KR20130063493A - Ｈｉｖ 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 HIV-1 항원을 포함하는 면역원성 조성물, 및 HIV-1의 예방 및/또는 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이종성 HIV-1 클레이드로부터의 HIV-1 감염과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료에서 한 클레이드로부터의 HIV-1 항원의 용도에 관한 것이다.

Description

ＨＩＶ 백신{HIV VACCINE}

본 발명은 HIV-1 항원을 포함하는 면역원성 조성물, 및 HIV-1의 예방 및/또는 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이종성 HIV-1 클레이드로부터의 HIV-1 감염과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료에서 한 클레이드로부터의 HIV-1 항원의 용도에 관한 것이다.

인간 면역결핍 바이러스 1형 (HIV-1)은 전세계의 건강상의 큰 문제들 중 하나인 것으로 여겨지는 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS)의 주요 원인이다. 전세계적으로 감염된 상태에 있는 사람들이 3,200만 명 넘게 존재하며, HIV-1에 대한 안전하고 효과적인 백신 개발이 전세계적으로 건강상의 최우선 사항이 된다.

HIV-1은 레트로비리다에(Retroviridae) 과의 RNA 바이러스이다. HIV-1 게놈은 9개 이상의 단백질을 코딩하는데, 이 단백질은 3개의 부류로 나뉜다: 주요 구조 단백질 Gag, Pol 및 Env, 조절 단백질 Tat 및 Rev, 및 부속 단백질 Vpu, Vpr, Vif 및 Nef.

HIV-1은 수개의 상이한 클레이드, 예를 들어, A, B, C, D, E, F, G, H, J 및 K로 나뉠 수 있는데, 그 우세 정도는 전세계에 걸쳐 차이를 보인다. 예를 들어, HIV-1 클레이드 B는 대개 북미 및 유럽 전역에서 발견되는 반면, HIV-1 클레이드 C는 주로 남아프리가, 인도 및 중국에서의 HIV-1 유행의 원인이 된다. 순환 재조합 형태 (CRF)로 알려져 있는 재조합 형태의 HIV-1 클레이드는 또한 순환하는 것으로 알려져 있다. 이러한 재조합 형태는 감염된 사람의 세포 내에서 상이한 클레이드들이 조합하여 새로운 하이브리드 바이러스를 형성하였을 때에 생성된다. 대부분의 하이브리드 형태는 수명이 짧지만, 사람을 1명 넘게 계속하여 감염시키는 것인 CRF로 알려져 있다. 그 예로는 A/E를 포함하는데, 이는 서브타입 A 및 일부 다른 "모체" 서브타입 E 사이의 혼성화로부터 생성된 것으로 판단된다. 그러나, 순수한 형태의 서브타입 E는 아직까지는 발견되지 않았다.

사이프러스(Cyprus)에서 단리된 바이러스는 재조합 형태 A/G/I로 재분류되기 이전에, 본래 새로운 서브타입 I에 배치되었다. 현재 이러한 바이러스는 서브타입 A, G, H, K, 및 미분류 영역으로 구성된, 보다 더 복잡한 CRF를 나타내는 것으로 판단된다.

각각의 클레이드는 그의 유전적 유사성에 기초하여 함께 같은 군으로 군 분류된 상이한 HIV-1 균주를 포함한다. 따라서, 상이한 클레이드로부터의 HIV-1 균주 간의 유전적 변이는 같은 클레이드로부터의 HIV-1 균주 간의 변이보다 더 크다.

HIV-1의 유전적 다양성 때문에 전세계에서 다중 HIV-1 클레이드로부터의 균주에 대해 안전하고 유효한 백신을 개발하는 것이 극도로 어렵다. 이러한 요구를 해소시켤 줄 수 있는 백신이 여전히 요구되고 있다.

지난 20여 년 동안, 예방용 백신 개발에 대한 노력이 끊임없이 이루어졌다. 현재까지는 단 3개의 후보 HIV-1 백신만이 IIb 상 또는 III 상 시험에서 테스트를 받았고, 이 둘 모두 HIV-1 감염을 예방하는 데에는 실패하였다 (문헌 ([Flynn NM, Formal DN, Harro CD, Judson FN, Mayer KH, et al. (2005) Placebo-controlled phase 3 trial of a recombinant glycoprotein 120 vaccine to prevent HIV-1 infection. J Infect Dis 191: 654-665], [Pitisuttithum P, Gilbert P, Gurwith M, Heyward W, Martin M, et al. (2006) Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Efficacy Trial of a Bivalent Recombinant Glycoprotein 120 HIV-1 Vaccine among Injection Drug Users in Bangkok, Thailand. J Infect Dis 194: 1661-1671], [Buchbinder SP, Mehrotra DV, Duerr A, Fitzgerald DW, Mogg R, et al. (2008) Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine (the Step Study): a double-blind, randomised, placebo-controlled, test-of-concept trial. Lancet 372: 1881-1893])). 감염을 예방하고, 이로써 불임 면역을 유도하는 백신용 백신 개발이 최우선 사항이다; 그러나, 강력한 T 세포 매개 면역 반응 유도에 기초한 치료용 또는 질환-조절용 백신 또한 바람직할 수 있다.

지속성 바이러스 감염을 방지하는 데 있어 CD8+ T 세포 반응의 역할은 잘 확립되어 있다(문헌 [Barouch DH, Letvin NL (2001) CD8+ cytotoxic T lymphocyte responses to lentiviruses and herpesviruses. Curr Opin Immunol 13: 479-482]). HIV-1 감염과 관련하여, 바이러스-특이 CD8+ T 세포의 출현은 1차 HIV-1 감염 동안에 발생되는 바이러스혈증의 감소와 매우 밀접한 연관성이 있고 (문헌 [Koup RA, Safrit JT, Cao Y, Andrews CA, McLeod G, et al. (1994) Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol 68: 4650-4655]), CD8+ T 세포의 결핍은 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV)에서의 바이러스혈증의 급격한 증가를 유발한다 (문헌 ([Schmitz JE, Kuroda MJ, Santra S, Sasseville VG, Simon MA, et al. (1999) Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science 283: 857-860], [Jin X, Bauer DE, Tuttleton SE, Lewin S, Gettie A, et al. (1999) Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Exp Med 189: 991-998])). 다관능성 CD8+ T 세포는 고도로 활성인 항-바이러스 요법 (HAART) 없이도 HIV-1 감염을 제어하는, 질환이 진행되지 않는 무진행자들에서 차별적으로 유지되는 것으로도 또한 밝혀져 있다 (문헌 [Betts MR, Nason MC, West SM, De Rosa SC, Migueles SA, et al. (2006) HIV nonprogressors preferentially maintain highly functional HIV-specific CD8+ T-cells. Blood 107: 4781-4789]).

바이러스-특이 CD4+ T 세포는 HIV-1을 비롯한, 다수의 바이러스 감염의 면역 제어에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (문헌 ([Day CL, Walker BD (2003) Progress in defining CD4 helper cell responses in chronic viral infections. J Exp Med 198: 1773-1777], [Klenerman P, Hill A (2005) T cells and viral persistence: lessons from diverse infections. Nat Immunol 6: 873-879])). 더욱 구체적으로, CD4+ T 세포는 기능성 CD8+ T 세포를 유도 및 유지시키는 데 필요하다 (문헌 ([Bourgeois C, Veiga-Fernandes H, Joret AM, Rocha B, Tanchot C (2002) CD8 lethargy in the absence of CD4 help. Eur J Immunol 32: 2199-2207], [Janssen EM, Lemmens EE, Wolfe T, Christen U, von Herrath MG, et al. (2003) CD4+ T cells are required for secondary expansion and memory in CD8+ T lymphocytes. Nature 421: 852-856], [Shedlock DJ, Shen H (2003) Requirement for CD4 T cell help in generating functional CD8 T cell memory. Science 300: 337-339], [Sun JC, Bevan MJ (2003) Defective CD8 T cell memory following acute infection without CD4 T cell help. Science 300: 339-342], [Sun JC, Williams MA, Bevan MJ (2004) CD4+ T cells are required for the maintenance, not programming, of memory CD8+ T cells after acute infection. Nat Immunol 5: 927-933], [Yang TC, Millar J, Groves T, Zhou W, Grinshtein N, et al. (2007) On the role of CD4+ T cells in the CD8+ T-cell response elicited by recombinant adenovirus vaccines. Mol Ther 15: 997-1006])). HIV-1로 감염된 환자에서 다관능성이며 증식능이 있는, HIV-1-특이 CD4+ T 세포의 존재는 장기간 동안 질환이 진행되지 않는 무진행과 관련이 있다 (문헌 ([Boaz MJ, Waters A, Murad S, Easterbrook PJ, Vyakarnam A (2002) Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. J Immunol 169: 6376-6385], [Harari A, Petitpierre S, Vallelian F, Pantaleo G (2004) Skewed representation of functionally distinct populations of virus-specific CD4 T cells in HIV-1-infected subjects with progressive disease: changes after antiretroviral therapy. Blood 103: 966-972], [Kannanganat S, Kapogiannis BG, Ibegbu C, Chennareddi L, Goepfert P, et al. (2007) Human immunodeficiency virus type 1 controllers but not noncontrollers maintain CD4 T cells coexpressing three cytokines. J Virol 81: 12071-12076], [Potter SJ, Lacabaratz C, Lambotte O, Perez-Patrigeon S, Vingert B, et al. (2007) Preserved central memory and activated effector memory CD4+ T-cell subsets in human immunodeficiency virus controllers: an ANRS EP36 study. J Virol 81: 13904-13915])). 추가로, 급성 HIV-1 감염 이후, HIV-1-특이 CD8+ T 세포 증식의 손실은 시험관내 및 생체내에서 IL-2를 생산하는 백신-유도성 HIV-1-특이 CD4+ T 세포에 의해 수복될 수 있다 (문헌 [Lichterfeld M, Kaufinann DE, Yu XG, Mui SK, Addo MM, et al. (2004) Loss of HIV-1-specific CD8+ T cell proliferation after acute HIV-1 infection and restoration by vaccine-induced HIV-1-specific CD4+ T cells. J Exp Med 200: 701-712]). 이러한 관찰 결과는, 효과적인 AIDS 백신은 또한 강력한 CD4+ T 세포 반응을 유도하여야 한다는 것을 제안한다.

HIV-1의 유전적 다양성이 대단히 높다는 것으로 고려해 볼 때, 효과적인 백신은 광범위한 순환 HIV-1 균주를 포괄하는 CD4+ T 세포 반응을 유도할 수 있는 것이 이로울 것이다. 그러한 백신이 여전히 요구되고 있다.

본 발명은 이러한 요구를 해소시키고자 하는 것이다.

본 발명의 요약

본 발명은 HIV의 예방 및/또는 치료를 위해 면역 반응을 유도하기 위한 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 조성물에 사용되는 HIV 항원에 대해 이종성인 1 초과의 HIV 클레이드 및/또는 클레이드들에 대해 면역 반응을 유도하기 위한, HIV 항원을 함유하는 조성물을 제공한다.

도 1: F4에 대한 뉴클레오티드 서열.
도 2: F4에 대한 아미노산 서열.
도 3: F4co에 대한 뉴클레오티드 서열.
도 4: p24 아미노산 서열 정렬.
도 5: RT 아미노산 서열 정렬.
도 6: Nef 아미노산 서열 정렬.
도 7: p17 아미노산 서열 정렬.
도 8: 클레이드 간 서열 동일성 및 에피토프 보존에 관한 분석.
도 9a: F4의 쿠마시(Coomassie) 염색 및 웨스턴 블롯.
도 9b: p24-RT-Nef-p17 가용성 검정.
도 10: F4co에 대한 쿠마시 염색된 겔 및 웨스턴 블롯.
도 11: F4co 정제 후처리 작업.
도 12: CB로 염색된 SDS-겔 및 항-F4 웨스턴 블롯.
도 13: F4 중 개별 항원에 대한 웨스턴 블롯.
도 14: 3가지 정제 로트에 관한 SEC 분석.
도 15: 항-이. 콜라이(E. coli)의 웨스턴 블롯.
도 16: 로트 3을 제조하는 동안 수집된 모든 분획에 대한 SDS-겔 및 항-F4 웨스턴 블롯.
도 17: F4/AS01_B 및 F4/WFI 군의 반응생성력.
도 18: IL-2 및 적어도 또 다른 마커 p를 발현하는 CD4+ T 세포.
도 19: F4/AS01_B-아주반트 첨가된 HIV-1 백신 후보 물질에 대한 CD4+ T 세포 반응: 반응자 비율.
도 20: F4/AS01_B-아주반트 첨가된 HIV-1 백신 후보 물질에 대한 CD4+ T 세포 반응: 항원당 반응자 백분율.
도 21: F4 융합 단백질에 대한 반응으로 IL-2 및 적어도 하나의 다른 마커를 발현하는 CD4+ T 세포의 백분율.
도 22: II 투여 후 2주째 10 ㎍ F4/AS01_B 군에서 F4-특이 CD4+CD40L+ T 세포의 시토카인 공동-발현 프로파일.
도 23: 10 ㎍ F4/AS01_B 군에서 모든 시점에서의 F4-특이 CD4+CD40L+ T 세포의 시토카인 공동-발현 프로파일: 파이 그래프.
도 24: 항원-특이 CD4+ T 세포의 시토카인 공동-발현 프로파일.
도 25: 항원-특이 CD4+ T 세포의 시토카인 공동-발현 프로파일.
도 26: CD4+ T 세포 반응의 클레이드 간 반응성.
도 27: CD4+ T 세포 반응의 교차-반응성.
도 28: F4 융합 단백질에 대한 체액성 면역 반응.
도 29: Nef, RT, p17, p24 항원에 대한 항체 반응.
도 30: 클레이드 A 특이 CD4+ T 세포 반응.
도 31: 클레이드 B 특이 CD4+ T 세포 반응.
도 32: 클레이드 C 특이 CD4+ T 세포 반응.
도 33: 클레이드 A 특이 CD8+ T 세포 반응.
도 34: 클레이드 B 특이 CD8+ T 세포 반응.
도 35: 클레이드 C 특이 CD8+ T 세포 반응.
도 36: 클레이드 간 T 세포 반응의 요약.

본 발명은

a. Nef, Pol 및/또는 Gag로부터 선택된 하나 이상의 항원을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드이며;

여기서, 상기 하나 이상의 항원이 하나 이상의 클레이드로부터의 하나 이상의 HIV-1 균주로부터 선택된 것인 하나 이상의 폴리펩티드; 및

b. Th1 면역 반응의 차별적 유도제인 아주반트

를 포함하며, 이 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 의한 질환 또는 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물을 제공한다.

본 발명자들은, 한 특정 클레이드로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 단백질성 HIV-1 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 다른 상이한 HIV-1 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대해 강력한 CD4+ T 세포 반응을 유도할 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 예를 들어, 클레이드 B의 HIV-1 균주로부터 유래된 HIV-1 항원은 특히, 클레이드 B가 아닌 클레이드의 HIV로부터 유래된 HIV-1 항원, 예를 들어, 클레이드 A, 클레이드 C 또는 재조합 클레이드들, 예컨대, 클레이드 CRF-01 (클레이드 A 및 E의 순환 재조합 형태)로부터의 HIV-1 항원 뿐만 아니라, 다른 상이한 클레이드 B의 HIV-1 균주로부터의 HIV-1 항원에 대해 교차 반응성 면역 반응을 유도할 수 있다.

이러한 교차-반응성은 같은 HIV-1 균주로부터의 HIV-1 항원에 대해 관찰되는 "동종성" 면역 반응에 더하여 나타나는 것이다. 따라서, 예를 들어, 클레이드 B로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 HIV-1 항원을 포함하는 면역원성 조성물은 같은 HIV-1 균주, 클레이드 B로부터의 상이한 HIV-1 균주, 또는 다른 클레이드 B가 아닌 클레이드의 HIV 균주, 예를 들어, 클레이드 A 및/또는 클레이드 C 및/또는 클레이드 CRF-01로부터의 균주에 의해 유발된 HIV-1 감염 및 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.

면역 반응은 면역계 세포와 항원과의 상호작용을 통해서 항원에 대해 발생한다. 생성된 면역 반응은 2개의 주된 흐름으로 광범위하게 구별될 수 있다: 다양성은 더 작지만, 독립적으로 작용을 하는 선천성 면역 반응, 및 그 다양성은 방대하지만, 선천성 면역에 강하게 의존하며, 이러한 이유에서 그 자율성에는 제한이 있는 후천성 면역 반응.

