切断部位を5'末端に付
加させるために、合成ヌクレオチドリンカーd(ATGGAATT
CCTCGAGATGAAGTTCCCCATTTAC)を用い、Molecular Clonin
g［J. Sambrook et al., 14.2-14.4(1989)］に従い、Ｐ
ＣＲ法を行なった。

【００２３】ＧｃＤＮＡの5'末端側に新たに付加したEc
oRＩ切断部位から3'末端側の翻訳終止コドンTGAの61塩
基下流に存在するBamHＩまでの消化断片、すなわちEcoR
Ｉ−BamHＩ切断断片（約1630塩基）をローメルティング
アガロースゲル電気泳動により回収した。得られた遺伝
子断片を、大腸菌発現ベクターpTrc99A（ファルマシア
社）中に存在するEcoRＩからBamHＩまでの領域を削除し
たものにライゲーションし、宿主大腸菌SURE（フナコシ
社）に添付のプロトコールの指示通りに導入して、大腸
菌での発現ベクターを構築した。つまり、狂犬病Ｇ蛋白
ｃＤＮＡは、発現ベクターpTrc99Aのtrcプロモーターの
直下に転写の方向に挿入された。最終的に得られた大腸
菌組換え蛋白は、狂犬病ウイルスＣＶＳ株のAuthentic
なＧ蛋白のＮ末端（+1番目のアミノ酸）の上流に６個の
アミノ酸残基が付加された形のものとなった（図１並び
に配列表配列番号２参照）。

【００２４】このＧ蛋白の発現については、一次抗体と
して、ウイルス中和活性を有する抗狂犬病ウイルスＧ蛋
白モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティン
グ法で検出確認した。その結果を図２に示した。この結
果より、本発明により得られた大腸菌組換え狂犬病ウイ
ルスＧ蛋白が狂犬病ウイルス中和活性を持つ抗体を誘導
できる可能性が示唆された。

【００２５】《実施例３．中和試験》実施例２で得られ
た組換え体をアンピシリン存在下のＬＢ寒天培地に薄く
まいた。37℃で一夜培養して現れた単一のコロニーを２
mlのＬＢ液体培地（アンピシリン存在）に移して、一夜
37℃で振とう培養した。その培養液の0.2mlを新しい200
mlＬＢ培地（アンピシリン存在）に接種して、37℃で３
時間振とうした。その後、IPTGを５mMになるように添加
し、さらに一夜37℃で培養した。その後、遠心して菌体
を回収し、ＰＢＳで洗浄後、20mlの蒸留水に懸濁したも
のを菌体浮遊液とした。

【００２６】得られた菌体浮遊液を菌数約10⁶個／mlに
なるようにＰＢＳに浮遊させ、その0.2mlを８週令のBal
b/cマウス13頭の腹腔内に注射し、さらに２週間間隔で
最終的に３回注射した。また、対照群として、発現ベク
ターpTrc99Aの存在する大腸菌SURE^TM株を上記と同様の
方法で調製し、得られた菌体を同様に接種したマウス15
頭を用意した。

【００２７】３回目の最終免疫より１週間後、採血し血
清を回収して、Smithらの方法［Smith, J.S., et al.,
"A rapid reproducible test for determining rabies
neutralizing antibodies.", Bull World Health Orga
n 48, pp535-541 (1973)］に準拠して中和試験を実施し
た。すなわち、個別のマウスから回収した血清は、その
量が少なかったため、各々の血清を混合して試験血清原
液とし、ＰＢＳで５倍、25倍、125倍、625倍と５倍段階
希釈した。５倍〜625倍までの希釈液をそれぞれ0.1mlを
プラスチック４チェンバースライド（ヌンク社製）に入
れ、その中に予め希釈した狂犬病ウイルス0.1mlを加え
て37℃１時間反応させた。その後、予め調製しておいた
ＮＡ細胞を0.2ml加えて、37℃で一夜培養した。プラス
チック４チェンバースライドのスライドグラス上に付着
したＮＡ細胞をＰＢＳで静かに洗浄した後、風乾し、冷
アセトン中で20分間固定した。モノクローナル抗体（一
次抗体）と抗マウスIgＧ蛍光抗体との間接蛍光法で、中
和を免れたウイルスによる感染細胞の数を計数して対数
グラフ上にプロットした。「血清なしウイルスのみ」の
ウイルス対照のスライド上の感染細胞数の50％の感染細
胞数に減少させるべき血清希釈倍数を推測したところ、
ベクターによる免疫対照群では５倍以下であったが、組
換え菌体免疫群ではおおむね45倍の中和抗体価が得られ
た。

