NL8603017A - Flavivirus antigeen. - Google Patents

Description

VO 8480 ^ Flavivirus antigeen

De uitvinding heeft betrekking op een flavivirus anti— geen.De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op een antigeen, dat ten minste ëén epitoop bevat, dat reactief is met een anti-flavivirus antilichaam.Het antigeen volgens de 5 uitvinding heeft een hoge zuiverheid en kan worden gebruikt als vaccin voor Japanse encephalitis . Het antigeen volgens, de uitvinding kan op veilige wijze op grote schaal en tegen geringe kosten worden geproduceerd. Verder kan het antigeen volgens de uitvinding door zijn hoge specifieke antigene werking met .

10 voordeel worden gebruikt als diagnostisch reagens voor anti-flavivirus antilichamen, en ook voor de bereiding van anti-flavivirus antilichamen.

Japanse encephalitis (verder dikwijls aangeduid als JE) is een besmettelijke ziekte veroorzaakt door infectie 15 van het JE-virus; de sterfte als gevolg van deze ziekte is hoog en de ziekte heeft ernstige gevolgen. In Japan is het » aantal patiënten,dat aan JE lijdt, in de afgelopen jaren aanmerkelijk gedaald. Niettemin heerst de ziekte soms in oostelijke, zuidoostelijke en zuidelijke Aziatische landen.

20 Dit veroorzaakt een sociaal probleem, dat niet beperkt is tot gebieden, waar de ziekte heerst, maar ontwikkelt zich momenteel tot een internationaal probleem, omdat er veel bezoeken tussen de landen worden uitgewisseld. Het JE-virus behoort tot het genus Flavivirus van de familie Togaviridae.

25 Volgens virus taxonomy behoren ongeveer 50 virussen, waaronder het JE-virus, tot het genus Flavivirus. De virussen, behorende tot het genus Flavivirus, worden eenvoudig flavi-virussen genoemd. Tot nu toe werden diverse onderzoeken verricht met betrekking tot verscheidene flavivirussen, name-30 lijk JE virus, gele koorts virus, West Nijl virus, knokkel-koort virus en dergelijke. Het is bekend, dat de structuur van een flavivirusdeeltje drie typen van structurele proteïnen bevat, namelijk een glycoproteine E (soms aangeduid als V3 antigeen met een molecuulgewicht van ongeveer 53.000) dat 35 het overwegende gedeelte van de omhulling van het flavivirus-deeltje vormt; een klein proteine M (soms aangeduid als V1 antigeen met een molecuulgewicht van ongeveer 8700) dat in .880 3 0 17 -2- J* i ? een omhulling aanwezig is; en een proteïne C (soms aangeduid als V2 antigeen met een molecuulgewicht van ongeveer 13.500) dat het nucleocapside van het flavivirusdeeltje uitmaakt. In het flavivirus deeltje bevindt zich een viraal 5 genome, dat enkelvoudig gewikkeld RNA met een molecuul- 6 6 gewicht van ongeveer 3,8 x 10 tot ongeveer 4,2 x 10 omvat. Het virale genome bevat genen, die gecodeerd zijn voor respectievelijk de bovengenoemde drie typen van structurele proteinen. Van de genoemde drie typen van proteïnen 10. speelt het proteine E (verder aan te duiden als "V3 antigeen") een belangrijke rol in de eerste fase van virus infectie. Het valt daarom te verwachten, dat het V3 antigeen kan worden gebruikt voor de preventie of diagnose van de infectie van het virus. Er zijn diverse onderzoekingen met 15 betrekking tot het V3 antigeen verricht. Zo zijn bijvoorbeeld de activiteit van het V3 antigeen - neutraliserende antiserum .en de hemagglutinerende activiteit, geïnfecteerde cellen samensmeltende activiteit, hemolytische activiteit enz. van het V3 antigeen bepaald. Er is literatuur, waaruit 20 blijkt dat ten minste negen epitopen in het V3 antigeen aanwezig zijn. Ook is bekend dat de flavivirussen van verschillende species antigenen hebben, die met elkaar nauw verwant zijn of sterk op elkaar gelijken.

Conventioneel wordt het V3 antigeen van JE virus 25; als volgt bereid. Met behulp van muizehersens of van een dier afkomstige somatische cellen als gastheer cultuur • voor kweken van het virus worden pathogene entvirussen gekweekt, waarna alle virusdeeltjes uit de kweek worden afgescheiden.. Vervolgens worden alle virusdeeltjes door een 30 fysico-chemische behandeling gekliefd ter verkrijging van een mengsel van VI, V2 en V3 antigenen, virus RNA en dergelijke, gevolgd door isolering en zuivering van het V3 antigeen. Een dergelijke conventionele werkwijze heeft de volgende nadelen.

35 (1) De waarschijnlijkheid van biologische risico's 8603017 -3- is groot wegens het directe hanteren van pathogene virussen.

(2) De produktiekosten zijn hoog omdat de grondstoffen, bereidingsprocessen en apparatuur zeer gecompliceerd zijn.

5 (3) Zeer zuiver V3 antigeen is uiterst moeilijk te verkrijgen wegens de grote kans op verontreiniging van het V3 antigeen met onzuiverheden, afkomstig uit de cultuur gastheer en het kweekmedium...

De uitvinders hebben een uitvoerig en intensief 10 onderzoek verricht ter oplossing van de genoemde problemen. Als resultaat daarvan zijn zij er in geslaagd een cDNA te klonen dat codeert voor de V3 antigeen van JE virus, dat een belangrijke rol speelt in de infectie van JE virus, en de base sequens te bepalen van het cDNA, dat codeert 15 voor het V3 antigeen van het JE virus. Verder werd onverwacht gevonden, dat wanneer het cDNA wordt onderworpen * aan expressie door de recombinant DNA techniek, een proteïne (verder aan te duiden als "V- proteïne") met een aminozuur sequens, overeenkomende met het V3 antigeen 20 van JE virus én met dezelfde antigeniciteit als die van het JE virus veilig en stabiel op grote schaal kan worden verkregen. Op basis van de genoemde ontdekkingen werd de uitvinding voltooid.

Een doel van de uitvinding is het verschaffen van een 25 nieuw flavivirus antigeen, dat uitermate effectief is als JE vaccin en veilig op grote schaal en tegen lage kosten kan worden geproduceerd.

Dit doel en andere doeleinden, aspecten en voordelen van de uitvinding worden in het hiernavolgende toe-30 gelicht aan de hand van de tekening, waarin:

Figuren 1a tot 1i de base sequenties coderend voor V3 proteïnen van JE virus, gele koorts virus en West Nijl virus en de aminozuur-sequenties van V3 pro-teinen van de genoemde virussen tonen; 35 figuren 2a tot 2f de base sequentie coderend voor 1603017 . -4-- f f V3 proteïne van JE virus (verder dikwijls aangeduid als "JEV3 proteïne") (bovenste rij) en de aminozuur sequentie van JEV3 proteïne (onderste rij) tonen; fig. 3 een stroomschema toont van de constructie pS22XS 5 uit·pS22; fig. 4 een stroomschema toont van de constructie van pJMl05; fig. 5 de structuren van diverse gereconstrueerde plasmiden van pJEV3 en een structuur van pJMlOS toont; en IQj fig.6 een weergave is van de resultaten van de elektroforese voor de identificatie van V3 proteïne van JE virus.

In figuren la tot li.zijn de sequenties in de volgende volgorde vanaf de bovenste rij tot de onderste rij gerang-15 schikt: (1) base sequentie coderend voor V3 proteïne van JE virus (2) aminozuur sequentie van V3 proteïne van JE virus, afgeleid uit de base sequentie (1) 20 (3) basesequentie coderend voor V3 proteïne van

West Nijl virus (4) aminozuur sequentie van V3 proteïne van West Nijl virus, afgeleid uit de base sequentie (3) (5) base ·sequentie coderend voor V3 proteïne 25' van gele koorts virus (6) aminozuur sequentie van V3 proteïne van gele koorts virus, afgeleid uit de base sequentie (5).

Verder betekent in figuren la tot 1i het symbool "***" dat dit gedeelte in dé base sequentie of aminozuur 30 sequentie hetzelfde codon of aminozuur is als dat van de base sequentie of aminozuur sequentie van JEV3 proteïne in het corresponderende gedeelte; het symbool "---" betekent dat dit gedeelte in de base sequentie of aminozuur sequentie ontbreekt, zodat twee codons of aminozuren, 35 die dit symbool aan beide zijden begrenzen, direct verbonden zijn.

8603017 -s- I I .

De uitvinding verschaft een antigeen, omvattende ten minste een gedeelte van een aminozuur sequentie/ voor gesteld door de volgende formule (I):

Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp 2 Phe lie Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp

Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr lie Met Ala Ash Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala - Ser Gin Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys · Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr

Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gin Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys ]_5 Gly Ser He Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser

Cys Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile

Gin Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly Asn Tyr Ser Ala Gin Val Gly 2q Ala Ser Gin Ala Ala Lys Phe Thr Ile Thr

Pro Asn Ala Pro Ser Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser 25 Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp

Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Cys Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met 160 3 0.1 7 i £ -6-

Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gin

Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gin Glu Gly

Gly Leu His Gin Ala Leu Ala Gly Ala Ile

Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu 5 Thr Ser Gly Eis Leu Lys Cys Arg Met Lys

Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr

Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe

Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly

Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly •j_0 Ser Asp Gly Pro Cys Lys lie Pro Ile Val

Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro

Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe

Val Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Leu

Leu Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp t_5 Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys

Gin Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly

Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr • Leu Lys Gly Ala Gin Arg Leu Ala Ala Leu 20 Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile

Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala

Val His Gin Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg

Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr

Gin Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp 25 Met Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile

Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gly Gly Val

Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala

..... CD

860 3 01.7 I f _ ' -7- waarin Ala staat voor een alaninerest, Arg voor een . argininerest, Asn voor een asparaginerest, Asp voor een aspartinezuurrest, Cys voor een cysteinerest, Gin voor een glutaminerest, Glu voor een glutaminezuurrest, Gly voor 5 een glycinerest, His voor een histidinerest, Ile voor een isoleucinerest, Lys voor een lysinerest, Leu voor een leu-cinerest, Met voor een methioninerest, Phe voor een fenyl-alaninerest, Pro voor een prolinerest, Ser voor een serine-rest, Thr voor een threoninerest, Trp voor een tryptofaan-101 rest, Tyr voor een tyrosinerest, en Val voor een valine-rest, welk gedeelte tenminste een epitoop bevat, dat reactief is met een anti-flavivirus antilichaam.