선천성 면역계와 후천성 면역계를 연결시키는 복잡한 신호전달 네트워크의 협동을 통해 침입 병원체에 대해 숙주를 효율적으로 방어할 수 있다. 바이러스 감염에 대한 방어는 우세하게는 후천성 면역, 및 체액 및 세포-매개 면역 둘 모두에 의해 매개된다. 체액성 면역의 항바이러스 효과는 바이러스의 표적 세포로의 진입/감염을 차단시킬 수 있는 중화 항체의 생산을 통해 매개된다. CD4+ 및 CD8+ T 세포는, 시토카인 분비, 및 바이러스로 감염된 표적 세포의 사멸을 통해 그의 항바이러스 효과를 매개하는 세포-매개 면역의 효과기 성분들이다.

바이러스 복제 제어 및 HIV-1-관련 질환 예방에 있어서 HIV-1-특이 T 세포 반응의 방어 역할을 강력하게 입증하는 연구들이 다수 존재한다.

항원 제시 세포, 예를 들어, 수지상 세포 (DC)에 의해 제시된 항원과의 상호작용시, CD4+ T 세포는 고전적 Th1 세포 및 Th2 세포, Th17 세포, 여포 헬퍼 T (Tfh) 세포, 및 유도된 조절 T (iTreg) 세포를 비롯한, 다양한 효과기 서브세트로 분화될 수 있다. 분화 결정은 우세하게는 시토카인의 존재에 의해 지배되고, 어느 정도까지는 항원과 T 세포 항원 수용체 사이의 상호작용의 강도에 의해 지배된다.

Th1 세포는 IFN-γ 생산을 특징으로 하고, 세포내 미생물에 대한 세포 면역에 관여한다. 선천성 면역 세포에 의해 생산되는 IL-12는 세포를 Th1 세포 분화 프로그램으로 유도할 뿐만 아니라, NK 세포 및 T 세포 둘 모두에 의한 IFN-γ의 생산도 유도한다.

Th2 세포는 IL-4, IL-5, 및 IL-13을 생산하며, 기생충 및 다른 세포외 병원체 방제를 위한 체액성 면역에 필요하다. Th2 세포 분화를 위해서는 IL-4 및 Stat6 하류에서의 GATA3의 작용이 필요하다.

Th17 세포는 IL-17A, IL-17F, 및 IL-22를 생산하고, 이는 특히 점막 표면에서 세포외 박테리아 및 진균을 제거하는 데 중요한 역할을 한다. Th17 세포 분화를 위해서는, 모두가 Stat3 인산화를 활성화시키는 것인 염증유발 시토카인 IL-6, IL-21, 및 IL-23과 함께 TGF-β에 의해 유도되는 전사 인자인 레티노이드계 오르판 수용체 (ROR)gt가 필요하다.

Tfh 세포는 B 세포 반응의 성숙을 조절하는 헬퍼 T 세포의 서브세트이다. 상기 세포가 분화되기 위해서는 시토카인 IL-21이 필요하며, 상기 분화는 전사 인자 Bcl-6에 의존할 수 있다.

효과기 T 세포 반응의 엄격한 조절은 효과적으로 감염을 방어하고, 자가면역 및 면역병리학적 질환을 회피하는 데 필요하다.

바이러스-특이 CD4+ T 세포가 많은 바이러스 감염의 면역 방어에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 것과 같이, 상기 세포는 상기 논의된 바와 같이 HIV-1에 의한 감염을 비롯한, 지속적인 바이러스 감염을 방어하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 기능성 CD8+ T 세포를 유도 및 유지시키는 데 필요하다.

HIV-1 게놈은 여러 단백질들 다수를 코딩한다. 예를 들어, 외피 단백질은 gp120 및 그의 전구체 gp160을 포함한다. HIV-1의 비-외피 단백질은 예를 들어, 내부 구조 단백질, 예컨대, gag 및 pol 유전자의 생성물 및 다른 비-구조 단백질, 예컨대, Rev, Nef, Vif 및 Tat를 포함한다.

가능한 한 최대로 광범위한 순환 HIV-1 균주에 대한 상기와 같은 CD4+ T 세포 반응이 바람직할 수 있기 때문에, HIV-1 백신은 각종 바이러스 단백질로부터의 가능한 한 많은 상이한 CD4 에피토프를 함유하는 것이 바람직할 수 있다. 최대 개수의 보존되는 T 세포 에피토프를 함유하는 바이러스 항원은 Gag, Pol, 및 Nef이다.

본 발명의 면역원성 조성물은 이들 항원들 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 Nef를 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다.

HIV-1 Nef는 조기 단백질로서, 즉, 이는 감염시 조기에 및 구조 단백질의 부재하에서 발현된다. Nef 유전자는 수개의 활성을 가지는 것으로 밝혀진 조기 보조 HIV-1 단백질을 코딩한다. 예를 들어, Nef 단백질은, 비록 이들 기능의 생물학적 중요성에 관한 논쟁이 있기는 하지만, 세포 표면으로부터 CD4, HIV-1 수용체, 및 MHC 클래스 I 분자를 하향조절하는 것으로 알려져 있다. 추가로, Nef는 T 세포의 신호 경로와 상호작용하고, 활성 상태를 유도함으로써 결국에는 보다 효율적인 유전자 발현을 촉진시킬 수 있다. 일부 HIV-1 단리물은 상기 영역에 돌연변이를 가지며, 이러한 돌연변이로 인해 기능성 단백질은 코딩되지 못하고, 생체내에서 그의 복제 및 발병기전은 심각하게 손상된 상태가 된다.

Nef에 대한 언급은 전장의 Nef 및 전장의 Nef의 단편, 변이체, 및 유도체를 언급하는 것이다. 상기 용어는 또한 Nef의 단편, 변이체, 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 비롯한, Nef를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

한 실시양태에서, Nef는 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, 또는 HIV-1의 순환 재조합 형태 (CRF)의 HIV-1 균주로부터의 것이다.

편리하게는, Nef는 클레이드 B의 HIV-1 균주로부터의 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 Pol을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다.

Pol 유전자는 감염 조기에 바이러스가 필요로 하는 2가지 활성을 포함하는 2가지 단백질, RT 및 바이러스 DNA의 세포 DNA로의 통합을 위해 필요한 인테그라제 단백질을 코딩한다. Pol의 1차 생성물이 비리온 프로테아제에 의해 절단되면, DNA 합성에 필요한 활성 (RNA 및 DNA-의존 DNA 폴리머라제 활성 뿐만 아니라, RNase H 기능)을 포함하는 아미노 말단 RT 펩티드, 및 카르복시 말단 인테그라제 단백질이 생성된다. 따라서, RT는 Pol 단편의 일례이다. HIV-1 RT는, 또한 Pol 단편의 일례인 것인 전장의 RT (p66)와 카르복시 말단 RNase H 도메인이 결여된 절단 생성물 (p51)로 이루어진 이종이량체이다.

Pol에 대한 언급은 전장의 Pol 및 전장의 Pol의 단편, 변이체, 및 유도체를 언급하는 것이다. 상기 용어는 또한 Pol의 단편, 변이체, 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 비롯한, Pol을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

한 실시양태에서, Pol은 RT 단편을 포함한다. RT 단편은 Pol 단편의 일례이다. RT에 대한 언급은 전장의 RT 및 전장의 RT의 단편, 변이체, 및 유도체를 언급하는 것이다. 상기 용어는 또한 RT의 단편, 변이체, 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 비롯한, RT를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 방식으로, RT는 p66 단편, p51 단편 및/또는 p66 및/또는 p51의 단편, 변이체, 및 유도체를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, Pol은 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, 또는 HIV-1의 순환 재조합 형태 (CRF)의 HIV-1 균주로부터의 것이다.

편리하게는, Pol은 클레이드 B의 HIV-1 균주로부터의 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 Gag를 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다.

Gag 유전자는 전구체 폴리단백질로서 번역되고, 이는 프로테아제에 의해 절단됨으로써, 기질 단백질 (p17), 캡시드 (p24), 뉴클레오캡시드 (p9), p6 및 2개의 공간 펩티드인, p2와 p1 (이들 모두 Gag 단편의 일례이다)을 포함하는 생성물이 생성된다.

Gag 유전자를 통해 p55로도 불리우는 55-킬로달톤 (kD) Gag 전구체 단백질이 생성되는데, 이는 스플라이싱되지 않은 바이러스 mRNA로부터 발현된다. 번역되는 동안, p55의 N 말단은 미리스토일화되어 p55는 세포막의 세포질 면에 결합하게 된다. 막-결합 Gag 폴리단백질은 감염된 세포의 표면으로부터 바이러스 입자가 발아될 수 있도록 유발하는 다른 바이러스 단백질 및 세포 단백질과 함께, 2 카피수의 바이러스 게놈 RNA를 동원한다. 발아 후, p55는 바이러스가 성숙되는 과정 동안 바이러스에 의해 코딩된 프로테아제 (pol 유전자의 생성물)에 의해 절단됨으로써 MA (기질 [p17]), CA (캡시드 [p24]), NC (뉴클레오캡시드 [p9]), 및 p6 (이들 모두 Gag 단편의 일례이다)으로 지정되는 4개의 더 작은 단백질이 생성된다.

p17 (MA) 폴리펩티드는 p55의 N-말단으로부터의 미리스토일화된 단부이다. 대부분의 MA 분자는 비리온 지질 이중층의 내부 표면에 부착된 상태로 남아 입자를 안정화시킨다. MA의 서브세트는 비리온의 보다 깊은 심부층 내로 동원되어, 그 곳에서 바이러스 DNA를 핵으로 호송하는 복합체의 일부분이 된다. MA 상의 친핵성 신호가 세포 핵 유입 기구에 의해 인식되기 때문에 이러한 MA 분자는 바이러스 게놈의 핵 수송이 원활하게 일어나도록 한다. 이러한 현상을 통해 HIV-1은 비-분열 세포를 감염시킬 수 있다.

p24 (CA) 단백질은 바이러스 입자의 원추형 코어를 형성한다. 시클로필린 A는 p55의 p24 영역과 상호작용하여 그가 HIV-1 입자 내로 도입할 수 있도록 하는 것으로 입증되었다. 시클로스포린 A에 의해 상기 상호작용을 파괴시키면 바이러스 복제가 억제되기 때문에, Gag 및 시클로필린 A 사이의 상호작용은 필수적이다.

Gag의 NC 영역은 소위 HIV-1의 패키징 신호라는 것을 특이적으로 인식하는 역할을 한다. 패키징 신호는 바이러스 RNA의 5' 말단 부근에 위치하는 4개의 스템 루프 구조로 구성되는데, 이는 이종 RNA의 HIV-1 비리온 내로의 도입을 매개하는 데 충분하다. NC는 2개의 아연-핑거 모티프에 의해 매개되는 상호작용을 통해 패키징 신호에 결합한다. NC는 또한 역전사가 원활하게 일어날 수 있게 한다.

p6 폴리펩티드 영역은 p55 Gag와 보조 단백질 Vpr 사이의 상호작용을 매개하여 Vpr이 조립 비리온 내로 도입되도록 한다. p6 영역은 또한 감염된 세포로부터 발아 비리온이 효율적으로 방출되도록 하는 데 필요한 소위 후기 도메인이라는 것을 함유한다.

한 실시양태에서, Gag는 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, 또는 HIV-1의 순환 재조합 형태 (CRF)의 HIV-1 균주로부터의 것이다.

편리하게는, Gag는 클레이드 B의 HIV-1 균주로부터의 것이다.

한 실시양태에서, Gag는 p17이다. 그러한 실시양태에서, p17은 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, 또는 HIV-1의 순환 재조합 형태 (CRF)의 HIV-1 균주로부터의 것이다. 편리하게는, p17은 클레이드 B의 HIV-1 균주로부터의 것이다.

한 실시양태에서, Gag는 p24이다. 그러한 실시양태에서, p24는 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, 또는 HIV-1의 순환 재조합 형태 (CRF)의 HIV-1 균주로부터의 것이다. 편리하게는, p24는 클레이드 B의 HIV-1 균주로부터의 것이다.

한 실시양태에서, Gag는 p17 및 p24 둘 모두를 별개의 단백질 항원 성분으로서 또는 함께 융합된 형태로서 포함한다.

편리하게는, p17 및 p24는 함께 융합되어 있고, 이종 아미노산 서열에 의해 분리되어 있다.

본 발명에서, 기술된 항원은 전장의 항원, 예를 들어, 전장의 Nef, 전장의 Pol, 전장의 Gag이다. 본 발명은 또한 전장의 것에 상응하거나, 상응하지 않을 수 있는, 항원의 단편 또는 변이체를 비롯한 전장의 것이 아닌 항원을 포함한다. 적합하게는, 단편은 면역원성 단편이고, 변이체는 면역원성 변이체이다.

전형적으로, 면역원성이든 아니든, "단편"은, 단편이 HIV-1 항원의 단편인 것인, HIV-1 항원을 포함하는 폴리펩티드로부터의 연속하는 아미노산 서열을 함유한다. 편리하게는, 단편은, 단편이 폴리펩티드의 단편인 것인, 폴리펩티드로부터의 적어도 5 내지 8개의 아미노산, 적어도 9 또는 15개의 아미노산, 적어도 20개, 적어도 50개, 또는 적어도 100개의 연속하는 아미노산을 함유한다.

본원에서 사용되는 바, "면역원성 단편"은 항원의 적어도 하나의 에피토프를 포함할 것이며, HIV-1 항원성을 나타낼 것이다. 그러한 단편은 단리된 상태로, 또는 적합한 구축물로 제시될 때, 예컨대, 다른 HIV-1 에피토프 또는 항원에 융합되었을 때, 단백질성 및/또는 면역원성일 수 있는 융합 파트너에 융합되었을 때, 또는 담체 상에 또는 담체 중에서 제시되었을 때 고유 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "변이체"라는 용어는 제한된 방식으로 변경된 폴리펩티드로서, 그의 비-변이체 대응물과 비교되는 것인 폴리펩티드를 포함한다. 이는 예를 들어, 발현 시스템에서의 발현을 개선시킴으로써 또는 비바람직한 효소 활성을 비롯한, 비바람직한 활성을 제거함으로써, 폴리펩티드의 특성을 변경시킬 수 있는 점 돌연변이를 포함한다. 그러나, HIV-1 항원을 포함하는 폴리펩티드 변이체는, 면역원성 조성물 또는 백신 중에서 바람직할 수 있는 항원 특성을 보유함으로써 그가 고유 항원에 대한 면역 반응을 여전히 일으킬 수 있도록 고유 폴리펩티드와 충분한 유사성을 보유하여야 한다. 특정 변이체가 그러한 면역 반응을 일으키는지 여부는 적합한 면역학적 검정, 예컨대, (항체 반응에 대한 경우) ELISA 또는 (세포 반응에 대한 경우) 세포 마커 및 시토카인에 대한 적합한 염색법을 사용하는 유동 세포측정법에 의해 측정될 수 있다.

편리하게는, 본 발명에 따른 "변이체"는 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실, 또는 치환을 포함한다. 이는, 항원의 C-말단 및/또는 N-말단에서 하나 이상의 아미노산이 절단된, 절두형 항원을 포함한다. 편리하게는, "변이체"는 1 내지 5개의 아미노산, 6 내지 10개의 아미노산, 11 내지 15개의 아미노산, 16 내지 20개의 아미노산, 21 내지 25개의 아미노산 또는 25개 초과의 아미노산이 항원의 C-말단 및/또는 N-말단으로부터 절단된 것인 말단절단물 또는 단편을 포함한다.

본 발명의 변이체는 하나 이상의 아미노산의 하나 이상의 결실, 부가, 또는 치환을 도입할 수 있다. 따라서, 항원의 말단절단물은 추가로 펩티드의 상이한 부분에 하나 이상의 아미노산의 결실, 부가, 또는 치환을 포함할 수 있다.

