FR2599626A1 - Antigene du flavivirus, procede pour sa production et vaccin le contenant - Google Patents

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Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN ANTIGENE. SELON L'INVENTION, IL COMPREND AU MOINS UNE PARTIE DE LA SEQUENCE D'ACIDES AMINES DE L'ANTIGENE D'UN FLAVIVIRUS, CETTE PARTIE CONTENANT AU MOINS L'UN DES EPITOPES DE L'ANTIGENE DE FLAVIVIRUS. L'ANTIGENE PEUT ETRE PRODUIT PAR TECHNIQUE D'ADN RECOMBINANT. LE DESSIN JOINT MONTRE UN DIAGRAMME INDIQUANT LA CONSTRUCTION DU PLASMIDE PS22XS A PARTIR DE PS22. LA PRESENTE INVENTION S'APPLIQUE NOTAMMENT A LA PRODUCTION D'UN VACCIN EFFICACE CONTRE L'ENCEPHALITE DU JAPON.

Description

La présente invention se rapporte à un antigène de flavivirus. Plus
particulièrement, la présente invention concerne un antigène qui contient au moins un épitope qui est réactif à un anticorps anti-flavivirus. L'antigène de la présente invention a une haute pureté et peut être
utilisé comme vaccin contre l'encéphalite du Japon.
L'antigène de la présente invention peut être produit en toute sécurité à grande échelle et à un faible prix.
Par ailleurs, du fait de sa haute antigénicité spécifique, 10 l'antigène de la présente invention peut être avantageusement utilisé comme réactif de diagnostic pour des anticorps anti-flavivirus et peut également être utilisé pour la
préparation d'anticorps anti-flavivirus.
L'encéphalite du Japon (souvent appelée ci-après JE) 15 est une maladie infectieuse provoquée par l'infection du virus JE, et la mortalité due à la maladie est élevée et la maladie produit des séquelles graves. Au Japon, le nombre de patients souffrant de JE a notamment diminué ces dernières années. Cependant, la maladie règne quelquefois 20 dans les pays d'Asie de l'Est, du Sud-Est et du Sud. Cela pose un problème social, qui n'est pas limité aux zones o règne la maladie mais se développe actuellement en un problème international parce qu'il y a de nombreuses visites et échanges entre les pays. Le virus JE appartient 25 au genre Flavivirus de la famille Togaviridae. Selon la taxonomie des virus, environ 50 virus comprenant le virus JE appartiennent au genre Flavivirus. Les virus appartenant
au genre Flavivirus sont simplement appelés flavivirus.
Jusqu'à maintenant, diverses études ont été faites relati30 vement à plusieurs flavivirus, c'est-à-dire le virus JE, le virus de la fièvre jaune, le virus du Nil de l'Ouest, le virus de la dengue et analogues. On sait que la structure d'une particule de flavivirus comprend trois types de protéines de structure, c'est-à-dire une glycoprotéine E 35 (appelée quelquefois antigène V3 et ayant un poids moléculaire d'environ 53.000) qui constitue une portion principale de l'enveloppe de la particule de flavivirus; une petite protéine M (appelée quelquefois antigène VI et ayant un poids moléculaire d'environ 8.700) qui est présente dans l'enveloppe; et une protéine C (quelquefois appelée antigène V2 et ayant un poids moléculaire d'environ 13.500) qui constitue le nucléocapside de la particule de flavivirus. Dans la particule de flavivirus, il y a un génome viral qui comprend un ARN monocaténaire ayant un
poids moléculaire d'environ 3,8 x 106 à environ 4,2 x 106.
Le génome viral contient des gènes codant respectivement 10 pour les trois types ci-dessus mentionnés de protéines de structure. Parmi les trois types ci-dessus mentionnés de - protéines, la protéine E (appelée ci-après "antigène V3") joue un rôle important dans l'étape initiale de l'infection par le virus. Par conséquent, on peut s'attendre à l'utilisation de l'antigène V3 pour la prévention ou le diagnostic de l'infection du virus. Diverses études de l'antigène V3 ont été faites. Par exemple, l'activité de l'antisér. n neutralisant l'antigène V3 et l'activité d'hémagglutination, l'activité de fusion des cellules infectées, l'activité hémolytique etc., de l'antigène V3 ont été mesurées. Il y a une littérature rapportant qu'au moins neuf épitopes sont présents dans l'antigène V3. On sait également que les flavivirus de différentes espèces
ont des antigènes qui sont en proche rapport ou semblables 25 les uns aux autres.
Traditionnellement, l'antigène V3 du virus JE a été produit comme suit. En utilisant un cerveau de souris ou des cellules somatiques dérivées d'un animal en tant qu'hôte de culture pour la culture du virus, des virus pathogènes d'ensemencement sont cultivés puis toutes les
particules du virus sont séparées de la culture. Subséquem.
ment, par un traitement physico-chimique, toutes les particules séparées du virus sont scindées pour obtenir un mélange d'antigènes V1, V2 et V3, l'ARN du virus et 35 analogues, avec ensuite isolement et purification de l'antigène V3. Un mode conventionnel tel que mentionné
ci-dessus présente les inconvénients suivants.
3 2599626
(1) La probabilité de risques biologiques est élevée du fait de la manipulation directe des virus pathogènes. (2) Le prix de production est élevé parce que - 5 les matières premières, les procédés de production et les
équipements sont très compliqués.
(3) Un antigène V3 très purifié est extrêmement difficile à obtenir parce qu'il y a une forte possibilité que l'antigène V3 soit contaminé d'impuretés dérivées de
l'hôte de culture et du milieu de culture.
Les présents inventeurs ont effectué des études intensives pour résoudre les problèmes ci-dessus mentionnés. Par suite, ils ont réussi à cloner un ADNc codant pour l'antigène V3 du virus JE, qui joue un rôle important dans l'infection du virus JE, et à déterminer la séquence
des-bases de l'ADNc qui code pour l'antigène V3 du virus JE.
Par ailleurs, on a trouvé de manière inattendue que lorsque l'ADNc est soumis à une expression par technique d'ADN recombinant, une protéine (appelée ci-après "protéine V3") ayant une séquence d'acides aminés correspondant à l'antigène V3 du virus JE et ayant la même antigénicité que celle du virus JE peut être obtenue en toute sécurité et de manière stable à grande échelle..La présente invention a été accomplie en se basant sur les nouvelles
découvertes ci-dessus mentionnées.
La présente invention a par conséquent pour objet un nouvel antigène de flavivirus extrêmement efficace comme vaccin JE et pouvant être produit en toute sécurité à
grande échelle et à faible prix.
L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci
apparaîtront plus clairement au cours de la description
explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple illustrant plusieurs modes de réalisation de l'invention et dans lesquels:
4 2599626
- la figure 1 montre un diagramme indiquant la construction de pS22XS à partir de pS22; - la figure 2 montre un diagramme indiquant la construction de pJM105; - la figure 3 montre des structures de divers plasmides reconstruits de pJEV3 et une structure de pJM105; et - la figure 4 est une illustration des résultats
de l'électrophorèse pour l'identification de la protéine V3 10 du virus JE.
Par ailleurs, sur les tableaux Ia à Ii qui suivent, les séquences sont agencées dans l'ordre suivant à partir de la rangée supérieure jusqu'à la rangée inférieure: (1) séquence des bases codant pour la protéine V3 15 du virus JE (2) séquence d'acides aminés de la protéine V3 du virus JE déduite de la séquence des bases (1) mentionnée ci-dessus (3) séquence des bases codant pour la protéine V3 20 du virus du Nil de l'Ouest (4) séquence d'acides aminés de la protéine V3 du virus du Nil de l'Ouest déduite de la séquence des bases (3) mentionnée ci-dessus (5) séquence des bases codant pour la protéine V3 25 du virus de la fièvre jaune (6) séquence d'acides aminés de la protéine V3 du virus de la fièvre jaune déduite de la séquence des
-bases (5) mentionnée ci-dessus.
Par ailleurs, sur ces tableaux, le symbole "***" 30 signifie que cette portion de la séquence des bases ou de la séquence d'acides aminés est le même codon ou acide aminé que celui de la séquence des bases ou de la séquence d'acides aminés de la protéine JEV3 à la portion correspondante; et le symbole "---" signifie que cette portion de la séquence des bases ou de la séquence d'acides aminés
est nulle et par conséquent que deux codons ou acides aminés adjacents à ce symbole,sur ses deux côtés, sont directement connectés.
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D1V DD991 DD1 all dJl JaS D1V DD991 1D1 06E1 Essentiellement, selon la présente invention, on prévoit un antigène comprenant au moins une partie d'une séquence d'acides aminés représentée par la formule (I) qui suit: Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala 10 Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly 15 Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu 20 Asn His Gly Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe Thr Ile Thr Pro Asn Ala Pro Ser Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala 25 Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro-Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Cys Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gln 30 Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Met Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr 35 Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Ser Asp Set Val Val Gly Val Ala Leu Val Ser Tyr Gln Ile Ser Thr Leu Lys Gly Asp Gly Gly Val His Thr Leu Gln Gly Met Gly Ala Leu Leu Val Val Ile Glu Gly Pro Cys Ala Ser Leu Arg Leu Val Thr Set Ser Glu Met Glu Ile Val Val Asn His His Leu Gly Lys Gly Ala Gin Thr:Ala Trp Val Phe Asn Gln Val Phe Phe Gly Gly Leu Met Gly Val Asn Ala Ala Phe Leu Phe Leu Ala Leu Ser Tyr Lys Ile Pro Asn Asp Met Thr Val Asn Ala Asn Ser Pro Pro Phe Gly Arg Gly Trp His Lys Ala Phe Set Arg Leu Ala Asp Phe Gly Set Ile Gly Gly Gly Ala Met Ser Trp Ala Leu Leu Arg Asp Arg Ala Thr Gly Thr Asn Val -Ser Gly Ile Val Thr Pro Pro Phe Lys Leu Gly Asp Asp Lys Ala Gly Thr Thr Ala Leu Ser Ile Lys Ala Phe Arg Ile Thr Leu Trp Set Ile Gly Val His Ala
20..... (I)
dans laquelle Ala indique un résidu d'alanine, Arg un résidu d'arginine, Asn un résidu d'asparagine, Asp un résidu d'acide aspartique, Cys un résidu de cystéine, Gln un résidu de glutamine, Glu un résidu d'acide gluta25 mique, Gly un résidu de glycine, His un-résidu d'histidine, Ile un résidu d'isoleucihe, Lys un résidu de lysine, Leu un résidu de leucine, Met un résidu de méthionine, Phe un résidu de phénylalanine, Pro un résidu de proline, Ser un résidu de sérine, Thr un résidu de thréonine, Trp un résidu de tryptophane, Tyr un résidu de tyrosine et Val un résidu de valine, ladite partie contenant au moins un épitope qui
est réactif avec un anticorps anti-flavivirus.