【００２８】《実施例４．攻撃試験》実施例３で用いた
最終免疫２週後のマウスに、狂犬病ウイルス野性分離株
1088株0.02mlを足蹠に筋肉内注射し感染発症の経過を観
察した。その結果を図３に示した。ベクターのみによる
免疫対照群では、攻撃から13日〜17日まで発症死亡例が
相次いでみられ、17日目までに15匹中13匹が死亡した
（生存率13％）。これに対して、本発明の組換え蛋白免
疫群では、13匹中死亡例はわずかに２匹で、22日経過後
も85％の高い生存率を示した。この結果より、本発明に
より得られた大腸菌組換え狂犬病ウイルスＧ蛋白を接種
されたマウスは野性株に対する感染防御能を有している
ことが認められる。従って、本発明の組換え蛋白がワク
チンとして有効であることが確認された。

【００２９】

【発明の効果】このように、本発明の大腸菌組換え狂犬
病ウイルスＧ蛋白は、狂犬病ウイルスに対する感染防御
能並びに中和抗体産生能を有することが明らかとなっ
た。すなわち、本発明の大腸菌組換えＧ蛋白がワクチン
として有効であることが示唆された。さらに、大腸菌は
培養が容易で組換え発現産物の大量製造が可能であるの
で、狂犬病の流行している発展途上諸国へ、安価でかつ
安全性及び有効性に優れた狂犬病ワクチンの提供が可能
となることが期待出来る。