본 발명의 변이체는 또한 Nef, Pol 및/또는 Gag의 폴리펩티드 서열과 70, 80, 90, 95 또는 98% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 하나 이상의 항원을 포함하는 2개의 폴리펩티드, 하나 이상의 항원을 포함하는 3개의 폴리펩티드, 하나 이상의 항원을 포함하는 4개의 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 항원을 포함하는 폴리펩티드를 5개 이상 포함한다.

Nef, Pol 및/또는 Gag는 각각 면역원성 조성물 중에 1회 초과로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 면역원성 조성물은 Nef를 포함하는 폴리펩티드를 2개 이상, Pol을 포함하는 폴리펩티드를 2개 이상 및/또는 Gag를 포함하는 폴리펩티드를 2개 이상 포함할 수 있다.

추가의 실시양태에서, 하나 이상의 폴리펩티드들은 각각 Nef, Pol 및/또는 Gag 중 하나, Nef, Pol 및/또는 Gag 중 2개, Nef, Pol 및/또는 Gag 중 3개, Nef, Pol 및/또는 Gag 중 4개 등을 포함할 수 있다. 조성물 중에 1 초과의 폴리펩티드가 존재할 경우, 각 폴리펩티드들은 같은 개수 및/또는 조성의 항원을 포함할 수 있고/거나, 각 폴리펩티드들은 다른 개수 및/또는 조성의 항원을 포함할 수 있다. 조성물 중에 3개 이상의 폴리펩티드가 존재할 경우, 2개 이상의 폴리펩티드는 같은 개수 및/또는 조성의 항원을 포함할 수 있는 데 반하여, 나머지 폴리펩티드(들)는 다른 개수 및/또는 조성의 항원을 포함할 수 있다.

이러한 항원에 대한 폴리펩티드 서열은 상이한 균주 간에, 예를 들어, 상이한 클레이드로부터의 HIV-1 균주 간에 잘 보존되어 있다는 것이 문서로 잘 입증되어 있다.

그러나, 상이한 클레이드들 간 HIV-1 항원에 대한 CD4+ T 세포 에피토프 보존 분석을 통해, 이들 항원에 대한 서열은 상이한 클레이드들 간에 상대적으로는 잘 보존될 수 있지만, 놀랍게도 CD4+ T 세포 에피토프는 그보다는 보존이 덜 이루어지는 것으로 밝혀졌다 (분석에 대해서는 도 8 참조).

상기 분석을 통해 "공지된" CD4+ T 세포 에피토프 및 "예측" CD4+ T 세포 에피토프를 검토하였다. 3가지 소프트웨어: SVMHC (www - bs . informatik . uni -tuebingen.de/SVMHC), ProPred (www.imtech.res.in/raghava/propred/) 및 GSKbio 프로그램 (T에피토프(Tepitope))를 사용하여 에피토프를 "예측하였다." 가능성이 있는 "에피토프"로서 선택되기 위해서는 9량체 펩티드가 3가지 프로그램에 의해서 백인종 집단에서 가장 대표적으로 제시되는 17개의 대립유전자들 중 주어진 HLA 대립유전자에 대한 에피토프인 것으로 예측되어야 했다. 이어서, 서열 중에서 보존되는 예측 CD4+ T 세포 에피토프의 개수를 계산하였다.

연구된 클레이드들 중에서 관찰되는 에피토프 보존 정도는 상대적으로 작았음에도 불구하고, 본 발명자들은 놀랍게도 예측되는 교차-반응성 정도는 훨씬 더 높다는 것을 발견하게 되었다.

본원에서 교차-반응성이란 본 발명의 면역원성 조성물에 의해 유도된 면역 반응이 면역원성 조성물 중에 제시되지 않은 클레이드로부터의 HIV-1 균주를 인식할 수 있는 의미를 가진다. 예를 들어, 조성물에 의해 유도된 HIV-특이 면역 반응, 예컨대, HIV-특이 CD4+ T 세포 반응이 조성물 중에 존재하지 않는 다른 HIV-1 균주와, 예를 들어, 클레이드 B 이외의 다른 클레이드로부터의 HIV-1 균주와 반응하였다면, 클레이드 B로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 항원을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물은 교차-반응성인 것으로 간주된다.

조성물에 의해 유도된 면역 반응에 의해 이루어지는, 상이한 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대한 반응은 유도되는 면역 반응의 유형에 따라 달라질 것이다. CD4 특이 면역 반응의 경우, 이는 관련 시토카인을 분비하는 것을 포함할 수 있다. CD8 특이 면역 반응은 세포용해 활성 및/또는 관련 시토카인 분비 유도를 포함할 수 있다. 항체 특이 반응은 예를 들어, 중화 항체의 유도를 포함할 수 있다.

본 발명에서, 본 발명의 면역원성 조성물 중에 제시되지 않은 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 의해 유도된 면역 반응이 CD4 특이 면역 반응인 것이 바람직하다.

교차-반응성 면역 반응은 상이한 HIV-1 클레이드로부터의 상이한 바이러스 균주 간에 보존되는 서열인, 폴리펩티드 상의 면역원성 영역, 즉, 에피토프에 대해 유도될 수 있거나, 또는 면역 인식을 폐기하지 않고, 특정 정도의 서열 변이를 용인하는 에피토프에 대해 유도될 수 있다.

교차-반응성은 주어진 면역 반응의 크기에 의해, 및/또는 반응자 백분율에 의해 측정될 수 있다.

면역 반응의 크기를 고찰할 경우, 면역원성 조성물 중에 제시되지 않은 클레이드로부터의 폴리펩티드에 의해 유도되는 면역 반응과 비교되는, 면역원성 조성물 중의 클레이드(들)과 같은 클레이드 또는 클레이드들로부터의 폴리펩티드에 의해 유도된 주어진 면역 반응의 크기에 의해 표시될 수 있다.

면역 반응의 크기를 분석하기 위해, 예를 들어, 항체 반응 분석을 위한 단백질 형태의 것, 또는 T 세포 반응 분석을 위한 중복 합성 펩티드로 이루어진 세트 형태의 것인, 면역원성 조성물 중의 항원을 포함하는 폴리펩티드가 면역학적 검정에서 사용될 수 있다. 적합한 면역학적 검정의 예는 당업자에게 주지되어 있고, 하기 실시예에 기술되어 있다.

면역 반응의 크기는 또한 적절한 혈청학적 검사에 의해 측정되는, 면역원성 조성물에 의해 유도된 항원-특이 항체의 역가 (또는 농도)로서 표시될 수 있다. T 세포 반응의 크기는 관찰되는 교차-반응성 수준은 전체 T 세포 집단 중 면역원성 조성물에 의해 유도된 항원-특이 세포의 빈도 (또는 개수)로서 표시될 수 있으며, 이는 시토카인 생산에 의해 모니터링될 수 있다.

면역 반응, 예를 들어, 교차-반응성 면역 반응의 크기는 전체적으로 또는 부분적으로 보존되는 에피토프 뿐만 아니라, 인식되는 에피토프의 우성에 의해 영향을 받을 수 있다.

예를 들어, 크기가 큰 면역 반응은 다수의 상대적으로 약한 보존되는 에피토프의 인식 또는 몇몇 우성 에피토프의 인식에 기인하는 것일 수 있다.

편리하게는, 관찰되는 교차-반응성 수준은 전체 T 세포 집단 중 면역원성 조성물에 의해 유도된 항원-특이 세포의, 또는 면역원성 조성물에 의해 유도된 항원-특이 항체의 역가 (또는 농도)의 최대 10%, 최대 15%, 최대 20%, 최대 25%, 최대 30%, 최대 35%, 최대 40%, 최대 45%, 최대 50%, 최대 55%, 최대 60%, 최대 65%, 최대 70%, 최대 80%, 최대 90% 또는 최대 100%이다.

상이한 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대한 반응자 백분율로서 교차-반응성을 측정할 경우, 후속 시험감염 후 면역학적 검정에서 양성 반응을 보이는 백신화된 개체의 수 또는 백분율을 측정할 수 있다. 반응자는 항원 상의 하나 이상의 에피토프에 반응할 수 있다. 반응자는 또한 본 발명의 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 폴리펩티드에 대해 및/또는 본 발명의 면역원성 조성물 중 하나 이상의 항원에 대해 반응할 수 있다.

반응자 백분율, 또는 면역 반응의 크기를 분석하는 데 사용될 수 있는 면역학적 검정 및 혈청학적 검사는 당업계에 공지되어 있다. 그러한 검정법의 예는 당업자에게 공지되어 있고, 하기 실시예 섹션에 기술되어 있다.

바람직하게, 관찰되는 교차-반응성의 수준은 샘플에 포함된 대상체 중 최대 10%, 최대 15%, 최대 20%, 최대 25%, 최대 30%, 최대 35%, 최대 40%, 최대 45%, 최대 50%, 최대 55%, 최대 60%, 최대 65%, 최대 70%, 최대 80%, 최대 90% 또는 최대 100%가 반응자인 것이다.

어떤 측정 방법이 사용되어도, 본 발명에서는 면역원성 조성물 중에 제시되지 않은 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대해 완전한 교차-반응성, 예를 들어 100% 교차-반응성이 요구되지 않는다.

본 발명의 면역원성 조성물은 Th1 면역 반응의 차별적 유도제인 아주반트를 포함한다.

아주반트는 일반적으로 문헌 [Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, New York, 1995] (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다.

면역자극제인 아주반트는 항원에 대해 특이적인 면역 반응 (항체 및/또는 세포 매개 면역 반응)을 증진시키거나 강화시키는, 면역원성 조성물 중의 성분을 의미한다.

아주반트는 Th1형 및 Th2형 반응의 면역 반응을 유도할 수 있다. Th1형 시토카인 (예를 들어, IFN-γ, IL-2, 및 IL-12)은 우선적으로 주어진 항원에 대해 세포-매개 면역 반응을 유도하는 경향이 있는 반면, Th2형 시토카인 (예를 들어, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10)은 우선적으로 항원에 대해 체액성 면역 반응을 유도하는 경향이 있다.

본 발명에서, 아주반트는 Th1 면역 반응의 차별적 유도제이다.

Th1형 및 Th2형 면역 반응에 있어서의 차이는 절대적인 것은 아니다. 사실상, 개체는 우세하게는 Th1 또는 우세하게는 Th2인 것으로 설명되는 면역 반응을 지원할 것이다. 그러나, 대개는 모스만(Mosmann)과 코프만(Coffman)에 의해 뮤린 CD4+ T 세포 클론에서 설명된 것 (문헌 [Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173] (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다))의 관점에서 시토카인 패밀리를 고찰하는 것이 편리하다. 전통적으로, Th1형 반응은 T-림프구에 의한 IFN-γ 및 IL-2 시토카인 생산과 관련이 있다. 예를 들어, IL-12와 같이, 대개 Th1형 면역 반응 유도와 직접적인 연관이 있는 다른 시토카인은 T 세포에 의해 생산되지 않는다. 대조적으로, Th2형 반응은 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 분비와 관련이 있다. 우세하게는 Th1 반응을 촉진시키는 적합한 아주반트 시스템으로는 모노포스포릴 지질 A 또는 그의 유도체 (또는 일반적으로 해독화된 지질 A, 예를 들어, WO2005107798 참조), 특히, 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL) (그의 제조에 대해서는 GB 2220211 A 참조); 및 알루미늄 염 (예를 들어, 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄) 또는 수중유 에멀젼과 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게, 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A의 조합물을 포함한다. 상기 조합물에서, 항원 및 3D-MPL은 같은 미립자 구조로 함유되어 있으며, 이를 통해 항원성 및 면역자극 신호를 더욱 효율적으로 전달할 수 있다. 3D-MPL이 알룸(alum)-흡착 항원의 면역원성을 추가로 증강시킬 수 있다는 것인 연구를 통해 밝혀졌다 (문헌 [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14]; EP 689454-B1 (이들 문헌은 각각 본원에 참고로 포함된다)).

증강된 시스템은 모노포스포릴 지질 A 및 사포닌 유도체의 조합물, 특히, WO 94/00153 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)에 개시된 것과 같은 QS21 및 3D-MPL의 조합물, 또는 WO 96/33739 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)에 개시된 바와 같은, QS21이 콜레스테롤로 켄칭된, 반응생성력이 더 작은 조성물을 포함한다. 수중유 에멀젼 중 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는, 특히 강력한 효능이 있는 아주반트 제제는 WO 95/17210 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 추가로 사포닌을 포함하며, 이는 QS21일 수 있다. 상기 제제는 또한 수중유 에멀젼 및 토코페롤을 포함할 수 있다 (WO 95/17210 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)).

본 발명의 한 실시양태에서, 아주반트는 면역학적으로 활성인 사포닌 분획 및/또는 리포폴리사카라이드 및/또는 면역자극성 올리고뉴클레오티드로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다.

한 실시양태에서, 아주반트는 면역학적으로 활성인 사포닌 분획 및 리포폴리사카라이드를 포함한다.

편리하게는, 면역학적으로 활성인 사포닌 분획은 QS21이고/거나, 리포폴리사카라이드는 지질 A 유도체이다. 적합하게는, 지질 A 유도체는 3D-MPL이다.

적합한 아주반트는 3D-MPL 및 QS21의 조합물 (EP 0 671 948 B1 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)), 3D-MPL 및 QS21을 포함하는 수중유 에멀젼 (WO 95/17210, WO 98/56414 (이들 문헌은 각각 본원에 참고로 포함된다)), 또는 다른 담체와 함께 제제화된 3D-MPL (EP 0 689 454 B1 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다))이다.

3D-MPL은 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈(GlaxoSmithKline Biologicals: 북미)로부터 이용가능하며, 이는 주로 IFN-γ (Th1) 표현형과의 CD4+ T 세포 반응을 촉진시킨다. 이는 GB 2 220 211 A에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다. 이는 화학적으로 3, 4, 5 또는 6개의 아실화된 쇄와 3-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A의 혼합물이다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물에서, 소형 입자 3D-MPL이 사용된다. 소형 입자 3D-MPL은 0.22 μm 필터를 통해 멸균 여과될 수 있는 입자 크기를 가진다. 그의 제조에 관해서는 WO 94/21292 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다.

본 발명에 사용하기에 적합한 또 다른 아주반트는 퀼 A(Quil A) 및 그의 유도체이다. 퀼 A는 남아메리카 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quilaja Saponaria Molina)로부터 단리된 사포닌 제제이고, 이것이 아주반트 활성을 가진다는 것은 1974년에 달스가르드(Dalsgaard) 등에 의해 최초로 기술되었다 (문헌 ["Saponin adjuvants", Archiv. fuer die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254] (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)). 예를 들어, QS7 및 QS21 (QA7 및 QA21로도 공지되어 있음)과 같이, 퀼 A와 관련된 독성은 없으며, 아주반트 활성은 보유하는 퀼 A의 정제된 단편은 HPLC에 의해 단리된 것이다 (EP 0 362 278 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)). QS21은 퀼라자 사포나리아 몰리나의 나무껍질로부터 유래된 천연 사포닌으로서, 이는 CD8+ 세포독성 T 세포 (CTL), Th1 세포 및 현저한 IgG2a 항체 반응을 유도하며, 이는 본 발명과 관련하여 바람직한 사포닌이다.

특히 적합한 QS21의 특정 제형이 기술된 바 있으며, 이러한 제형은 스테롤을 추가로 포함한다 (WO96/33739 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)). 본 발명의 사포닌 형성부는 미셀, 혼합형 미셀 (우선적으로, 그러나, 배타적인 것은 아니지만, 담즙 염과의 혼합형 미셀)의 형태로 분리될 수 있거나, ISCOM 매트릭스 (EP 0 109 942 B1 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)), 리포솜 또는 관련 콜로이드 구조, 예를 들어, 연충형(worm-like) 또는 환형 다량체 복합체 또는 지질성/층상 구조 및 층판 (콜레스테롤 및 지질로 제제화된 경우) 형태, 또는 수중유 에멀젼 형태 (예를 들어, WO 95/17210 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)에서와 같은 형태)일 수 있다. 사포닌은 금속 염, 예를 들어, 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄과 결합될 수 있다 (WO 98/15287 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)).

증강된 시스템은 모노포스포릴 지질 A (또는 해독화된 지질 A) 및 사포닌 유도체의 조합물, 특히, WO 94/00153 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)에 개시된 것과 같은 QS21 및 3D-MPL의 조합물, 또는 WO 96/33739 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)에 개시된 바와 같은, QS21이 콜레스테롤로 켄칭된, 반응생성력이 더 작은 조성물을 포함한다. 수중유 에멀젼 중 QS21 및/또는 3D-MPL을 포함하거나, 포함하지 않으며, 토코페롤을 포함하는, 특히 강력한 효능이 있는 아주반트 제제는 WO 95/17210 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다.