De même selon la présente invention, on prévoit 35 un acide désoxyribonucléique qui comprend une séquence des bases codant pour un antigène comprenant au moins une partie d'une séquence d'acides aminés représentée par la formule (I) ci-dessus mentionnée, ladite partie contenant au moins un épitope qui
est réactif à un anticorps anti-flavivirus.
Par ailleurs, selon la présente invention, on prévoit un procédé de production d'un antigène comprenant au moins une partie d'une séquence d'acides aminés représentée par la formule (I) ci-dessus, ladite partie contenant au moins un épitope qui 10 est réactif à un anticorps antiflavivirus, qui comprend: (a) la ligature d'un acide désoxyribonucléique comprenant une séquence des bases codant pour ledit antigène à un vecteur d'expression réplicable pour obtenir 15 un ADN recombinant réplicable comprenant ledit acide désoxyribonucléique et ledit vecteur d'expression réplicable; (b) la transformation des cellules d'un microorganisme ou d'une culture de cellules par ledit ADN 20 recombinant réplicable pour former des transformants; (c) la sélection desdits transformants de cellules parentes du micro-organisme ou de la culture de cellules; (d) l'incubation desdits transformants, forçant 25 lesdits transformants à exprimer ledit acide désoxyribonucléique et à produire un antigène; et (e) l'isolement dudit antigène des transformants incubés. L'antigène de la présente invention comprend au moins une partie d'une séquence d'acides aminés représentée par la formule (I) ci-dessus mentionnée. La séquence d'acides aminés de la formule (I) correspond à la pleine
séquence d'acides aminés de l'antigène V3 du virus JE.
Le présent antigène peut comprendre la totalité de la 35 séquence d'acides aminés de la formule (I). L'antigène ayant la totalité de la séquence d'acides aminés de la
formule (I) sera appelé ci-après protéine JEV3.
Alternativement, le présent antigène peut comprendre une partie de la séquence d'acides aminés de la formule (I) tant que la partie contient au moins un épitope qui est
réactif à un anticorps anti-flavivirus.
"L'épitope" est un déterminant antigénique, ce qui signifie une structure dans un antigène qui détermine
la spécificité de la réaction. antigène-anticorps.
Comme partie de la séquence d'acides aminés de.
la formule (I), on peut mentionner, par exemple, une 10 partie correspondant à la séquence d'acides aminés du ème au 159ème. acide aminé en comptant à partir de l'extrémité N-terminale de la séquence d'acides aminés de la formule (I), une-partie correspondant à la séquence d'acides aminés du 375ème au 456ème acide aminé en 15 comptant à partir de l'extrémité N terminale de la séquence d'acides aminés de la formule (I), etc. L'antigène de la présente invention ayant la séquence d'acides aminés de la formule (I)(c'est-à-dire
la protéine JEV3) peut être préparé par un procédé 20 comprenant les étapes(1)à (9)mentionnées ci-dessous.
A l'étape (1), un ARN génomique est extrait du virus JE. A cette étape, des techniques habituelles conventionnelles comme une technique d'extraction au phénol
et analogues peuvent être utilisées.
A l'étape (2), un ADNc bicaténaire complémentaire de l'ARN du virus obtenu à l'étape (1) est préparé. A cette étape, on peut employer une méthode habituelle
conventionnelle o l'on utilise une transcriptase réverse.
A l'étape (3), l'ADNc est cloné et la séquence 30 des bases de l'ADNc cloné est déterminée. Comme vecteur pour le clonage, on peut utiliser tout vecteur connu comme des plasmides, ayant une adaptabilité à une cellule prokaryote comme Escherichia coli, Bacillus subtilis et analogues et des vecteurs dérivés de bactériophages comm-e 35 >- phage, T4 phages etanalogues. Dans cette étape, il est souhaitable de choisir une combinaison appropriée d'un
vecteur clonant et d'une cellule hôte.
A l'étape (4), un ADNc cloné contenant un gène codant pour la protéine JEV3 (que l'on appellera ci-après
"gène JEV3") est identifié.
Usuellement, les gènes de structure dérivés de cellules ont une séquence spécifique des bases dans la région de l'initiation et de la terminaison de la translation et les gènes régulateurs sont analogues en structure. Par conséquent, il est relativement facile de détecter et d'identifier les régions de tels gènes de structure. Par 10 ailleurs, dans le cas du gène JEV3, comme les régions de l'initiation et de la terminaison de la translation et les gènes régulateurs ne sont pas présents, il n'y a pas de séquence spécifique des bases utilisable comme
indice et par conséquent la détection et l'identification 15 des régions du gène JEV3 sont extrêmement difficiles.
Cependant, cette difficulté a été surmontée adroitement par les présents inventeurs. En effet, les présents inventeurs ont analysé la séquence des bases de l'ADNc cloné, ont exprimé l'ADNc cloné et ont effectué la détec20 tion et l'identification immunologiques du produit - exprimé et par ailleurs, ils ont comparé la séquence des bases de l'ADNc cloné à la séquence d'acides aminés déjà rapportée des protéines V3 et la séquence des bases des gènes par rapport aux gènes V3 du virus de la fièvre jeune 25 et du virus du Nil de l'Ouest pour ainsi déterminerla
séquence des bases de l'ADNc du gène JEV3.
Par suite, on a trouvé que le gène JEV3 avait une séquence des bases de la formule (II) suivante:
TTT AAT TGT CTG GGA ATG GGC AAT CGT GAC 30 TTC ATA GAA GGA GCC AGT GGA GCC ACT TGG
GTG GAC TTG GTG CTA GAA GGA GAT AGC TGC TTG ACA ATC ATG GCA AAC GAC AAA CCA ACA TTG GAC GTC CGC ATG ATT AAC ATC GAA GCT AGC CAA CTT GCT GAG GTC AGA AGT TAC TGC 35 TAT CAT GCT TCA GTC ACT GAC ATC TCG ACG
GTG GCT CGG TGC CCC ACG ACT GGA GAA GCT
15 20
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AAC TGC G A, Quu
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AGC ATT GAC ACA ACC AGC AAA GC'
CCA TTT CAT TCC AAT GAC CCA TAC CTG GCT GCG
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GTT CTC GTG TCA GAC GGC AAA GTT GAT GTT GGG GCG GTC TAC ATC ACG AAG GAC GGG
GAA GTG GGG CAG CGT TAC AGG GTC GTC CTC
TGC GAA GTT CAT GAG GGC AAA ATG AAT GTC GGC GCG CGG ACT GAG ATC AAC CTA GGA ACA GTC
AAC CAT AAT GCG CCT GGA AGT ATG CAT
CCC AGA GAG GCT CAG TAC CAC CTG TGT
CCG
ATT CCC AGC C TG TCC ATG GTG CAC GGC GCT GCC TTC
AAG CGA GC SA-i AGT AGC TAT CAA GGC T7 ACi GAT CST GGG GGA TGT GGA C77 T7C GGG AAG
ATC GGA TAT GCA TCG GAA GGA ACC AGG TGG AAC GCG CTT GOG
TCA CTG GCT ACA GCG
-GAA TGC
CTC GTG AGT GAA GTT
CAT AAG CAA TGG AAC
TGT GCA AAA ATT GGA AGA AAA TAC GAA ACC ACC ACT TCA GCS CAA AAG TTT ACA ATA ACC 2TC GTC ACG CTG CTG AAC ACT GTG GGG TCA GAA TGG TTT ACG TCC CCT AGA GAA CTC CAC GCC ACA GGG TCA CAG TTG GCA GGA AGC TCA GTG AAA TGT AGG CTG AAA GGC GAA AAA TTC GAC ACT GGC CTA TCC TAC AAA ATT CCG AAT GAC ATG ACA GTG AAC GCC AAC TCA CCC CCC TTC GGG AGG GGA TGG CAC AAA GCC TTT TCA AGA CTG GCA GAC TTT GGC TCC ATA GGA
TTC ACA GTT TCS GTT ATA GG^ GAC GAA AAG CAT
TCG CTC AAA GAA GCC AAG A I, G
AT^ ACA
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TCT ATT
ACC CCT AAG GGA GAC GCT ACA GCG TCC AAA
TCC ATC GCC GAA GGG ACA CTT TGT GCG TCA GAC AGC ATG CAG jGA ATC TTA AAA ACC TTC GGA GGG GTC CCC TI -1 TTC CTG GAC AAG GGA ACT TTG ATT GCC *; Lu 2599626
GIT CAC CAA G7G TII GGT GGT GCC TTC AGA ACA CC TT7 GGG GGA ATG 7C7.GG A7ACA CAA GGG CA AT3 GG7 GCC CIA C7A CC TGG ATG GGC GTC AAC GCA CGA GAC CGA ICA A7T 5 GCT TTG GCC TTC TTA GCC ACA GGA GGT 7GG
CTC GTG TTC TTA GCG ACC AAT GTG CAT GC.
(II) dans laquelle A représente un résidu d'acide désoxyadénylique, G un résidu d'acide désoxyguanylique, 10 C un résidu d'acide désoxycytidylique et T un résidu d'acide désoxythymidylique et les extrémités gauche et droite de la formule (II) représentent respectivement le côté du groupe 5'-hydroxyle et le cô6té du groupe 3'-hydroxyle. Selon la dégénêracion du code génétique, il est possible de substituer au moins une base de la séquence des bases d'un gène par un autre type de base sar.s provoquer de changement de la séquence des acides aminés du polypeptiae produit à partir ou gène. par consécuen:, l'ADN 20 codant pour la protéine JEV3 peut également avoir toute séquence des bases qui est échangée par subs:!:ut:on selon l: dgécénérazin du code génétique. Dans ce cas, la séquence des acides aminés déduite de la sécuence des bases obtenue par la substitution ci-dessus menionnée 25 est identique à ia séquence ces acides aminés ce la
formule (I) définie précédemment.
A l'étape (5), l'ADNc du gène JEV3 est lié à un
vecteur d'expression réplicable.