Verder verschaft de uitvinding een deoxyribo-15 nuclelnezuur, omvattende een base sequentie coderend voor een antigeen omvattende tenminste een gedeelte van een aminozuur sequentie,voorgesteld door formule (1), welk gedeelte ten minste een epitoop bevat, dat reactief is met een anti-flavivirus antilichaam.

20 De uitvinding verschaft tevens een werkwijze ter be reiding van een antigeen, dat tenminste een gedeelte van een aminozuur sequentie bevat, voorgesteld door formule (1), welk gedeelte ten minste een epitoop bevat, dat reactief is met een anti-flavivirus antilichaam, welke 25; werkwijze omvat:

Ca) ligatering van een deoxyribonucle'inezuur, dat een base sequentie omvat coderend, voor het antigeen, aan een repliceerbare expressie-vector ter verkrijging van een repliceerbaar recombinant DNA,omvattende het deoxyribonucle-30 inezuur en de repliceerbare expressie-vector; (b) transformering van cellen van een microörganisme of celcultuur met het repliceerbare recombinant DNA onder vorming van transformanten; (c) selectie van de transformanten uit moedercellen 35 van het micro-organisme of de celcultuur, (d) incubatie van de transformanten om expressie van het deoxyribonucleinezuur en vorming van een antigeen 8603017 a •ί ¥ - -8- door de transformanten te veroorzaken en (e) isolatie van het antigeen uit de geïncubeerde transformanten.

Het antigeen volgens de uitvinding omvat ten minste 5 een gedeelte van een aminozuur sequentie, weergegeven door formule(1). De aminozuur sequentie van formule (1) komt overeen met de volledige aminozuursequentie van het V3 antigeen van JE virus. Het onderhavige antigeen kan de gehele aminozuur sequentie met formule(1) omvatten. Het antigeen 10 met de gehele aminozuur sequentie van formule (1) wordt verder aangeduid als JEV3 proteïne. Ook kan het onderhavige antigeen een gedeelte van de aminozuur sequentie met formule (1) omvatten, voor zover dat gedeelte ten minste één epitoop bevat, dat reactief is met een anti-flavivirus 15 antilichaam.

Het "epitoop" is een antigene determinant waarmee een structuur in een antigeen wordt bedoeld, die de specificiteit van antigeen-antilichaam reactie bepaalt.

Als het gedeelte van de aminozuur sequentie met for-20 mule (l) kan bijvoorbeeld worden genoemd een gedeelte, overeenkomend met de aminozuur sequentie vanaf het 45e tot het 159e aminozuur, geteld vanaf de eindstandige N van de aminozuur sequentie met formule (1), een gedeelte over-, eenkomend met de aminozuur sequentie vanaf het 375e tot het. 25- 456e aminozuur, geteld vanaf de eindstandige N van de aminozuur sequentie van de formule (1), enz.

Het antigeen volgens de uitvinding met de aminozuur sequentie met formule (I) (d.w.z. JEV3 proteïne) kan worden bereid door een werkwijze, die de onderstaand 50 genoemde trappen (1) tot (9) omvat.

In trap (1) wordt een genomisch RNA geëxtraheerd uit JE virus. In deze trap kunnen conventionele technieken worden toegepast,zoals fenolextractie en dergelijke.

In trap (2) wordt een dubbel gevlochten cDNA, comple-35 mentair met het in trap (1) verkregen virus RNA, bereid.

In deze trap kan een conventionele methode worden toegepast, waarbij gebruik wordt gemaakt van reverse transcriptase.

8803017 £ é -9-

In trap (3) wordt het cDNA gekloond en wordt de base sequentie van het gekloonde cDNA bepaald. De vector voor het klonen kan worden gekozen uit de bekende vectors, zoals plasmiden met geschiktheid voor een prokaryotische 5 cel zoals Escherichia coll, Bacillus subtilis en dergelijke en vectors, afgeleid van bacteriofagên aoals fage, T4 fageö en dergelijke. Het is in deze trap gewenst, dat een geschikte combinatie van een kloonvector en een gastheercel wordt gekozen.

10 In trap (4) wordt een gekloond cDNA, bevattende een gen coderend voor JEV3 proteïne (verder aangeduid als "JEV3 gen") geïdentificeerd.

Gewoonlijk hebben structurele genen, afgeleid van cellen, een specifieke base sequentie in het gebied van 15 dê initiering en beëindiging van translatie, en de regulator genen zijn analoog van structuur. Het is daarom betrekkelijk gemakkelijk de gebieden van dergelijke structurele genen te ontdekken en te identificeren. Anderzijds zijn in het geval van JEV3 gen door het ontbreken van de gebieden van de ini-20 tiering en beëindiging van translatie en van de regulator-.genen geen specifieke base-sequenties bruikbaar als index, zodat de detectie en identificatie van de gebieden van JEV3 gen uiterst moeilijk zijn. Deze moeilijkheid is echter door de uitvinders overwonnen. Door analyse van de base-sequentie 25 van het gekloonde cDNA, expressie van het gekloonde cDNA en immunologische detectie en identificatie van het door expressie verkregen produkt, gevolgd door vergelijking van de base sequentie van het gekloonde cDNA met de reeds bekende aminozuursequentie van V3 proteïne en base sequentie 30 van genen met betrekking, tot V3-genen van het gele koorts virus en het West Nijl virus, ter bepaling van de base sequentie van het cDNA van JEV3 gen.

Als resultaat werd gevonden dat het JEV3 gen een base sequentie met de volgende formule ( .Z) bezit: iSO3 0 17 35 ί 1 -10- .

TTT AAT TGT GTG GGA ATG GGC AAT CGT GAC

TTC ΑΤΑ GAA GGA GCC AGT GGA GCC ACT TGG

GTG GAC TTG GTG CTA GAA GGA GAT AGC TGC

TTG ACA ATC ATG GCA AAC GAC AAA CCA ACA

5 TTG GAC GTC CGC ATG ATT AAC ATC GAA GCT

AGC CAA CTT GCT GAG GTC AGA AGT TAC TGC TAT CAT GCT TCA GTC ACT GAC ATC TCG ACG GTG GCT CGG TGC CCC ACG ACT GGA GAA GCT CAC AAC GAG AAG CGA GCT GAT AGT AGC TAT 10 GTG TGC AAA CAA GGC TTC ACT GAT CGT GGG

TGG GGC AAC GGA TGT GGA CTT TTC GGG AAG GGA AGC ATT GAC ACA TGT GCA AAA TTC TCC TGC ACC AGC AAA GCG ATT GGA AGA ACA ATC CAG CCA GAA AAC ATC AAA TAC GAA GTT GCC lb ATT TTT GTG CAT GGA ACC ACC ACT TCG GAA

AAC CAT GGG AAT TAT TCA GCG CAA GTT GGG GCG TCC CAG GCG GCA AAG TTT ACA ATA ACA CCC AAT CGT CCT TCG ATA ACC CTC GGG CTT

GGT GAC TAC GGA GAA GTC ACG CTG GAC TGT

20

GAG CCA AGG AGT GGA CTG AAC ACT GAA GCG TTT TAC GTC ATG ACC GTG GTG TCA AAG TCA •TTT CTG GTC CAT AGG GAA TGG TTT CAT GAC GTC GCT CTC CCC TGG ACG TCC CCT TCG AGC 25 ACA GCG TGC AGA AAC AGA GAA CTC CTC ATG

GAA TTT GAA GAG GCG CAC GCC ACA AAA CAG TCC GTT GTT GCT CTT GGG TCA CAG GAA GGA GGC CTC CAT CAG GCG TTG GCA GGA GCC ATC GTG GTG GAG TAC TCA AGC TCA GTG AAG TTA

____A

8603017 r fc' -11-

ACATCA GGC CAC CTG AAA TGT AGG ATG AAA ATG GAG AAA CTG GCT CTG AAA GGC ACA ACC

TAT GGC ATG TGT ACA GAA AAA TTC TCG TTC

GCG AAA AAT CCG GCG GAC ACT GGC CAC GGA

5 ACA GTT GTC ATT GAA CTA TCC TAC TCT GGG

AGT GAT GGC CCC TGC AAA ATT CCG ATT GTC

TCC GTT GCG AGC CTC AAT GAC ATG ACC CCC

GTT GGG CGG CTG GTG ACA GTG AAC CCT TTC

GTC GCG ACT TCC AGT GCC AAC TCA AAG CTG

10 CTG GTC GAG ATG GAA CCC CCC TTC GGA GAC

TCC TAC ATC GTG GTT GGG AGG GGA GAC AAG

CAG ATC AAC CAC CAT TGG CAC AAA GCT GGA

AGC ACG CTA GGC AAG GCC TTT TCA ACA ACT

TTG AAG GGA GCT CAA AGA CTG GCA GCG TTG

15 GGC GAC ACA GCC TGG GAC TTT GGC TCC ATT

GGA GGG GTC TTC AAC TCC ATA GGA AAA GCC

GTT CAC CAA GTG TTT GGT GGT GCC TTC AGA

ACA CTC TTT GGG GGA ATG TCT TGG ATC ACA

CAA GGG CTA ATG GGT GCC CTA CTA CTC TGG

20 ATG GCC GTC AAC GCA CGA GAC CGA TCA ATT

GCT TTG GCC TTC TTA GCC ACA GGA GGT GTG

CTC GTG TTC TTA GCG ACC AAT GTG CAT GCT

.....{-%) ^ s A ‘to 17 0 Q xg O i / -12- i i waarin A een deoxyadenylinezuurrest, G een deoxyguaniline-zuurrest, G een deoxycytidylinezuurrest en T een deoxy-thymidylinezuurrest voorstellen, en de linker- en rechter-uiteinden van formule ( '2 ) resp. de 5 '-hydroxylgroepzi jde 5 en 3'-hydroxylgroepzijde voorstellen.