【００３０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：1575 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to RNA 起源 生物名：狂犬病ウイルスＣＶＳ株 配列 ATG GTT CCT CAG GTT CTT TTG TTT GTA CTC CTT CTG GGT TTT TCG TTG 48 Met Val Pro Gln Val Leu Leu Phe Val Leu Leu Leu Gly Phe Ser Leu -19 -15 -10 -5 TGT TTC GGG AAG TTC CCC ATT TAC ACG ATA CCA GAC AAA CTT GGT CCC 96 Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro -1 +1 +5 10 TGG AGC CCT ATT GAC ATA CAC CAT CTC CGC TGT CCA AAT AAC CTG GTT 144 Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Arg Cys Pro Asn Asn Leu Val 15 20 25 GTG GAG GAT GAA GGA TGT ACC AAC CTG TCC GGG TTC TCC TAC ATG GAA 192 Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu 30 35 40 45 CTT AAA GTG GGA TAC ATC TCA GCC ATC AAA GTG AAC GGG TTC ACT TGC 240 Leu Lys Val Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys 50 55 60 ACA GGT GTT GTG ACA GAG GCA GAG ACC TAC ACC AAC TTT GTT GGT TAT 288 Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr 65 70 75 GTC ACA ACC ACA TTC AAG AGA AAG CAT TTC CGC CCC ACC CCA GAC GCA 336 Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala 80 85 90 TGT AGA GCC GCG TAT AAC TGG AAG ATG GCC GGT GAC CCC AGA TAT GAA 384 Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu 95 100 105 GAG TCC CTA CAA AAT CCA TAC CCC GAC TAC CAC TGG CTT CGA ACT GTA 432 Glu Ser Leu Gln Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val 110 115 120 125 AGA ACC ACC AAA GAG TCC CTC ATT ATC ATA TCC CCA AGT GTG ACA GAT 480 Arg Thr Thr Lys Glu Ser Leu Ile Ile Ile Ser Pro Ser Val Thr Asp 130 135 140 TTG GAC CCA TAT GAC AAA TCC CTT CAC TCA AGG GTC TTC CCT GGC GGA 528 Leu Asp Pro Tyr Asp Lys Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly 145 150 155 AAG TGC TCA GGA ATA ACG GTG TCC TCT ACC TAC TGC TCA ACT AAC CAT 576 Lys Cys Ser GLy Ile Thr Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His 160 165 170 GAT TAC ACC ATT TGG ATG CCC GAG AAT CCG AGA CCA GGG ACA CCT TGT 624 Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys 175 180 185 GAC ATT TTT ACC AAT AGC AGA GGG AAG AGA GCA TCC AAC GGG AAC AAG 672 Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly Asn Lys 190 195 200 205 ACT TGC GGC TTT GTG GAT GAA AGA GGC CTG TAT AAG TCT CTA AAA GGA 720 Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly 210 215 220 GCA TGC AGG CTC AAG TTA TGT GGA GTT CTT GGA CTT AGA CTT ATG GAT 768 Ala Cys Arg Ley Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp 225 230 235 GGA ACA TGG GTC GCG ATG CAA ACA TCA GAT GAG ACC AAA TGG TGC TCT 816 Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Ser 240 245 250 CCA GAT CAG TTG GTG AAT TTG CAC GAC TTT CGC TCA GAC GAG ATT GAG 864 Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg ser Asp Glu Ile Glu 255 260 265 CAT CTC GTT GTG GAG GAG TTA GTC AAG AAA AGA GAG GAA TGT CTG GAT 912 His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Lys Leu Asp 270 275 280 285 ACA TTA GAG TCC ATC ATG ACC ACC AAG TCA GTA AGT TTC AGA CGT CTC 960 Thr Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu 290 295 300 AGT CAC CTG AGA AAA CTT GTT CCA GGT TTC GGA AAA GCA TAT ACC ATA 1008 Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile 305 310 315 TTC AAC AAA ACC TTG ATG GAG GCT GAT GCT CAC TAC AAG TCA GTC CGG 1056 Phe Asb Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg 320 325 330 ACC TGG AAT GAG ATC ATC CCC TCA AAA GGG TGT TTG AAA GTT GGA GGA 1104 Thr Trp Asn Gly Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Lys Val Gly Gly 335 340 345 AGG TGC CAT CCT CAT GTG AAC GGG GTG TTT TTC AAT GGT ATA ATA TTA 1152 Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu 350 355 360 365 GGG CCT GAC GAC CGT GTC CTA ATC CCA GAG ATG CAA TCA TCC CTC CTC 1200 Gly Pro Asp Asp Arg Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu 370 375 380 CGG CAA CAT ATG GAG TTG TTG GAA TCT TCA GTT ATC CCC CTG ATG CAC 1248 Arg Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His 385 390 395 CCC CTG GCT GAC CCT TCT ACA GTT TTC AAA GAA GGT GAT GAG GCT GAG 1296 Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Glu Gly Asp Glu Ala Glu 400 405 410 GAT TTT GTT GAA GTT CAC CTC CCC GAT GTG TAC AAA CAG ATC TCA GGG 1344 Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val Tyr Lys Gln Ile Ser Gly 415 420 425 GTT GAC CTG GGT CTC CCG AAC TGG GGA AAG TAT GTA TTG ATG ACT GCA 1392 Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Met Thr Ala 430 435 440 445 GGG GCC ATG ATT GGG CTG GTG TTG ATA TTT TCC CTA ATG ACA TGG TGC 1440 Gly Ala Met Ile Gly Leu Val Leu Ile Phe Ser Leu Met Thr Trp Cys 450 455 460 AGA AGA GCC AAT CGA CCA GAA TCG AAA CAA CGC AGT TTT GGA GGG ACA 1488 Arg Arg Ala Asn Arg Pro Glu Ser Lys Gln Arg Ser Phe Gly Gly Thr 465 470 475 GGG GGG AAT GTG TCA GTC ACT TCC CAA AGC GGA AAA GTC ATA CCT TCA 1536 Gly Gly Asn Val Ser Val Thr Ser Gln Ser Gly Lys val Ile Pro Ser 480 485 490 TGG GAA TCA TAT AAG AGT GGA GGG GAG ATC AGA CTG TGA 1575 Trp Glu Ser Tyr Lys Ser Gly Gly Glu Ile Arg Leu *** 495 500 505