Dans cette étape, on prépare i'ADNc du gène JEV3 30 à partir de l'ADNc cloné obtenu à l'étape (4) et on le lie à un vecteur d'expression réplicable pour former un ADN recombinant réplicable. Comme vecteur d'expression réplicable utilisé dans cette étape, on peut menticnner tout vecteur connu tel que des plasmides d'expression, des vecteurs navettes d'expression et des vecteurs d'expression dérivés de virus tels que le virus de la vaccine et SV40,
21 2599626
qui ont une adaptabilité aux cellules hôtes à utiliser.
Une explication sera donnée ultérieurement concernant les
cellules hôtes.
La ligature de l'ADNc du gène JEV3 à un vecteur d'expression réplicable peut être effectuée par une méthode habituelle. Dans la mise en pratique de la ligature, il faut noter que, comme li'ADNc du gène JEV3 n'a pas de région pour l'initiation et la terminaison de la translation, il est nécessaire que l'ADNc soit complété d'ADN 10 ayant des séquences des bases correspondant à de telles régions. De ce point de vue, dans le cas o le vecteur d'expression à lier à l'ADNc contient-des séquences des bases correspondant à de telles régions, l'ADNc est lié au vecteur d'expression de manière que l'ADNc puisse être 15 exprimé en utilisant de telles régions. Par ailleurs, dans le cas o le vecteur d'expression à lier à l'ADNc ne contient pas les régions pour l'initiation et la terminaison
de la translation, l'ADNc est complété d'ADN qui ont des séquences des bases correspondant à de telles régions et 20 est lié à un vecteur d'expression.
Par ailleurs, un vecteur d'expression auquel doit être lié l'ADNc du gène JEV3 peut être modifié afin que: (1) l'antigénécité et l'immunogénicité d'un produit exprimé (protéine JEV3)soient améliorées; (2) la stabilité de l'ADNc du gène JEV3 dans un vecteur d'expression et dans une cellule hôte soit accrue; (3) le rendement de la protéine JEV3 produite par l'expression du gène soit accru; et (4) l'antigène JEV3 produit par l'expression du 30 gène dans une cellule hôte soit sécrété hors de la cellule hôte de manière que l'extraction et la purification de
l'antigène soient simplifiées.
Par ailleurs, poue effectuer la ligature de l'ADNc du gène JEV3 à un vecteur d'expression, si on le souhaite, 35 l'ADNc du gène JEV3 peut être lié au vecteur d'expression
par un linker approprié.
L'ADNc cloné obtenu à l'étape (4) ci-dessus contient quelquefois, en plus de la séquence des bases codant pour la protéine JEV3, une séquence de bases dérivée d'un gène du virus JE autre que le gène JEV3. Dans un 5 tel cas, la séquence des bases autre que celle codant pour la protéine JEV3 peut être éliminée de l'ADNc avant ligature. Alternativement, l'ADNc peut être utilisé tel quel. A l'étape (6), l'ADN recombinant réplicable conte10 nant l'ADNc du gène JEV3 est transféré à une cellule hôte
pour obtenir un transformant.
Dans cette étape, la transformation d'une cellule hôte par l'ADN recombinant est effectuée par une méthode habituelle. Comme exemples de cellules hôtes, on peut mentionner des cellules prokaryotes comme Escherichia coli et Bacillus subtilis, et des cellules eukaryotes comme
la levure et une culture de cellules d'organisme supérieur.
Les transformants formés par la transformation sont choisis de cellules parentes qui restent non trans20 formées avec l'ADN recombinant en utilisant comme critère, par exemple, un trait phénotypique tel que la résistance
à un médicament impartie par le vecteur d'expression réplicable ayant un gène pour le trait phénotypique.
A l'étape (7), le transformant est cultivé pour
exprimer l'ADNc du gène JEV3 et produire la protéine JEV3.
A l'étape (8), le présent antigène produit par expression est isolé du transformant incubé par méthodes
-habituelles d'extraction et de purification.
Dans cette étape, des techniques conventionnelles 30 peuvent être utilisées en combinaison. Par exemple, des techniques comme une filtration, un dessalement, une centrifugation et une chromatographie en colonne peuvent être utilisées en combinaison pour extraire et purifier
le présent antigène.
Ainsi, on obtient un antigène de flavivirus de la présente invention comprenant une séquence d'acides aminés représentée par la formule (1) cidessus sous une forme
sensiblement pure.
A l'étape (9), l'antigénicité et l'immunogénicité
du présent antigène sont déterminées.
Dans cette étape, des techniques conventionnelles peuvent être utilisées en combinaison. Par exemple, des techniques telles que la détermination par immunosorbant lié aux enzymes (que l'on appellera ci-après "ELISA") et l'essai de neutralisation (méthode de réduction de plaques à 50%: "Standard for the biological preparation of medicines", page 76, supervisé par Pharmaceutical and Supply Bureau, Ministère de la Santé et du Bien-être, Japon, et publié par l'Association of Bacterial Pharmaceutical préparation le 10 Octobre 1985) peuvent être utilisées en
combinaison pour déterminer l'antigénicité et l'immuno15 génicité.
Comme on l'a décrit ci-dessus, la protéine JEV3 est préparée par technique d'ADN recombinant en utilisant l'ADNc du gène JEV3 ayant la séquence des bases représentée
par la formule (II). Dans la méthode ci-dessus mentionnée, 20 l'ADNc du gène JEV3 est obtenu du virus JE par clonage.
Alternativement, l'ADNc du gène JEV3 peut être synthétisé par voie organochimique en utilisant un synthétiseur
automatique d'ADN du commerce, et autres.
Dans le cas o l'antigène de la présente invention 25 comprend une partie de la protéine JEV3, laquelle partie contient au moins un épitope qui est réactif à un anticorps anti-flavivirus, un tel antigène peut être produit par technique d'ADN recombinant sensiblement de la même manière qu'on l'a décrit aux étapes (5) à (8) ci-dessus 30 à l'exception qu'au lieu de l'ADNc du gène JEV3, une portion de l'ADNc du gène JEV3 correspondant à la partie ci-dessus mentionnée de la protéine JEV3 est liée à un vecteur d'expression. La partie du gène JEV3 peut être
préparée en scindant l'ADNc du gène JEV3 en utilisant, par 35 exemple, une enzyme de restriction appropriée, et autres.
Alternativement, la partie de l'ADNc du gène JEV3 peut être synthétisée par voie organochimique en utilisant un
synthétiseur automatique d'ADN du commerce.
Comme on l'a mentionné ci-dessus, l'antigène de la présente invention peut être produit par expression du gène. L'antigène de la présente invention peut également être obtenu sous la forme d'un peptide fusionné comprenant une partie ou la totalité de la séquence d'acides aminés de la protéine JEV3 et, attachée à son extrémité C-terminale et/ou à son extrémité N-terminale, la séquence d'acides aminés d'un autre peptide tel qu'un peptide dérivé d'un linker, 10 un peptide dérivé d'un vecteur d'expression et/ou un peptide dérivé de la protéine de structure du flavivirus autre que la protéine JEV3. Dans ce cas, le peptide fusionné peut être scindé chimiquement ou enzymatiquement pour le séparer en la partie ou la totalité de la séquence d'acides 15 aminés de la protéine JEV3 et la séquence d'acides aminés de l'autre peptide qui lui a été attachée. Alternativement, le peptide fusionné tel quel peut être utilisé comme antigène si l'antigénicité et l'immunogénicibé ne sont pas
affectées par la présence du peptide autre que la 20 protéine JEV3.
L'antigène de Ia présente invention peut également être-synthétisé par voie organochimique en utilisant un
synthétiseur de peptide automatique du commerce, et autres.
- Par ailleurs, la reconception et la modification de chaque 25 épitope de l'antigène de la présente invention peuvent être facilement effectuées selon une méthode habituelle
connue de génie des protéines.
L'antigène de la présente invention peut être
utilisé comme ingrédient actif des vaccins de flavivirus, 30 en particulier le vaccin JE.
Le vaccin peut être préparé en ajoutant l'antigène de la présente invention à une solution isotonique stérilisée comme une solution saline physiologique ou tampon aux phosphates. Dans ce cas,-il est préférable qu'une-peptone, 35 un acide aminé, un saccharide ou analogue soit incorporé comme stabilisant, dans le vaccin. Le vaccin ainsi obtenu est sous forme liquide. Mais le vaccin peut être reformulé
- 2599626
en un vaccin précipité en ajoutant un adjuvant pour améliorer l'immunogénicité, ou en un vaccin lyophilisé qui est très stable et est pratique pour le transport. Par ailleurs, l'immunogénicité de l'antigène de la présente invention peut être améliorée par introduction d'une chaîne de saccharidesdans l'antigène par une technique de fusion moléculaire ou par modification dans la cellule après la translation. Le vaccin contenant le présent antigène peut généralement être administré sous la forme d'un liquide ou d'une suspension. Par- conséquent, dans le cas o le vaccin est un vaccin lyophilisé, le vaccin est dissous ou mis en suspension dans la solution isotonique stérilisée ci-dessus mentionnée avant administration. La concentration du présent 15 antigène dans le vaccin pour l'administration peut généralement être d'environ 0,001 à 1. 000 ug/mC. En général, le vaccin peut être administré par voie sous- cutanée ou intramusculaire. La dose du vaccin pour adulte peut généralement être comprise entre 0,1 et 2,0 mi. En général, la dose du vaccin pour enfant peut être égale à la moitié de celle du vaccin pour adulte. Lé vaccin peut généralement être administré deux fois à un intervalle d'environ une semaine à un mois puis être administré une fois de plus environ
un an plus tard.
Par ailleurs, l'antigène de la présente invention peut être utilisé comme diagnostic immunologique pour détecter l'infection du virus JE. Le présent antigène peut également être utilisé comme diagnostic immunologique pour détecter l'infection par des flavivirus autres que le virus 30 JE qui ont une antigénécité qui est en rapport proche avec ou semblable à celle de l'antigène de la présente invention.' Par exemple, l'antigène de la présente substance est utile pour une utilisation dans ELISA, un essai d'hémagglutination, un essai d'hémagglutination passive, un essai de fixation de complément et divers essais o l'on utilise respectivement un antigène ou anticorps marqué d'un pigment fluorescent,
une enzyme, un radio-isotope et autres.