In overeenstemming met degeneratie van genetische code,is het mogelijk ten minste éen base van de base-sequentie van een gen te vervangen door een ander type base, zonder dat de aminozuursequentie van het uit het 10 gen bereide polypeptide wordt veranderd. Vandaar dat de DNA code voor JEV3 proteïne een base sequentie kan hebben, die gewijzigd is door substitutie in overeenstemming met degeneratie van genetishe code. In di^geval is de aminozuur sequentie, afgeleid van de base sequentie, 15 die verkregen is door de bovengenoemde substitutie, identiek met de aminozuursequentie met formule (1).

In trap (5) wordt het cDNA van JEV3 gen geligateerd aan een repliceerbare expressie-'Vector.

In deze trap wordt het cDNA van JEV3 gen bereid 20 uit het gekloonde cDNA, dat verkregen is in trap (4) en geligateerd aan een repliceerbare expressievector onder vorming van een repliceerbaar recombinant DNA. De in deze. trap gebruikte repliceerbare expressievector kan worden gekozen uit bekende vectors, zoals expressie plasmiden, 25 expressie'"shuttle'’ vectors en expressie vectors afgeleid van virussen, zoals vaccinia virus en SV40 die geschiktheid bezitten voor de te gebruiken gastheercellen. Wat de gastheercellen betreft wordt in het volgende een toelichting . gegeven .

30 De ligatering van het cDNA van JEV3 gen aan een re- pliceerbare expressie-veetor kan op gebruikelijke wijze geschieden. Wat de uitvoering van de ligatering betreft wordt opgemerkt, dat daar het cDNA van JEV3 gen geen gebieden voor de initiering en beëindiging van translatie be-35 vat, het cDNA moet worden gesuppleerd door DNA*s, die base sequenties bevatten, welke met zulke gebieden overeenkomen.

860 3 0 1-7 . -13- ί. *

Verder kan. een' expressievector, waaraan het cDNA van JEV3 gen. moet worden geligateerd, worden gemodificeerd teneinde: (1) de antigeniciteit en immunogeniciteit van een 5 expressie-produkt (JEV3 proteïne) te vergroten; (2) de stabiliteit van het cDNA van JEV3 gen in een expressievector en in een gastheercel te verhogen; (3) de opbrengst van het JEV3 proteïne, geproduceerd door gen expressie, te verhogen; en 1D (;4) het JEV3 antigen, geproduceerd door gen expressie in een gastheercel, uit de gastheercel af te scheiden, zodat de extractie en zuivering van het antigen wordt vereenvoudigd.

Verder kan bij de uitvoering van de ligatering van het 15 cDNA van JEV3 gen aan een expressie vector, desgewenst, het cDNA van JEV3 gen via een geschikte koppeling aan de expressievector worden geligateerd.

Het in de trap (4) verkregen gekloonde cDNA bevat soms naast de base sequentie coderend voor JEV3 proteïne, 20 een base sequentie/afgeleid van het andere gen van het JE virus dan het JEV3 gen. In een dergelijk geval kan de andere base sequentie dan die voor codering van JEV3 proteïne voor de ligatering uit het cDNA worden verwijderd. Ook kan het cDNA als zodanig worden gebruikt.

25 In trap (6) wordt het repliceerbare recombinant DNA

dat het. cDNA van JEV3 gen bevat, overgebracht in een gastheercel ter verkrijging van een transformant.

In deze trap geschiedt de transformatie van een gastheercel met het recombinant DNA op gebruikelijke wijze.

30 Als voorbeelden van de gastheercellen kunnen worden genoemd, prokaryotische cellen zoals Escherichia coli en Bacillus subtilis , en eukaryotische cellen, zoals een gist en een hoger organisme celcultuur.

De transformanten, gevormd door de transformatie,.

35 worden gekozen uit moedercellen, die met het recombinant DNA ongetransformeerd blijven, waarbij als kriterium bijvoorbeeld wordt gebruikt een fenotypische eigenschap,zoals /86030 1 7 ƒ )· · -14- drug resistentie, verleend door de repliceerbare expressie-vector met een gen voor de fenotypische eigenschap.

In trap (7) wordt de. transformant gekweekt onder expressie van het cDNA van JEV3 gen en vorming van het JEV3 pro-5 teine.

In trap (8) .wordt het onderhavige, door expressie gevormde antigen door gebruikelijke extractie- en zuiverings-methoden geïsoleerd uit de geïncubeerde transformant.. .

In deze trap kunnen conventionele technieken in 10 combinatie worden toegepast. Zo kunnen bijvoorbeeld technieken zoals filtratie, uitzouten, centrifugeren en kolom-chromatografie in combinatie worden toegepast voor de extractie en zuivering van het onderhavige antigen.

Aldus verkrijgt men een flavivirus antigen volgens 15 de uitvinding, dat een aminozuur sequentie bevat, voorgesteld door de formule (1) in nagenoeg zuivere vorm.

In trap (9) worden de antigeniciteit en immunogeniciteit • » van het onderhavige antigen bepaald.

In deze trap kunnen conventionele technieken in com-20 binatiè worden toegepast.Zo .kunnen bijvoorbeeld technieken, zoals een enzyme-gebonden immunosorbentbepaling (verder aan te duiden als ''ELISA") en neutralisatieproef (50% plaqüe-reductiemethode: "Standard for the biological preparation of medicines", biz.76, onder supervisie van Pharmaceutical 25 and. Supply Bureau,MinIstry of Health and Welfare, Japan, en uitgegeven door Association of Bacterial Pharmaceutical Preparation, 10 oktober 1985) in combinatie worden toegepast voor de bepaling van de antigeniciteit en immunogeniciteit.

Zoals, hierboven beschreven wordt het JEV3 proteïne 30 bereid door middel van recombinant DNA techniek met behulp van het cDNA van JEV3 gen met de base sequentie, voorgesteld door formule (2.,). Bij de bedoelde methode wordt het cDNA van JEV3 gen uit het JË virus verkregen door klonen. Het cDNA van JEV3 gen kan echter ook organisch-chemisch worden 35 gesynthetiseerd met behulp van een in de handel verkrijgbare automatische DNA synthesizer, enz.

8603017 ΐ -¾ _ - -15-

In het geval waarin het antigen volgens de uitvinding een gedeelte van het JEV3 proteïne omvat, welk gedeelte ten minste één epitoop bevat, dat reactief is met een anti-flavi-virus an&Lichaam, kan een dergelijk antigeen worden bereid 5 door middel van recombinant DNA techniek op nagenoeg dezelfde wijze als hierboven beschreven voor de trappen (5) tot (8), echter met dit verschil, dat in plaats van het cDNA van JEV3 gen een gedeelte van het cDNA van JEV3 gen, overeenkomend met het bovengenoemde gedeelte van het JEV3 proteïne 10 aan een expressie vector wordt geligateerd. Het gedeelte van het JEV3 gen kan worden bereid door klieven van het cDNA van JEV3 gen, bijvoorbeeld met behulp van een geschikt restrictie-enzyme, enz. Ook kan het gedeelte van het cDNA van JEV3 gen organiseh-chemisch worden gesynthetiseerd met behulp van een . 15 in de handel verkrijgbare automatische DNA synthesizer*

Zoals reeds vermeld kan het antigeen volgens de uitvinding worden geproduceerd door gen-expressie. Het antigen volgens de uitvinding kan ook worden verkregen in de vorm van een versmolten peptide, dat de aminozuur-20 sequentie van het JEV3 ..proteïne of een gedeelte daarvan omvat en daaraan gehecht aan zijn eindstandige C- en/of eind-standige N- de aminozuursequentie van een andere peptide, zoals een van een verbinder afgeleid peptide, van een expressievector afgeleid peptide en/of van het andere struc-25 turele proteïne van het flavivirus dan het JEV3 proteïne afgeleid peptide. In dit geval kan het versmolten peptide . chemisch of enzymatisch worden gekliefd en gescheiden in de aminozuur sequentie van JEV3 proteine of het gedeelte daarvan en de aminozuur sequentie van het andere peptide, dat 30 er aan is gehecht.Ook kan het versmolten peptide als zodanig als antigen worden gebruikt indien de antigeniciteit en immunogeniciteit niet door de aanwez igheid van het andere peptide dan het JEV3 proteine worden beinvloed.