한 실시양태에서, 아주반트는 스테롤을 포함하며, 이는 콜레스테롤인 것이 적합할 수 있다. 적합한 스테롤, 예를 들어, 콜레스테롤은 사포닌의 아주반트 효과는 유지시켜 주면서, 조성물의 반응생성력을 감소시키는 작용을 한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 아주반트는 리포솜 담체를 포함한다.

한 실시양태에서, 아주반트는 1:1 내지 1:100 (w/w)의 사포닌:스테롤의 비로 사포닌 및 스테롤을 포함한다. 편리하게는, 사포닌:스테롤의 비는 1:1 내지 1:10 (w/w)이거나, 또는 사포닌:스테롤의 비는 1:1 내지 1:5 (w/w)이다.

한 실시양태에서, 아주반트는 1:1의 사포닌:리포폴리사카라이드의 비로 사포닌 및 리포폴리사카라이드를 포함한다.

편리하게는, 아주반트는 리포폴리사카라이드를 포함하는데, 상기 리포폴리사카라이드는 용량당 1-60 ㎍의 양으로 존재한다. 적합하게는, 리포폴리사카라이드는 용량당 50 ㎍, 용량당 25 ㎍, 용량당 10 ㎍, 또는 용량당 5 ㎍의 양으로 존재한다.

편리하게는, 아주반트는 사포닌을 포함하는데, 상기 사포닌은 용량당 1-60 ㎍의 양으로 존재한다. 적합하게는, 사포닌은 용량당 50 ㎍, 용량당 25 ㎍, 용량당 10 ㎍, 또는 용량당 5 ㎍의 양으로 존재한다.

한 실시양태에서, 아주반트는 (0.5 mL의 용량당) 0.025-2.5, 0.05-1.5, 0.075-0.75, 0.1-0.3, 또는 0.125-0.25 mg (예를 들어, 0.2-0.3, 0.1-0.15, 0.25 또는 0.125 mg)의 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤)을 포함한다.

한 실시양태에서, 아주반트는 (0.5 mL의 용량당) 5-60, 10-50, 또는 20-30 ㎍ (예를 들어, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎍)의 지질 A 유도체 (예를 들어, 3D-MPL)를 포함한다.

한 실시양태에서, 아주반트는 (0.5 mL의 용량당) 5-60, 10-50, 또는 20-30 ㎍ (예를 들어, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎍)의 사포닌 (예를 들어, QS21)을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 아주반트는 수중유 에멀젼을 포함한다.

편리하게는, 수중유 에멀젼은 스쿠알렌 및/또는 알파 토코페롤을 포함한다. 적합하게는, 수중유 에멀젼은 대사가능한 수중유 에멀젼이다. 특히, 수중유 에멀젼은 유화제, 예를 들어, 트윈 80을 포함하는 것이 적합하다.

편리하게는, 아주반트는 사포닌 및 리포폴리사카라이드를 포함할 수 있다. 특히, 아주반트는 1:10 내지 10:1 (w/w) 범위의 사포닌:리포폴리사카라이드의 비로 사포닌 및 리포폴리사카라이드를 포함할 수 있다.

편리하게는, 아주반트는 사포닌 및 스테롤을 포함할 수 있다. 특히, 아주반트는 1:1 내지 1:20 (w/w) 범위의 사포닌:스테롤의 비로 사포닌 및 스테롤을 포함할 수 있다.

편리하게는, 아주반트는 사포닌 및 대사가능한 오일을 포함할 수 있다. 특히, 아주반트는 1:1 내지 250:1 (w/w) 범위의 대사가능한 오일:사포닌의 비로 사포닌 및 대사가능한 오일을 포함할 수 있다.

편리하게는, 아주반트는 알파 토코페롤을 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 아주반트는 (0.5 mL의 용량당) 0.5-15, 1-13, 2-11, 4-8, 또는 5-6 mg (예를 들어, 2-3, 5-6, 또는 10-11 mg)의 대사가능한 오일 (예를 들어, 스쿠알렌)을 포함한다.

한 실시양태에서, 아주반트는 (0.5 mL의 용량당) 0.1-10, 0.3-8, 0.6-6, 0.9-5, 1-4, 또는 2-3 mg (예를 들어, 0.9-1.1, 2-3 또는 4-5 mg)의 유화제 (예를 들어, 트윈 80)를 포함한다.

한 실시양태에서, 아주반트는 (0.5 mL의 용량당) 0.5-20, 1-15, 2-12, 4-10, 5-7 mg (예를 들어, 11-13, 5-6, 또는 2-3 mg)의 토콜 (예를 들어, 알파 토코페롤)을 포함한다.

한 실시양태에서, 아주반트는 (0.5 mL의 용량당) 5-60, 10-50, 또는 20-30 ㎍ (예를 들어, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎍)의 지질 A 유도체 (예를 들어, 3D-MPL)를 포함한다.

한 실시양태에서, 아주반트는 (0.5 mL의 용량당) 0.025-2.5, 0.05-1.5, 0.075-0.75, 0.1-0.3, 또는 0.125-0.25 mg (예를 들어, 0.2-0.3, 0.1-0.15, 0.25 또는 0.125 mg)의 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤)을 포함한다.

한 실시양태에서, 아주반트는 (0.5 mL의 용량당) 5-60, 10-50, 또는 20-30 ㎍ (예를 들어, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎍)의 사포닌 (예를 들어, QS21)을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 아주반트는 금속 염 및 지질 A 유도체을 포함한다.

관심의 대상이 되는 상기와 같은 아주반트 시스템으로는 리포폴리사카라이드 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A와의 알루미늄 염 기반의 것을 포함한다. 항원 및 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A는 같은 금속 염 입자에 함께 공동으로 흡착될 수 있거나, 다른 금속 염 입자에 흡착될 수 있다.

적합하게는, 아주반트는 (0.5 mL의 용량당) 100-750, 200-500, 또는 300-400 ㎍의 Al, 예를 들어, 인산알루미늄을 포함한다. 상기 실시양태에서, 아주반트는 (0.5 mL의 용량당) 5-60, 10-50, 또는 20-30 ㎍ (예를 들어, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎍)의 지질 A 유도체 (예를 들어, 3D-MPL)를 포함한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 아주반트는 CpG 모티프를 포함하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

면역자극성 올리고뉴클레오티드가 본 발명의 면역원성 조성물에 사용될 수 있다. 아주반트 또는 본 발명의 면역원성 조성물에 사용하기에 바람직한 올리고뉴클레오티드는 CpG 함유 올리고뉴클레오티드, 바람직하게, 적어도 3개, 더욱 바람직하게는, 적어도 6개 이상 뉴클레오티드 만큼 이격화되어 있는 2개 이상 디뉴클레오티드 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드이다. CpG 모티프는 시토신 뉴클레오티드에 구아닌 뉴클레오티드가 후속된 것이다. 본 발명의 CpG 올리고뉴클레오티드는 전형적으로는 데옥시뉴클레오티드이다. 바람직한 실시양태에서, 비록 포스포디에스테르 및 다른 뉴클레오티드 간 결합도 본 발명의 범주 내에 포함되기는 하지만, 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드 간에는 포스포로디티오에이트, 또는 더욱 바람직하게, 포스포로티오에이트 결합이 존재한다. 혼합형 뉴클레오티드 간 결합을 가진 올리고뉴클레오티드 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로디티오에이트를 제조하는 방법은 US5,666,153, US5,278,302 및 WO95/26204 (이들 출원은 각각 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다.

바람직한 올리고뉴클레오티드의 예는 하기 서열을 가진다. 서열은 바람직하게 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드 간 결합을 포함한다.

대체 CpG 올리고뉴클레오티드는 그가 중요하지 않은 결실 또는 그에의 부가를 가지고 있다는 점에서 상기 바람직한 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 CpG 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 합성될 수 있다 (예를 들어, EP 468520 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다) 참조). 편리하게는, 상기 올리고뉴클레오티드는 자동 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 의한 질환 또는 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.

추가로, 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 의한 질환 또는 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.

따라서, 면역원성 조성물은 본원에 제시된 클레이드들에 대한 동종 면역 반응을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 조성물에 존재하는 항원 균주에 의해 포괄되지 않는 클레이드들에 대한 교차-반응성 면역 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 면역원성 조성물은 광범위하게 다중 클레이드로부터의 다중 HIV-1 균주에 의한 질환 또는 감염을 치료 또는 예방할 수 있다.

편리하게는, 본 발명의 모든 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드들은 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, 또는 HIV-1의 순환 재조합 형태 (CRF)로부터 선택된다. 특히, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드들은 클레이드 B이다.

유사하게 편리하게는, 본 발명의 모든 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드들은 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, 또는 HIV-1의 순환 재조합 형태 (CRF)로부터 선택된다. 특히, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드들은 클레이드 A 또는 C로부터 선택된다. 적합하게는, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드들은 클레이드 A 및 C로부터 선택된다.

세계적으로 이러한 HIV-1 클레이드들의 유병률은 다양하다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물을 그의 적합한 사용 지역으로 제한할 필요도 없고, 전 세계에서 HIV-1 감염 및 질환을 치료 및 예방하는 데 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대한 체액성 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한 것이다. 편리하게는, 그러한 실시양태에서, 체액성 면역 반응은 또한 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대해 유도될 수도 있다.

본 발명에서, 체액성 면역 반응은 강력한 항원-특이 항체 역가를 특징으로 하였다. 면역 반응은 ELISA 기반 검정에 의해 검출하였다. 강력한 체액 반응 유도는 본 발명의 면역원성 조성물의 광범위한 면역원성을 나타낸다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에게 장기간 동안 질환이 진행되지 않는 무진행자 지위를 부여하는 데 사용하기 위한 것이다. 편리하게는, 상기 실시양태에서, 장기간 동안 질환이 진행되지 않는 무진행자 지위는 또한 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에게 부여될 수도 있다.

장기간 동안 질환이 진행되지 않는 무진행자 (LTNP)는 HIV-1 감염을 방어할 수 있고, 이로써, 질환이 진행되지 못하도록 예방할 수 있는, HIV-1 감염 환자이다. 상기와 같은 지위는 대개 다관능성이며 증식능이 있는 HIV-1-특이 CD4+ T 세포의 존재와 관련이 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대한 다중-시토카인-생산 항바이러스 CD4+ T 세포를 유도하는 데 사용하기 위한 것이다. 편리하게는, 상기와 같은 실시양태에서, 다중-시토카인-생산 항바이러스 CD4+ T 세포는 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대해 유도될 수 있다.

편리하게는, CD4+ T 세포는 IL2, IFNγ 및 TNFα 중 2개 이상을 생산한다. 상기 세포는 다관능성인 것으로 간주될 수 있다. 이런 점에서, CD4+ T 세포는 IL2 및 IFNγ을 생산하거나, 또는 CD4+ T 세포는 IL2 및 TNFα를 생산하거나, 또는 CD4+ T 세포는 IFNγ 및 TNFα를 생산한다. 적합하게는, CD4+ T 세포는 IL2, IFNγ 및 TNFα를 생산한다. 한 실시양태에서, CD4+ T 세포는 CD40L을 발현한다.

다기능성 표현형을 보이는 CD4+ T 세포 유도는 본 발명의 면역원성 조성물의 광범위한 면역원성을 시사하는 것이다. 그러한 다관능성 CD4+ T 세포의 존재는 HIV-1 감염 및 바이러스혈증의 방어와, 예를 들어, 장기간 동안 질환이 진행되지 않는 무진행자에서 감염 및/또는 질환이 진행되지 않는 것과 관련이 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에서의 진행성 CD4+ T 세포 감소를 방지하는 데 사용하기 위한 것이다. 편리하게는, 상기와 같은 실시양태에서, 진행성 CD4+ T 세포 감소는 또한 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에서 저지된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역원성 조성물은 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에서 바이러스 저장소를 감소 또는 제거하는 데 사용하기 위한 것이다. 편리하게는, 상기와 같은 실시양태에서, 바이러스 저장소는 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에서 감소 또는 제거될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역원성 조성물은 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에서 장기 지속되는 높은 수치의 HIV-1-특이 다관능성 CD4+ T 세포를 유도하는 데 사용하기 위한 것이다. 편리하게는, 상기와 같은 실시양태에서, 장기 지속되는 높은 수치의 HIV-1-특이 다관능성 CD4+ T 세포는 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에서 유도될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역원성 조성물은 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에서 바이러스혈증을 통제하거나 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 편리하게는, 상기와 같은 실시양태에서, 바이러스혈증은 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에서 통제되거나 감소될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대한 항바이러스 면역 반응의 장기간 기억을 유도시키는 데 사용하기 위한 것이다. 편리하게는, 항바이러스 면역 반응의 장기간 기억은 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대해 유도될 수 있다.

적합하게는, 항바이러스 면역 반응은 지속성 항바이러스 CD4+ T 세포의 유도를 포함한다. 상기 T 세포는 면역원성 조성물 중에 제시되어 있는 클레이드들 뿐만 아니라, 면역원성 조성물 중에 제시되지 않은 클레이드로부터의 항원에 대한 반응으로 유도되고, 따라서, 이는 본 발명에 따라 교차-반응성 면역 반응이다.

편리하게는, CD4+ T 세포는 적어도 6개월 동안 지속된다. "지속된다"라는 것은 CD4+ T 세포가 그가 처음 유도되었을 때와 등가인 표현형 상태로 장기간에 걸쳐 존재할 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, CD4+ T 세포가 처음 유도되었을 때에 2개 이상의 특이 시토카인을 방출하였다면, 장기간 후에도, 예를 들어, 적어도 6개월 후에도 여전히 CD4+ T 세포는 지속적으로 같은 시토카인 프로파일을 보일 것이다.

적합하게는, CD4+ T 세포는 6 내지 24개월, 또는 9 내지 18개월, 예를 들어, 12개월 동안 지속된다.

따라서, 본 발명은 또한 대상체에게 면역원성 조성물을 투여하고, 대상체에서 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대한 면역 반응을 유도하는 단계를 포함하는, HIV 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 면역원성 조성물에 존재할 수 있는 항원들 중 하나 이상을 포함하는 융합 단백질이 WO2006/013106 (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)에 개시되어 있다. 다른 HIV 균주 간에도 상대적으로 잘 보존되는 것으로 간주되고, 이에 그보다는 보존이 덜 이루어지는 항원보다는 다른 HIV 균주로부터 유래된 항원과 교차 반응할 가능성이 더 크기 때문에, 항원 Pol, Nef, Gag 및 그의 변이체 및 단편은 면역원성 조성물에서 사용하기 위한 융합 단백질에 포함시키기 위한 것으로 이미 선택된 것이다. 그러나, 이러한 항원을 융합 단백질에 혼입시키면 예측불가능한 문제가 도입될 수 있는데, 그 이유는 그 안의 항원이 고유 단백질에 상응하지 않기 때문이다. 따라서, 융합 단백질을 제조하는 것이 쉽지 않고, 고유 단백질과 같은 반응을 보일 것이라고 가정할 수도 없다.

본 발명의 한 실시양태에서, 면역원성 조성물 중 2, 3, 4개 또는 그 초과의 항원이 융합되어 융합 단백질을 형성한다.

편리하게는, Gag가 Pol에 융합되어 있거나, 또는 Pol이 Gag에 융합되어 있거나, 또는 Pol이 Nef에 융합되어 있거나, 또는 Nef가 Pol에 융합되어 있고/거나, Nef가 Gag에 융합되어 있거나, 또는 Gag가 Nef에 융합되어 있다.

적합하게는, 본 발명의의 융합 단백질에서, Gag는 p17 및/또는 p24이고/거나, Pol은 RT이다.

특히, 편리하게는, 면역원성 조성물 중 항원이 융합되어 임의 순서로 Nef, RT, p17 및 p24를 포함하는 융합 단백질이 형성된다. 적합하게는, 항원이 융합되어 p24-RT-Nef-p17을 포함하는 융합 단백질이 형성된다. 상기 융합 단백질이 F4로 공지되어 있으며, 이는 실시예에 기술되어 있다.