26 2599626
L'antigène de la présente invention peut être utilisé pour la détection et l'identification d'un anticorps de flavivirus selon les diverses méthodes d'essai ci-dessus mentionnées. L'antigène de la présente invention peut également être utilisé pour la production d'un anticorps contre le présent antigène. L'anticorps ainsi produit peut avantageusement être utilisé pour détecter et identifier un antigène de flavivirus selon les méthodes d'essai ci-dessus 10 mentionnées. La production d'un tel anticorps peut être effectuée par une méthode o l'antigène de la présente invention est injecté à un animal de laboratoire, pour ainsi forcer l'animal à produire un anticorps puis on recueille le sang ou les sécrétions de l'animal. L'anticorps peut 15 également être produit par une technique habituelle de fusion de cellules. Lorsque l'anticorps est produit par la première méthode, on obtient un anticorps polyclonal. Par ailleurs, lorsque l'anticorps est produit par la dernière
méthode, on obtient un anticorps monoclonal.
Par ailleurs, l'antigène de la présente invention ou l'anticorps contre le présent antigène peut être utilisé comme bioséparateur, bioréacteur et biocapteur utilisant la réaction antigène-anticorps. Dans ce cas, l'antigène de la présente invention ou l'anticorps contre le présent 25 antigène peut être fixé à un substrat ou support selon une méthode habituelle connue. Selon le but, l'antigène de la présente invention et l'anticorps contre le présent antigène peuvent être marqués par un pigment fluorescent,
une enzyme, un radio-isotope ou analogue selon une méthode 30 habituelle connue.
L'antigène de la présente invention présente les
avantages suivants.
La structure moléculaire du présent antigène est nette. Par conséquent, par l'utilisation du présent 35 antigène, il est possible d'obtenir des préparations biologiques très efficaces, très sûres et uniformes et des diagnostics très spécifiques et très efficaces. Par ailleurs, le présent antigène n'est pas produit par l'infection d'un animal par un virus, mais est produit par l'expression génétique de l'ADN codant pour le présent antigène dans une cellule hôte. Par conséquent, la possibilité de risques biologiquespendant les étapes de production du présent antigène est sensiblement éliminée. De même, le prix de production peut être diminué. Par ailleurs, comme la totalité des matériels, comme le milieu, du système d'incubation, est connue relativement à leur composition et à leur construction, la purification est facile et l'on peut
obtenir un antigène produit d'une haute pureté.
La présente invention sera maintenant décrite en détail en se référant aux Exemples suivants, qui ne doivent
pas être considérés comme limitant le cadre de la présente 15 invention.
EXEMPLE 1
Etape 1 Extraction de l'ARN génomique du virus de l'encéphalite du Japon? La souche JaOArS982 du virus JE a été mise en culture en utilisant, comme hôte de culture, des cellules d'une ligne de cellules C6/36 dérivée de Aedes albopictus, sorte de moustique (Igarashi, A., J. Gen. Virol. 40, 531, 1973) dans un milieu de culture nutritive à 28 C pendant 48 heures. Après culture, on a recueilli un produit sur25 nageant du milieu de culture. Alors, au produit surnageant, on a ajouté 6 g/dl de polyéthylène glycol 6000 et 2,22 g/dl de chlorure de sodium et le mélange obtenu a été soumis à agitation pendant 15 minutes. Le mélange a été soumis à centrifugation à 12.000 g pendant 30 minutes pour précipiter 30 les particules du virus. Les particules du virus ont été
recueillies et mises en suspension dans un tampon STE (NaCl 0,1 M, TrisHCl 0,01M et EDTA 0,001 M, pH 7,6).
La suspension ainsi obtenue a été mise en couche sur une solution à 15% de saccharose dans un tube de centrifugeuse 35 et soumise à une centrifugation à 37.000 t/mn pendant minutes pour obtenir des précipités. Les précipités résultants ont été dissous dans STE-0,1% SDS (dodécyl sulfate de sodium). Alors, à la solution obtenue, on a ajouté le même volume de phénol saturé de STE afin d'extraire l'ARN génomique du virus et le mélange résultant a été totalement soumis à agitation. La couche aqueuse du mélange a été prélevée et de l'éthanol a été ajouté à la couche aqueuse en un volume égal à deux fois celui de la couche aqueuse. On a laissé reposer le mélange ainsi obtenu pendant une nuit à -20 C et on l'a soumis à centrifugation
à 15.000 t/mn pendant 30 minutes pour précipiter l'ARN.
L'ARN précipité a été recueilli et lyophilisé puis mis en suspension dans STE-0,1% SDS. La suspension résultante a été mise en couche sur une solution de saccharose dans un tube de centrifugeuse, laquelle solution de saccharose contenait 0,01% de SOS et avait un gradient de densité de 15 15 à 30% (poids/poids) et on a soumis à centrifugation à 45.000 t/mn pendant 180 minutes. Une fraction ayant une constante de sédimentation de 42S a été recueillie du tube de centrifugeuse et groupée, et soumise à précipitation en utilisant l'éthanol pour obtenir des précipités. Les précipités ont été séchés et dissous dans tris-HC1 50 mM (pH 7,9) pour obtenir une solution de l'ARN du virus purifié. Etape 2 [Préparation d'un ADNc bicaténaire contenant un ADN qui est complémentaire de 25 l'ARN génomique 1 A 50 Pl de la solution de l'ARN du virus contenant 10 pg de l'ARN génomique, on a ajouté MgCl2 10 mM, NaCl 250 mM, MnCl2 2,5 mM, 0,5 mg/ml d'albumine de sérum bovin (que l'on appellera ci-après fréquemment "BSA"), 30 ATP 1 mM, 30 unités de RNase inhibitrice et 1 unité de poly(A) polymérase, et l'on a incubé le mélange résultant à 37 C pendant 5 minutes. Alors, le mélange a été soumis à une extraction par le phénol et une précipitation par l'éthanol pour précipiter l'ARN, avec ensuite centrifuga35 tion pour obtenir des précipités. Les précipités ont été séchés pour obtenir un ARN séché. Subséquemment, l'ARN obtenu a été dissous dans 50 Pl d'une solution contenant KCl 0,1 M, MgC12 10 mM, DTT 10 mM, dNTP 1 mM, 20 pg d'oligo(dT)12_18, Tris-HC1 50 mM (pH 7,9) et 30 unités de transcriptase réverse, et l'on a soumis le mélange résultant à incubation à 42 C pendant 60 minutes. Au mélange, on a ajouté 150 pl d'une solution enzymatique contenant MgS04 0,1 mM, 0,5 mg/ml de BSA, dNTP 1 mM, NAD 100 pM, Tris-HCl 0,5 M (pH 7,9), 25 unités de RNase H, 1 unité d'ADN ligase et 20 unités d'ADN polymérase I pour obtenir 200 pl d'un mélange. Le mélange a été soumis à incubation à 15 C pendant 2 heures. Le mélange réactionnel résultant a été soumis à une extraction au phénol et une
précipitation dans l'éthanol pour obtenir des précipités.
Alors, les précipités ont été dissous dans 100 pl d'une solution aqueuse contenant MgCl2 10 mM, NaCl 50 mM, 0,1 mg/ml de BSA, DTT 1 mM, dNTP 1 mM et Tris-HCl 50 mM (pH 7,9). A la solution résultante, on a ajouté 2 unités d'ADN polymérase T4 et le mélange résultant a été soumis à incubation à 37 C raendant 10 minutes. Après incubation, le mélange a été soumis à une extraction au phénol et une 20 précipitation dans l'éthanol pour obtenir un ADNc bicaténaire contenant un ADN qui est complémentaire de
l'ARN génomique viral.
Etape 3 Clonage de l'ADNc et détermination
de sa séquence des bases].
L'ADNc bicaténaire obtenu à l'étape 2 à été dissous dans une solution aqueuse contenant Tris-HCl 60 mM (pH 7,6), MgCl2 6,6 mM, DTT 10 mM et ATP 1 mM. A la solution ainsi obtenue, on a ajouté un linker BamHI et l'ADN ligase T4,
avec ensuite incubation à 4 C pendant 16 heures pour 30 avancer une réaction de ligature de l'ADNc au linker.
Ensuite, le linker de BamHI restant sans avoir réagi a été enlevé en effectuant une filtration sur gel en utilisant un gel CL-4B qui avait été équilibré par un tampon TEN50 consistant en Tris-HC1 10 mM (pH 8,0), NaCl 50 mM et EDTA 1 mM. Alors, le linker qui avait été lié à l'ADNc en excès a été enlevé par digestion du linker par BamHI et en effectuant une filtration sur gel en utilisant un gel CL-4B. On a ainsi préparé un ADNc bicaténaire aux deux extrémités duquel était lié un linker BamHI. L'ADNc ainsi obtenu a été inséré au site BamHI d'un vecteur de clonage pUC13 (fabriqué et vendu par- Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède). A titre d'exemple, pUC13 a été scindé par BamHI. L'ADNc aux deux extrémités duquel était lié un linker de BamHI a été ajouté au pUC13 scindé et l'on a fait réagir le mélange résultant en présence d'ADN ligase T4 à 4 C pendant 16 heures pour lier l'ADNc au vecteur pUC13. Alors, le produit résultant, c'est-à-dire l'ADN recombinant,a été transféré dans une cellule de la souche DH1 de Escherichia coli (N ATCC 33849) pour obtenir un transformant. Subséquemment, les fragments d'ADNc ayant diverses longueurs ont été préparés à partir de l'ADNc 15 comme suit. D'-abord, on a préparé l'ADNc à partir du transformant ci-dessus mentionné et on l'a dissous dans pl d'un tampon Ba131 consistant en Tris-HC1 50 mM (pH 8,0), CaCl2 12 mM, MgC12 J'l mM et NaCl 400 mM. A la solution résultante, on a ajouté 2 unités d'exénucléase Bal31, 20 avec ensuite incubation à 20 C. A chaque point de temps de 3, 6, 10 et 15 minutes après l'incubation, on a recueilli p1 du mélange réactionnel et on les a soumis à une extraction au phénol et une précipitation dans l'éthanol pour ainsi obtenir des fragments d'ADNc. Alors, les frag25 ments d'ADNc ont été dissous dans un tampon d'ADN polymérase T4 contenant Tris-HCl 70 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, dithiothréitol 5 mM et dNTP 20MM, et l'on a ajouté l'ADN polymérase T4 à la solution obtenue. Le mélange résultant a été incubé à 37 C pendant 30 minutes pour convertir les 30 deux extrémités de chacun des fragments d'ADNc en bouts francs. Subséquemment, les fragments d'ADNc ont été insérés séparément dans un site HincII du vecteur clonant pUC19 (fabriqué et vendu par Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède) pour former des vecteursrecombinants. Les vecteurs recombinants ont été séparément transférés chez une souche JM83 de E. coli pour obtenir des transformants contenant diverses dimensions des fragments d'ADNc. Les transformants 3-1 ont été mis séparément en culture pour obtenir les clones de fragments d'ADNc. Les séquences des bases des clones obtenus ont été déterminées par la méthode de terminaison de la chaîne de didésoxy (Sanger, F. et autres, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977; et Hattori, M. et autres, Anal. Biol., 152, 232, 1986). Par suite, on a trouvé que l'un des clones était un ADNc consistant en environ 4.000 paires de bases (que l'on appellera ci-après "pb") qui correspond à une séquence partielle des bases de l'ARN 10 génomique du virus JE, ladite séquence partielle partant du site à environ 2.000 pb en aval de l'extrémité 5' de l'ARN génomique et s'étendant jusqu'à une position telle qu'il y ait environ 4. 000 paires de bases. Ce clone a été désigné par K68. Le clone K68 s'est révélé contenir une séquence de bases correspondant à la partie du gène V3 du virus JE mais pas la pleine séquence du gène V3. Alors, un oligonucléotide (26 mère) ayant la séquence des bases suivante complémentaire de la partie dl, gène V3 dans l'ARN génomique du virus JE et contenue dans la séquence 20 du clone K68 a été synthétisé par voie organochimique d G T A C G G C T T C C C A C A T T T G G T G C T C C,
2 6 mère.