Het antigen volgens de uitvinding kan ook organo-che-35 misch worden gesynthetiseerd met behulp van een in de handel verkrijgbare automatische peptide synthesizer, enz.

8803017 it, -16-

Verder kunnen de herconstructie en modificatie van elke epi-toop van het antigen volgens dè uitvinding gemakkelijk tot stand worden gebracht volgens bekende gebruikelijke methoden van de eiwittechniek.

5 Het antigen volgens de uitvinding kan worden ge bruikt als een actief bestanddeel van flavivirus vaccins, in het bijzonder JE vaccin.

Het vaccin kan worden bereid door toevoeging van . het antigen volgens de uitvinding aan een gesteriliseerde 110. isotonische oplossing zoals een fysiologische zout- of fosfaatbuffer.In dit geval verdient het de voorkeur dat een pepton, aminozuur, saccharide of dergelijke als katalysator in het vacCin wordt opgenomen. Het aldus verkregen vaccin is in vloeibare toestand. Het vaccin kan ook worden 15 omgezet in een geprecipiteerd vaccin door toevoeging van een hulpstof ter versterking van de immunogenicitext, of irtfeen gelyofiliseerd vaccin dat zeer stabiel en gemakkelijk trans-porteerbaar is. Verder kan de immunogeniciteit van het antigen volgens de uitvinding worden versterkt door introductie 20 'van een saccharideketen in het antigen door middel van de moleculaire fusietechniek of door modificatie in de cel na de translatie.

Het vaccin, dat het onderhavige antigen bevat, kan in het algemeen worden toegediend in de vorm van een vloéi-25 stof of suspensie. Indien het vaccin een gelyofiliseerd vaccin is, wordt het vaccin voor de toediening opgelost of gesuspendeerd in de hierboven genoemde gesteriliseerde isotonische oplossing. De concentratie van het onderhavige antigen in het vaccin voor toediening kan in het algemeen on-30 geveer 0,001 tot 1000 microgram/ml bedragen. In het algemeen kan het vaccin subcutaan of intramusculair worden toegediend . De dosis van het vaccin voor een volwassene is in het algemeen gelegen tussen 0,1 en 2,0 ml. Voor kinderen kan de dosis in het algemeen de helft zijn van die voor volwassenen. 35 Het vaccin kan in het algemeen tweemaal worden toegediend met een interval van ongeveer 1 week tot 1 maand en dan 880 30 1 7' -17- * t- ongeveer 1 jaar later nogmaals worden toegediend.

Verder kan het antigeen volgens de uitvinding worden gebruikt als immunologisch diagnosticum voor het constateren van infectie van JE virus.Het onderhavige antigen kan ook 5 worden gebruikt als immunologisch diagnosticum voor het constateren van infectie van andere flavivirussen dan JE virus, waarvan de antigeniciteit nauw verwant is met of soortgelijk aan die van het antigen volgens de uitvinding. Zo is bijvoorbeeld het antigen volgens de uit-10; vinding geschikt voor toepassing in ELISA,de.'hëmagg.utinatie-proef, passieve hemagglutinatieproef, complement fixatieproef en andere diverse proeven, waarin een antigen of anti-lichaam, resp. gemerkt meteen, fluorescerend pigment, een enzyme een radioïsotoop en dergelijke wordt gebruikt.

15 Het antigen volgens de uitvinding kan worden gebruikt voor het ontdekken en identificeren van een flavivirus anti-lichaam volgens een der bovengenoemde testmethoden.

Het antigen volgens de uitvinding kan ook worden gebruikt voor’de bereiding van een antilichaam tegen het 20 onderhavige antigen. Het aldus geproduceerde antilichaam kan met voordeel worden gebruikt voor de detectie en identificatie van een flavivirus antigen volgens de bovengenoemde testmethoden. De produktie van een dergelijk antilichaam kan geschieden volgens een methode, waarbij het 25 antigen volgens de uitvinding wordt geïnjecteerd in een laboratoriumproefdier waardoor het dier een antilichaam produceert, waarna het bloed of de lichaamsvloeistof van het dier wordt verzameld. Het antilichaam kan ook worden geproduceerd door middel van een gebruikelijke celfusie-30 techniek. Wanneer het antilichaam volgens de eerstgenoemde methode wordt geproduceerd, wordt een polyklonaal antilichaam verkregen. Wordt echter het antilichaam geproduceerd volgens de laatstgenoemde methode, dan wordt een monoklonaal antilichaam verkregen.

35 Ook kan het antigen volgens de uitvinding of het S SO 3 0 17 is.

-18- antilichaam tegen het onderhavige antigen worden gebruikt als bioseparator, bioreactor en biosensor onder toepassing van de antigen-antilichaamreactie. In dit geval kan het antigen volgens de uitvinding of het antilichaam tegen het 5 onderhavige antigen op de gebruikelijke wijze worden gehecht aan een substraat of drager. Afhankelijk van het doel kan het antigen volgens de uitvinding of het antilichaam tegen het onderhavige antigen op gebruikelijke wijze worden gemerkt met een fluorescerend pigment, een enzyme, een 10 radioïsotoop of dergelijke.

Het antigen volgens de uitvinding heeft de volgende voordelen.

De moleculaire structuur van het onderhavige antigen is duidelijk. Het is daardoor mogelijk door toepassing van 15 het onderhavige antigen zeer effectieve, zeer veilige, uniforme biologische preparaten en zeer specifieke, zeer effectieve diagnostica te verkrijgen. Verder wordt het onderhavige antigen niet geproduceerd door infectie van een dier met een virus, maar door gen expressie van het DNA code-•20 rend voor het onderhavige antigen in een gastheercel. Daardoor wordt de mogelijkheid van biologische risico's tijdens de trappen van de bereiding van het onderhavige antigen nagenoeg geëlimineerd. Ook kunnen de produktiekosten worden verminderd. Daar verder alle materialen van het incubatie-25 systeem, bijvoorbeeld het medium, qua samenstelling en structuur bekend zijn,is de zuivering niet moeilijk en kan een antigen produkt met een grote zuiverheid worden verkregen.

De uitvinding wordt aan de hand van de volgende voorbeelden nader toegelicht,

30 Voorbeeld I

Trap 1 (extractie van het genomisch RNA van het Japanse encefalitis virus) JE virus,stam JaOArS982 werd gedurende 48 uur in een nutriënt cultuurmedium bij 28°C gekweekt met als cultuurgast-35 heer cellen van een cellenlijn C6/36, afkomstig van Aedes albopictus , een muggesoort (A.Igarashi, J.Gen.Virol. 40 (1973) 531). Vervolgens werd de bovenstaande vloeistof van 8803017 s. -t -19- het cultuurmediüm verzameld. Aan deze bovenstaande vloeistof werden toegevoegd 6 g/dl polyethyleenglycol 6000 en 2,22 g/dl natriumchloride,waarna het verkregen mengsel gedurende 15 minuten werd geroerd. Het mengsel werd gedurende 30 rninu-5 ten gecentrifugeerd bij 12000 g onder precipitatie van virusdeeltjes.De virusdeeltjes werden verzameld en gesuspendeerd in STE buffer (0,1 M NaCl, 0,01 M tris-HCl en 0,001 M EDTA, pH 7,6). De aldus verkregen suspensie werd als laag aangebracht over een 15% .sucrose-oplossing in een 10 centrifugebuis en gedurende 120 minuten gecentrifugeerd bij 37000 toeren per minuut ter verkrijging van precipitaten.

De gevormde precipitaten werden opgelost in STE-0,1% SDS (natriumdodecy1sulfaat). Vervolgens werd aan de verkregen oplossing hetzelfde volume met STE verzadigde fenol toe-15 gevoegd teneinde het genomische RNA van het virus te extraheren en het verkregen mengsel werd grondig geroerd. De waterige laag van het mengsel werd verwijderd en aan deze waterige laag werd een volume ethanol toegevoegd, dat 2 maal zo groot was als dat van de waterige laag.Men liet het aldus ver-20 kregen mengsel gedurende 1 nacht bij -20°C met rust, waarna het mengsel gedurende 30 minuten werd gecentrifugeerd bij 15000 toeren per minuut onder precipitatie van RNA. Het geprecipiteerde RNA werd verzameld en gelyofiliseerd en daarna gesuspendeerd in STE-0,1% SDS. De verkregen suspensie 25 werd als een laag aangebracht over een sucrose-oplossing in een centrifugebuis, welke sucrose-oplossing 0,01% SDS bevatte en een dichtheidsgradient van 15-30% (gew./gew.) vertoonde en gedurende 180 minuten gecentrifugeerd bij 45000 toeren per minuut. Een fractie met een sedimentatiecon-30 stante van 42S werd uit de centrifugebuis verzameld en samengevoegd, en blootgesteld aan precipitatie met behulp van ethanol ter verkrijging van precipitaten.De precipitaten werden gedroogd en opgelost in 50 mM Tris-HCl (pH 7,9) ter verkrijging van een gezuiverde virus RNA-oplos-35 sing.

Trap 2(Bereiding van een dubbelgevlochten cDNA, bevattende een DNA, dat complementair is met het genomische RNA).