융합 단백질 중의 항원은 서로 직접 융합되어 있을 수 있거나, 링커를 수단으로 하여 융합되어 있을 수 있다. 그러한 링커는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 이종 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

융합체 중의 항원은 같은 HIV 균주로부터 유래된 것일 수 있거나, 같은 HIV-1 클레이드 내의 상이한 균주로부터 유래된 것일 수 있거나, 또는 상이한 HIV-1 클레이드로부터의 상이한 균주로부터 유래된 것일 수 있다.

한 실시양태에서, 융합체 중의 항원은 2, 3, 또는 4개의 상이한 HIV-1 클레이드로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 것이다. 별법으로, 융합 단백질 중의 모든 항원이 한 HIV-1 균주로부터, 또는 같은 HIV-1 클레이드로부터의 균주들부터 유래된 것이다.

본 발명에 따른 펩티드는 다른 항원과 조합될 수 있다. 특히, 이는 HIV-1 env 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. env의 바람직한 형태는 gp120, gp140 및 gp160이다. env는 예를 들어, WO 00/07631에 기술된 바와 같은, R2로 공지된 HIV-1 클레이드 B 외피 클론으로부터의 외피 단백질, 또는 그의 단편 또는 변이체일 수 있다. env는 또한 W61.D로도 공지되어 있는 gp120 클론, 또는 그의 단편 또는 변이체일 수 있다.

따라서, 본 발명은 추가로 HIV-1 env 단백질 또는 그의 단편 또는 변이체를 추가로 포함하는 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제공한다. 명확하게 하기 위해, 본원에서 사용되는 바, "단편" 및 "변이체"라는 용어의 의미는 상기 정의된 바와 같다.

한 실시양태에서, 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물은 항원을 포함하는 하나 이상의 비융합 폴리펩티드를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 비융합 폴리펩티드 중의 항원은 융합 단백질 중의 항원들 중 적어도 하나와 같은 클레이드로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 것이다.

별법으로, 비융합 폴리펩티드 중의 항원은 융합 단백질 중의 하나 이상의 클레이드와 상이한 HIV-1 균주로부터 유래된 것이다.

한 실시양태에서, 비융합 폴리펩티드는 Env를 포함한다. 예를 들어, 비융합 폴리펩티드는 gp120, gp140 또는 gp160 중 하나 이상을 포함한다.

HIV-1 외피 당단백질 gp120은 숙주 세포에의 부착에 사용되는 바이러스 단백질이다. gp120 단백질이 중화 항체의 주된 표적이지만, 불행하게도, 상기 단백질의 면역원성이 가장 큰 영역 (V3 루프)은 또한 상기 단백질의 가변성이 가장 큰 부분이기도 하다. gp120 단백질은 또한 세포독성 T 림프구 (CTL)에 의해 인식되는 에피토프를 함유한다. 이러한 효과기 세포는 바이러스로 감염된 세포를 제거할 수 있으며, 이로써 제2 주요 항바이러스 면역 기전을 구성한다. 중화 항체의 표적 영역과는 대조적으로, 일부 CTL 에피토프는 상이한 HIV-1 균주들간에 상대적으로 보존되는 것으로 보여진다. 이러한 이유에서, gp120 및 gp160은 세포 매개 면역 반응 (특히, CTL)을 유도하고자 하는 백신에서 유용한 항원 성분이 될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물에서 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 항원 중 하나는 A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, 또는 HIV-1의 순환 재조합 형태 (CRF)로부터 선택된 클레이드들 중 어느 하나로부터의 HIV-1로부터 유래된 것이다. 면역원성 조성물 중에 1 초과의 항원이 존재할 경우, 이때 모든 항원은 같은 클레이드로부터의 것일 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물에서 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 항원 중 하나는 클레이드 B로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 것이다.

예를 들어, 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물 중에 2개의 항원이 존재할 경우, 2가지 항원 모두 클레이드 B로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 것이거나, 또는 면역원성 조성물 중에 3개의 항원이 존재할 경우, 3가지 항원 모두 클레이드 B로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 것이거나, 또는 면역원성 조성물 중에 4개의 항원이 존재할 경우, 4가지 항원 모두 클레이드 B로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 것이거나 하는 등이다.

별법으로, 본 발명의 면역원성 조성물에서 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 항원 중 하나는 클레이드 C로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 것이다.

예를 들어, 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물 중에 2개의 항원이 존재할 경우, 2가지 항원 모두 클레이드 C로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 것이거나, 또는 면역원성 조성물 중에 3개의 항원이 존재할 경우, 3가지 항원 모두 클레이드 C로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 것이거나, 또는 면역원성 조성물 중에 4개의 항원이 존재할 경우, 4가지 항원 모두 클레이드 C로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 것이거나 하는 등이다.

본 발명의 면역원성 조성물, 또는 백신은 면역방어량 또는 면역치료량의 폴리펩티드를 함유할 것이며, 이는 종래 기법에 의해 제조될 수 있다.

한 실시양태에서, 단일 용량의 면역원성 조성물 중 각 항원의 총량은 0.5-25 ㎍, 2-20 ㎍, 5-15 ㎍, 또는 약 10 ㎍이다.

적합하게는, 단일 용량의 면역원성 조성물 중 융합 단백질의 총량은 10 ㎍이고/거나, 단일 용량의 면역원성 조성물 중 비융합 폴리펩티드의 총량은 20 ㎍이다.

한 실시양태에서, 단일 용량의 면역원성 조성물 중 모든 항원의 총량은 0.5-50 ㎍, 2-40 ㎍, 5-30 ㎍, 7-20 ㎍ 또는 약 30 ㎍, 약 20 ㎍ 또는 약 10 ㎍이다.

한 용량의 면역원성 조성물 중 단백질의 양은 전형적인 수혜자에서 유의적인 유해한 부작용을 일으키지 않으면서, 면역 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 그러한 양은 어떤 특이 면역원이 사용되는지, 및 선택된 투여 또는 백신화 요법에 따라 달라질 것이다. 특정 면역원성 조성물에 대해 최적인 양은 대상체에서 관련 면역 반응을 관찰하는 것을 비롯한 표준 연구에 의해 확인할 수 있다.

제약 조성물 투여는 한 개별 투여 형태를 취할 수 있거나, 1 초과의 개별 투여 형태, 예를 들어, 같은 폴리펩티드를 함유하는 조성물의 반복 투여 형태를 취할 수 있거나, 또는 이종 "프라임-부스트" 백신화 요법을 취할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 초기에는 2회 또는 3회 투여로서 대상체에게 투여되고, 여기서, 투여는 2주 내지 3개월, 바람직하게는 1개월의 기간을 두고 분리되어 있다.

편리하게는, 조성물은 대상체에게 (예를 들어, 부스터로서) 매 6-24개월, 또는 9-18개월마다, 예를 들어, 1년 단위로 투여된다. 예를 들어, 조성물은 대상체에게 (예를 들어, 부스터로서) 6개월 또는 1년의 간격을 두고 투여된다.

적합하게는 이러한 점에서, 대상체에 대한 조성물의 후속적 투여는 같은 대상체에 대한 이전의 조성물 투여의 면역 반응을 부스팅시킨다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 의한 질환 또는 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 프라임-부스트 요법의 일부로서 사용된다.

편리하게는, 조성물은 프라이밍 용량이다. 별법으로, 조성물은 부스팅 용량이다.

적합하게는, 2회 이상의 프라이밍 및/또는 부스팅 용량이 투여된다.

이종 프라임-부스트 요법은 프라임 및 부스트시 상이한 형태의 면역원성 조성물 또는 백신 투여를 사용하는데, 이들 각각은 그 자체가 2회 이상의 투여를 포함할 수 있다. 프라이밍 조성물 및 부스팅 조성물은 공통적으로 적어도 하나의 항원을 가질 것이며, 비록 상기 항원이 동일한 형태의 항원일 필요는 없지만, 이는 다른 형태의 같은 항원일 수 있다.

본 발명에 따른 프라임-부스트 면역화는 동종 프라임-부스트 요법 또는 이종 프라임-부스트 요법일 수 있다. 동종 프라임-부스트 요법은 프라임 및 부스트를 위해 같은 조성물, 예를 들어, 본 발명의 면역원성 조성물을 사용한다.

이종 프라임-부스트 요법은 단백질 및 DNA-기반 제제의 조합을 사용함으로써 수행될 수 있다. 상기와 같은 전략법은 광범위한 면역 반응을 유도하는 데 효과적인 것으로 간주된다. 아주반트 첨가된 단백질 백신은 주로 항체 및 CD4+ T 세포 면역 반응을 유도하는 반면, 플라스미드 또는 재조합 벡터로서 DNA를 전달하면 강력한 CD8+ T 세포 반응이 유도된다. 따라서, 단백질과 DNA 백신화의 조합이 매우 다양한 면역 반응을 제공할 수 있다. 이는 특히 HIV에 관하여 관련성이 있는데, 그 이유는 중화 항체, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 HIV-1에 대한 면역 방어에 있어서 중요한 것으로 사료되기 때문이다.

한 실시양태에서, DNA는 바이러스 벡터에 포함된 상태로 전달된다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 아데노바이러스로부터 유래된 것일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 바이러스 벡터는 US20100055166 (이 문헌은 바이러스 벡터 및 프라임-부스트 방법에 관한 본원의 개시내용을 위해 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있는 것과 같을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 홍역 바이러스로부터 유래된 것일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 바이러스 벡터는 WO2010/023260 (이 문헌은 바이러스 벡터 및 프라임-부스트 방법에 관한 본원의 개시내용을 위해 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있는 것과 같은 재조합 홍역 벡터일 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 제1 조성물을 대상체에게 투여한 후, 이어서 제2 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 투여 후 대상체는 대상체에서 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대해 검출가능한 면역 반응을 보이는 것인, HIV 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 대체 실시양태에서, 상기 방법은 동종 프라임-부스트 요법 또는 이종 프라임-부스트 요법일 수 있다.

본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 백신 조성물이다.

백신 제제는 일반적으로 문헌 [New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978] (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다.

본 발명의 추가의 측면에서, 상기 모든 사례로 기술된 바와 같은 HIV-1 균주에 의한 질환 또는 감염의 치료 또는 예방용 의약의 제조에서 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 기술된 모든 사례에 따른 HIV-1 질환 또는 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본원에서 "포함하는," 포함하다," 및 "포함한다"라는 용어는 본 발명자에 의해 임의로는 모든 사례에서 각각 "구성된," "구성되다," 및 "구성된다"라는 용어와 치환가능한 것으로 한다.

본원에서 본 발명의 "면역원성 조성물"에 관한 실시양태는 또한 본 발명의 "백신"에 관한 실시양태에 적용될 수 있으며, 그 반대의 경우로도 적용될 수 있다.

본 발명이 보다 잘 이해될 수 있도록 하기 위해, 하기 실시예를 기술한다. 이러한 실시예는 단지 예시적인 목적의 것이며, 어느 방식으로는 본 발명의 제한하는 것으로 해석되서는 안된다.

실시예

하기 실시예 및 데이터가 본 발명을 예시하지만, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

1. 아주반트 제제

유기 용매 중의 지질 (예를 들어, 난황으로부터 유래된 포스파티딜콜린 또는 합성의 것) 및 콜레스테롤 및 3D-MPL의 혼합물을 진공하에 (또는 별법으로, 불활성 기체 흐름하에) 건조시켰다. 이어서, 수용액 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수)을 첨가하고, 모든 지질이 현탁 상태가 될 때까지 용기를 교반하였다. 이어서, 리포솜 크기가 약 100 nm로까지 축소될 때까지 상기 현탁액을 미세유동화시킨 후, 0.2 ㎛ 필터를 통해 멸균 여과시켰다. 상기 단계 대신 압출 또는 초음파 처리를 수행할 수 있다.

전형적으로, 콜레스테롤:포스파티딜콜린 비는 1:4 (w/w)였고, 콜레스테롤의 최종 농도가 10 mg/ml가 되도록 수용액을 첨가하였다.

리포솜의 크기는 대략 100 nm이고, 이를 SUV (소형 단일층 소포체)로 지칭한다. 리포솜은 그 스스로 오랜 시간에 걸쳐서 안정성이고, 융합생성능은 없다.

멸균의 벌크 형태의 SUV를 PBS에 첨가하였다. PBS 조성은 Na₂HPO₄: 9 mM; KH₂PO₄: 48 mM; NaCl: 100 mM (pH 6.1)이었다. 수용액 중의 QS21을 SUV에 첨가하였다. 3D-MPL 및 QS21의 최종 농도는 각각 100 ㎍/ml였다. 각 성분들을 첨가하는 동안 그 중간에, 중간체 생성물을 5분 동안 교반하였다. pH를 체크하고, 필요에 따라 NaOH 또는 HCl을 사용하여 6.1 ± 0.1로 조정하였다.

2. HIV -1 항원 제조

2.1 HIV -1 p24 - RT - Nef - p17 융합체 ("F4") 및 코돈 최적화된 ( co ) F4 ("F4co")의 구축 및 발현

2.1.1 비-코돈 최적화된 F4

HIV-1 gag p24 (캡시드 단백질) 및 p17 (기질 단백질), 역전사 효소 및 Nef 단백질을 박테리오파지 T7 프로모터 (pET 발현 시스템)의 제어하에 이. 콜라이 B834 균주 (B834 (DE3)는 BL21 (DE3)의 메티오닌 영양요구균주 모체이다)에서 발현시켰다.

상기 단백질은 4개의 단백질의 완전 서열을 함유하는 단일 융합 단백질로서 발현되었다. 성숙한 p24 코딩 서열은 HIV-1 BH10 분자 클론으로부터 유도되고, 성숙한 p17 서열 및 RT 유전자는 HXB2로부터 유도되고, Nef 유전자는 BRU 단리물로부터 유도되었다.

유도 후, 재조합 세포는 총 단백질의 10%에 이르는 상당한 수준으로 p24-RT-Nef-p17 융합체를 발현하였다.

세포를 22℃에서 성장시키고, 유도시켰을 때에는 p24-RT-Nef-p17 융합 단백질이 주로 박테리아 용해물의 가용성 분획으로 한정되었다 (냉동/해동 이후에도). 30℃에서 성장시켰을 때에는 약 30%의 재조합 단백질이 불용성 분획과 결합하였다.

융합 단백질 p24-RT-Nef-p17은 분자량이 약 129 kDa인 1,136개의 아미노산으로 구성되어 있다. 전장의 단백질은 SDS 겔 상에서 약 130 kDa으로 이동하였다. 이 단백질은 2D 겔 전기영동에 의해 확인된 바와 같이, 그 아미노산 서열에 기초하여 그의 이론상의 등전점 (pI)은 7.96이었다.

재조합 플라스미드에 대한 상세한 설명:

명칭: pRIT15436 (또는 실험실 명칭 pET28b/p24-RT-Nef-p17)

숙주 벡터: pET28b

레플리콘: colE1

선택: 카나마이신

프로모터: T7

삽입체: p24-RT-Nef-p17 융합 유전자.

재조합 단백질에 대한 상세한 내용:

p24-RT-Nef-p17 융합 단백질: 1,136개의 아미노산.

N-말단-p24: 232a.a.-힌지: 2a.a.-RT: 562a.a.-힌지: 2a.a.-Nef: 206a.a.-- P17: 132a.a.-C-말단

뉴클레오티드 및 아미노산 서열:

뉴클레오티드 서열

아미노산 서열

재조합 단백질의 발현:

pET 플라스미드에서, 표적 유전자 (p24-RT-Nef-p17)는 강력한 박테리오파지 T7 프로모터 제어하에 있었다. 이 프로모터는 이. 콜라이 RNA 폴리머라제에 의해 인식되지 않으며, 숙주 세포에서 T7 RNA 폴리머라제의 공급원에 의존하였다. B834 (DE3) 숙주 세포는 lacUV5 제어하에 T7 RNA 폴리머라제 유전자의 염색체 카피를 함유하며, 발현은 IPTG를 박테리아 배양물에 첨가함으로써 유도되었다.

사전 배양물을 37℃하에 진탕 플라스크 중에서 대수증식기 중기 (A620:0.6)까지 성장시킨 후, 4℃에서 밤새 보관하였다 (증식정지기 배양물을 피하기 위해). 1% 글루코스 및 50 ㎍/ml 카나마이신으로 보충된 LBT 배지 중에서 배양물을 성장시켰다. 글루코스를 성장 배지에 첨가하면 기준 재조합 단백질 발현이 감소된다는 이점이 있다 (lacUV5 프로모터의 cAMP 매개된 탈억제 회피).