Etape 4 [Clonage du clone S22 contenant une
région d'ADN codant pour la protéine V3].
On a répété sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 2 à l'exception que l'on a utilisé l'oligonucléotide (26 mère) préparé à l'étape 3 comme amorce pour la synthèse de l'ADNc, pour obtenir des ADNc. Les ADNc ainsi obtenus ont été insérés séparément dans un vecteur clonant pUC13 30 pour obtenir des vecteurs recombinants et les vecteurs recombinants ont été séparément transférés chez la souche de E. coli ci-dessus mentionnée pour former des transformants. De chaque transformant, un vecteur recombinant aété isolé par une méthode d'extraction aux alcalis [Nucleic 35 Acid Res. , 7 (6), 1513-1523 (1979)] et soumis à une détermination de la séquence des bases par la méthode décrite à l'étape 3. Par suite, on a trouvé que l'un des vecteurs recombinants contenait un fragment d'ADNc ayant une longueur moléculaire d'environ 2.500 pb, lequel fragment d'ADNc correspond à une séquence partielle des bases de l'ARN génomique du virus JE, ladite séquence partielle partant de l'extrémité 5' de l'ARN génomique et s'étendant jusqu'à une position telle qu'elle ait environ 2. 500 pb. Le fragment d'ADNc est désigné par clone S22. La séquence des bases du clone S22 et la séquence des acides aminés pour laquelle code la séquence des bases ont été 10 comparées aux séquences des bases de l'ARN génomique de deux flavivirus autres que le virus JE, c'est-à-dire le virus de la fièvre jaune et le virus du Nil de l'Ouest et la séquence d'acides aminés pour laquelle code la l'ARN génomique, lesquelles séquences sont décrites dans Rice, C.M. et autres, Science, 229, 726, 1985 et Wengler, G et autres,Virology, 147, 264, 1985. Par suite, on a trouvé que le clone S22 contenait la région d'ADN codant pour la
protéine V3 du virus de l'encéphalite du Japon.
Les résultats sont montrés aux Tableaux IIa à IIf 20 qui suivent.
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éta désigné par le plasmide pS22 (voir figure 1).
L' Escherichia coli contenant le vecteur recombinant portant le clone S22 obtenu ci-dessus a été désigné par la souche JM83/pS22 de E. coli et déposé au Fermentation Research Institute sous le N d'accession FERM BP1074. Etape 5 [Construction d'un plasmide d'expression
portant un gène de la protéine V3].
Le plasmide pS22 portant le clone S22 du fragment 10 d'ADN a un site MluI à 49 pb en amont de l'extrémité 5' du gène de la protéine V3 et a un site SphI à 7 pb en amont de l'extrémité 3' du gène. Le plasmide de pS22 a été séparé de la souche JM83/pS22 de E. coli sensiblement de la même manière qu'on l'a décrit à l'étape 4 et dissous dans une solution contenant TrisHCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM et MgCl2 7 mM. A la solution ainsi obtenue, on a ajouté des enzymes de restriction MluI et EcoRI avec ensuite incubation
à 37 C pendant 2 heures pour scinder deux sites, c'est-àdire le site MluI et le site EcoRI du plasmide, lequel 20 site EcoRI était placé plus loin, en amont de l'extrémité 5' du gène de la protéine V3, que le site MluI.
Après clivage, le mélange a été soumis à une extraction au phénol et une précipitation dans l'éthanol pour récupérer un ADN. L'ADN a été dissous dans le tampon ci-dessus mentionné d'ADN polymérase T4 et chauffé à 37 C pendant minutes pour convertir les deux extrémités de l'ADN en bouts francs. Le mélange résultant a été soumis à une extraction au phénol et une précipitation dans l'éthanol pour récupérer un ADN. Un linker XhoI a été lié à chacune des deux extrémités de l'ADN sensiblement de la même manière qu'on l'a décrit à l'exemple 3. La souche JM83 de E. coli a été transformée par l'ADN auquel était lié le linker, pour obtenir un transformant. Par mise en culture du transformant, l'ADN lié au linker a été cloné. L'ADN lié au 35 linker cloné a été désigné par S22X (voir figure 1). Le plasmide porteur de S22X a été désigné par le plasmide pS22X. Le plasmide pS22X porteur du clone S22X a été dissous dans une solution contenant Tris-HC1 10 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM et MgCl2 7 mM, et digéré par les enzymes de restriction SphI et BamHI à 37 C pendant 2 heures. La récupération d'un ADN et la conversion des deux extrémités de l'ADN en bouts francs par l'utilisation de l'ADN polymérase T4 ont été effectuées sensiblement de la même manière qu'on l'a décrit ci-dessus. Un terminateur universel (fabriqué et vendu par Pharmacia Fine Chemicals Co, Suède) 10 a été lié à l'ADN et l'ADN lié au terminateura été utilisé pour transformer la souche JM83 de E. coli. L'ADN ci-dessus
obtenu a été désigné par le clone S22XS (voir figure 1).
Par ailleurs, comme véhicule d'expression, on a utilisé le vecteur YEp133PCT. Ce vecteur a été construit 15 par les présents inventeurs comme suit. D'abord, pour le plasmide YEp13 (N d'Accession ATCC 37115), son fragment de gène LEU2 obtenu par clivage par XhoI et SalI du plasmide
a 6té relié au fragment du plasmide restant dans une direction réverse pour forcer les sites de XhoI et SalI aux 20 deux extrémités du fragment du gène à disparaître.
Deuxièmement, le fragment de BamHI-SalI présent dans le gène Tc du plasmide a été remplacé par un fragment BamHI-SalI d'environ 650 pb de long contenant le promoteur PH05 dérivé de pPH05 (voir Kenji Arima et autres, Nucl. 25 Acid Res. 11, 1657, 1983). Troisièmement, le fragment de BamHI-SalI ci-dessus remplacé a été rogné de son site Sali à l'extrémité 3' du promoteur contenu par l'utilisation de -l'exonucléase Bal31. Quatrièmement, un linker XhoI a été inséré dans le promoteur à son extrémité 3' pour incorporer 30 un site de clonage. Cinquièmement, un fragment d'ADN d'environ 800 pb de longueur préparé par ligature des linkers XhoI et SalI, aux sites HindIII et EcoRI,respectivement, au fragment de HindIII-EcoRI contenant un terminateur TRPI1 et un ARS (séquence de réplication autonome), lequel fragment de HindIII-EcoRI a été obtenu à partir de YRp7 (N d'Accession ATCC 37060) a été inséré dans le vecteur clonant ci-dessus préparé pour ainsi
* obtenir le vecteur d'expression YEp133PCT.
L'ADNc du gène de la protéine V3 a été inséré dans le vecteur d'expression ainsi obtenu. A titre d'exemple, pS22XS a été digéré par les enzymes de restriction XhoI et SalI, et le mélange résultant a été soumis à une électrophorèse sur gel agarose pour récupérer un fragment d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 1.600 pb. Le fragment d'ADN récupéré a été lié au vecteur d'expression 10 YEp133PCT à son site XhoI. La souche JM83 de E. coli a été transformée par le plasmide résultant pour former un transformant. Le transformant a été isolé et mis en culture dans un milieu L (1% poids/volume de bactotrypton, 0,5%
poids/volume d'extrait de levure, 0,5% poids/volume de 15 chlorure de sodium, 25 fg/ml d'ampicilline, pH 7,2-7,4).
Le plasmide a été extrait du transformant par la méthode d'extraction aux alcalis ci-dessus mentionnée. Alors, la direction dans laquelle le fragment d'ADN contenant le gène V3 était lié à YEp133PCT dans le plasmide extrait a été confirmée par digestion du plasmide par diverses enzymes de restriction et en soumettant le mélange de digestion à une électrophorèse sur gel agarose. Le plasmide a été désigné par plasmide pJEV3 (voir figure 2). De la levure a été transformée par le plasmide et miseen culture. La production de la protéine V3 dans la levure incubée a été confirmée selon la méthode ELISA. Divers essais ont été faits pour la reconstruction du plasmide pJEV3 pour augmenter l'efficacité de production de la protéine V3. Les résultats sont montrés à la figure 3. En particulier, l'ADN pJEV3 30 a été digéré par l'enzyme de restriction XhoI et les deux extrémités de l'ADN digéré ont été converties en bouts francs par l'utilisation de l'ADN polymérase T4. L'ADN résultant a été digéré par l'enzyme de restriction BamHI et soumis a une électrophorèse sur gel agarose pour récupérer 35 un fragment d'ADN de 13.000 bp de long. Cet ADN correspond à pJEV3 dépourvu de la région du promoteur PH05. Par ailleurs, pour utiliser le codon ATG d'initiation de translation du gène structural PH05, pPH05 a été digéré par les enzymes de restriction BamHI et DraI et le mélange de digestion a été soumis à une électrophorèse sur gel agarose pour récupérer un fragment d'ADN de. 550 pb de long de la région de promoteur de PH05. Le fragment d'ADN de 13.000 pb ci-dessus mentionné a été lié à ce fragment d'ADN de 550 pb. La souche JM83 de E. coli a été transformée par l'ADN lié, et mise en culture pour cloner l'ADN lié. L'ADN cloné résultant a été désigné par plasmide pJM105. Le
diagramme de la figure 2 illustre les processus de préparation de pJM105.
