JPH06501151A

JPH06501151A - ｇｐ１６０の誘導体およびアジュバントを含有するｇｐ１６０またはその誘導体に基づくワクチン

Info

Publication number: JPH06501151A
Application number: JP3514926A
Authority: JP
Inventors: ヴァン・ウィナンダール・フラン; スラウィ，モンセフ; ブリュック，クロディーヌ; フランコット，ミリアム; キュメル，シュジイ
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム）
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-21
Publication date: 1994-02-10
Also published as: IE913385A1; CA2092827A1; PT99063A; NZ239948A; EP0644201A1; PT99063B; AU654970B2; WO1992006113A2; KR100194079B1; AU8510991A; EP0550485A1; MX9101275A; WO1992006113A3; KR930702527A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ｇｐ１６０の誘導体およびアジュバントを含有するｇｐ１６０またはその誘導体に基づくワクチン本発明は、新規ワクチンおよび医薬製剤ならびにその製剤化およびＡＩＤＳ治療における使用に関する。特に、本発明は、３−Ｄモノホスホリル脂質Ａでアジュバントしたワクチンにおけるｇｐ１６０の新規な形態を含むｇｐ１６０またはその誘導体の使用に関する。

レトロウィルス、すなわち、当該科内のウィルス、レトロヴイリデ（Ｒｅｔｒｏ ν１ｒｉｄａｅ）は、コア構造内にコイル状ヌクレオカプシドを有し、遺伝物質としてＲＮＡを有する約１５０ｎｍのエンベロープを有する２０面体ウィルスからなる大きい科である。当該科は、肉腫ウィルスおよび白血病ウィルスのようなオンコウイルス、ある免疫不全ウィルスおよびレンチウィルスからなる。

１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）はＡＩＤＳとしても知られている後天性免疫不全症候群の病因学的因子である。このレトロウィルスは、ＬＴＲｌｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子、および他の遺伝子を含む複雑な遺伝機構を有する。このレトロウィルスは、単独で、または保護免疫応答を誘発することができる接種薬物と一緒に、有効な候補である多（のウィルス抗原を有する。

ＨＩＶ−１エンベロープ蛋白は、ポリプロティン前駆体として合成され、これは次に感染細胞内でグリコジル化されて分子量１６０ｋＤａを有する糖蛋白（ｇｐ１６０）を生じ、これは蛋白分解によってｇｌ）１２０体外糖蛋白およびｇｐ４１膜内外蛋白に加工処理される。

プロウィルスＨｒｖに関するＤＮＡコード化領域は文献に開示されているいくつかの免疫不全ウィルスゲノムクローンのいずれかから作製され得る。例えば、ンａ　（Ｓ　ｈａｙ）ら、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２２６　：１１６５　（１９８４）；クレイ７−　（Ｋ　ｒａｗｅｒ）ら、サイエンス、２３１　：１５８０　（１９８６）を参照。別法としては、免疫不全ウィルスゲノムクローンは標準的なりＮＡクローニング法によって臨床学的標本から単離されたウィルスから作製され得る。ガロ（Ｇａｌｌｏ）ら、Ｕ。

Ｓ、特許４，５２０．１１３　：モンタニ＋　−（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ）ら、Ｕ、Ｓ特許４，７０８．８１８を参照。

ＨＩＶ−ＢＨＩ○−２のプロウィルスＤＮＡ配列は、ラットナー（Ｒａｔｎｅｒ）ら、「ヒトレトロウィルスおよびＡ　Ｉ　ＤＳ（Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓ）Ｊ、１９８９、エイチ・アイ・ブイ・シーケンス・データベース（ＨＩ　Ｖ　５ｅｑｕｅｎｃｅＤ　ａｔａｂａｓｅ）、ゲラルド・メイヤーズ（Ｇｅｒａｌｄ　Ｍｅｙｅｒｓ）！、クロスアラモス・ナショナル・ラボラトリ−（Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって開示されている。該配列は、長さ８９３２　、ｂ　ｐであり、ｅｎｖ遺伝子が５５８０−８１５０位に位置しており、その切断部位はアミノ酸５０３および５１１に対応する７０８８位および７１１２位である（これらの残基の後で切断）（ロス・アラモス・データベースに従って番号付けをした）。

本発明は、５０２位および５１０位に、各々、リシンまたはアルギニン以外のアミノ酸を供給するように修飾されたＨＩＶｇｐ１６０を提供するものである。

リシンに代わる好適なものは、ヒスチジン、トレオニン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミンおよびグルタミン酸のような親水性および大きさがりシンと同一なものである。これらのうち好ましいアミノ酸はグルタミン酸である。この好ましい蛋白は、誘導された突然変異によって切断不可能であり、交差中和抗体を誘発することができ、これは蛋白の正しい折畳みに左右される。

より好ましくは、本発明は、特に、相対分子量６４０ｋＤａを有する、オリゴマー形態の本発明の修飾蛋白を提供するものである。当該分子量のｇｐ１６０単量体に基づいて、この形態は四量体であると思われる。これは、ウィルス表面蛋白がウィルス表面から突出しているスパイクをイン・ビボで形成するオリゴマーとして存在するので好都合である。多くの中和エピトープは構造的であるので、天然の抗原の形態を出来る限り近接して模倣することが重要であるのは明らかである。というのは、これが最も関連する免疫応答を供給するからであろう。

好ましい具体例では、本発明は、オリゴマー型の実質的に純粋な形態の、本発明の修飾蛋白を提供するものである。

実質的に純粋な形態とは、少なくとも純度７５％、より好ましくは純度９０％、より好ましくは純度９９％を意味する。

さらに、本発明は、組換え真核宿主細胞中で当該修飾蛋白をコードするＤＮＡを発現し、修飾蛋白生成物を回収することからなる、本発明の修飾ＨＩＶ　ｇｐ１６０の製造方法を提供するものである。

修飾蛋白をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡポリマーは本発明の一部分を形成する。

本発明の組換えＤＮＡ分子は適当な単量体、二量体またはオリゴマー型ヌクレオチド単位の縮合によって本発明に従って製造され得る。

該製造は、化学的に、酵素的に、またはこの２つの方法の組み合わせによって、所望によりイン・ビトロまたはイン・ビボで行われ得る。かくして、ＤＮＡ分子は、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９８５．２４．５０９０−５０９８においてディ・エム・ロバーツ（Ｄ、　Ｍ、　Ｒｏｂｅｒｔｓ）らによって開示された方法のような慣用の方法によって、適当なりＮＡ断片の酵素的連結によって、製造され得る。

ＤＮＡ断片は、適当な制限酵素による所望のヌクレオチドの配列を含有するＤＮＡの消化によって、化学合成によって、酵素重合法によって、またはこれらの方法を組み合わせて得られる。

制限酵素による消化は、２０６〜７０℃の温度で適当な緩衝液中、一般に、５０ μｌ以下の容量で領１〜１０μ９　ＤＮＡで行われ得る。

ＤＮＡの酵素的重合法は、イン・ビトロで、１０°〜３７℃の温度でヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含有する適当な緩衝液中、ＤＮＡポリメラーゼエ（フレノウ断片）のようなりＮＡポリメラーゼを使用して、一般に５０μＩ９下の容量で行われ得る。断片は、Ｔａｑポリメラーゼを使用してポリメラーゼ連鎖反応によって重合および増幅することができる（ピー・シー・アール・プロトコルズ１９８９−ア・ガイド・トウ・メソッズ・アンド・アプリケーションズ（Ｐ　ＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　１９８９−　ａ　ｇｕｉｄｅ　ｔ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、エム・エイ・インニス（Ｍ、　Ａ、　Ｉ　ｎｎ１ｓ）ら編、アカデミツク・プレスを参照）。

ＤＮＡ断片の酵素的連結は、４℃〜室温で適当な緩衝液中、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼのようなりＮＡリガーゼを使用して、一般に５０μ！以下の容量で行われ得る。