【００３１】配列番号：２ 配列の長さ：1536 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成cDNA to RNA 起源 生物名：狂犬病ウイルスＣＶＳ株 配列 ATG GAA TTC 9 Met Glu Phe -5 CTC GAG ATG AAG TTC CCC ATT TAC ACG ATA CCA GAC AAA CTT GGT CCC 57 Leu Glu Met Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro -1 +1 +5 10 TGG AGC CCT ATT GAC ATA CAC CAT CTC CGC TGT CCA AAT AAC CTG GTT 105 Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Arg Cys Pro Asn Asn Leu Val 15 20 25 GTG GAG GAT GAA GGA TGT ACC AAC CTG TCC GGG TTC TCC TAC ATG GAA 153 Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu 30 35 40 45 CTT AAA GTG GGA TAC ATC TCA GCC ATC AAA GTG AAC GGG TTC ACT TGC 201 Leu Lys Val Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys 50 55 60 ACA GGT GTT GTG ACA GAG GCA GAG ACC TAC ACC AAC TTT GTT GGT TAT 249 Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr 65 70 75 GTC ACA ACC ACA TTC AAG AGA AAG CAT TTC CGC CCC ACC CCA GAC GCA 297 Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala 80 85 90 TGT AGA GCC GCG TAT AAC TGG AAG ATG GCC GGT GAC CCC AGA TAT GAA 345 Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu 95 100 105 GAG TCC CTA CAA AAT CCA TAC CCC GAC TAC CAC TGG CTT CGA ACT GTA 393 Glu Ser Leu Gln Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val 110 115 120 125 AGA ACC ACC AAA GAG TCC CTC ATT ATC ATA TCC CCA AGT GTG ACA GAT 441 Arg Thr Thr Lys Glu Ser Leu Ile Ile Ile Ser Pro Ser Val Thr Asp 130 135 140 TTG GAC CCA TAT GAC AAA TCC CTT CAC TCA AGG GTC TTC CCT GGC GGA 489 Leu Asp Pro Tyr Asp Lys Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly 145 150 155 AAG TGC TCA GGA ATA ACG GTG TCC TCT ACC TAC TGC TCA ACT AAC CAT 537 Lys Cys Ser GLy Ile Thr Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His 160 165 170 GAT TAC ACC ATT TGG ATG CCC GAG AAT CCG AGA CCA GGG ACA CCT TGT 585 Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys 175 180 185 GAC ATT TTT ACC AAT AGC AGA GGG AAG AGA GCA TCC AAC GGG AAC AAG 633 Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly Asn Lys 190 195 200 205 ACT TGC GGC TTT GTG GAT GAA AGA GGC CTG TAT AAG TCT CTA AAA GGA 681 Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly 210 215 220 GCA TGC AGG CTC AAG TTA TGT GGA GTT CTT GGA CTT AGA CTT ATG GAT 729 Ala Cys Arg Ley Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp 225 230 235 GGA ACA TGG GTC GCG ATG CAA ACA TCA GAT GAG ACC AAA TGG TGC TCT 777 Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Ser 240 245 250 CCA GAT CAG TTG GTG AAT TTG CAC GAC TTT CGC TCA GAC GAG ATT GAG 825 Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg ser Asp Glu Ile Glu 255 260 265 CAT CTC GTT GTG GAG GAG TTA GTC AAG AAA AGA GAG GAA TGT CTG GAT 873 His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Lys Leu Asp 270 275 280 285 ACA TTA GAG TCC ATC ATG ACC ACC AAG TCA GTA AGT TTC AGA CGT CTC 921 Thr Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu 290 295 300 AGT CAC CTG AGA AAA CTT GTT CCA GGT TTC GGA AAA GCA TAT ACC ATA 969 Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile 305 310 315 TTC AAC AAA ACC TTG ATG GAG GCT GAT GCT CAC TAC AAG TCA GTC CGG 1017 Phe Asb Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg 320 325 330 ACC TGG AAT GAG ATC ATC CCC TCA AAA GGG TGT TTG AAA GTT GGA GGA 1065 Thr Trp Asn Gly Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Lys Val Gly Gly 335 340 345 AGG TGC CAT CCT CAT GTG AAC GGG GTG TTT TTC AAT GGT ATA ATA TTA 1113 Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu 350 355 360 365 GGG CCT GAC GAC CGT GTC CTA ATC CCA GAG ATG CAA TCA TCC CTC CTC 1161 Gly Pro Asp Asp Arg Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu 370 375 380 CGG CAA CAT ATG GAG TTG TTG GAA TCT TCA GTT ATC CCC CTG ATG CAC 1209 Arg Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His 385 390 395 CCC CTG GCT GAC CCT TCT ACA GTT TTC AAA GAA GGT GAT GAG GCT GAG 1257 Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Glu Gly Asp Glu Ala Glu 400 405 410 GAT TTT GTT GAA GTT CAC CTC CCC GAT GTG TAC AAA CAG ATC TCA GGG 1305 Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val Tyr Lys Gln Ile Ser Gly 415 420 425 GTT GAC CTG GGT CTC CCG AAC TGG GGA AAG TAT GTA TTG ATG ACT GCA 1353 Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Met Thr Ala 430 435 440 445 GGG GCC ATG ATT GGG CTG GTG TTG ATA TTT TCC CTA ATG ACA TGG TGC 1401 Gly Ala Met Ile Gly Leu Val Leu Ile Phe Ser Leu Met Thr Trp Cys 450 455 460 AGA AGA GCC AAT CGA CCA GAA TCG AAA CAA CGC AGT TTT GGA GGG ACA 1449 Arg Arg Ala Asn Arg Pro Glu Ser Lys Gln Arg Ser Phe Gly Gly Thr 465 470 475 GGG GGG AAT GTG TCA GTC ACT TCC CAA AGC GGA AAA GTC ATA CCT TCA 1497 Gly Gly Asn Val Ser Val Thr Ser Gln Ser Gly Lys val Ile Pro Ser 480 485 490 TGG GAA TCA TAT AAG AGT GGA GGG GAG ATC AGA CTG TGA 1536 Trp Glu Ser Tyr Lys Ser Gly Gly Glu Ile Arg Leu *** 495 500 505