4℃에서 밤새 보관된 10 ml의 배양물을 사용하여 카나마이신을 함유하는 200 ml의 LBT 배지 (글루코스 비함유)에 접종하였다. 배양물을 30℃ 및 22℃에서 성장시키고, O.D.620이 0.6에 도달하였을 때, IPTG를 첨가하였다 (최종 1 mM). 배양물을 추가로 3, 5 및 18시간 (밤새) 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 유도 전 및 유도 후 3, 5 및 18시간 경과하였을 때에 수집하였다.

하기와 같이 추출물을 제조하였다:

세포 펠릿을 파괴 완충제^* (이론상 O.D.=10에서)에 현탁시키고, 프렌치(French) 프레스에서 4개의 통로에 의해 파괴시켰다 (20,000 psi 또는 1,250 bar에서). 조 추출물 (T)을 30분 동안 20,000 g에서 원심분리하여 가용성 (S) 및 불용성 (P) 분획을 분리시켰다.

(여기서, 파괴 완충제^*: 50 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1 mM DTT + 프로테아제 억제제 칵테일 (컴플리트/베링거(Complete/Boerhinger))).

SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석:

불용성 펠릿 (P), 상청액 (S) 및 조 추출물 (T)에 상응하는 분획을 10% 환원성 SDS-PAGE 상에서 전개시켰다. p24-RT-Nef-p17 재조합 단백질을 쿠마시-블루 염색법 및 웨스턴 블롯 (WB)에 의해 검출하였다.

쿠마시 염색: p24-RT-Nef-p17 단백질은 하기와 같이 나타났다:

±130 kDa에서 하나의 밴드로 나타남 (MW 계산치로 피팅됨)

MW 이론치: 128.970 달톤

MW 겉보기 수치: 130 kDa

웨스턴 블롯 분석:

시약 = - RT에 대한 모노클로날 항체 (p66/p51)

ABI(어드밴스드 바이오테크놀로지스(Advanced Biotechnologies))로부터 구입

희석율: 1/5,000

- 알칼리성 포스파타제-컨쥬게이트 항-마우스 항체

희석율: 1/7,500

발현 수준: - 22℃에서 20h 동안의 유도 후 매우 강력한 p24-RT-Nef-p17 특이적 밴드 (이는 총 단백질의 최대 10%를 나타냄) (도 9a 참조)

재조합 단백질의 "가용성":

"새로운" 세포 추출물 (T,S,P 분획): 22℃/20h의 성장/유도로 거의 모든 p24-RT-Nef-p17 융합 단백질이 세포 추출물의 가용성 분획으로 회수되었다 (도 9a 참조). 30℃/20h의 성장/유도로 약 30%의 p24-RT-Nef-p17 단백질이 불용성 분획과 결합하였다 (도 9a).

"냉동/해동" (S2, P2 분획):

가용성 (S1) 분획 (22℃에서 20h 유도)을 -20℃에서 보존하였다. 해동하고 20,000 g/30 min에서 원심분리하였다: S2 및 P2 (1/10 부피로 재현탁시킴).

VB64185

DTT를 함유하는 파괴 완충제: 거의 모든 p24-RT-Nef-p17 융합 단백질이 여전히 가용성이다 (단지 1 내지 5%만 침전됨) (도 9b 참조).

DTT를 함유하지 않는 파괴 완충제: 85-90%의 p24-RT-Nef-p17이 여전히 가용성이다 (도 9b).

하기 정의된 정제 방법을 사용하여 F4 단백질을 정제하였다.

2.1.2 코돈 최적화된 F4

코돈 사용 빈도가 이. 콜라이에서 고도로 발현되는 유전자의 코돈 사용 빈도와 유사하도록 하기 폴리뉴클레오티드 서열을 코돈 최적화시켰다. 이 아미노산 서열은 비-코돈 최적화된 F4에 대해 상기 제시된 것과 동일하다.

F4co에 대한 뉴클레오티드 서열:

비-코돈 최적화된 F4와 관련하여 사용된 방법을 코돈 최적화된 서열에 적용시켰다.

재조합 플라스미드에 대한 상세한 설명:

명칭: pRIT15513 (실험실 명칭: pET28b/p24-RT-Nef-p17)

숙주 벡터: pET28b

레플리콘: colE1

선택: 카나마이신

프로모터: T7

삽입체: 코돈 최적화된 p24-RT-Nef-p17 융합 유전자

B834(DE3) 균주의 recA^- 유도체인 이. 콜라이 BLR(DE3) 세포에서 코돈 최적화된 F4 유전자를 발현시켰다. RecA 돌연변이가 람다 파지의 추정 생산을 억제시켰다.

사전 배양물을 37℃에서 진탕 플라스크 중에서 대수증식기 중기 (A₆₂₀:0.6)까지 성장시킨 후, 4℃에서 밤새 보관하였다 (증식정지기 배양물을 피하기 위해).

1% 글루코스 및 50 ㎍/ml 카나마이신으로 보충된 LBT 배지 중에서 배양물을 성장시켰다. 글루코스를 성장 배지에 첨가하면 기준 재조합 단백질 발현이 감소된다는 이점이 있다 (lacUV5 프로모터의 cAMP 매개된 탈억제 회피).

4℃에서 밤새 보관된 10 ml의 배양물을 사용하여 카나마이신을 함유하는 200 ml의 LBT 배지 (글루코스 비함유)에 접종하였다. 배양물을 37℃에서 성장시키고, O.D.₆₂₀이 0.6에 도달하였을 때, IPTG를 첨가하였다 (최종 1 mM). 배양물을 22℃에서 추가로 19시간 (밤새) 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 유도 전 및 유도 후 19시간 경과하였을 때 수집하였다.

하기와 같이 추출물을 제조하였다:

세포 펠릿을 샘플 완충제에 재현탁시키고 (이론상 O.D.=10에서), 비등시키고, 직접 SDS-PAGE 상에 로딩하였다.

SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석:

조 추출물 샘플을 10% 환원성 SDS-PAGE 상에서 전개시켰다.

p24-RT-Nef-p17 재조합 단백질을 쿠마시-블루 염색법 (도 10)에 의해 웨스턴 블롯 상에서 검출하였다.

쿠마시 염색: p24-RT-Nef-p17 단백질은 하기와 같이 나타났다:

±130 kDa에서 하나의 밴드로 나타남 (MW 계산치로 피팅됨)

MW 이론치: 128.967 달톤

MW 겉보기 수치: 130 kDa

웨스턴 블롯 분석:

시약 = - 토끼 폴리클로날 항RT (토끼 PO3L16)

희석율: 1/10,000

- 토끼 폴리클로날 항Nef-Tat (토끼 388)

희석율 1/10,000

- 알칼리성 포스파타제-컨쥬게이트 항-토끼 항체

희석율: 1/7,500

22℃에서 19시간 동안의 유도 후, 재조합 BLR(DE3) 세포는 총 단백질의 10-15% 범위의 매우 높은 수준으로 F4 융합체를 발현하였다.

고유 유전자로부터 F4를 비교한 결과, 코돈 최적화된 유전자로부터의 F4 재조합 생성물 프로파일은 약간 단순화되었다. 60 kDa에서의 F4 관련 주 밴드 뿐만 아니라, 그 아래의 부 밴드가 소실되었다 (도 10 참조).

2.2 F4co GMP 로트 제조

에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주 B1977의 냉동 시드 배양물을 사용하여 사전 배양물을 제조하였다. 상기 균주는 F4에 대해 코돈 최적화된 서열 (F4co)을 사용하는 pET28b 유도체로 형질전환된 BLR(DE3) 균주이다. 상기 시드의 배양 가능성은 대략 1 ml당 1E+10 콜로니 형성 단위인 것으로 측정되었다.

시드 배양물을 실온으로 해동시키고, 500 ㎕를 사용하여, (문헌 [Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987))] (이 문헌은 본원에 참고로 포함된다)로부터 적합화된) 50 ㎍/ml 카나마이신으로 보충된 400 ml의 사전배양 배지를 함유하는 2 ℓ 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 (배플 미포함)에 접종하였다.

이어서, 접종된 플라스크를 37℃ (± 1℃)에서 200 rpm (뉴 브런즈윅 사이언티픽(New Brunswick Scientific), 스트로크가 1인치인 이노바 4430(Innova 4430))으로 인큐베이션시켰다. 650 nm에서의 광학 밀도 (OD_{650 nm})가 2에 도달하였을 때 (이는 대략 5h 30분 동안 인큐베이션시킨 것에 상응함), 사전 배양을 중단하였다. 중단 즉시 사전 배양물을 사용하여 접종하였다.

대규모 발효조의 접종이 필요한 경우, 사전 배양물의 다중 배치를 조합할 수 있다.

2.3 F4co ( p24 - RT - Nef - p17 )-이. 콜라이 균주 B1977의 정제

2.3.1 요약

융합 구축물 F4co를 정제하기 위해, 2개의 크로마토그래피 단계, 및 최종 완충제 교환을 위한 정용여과 및 단백질 리폴딩을 포함하는 정제 공정을 사용할 수 있었다. 상기 방법은 하기의 주요 단계를 포함하였다:

· OD90에서의 세포 페이스트 균질화 및 8 M 우레아 첨가

· CM 하이퍼Z(CM hyperZ) 상에서의 양이온 교환 크로마토그래피 (양 모드)

· QAE 550C 상에서의 음이온 교환 크로마토그래피 (양 모드)

· 접선 유동 여과

· 멸균 여과

최종 발생 규모 1.5 ℓ의 균질물 OD 90에서 재현가능성이 있는 3개의 배치가 성공적으로 제조되었다. 3가지의 상이한 세포 배양물 수거물로부터 얻은 일관된 결과를 통해 정제 공정의 강건성이 입증되었다.

3개의 로트에서 1.3 내지 1.6 g의 F4co가 제조되었다. 생성물의 이질성으로 인해 전장의 생성물의 순도는 약 93-94% (쿠마시-블루 염색된 SDS-겔의 밀도 스캔)였다.

재현가능성이 있는 3개의 배치를 사용하여 수득된 결과는 하기에 제시한다.

2.3.2 분석 방법

로우리(Lowry) 검정을 사용하여 총 단백질 농도를 측정하였다.

SDS-PAGE를 위해, 환원성 및 비-환원성 SDS-PAGE 샘플 완충제 (+/- β-메르캅토에탄올) 중에서 샘플을 제조하고, 95℃에서 5 min 동안 가열하였다.

주조 뉴페이지(NuPage) 겔 또는 크라이테리온 XT(Criterion XT) 겔 (바이오-래드(Bio-Rad)) 중 어느 것 (두께 1 mm)을 사용하여 90 min 동안 150 V에서 4-12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 단백질을 분리하였다.

쿠마시-블루 R250을 이용하여 단백질을 시각화하였다.

항-F4 웨스턴 블롯을 위해, 4℃하에 70 V에서 2 h 동안 또는 30 V에서 밤새 단백질을 비염색 SDS-겔로부터 니트로셀룰로스 막 (바이오-래드) 상으로 옮겨 놓았다. 항-F4 항체를 사용하여 F4를 검출하였다. 알칼리성-포스파타제-컨쥬게이트된 항-토끼 항체 (프로메가(Promega))를 1차 항체에 결합시키고, 기질로서 BCIP 및 NBT를 사용하여 단백질 밴드를 시각화하였다.

항-이. 콜라이 웨스턴 블롯을 위해, SDS-PAGE에 의해 단백질을 분리하고, 상기와 같이 니트로셀룰로스 막 상으로 옮겨 놓았다. 폴리클로날 항-이. 콜라이 항체를 사용하여 잔류 숙주 세포 단백질을 검출하였다. 상기 기술된 바와 같이 알칼리성-포스파타제 반응을 사용하여 단백질 밴드를 시각화하였다.

멸균 조건하에 에펜도르프 컵(Eppendorf cup)에서 상이한 온도 (일반적으로 -20℃, 4℃, RT, 30℃) 하에서의 샘플의 안정성 시험을 수행하였다. 샘플을 지정된 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 분석하여 F4 분해를 검출하거나, 비-환원성 조건하에서 분석하여 응집물을 검출하였다.

분석용 SEC를 위해, 0.5 ml/min의 유속으로 10 mM 트리스 완충제 (pH 8.5)-0.4 M 아르기닌-10 mM 아황산나트륨-1 mM EDTA 중 분석용 슈퍼덱스(Superdex) 200 HR10/30 칼럼 (아머샴 바이오사이언스 (Amersham Biosciences)) 상에서 단백질을 분리하였다. 단백질 용리에 대해 280 nm에서 온라인으로 모니터링하였다.

바이오 휘터커(Bio Whittaker)로부터 입수한 키트를 사용하여 정제된 벌크 중의 내독소를 측정하기 위해 LAL 시험을 사용하였다. 이. 콜라이 055:B5 내독소를 표준으로서 사용하였다. 96-웰 분광광도계 (스펙트라맥스 250(Spectramax 250), 몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices))에서 37℃하의 반응 속도 곡선을 기록하고, 소프트맥스프로(SoftmaxPro)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

로슈(Roche)로부터 입수한 우레아/암모니아 시험용 키트를 사용하여 잔류 우레아를 측정하였다. 340 nm에서 분광광도계 (울트라스펙 II(Ultraspec II), 파마시아(Pharmacia))를 사용하여 NADH 흡광을 모니터링하였다.

2.3.3 정제 공정

균질물 OD90

50 mM 트리스 (pH 8.0), 10 mM DTT

↓

8 M 우레아 첨가 (pH 7.0으로 조정)

↓

(+) CM 하이퍼 Z 크로마토그래피 (스트림라인(Streamline) 100, 1 l)

PO4 완충제 (pH 7.0) - 8 M 우레아 - 2 mM DTT, 용리 전 130 mM NaCl, 용리 350 mM NaCl

↓

4 mS/cm로 5 x 희석 및 pH 9.0으로 조정

↓

(+) QAE 550C 크로마토그래피 (밴티지(Vantage) 60/55, 0.76 l)

트리스 완충제 (pH 9.0) - 8 M 우레아 - 2 mM DTT, 용리 전 70 mM NaCl, 용리 200 mM NaCl

↓

TFF 농축/ 정용여과 (오메가(Omega) 30 kDa, 0.1 ㎡)

10 부피 10 mM 트리스 완충제 (pH 8.5) - 0.4 M 아르기닌- 10 mM 아황산나트륨 - 1 mM EDTA

↓

멸균 여과 (밀리팩 20(Millipak 20))

2.3.4 재현가능성이 있는 로트의 결과

후처리 작업

전형적인 일례로서 로트 1의 정제 후처리 작업은 도 11에 제시되어 있다. 오직 F4co (+) 분획만을 상기 SDS-PAGE 및 상응하는 항-F4 웨스턴 블롯 상에서 분석하였다.

도 3A의 겔 상에서, 상기 단백질의 순도가 증가함에 따라 약 130 kDa에 위치하는 전장의 F4co 밴드가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 레인 2는 균질물 중 F4co의 비율을 나타낸다. F4co는 CM 용출액 중에서 회수되었고, 많은 HCP는 제거되었다 (레인 3). 최종의 생성물 순도는 이미 QAE 용출액 중에서의 제2 정제 단계 이후에 수득되었다 (레인 4). 한외여과 후, 잔류물 중 F4co에는 어떤 변화도 없었고 (레인 5), 레인 6은 정제된 생성물을 나타낸다. 생성물의 이질성으로 인해 SDS-겔 상에서 수개의 저분자량 밴드가 관찰되었다; 이러한 밴드는 또한 도 3B의 항-F4co 웨스턴 블롯 상에서도 검출되었다.

순도

생성물의 일관성을 확인하기 위해, 정제된 벌크 3개를 도 12A 및 12B에 제시된 CB-염색된 SDS-겔 및 항F4 웨스턴 블롯 상에서 비교하였다. 추가로, 웨스턴 블롯은 개개의 단백질에 대해 유도되는 항체 (도 13A-13D에서 항-p24, 항-RT, 항-Nef-Tat 및 항-p17-His)를 사용하여 달성되었다.