ＤＮＡ分子または断片の化学合成は、「ケミカル・アンド・エンザイマティック・シンシシス・オフ・ジーン・フラグメンツーア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｚｔｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ　（エイチ・ジー・ガッセ：／（Ｈ，Ｇ、　Ｇａ５５ｅｎ）およびエイ・ラング（Ａ、　Ｌａｎｇ）編）、ヘルラーク・ヘミイ（Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ）、ワインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）　（１９８２）　、または他の科学刊行物、例えば、エム・ジエイ・ゲイト（Ｍ、　Ｊ　、　Ｇａ１ｔ）、エイチ・ダブリュ・ディ・マッケス（Ｈ，Ｗ、　Ｄ、　Ｍａｔｔｈｅｓ）、エム・ラング（Ｍ、　Ｓ　ｉｎｇｈ）、ビー４ス−スブロート（Ｂ、　Ｓ、　５ｐｒｏａｔ）およびアール・シー・ティトマス（Ｒ，Ｃ，Ｔｉｔｍａｓ）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１９８２．１０．６２４３　：ビー・ニス・スプロートおよびダブリュ・パンワース（Ｗ、　Ｂ　ａｎｎｗａｒｔｈ）、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１９８３．２４．５７７１　；エム・ディーマツテラシイ（Ｍ、　Ｃ，Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）およびエム・エイチ・カルザーズ、テトラヘドロン・レターズ、１９８０．２１．７１９：エム・ディ・マツテウンイおよびエム・エイト・カルザーズ、ジャーナル・オフ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ）、１９８１．１０３．３１８５：ニス・ビー・アダニス（Ｓ、　Ｐ、　Ａｄａｍｓ）ら、ジャーナル・オフ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　、Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ）、１９８３．１０．５．６６１．エヌ・ディ・シンハ（Ｎ、　Ｄ、　５ｉｎｈａ）、ジエイ・ビヤ−ナツト（Ｊ　Ｂｉｅｒｎａｔ）、ジエイ・マクマナス（Ｊ　、　ＭｃＭａｎｎｕｓ）およびエイチ・ケスター（Ｈ，Ｋｏｅｓｔｅｒ）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１９８４．１２．４５３９；およびエイチ・ダブリュ・ディ・マツチイスら、Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｏ・ジャーナル（ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ）、１９８４．３．８０１に開示されたもののような固相法を使用して、慣用のホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホルアミダイト化学によって行われ得る。好ましくは、自動ＤＮＡ合成器を使用することである。

修飾蛋白をコードするＤＮＡポリマーは、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９８２．２９９．７５６−７５８においてジー・ウィンター（Ｇ、Ｗｉｎｔｅｒ）らによッテ、またはヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）、１９８２．１０．６４８７−６５００においてシーラー（Ｚｏｌｌｅｒ）およびスミス（Ｓ　ｍ１ｔｈ）によって開示されたもののような、慣用の方法によって、非修飾蛋白をコードするｃＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によって製造され得る。

本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子からなるベクターおよび該ベクターを含有する組換えワクシニアウィルスにまで拡大解釈される。

該ベクターは、本発明に従ってベクターを切断して無傷のレプリコンを有する直線状ＤＮＡセグメントを得、該直線状セグメントおよび該直線状セグメントと一緒に本発明の組換えＤＮＡ分子を完成する１個以上のＤＮＡ分子を連結するこ。

とによって製造され得る。

本発明の組換え宿主細胞は、本発明のベクターでワクシニアウィルスを形質転換することによって製造され得る。

修飾蛋白生成物は、蛋白単離および精製の標準的な技術によってコンディンヨンドメディウムから単離される。洗浄剤、例えば、Ｄｅｃｙｌ　ＰＥＧ−３００゜Ｄｏ　Ｄｅｃｙｌ　Ｐ　Ｅ　Ｇ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００．　Ｔｈｅｓｉｔ　Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅを添加して、細胞溶解を行い、細胞膜質から修飾蛋白を遊離することができる。これらのうち、Ｄｅｃｙｌ　ＰＥＧ−３００およびＴｈｅｓｉｔ　Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅが好ましく、次いで、ＤｏＤｅｃｌｙ　Ｐ　Ｅ　Ｇ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００修飾蛋白を一連の超濾過工程、超遠心工程、例えば硫酸アンモニウムまたはＰＥＧによる選択的沈澱、ＣｓＣ４またはシュークロースまたはメトリザミド勾配液中での密度勾配遠心、および／または親和性クロマトグラフィー、好ましくは免疫親和性クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ，逆相ＨＰＬＣ，カチオンおよびアニオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分取等電点電気泳動のようなりロマトグラフィ一工程によって精製することができる。免疫親和性クロマトグラフィーを使用する精製が好ましい。精製の間またはその後、修飾蛋白を、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたはＮＡＥで処理して安定性または免疫原性を増強することができる。

本発明のオリゴマー形態の製造について、精製工程の間、緩和条件を使用するのが好ましい。特に、還元剤は避けるべきであり、クロマトグラフィ一工程の間の細胞溶解および可溶化のために、イオン性洗浄剤よりもＤｅｃｙｌ　ＰＥＧ−３００（ポリエチレングリコール３００モノデシルエーテル）のような非イオン性洗浄剤が好ましい。好ましい親和性クロマトグラフィー媒質はレンチルレクチンセファ０−ス（Ｌｅｎｔｉｌ　１ｅｃｔｉｎ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ）であり、好ましい免疫親和性り０７トグラフイー媒質は、グルタルアルデヒド活性化トリサクリル（ＩＢＦ）のような適当７’、＋担体上ニ結合された１７８．１　（ＷＯ９０１０６３５８）（７）ような抗−ｇｐ１６０モノクローナル抗体である。

修飾蛋白は、透析によって除去され得るオクチル・グルコピラノシド洗浄剤の存在下、モノクローナル抗体から吸着され得る。洗浄剤は、それらの理論的な臨界ミセル濃度以上の濃度で使用されるのが好ましい。

本発明に従って製造した修飾蛋白は、ＨＩＶへの暴露の検出用診断薬として有用である。修飾蛋白は、感染予防用または疾病進行の抑制用もしくは予防用ワクチンにも有用である。

本発明は、本発明の修飾蛋白を含有するワクチンおよび医薬組成物に関Ｔるものでもある。このような組成物は、本発明の修飾蛋白の免疫保護量を含有するであろうし、慣用の手段によって製造されていてもよい。

本発明のワクチンでは、当該蛋白の水溶液を直接使用することができる。別法としては、当該蛋白は、予め凍結乾燥してもしなくても、種々の公知のアジュバントのいずれかと混合するかまたはそれに吸収され得る。・このようなアジュバントとしては、限定されないが、水酸化アルミニウム、ムラミル・ジペプチドおよびサポニン、例えば、タイルＡ（Ｑｕｉｌ　Ａ）、３Ｄ−ＭＰＬ　（３脱アンル化モノホスホリル脂質Ａ）またはＴＤＭが挙げられる。さらなる典型的な別法としては、当該蛋白は、リポソームのような微粒子内に被包され得る。さらなる典型的な別法としては、蛋白は、死菌ボルデテラ（Ｂ　ｏｒｄｅｔｅｌｌａ）または破傷風トキソイドのような免疫刺激性巨大分子とコンジュゲートすることができる。

ワクチン製造は、一般に、１９７８、Ｕ、Ｓ、Ａ、メリーランド州バルチモアのユニバーンティ’パーク・プレス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ）、ボラ−（Ｖｏｌｌｅｒ）らによって編集されたニュー・トレンズ・アンド・デイベローブメンツ・イン・バクンーンズ（Ｎｅｗ　Ｔｒｅｎｄｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ）に開示されている。リポソーム内ヘノ被包は、例えば、フラートン（Ｆ　ｕｌｌｅｒｔｏｎ）、Ｕ、Ｓ、特許４゜２３５．８７７によって開示されている。蛋百の巨大分子へのフンジュゲーンヨンは、例えば、リックハイド（Ｌ　１ｋｈｉｔｅ）、Ｕ、Ｓ、特許４．３７２．９４５およびア−ｖ−（Ａｒｍｏｒ）ら、Ｕ、Ｓ、特許４．４７４．７５７によって開示されている。

各ワクチン投与量中の本発明の修飾蛋白の量は、典型的なワクチンにおける有意な副作用を伴わずに免疫保護応答を誘発する量として選択される。このような量は、どの特異的免疫原を使用するか、およびワクチンがアジュバントされるか否かによって変わるであろう。一般に、各投与量は修飾蛋白１〜１０００μ９、好ましくは１０〜２００μｑからなると思われる。特定のワクチンに関する最適使用量は、被験体における抗体力価および他の応答の観察を含む標準的な研究によって評価され得る。最初のワクチン接種の後に、被験体は約４週間のうちにブーストを受け、次いで、感染の危険が存在する限り、６力月ごとにブーストを繰り返すのが好ましい。