8603017

ϊ· I

-20-

Aan 50 microliter van de virus RNA oplossing, bevattende 10 microgram van het genomische RNA, werden toegevoegd 10 mM MgCl2, 250 mM NaCl, 2,5 mM MnCl2, 0/5 mg/ml run-derserum albumine (verder dikwijls aangeduid als "BSA”), 5 1 mM ATP, 30 eenheden RNase inhibitor en 1 eenheid poly(A) polymerase, en het verkregen mengsel werd gedurende 5 minuten bij 37°C geïncubeerd, Vervolgens werd het mengsel blootgesteld aan extractie door fenol en precipitatie door ethanol onder precipitatie van RNA, gevolgd door centrifugeren ter ver-10 krijging van precipitaten. De precipitaten werden gedroogd ter verkrijging van een gedroogd RNA. Vervolgens werd het verkregen RNA opgelost in 50 microliter van een oplossing> bevattende 0,1 M KC1, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM dNTP, 20 microgram oligo(dT)12-T8T 50 ^ Tris-HCl{pH 7,9) en 15 30 eenheden reverse transcriptase, Waarna het verkregen mengsel gedurende 60 minuten werd blootgesteld aan incubatie bij 42°C. Aan het mengsel werd toegevoegd 150 microliter van een enzym-oplossing, bevattende 0,1 mM MgSO^j, 0,5 mg/ml BSA, 1 mM dNTP, 100 micro M NAD, 0,5 M Tris-HCl(pH 7,9),

20 25 eenheden RNase Η, 1 eenheid DNA ligase en 20 eenheden DNA

polymerase I onder vorming van een mengsel van 200 microliter. Het mengsel werd gedurende 2 uur bij 15°C blootgesteld aan incubatie. Het verkregen reactiëmengsel werd blootgesteld aan extractie door fenol en precipiiatie door ethanol ter 25 verkrijging van precipitaten. De precipitaten werden opge- lost in 100 microliter van een waterige oplossing, bevattende 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 0,1 mg/ml BSA, 1 mM DTT, 1 mM dNTP en 50 mM Tris-HCl (pH 7,9).Aan de verkregen oplossing werden 2 eenheden T4DNA polymerase toegevoegd en het verkregen meng-30 sel werd gedurende 10 minuten bij 37°C geïncubeerd. Na de incubatie werd het mengsel blootgesteld aan extractie door fenol en precipitatie door ethanol ter verkrijging van een dubbelgewikkeld cDNA dat een DNA bevatte,dat complementair is met het virale genomische RNA.

35 Trap 3 (klonen van het cDNA én bepaling van de base sequentie daarvan).

1603017 ‘ - 21- $ t

Het in. trao -2 verkregen tobbel gewikkelde cDNA werd opge-lost in een waterige oplossing, bevattende 60 mM Tris-HCl (pH 7,6) , 6,6 mM MgC^, 10 rnM DTT en 1 mM ATP. Aan de aldus verkregen oplossing werden toegevoegd een BamHI verbinder en 5 T4DNA ligase, gevolgd door incubatie bij 4°C gedurende 16 uur ter bevordering van een ligatiereactie van het cDNA met de verbinder. Daarna werd de onomgezet gebleven BamHI verbinder verwijderd door gelfiltratie met behulp van CL-4B gel, dat in evenwicht was gebracht met TEN50 buffer, bestaande uit 10 mM 10 Tris-HCl fpH 8,0) , 50 inM NaCl· en 1 mM EDTA. Vervolgens werd de in overmaat aan het cDNA geligateerde verbinder verwijderd door digerering van de verbinder met BamHI en uitvoering van een gelfiltratie met behulp van CL-4B gel. Aldus werd een dubbel gewikkeld cDNA bereidvaan beide uiteinden waarvan 15 BamHI verbinder was geligateerd. Het aldus verkregen cDNA werd gestoken in de BamHI plaats van een kloonvector pUC13 (vervaardigd en in de handel gebracht door Pharmacia Fine Chemicals AB, Sweden).Toelichtenderwijze gesteld werd pUC13 gekliefd door BamHI. Het cDNA, aan beide uiteinden 20 waarvan een BamHI verbinder was geligateerd, werd toegevoegd aan het gekliefde pUC13 en het verkregen mengsel werd gedurende 16 uur in tegenwoordigheid van T4DNA ligase bij 4°C tot reactie gebracht onder ligatering van het cDNA met de vector pUCl3. Vervolgens werd het resulterende ligaterings-25 produkt, d.w.z. recombinant DNA, overgebracht in een cel van Escherichia coli stam DH1 (ATCC No.33849) ter verkrijging van een transformant. Vervolgens werder^cDNA fragmenten met diverse lengten als volgt uit het cDNA bereid. Eerst werd het cDNA bereid uit de bovengenoemde transformant en opge-30 lost in 100 microliter van een Bal31 buffer, bestaande uit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 12 mM CaCl2, 12 mM MgC^ en 400 mM NaCl. Aan de verkregen oplossing werden 2 eenheden exonuclease Bal31 toegevoegd, gevolgd door incubatie bij 20°C. Na verloop van 3,6, 10 en 15 minuten na de incubatie werd 35 20 microliter van het reactiemengsel verzameld en onderworpen aan extractie door fenol en precipitatie door ethanol ter 880 30 17 -22-

·£ T

verkrijging van cDNA-fragmenten. Vervolgens werden de cDNA-fragmenten opgelost in een T4DNA polymerasebuffer, bevattende 70 mil Tris-HCl(pH 7,5), 10 mM MgCl^, 5 mM dithiothreltol en 200 microM dNTP, en werd aan de verkregen oplossing T4 DNA polymerase toegevoegd. Het verkregen mengsel werd gedurende 5 30 minuten bij 37°C geincubeerd ter omzetting van beide uit einden van elk van de cDNA-fragmenten in stompe uiteinden. Vervolgens werden de cDNA-fragmenten afzonderlijk gestoken in een Hindi plaats van kloonvector pUC19 (vervaardigd en in de handel gebracht door Pharmacia Fine Chemicals AB, 10'· Zweden ter vorming van recombinantvectors. De recombinantvec-tors werden afzonderlijk overgebracht in E.coli stam JM‘83 ter ver&Ljging van transformanten, die cDNA fragmenten van verschillende afmetingen bevatten. De transformanten werden afzonderlijk gekweekt ter verkrijging van de cDNA-15 fragmentklonen. De base sequenties van de verkregen klonen werden bepaald volgens de dideoxy keten termineringsmethode (F.Sanger, e.a., Proc.Natl.Acad.Sci.üSA, 7£,(1977)5463 en M. Hattori, e.a., Anal. Biol. 152,(1986) 232)♦ Gevonden werd dat een van de klonen een cDNA was, bestaande uit ongeveer 20 4000 base paren (verder aangeduid als "bp"), hetgeen overeen komt met een partiele base sequentie van het genomische RNA van het JE virus, welke partiele base sequentie - begint vanaf de plaats ongeveer 2000 bp benedenstrooms van het 51-uiteinde van het genomische RNA en zich uitstrekkende 25 tot een positie van ongeveer 40Q0 base paren. Deze kloon werd aangeduid als K68. De kloon 68 bleek een base sequentie te bevatten, overeenkomende met een deel van het V3 gene van JE virus, maar niet een volledige sequentie van het , V3 gene. Vervolgens werd een oligonucleotide (26 mer) 30 met de volgende base sequentie, die complementair is aan een deel van het V3 gene in het genomische RNA van het JE virus en aanwezig in de sequentie van de kloon K68, organo-chemisch gesynthetiseerds dGTACGGCTTCCCACATTTGGTGCTCC, 35 26 mer · SS03017

J, X

-23- .

Trap 4 (klonen van kloon S22, bevattende een DNA-gebied coderend voor V3 proteïne),

Nagenoeg dezelfde procedures als in trap 2, behalve dat het oligonucleotide (26 mer), bereid in trap 3, werd 5 gebruikt als inleiding voor de cDNA synthese werden herhaald ter verkrijging van cDNAs. De aldus verkregen cDNAs werden afzonderlijk gestoken in een kloring vector pUC13 ter ver- -krijging van recombinant vectors, waarna de recombinant vectors afzonderlijk werden overgebracht in de bovengenoemde 10.. E. coli stam ter vorming van transformanten. Uit elke transformant werd de recombinant vector geïsoleerd volgens een akali-extractiemethode (Nucleic Acid Res. (6) , (1979) 1513- 1523) , waarna de base sequentie werd bepaald volgens de in trap 3 beschreven methode. Gevonden werd dat een van de re-15 combinant vectors een .cDNA fragment bevatte met een molecuul-1engte van ongeveer 2500 bp, welk cDNA-fragment overeenkomt met een partiele base sequentie van het genomische RNA van het JE virus, welke partiele sequentie begint vanaf het 5'-uiteinde van het genomische RNA en zich uitstrekt tot een 20 positie van ongeveer 2500 bp. Het cDNA fragment wordt aangeduid als kloon S22. De base sequentie van de kloon S22 en de aminozuur sequentie waarvoor door de base sequentie wordt gecodeerd, werden vergeleken met de base sequenties van het genomische RNA van twee andere flavivirussen dan JE virus, 25 namelijk gele koorts virus en West-Nijl virus, en de amino-zuursequentie, waarvoor door het genomische RNA wordt gecodeerd, welke sequenties zijn beschreven in Science, 229, 1985, 726 en Virology, 147,(1985) 264. Gevonden werd dat de kloon S22 het DNA-gebied bevatte, coderend voor V3 proteïne 30 van het Japanse encefalitis virus.

De resultaten worden getoond in fig. 2a tot 2f. De recombinant vector, die de kloon S22 droeg werd aangeduid als plasmide pS22 (zie fig.3). De Escherichia coli, bevattende de recombinant vector die de kloon S22 draagt, werd aangeduid 35 als E. coli stam JM83/pS22 en gedeponeerd bij het Fermentation Research Institute onder Accession No.FERM BP-1074.