Sur la figure 5, a indique le gène non structural de PH05 de la levure b désigne le gène structural PH05 de la levure 15 c désigne le gène structural JE-V1 (M) et
d indique le gène structural JE-V3 (E).
L'utilisation de pJM105 cloné ci-dessus conduit à la production d'un polypeptide consistant en 519 acides aminés et ayant une séquence d'acides animés telle 20 que les acides aminés suivants sont liés en séquence dans l'ordre de: (a) deux acides aminés, c'est-à-dire Met-Phe-, dérivés de PH05; (b) deux acides aminés, c'est-à-dire -Ser-Arg-, 25 dérivés de la portion entre le promoteur PH05 et l'ADNc ci-dessous mentionné du gène de la protéine VI; (c) 16 acides aminés, c'est-à-dire Arg-Val-ValPhe-Thr-Ile-Leu-Leu-Leu-Leu-Val-Ala-Pro-Ala-Tyr-Ser-, dérivés de l'ADNc du gène de la protéine Vi se trouvant en 30 amont du gène de la protéine V3 dans l'ARN génomique du virus JE; (d) 498 acides aminés dérivés de l'ADNc de la protéine V3 et ayant une séquence d'acides aminés telle que deux acides aminés, c'est-à-dire -His-Ala soient éliminés 35 de la partie C-terminale de la séquence d'acides aminés représentée par la formule (I) ci-dessus mentionnée; et (e) un acide aminé, c'est-à-dire,Ala dérivé du
terminateur universel.
Etape 6 [Transformation de la levure par le plasmide d'expression pJM105 et isolement de la levure transformée j. La levure Saccharomyces cerevisiae souche SHY4 (N d'Accession ATCC 44772) a été transformée par le plasmide d'expression pJM105 selon la méthode des cations alcalins. A titre d'exemple, la levure a été mise en culture dans le milieu YPD (2% poids/volume de bacto10 peptone, 1% poids/volume d'extrait de levure, 2% poids/ volume de dextrose), et l'on a centrifugé 5 ml de la culture à 2. 500 t/mn pendant 5 minutes pour récolter les cellules. Les cellules ont été mises en suspension dans ml de tampon TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM) et 15 centrifugées pour récolter les cellules. Les cellules ont été remises en suspension dans 0,6 ml de tampon TE. A 0,5 ml de la suspension, on a ajouté 0,5 ml d'acétate de
lithium 0,2 M et on a incubé a 30 C pendant 60 minutes.
Alors, on a ajouté 8 pi de l'ADN plasmidique à 0,1 ml de 20 la culture et on a incubé à 30 C pendant 30 minutes. A la culture résultante, on a ajouté 0,1 ml de 70% poids/volume de polyéthylène glycol 4000, et on a incubé à 300C pendant 60 minutes. Par ailleurs, on a ajouté 2 mi d'eau distillée à la culture, avec ensuite centrifugation à 2.500 t/mn pendant 5 minutes pour récolter les cellules. Les cellules ont été remises en suspension dans une petite quantité d'eau distillée, inoculées à un milieu d'agar SD [0,67% poids/volume de bactolevure exempte d'acides aminés libres à base d'azote (fabriquée et vendue par Difco Co., 30 E.U-. A.), 2% poids/volume de dextrose, 20 pg/ml d'uracil, pg/ml de L- tryptophane, 20 pg/ml de L-histidine, 2% poids/volume d'agar] qui est un milieu sélectif ne contenant pas de leucine, et on a incubé à 30 C. La colonie formée par incubation a été isolée pour obtenir 35 une levure transformée. La levure transformée a été
désignée par SHY4/pJM105.
Etape 7 L Incubation de la levure transformée
et extraction de l'antigène].
La levure transformée SHY4/pJM105 a été inoculée à un milieu de Burkholder [ qui est un milieu totalement synthétique contenant 1,5 g/l de phosphate potassique monobasique (voir Burkholder, P.R. et autres, Am. J. Botany, , 206, 1943)] et incubée tout en agitant à 30 C pendant 24 heures. Après l'incubation, la culture a été centrifugée à 2.500 t/mn pendant 5 minutes pour récolter les cellules. 10 Les cellules ont été lavées une fois avec de l'eau distillée, inoculées à un milieu de Burkholder contenant 1,5 g/l de chlorure de potassium à la place du phosphate potassique monobasique ci-dessus mentionné et incubées tout en agitant à 30 C pendant 48 heures. Après l'incubation, 15 les cellules ont été récoltées par centrifugation, lavées et remises en suspension dans un tampon de phosphate 0,01 M (pH 9,0). Des perles de verre ont été placées dans la suspension et on a vigoureusement agit- pour interrompre les cellules. La suspension résultante a été centrifugée 20 à 10.000 t/mn pendant 10 minutes et le produit surnageant
a été séparé. On a ainsi obtenu un extrait de levure.
Etape 8 [Efficacité de la levure transformée pour la production d'un antigènej La détermination quantitative de l'antigène dans
l'extrait de levure a été effectuée selon la méthode ELISA.
Le titre ELISA a été déterminé par la méthode du sandwich en utilisant comme anticorps preneur, l'IgG purifié obtenu du sérum d'une souris immunisée par un excès du virus de l'encéphalite du Japon (souche Nakayama) et comme anticorps détecteur l'anticorps monoclonal de la protéine V3 anti-encéphalite du Japon conjugué à HRPO (peroxydase du raifort) (voir Kimura, K.J. et autres, J. Virol. 45, 124, 1983). En effectuant la détermination du titre ELISA, une réaction de couleur a été développée par la o-phénylène35 diamine, et l'absorbance à 420 nm a été mesurée. Le titre d'antigène ELISA d'un échantillon d'essai a été déterminé en utilisant un antigène R-181 de référence du virus de l'encéphalite du Japon (National Institute- of Health of Japan) comme standard de 100 unités. Les résultats de ELISA sont montrés au Tableau III. De la détermination, on a pu confirmer que la levure transformée SHY4/pJM105 produisait efficacement l'antigène de la présente invention.
Tableau III
15 Période Population Antigène de la d'incuba- de présente inventiontion cellules/ml (Titre d'antigène (h) (x 106) ELISA)
0 6,1 2,4
16 30
43 27
18 63 37
24 71 57
72 61
48 58 81
R-181 1) 100
1) Antigène de l'encéphalite du Japon de référence lot 181 LU Etape 9 [Identification et détermination du poids moléculaire de l'antigène produit par la levure transformée SHY4/pJM105 selon la
technique des taches de l'Ouest].
L'extrait. d'antigène de la levure a été purifié par centrifugation sur un gradient de saccharose à 20-30% poids/poids à 21.000 t/mn pendant 20 heures. La fraction contenant un antigène purifié de la présente invention a été placée dans 1% poids/volume de 2-mercaptoéthanol/ Tris- HC1 125 mM (pH 6,8), maintenue à température ambiante pendant 20 minutes et soumise à électrophorèse sur 10% de gel de polyacrylamide. Le gel a été retiré et la protéine sur le gel a été maculée sur une membrane en nitrocellulose en utilisant la cellule Transblot (marque déposée) fabriquée et vendue par Bio-RAD Co, EUA. Le film résultant de nitrocellulose a été soumis à une réaction avec l'anticorps monoclonal V3 du virus anti-encéphalite du Japon ci-dessus mentionné, et ensuite à une réaction avec IgG de chèvre anti-IgG de souris conjugué à HRPO. La réaction de
couleur a été développée par le 4-chloroindonaphtol.
Ainsi, a été effectuée l'identification de l'antigène.
La figure 4 illustre la réaction entre une- protéine ayant un poids moléculaire d'environ 53 KD (kilodalton) et l'anticorps monoclonal antiV3. Comme le poids moléculaire est en accord avec celui calculé à partir de la séquence 15 des bases codant pour un peptide contenant la séquence d'acides aminés comme on l'a mentionné à l'étape 5, la protéine a été identifiée comme un antigène contenant une séquence d'acides aminés telle que les premier et second acides aminés comptés à partir de l'extrémité Cterminale 20 de la séquence d'acides aminés de la protéine V3 soient éliminés. Etape 10 LImmunogénicité du présent antigène
produit par la levure transformée.
L'extrait d'antigène obtenu à l'étape 7 a été 25 centrifugé sur un gradient de 20-50% en poids/poids de saccharose à 21.000 t/mn pendant 20 heures pour obtenir un antigène partiellement purifié. L'antigène a été mélangé à de l'hydroxyde d'aluminium en tant qu'adjuvant pour obtenir une solution de l'antigène. La solution de 30 l'antigène a été injectée, en quantités de 4, 20 et 100 (titre de l'antigène ELISA), par voie intrapéritonéale à des souris ddY de 4 semaines pour les immuniser. Une
semaine plus tard, les souris ont été immunisées par injection de l'extrait d'antigène à la même quantité.
Une autre semaine plus tard, le sang a été recueilli de chacune des souris. Pour le sang, le titre d'anticorps ELISA contre le virus de l'encéphalite du Japon a été déterminé selon la méthode ELISA comme on l'a mentionné précédemment et le titre d'anticorps neutralisant contre le virus de l'encéphalite du Japon a été déterminé selon la méthode de réduction de plaques à 50% comme on l'a mentionné ci-dessus. Les résultats sont montrés au Tableau IV. Comme le montre le tableau, le titre d'enticorps ELISA de l'antigène a été détecté par la méthode ELISA, mais le titre d'anticorps neutralisant n'a pas été détecté dans la méthode d'immunisation ci-dessus mentionnée. 10 Tableau IV
20 25
Adjuvant Titre Titre Titre d'antigène 1) d'anti d'anticorps 2) corps neutralisant ELISA
100 <1: 10
Al(OH)3 20 51 0,2mg/ dose 4 64
100 < 1: 10
(-) 20 54
4 20
R-181 3) 4 200
35
1) Titre d'antigène ELISA.