本発明は、さらに、宿主にワクチン接種するのに有用な本発明の修飾蛋白およびワクチンの製造における本発明の修飾蛋白の使用を提供するものである。

ＨＩＶ感染に敏感なヒトへのワクチン接種に加えて、本発明の医薬組成物は、ＨＩＶ感染に罹患している患者を免疫治療的に処置するために使用され得る。

したがって、本発明は、前記修飾ｇｐ１．ａｏの有効量を投与することによるＨＩＶ感染に敏感であるかまたは罹患しているヒトの処置方法を提供する。

例えば、°組換え技術によって製造されたサブユニット成分を使用する概念と一致して、免疫応答の両腕（中和抗体および有効細胞媒介免疫性（ＤＴＨ）が製造されるような宿生免疫系に対する有効な免疫原を生じるためにアジュバントおよび／または担体が必要となる。本発明に関連して、（すなわち、ＨＩＶ感染の予防的または治療的処置において）、本発明者らは、免疫刺激成分、３ＤＭＰＬが免疫系の両腕を刺激できることを発見した。

したがりて、本発明は、好ましくは、ｇｐ１６０またはその免疫的誘導体および３Ｄモノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰ’Ｌ）ならびに適当な担体からなる医薬製剤を提供するものである。

本発明の好ましい具体例では、ｇｐ１６０またはその免疫的誘導体および３Ｄ− ＭＰＬは水中油エマルジョン中に存在する。この系は増強された中和活性を供その免疫的誘導体、３Ｄ−ＭＰＬからなり、該担体が緩衝化生理食塩水溶液中のテトラポリオールおよび非毒性鉱油のエマルジョンからなる医薬的またはワクチン製剤を提供する。

好ましくは、担体は、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）　Ｌ　１２１のようなプルロニック型ポリオール、およびスクアランまたはスクアレンまたは他の代謝可能な油からなる。エマルジョンを安定化させるために、トゥイーン（Ｔｖｅｅｎ）　８０またはトゥイーン２８のような乳化剤を供給するのが好ましい。

担体は、好ましくは、１００〜４００ｎｆｆｌのサブミクロン粒子だけを含有する。

最終製剤中の抗原の濃度は、１０μｇ〜１５０μｇ／ｘｉ、好ましくは２０μ９〜１００μｇ／ＩＩｌである。

ワクチン中のアジュバント、３Ｄ−ＭＰＬの濃度範囲は、好ましくは１０μ９〜１００　ａｙ／ｗｌ、より好ましくは２５〜５０μｇ／翼ｌである。

本発明は、また、医学用の、特に、ＡＩＤＳもしくはＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）のようなＨＩＶ−１感染の免疫治療による処置および予防処置用の本明細書に記載のワクチン製剤を提供する。

また、本発明は、ｇｐ１６０またはその免疫的誘導体を担体とおよび３Ｄモノホスホリル脂買Ａと混合することからなる、ｇｐ１６０またはその免疫的誘導体、３Ｄモノホスホリル脂質Ａならびに適当な担体からなるワクチンの製造方法を提供する。

具体的には、水中油エマルジョンが微細流動化されて、該エマルジョン中にサブミクロン粒子を供給し、ｇｐ１６０またはその免疫的誘導体および３ＤＭＰＬと混合されることを特徴とする水中油担体中の本明細書に記載のワクチンの製造方法を提供する。

典型的には、３Ｄ−ＭＰＬはエマルションとプレミックスされ、その後、得られた組成物中に抗原を混合する。

３Ｄ−ＭＰＬは英国特許２２１１５０２に開示されている方法によって得られ得る。

これに関連する適当な担体は水中油エマルションからなる。本発明の製剤は、アジュバントとしてミョウバン（ヒト用に許可された唯一のアジュバント）だけからなる慣用のワクチン製剤と比較すると増強された中和力価を供給する。

本明細書で使用する免疫的誘導体なる語は、３Ｄモノホスホリル脂質ＡでアジュバントされるとＨＩＶ−１に対する中和抗体を生じることができるｇｐ１６０の免疫原性断片を含む。故に、これは、例えばＨＩＶ−１外膜糖蛋白ｇｐ１２０、本明細書に記載の修飾ｇｐ１６０および天然の単離されたｇｐ１６０を含むであろう。特に好ましくは、ＤＴＨ応答を生じることもできるこれらの誘導体である。

かくして、最も好ましくは、本発明は、緩和非還元条件下で精製すると、外見上の分子量６００〜７００ＫＤａ　６４０Ｋｄを有することを示し、四量体であると思われるオリゴマー形態の蛋白の修飾形態を提供する。この四量体は、非還元条件下でＳＤＳゲル上に蛋白を加えることによって不安定にし、次いで、これは３３０ｋｄの二量体および単量体を供給する。二量体を標準的な還元条件でさらに還元して単量体を得ることができる。

ｇｐ１６０の全ての形態は、本発明の製剤に使用され得る。

ｇｐ１６０またはその誘導体の製造は、当該技術分野で公知の方法によって行われ得る。典型的には、これは、適当な宿主においてｇｐ１６０をコードする遺伝子のクローニングおよび発現を含むであろう。このような方法における組換えｇｐ１６０（ｒｇｐ１６０）の製造は、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クローニング−７−ラボラトリ−”　マ：−ユアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリングＨハーバ−１１９８２に開示されている技術を使用して行われ得る。

種々の真核細胞および発現系は、組換えＤＮＡ分子の発現に利用可能である。

これらのうち最も広範囲に使用されるものは、酵母、昆虫および哺乳動物系であるが、本発明は、これらの使用に限定されない。このような系は、本発明の組換えＤＮＡ分子、所望により選択マーカー、場合によっては、複製起源のような維持機能を使用する。

本発明で使用され得る昆虫細胞としては、ンヨウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞および鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）細胞が挙げられる。有用なショウジヨウバエ細胞としては、Ｓｌ、Ｓ２、Ｓ３、ＫＣ−○およびディ’ヒイデイ（Ｄ、　Ｈｙｄｅｉ）細胞が挙げられる。例えば、ンユナイダー（Ｓ　ｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、ジャーナル・オフ・エンブリオロジー・アンド・イクスペリメンタル・モルホロジー（Ｊ　、　Ｅ　ｍｂｒｙｏｌ、　Ｅ　ｘｐ。

Ｍｏｒｐｈ、　）、２７　：　３５３（１９７２）＋シュ／しン（Ｓ　ｃｈｕｌｚンら、プｏンーデインダス・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　、Ａ）、８３　：　９４２８（１９８６）；　ンンクレイア−（Ｓ　１ｎｃｌａｉｒ）ら、モレキュラー・アンド・セルーラー・バイオロジー（Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂ　ｉｏｌ、　）、５　：　３２０８（１９８５）を参照。

ショウジヨウバエ細胞は、リン酸カルシウム沈殿、細胞融合、電気泳動およびウィルス・トランスフェクションを含む標準的な技術によってトランスフェクトされる。細胞は、例えば平衡塩および必須アミノ酸からなるＭ３培地を含む種々の栄養培地中、標準的な細胞培養法に従って培養される。リントクイスト（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ）、ＤＩＳ、５８　：　１６３（１９８２）を参照。

ショウジヨウバエにおいて有用であることが知られているプロモーターとしては、ＳＶ４０のような哺乳動物細胞プロモーターおよびショウジヨウバエ・プロモーターが挙げられ、後者が好ましい。有用なショウジヨウバエ・プロモーターの例としては、ショウジヨウバエ・メタロチオネイン・プロモーター、７０キロダルトン熱シヨツク蛋白プロモーター（Ｈ３Ｐ７０）およびＣ０ＰＩＡ　ＬＴＲが挙げられる。例えば、ジノセラ（ＤｉＮｏｃｅｒａ）ら、プロシーディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ、８０　；　７０９５（１９８３）；マクガーリベＭｃＧａｒｒｙ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、４２　：　９０３　（１９８５）を参照。

有用な鱗翅類細胞としては、トリコブルシア・二（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）、スポドブテラ・フルギベルダ（Ｓ　ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ヘリオチス・ゼア（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｚｅａ）、アウトグラフイカ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、ラチブルンス・オウ（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉｓ　ｏｕ）、ガレリア・メロネラ（Ｇａｌｌｅｒｉａ　ｍｅｌｏｎｅｌｌａ）、マンデュカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａ）由来の細胞、または、核多角体病ウィルス（ＮＰＶ）、単一ヌクレオチドンド・ウィルス（ＳＮＰＶ）および多重ヌクレオチドンド・ウィルス（ＭＮＰＶ）を含むバキュロウィルスで感染され得る他の細胞が挙げられる。