ISO 3017 · -- i X- · -24-

Trap 5 (constructie van een expressieplasmide, dat een V3 proteïne gene draagt)

Het plasmide pS22, dat de DNA fragment kloon S22 draagt, heeft een Mlul plaats bij 49 bp bovenstrooms van het 5'-uiteinde van het V3 proteïne gene en heeft een SphI-plaats 5 bij 7 bp bovenstrooms van het 3'-uiteinde van het gene.

Het plasmide van pS22 werd afgescheiden van E. coli stam JM83/pS22 op nagenoeg deselfde wijze als beschreven in trap 4 en opgelost in een oplossing? bevattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl en 7 mM MgCl2· Aan de aldus verkregen oplos-10 sing werden restrictie enzymen Mlul en EcoRI toegevoegd, gevolgd door incubatie bij 37°C gedurende 2 uren ter klieving van twee plaatsen, nl. Mlul plaats en de EcoRI-plaats van het plasmide, welke EcoRI plaats zich verder stroomopwaarts van het 51-uiteinde van het V3 proteïne gene bevond dan de Mlul-15 plaats. Na de klieving werd het mengsel onderworpen aan extractie door fenol en precipitatie door ethanol ter winning van een DNA. Het DNA werd opgelost in de bovengenoemde T4DNA polymerase buffer en 30 minuten op 37°C verwarmd ter omzetting van beide uiteinden van het DNA in stompe uiteinden. Het ver-20 kregen mengsel werd onderworpen aan extractie door fenol en precipitatie door ethanol ter winning van een DNA. Een Xhol verbinder werd geligateerd met elk van beide uiteinden van het DNA op nagenoeg dezelfde wijze als beschreven in trap 3.

E. coli stam JM83 werd met het verbinder geligateerde DNA ge-25 transformeerd ter verkrijging van een transformant.Door kweken van de transformant werd het verbinder-geligateerde DNA gekloond. Het gekloonde verbinder-geligateerde DNA werd aangeduid als S22X (zie fig.3). Het plasmide, dat het S22X droeg, werd aangeduid als plasmide pS22X.

30 Het plasmide pS22X, dat de kloon S22X droeg werd opgelost in een oplossing, bevattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl en 7 mM MgCl2, en gedurende 2 uur bij 37°C gedigereerd met restrictie-enzymen Sphl en BamHI.Winning van een DNA en omzetting van beide uiteinden van het DNA in stompe 35 uiteinden met behulp van‘het T4 DNA polymerase geschieden op 880 3 0-1 7 '* % -25- nagenoeg dezelfde wijze als hierboven beschreven. Een universele terminator (in de handel gébracht door Pharmacia Fine Chemicals Co., Zweden), werd aan het DNA geligateerd en het terminator geligateerde DNA werd gebruikt voor transformatie 5 van dè E.coli stam JM83. Het aldus verkregen DNA werd aangeduid als kloon S22XS (zie fig. 3).

Anderzijds werd als expressie vector gebruik gemaakt van vector YEpl33PCT. Deze vector werd als volgt geconstrueerd. Eerst werd met betrekking tot het plasmide YEpl3 (ATCC Acces-10' sion No.37115) het LEU2 gen-fragment daarvan, dat verkregen was door klieving met het Xhol en Sail van het plasmide, her-ligateerd aan het resterende plasmide fragment in omgekeerde richting om de Xhol en Sail plaatsen aan beide uiteinden van het gene-fragment te doen verdwijnen. In de tweede plaats 15 werd het BamHI-Sall fragment, aanwezig in het Tcr gene van het plasmide vervangen door een BamHI-Sall fragment met een lengte van ongeveer 650 bp dat de PH05-promotor bevatte, afgeleid van pPH05 (zie Nucl. Acid Res. 11 (1983) 1657).

In de derde plaats werd het aldus vervangen BamHI-Sall-fragment 20 met behulp van exonuclease Bal31 ontdaan vanaf de Sail plaats daarvan tot het 3’-uiteinde van de daarin aanwezige promotor.

In de vierde plaats werd een Xhol verbinder in de promotor gebracht aan het 3’-uiteinde daarvan ter invoering van een kloon-plaats. In de vijfde plaats werd een DNA-fragment met 25 een lengte van ongeveer 800 bp, bereid door ligatering van

Xhol en Sail verbinders op respectievelijk de HindlII en EcoRI plaatsen aan het HinduΙ-EcoRI fragment, bevattende een TRP1 terminator en een ARS (autonome replicatie sequentie), welk HindlII-EcoRI fragment was verkregen uit YRp7 (ATCC Accession 30 No.37060) ingebracht in de op de hierboven beschreven wijze bereide kloning vector, waarbij expressie vector YEpl33PCT werd verkregen.

Het cDNA van V3 proteïne gene werd ingebracht in de aldus verkregen expressievector. Toelichtenderwijze gesteld werd 35 pS22XS gedigereerd met restrictie enzymen Xhol en Sail, en ISO 3 0 17 r ï -26- het verkregen mengsel werd onderworpen aan agarosegel elektroforese ter winning van een DNA-fragment met een mole-cuullengte van ongeveer 1600 bp. Het gewonnen DNA-fragment werd geligateerd aan de expressie vector YEpl33PCT op de 5 Xhol-plaats daarvan. E. coli stam JM83 werd met het resulterende plasmide getransformeerd onder vorming van een transformant. De transformant werd geïsoleerd en gekweekt in L-medium (1 gew./vol.% bactotrypton, 0,5'gew./val.% gistextract, 0,5 gew./vol.% natriumchloride, 25 microgram/ml ampicilline,.

1,0 pH 7 ,.2-7,4) . Het plasmide werd uit de transformant geëxtraheerd volgens de hierboven genoemde alkali-extractiemethode. Vervolgens werd de richting, waarin het DNA-fragment, dat het V3 gene bevatte, was geligateerd door. het YEpl33PCT in het geëxtraheerde plasmide bevestigd door digerering van het 15 plasmide met diverse restrictie-enzymen en onderwerping van het digereringsmengsel aan agarosegel elektroforese. Het plasmide werd aangeduid als plasmide pJEV3 (zie fig.4). Gist werd met het plasmide getransformeerd en gekweekt.Produktie van het V3 proteïne in de geïncubeerde gist werd bevestigd volgens de 20 ELISA methode. Er werdén diverse proeven uitgevoerd voor de reconstructie van het plasmide pJEV3 ter verhoging van de produktie-efficiency van het V3 proteïne.De resultaten worden in fig. 5 getoond.In het bijzonder werd het pJEV3 DNA gedigereerd met restrictie-enzyme Xhol en beide uiteinden van het 25. gedigereerde DNA werden met behulp van T4DNA polymerase omgezet. in stompe uiteinden. Het verkregen DNA werd gedigereerd met- restrictie-enzyme BamHI en onderworpen aan agarosegel elek- troforese ter winning van een DNA-fragment met een lengte van 13.000 bp. Dit DNA komt overeen met het pJEV3 zonder het PH05 • 30 promotor gebied. Anderzijds werd ter benutting van het trans-latie-initi'êringseodön ATG van het PH05 structurele gene pPHOS gedigereerd met restrictie-enzymen BamHI en Dral, en werd het gedigereerde mengsel onderworpen aan agarosegel elektroforese ter winning van een 550 bp lang DNA-fragment 35 van het PH05 promotorgebied. Het bovengenoemde DNA fragment met een lengte van 13.000 bp werd aan dit DNA fragment met 160 3 0 1 7 -i *· -27- een lengte van 550 bp geligateerd. E. coli stam JM83 werd met het geligateerde . DNA getransformeerd en gekweekt om het geligateerde DNA te klonen. Het resulterende gekloonde DNA werd aangeduid als plasmide pJMl05. Het stroomschema van fig.4 5 toont de procedures voor de bereiding van pJM105.

Het gebruik van het aldus gekloonde pJM105_;leidt tot de produktie van een polypeptide, bestaande uit 519 aminozuren en met een zodanige aminozuursequentie, dat de volgende aminozuren achtereenvolgens zijn gebonden in de volgorde van; 10 (a) twee aminozuren, nl. Met-Phe-, afgeleid van PH05; (b) twee aminozuren, nl. -Ser-Arg-, afgeleid van het gedeelte tussen de PH05 promotor en het onderstaand genoemde cDNA van VI proteine gene;

(c) 16 aminozuren, nl. -Arg-Val-Val-Phe-Thr-Ile-Leu-15 Leu-Leu-Leu-Val-Ala-Pro-Ala-Tyr-Ser-, afgeleid van het cDNA

van VI proteine gene, dat in het genomische ENA van JE virus stroomopwaarts van het V8 proteine gene is gelegen? (d) 498 aminozuren afgeleid van het cDNA van V3 proteine en met een zodanige aminozuur, .sequentie, dat 2 aminozu- 20 ren, nl. -His-Ala, zijn verwijderd uit het C-einde van de aminozuursequentie voorgesteld door formule (1); en (e) een aminozuur, nl. -Ala, afkomstig van de universele terminator.

Trap 6 (transformatie van gist met het expressie pias-25. mide pJM105 en isolering van de getransformeerde gist),

De gist Sacchoromyces cerevisiae stam SHY4 (ATCC Accession No. 44772) werd met het expressie plasmide pJM105 getransformeerd volgens de alkalikationmethode. Toelichtenderwijze gesteld werd de gist gekweekt in YPD medium (2 gew./vol.% bacto-30 pepton, 1 gew./v©l.% gistextract, 2 gew./vol.% dextrose),waarna 5 ml van de cultuur gedurende 5 minuten werd gecentrifugeerd bij 2500 toeren per minuut om de cellen te oogsten. De cellen werden gesuspendeerd in 5 ml TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA), en gecentrifugeerd om de cellen te oog-35 sten. De cellen werden hersuspendeerd in 0,6 ml TE buffer.