SEC 분석

분석용 슈퍼덱스 200 칼럼 상에서의 크기 배제 크로마토그래피 SEC 분석에 의해 정제된 벌크 3개를 추가로 비교하였다. 3개의 크로마토그램은 하기 도 14에서 비교하였다.

도 12A의 SDS-겔 상에서, 및 도 12B 및 13A-13D의 웨스턴 블롯 상에서 가시적이었던 F4co의 단백질 패턴의 유사성 뿐만 아니라, 도 14의 SEC 칼럼으로부터 거의 동일한 용리 프로파일은 로트 대 로트의 일관성이 매우 우수하다는 것을 가리킨다.

전장의 F4co 및 저분자량 분자 (LMW) 밴드가 겔 및 웨스턴 블롯 상의 유사 강도에서 출현하였다. 상기 겔 상의 가시적 LMW 밴드는 명확하게 생성물과 관련이 있는 것으로 나타났는데: 이는 항-F4 항체 및/또는 개개의 단백질에 대해 유도된 항체에 의해 인식되고, 하기 도 15의 항-이. 콜라이 웨스턴 블롯 상에서는 검출되지 않았다.

항-이. 콜라이 웨스턴 블롯은 각 정제된 벌크의 레인당 10 ㎍씩의 단백질을 사용하여 달성되었다. 가시적 밴드가 없다는 것은 추가로 생성물의 순도를 나타내는 것이며, SDS-겔 상의 가시적 밴드는 생성물과 관련이 있음을 나타낸다. 표준 (0.1-1 ㎍ 균질물)과 비교하였을 때, 3개의 정제된 벌크 모두에서 잔류 HCP 오염은 일관되게 1% 미만인 것으로 나타났다.

모두 종합해 보면, 이들 데이터들 모두는 생성물의 순수함, 불순물의 부재, 그러나 또한 F4co의 이질성을 입증한다. 중요한 것으로서, 상이한 발효 배치로부터 얻은 정제된 물질의 로트 대 로트의 일관성이 탁월하다는 것이 데이터를 통해 입증되었다.

회수율 및 수율

각 정제 단계 이후의 F4co 회수율은 CB-염색된 SDS-겔 및 총 단백질 회수율 (로우리 테스트로 측정된 단백질 농도)에 기초하여 추정되었다.

도 16은 일례로서 로트 3이 제조되는 동안 수집된 모든 분획을 나타내는 것이다. 겔 상에 침착된 샘플의 부피는 각각의 수집된 분획의 부피와 등가이고, 도 16의 레인 2의 균질물 부피와 직접적인 관련이 있었다. 따라서, 전장의 F4co 밴드의 밀도를 시각적으로 검사함으로써 회수율을 추정할 수 있었다.

SDS-겔은 레인 2의 균질물, 및 초기 F4co 함량을 나타낸다. CM 칼럼은 비-정화된 균질물으로부터의 모든 F4co를 포획하는 반면, 많은 양의 HCP는 pH 7.0에서 수지와 상호작용하지 못하지만, FT를 통해 제거되었다 (레인 3). 사전 용출액에 약간의 손실이 있는 것으로 관찰될 수 있고, 그 결과, 생성물은 단순화되고, HCP 제거는 개선되었다. 전장의 F4co는 350 mM NaCl을 사용한 CM 용출액에서 거의 정량적으로 회수되었다 (레인 5).

하기 단계에서는 F4co의 손실은 거의 없는 것으로 검출되었다. FT 및 QAE 칼럼의 사전 용출액에 추가의 HCP 및 LMW F4co-밴드 제거를 관찰할 수 있었다 (레인 7 및 8). QAE 용출액에서 높은 F4co 회수율 및 최종 생성물의 순도가 수득되었다 (레인 9).

한외여과 단계 이후 일부 생성물의 손실을 관찰할 수 있었다. 이러한 손실은 약 10-15%인 것으로 예측되었고, 이는 UF 막 상의 단백질 흡수에 의해 설명될 수 있는데, 그 이유는 어떤 상당량의 단백질도 여과물 중에서는 발견되지 않았기 때문이었다 (레인 11 및 12).

이러한 SDS-겔에 기초하여, 전체 F4co 회수율은 3가지 로트 모두에서 50%를 초과하는 것으로 나타났다.

3. 인간 대상체에서 F4의 면역원성

3.1 방법

본 실시예에서, HIV-1 백신 후보 물질은 활성 성분으로서 F4 재조합 단백질을 용량당 10, 30 또는 90 ㎍ 함유하였고, AS01_B로 아주반트가 첨가되거나, 또는 주사용수 (WFI)로 재구성되었다.

포스페이트 완충제 중의 수크로스 중 F4 항원, EDTA, 아르기닌, 폴리소르베이트 80 및 아황산나트륨을 함유하는 동결건조된 펠릿으로서 백신 항원을 제조하였다. AS01_B 리포솜-기반 아주반트 시스템은 50 ㎍의 MPL 및 50 ㎍의 QS21을 함유하였고, 상기 실시예 1에 따라 제조하였다.

둘 모두 3 ml 단일 용량의 유리 바이알로 제공되는, F4 항원을 함유하는 냉동 건조된 분획 및 AS01_B 아주반트 시스템 또는 WFI를 함유하는 액상 분획은 주사 직전에 백신을 투여받는 당사자가 재구성하였다. 바이알 내용물을 용해시킨 후, 근육내 투여용의 시린지 내로 0.5 ml의 재구성된 백신 용액을 취출하였다.

참가자는 이전에 또 다른 HIV-1 백신 연구에 참가한 적이 없거나, MPL을 받은 적이 없으며, HIV-1 감염의 위험이 낮은 18-40세의 건강한 성인 남성 및 여성이었다. 대상체는 1차 백신화 전 8주 이내에 혈청 스크리닝시 HBV 코어 항원 (HBc), C형 간염 바이러스 (HCV), HIV-1 및 HIV-2에 대한 항체에 대하여 음성의 혈청 반응을 보여야 하며, HBV 표면 항원 (HBs Ag) 및 HIV-1 p24 항원에 대하여 음성을 보여여 했다 (이들 모두는 애보트 AxSYM(Abbott AxSYM)가 테스트함). ClinicalTrials.gov registry에 상세하게 설명되어 있는 바와 같이, 본 연구에의 등록에 대해서는 표준 자격 조건을 사용하였다.

아주반트가 첨가된 군 및 아주반트가 첨가되지 않은 군 간의 비율이 5:1이 되도록 180명의 대상체를 무작위화하였다. 대상체 50명씩으로 이루어진 3개의 군은 AS01B 중 F4를 10, 30 또는 90 ㎍의 상승 용량으로 투여받았고, 대상체 10명씩으로 이루어진 3개의 군은 주사용수 (WFI) 중 F4를 상승 용량으로 투여받았다. 본 연구는 아주반트 첨가에 대해서는 관찰자가 모르는 맹검을 실시하였고, 항원 내용물에 대해서는 개방하였다. 각 대상체는 비-우성 상지의 삼각근 내로의 주사에 의해 0개월째에 제1 백신 용량을, 및 1개월째에는 제2의 것을 투여받았다. 백신 투여 전 (0일째), 제2 백신 용량 후 2주째 (44일째) 및 1개월째 (60일째), 및 안전성 및 면역 반응 평가를 위해 6개월째 (180일째) 및 12개월째 (360일째) 혈액 샘플을 수득하였다.

본 연구 참가자의 평균 (±SD) 연령은 22.3세 (±4.62) (연령 범위: 18-40세)였고, 63.3%가 여성이었으며, 집단은 우세하게 백인/백인종 (96.7%)이었다. 6개의 연구군들 간에는 기준 인구학적 특징에 있어서는 어떤 차이도 없는 것으로 관찰되었다. 모든 대상체는 2 용량의 연구 백신을 투여받았고, 180명의 대상체 중 176명이 본 연구를 완수하였다. 150명의 대상체 (83.3%)가 12개월 동안 프로토콜 면역원성 코호트에 포함되었다. 분석으로부터 배제시킨 이유에 대해서는 하기에 요약되어 있다.

3.2 안전성

각 백신 투여 후 7일 동안 다이어리 카드에 반응형의 국소 증상 (주사 부위 통증, 발적, 종창), 일반 증상 (발열, 피로감, 두통, 발한, 근육통) 및 위장관 증상 (구역, 구토, 설사, 복통)에 관하여 기록하였다. 증상의 중증도를 1 등급 내지 3 등급으로 등급을 분류하였는데, 여기서, 3 등급 증상은 발적 또는 종창의 직경이 50 mm 초과이거나, 또는 39.0℃ 초과로 발열 및 정상적인 일상 활동을 방해하는 임의의 다른 증상으로 정의되었다. 비반응형의 증상은 각 백신 투여 후 30일 동안 기록한 반면, 중증의 유해 사례 (SAE)는 연구 기간 내내 기록하였다.

백신화된 코호트 전체에서 반응생성력 및 안전성에 대해 분석하였다. 반응형 및/또는 비반응형 국소 및 일반 증상을 보고한 대상체의 수 및 백분율은 정확한 95% 신뢰 구간 (CI)을 이용하여 계산하였다. 안전성 데이터에 관한 공식적인 통계학적 비교는 수행하지 않았다.

각 백신 투여 후, 백신화 후 7일간의 기간 동안 F4/WFI 군과 비교하였을 때 F4/AS01_B 군에서 반응생성력이 현저히 더 높게 나타난 것으로 관찰되었다 (도 17). 백신화 후 7일간의 기간 동안 반응형 및 비반응형 증상의 총 발병률은 F4/WFI 군의 경우, 45.0-75.0%인 것과 비교하여 F4/AS01_B 군의 경우, 투여의 99.0-100.0%인 것으로 나타났다. 추가로, 제2 백신 투여 후 일반 증상의 발병률은 F4/AS01_B 군에서 더 높았다. F4/AS01_B 군에서 모든 투여의 대략 ⅓에서 3 등급 증상이 후속되었다. 대조적으로, F4/WFI 군에서는 백신화와 관련하여 어떤 반응형 및 비반응형의 3 등급 증상도 보고되지 않았다.

F4/AS01_B 군에서 항원 용량 수준 간에는 반응생성력에 있어 어떤 차이도 관찰되지 않았다. 주사 부위의 동통은 가장 일반적인 반응형의 국소 증상이었다. 이는 F4/WFI 군에서 10.0-30.0%의 투여 후에 발생한 것과 비교하여, F4/AS01_B 군에서는 96.0-98.0%의 투여 후에 발생하였다. 중증도가 3 등급인 주사 부위의 동통은 F4/AS01_B 군에서 ≤10.1%의 투여 후에 발생하였다. 발적 및 종창은 오직 F4/AS01_B 군에서만 보고되었고, 이는 각각 19.0-35.0% 및 20.0-25.0%의 투여 후에 발생하였다. 가장 보편적인 반응형의 일반 증상은 F4/AS01_B 및 F4/WFI 군에서 각각 피로감 (66-77%, 30-45%의 투여) 및 두통 (58-62%, 20-25%의 투여)이었다. 3 등급인 주어진 반응형의 일반 증상의 용량당 총 발병률은 F4/AS01_B 군에서 ≤12.1%였다.

백신화 후 30일의 기간 동안, F4/AS01_B 군 중 60.0-84.0%의 대상체와 비교하여 F4/WFI 군 중 50.0-70.0%의 대상체가 비반응형 증상을 보고하였다. 증상은 F4/AS01_B 군 중 30.0-44.0%의 대상체에서 백신화가 원인이 되어 그와 관련하여 나타나는 것으로 간주되었고 (가장 빈번하게 보이는 증상은 오한 및 주사 부위 반응), 극히 소수만이 그 중증도가 3 등급이었다. 대체로 증상은 일시적이었으며, 일반적으로는 2 내지 3일 이내에 후유증없이 해소되었다. 전체 연구 기간 동안에 F4/AS01_B 군에서는 6개의 SAE가 보고되었다. 이들 모두 백신화와는 관련이 없는 것으로 간주되었고, 후유증없이 해소되었다. 연구 기간 동안에는 어떤 사망도 발생하지 않았고, 유해 사례로 인해 연구로부터 퇴출되는 대상체도 없었다.

3.3 T 세포 반응

인터류킨 2 (IL-2), 인터페론 감마 (IFN-γ), 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 및 CD40-리간드 (CD40L)의 발현을 평가하기 위해 p17, p24, RT 및 Nef 펩티드 풀로 자극한 후, 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 CD4+ T 세포 반응을 평가하였다. 수행된 ICS는 혈액을 샘플링한 후 6시간 이내에 표준 피콜-이소파크(Ficoll-Isopaque) 밀도 구배 원심분리에 의해 전혈 세포로부터 단리되고, 추가 분석시까지 액체 질소 중에서 냉동보관된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용한, 앞서 기술된 방법을 적합화시킨 방법이었다 (문헌 [Maecker HT, Maino VC, Picker LJ (2000) Immunofluorescence analysis of T-cell responses in health and disease. J Clin Immunol 20: 391-399] 및 [Maecker HT, Dunn HS, Suni MA, Khatamzas E, Pitcher CJ, et al. (2001) Use of overlapping peptide mixtures as antigens for cytokine flow cytometry. J Immunol Methods 255: 27-40] (이들 문헌은 각각이 본원에 참고로 포함된다)).

간략하면, 항-CD28 및 항-CD49d 항체 (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences: 벨기에))의 존재하에, 클레이드 B p17, p24, RT 또는 Nef 매칭된 항원의 서열을 포괄하는, 11개의 아미노산이 중복되는 15량체 펩티드 풀 (유로젠텍(Eurogentec: 벨기에))을 사용하여 시험관내에서 해동된 PBMC를 자극시켰다. 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세포내 차단제인 브레펠딘 A(Brefeldin A) (BD 바이오사이언시즈: 벨기에)를 첨가하여 추가로 밤새 인큐베이션시키는 동안 시토카인이 분비되지 못하도록 하였다. 이어서, 세포를 수거하고, 표면 마커 CD4+ 및 CD8+ (BD 바이오사이언시즈)에 대해 염색한 후, 고정시켰다 (시토픽스/시토펌(Cytofix/Cytoperm) 키트, BD 바이오사이언시즈). 이어서, 고정된 세포를 투과시키고, IL-2, IFN-γ, TNF-α 및 CD40L에 대한 표지된 항체 (BD 바이오사이언시즈)로 염색하고, 세척하고, 포스페이트 완충 염수를 함유하는 소 태아 혈청에 재현탁시키고, FACSCanto 유동 세포측정기 및 FACSDiva 소프트웨어 (BD 바이오사이언시즈) 또는 FlowJo 소프트웨어 (트리 스타(Tree Star))를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.

백신으로 유도된 CD4+ T 세포의 클레이드 간의 반응성을 평가하기 위해, 0 및 44일째 수집된 PBMC를 ICS에 의해 클레이드 A, 및 C HIV-1 균주의 컨센서스 서열로부터의 펩티드 풀을 사용하여 CD40L의 발현 및 IL-2, IFN-γ 및 TNF-α 생산에 대해 분석하였다. p24 및 p17에 대해 사용된 클레이드 A 서열은 천연 단리물 TZA173 (탄자니아)으로부터 유래된 것이고, RT 및 Nef에 대해 사용된 클레이드 A 서열은 천연 단리물 KE MSA4070 (케냐)으로부터 유래된 것이었다. 모든 항원에 대한 클레이드 C 서열은 균주 ZM651로부터 유래된 것이었다. 이러한 시험적 조사를 상기 기술된 바와 같이 F4 10 ㎍/AS01_B 군으로부터의 대상체로부터 유래된 샘플에 대해 수행하였다.

p17, p24, RT 또는 Nef 항원에 의한 자극에 대한 반응으로 면역 마커 IL-2, IFN-γ, TNF-α 및/또는 CD40L을 발현하는, 각각의 총 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 빈도 (%)로서 ICS 결과를 나타내었다. 항원-특이 CD4+ 반응이 컷-오프 값보다 크거나, 그와 같다면, 대상체는 반응자인 것으로 간주되었다. 상이한 항원에 대한 이중 양성 항원-특이 CD4+ T 세포 중 모든 95번째 백분위수 중에서 (상위 100으로 반올림됨) 최대값에 기초하여 0.03% 이중 양성 항원-특이 CD4+ T 세포 (즉, IL-2, IFN-γ, TNF-α 및 CD40L로부터 적어도 2개의 마커를 발현하는 세포)의 컷-오프 값을 선택하였다.