好ましいバキュロウィルスは、ＮＰＶまたはＭＮＰＶバキュロウィルスである。

というのは、これらは、感染細胞中で非常に発現される多角体遺伝子プロモーターを含有するからである。特に、以下に例示するアウトグラフイカ・カリフォルニカ（、Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）（ＡｃＭＮ　Ｐ　Ｖ）由来のＭＮＰＶウィルスである。しかし、他のＭＮＰＶおよびＮＰＶウィルスは、カイコ・ウィルス、ホムビイクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）を使用することができる。鱗翅類細胞は、前記のとおり、標準的な技術によって、本発明の組換えＤＮＡ分子からなるＤＮＡおよび感染性バキュロウィルスのＤＮＡとトランスフェクトされる。細胞は、例えば、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を補足したＴＣｌｏｏ（ギブコ・ニーロブ（Ｇｉｂｃｏ　Ｅｕｒｏｐｅ）、ガーディナー（Ｇ　ａｒｄｉｎｅｒ）ら、ジャーナル・オフ・インバーチプレイテッド・バ’１０ジー（Ｊ　、　Ｉ　ｎｖｅｒｔｅｂ、　Ｐａｔｈｏｌ、　）、２５：３６３　（１９７５））を含む種々の栄養培地中で標準的な細胞培養技術に従って培養される。ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、編集二セットロウ（Ｓ　ｅｔｌｏｖ）ら、ジエネティク・エンジニアリング・プリンシプルズ・アンド・メソッズ（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　：　Ｐｒ１ｎｃｏｐｌｅｓａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｃｌｓ）、第８巻、ニューヨーク、ブレナム、１９８６、第２７７〜２９８頁を参照。

鱗翅類細胞用プロモーターとしては、バキュロウィルス・ゲノム由来のプロモーターが挙げられる。多角体蛋白が他のバキュロウィルス蛋白と比較して自然に過剰に発現されるので、多角体遺伝子のプロモーターが好ましい。ＡｃＭＮＰＶウィルス由来の多角体遺伝子プロモーターが好ましい。サマーズ（Ｓ　ｕｍｍｅｒｓ）ら、ＴＡ、ＥＳ　Ｂｕｌｌ、ＮＲ１５５，１９８７年５月ニスミス（Ｓ　ｆｆ１ｉｔｈ）ら、ＥＰ−Ａ−１２７，８３９ニスミスら、プロシーディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ、８２：８４０４（１９８５）；およびコクラン（Ｃｏｃｈｒａｎ）、ＥＰ−Ａ−２２８，０３６を参照。

哺乳動物細胞における発現について、組換えＤＮＡ分子は、同様に、クローニングベクター内でクローン化され、次いで、哺乳動物細胞をトランスフェクトするのに使用される。ベクターは、好ましくは、例えば、ＤＨＦＲ発現カセットのような遺伝子増幅のためのさらなるＤＡＮ機能からなり、例えば、６４１８選択のためのネオマイシン耐性カセットのような選択および／または増幅のためのさらなる機能からもなり得る。転写増強のためのような他の機能も使用され得る。

また、他の機能は、所望により、ラン乳頭腫ウィルスの維持機能のような安定なエビソーム維持のためのベクター内からなり得る。別法として、好ましくは、クローニングベクターは、ワクシニアウィルスのような組換え哺乳動物ウィルスである。

ワクシニアウィルスは、組換えがワクシニアＤＮＡの可欠領域における異種遺伝子の組込みによって容易に構築され、かくして、感染性を維持し得る点で特に有用なベクターである。適当に操作すると、蛋白が合成され、処理され、感染細胞の膜にトランスポートされる。ワクシニアウィルス感染は、細胞死を導くが、あまり溶解せずに、細胞の大部分が無傷で残り、感染細胞から所望の蛋白を容易に抽出させる。ワクシニア発現系は、パレット（ｆ３　ａｒｒｅｔｔ）ら、エイズ・リサーチ・アンド・ヒユーマン・レトロバイランズ（Ａｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏ−ｖｉｒｕｓｅｓ）、１９８９；５：１５９−１７１によって研究された。

有用な哺乳動物細胞としては、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯ３−７、ＣＶ−Ｉ、ＢＨＫ−２１、マウスもしくはラット骨髄腫、ＨＡＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａＳＭＲＣ−５およびＷＩ３８のようなヒト２倍体細胞、またはニワトリ・リンパ腫細胞株が挙げられ、ｃｖ−ｒおよびＢＨＫ−２１が好ましい。

トランスフェクションおよび細胞培養は標準的な技術によって行われる。哺乳動物細胞の製造は、遺伝子導入動物における発現によって行うこともできる。

哺乳動物細胞株または哺乳動物−次細胞における遺伝子発現を駆動するために有用な調節配列は、ＳＶ　４０初期および後期遺伝子プロモーター、メタロチオネイン・プロモーター、ラウス肉腫ＬＴＲのようなウィルス性ＬＴＲ’ｓ、モロニー肉腫ウィルス（ＭＳＶ）ＬＴＲまたはマウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）ＬＴＲ。

アデノウィルス主要後期プロモーターおよびハイブリッドＢＫウィルスおよびアデノウィルス主要後期プロモーターのようなハイブリッド・プロモーターが挙げられる。調節要素領域は、ポリアデニル化のための領域のような下流の機能、または、転写増強配列のような他の機能からもなり得る。

本発明の実施において使用され得る酵母としては、ハネンズラ属（Ｈａｎｅｎｓｕｌａ）、ビヒア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クルベロマイでスＩ）！ｉ（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、フッオサツカ０フイセス属（Ｓ　ｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）およびサツカロマイでス属（Ｓ　ａｃｃｈｏｒｏｍｙｃｅｓ）のものが挙げられる。サツカロマイセス・セレビシェ（Ｓ　ａｃｃｈｏｒｏＩｌｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は好ましい酵母宿主である。有用なプロモーターとしては、銅誘導性（ＣＵＰｌ）プロモーター、解糖遺伝子プロモーター、例えば、ＴＤＨ３、ＰＧＫおよびＡＤＨ，ならびにＰＨ○５およびＡＲＧ３プロモーターが挙げられる。例えば、ミャノハラ（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ）ら、プロシーディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミ− ・オフ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ、８０゜１（１９８３）：メロ（Ｍｅｌｌｏｒ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、２４　：　１（１９８３）；ヒンツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２１９　：　６２０（１９８３）：カベジン（Ｃａｂｅｚｏｎ）ら、ブロン−ディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ、８１　：　６５９４（１９８４）を参照。

ＢＨＩＯ分子クローンのＨＩＶ　ｅｎｖ遺伝子を突然変異誘発させて前駆体切断を廃止した。

このために、これらの配列に存在する「切断配列Ｊ　ｌｙｓ　ａｌａ　ｌｙｓ　ａｒｇおよびａｒｇｇｌｙ　ｌｙｓ　ａｒｇを、部位特異的突然変異誘発によってｌｙｓ／ａｒｇ　ｘ　ｇｌｕ　ａｒｇに修飾しＢＨｌｏ　ＡＡＧ　ＧＣＡ　ＡＡＧ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＧＴＧ　ＧＴＧユＧＡユωはｙ講Ａニア０−ン：　Ｌ” Ｓ　ＡＬＡ　ＬＹＳ　ＡＲＧ　λＲＧＶλＬ　ＶＡＬ　ＧＬＮ　入ＲＧ　ＧＩＵ　二ＹＳＡ只Ｇを　↓　↓ ＡＡＧ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　Ｇ丁ＣＧτＧ　ＣＡＧ　ＡＧＡ　Ｇ導入　ｇＡＡ　ＡＧＡＬＹＳ　ＡＬＡΩＬＵ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　ＶＡＬ　ＶＡＬ　ＧＬＡ　ＡＲＧ　ＧＬＵ　９Ｕ　ＡＲＧに突然変異させた。

完全な突然変異ｅｎｖ遺伝子（ヌクレオチド５８０２−８４７８）をワクシニア・プラスミド・トランスファ町ベクターｐＧｓ２ｃｌ中にクローン化し［マヶットエム・ジー（Ｍａｃｋｅｔｔ　Ｍ、　Ｇ、　）、スミス・エル（Ｓｍｊ、ｔｈ　Ｌ、）おヨヒモスーヒ−（Ｍｏｓｓ　Ｂ、　Ｘ　１９８４　）ジャーナル・オフ・パイロロジー（Ｊ　、　Ｖ　ｉｒｏｌｏｇｙ）　４９　：８５７−８６４３　、組換えによって感染性ワクシニアウィルス中にトランスファーした。組換えワクシニアプラークを、カブチャーＥＩＡによってｅｎｖ発現についてスクリーニングし、陽性プラークをＣＶ−１細胞上で２回再クローン化した。これらの細胞株における非切断ｇｐ１６０の製造は、さらに、組換えワタシニアによって感染した細胞の代謝性標識化の後、ＲＩＰＡによって立証された。