【図面の簡単な説明】

【図１】 大腸菌を宿主とした発現ベクターの構築手順
を示す。

【図２】 実施例２のウェスタンブロッティングによる
解析における、本発明の大腸菌組換え狂犬病ウイルスＧ
蛋白と抗狂犬病ウイルスＧ蛋白モノクローナル抗体との
反応を示す電気泳動の結果を示す写真。

【図３】 大腸菌組換え狂犬病ウイルスＧ蛋白により免
疫されたマウスを用いた狂犬病野性株攻撃試験結果を示
す。

【手続補正書】

【提出日】平成７年８月１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 三舟 求眞人 大分県大分郡挾間町医大ケ丘１丁目１番地 大分医科大学内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表配列番号１に記載の狂犬病ウイル
   ス糖蛋白のアミノ酸配列のうち、+1〜505番目のアミノ
   酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片を大腸菌
   内で発現させることにより得られ、かつ免疫原性を有す
   ることを特徴とする組換え狂犬病ウイルスＧ蛋白。
2. 【請求項２】 該遺伝子断片が、配列表配列番号２に記
   載のアミノ酸配列のうち、-6〜505番目のアミノ酸配列
   をコードする塩基配列を含む遺伝子断片である請求項１
   に記載の組換え狂犬病ウイルスＧ蛋白。
3. 【請求項３】 配列表配列番号１に記載の+1〜505番目
   のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片
   を大腸菌用発現ベクター内のプロモーター下流に組み込
   んだベクターを大腸菌中に導入し、この形質転換体を培
   養することにより狂犬病ウイルスＧ蛋白を産生させるこ
   とを特徴とする組換え狂犬病ウイルス蛋白の製法。
4. 【請求項４】 該遺伝子断片が、配列表配列番号２に記
   載の-6〜505番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列
   を含む遺伝子断片である請求項３に記載の組換え狂犬病
   ウイルス蛋白の製法。
5. 【請求項５】 配列表配列番号１に記載の狂犬病ウイル
   ス糖蛋白のアミノ酸配列のうち、+1〜505番目のアミノ
   酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片を大腸菌
   内で発現させることにより得られ、かつ免疫原性を有す
   る組換え狂犬病ウイルスＧ蛋白を含有する狂犬病ワクチ
   ン。
6. 【請求項６】 該遺伝子断片が、配列表配列番号２に記
   載のアミノ酸配列のうち、-6〜505番目のアミノ酸配列
   をコードする塩基配列を含む遺伝子断片である請求項５
   に記載の組換え狂犬病ウイルスＧ蛋白を含有する狂犬病
   ワクチン。