Aan 0,5 ml van de suspensie werd 0,5 ml 0,2 M lithiumacetaat toegevoegd, waarna de suspensie gedurende 60 minuten bij 30°C werd geïncubeerd. Daarna werd 8 microliter van het plasmide .

§603017 % ï; -28- DNA toegevoegd aan 0,1 ml van de cultuur, gevolgd door 30 min incubatie bij 30°C. Aan de resulterende cultuur werd 0,1 ml 70 gew,/vol.% polyethyleenglycol 4000 toegevoegd, gevolgd door 60 min incubatie bij 30°C. Verder werd 2 ml gedestilleerd 5 water aan de cultuur toegevoegd, gevolgd door 5 minuten centrifugeren bij 2500 toeren per minuut voor het oogsten van > cellen. De cellen werden opnieuw gesuspendeerd in een kleine hoeveelheid water, geënt aan 1agarmedium (0,67 gewicht/volume % bactogist stikstofbase aminozuurvrij (in de handel gebracht 10.? door Difco· Co., USA) , 2 gew./ vol.% dextrose, 20 microgram/ml uracil, 20 microgram/ml L-tryptophan, 20 microgram/ml L-his-tidine, 2 gew./vol.% agar)j dat een selectief medium is, dat geen leucine bevat, en bij 30°C geïncubeerd. De door incubatie gevormde kolonie werd geïsoleerd ter verkrijging van een 15 getransformeerde gist. De getransformeerde gist werd aangeduid als SHY4/pJMl05.

Trap 7 (incubatie van de getransformeerde gist en extractie van het antigen)»

De getransformeerde gist -SHY4/pJMl05. werd geënt aan 20 Burkholder medium (een volkomen synthetisch medium, bevattende 1,5 g/1 monobasisch kaliumfosfaat (zie Am.J.Botany, 30(1943) 206, en gedurende 24 uur onder schudden bij 30°C geïncubeerd. Na de incubatie werd de cultuur 5 minuten gecentrifugeerd bij 2500 toeren per minuut voor het oogsten van cellen.

25 De cellens werden eenmaal gewassen met gedestilleerd water, geënt aan Burkholder medium, dat 1,5 g/liter kaliumchloride in plaats van het monobasische kaliumfosfaat bevatte, gevolgd door 48 uur incubatie bij 30°C onder schudden. Na de incubatie werden de cellen geoogst door centrifugeren, gewassen 30 en opnieuw gesuspendeerd in 0,01 M fosfaatbuffer (pH 9,0).

Aan de suspensie werden glasparels toegevoegd, waarna de suspensie krachtig werd geschud om de cellen te breken. De verkregen suspensie werd 10 minuten gecentrifugeerd bij 10.000 toeren per minuut, waarna de bovenstaande, vloeistof werd af-35 gescheiden. Op deze wijze werd een gistextract verkregen.

Trap 8 (Antigenproduktie-efficiency van de getransformeerde gist).

De kwantitatieve bepaling van het antigen in het gist- S 6 0 3 0 1.7 .

£. £ -29- extract geschiedde volgens de ELISA-methode. De ELISA-titer werd bepaald volgens de sandwich-methode met als vangend an-tilichaam het gezuiverde IgG, verkregen uit het serum van een muis, die met een overmaat Japans encejdalitis virus (Nakayama 5 stam)was geïmmuniseerd en als ontdekkend antilichaam het MWPO (mierikswortelperoxydase)-geconjugeerde anti-Japans encefalitis V3 eiwit monoklonale antilichaam (zie J.Virol.45 (1983) 124). Bij de uitvoering van de bepaling van de ELISA-titer werd de kleurreactie ontwikkeld door ö-fenyleendiamine 10.'· en werd de absorptie bij 420 nm gemeten. De ELISA-antigen titer van een proefmonster werd bepaald met behulp van een referentie Japans enc^telitis virus-antigen R-181 (National Institute of Health/Japan) als standaard van 100 eenheden.

De resultaten zijn vermeld in tabel A. Bevestigd werd dat 15 de getransformeerde gist SHY4/pJM105 het antigen volgens de uitvinding efficient produceerde.

Tabel A

Incubatie: Celpopulatie/ml Antigen volgens de periode (xlO6) uitvinding 5 (uur)_ - (ELISA antigen titer) 0 6/1 2/4 5 16 30 10 43 27 18 63 37 10 24 71 57 30 72 61 48 58 81 R-181 1) 100 1) Referentie Japanese encephalitis antigen 15 lot 181 · -aBmc— _· 85Ö 3 01 7

X X

-30- »

Trap 9 (Identificatie en molecuulgewichtsbepalïng van het antigen, geproduceerd door de getransformeerde gist SHY4/pJMl05 volgens de Westerse vloeitechniek)

Het antigenextract van de gist werd.gezuiverd door 20 uur 5 centrifugeren óp 20-30 gew./gew.% sucrosegradiënt bij 21000 toeren per minuut* De fractie, die een gezuiverd antigen volgens de uitvinding bevatte, werd in 1 gew,/vol.% 2-mercapto-ethanol/125 mM Tris-HCl (pH 6,8) gebracht, 20 minuten op kamertemperatuur gehouden en onderworpen aan elektroforese 10 op 10% polyacrylamidegel. Het gel werd verwijderd en het proteine op het gel werd afgevloeid op een nitrocellulose-membraan met behulp van de Transhlotcel, in de handel gebracht door Bio-RAD Co., U.S.A. De verkregen nitrocellulosefilm werd blootgesteld aan reactie met het bovengenoemde anti-Japans 15 encephalitis virus V3 monoklonaal antilichaam en vervolgens aan reactie met-een MWPO-geconjugeerd anti-muis IgG geit IgG.

De kleurreactie werd ontwikkeld door. 4-chloorindonaftol.Aldus werd·de identificatie van het antigen verricht. Fig.6 toont de reactie tussen een proteine met een molecuulgewicht van 20 ongeveer 53 KD (kilodalton) en het anti-V3 monoklonale antilichaam. Daar het molecuulgewicht in overeenstemming is met het berekende uit de base sequentie coderend voor een peptide, dat de aminozuursequentie zoals vermeld in trap 5 bevat, werd het proteine geïdentificeerd als een antigen, dat een zoda-25 nige aminozuur-sequentie bevat, dat de eerste en tweede aminozuren, geteld vanaf het C-einde van de aminozuur-sequentie van het V3 proteïne zijn verwijderd.

Trap 10 (Immunogeniciteit van het onderhavige antigen, geproduceerd door de getransformeerde gist).

30 Het in trap 7 verkregen antigen-extract werd 20 uur op

20-50 gew./gew.% sucrosegradiënt gecentrifugeerd bij 21000 toeren per minuut ter verkrijging van een partieel gezuiverd antigen. Het antigen werd vermengd met aluminiumhydroxyde als hulpstof ter verkrijging van een antigen-oplossing. De antigen-35 oplossing werd in hoeveelheden van 4, 20 en 100 (ELISA antigen titer)- intraperitoneaal geïnjecteerd in in 4 weken oude ddY

860 3 0 1 7 -31- muizen teneinde ze te immuniseren. Een week later werden de muizen geïmmuniseerd door injectie van het antigen-extract in dezelfde hoeveelheid. Nog een week later werd van elk van de muizen het bloed verzameld. In het bloed werd de 5 ELISA antilichaamtiter tegen het Japanse encephalitis virus bepaald volgens de eerder genoemde ELISA-methode en werd de neutraliserende antilichaam titer tegen het Japanse encephalitis virus bepaald volgens de eerder genoemde 50% plak-reductiemethode. De resultaten zijn vermeld in tabel B.

10 Zoals in de tabel getoond werd de ELISA antilichaam titer van het antigen volgens de ELISA-methode gevonden, maar de neutraliserende antilichaam titer niet.

TABEL B

—“ .......- !' ' ' ' " 1 'I ....... . ' " 1 I ' ' , ... Antigen ELISA anti \ Neutraliserende . Hulpstof titer ,, titej_ antilicnaair.

titer ^ 100 100 < 1 : 10

Al(OH)3 20 51 ” 0.2mg /dos is 4 64 " 100 100 < 1 : 10 (-) 20 54 4 20 " * i—---«—-------:----—— . R-1813* 4 200 1 2 3 .-060 3 0 1 7 ELISA antigen titer 2 volgens de 50% plaque reductiemethode 3

Referentie Japans encephalitis antigen lot 181 .· -32- J· J;

Trap 11 (Immunogeniciteit van het antigeen geproduceerd door de getransformeerde gist)

Een antigenoplossing, die op de in trap 10' beschreven wijze was bereid werd 6 maal met intervallen van 2 7 dagen (le,8e, 15e,22e,29een 36e dag), geïnjecteerd in de buikholte van elk van de muizen. Op de 43e dag werd het bloed van elk van de muizen verzameld. De neutraliserende antilichaam titer van het bloed tegen JE virus werd bepaald,, waarbij als het JE-virus de Nakayamastam, Beijing stam, en. JaOArS982 stam werden gebruikt.De resultaten zijn vermeld in tabel £. Zoals in de tabel wordt getoond, werd met betrekking tot alle gebruikte stammen van JE-virus het neutraliserende antilichaam ontdekt.