細胞表面発現は、抗ｇｐ１２０抗体を使用して無傷細胞表面の蛍光標識によって確認された。

（１ｉ）足場依存性細胞から修飾ｇｐ１６ｏの精製（ｉ）からのＨＩＶ　ｇｐ１６０エンベロープ蛋白を、三二程プロトコル：宿生細胞の溶解および洗浄剤の補助による抗原の抽出、次いで、２つの親和性クロマトグラフィ一工程で精製した。全ての精製工程は４℃で行った。

工ｆｕｌ：　ｃｖ−１細胞の溶解および抗原ｇｐ１６０の抽出解凍した後、細胞懸濁および培養液２０Ｊに対応する微小担体ビーズを２，２゜Ｏｘｇで１５分間遠心し、上清を廃棄した。沈殿物を、１５０１＆Ｍ　ＮａＣＡ、１％ポリエチレングリコール３００モノデンルエーテル（Ｄｅｃｙｌ　ＰＥＧ）およヒ２゜紅ｇ／＊ｌアプロチニンを補足した３０冨Ｍ）リス／ＨＣｐ緩衝液（ｐＨ８）ｌｊ！に再懸濁した。水上で１時間、時折手動で振盪しつつ、細胞を溶解し、１１．３００Ｘｇで２０分間遠心した。上清の分離後、ペレットを溶解緩衝液４ｏｏｍｌで洗浄し、１１．３００ｘｇで２０分間遠心した。細胞デブリおよび微小担体ビーズを廃棄し、合わせた上溝をさらなる精製のために使用した。

溶解物を、１５０ｗＭ　ＮａＣ１および０．１％Ｄｅｃｙｌ　ＰＥＧを補足した３０＊Ｍトリス／ｌ−１ｃｌ緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したレンチル・レクチン・セファロース４Ｂ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）−ＬＫＢ）カラム（２，５ｃｍＸ　２０（：ｌ）上でクロマトグラフィーに付した。流速ｌ　ｍｌ１分で溶解物を付加した後、カラムをＩＭＮａＣｌおよび０．１％ＤｅｃｙｌＰＥＧを補足した３０ｍＭトリス／ＨＣｊ’緩衝液（ｐＨ８）で洗浄した。次いで、抗原を平衡化緩衝液中０．５Ｍメチルａ”Ｄ−マノピラノシドでカラムから溶出させ、ｇｐ１６０陽性画分をプールした。流速５．５ｚｌ！／分で洗浄および溶離工程を行った。

１８３：　Ｉ７８．１−１−リヤクリル上での免疫親和性クロマトグラフィー蛋白Ｇ−セファロースカラム（ファルマシアーＬＫＢ）上で腹水から抗−ｇｐ１６０モノクローナル抗体１７８．Ｈ特許公開Ｗ０９０１０６３５８）を精製し、次いで、製造者のガイドラインに従って、グルタルアルデヒド−活性化トリサクリル（ＩＢＦ）上に結合させた。抗原のｇｐ１２０成分上のエピトープ（Ｖ３ループ）に対して指向する抗体を１．５　ｚｇ／　ａｌｌゲルの濃度で結合させた。

樹脂をカラム（２，５ｃｍＸ　１０ｃｍ）中に充填し、１５（ｈＭ　ＮａＣ１および０．１％ＤｅｃｙｌＰＥＧを補足した３０冨Ｍトリス／ＨＣＩ！緩衝液（ｐＨ８）中で平衡化させた。

カラム上にレンチル・レクチン・セファｏ−ス４Ｂ溶離液を、１ｗｌ／分で一晩、リサイクルすることによって付加した。次いで、該カラムを、ＩＭＮａ（Ｊおよび１％ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＰ）を補足した３０款Ｍトリス／ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８）２０カラム容量で流速３．３ｍｊｌ１分で洗浄した。最後に、抗原を、１％○ＧＰを補足したＯ、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３，３）で同一流速で溶離した。次いで、溶出画分をＩＭトリス／Ｈ（Ｊ（ｐＨ８，８）で中和し、抗原陽性画分をプールした。

（注）蛋白測定標準としてウシ血清アルブミンを使用して、ブラッドフォード（Ｂ　ｒａｄｆｏｒｄ）の方法（ブラッドフォード、１９７６）によって蛋白濃度を測定した。

（ｔｖ）　抗原測定カブチャーリングモノクローナル抗体としてヒツジ抗−ｇｐ４１および指示モノクローナル抗体としてネズミ抗−ｇｐ１２０を使用する社内で開発したサンドイッチＥＬＩ　ＳＡによってｇｐ１６０抗原の量を測定した。さらなる検出は、古典的ビオチニル化抗マウス抗体、ストレプトアビジンおよびペルオキシダーゼ系レムリ（Ｌａｅｏ＋ｍ１ｉ）の方法（レムリ、１９７０）に従って、１０％ポリアクリルアミドゲル中で５ＤＳ−スラブゲル電気泳動を行った。移行の後、過ヨウ素酸酸化の後に銀染色によって蛋白を可視化した（バス（Ｐ　ａｓ）染色）（デュブレイ（Ｄｕｂｒａｙ）ら、１９８２）。

還元剤の存在下および不在下で電気泳動を行った。トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）（トウビンら、１９７９）に従って、ニトロセルロース上でのウェスターンブロッティングによって蛋白バンドをさらに同定し、ｇｐ１６０抗原に対してまたは宿主細胞（ＣＶ−１）もしくはワクンニア蛋白に対して指向する抗体でプローブした。

（ｖｉ）　１７８．１モノクローナル抗体の漏出精製したｇｐ１６０抗原におけるモノクローナル抗体１７８１の存在は、ＥＬＩＳＡによって測定した。ヤギー抗ネズミ抗体によって抗体を捕獲し、ビオチニル化抗マウス抗体で検出した。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ系でさらに検出した。

（■）純粋なｅｎＶ　ｇｐ１６０のサイズ排除クロマトグラフィー精製したｇｐ１６０を、１％ＯＧＰを補足した０、２Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）中で平衡化したＴＳＫ、４０００　ＳＷ　ＨＰＬＳカラム（７，５ｘｘＸ３００＋ｎ）上でクロマトグラフィーに付した。流速はＯ７７５ｍＡ／分であり、カラム画分をＥＬＩｓＡによって抗原について分析した。

（ｖｉ）　純度測定還元条件下で５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって各精製工程後に純度を概算した。Ｐ　Ａ　Ｓ染色によって蛋白バンドを可視化し、さらにウェスタン・プロッティングによって同定した。

結果は、明らかに、免疫親和性カラム上でのクロマトグラフィーの後に抗原が検出可能な汚染蛋白を含まないことを示した。しかし、最終生成物は免疫親和性カラムから漏出する痕跡量のモノクローナル抗体で汚染されるかもしれない。したがって、純粋なｇｐ１６０中の１７８１抗体の量は、ＥＬＩＳＡによつて測定され、試料中に存在する蛋白の合計量は領００４％〜０．０２％の範囲であった。

ｇｐ１６０のオリゴマー形態の存在について純粋な抗原を分析した。オリゴマーの形態は、エンベロープ蛋白がピリオンの表面でスパイクとして配置されるウィルスにおけるｇｐ１６ｃｌの構築を反映する。抗原の一次配列におけるンステインの存在は、ジスルフィド架橋によって結合される（ホモ〜）オリゴマーを形成させる。これは、β−メルカプトエタノールの存在および不在下で、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって示された。還元剤なしで、抗原は、洗浄剤（ＳＤＳ）の存在下でさえ、１６０．０ＯＯＤａよりも大きい分子塊の蛋白バンドを示した。これに反して、抗原が還元剤の存在下で沸騰されると、１６０ｋＤａで単一蛋白バンドが観察された。オリゴマー構造の大きさを測定するために、抗原をＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。公知の分子量の標準を用いるカラム目盛りからｇｐ１６０分子のほとんどが６４０．０００Ｄａの分子量に対応する保持時間で溶出することが判明した。したがって、洗浄剤の存在下、還元剤の不在下で、ＨＩＶ　ｇｐ１６０　ｅｎｖ蛋白のほとんどが四量体構造中に組み込まれた。