2) Selon la méthode de réduction de plaques à 50%.
3) Lot 181 de l'antigène de l'encéphalite du Japon
de référence.
Etape 11 [Immunogénicité de l'antigène produit par
la levure transformée].
La solution de l'antigène préparée sensiblement de la même manière qu'à l'étape 10 a été injectée dans la cavité abdominale de chacune des souris, 6 fois, à des intervalles de 7 jours (ler, 8ème, 15ème, 22ème, 29ème et 36ème jour). Au 43ème jour, le sang a été recueilli de chacune des souris. Le titre d'anticorps neutralisant 5 du sang contre le virus JE a été déterminé en utilisant, pour le virus JE, la souche Nakayama, la souche Beijing et la souche JaOArS982, et les résultats sont montrés au Tableau V. Comme le montre le tableau, pour toutes les souches Nakayama, Beijing et JaOArS982 du virus JE, on a 10 détecté l'anticorps neutralisant. Tableau V Adjuvant Titre d'anticorps neutralisant 2) Titre Souche Souche Souche d'anti- Nakayama Beijing JaOArS982 gène 1)
1:117 1:48 1:59
Al(OH3) 20 C 1:10 < 1:10 1:11 0,2 mg/ dose 4 " " 1:10
<1:10 < 1:10 1:15
(-) 20 " " 1:10
4 "
R-181 3) 4 1:3500 1:70 1:370
1), 2), 3)
: Comme mentionné au Tableau IV.
EXEMPLE 2
La souche JM83/pS22 de E. coli obtenue à l'étape 4 de l'Exemple 1 a été mise en culture pour obtenir des
cellules de la souche. Des cellules ainsi obtenues, on a isolé l'ADN du plasmide pS22 par la méthode d'extraction 35 aux alcalis décrite à l'étape 4 de l'Exemple 1.
L'ADN plasmidique isolé a été dissous dans une solution aqueuse contenant Tris-HC1 10 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM et MgCl2 7 mM. Au mélange résultant, on a ajouté les enzymes de restriction MluI et SphI, avec ensuite incubation à 37 C pendant 2 heures, pour ainsi digérer l'ADN plasmidique. Le mélange résultant a été soumis à une électrophorèse sur gel agarose. Du gel agarose résultant, on a récupéré des fragments d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 1500 pb, qui contenaient une séquence des bases 10 codant pour la protéine JEV3. Les fragments d'ADN ont été digérés en utilisant les enzymes de restriction sensiblement de la même manière qu'on l'a décrit ci-dessus à l'exception que l'on a utilisé les enzymes de restriction
NruI et DdeI au lieu des enzymes de restriction MluI et 15 SphI, pour ainsi obtenir des produits de digestion d'ADN.
Les produits de digestion d'ADN ainsi obtenus ont été soumis à une électrophorèse sur gel agarose. Du gel agarose résultant, on a récupéré des fragments d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 350 pb. Les fragments 20 récupérés d'ADN ont été liés au vecteur YEp133PCT obtenu à l'étape 3 de l'Exemple 1 à son site XhoI en utilisant un linker XhoI pour obtenir des recombinants. Les recombinants ont été transférés dans des cellules de la souche DH1 de E. coli pour obtenir des transformants. La sélection du transformant qui contient le fragment souhaité d'ADN d'environ 350 pb parmi les transformants ci-dessus obtenus a été effectuée par méthode d'hybridation de colonies en utilisant, comme témoin, l'ADN marqué 32p codant pour la protéine JEV3. L'ADN marqué 32p a été préparé comme suit. D'abord, le plasmide pS22XS obtenu à l'étape 5 de l'Exemple 1 a été digéré par les enzymes de restriction XhoI et SalI, et le mélange résultant a été soumis à une électrophorèse sur gel agarOse pour récupérer un fragment d'ADN d'une longueur moléculaire d'environ 1. 600 pb. Deuxièmement, le fragment d'ADN récupéré a été marqué par 32p au moyen d'une translation d'entaille en utilisant un ensemble de translation N.500 fabriqué et
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vendu par Amersham Japan Limited. On a ainsi obtenu
l'ADN marqué 32P ci-dessus mentionné.
Le transformant choisi par la méthode d'hybridation de colonies ci-dessus mentionnée a été mis en culture pour obtenir un clone du transformant. Du clone, des plasmides ont été-isolés par la méthode d'extraction aux alcalis comme mentionné précédemment. Avec les plasmides ainsi obtenus, on a transformé les cellules de la souche de levure SHY4. Les cellules résultantes ont été mises en culture sur le milieu d'agar SD comme décrit à l'étape 6 de l'Exemple 1. La colonie formée par mise en culture
a été isolée pour obtenir une levure transformée.
La levure transformée a été utilisée pour la production d'un polypeptide comprenant une partie de la séquence d'acides aminés de la formule (I), laquelle partie comprend les 375ème à 456ème acides aminés comptés à partir de l'extrémité N-terminale de la séquence d'acides aminés de la formule (I). Sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1, la levure transformée a été 20 mise en culture pour obtenir des cellules de levure et l'on a obtenu un extrait de levure des cellules ainsi obtenues. Une aliquote de l'extrait de levure ainsi obtenu a été soumise à un essai d'hémagglutination-inhibition 25 (HAI) selon la méthode de Clarke et Casals [American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 7, 561-573 (1958)j en utilisant 4 anticorps monoclonaux respectivement contre 4 régions déterminant l'antigène (groupes 1 à 4) de la protéine JEV3 E J. Kimura-Kuroda et K. Yasui, Journal of 30 Virology, 45 (1), 124-132 (1983) J. Les résultats sont montrés au Tableau VI qui sera donné ci-après. Lesrésultats montrent que l'extrait de levure de la levure transformée contient une substance qui se lie spécifiquement à l'anticorps monoclonal contre le groupe 4 de la 35 région déterminant l'antigène de l'antigène JEV3. Le plasmide contenu dans la levure transformée a été désigné par pV3G4-96 et la levure transformée a été désignée par
25996Z6
souche de levure SHY4/pV3G4-96.
L'extrait de levure obtenu ci-dessus a été soumis à une purification sensiblement de la même manière qu'à l'étape 9 de l'Exemple 1 pour obtenir un antigène purifié de la présente invention.
EXEMPLE 3
On a répété sensiblement les-mêmes processus qu'à l'Exemple 2 pour obtenir des fragments d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 1. 500 pb, contenant une 10 séquence des bases codant pour la protéine JEV3. Les fragments d'ADN ont été digérés successivement avec les enzymes de restriction HpaII, Bgl3l et StuI, pour ainsi obtenir des produits de digestion d'ADN. Les produits de digestion d'ADN ont été soumis à une électrophorèse sur 15 gel agarose pour récupérer des fragments d'ADN d'une longueur moléculaire d'environ 700 à 800 pb. Les fragments récupérés d'ADN ont été liés au vecteur YEp133PCT à son site XhoI en utilisant un linker XhoI pour obtenir des recombinants. Les recombinants ont été transférés dans 20 des cellules de la souche DH1 de E. coli pour obtenir des transformants. La sélection du transformant qui contient les fragments voulus d'ADN d'environ 700 à 800 pb à partir des transformants ci-dessus obtenus a été effectuée par une méthode d'hybridation de colonies sensiblement de 25 la même manière qu'à l'Exemple 2. Alors, le transformant ainsi choisi a été mis en culture pour obtenir un clone du transformant. Du clone, des plasmides ont été isolés par la méthode d'extraction aux alcalis mentionnée cidessus. Avec les plasmides ainsi obtenus, on a transformé 30 des cellules de la souche de levure SHY4. Les cellules résultantes ont été mises en culture sur le milieu d'agar SD décrit à l'étape 6 de l'Exemple 1. La colonie formée par mise en culture a été isolée pour obtenir une levure transformée. La levure transformée a été utilisée pour la production d'un polypeptide comprenant une partie de la séquence d'acides aminés de la formule (I), laquelle partie
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comprend les 45ème à 159ème acides aminés comptés à partir de l'extrémité N-terminale de la séquence d'acides aminés de la formule (I). Sensiblement de la même manière
qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1, la levure transformée a été 5 mise en culture pour obtenir des cellules de levure et,des cellules ainsi obtenues, on a obtenu un extrait de levure.
Une aliquote de l'extrait de levure ainsi obtenu a été soumise à l'essai HAI de la-même manière qu'on l'a décrit à l'Exemple 2. Les résultats sont montrés au Tableau VI donné ci-dessous. Les résultats montrent que l'extrait de levure de la levure transformée contient une substance qui se lie spécifiquement à l'anticorps monoclonal contre le groupe- I de la région déterminant l'antigène de l'antigène JEV3. Le plasmide contenu dans 15 la levure transformée a été désigné par pV3G1-38 et la levure transformée a été désignée par souche de levure SHY4/pV3G1-38. L'extrait de levure obtenu ci-dessus a été soumis à une purification sensiblement de la même manière qu'à l'étape 9 de l'Exemple 1 pour obtenir un antigène purifié
de la présente invention.
Par ailleurs, un extrait de levure a été obtenu de cellules de la souche de levure SHY4, ne retenant pas de plasmide, sensiblement de la même manière qu'à l'étape 7 de l'Exemple 1. L'extrait ainsi obtenu de levure a été utilisé comme témoin et soumis à l'essai HAI de la même manière qu'on l'a décrit ci-dessus. Les
résultats sont également montrés au Tableau VI.
Tableau VI
15 Titre HAI Souche de Anticorps monoclonal levure groupe 1)
1 2 3: 4
Exemple 2 SHY4/pV3G4-96 < 10 < 10 < 10 10240 Exemple 3 SHY4/pV3G1-38 5120 <10 < 10 <10 Témoin SHY4 <10 <10 < 10 Z10 Note: 1) Les numéros de groupe du groupe d'anticorps monoclonaux correspondent à ceux des groupes des régions déterminant l'antigène rapportées dans Journal of Virology, 45 (1) 124-132
(1983).
Sur la figure 4, (a)indique le virus de l'encéphalite du Japon, (b)un extrait de pJM105 et (c) un extrait de levure normale.