Tabel C

--—|---;-;-;--ΓΤr~-

Hulpstof Neutraliserende antilichaamtiter_

Antigen Nakayama Beijing JaOArS982 titer ^ s.taia stam stam 100 1 :117 1 :48 1 :59

Al(OH)3 20 < 1:10 < 1:10 1:11 0,2 mg, / dos. 4 " " <1:10 — — ~TT*TÓ < 1:10 - T7Ï1 {-) 20 " " <1:10 £ Μ Η 1« R-18T1 4 1:3500 1:70 1:370

1), 2), 3): Zoals vermeld in tabel B

8605017 ' . -33- , -£ *

Voorbeeld II

De E. coli stam JM83/pS22, verkregen in trap 4 van voorbeeld I werd gekweekt ter verkrijging van cellen van de stam. Oit de aldus verkregen cellen werd het plasmide pS22 2 DNA geïsoleerd volgens de alkali-extractiemethode,zoals beschreven in trap 4 van voorbeeld I. Het geïsoleerde jfesmide DNA werd opgelost in een waterige oplossing, bevattende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) , 100 mM NaCl en 7 mM MgC^. Aan het verkregen mengsel werden restrictie-enzymen Mlul en Sphl, toegevoegd, gevolgd door 2 uur incubatie bij 37°C ter dige-*rering van het plasmide DNA. Het verkregen mengsel werd onderworpen aan agarose gel elektroforese. Uit het resulterende agarosegel werden DNA fragmenten met een molecuullengte van ongeveer 1500 bp gewonnen die een base sequentie code-rend voor JEV3 proteïne bevatten. De DNA fragmenten werden gedigereerd met behulp van restrictie-enzymen op praktisch dezelfde wijze als hierboven beschreven, behalve dat restrictie-enzymen Nrul en Ddel werden gebruikt in plaats van de restrictie-enzymen Mlul en Sphl, ter verkrijging van DNA 2q digesten. De aldus verkregen DNA digesten werden onderworpen aan agarose gel elektrof orese·. Uit het resulterende agarosegel werden DNA-fragmenten met een molecuullengte van ongeveer 350 bp gewonnen. De gewonnen DNA-fragmenten werden gelegateerd aan de in trap 3 van voorbeeld I verkregen vector 25· YEpl33PCT op de Xhol plaats daarvan met behulp van eèn Xhol verbinder ter verkrijging van recombinanten.De recombinanten werden overgebracht in cellen van E. coll stam DHT ter verkrijging, van trans formant en. De keuze van de trans foment, die het beoogde DNA fragment van ongeveer 350 bp bevatte 30 uit de op de beschreven wijze verkregen transformanten geschiedde volgens de kolonie hybridiseringsmethode waarbij 32 als sonde P-gemerkt DNA coderend voor JEV3-proteine werd 32 gebruikt. Het P-gemerkte DNA werd als volgt bereid.

Eerst werd het in trap 5 van voorbeeld I verkregen plasmide 25 pS22XS gedigereerd met restrictie-enzymen Xhol en Sail, waarna het verkregen mengsel werd onderworpen aan agarosegel elektroforese ter winning van een DNA fragment met een 8603017 Λ· ΐ -34- mo 1 ecuuUsngte van ongeveer 1600 bp. Vervolgens werd het 32 gewonnen DNA--fragment gemerkt met P door middel van nick- translatie met behulp van een nick translatiekit N.5000, in de handel gebracht door Amersham Japan Limited. Op deze 32 5 ' wijze werd het bovengenoemde P-gemerkt DNA verkregen.

De aldus gekozen transformant werd gekweekt ter verkrijging van een kloon van de transformant. Uit de kloon werden plasmiden geïsoleerd volgens de alkali-extractiemethode, zoals hierboven vermeld. Met de aldus verkregen plasmiden 10 werden cellen van de giststam SHY4 getransformeerd. De resulterende cellen werden gekweekt op het SD agar medium, zoals beschreven in trap 6 van Voorbeeld I.De door de kweek gevormde kolonie werd geïsoleerd ter verkrijging van een getransformeerde gist. .

15 De getransformeerde gist werd gebruikt voor de pro- dukti.e van een polypeptide, omvattende een gedeelte van de aminozuursequentie van formule (1) , welk gedeelte bestaat uit hét 375e tot het 456e aminozuur, geteld vanaf het N-einde van de aminozuursequentie met formule (1). Op nagenoeg de-20 zelfde wijze als in trap 7 van voorbeeld I werd de getransformeerde gist gekweekt ter verkrijging van gistcellen,waarna uit de aldus verkregen gistcellen een gistextract werd verkregen.

Een monster van het verkregen gistextract werd onder-25 worpen aan; de hemagglutinering-inhibiteringsproef(HAI) volgens de methode van Clarke en Casals (American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, Ί_ (1953) 561-573 ) onder toepassing van 4 monoklonale antilichamen resp. tegen 4 antigen determinantgebieden (groepen 1 tot 4) van JEV3 proteïne 30 (Journal of Virology, 45 (1) (1983) 124-132. De resultaten zijn vermeld in tabel D. Deze resultaten tonen net gistextract van de getransformeerde gist een stof bevat, die zich specifiek verbindt met het monoklonale antilichaam tegen de antigen determinantgebiedgroep 4 van het JEV3 antigen. Het plasmide 35 in de getransformeerde gist werd aangeduid als pV3G4-96 en de getransformeerde gist werd aangeduid als giststam 1603017 -35-

Ar' 4 SHY4/pV3G4-96.

Het gistextract werd op praktisch dezelfde wijze als in trap 9 van voorbeeld I gezuiverd ter verkrijging van een gezuiverd antigen volgens de uitvinding.

5 Voorbeeld III

Nagenoeg dezelfde procedures als in voorbeeld II werden herhaald ter verkrijging van DNA-fragmenten met een mole-cuullengte van ongeveer 1500 bp, die een base sequentie coderend voor JEV3 proteïne bevatten, De DNA-fragmenten werden 10 achtereenvolgens gedigereerd met restrictie-enzymen Hpall,

Bgl31 en Stul, waarbij DNA-digesten werden verkregen. De DNA-digesten werden onderworpen aan agarosegel-elektroforese ter winning van DNA-fragmenten met molecuullengten van ongeveer 700 tot 800 bp. De gewonnen DNA-fragmenten werden aan de 15 vector YEpl33PCT op de Xhol-plaats daarvan geligateerd onder toepassing van een Xhol-verbinder ter verkrijging van recombinanten, De recombinanten werden overgebracht in cellen van E.coli stam DH1 ter verkrijging van transformanten, De keuze van de transformant , die de beoogde DNA-fragmenten van on-20 geveer 700 tot 800 bp bevatte, uit de verkregen transformanten geschiedde volgens de kolonie hybridiseringsmethode op nagenoeg dezelfde wijze als in voorbeeld II. Vervolgens werd de gekozen transformant gekweekt ter verkrijging.van een kloon van de transformant. Uit" de kloon werden plasmiden geïsoleerd 25 volgens de alkali-extractiemethode, zoals eerder.genoemd.Met de aldus verkregen plasmiden werden cellen van de giststand SHY4 getransformeerd. De verkregen cellen werden gekweekt op het SD-agarmedium, zoals beschreven in trap 6 van voorbeeld I. De gevormde kolonie werd geïsoleerd ter verkrijging van een 30 getransformeerde gist.

De getransformeerde gist werd gebruikt voor de bereiding van een polypeptide, omvattende een gedeelte van de aminozuur-sequentie met formule (1), welk gedeelte bestond uit 45e tot het 159e aminozuur, geteld vanaf het N-einde van 35 de aminozuursequentie met formule (I). Op analoge wijze als in trap 7 van voorbeeld I werd de getransformeerde gist gekweekt ter verkrijging van gistcellen, waarna uit de verkregen 1603017 Ï. £ - ' j? • -36- gistcellen een gistextract werd verkregen.

Een monster van het gistextract werd op dezelfde wijze als beschreven in voorbeeld II onderworpen aan de HAI-proef. De resultaten zijn vermeld in tabel D. De resul-5 taten tonen dat het gistextract van de getransformeerde gist een stof bevatte, die zich specifiek verbindt met het mono-klonale antilichaam tegen de antigen determinantgebiedgroep 1 van JEV3 antigen. Het plasmide in de getransformeerde gist werd aangeduid als pV3G1-38 en de getransformeerde gist 10 werd aangeduid als giststam SHY4/pV3Gl-38.

Het verkregen gistextract werd op nagenoeg dezelfde wijze als in trap 9 van voorbeeld I gezuiverd ter verkrijging van een gezuiverd antigen volgens de uitvinding.

Anderzijds werd een gistextract op nagenoeg dezelfde 15 wijze als in trap 7 van voorbeeld I een gistextract verkregen uit cellen van de giststam SHY4, die geen plasmide bevatten. Het aldus verkregen gistextract werd gebruikt als controle en wordt op dezelfde wijze als eerder beschreven onderworpen aan de HAI-proef. De resultaten zijn eveneens 20 in Tabel D vermeld.

-___Tabel D _;__ ‘ · HAI titer

Giststam -

Monoklonaal antilichaam 1) groep __1 2_3_4

Voorbeeld II SHY4/pV3G4-96 <10 <10 £10 10240

Voorbeeld III SHY4/pV3G1-38 5120 <10 <10 10 25 Controle SHY4 <10 <10 <10 10

Voetnoot: 1) de groepnummers van de monoklonale antilichaam-groep komen overeen met die.van groepen van de antigen deter-'minantgebieden, vermeld in Journal of Virology,45 (1)(1983) 124-132.

860-301 7