（ＩＸ）分析最終生成物は、溶解物のＥＬＩ　ＳＡ含量（培養物１１当たりＥＬＩ　ＳＡによる抗原０．８〜１．４ｕ）に適合する約２の抗原／蛋白比を示した。

実施例２ＢＨＫ−２１における修飾ｇｐ１６０の発現および懸濁液中で培養された細胞からのｅｎＶ　ｇｐ１６０の精製組換えワクシニアウィルスで実施例１（１）に記載と同様の方法によってＢＨＫ −２１細胞中で発現されたＨＩＶ　ｇｐ１６０エンベロープ蛋白を、溶解工程でいくつかの小さい変形以外は実施例（ｉｉ）に概略記載した計画に従って精製した。

ＩＮＩ：　ＢＨＫ−２１細胞の溶解および抗原ｇｐ１６０の抽出解凍後、細胞Ｗｆ！濁液（細胞１０”個）を２．２００ｘｇで１５分間遠心し、上清を廃棄した。１５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ、１％ポリエチレングリコール３００モノデシルエーテル（Ｄｅｃｙｌ　ＰＥＧ）および２０菖ｃｇ／諷ｌアプロチニンを補足した３０１μＭトリス／ＨＣＩ！緩衝液（ｐＨ８）５０ｍ！！に該細胞ベレットを再懸濁した。氷上で１時間、時折手動で振盪しつつ、該細胞を溶解し、１１，３００ｘｇで１５分間遠心した。

上清の分離後、ペレットを溶解緩衝液２Ｑｔ！で洗浄し、１１，３００ｘｇで１５分間遠心した。該ベレットを廃棄し、合わせた上清をさらなる精製に使用した。

ワクシニアから精製したｒｇｐ１６０（各投与量当たり１００μｑまたは２０μ ９）（実施例１）を、１５（ｂＭ　ＮａＣ１、ｌＱｉＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６，８）ＩＩＡ中０５μｇ当量ＡＩ”に相当する水酸化アルミニウム（ミョウバン）上に４℃で一晩吸看させた。−晩インキュベーション後、アジュバント調製物を遠心し、上清を除去した。次いで、ミョウバン結合ｒｇｐ１６０に３Ｄ−ＭＰＬ　１００μ９を含有する等量の吸着緩衝液を添加した。９５％よりも大きいｒｇｐ１６０が水酸化アルミニウム上に吸着したことが判明した。

３（ｂ）　ｒｇｐ１６０−３Ｄ−ＭＰＬ水中油エマルジョン以下のとおり、賦形剤を調製した。０．４％（ｖ／ｖ）ｈウィーン（Ｔｗｅｅｎ）　８０を含有するリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）にプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）　Ｌ　１２１５％（ビー−エイ・ニス・エフ・ワイアンドット（Ｂ　Ａ　Ｓ　Ｆ　Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ）、ニューノヤーンーＸＶ／Ｖ）および１０％スクワラン（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））を添加した。次いで、この混合物を微小流動化した。微小流動化に関しては、微小流動化器（モデル（Ｍｏｄｅｌ）Ｍ１１０マイクロフルディクス・コーポレイション（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ　Ｃａｒｐ、　）、−ユ）：／、マサチューセッツ州）を介しテエマルジョンを１０回循環した。得られたエマルジョンはサブミクロン粒子だけからなっていた。このエマルジョン１容量を当量の２倍濃縮ｒｇｐ１６０（２０μ９または１００μｇ）と混合し、簡単に渦巻し、確実に成分の混合を完了させた。次いで、このｒｇｐ１６０ｏ／ｗエマルジョンに１００Ａｌｙ／ｚｌ　３Ｄ−ＭＰＬを添加した。最終調製物は、注射投与量ＩＮｌ中０．２％トウイーン８０．２．５％プルロニックＬ１２１．５％スクワラン、１００μｇ３Ｄ−ＭＰＬおよびＩ”ｇｐ１６０（１００μ９または２０μｇ）からなっていた。

５ＡＦ−１（シンテックス・アジュバント製剤−１）（バイヤーズ・エフ・イー（Ｂｙａｒｓ　ＮＥ）およびアリソン・エイ・シー（Ａｌｌｉｓｏｎ　Ａ、　Ｃ，Ｘ１９８７）バクシン（Ｖａｃｃｉｎｅ）５　：　２２３−２２７）中の修飾ｇｐ１６０（実施例１）５（ｂｚｙの注射を月１回の間隔で３回行ってモルモット５匹を免疫化した。当該モルモットの第２回目の免疫化の２週間後および１力月後、ならびに第３回目の免疫化の２週間後に血清を試験した。結果を第２表に示す。

ＨＩＶ−１（ｍＢ）感染細胞の溶解物に基づくカブチャー酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）を使用して、第１および第２ブースト後の抗血清のＥＬＩＳＡ力価を決定した。使用した試験は、ムーア（Ｍｏｏｒｅ）らによって開示されたもの〔ムーア・ジエイ・ビー（Ｍｏｏｒｅ　Ｊ、Ｐ、）ら、１９８９、ＡＩＤＳ、３　：　１５５（６３）］と非常に類似している。

マイクロプレート中和アッセイは、指示細胞におけるＨＩＶ　ｇａｇ抗原の検出に基づいている。すなわち、指示細胞として５ｕｐＴ１細胞（ヘクト（Ｈｅｃｈｔ）ら、１９８４、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２２６　：１４４５）を使用する。ウィルス接種物は、ＨＩＶ−１（ＩＩ［Ｂ）生産リンパ球細胞株の細胞不含上清からなる。該上清を高速で遠心し、細胞および細胞デブリを除去し、１ｍｌバイアルに入れ、使用するまで一８０℃に貯蔵する。試験されるべき血清を、試験前に５６°Ｃで３０分間インキュベートする。本発明者らの負の対照は、予備免疫またはアジュバントだけを接種した動物（試験されるべき血清と同一の種）からの血清のプールからなる。中和について、７５０　ＴＣＩＤｓｏを血清の一連の２倍希釈物と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。次いで、５ｕｐＴｌ細胞（細胞４．１０’個／ウェル）を添加し、３７℃で４日間インキュベートした。細胞変性効果を顕微鏡でモニターし、各ウェルにトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ−１００（最終濃度１％）を添加し、プレートを冷凍した。サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、培養物中で生産されたウィルス抗原の相対量をモニターした。該プレートを抗ｐ５５モノクローナル抗体で被覆する。前記トリトンＸ−１００処理試料をプレート中でインキュベートし、ビオチニル化ＨＩＶ− １＋ヒトＩｇＧ、次いでストレプトアビジン・ベルオキシダーゼ工程によってｇａｇ抗原の存在を可視化する。次いで、対照に対するＨＩＶ−１抗原生産の減少のパーセントを全ての試験された血清希釈物について評価する。非線形最小二乗分析によるデータポイントに適合する曲線を使用して、対照と比較する抗原生成物を５０％減少させる血清希釈を（あるとすれば）補性する。

第２表は、第３回目の免疫化後の中和抗体力価を示す。

第２のブースト後に観察される中和力価は、感染したヒト由来の血清中にあるものを越えている。正確には、ＨＩＶＩ［［Ｂ単離体に対する本発明者らの抗血清の中和力価は、５つの血清陽性（ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ）ＷＨ○参照血清（マクキーティング（ＭｃＫｅａｔｉｎｇ）ら、１９８９、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、７０：３３２６　３３３３）の１グループについて観察されたものよりも平均４倍高い。一連のＨＩＶ−１単離体の中和（交差中和）は、より低い感受性および力価が得られるより厳密な中和試験を使用してワイス（Ｗｅｉｓｓ）博士の研究所（チニスター・ビーティ・ラボラトリーズ（Ｃｈｅｓｔｅｒ　Ｂｅａｔｔｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、イギリス国）によって試験した０第３表に示す結果は、２種類のブリードを有する３つの場合について再生され、アフリカ菌株（ＣＢＬ−４）を含む種々のＨＩＶ−１％株の良好な交差中和を示す（第３表参照）。

ワクシニアｇｐ１６０（実施例１）で免疫化されたモルモット由来の血清（０１ −０５）は第３回目の免疫化の後に良好な交差中和力価を示す。

３回の投与の後に観察された強い交差中和応答のために、本発明のワクシニアｇｐ１６０は、ＨＩＶ−１ワクチン接種に有効に使用されると思われる。

実施例５種々のワクチン製剤の、アカゲザルにおける精製ＨＩＶワクシニア組換えｇｐ１６０（ＩＩＩＢ単離体）の免疫原性への効果の研究この研究では、アカゲザル（マカカ・ムラツタ（Ｍａｃａｃａ　ｍｕｌａｔｔａ））において、種々のワクチン製剤の、精製ワクシニア組換えｇｐ１６０の免疫原性を増強する能力を評価した。試験されたアジュバントは、３Ｄ−ＭＰＬ（実施例２ｂＸ３Ｄモノホスホリル脂質Ａ、リビ（Ｒｉｂｉ））と組み合わせた水酸化アルミニウム（アルヒドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）、スパーホス（Ｓ　ｕｐｅｒｆｏｓ）、デンマーク）、水中油エマルジョン中の３Ｄ−ＭＰＬ（実施例２ａ）であった。