R E V END I C A T I 0 N S
1.- Antigène caractérisé en ce qu'il comprend au moins une-partie d'une séquence d'acides aminés représentée par la formule suivante (I): - Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala 10 Ser GIn Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly 15 Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu 20 Asn His Gly Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe-Thr Ile Thr Pro Asn Ala Pro Ser Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val. Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala 25 Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Cys Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gln 30 Ser Val Val Ala.Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Met Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Ala Thr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Ser Val Ala Val Gly Arg Val Ala Thr Leu Val Glu Ser Tyr Ile Gln Ile Asn Ser Thr Leu Leu Lys Gly Gly Asp Thr Gly Gly Val Val His Gln Thr Leu Phe Gln Gly Leu Met Gly Val Ala Leu Ala Leu Val Phe (I) Pro Ser Leu Cys Lys Ile Pro Leu Asn Asp Met Val Thr Val Asn Ile Thr Pro Val Pro Phe Ser Ser Ala Met Glu Pro Val Val Gly His His Trp Gly Lys Ala Ala Gin Arg Ala Trp Asp Phe Asn Ser Val Phe Gly Gly Gly Met Met Gly Ala Asn Ala Arg Phe Leu Ala Leu Ala Thr Asn Ser Lys Leu Pro Phe Gly Asp Arg Gly Asp Lys His Lys Ala Gly Phe Ser Thr Thr Leu Ala Ala Leu Phe Gly Ser Ile Ile Gly Lys Ala Gly Ala Phe Arg Ser Trp Ile Thr Leu Leu Leu Trp Asp Arg Ser Ile Thr Gly Gly Val Asn Val His Ala dans laquelle Ala indique un résidu d'alanine, Arg un résidu d'arginine, Asn un résidu d'asparagine, Asp un résidu d'acide aspartique, Cys un résidu de 25 cystéine, Gin un résidu de glutamine, Glu un résidu d'acide glutamique, Gly un résidu de glycine, His un résidu d'hystidine, Ile un résidu d'isoieucine, Lys un résidu de lysine, Leu un résidu de leucine, Met un résidu de méthionine, Phe un résidu de phénylalanine, Pro un résidu de proline, Ser un résidu de sérine, Thr un résidu de thréonine, Trp un résidu de tryptophane, Tyr un résidu de tyrosine et Val un résidu de valine, ladite partie contenant au moins un épitope qui
est réactif à un anticorps anti-flavivirus.
2.- Antigène selon la revendication 1, caractérisé
en ce que l'anticorps anti-flavivirus précité est un anticorps antiprotéine V3 de l'encéphalite du Japon.
3.- Anticorps selon la revendication 1, caractérisé 5 en ce que la partie d'une séquence d'acides aminés précitée correspond à la séquence d'acides aminés des ler à 498ème acides aminés comptés à partir de l'extrémité Nterminale
de la séquence d'acides aminés de la formule (I).
4.- Anticorps selon la revendication 1, caractérisé 10 en ce que la partie d'une séquence d'acides aminés précitée correspond à la séquence d'acides aminés des 45ème à 159ème acides aminés comptés à partir de l'extrémité N-terminale de la séquence d'acides aminés de la formule (I). 5.Anticorps selon la revendication 1, caractérisé 15 en ce que la partie d'une séquence d'acides aminés précitée correspond à la séquence d'acides aminés des 375ème à 456ème acides aminés comptés à partir de l'extrémité
N-terminale de la séquence d'acides aminés de la formule (I).
6.- Antigène selon la revendication 1, caractérisé 20 en ce que c'est un peptide fusionné comprenant ladite au moins une partie d'une séquence d'acides aminés représentée par la formule (I) et, attachée à son extrémité C-terminale et/ou N-terminale, une séquence d'acides aminés d'un peptide autre que l'antigène ayant ladite au moins une partie d'une séquence d'acides aminés représentée par la
formule (I).
7.- Antigène sensiblement pur caractérisé en ce qu'il comprend au moins une partie d'une séquence d'acides
aminés selon la revendication 1.
8.- Acide désoxyribonucléique caractérisé en ce qu'il contient une séquence des bases codant pour un
antigène selon la revendication 1.
9.- Acide désoxyribonucléique caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence de bases choisie dans 35 le groupe consistant en une séquence de bases comprenant au moins une partie d'une séquence de bases représentée par la formule (II) qui suit et une séquence de bases complémentaire de ladite séquence de bases comprenant au moins une partie de la séquence de bases de la formule (II): 15
TTT TTC GTG TTG TTG AGC TAT GTG CAC GTG TGG GGA TGC CAG ATT AAC GCG
CCC GGT GAG TTT TTT CTC ACA GAA TCC GGC GTG ACA ATG TAT GCG ACA AGT
AAT TGT CTG GGA ATG GGC ATA GAA GGA GCC AGT GGA GAC TTG GTG CTA GAA GGA ACA ATC ATG GCA AAC GAC GAC GTC CGC ATG ATT AAC CAA CTT GCT GAG GTC AGA CAT GCT TCA GTC ACT GAC GCT CGG TGC CCC ACG ACT AAC GAG AAG CGA GCT GAT TGC AAA CAA GGC TTC ACT GGC AAC GGA TGT GGA CTT AGC ATT GAC ACA TGT GCA ACC AGC AAA GCG ATT GGA CCA GAA AAC ATC AAA TAC TTT GTG CAT GGA ACC. ACC CAT GGG AAT TAT TCA GCG TCC CAG GCG GCA AAG TTT AAT CGT CCT TCG ATA ACC GAC TAC GGA GAA GTC ACG CCA AGG AGT GGA CTG AAC TAC GTC-ATG ACC GTG GTG CTG GTC CAT AGG GAA TGG GCT CTC CCC TGG ACG TCC GCG TGC AGA AAC AGA GAA TTT GAA GAG GCG CAC GCC GTT GTT GCT CTT GGG TCA CTC CAT CAG GCG TTG GCA GTG GAG TAC TCA AGC TCA TCA GGC CAC CTG AAA TGT GAC AAA CTG GCT CTG AAA GGC ATG TGT ACA GAA AAA AAA AAT CCG GCG GAC ACT GTT GTC ATT GAA CTA TCC GAT GGC CCC TGC AAA ATT
AAT GCC GAT AAA ATC AGT
CGT GAC ACT TGG AGC TGC CCA ACA GAA GCT TAC TGC
ATC TCG ACG GGA GAA GCT AGT AGC TAT GAT CGT GGG TTC GGG AAG AAA TTC TCCAGA ACA ATC GAA GTT GCC ACT TCG GAA CAA GTT GGG ACA ATA ACA CTC GGG CTT CTG GAC TGT ACT GAA GCG TCA AAG TCA TTT CAT GAC CCT TCG AGC CTC CTC ATG
ACA CAG GGA GTG AGG GGC TTC GGC TAC CCG
AAA CAG GAA GGA GCC ATC AAG TTA ATG AAA ACA ACC TCG TTC CAC GGA TCT GGG ATT GTC
TCC GTT GCG AGC GTT GGG CGG CTG GTC GCG ACT TCC CTG GTC GAG ATG TCC TAC ATC GTG CAG ATC AAC CAC AGC ACG CTA GGC TTG AAG GGA GCT GGC GAC ACA GCC GGA GGG GTC TTC GTT CAC CAA GTG ACA CTC TTT GGG CAA GGG CTA ATG ATG GCC GTC AAC GCT TTG GCC TTC CTC GTG TTC TTA..... (II)
dans laquelle A
CTC AAT GAC ATG ACC GTG ACA GTG AAC CCT AGT GCC AAC TCA AAG GAA CCC-CCC TTC GGA GTT GGG AGG GGA GAC CAT TGG CAC AAA GCT AAG GCC TTT.TCA ACA CAA AGA CTG GCA GCG TGG GAC TTT GGC TCC AAC TCC ATA GGA AAA TTT GGT GGT GCC TTC GGA ATG TCT TGG ATC GGT GCC CTA CTA CTC GCA CGA GAC CGA TCA TTA GCC ACA GGA GGT GCG ACC AAT GTG CAT
CCC TTC CTG
GAC AAG GGA ACT TTG ATT GCC AGA ACA TGG ATT
GTG GCT
- représenteun résidu d'a-ide désoxyadénylique, G un résidu d'acide désoxyguanylique, 20 C un résidu d'acide désoxycytidylique et T un résidu d'acide désoxythymidylique et les extrémités gauche et droite de la formule (II) représentent le côté du groupe '-hydroxyle et le côté du groupe 3'-hydroxyle, respectivement. 10.- Acide désoxyribonucléique caractérisé en ce qu'il comprend une séquence des bases qui est celle obtenue par substitution d'au moins une base de ladite au moins
une séquence des bases de l'acide désoxyribonucléique de la revendication 9, selon la dégénération du code 30 génétique.
11.- ADN recombinant réplicable caractérisé en ce qu'il comprend un acide désoxyribonucléique selon la
revendication 8 et un vecteur d'expression réplicable.
12.- Micro-organisme ou culture de cellules trans35 formé par un ADN recombinant réplicable selon la
revendication 11.
2599626'
13.- Procédé de production d'un antigène comprenant au moins une partie d'une séquence d'acides aminés selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend: (a) la ligature d'un acide désoxyribonucléique comprenant une séquence de bases codant pour ledit antigène à un vecteur d'expression réplicable pour obtenir un ADN recombinant réplicable comprenant ledit acide désoxyribonucléique et ledit vecteur d'expression réplicable; (b) la transformation de cellules d'un micro10 organisme ou culture de cellules par ledit ADN recombinant réplicable pour former des transformants; (c) la sélection desdits transformants de cellules parentes du micro-organisme ou de la culture de cellules; (d) l'incubation desdits transformants, en 15 forçant lesdits transformants à exprimer ledit acide désoxyribonucléique et à produire un antigène; et (e) l'isolement dudit antigène des transformants incubés. 14.- Vaccin contre le flavivirus caractérisé en 20 ce qu'il comprend: une quantité immunogène efficace d'un antigène selon la revendication 1; et au moins un véhicule, diluant ou excipient
acceptable en pharmacie.
15.- Vaccin selon la revendication 14, caractérisé
en ce que c'est un vaccin contre l'encéphalite du Japon.
16.- Souche JM83/ps22 du micro-organisme Escherichia coli caractérisée en ce qu'elle est déposée
au Fermentation Research Institute sous le numéro 30 d'accession FERM BP1074.
17.- Plasmide pS22 caractérisé en ce qu'il est
porteur d'un gène de la protéine V3.
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