体重３．５〜５に９のアルヒドロゲル（マカカ・ムラツタ）を１グループ当たり３または４匹を含む７つのグループに任意に分けた。

以下のとおり、グループを、３つのアジュバント製剤化において製剤化した種々の投与量のｒｇｐ１６０で免疫化した。

グループ１（サル４匹）：水酸化アルミニウム＋３Ｄ−ＭＰＬに吸着したｒｇｐ１６０　１００μ９゜グループ２（サル４匹）：水酸化アルミニウム＋３Ｄ−ＭＰＬに吸着したｒｇｐ１６０　２０μ９゜グループ３（サル４匹辷○／Ｗエマルジョン中ｒｇｐ１６０＋３Ｄ−ＭＰＬ１００μ９゜グループ４（サル４匹）：０／Ｗ工フルジョン中ｒｇｐ１６０＋３Ｄ−ＭＰＬ２０μ９゜５、ｌ、抗原−アシュバント調製物使用直前に全てのｒｇｐ１６ｏ製剤を調製した。各注射投薬を１ｙｓｌ容量で投与した。

０日目および３５日目に、アカゲザルのグループに種々のｇｐ１６０製剤を投与量１ｍｌで上腕二頭筋に筋肉内注射した。第２の免疫化の２週間後、該動物を抗体測定のために採血した。

５．２．　リード・アウト第２の注射の２週間後にこれらの動物から採取した血清をＥＬＩＳＡおよび中和アッセイで試験した。

５．３．　ＥＬＩＳＡ一般的なプロトコルがシリアート（Ｔｈｉｒｉａｒｔ）ら（シリアートら、１９８９、ジャーナル・オフ・イムノロジー（Ｊ、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ）、１４８６　：　８３２　：１８３６）で開示されたカブチャー免疫アッセイの修飾法を使用した。このアッセイは、バイオクロム（Ｂ　ｉｏｃｈｒｏｍ）から入手した市販の単−特異性抗ｇｐ４１試薬を使用する。

抗原としてワクシニアｇｐ１６０感染ＢＨＫ２１細胞の粗製溶解物を使用した。

５．４　中和アッセイマイクロプレート中和アッセイは、指示細胞におけるＨＩＶ　ｇａｇ抗原の検出に基づく。すなわち、指示細胞として５ｕｐＴｌ細胞（ヘクト（Ｈｅｃｈｔ）ら、１９８４、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２６　＋１４４５）を使用した。

ウィルス接種物はＨＩＶ−１（ＩＩＴＢ）生産リンパ球様細胞株の細胞不含上清からなる。該上清を高速で遠心して、細胞および細胞デブリを除去し、１ｄバイアル中に入れ、使用まで一８０℃で貯蔵する。試験前に、試験されるべき血清を５６℃で３０分間不活化する。負の対照は、予備免疫動物由来の血清のプールからなる。中和のために、３７℃で１時間、血清の一連の２倍希釈物と一緒に７５０　ＴＣＩＤ、。をインキュベートする。次いで、５ｕｐＴｌ細胞を添加しく細胞２．１０’個／ウェル）、３７℃で４日間インキュベートする。細胞変性効果を顕微鏡でモニターし、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ−１００（最終濃度１％）を各ウェルに添加し、プレートを冷凍する。

サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して培養物中で生産したウィルス抗原の相対量をモニターする。プレートを抗ｐ５５モノクローナル抗体で被覆する。前記トリトンＸ−１００処理試料をプレート中でインキュベートし、ビオチニル化ＨＩＶ− １＋ヒトＩｇＧに次ぐストレプトアビジン・ベルオキシダーゼ工程によってｇａｇ抗原の存在を可視化する。次いで、対照に対するＨＩＶ−１抗原生産の減少のパーセントを、試験した全ての血清希釈物について評価する。直線回帰分析によってデータポイントに適合する曲線を使用して、対照と比較して抗原生産において５０％減少を与える血清希釈（いくらかでもあれば）を補性する。

５．５．　結果第４表は、第２免疫化後のＥＬＩ　ＳＡおよび中和抗体力価を示す。３Ｄ−ＭＰＬｏ／ｗ中のＨＩＶ　ｒｇｐ１６０の一般的な免疫原性は非常に良好である。ｇｐ１６０２０℃１ｇの投与量を動物に投与すると、中和力価（ＮＴ）およびＥＬＩＳＡ力価は３Ｄ−ＭＰＬ　ｏ／ｗ中のｒｇｐ１６０を投与した動物のグループ（グループ４）において非常に良好であった。これらのデータは、３Ｄ−ＭＰＬ　ｏ／ｗエマルジョンの優れたアジュバント効果を示唆する。３Ｄ−ＭＰＬの存在下でミョウバンに吸着したｇｐ１６０で免疫化した動物の免疫応答は少ないけれども、多少の中和抗体を生産する。ＨＩＶ　ｇｐ１６０は、疎水性部分を含有し、これは、おそらく、該分子に、脂質に対する高い親和性を与える。ＨＩＶ　ｒｇｐ１６０は水中油を基剤とする３Ｄ−ＭＰＬ含有製剤を使用することによって免疫系に最も良く提供される。

２匹のチンパンジー（Ｎｏ、１、Ｎｏ、２）を実施例１からの精製ワタシニア組換えｇｐ１６０（１００μｇ／投与量）で免疫化した。

２匹のチンパンジー（Ｎｏ、３、Ｎｏ、４）をドロソフィラ・シュナイダー（Ｄｒｏｓｏｈｉｌａ　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ）細胞（ｒｇｐ１２０Ｘカルブ（Ｃｕｌｐ）ら、バイオテクノロジー（Ｂ　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、９：１７３− １７７．１９９１）において発現された精製組換えｇｐ１２０（１００μｇ／投与量）で免疫化した。

組換え蛋白を。／Ｗエマルジョン中の３Ｄ　ＭＰＬ（１００μｇ／投与量）で製剤化した。該製剤は、１１ｊ’注射投与量中、トウイーン８００．２％、プルロニックＬ１２１　２．５％、スクワラン５％、３ＤＭＰＬ１００μ９および組換え抗原投薬（ｒｇｐ１６０またはｒｇｐ１２０に対して１００ａｙ）からなワタ。

０．１および２力月目に動物を足への筋肉的投与で免疫化した。

ＥＬＩ　ＳＡおよび中和アッセイによる抗体測定のために２週間ごとに動物から採血した（ＥＬＩＳＡ法については実施例４．３を参照：ＨＩＶ中和アッセイは以下のとおりわずかに変形した）。遅延型過敏症応答（ＤＴＨ）の誘発も以下のとおり評価した。

６．２．　体液性免疫の誘発第５表に示すとおり、３Ｄ　ＭＰＬ　ｏ／ｗエマルジョン中で誘導されるｒｇｐ１６０またはｒｇｌ）１２Ｑでワクチン接種したチンパンジーは３回の免疫化後に高いＥＬＩ　ＳＡおよび中和力価を生産した。中和活性は、２回の注射の後に４つのうち３つの血清中で、さらなるブーストの後には４つのうち４つの血清中で検出することがてきた。中和力価の増加は、第３回目の免疫化の後に観察された。

このブースト後に測定されたＥＬＩＳＡおよび中和力価は間−のｒｇｐ１６０製剤で３回免疫化したアカゲザルにおいて得られたものと非常に類似している。

６．３．　ＤＴＨの誘発第３回目の免疫化の２週間後にＤＨＴ試験を行った。注射液当たり１００μり容量で全ての注射液を腹部に投与した。

２匹のｒｇｐ１６０免疫化チンパンジーおよび２匹のｒｇｐ１２０処置動物を、３種類の抗原（ｒｇｐ１６０、ｒｇＤ２６、破傷風トキソイド）および２つの対照緩衝液（ｒｇＤ２を対照緩衝液（ＰＢＳ）およびｒｇｐ１６０対照緩衝液）で皮膚試験した。種々の組換え抗原投与量を試験した：　ｒｇｐ１６０については４０．２０または１０μ９、ｒｇＤ２ｔについては２０．１０または５μ９゜皮膚の厚さの測定によってＤＴＨ応答を２４時間後にモニターした。結果を第１図〜ｊ１！３図に示す。

ｒｇｐ１６０（第１図）またはｒｇｐ１２０（第２図）でワクチン接種した動物において、破傷風トキソイドおよびｒｇｐ１６０に対する特異的ＤＴＨ応答を観察した。

これらの結果は、Ｏ／Ｗエマルジョン中の３Ｄ　ＭＰＬを含有する製剤が特異的Ｔ細胞応答を誘発することができることを示す（第６表を参照）。

最後に、チンパンジーにおいて得られた結果は、明らかに、霊長類において、水中油エマルジョン中３０ＭＰＬを含有するアジュバント製剤が体液性（中和抗体）およびエフェクター細胞媒介（ＤＴＨ）免疫応答を有意に改善することを示す。

中和アッセイマイクロプレート中和アッセイは指示細胞においてＨＩＶＩ感染によって誘発されたＣＰＨの可視評価に基づ（。すなわち、指示細胞として５ｕｐＴ１細胞（ヘクトら、１９８４、サイエンス、２２６・１４４５）を使用する。ウィルス接種物は、ＨＩＶ−１（Ｉ［［Ｂ）生産リンパ球様細胞株の細胞不含上清からなる。

該上清を高速で遠心して細胞および細胞デブリを除去し、１ｘｌバイアルに入れ、使用まで一８０℃で貯蔵する。試験前に試験されるべき血清を５６℃で３０分間不活化する。本発明者らの負の対照は予備免疫動物由来の血清のプールからなる。中和について、３７℃で１時間、７５０　ＴＣＩＤｓ。を血清の一連の２倍希釈液と一緒にインキュベートする。次いで、５ｕｐＴ１細胞を添加しくＮ胞２．１０’個／ウェル）、３７℃で４日間インキュベートする。４日目に細胞変性効果を顕微鏡でモニターし、中和を可視的に測定する。得られた中和力価は予備免疫対照と比較して多核性製剤の８０％減少を得る血清の希釈の反対と一致する。バウエルズ（Ｐａｕｗｅｌｓ）ら（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、　２０　＋　３０９−３２Ｌ　１９８８）によって開示されたＭＴＴアッセイを使用して各ウェルにおいて細胞生存性を測定することによって、７日目に、可視的に測定された力価をさらに客観的にする。このアッセイて測定した力価は、非感染細胞と比較してＣＰＥに対する８０％保護を与える血清希釈物の逆を示す。可視的なＭＴＴ測定力価は、１つのアッセイから別のものへの非常に再現性があり、ＭＴＴ測定力価（示さない）は可視的に測定されたものよりも２〜４倍低い。

第１表ＣＶ−１およＵＢＨＫ−２１細胞中で（７）ＨＩＶ　ｇｐ１６０の精製（１）出発物質として２０Ｉ！の培養物。

（２）出発物質として１４Ａ’の培養物（細胞２．ｌＸ１０”個）。

第２表モルモットにおけるｇｐ１６０の免疫原性（１）　Ｏ，Ｄ、０．５を与える血清希釈の逆数を示す。

！旦！０同種（ｍｂ）および異種単離体に対するｇｐ１６０へのモルモット血清の活性を中和する。

１陽性中和効果は、可視的に判断すると多核製剤の９０％抑制である。

第４表アカゲザルにおける組換えワタソニアｇｐ１６０の免疫原性８　対照と比較して抗原生産の５０％減少を与える血清希釈の逆数に相当する。

＝最大吸光度の５０％と等しい吸光度を与える血清希釈の逆数に相当する（中間力価ン。

ＧＭＴ　＝幾何平均力価。

第５表ｒｇｌ）１６０およびｒｇｐ１２０ワクチン接種チンパンジーの抗ＨＩＶ抗体応答ＥＬＩＳＡ力価　最大吸光度の５０％と等しい吸光度を与える血清希釈の逆数に相当する（中間力価）。

中和力価　：　ｍＢ　ＨＩＶＩ単離体の細胞変性効果から８０％保護を与える血清希釈の逆数に相当する。

スラッシュは中和力価が血清の２つの連続希釈間にあることを示す１例えば、２００／は力価が２００と４００の間にあることを示す。

第６表ワクチン接種したチンパンジーの抗Ｈ３Ｖ抗体応答ＥＬＩＳＡ力価：　最大吸光度の５０％と等しい吸光度を与える血清希釈の逆数に相当する（中間力価）。

中和力価　：　Ｈ３Ｖ２の細胞変性効果対して１００％保護を与える血清希釈の逆数に相当する。

国際調査報告国際調査報告ＥＰ　９１０１８１０Ｓ＾　５１１５０フロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＵ、　ＣＡ、ＪＰ、　ＫＲ，ＵＳ（７２）発明者　ブリュック、クロディーヌベルギー国べ−−１３３０リクセンザルト、リュ・デュ・ランスティチュー８８９番　スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム）内（７２）発明者　フランコツト、ミリアムベルギー国ベーー１３３０リクセンザルト、リュ・デュ・ランスティチュー８８９番　スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム）内（７２）発明者　キュメル、シュジイベルギー国ベー−１３３０リクセンザルト、リュ・デュ・ランスティチュー８８９番　スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム）内

Claims

【特許請求の範囲】

１．独立して、５０２位および５１０位にリシンまたはアルギニン以外のアミノ酸を供給するように修飾されたＨＩＶｇｐ１６０蛋白。
２．５０２位および５１０位のアミノ酸がヒスチジン、トレオニン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミンおよびグルタミン酸からなる群から選択される請求項１記載のＨＩＶｇｐ１６０蛋白。
３．５０２位および５１０位のアミノ酸がグルタミン酸である請求項１または２記載のＨＩＶｇｐ１６０蛋白。
４．請求項１〜３のいずれか１項記載のＨＩＶｇｐ１６０蛋白のオリゴマーまたは二量体。
５．約６４０ｋＤａの相対分子量を有する請求項４記載のオリゴマー。
６．実質的に純粋な形態の請求項１〜６のいずれか１項記載のＨＩＶｇｐ１６０蛋白またはオリゴマーもしくは二量体。
７．医薬的に許容される担体と混合してなる前記定義の蛋白またはオリゴマーからなるワクチン組成物。
８．医薬的に許容される担体と混合してなる前記定義の蛋白またはオリゴマーからなる医薬組成物。
９．ｇｐ１６０またはその免疫的誘導体および３Ｄモノホスホリル脂質Ａならびに適当な担体からなるワクチンまたは医薬組成物。
１０．ｇｐ１６０免疫的誘導体が請求項１〜８のいずれか１損記載の蛋白またはオリゴマーである請求項９記載のワクチンまたは医薬組成物。
１１．担体が水中油エマルジョンである請求項９または１０記載のワクチン組成物。
１２．ｇｐ１６０の濃度が１０〜１５０μｇ／ｍｌである請求項１１記載のワクチン。
１３．薬物用の請求項１〜８のいずれか１項記載のＨＩＶｇｐ１６０蛋白またはオリゴマー。
１４．薬物用の請求項９〜１２のいずれか１項記載のワクチン組成物。
１５．ＨＩＶ−１感染治療用ワクチンの製剤化における請求項１〜８のいずれか１項記載のＨＩＶｇｐ１６０蛋白またはオリゴマーの使用。
１６．ＨＩＶ感染の予防的処置のための請求項１５記載の使用。
１７．組換え真核宿主細胞において蛋白をコードするＤＮＡ配列を発現させ、修飾蛋白を回収することからなる請求項１〜３のいずれか１項記載の修飾ＨＩＶｇｐ１６０蛋白の製造方法。
１８．請求項１〜３のいずれか１項記載の修飾蛋白をコードするＤＮＡ配列。
１９．組換え真核宿主から修飾蛋白を単離し、非還元条件下で精製することからなる請求項４または５記載の修飾ｇｐ１６０のオリゴマーまたは二量体の製造方法。
２０．ｇｐ１６０またはその免疫的誘導体、３Ｄモノホスホリル脂質Ａおよび担体を混合することからなる、ｇｐ１６０またはその免疫的誘導体、３Ｄモノホスホリル脂質Ａならびに医薬的に許容される担体からなるワクチンの製造方法。
２１．請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物の有効量を投与することからなるＨＩＶ感染に敏感なヒトの予防的治療方法。
２２．請求項９〜１２のいずれか１項記載のワクチンの有効量を投与することからなるＨＩＶ感染に敏感なヒトの予防的治療方法。
２３．請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物の有効量を投与することからなるＨＩＶに罹患したヒトの治療方法。