프로토콜에 따른 면역원성 (ATP) 코호트에서 면역원성 분석을 수행하였다. 각각의 개별 항원에 의해, 및 적어도 1, 2, 3개의 항원 및 4개 항원 모두에 의한 시험관내 자극 후 IL-2 및 적어도 하나의 다른 마커를 발현하는 CD4+ T 세포의 빈도 및 반응자 백분율을 각 시점에 측정하였다. F4-특이 CD4+ T 세포 반응은 각각의 개별 항원에 대한 반응에서 특이 CD4+ T 세포 빈도의 총합으로서 정의하였다.

IL-2 및 적어도 하나의 다른 마커를 발현하는 CD4+ T 세포의 빈도에 대해 2원 ANOVA 통계 검정을 수행하여 제2 백신 투여 후 2주째 아주반트를 포함하거나 포함하지 않는 3가지 용량의 F4를 비교하였다. ANOVA 모델은 고정 효과로서 아주반트 (AS01_B 및 WFI) 및 용량 (10, 30 및 90 ㎍)을 포함하였다. 정규 분포 반응을 얻기 위해 CD4+ T 세포의 log10 빈도에 대해 분석을 수행하였다. 아주반트가 첨가된 군과 아주반트가 첨가되지 않은 군 사이에는 등분산성 기준이 이행되지 않았다.

항원 대부분 (p17 제외)에 의해 이루어지는 시험관 자극에 대한 용량과 아주반트 사이의 상호작용이 유의적이기 때문에 (p ≤0.05), 그리고, AS01_B와 WFI 사이의 차이가 뚜렷이 높게 나타나는 바, IL-2 및 적어도 하나의 다른 마커를 발현하는 CD4+ T 세포의 log10 빈도에 대해 1원 ANOVA를 수행하여 II 투여 후 2주째 (44일째) AS01_B를 포함하는 3가지 용량의 F4를 비교하였다. 1원 ANOVA 모델은 고정 효과로서 용량 (10, 30 및 90 ㎍)을 포함하였다. 3개의 AS01_B 군 사이에는 등분산성 기준이 이행되었다. F4 항원 및 그의 각 성분에 대한 CD4+ T 세포 반응에 관하여 ANOVA 분석을 수행하였다.

다중 비교 (터키-크래머(Tukey-Kramer) 조정)를 수행하고, 용량과 CD4+ T 세포 반응 사이의 관계 또한 평가하였다. 기하 평균 (GM) 비 및 그의 CI를 표로 작성하였다. F4 항원 및 그의 각 성분에 대한 CD4+ T 세포 반응에 관하여 분석하였다.

3.4 동종 항원에 대한 CD4 + T 세포 반응

아주반트가 첨가되지 않은 백신 군 모두에서, IL-2를 포함하는 적어도 2개의 면역 마커를 발현하는 항원-특이 CD4+ T 세포의 빈도는 대개의 경우 컷-오프 값 미만이거나, 그와 유사한 값이었다 (도 18 참조). 대조적으로, 모든 F4/AS01_B 군에서 반응자 비율은 매우 높은 것으로 관찰되었다 (도 19). 제2 백신 투여 후 2주째 (44일째) 10 ㎍ F4/AS01_B 군에서 반응자 비율이 최고인 것으로 관찰되었으며, 모든 백신화된 대상체는 적어도 3개의 항원에 대해 반응하였고, 4가지 항원 모두에 대해서는 80.4%가 반응하였다. 항원당 CD4+ T 세포 반응자 비율을 조사하였을 때 (도 20), F4/AS01_B 군에서의 반응이 매우 광범위하고, 이는 4가지 백신 항원 모두에 대해 유도되었지만, RT 항원을 사용한 자극 이후에 빈도가 높았다는 것이 명백해졌다.

360일째에 10 ㎍ F4/AS01_B 군 중 97.7%의 대상체가 여전히 2개의 항원에 대해 반응을 보였고, 84.1% 및 59.1%는 각각 3개 및 4개의 항원에 대해 여전히 반응을 하였는 바, 백신으로 유도된 CD4+ T 세포 반응은 장수명을 가졌다 (도 19). F4 융합 단백질에 대한 전반적인 반응은 F4 10 ㎍/AS01_B 군에서 더 크며 더 오래 지속되었다 (44일째 p<0.0001) (도 21). 상기 군에서, IL-2 및 적어도 하나의 다른 마커를 생산하는 F4-특이 CD4+ T 세포의 빈도의 기하 평균은 44일째 거의 1.2%의 최고점에 도달하였다.

10 ㎍ F4/AS01_B 군에서 그의 시토카인 공동-발현 프로파일을 통해 입증되는 바 (도 22), F4/AS01_B 백신은 다관능성 F4-특이 CD4+ T 세포를 유도하였다. 특이 CD4+ T 세포 대다수는 CD40L을 발현하였고, IL-2를 단독으로, 또는 TNF-α 및/또는 IFN-γ와 함께 생산하였다. F4-특이 CD4+ T 세포 중 대략 50%가 적어도 2개의 시토카인을 분비하였고, 이러한 시토카인 공동-발현 프로파일은 최대 12개월째까지 유지되었다 (도 23). 모든 개별 항원에 대해서는 유사한 프로파일이 관찰되었다 (도 24 & 25 참조).

3.5 CD8 + T 세포 반응

ICS 방법에 기초하여, 백신으로 유도된 CD8+ T 세포는 아직까지 검출되지 않았다.

3.6 이종 항원에 대한 CD4 + T 세포 반응 ( 클레이드 간 반응성)

44일째 10 ㎍ F4/AS01_B 군에서 백신으로 유도된 CD4+ T 세포 반응의 클레이드 B가 아닌 클레이드의 HIV-1 항원과의 교차-반응성을 평가하기 위해, 대조군으로서 포함시킨 클레이드 B 항원와 함께, 클레이드 A 및 C로부터의 항원으로 시험관내에서 자극시킨 후, 반응을 분석하였다. p17, p24, RT 및 Nef 펩티드 풀을 사용하여 수행된 ICS 및 유동 세포측정법 분석을 통해 클레이드 A 및 C의 4가지 항원 모두에 대한 광범위한 교차 반응성 CD4+ T 세포 반응이 밝혀졌다 (도 26). 흥미롭게도, 10 ㎍ F4co 용량을 투여받은 모든 지원자는 동종 클레이드 B로부터의 RT 및 p24에 대한 반응을 보이기 시작하였고, 또한 클레이드 A 및 C에 상응하는 항원 둘 모두에 대한 반응도 나타내었다 (도 27).

상이한 클레이드들 간의 상기 항원 중에 에피토프가 상대적으로 낮은 수준으로 보존되는 것과 비교하였을 때, 상기와 같이 높은 수준의 교차 반응성이 관찰되었다는 점은 놀라운 사실이다.

3.7 체액성 면역 반응

효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하여 혈청 중, p17, p24, RT, Nef 및 F4에 대한 이뮤노글로불린 G (IgG) 항체 반응의 존재 또는 부재에 대해 분석하였다. 각 시험 샘플의 상대적인 농도를 평가하기 위해 양성 대조군 및 캘리브레이터를, 및 특이성 확인을 위해 음성 대조군을 각 플레이트 상에서 전개시켰다. 베르사맥스(VersaMax) 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈(영국 버크셔)) 상에서 450 nm하에 플레이트를 판독하고, 소프트맥스 프로 3.1.1.(SoftMax Pro 3.1.1) 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 분석하였다. 혈청 반응 양성은 검정 컷-오프 값 (p17의 경우 ≥187 mEU/ml, p24의 경우 ≥119 mEU/ml, RT의 경우 ≥125 mEU/ml, Nef의 경우 ≥232 mEU/ml, 및 F4의 경우 ≥42 mEU/ml)보다 크거나, 그와 같은 항체 농도로서 정의하였다. 컷-오프 값은 대상체 모두에 대한 백신화 전 반응에 기초하여 선택하였다. Nef의 경우, 백신화 전 95% 백분위수에 기초하여, 및 F4co, p17, p24 및 RT의 경우, 백신화 전 99% 백분위수에 기초하여 선택이 이루어졌다.

각각의 개별 항원 및 융합 단백질에 대한 혈청 반응 양성 비율 및 항체 농도의 기하 평균 (GMC)은 95% CI를 이용하여 계산하였다. 혈청 반응 양성 비율의 경우, 이항 변수에 대한 정확 검정 방법을 사용하여 95% CI를 산정하였다. GMC에 대한 95% CI는 평균 log10-변환 항체 농도의 95% CI의 역로그를 취함으로써 산정하였다. 검정의 컷-오프 미만인 항체 농도는 GMC 산정을 위해 컷-오프의 절반인 임의의 값으로 주어졌다.

체액성 면역 반응은 AS01_B 군에서 F4 융합 단백질에 대한 강력한 항체 농도를 특징으로 하였다 (도 28). 아주반트가 첨가된 군 모두에서 F4에 대한 혈청 전환율은 100%인 것으로 관찰되었고, 모든 용량 수준에 대하여 유사한 IgG 역가가 최대 12개월째까지 지속되었다. 추가로, IgG 항체는 각각의 개별 F4 항원 성분에 대해 유도되었다. 아주반트가 첨가되지 않은 군에서는, 매우 낮은 반응이 유도되었다 (도 29 참조).

3.8 결론

본 결과는 F4/AS01_B-아주반트 첨가된 HIV-1 백신의 반응생성력 프로파일이 허용가능하며, 어떤 안전성에 관한 문제도 없다는 것을 나타낸다. 추가로, 면역원성 결과는 F4/AS01_B-아주반트 첨가된 HIV-1 백신 후보 물질이 장기 지속되는 높은 수치의 HIV-1-특이 다관능성 CD4+ T 세포를 유도하였다는 것을 시사한다. 아주반트 첨가된 백신 군에서 반응자 비율이 전반적으로 높다는 것이 특히 두드러졌으며, 백신 항원 모두에 대해 반응이 유도되었다. 흥미롭게도, 최소 용량의 항원 군 (10 ㎍ F4/AS01)에서 최고 반응자 비율이 관찰되었고, 참가자 100%가 3개의 HIV-1 항원에 대해 반응하였고, 80%가 4가지 HIV-1 항원 모두에 대해 반응하였다. 아주반트 첨가된 백신 군은 최대 12개월째까지 지속되는, 최고로 높은 F4-특이 CD4+ T 세포 빈도를 특징으로 하였다.

다중-시토카인-생산 항바이러스 CD4+ T 세포가 단일-시토카인-생산 세포에 비해 기능상 우수하다고 간주되는 바, 백신으로 유도된 CD4+ T 세포가 CD40L을 발현하였고, IL-2를 단독으로, 또는 TNF-α 및/또는 IFN-γ와 함께 생산하였다는 결과는 중요하고 유망한 관찰 결과이다.

추가로, 본 연구 결과는, 단지 클레이드 B 항원만으로 구성된 F4/AS01_B-아주반트 첨가된 HIV-1 백신이 클레이드 A 및 C로부터의 4가지 항원 모두에 대해서도 또한 광범위한 교차-반응성 CD4+ T 세포 반응을 유도할 수 있다는 것을 제시한다. 전세계적으로 HIV-1 바이러스의 다양성을 고려해 볼 때, HIV-1 백신 개발에 있어 광범위한 교차-반응성 및 장기간 지속되는 면역 반응의 유도가 중요한 고려 사항이 된다.

결론적으로, 본 연구 결과는 F4/AS01_B-아주반트 첨가된 HIV-1 백신 후보 물질의 안전성 및 면역원성을 입증한다. AS01 아주반트 첨가된 F4 단백질 10 ㎍을 함유하는 2 용량의 백신을 통해 강력한 다관능성, 광범위한 반응성, 및 지속성을 지닌 CD4+ T 세포 반응이 유도되었다. 이러한 면역 반응의 특성을 통해 상기 백신은 예방학적 환경에서 뿐만 아니라, 질환 조절용 치료 백신으로서도 유망한 AIDS 백신 후보 물질이 된다.

4. 상이한 클레이드로부터 유래된 F4co의 면역원성

본 실시예에서, 클레이드 B 및 C로부터 유래된 코돈 최적화된 F4에 의해 유도된 T 세포 반응을 클레이드 A, B 및 C로부터의 펩티드에 대한 교차-반응성에 대해 시험하였다.

4.1 방법

면역화를 위해 사용된 클레이드 B F4co 단백질을 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조하였고, 이는 같은 서열을 가졌다.

면역화를 위해 사용된 클레이드 C F4co는 하기 서열을 포함하는 컨센서스 클레이드 C 서열을 사용하여 제조하였다:

F4co 클레이드 C 컨센서스 항원의 아미노산 서열:

클레이드 C F4co를 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열:

각각의 면역화를 위해, AS01_B를 사용하여 F4co 단백질에 아주반트를 첨가하였다.

0, 14, 및 28일째에 3회에 걸쳐 근육내 경로를 통해 AS01_B 아주반트 시스템 중에서 제제화된 50 ㎕의 F4co 클레이드 B 또는 클레이드 C (3 또는 9 ㎍)로 6 내지 8주령된 암컷 CB6F1 (C57Bl/6 및 Balb/C 마우스의 하이브리드)을 면역화시켰다.

마우스를 4개의 군으로 배정하였다 (각 군당 동물 40마리씩):

1군: 9 ㎍ F4co 클레이드 B/AS01_B

2군: 3 ㎍ F4co 클레이드 B/AS01_B

3군: 9 ㎍ F4co 클레이드 C/AS01_B

4군: 3 ㎍ F4co 클레이드 C/AS01_B

2차 및 3차 면역화 후 7일째 (각각 7d pII 및 7d pIII)에 시험을 위해 혈액 샘플을 채취하였다. IFN-γ 및/또는 IL-2 및/또는 TNF-α를 분비하는 F4co-특이 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 빈도를 2차 및 3차 투여 후 7일째 측정하였다.

간략하면, 40마리 마우스/군으로부터 말초 혈액 림프구 (PBL)를 수집하고, 풀링하였다 (10마리 마우스/군으로부터 4개의 풀). 적혈구 세포 용해를 수행한 후, 세포를 웰당 100만 개의 세포로 둥근 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 이어서, 항-CD28 및 항-CD49d의 존재하에 37℃에서 6시간 동안, F4co 클레이드 B, 클레이드 C 또는 클레이드 A 서열을 포괄하는 중첩되는 15량체 펩티드 풀로 시험관내에서 세포를 재자극시켰다 (1 ㎍/ml/펩티드로). p24 및 p17에 대한 클레이드 A 펩티드의 서열은 천연 단리물 TZA173 (탄자니아)으로부터 유래된 것이고, RT 및 Nef에 대한 클레이드 A 펩티드의 서열은 천연 단리물 KE MSA4070 (케냐)으로부터 유래된 것이었다. (p24, p17, Nef 및 RT에 대한) 클레이드 C 펩티드의 서열은 ZM651 균주로부터 유래된 것이었다. 클레이드 B 펩티드는 F4co 클레이드 B 항원의 서열 (균주 BH10으로부터의 p24 및 p17, 균주 HXB2로부터의 RT 및 균주 Bru-Lai로부터의 Nef)을 포괄한다.

배지에 남아있는 세포 (펩티드 자극이 없음)를 배경 반응을 위한 음성 대조군으로서 사용하였다. 펩티드 풀과 함께 공동-배양한 후 2시간 경과하였을 때, (시토카인 분비를 억제하기 위해) 브레펠딘 A를 웰에 첨가하고, 세포를 4시간 동안 추가로 인큐베이션시키고, ℃에서 밤새 옮겨 놓았다. 이어서, 세포를 하기 마커, 즉 CD4, CD8, IL-2, IFN-γ 및 TNF-α에 대하여 염색하고, LSRII (BD 바이오사이언시즈, 미국) 및 FlowJo 소프트웨어 (트리 스타)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.

4.2 CD4 + T 세포 반응

마우스에서 클레이드 A, 클레이드 B 및 C 펩티드에 대한 HIV-특이 CD4⁺ T 세포 반응의 크기를 측정함으로써 F4co 클레이드 B 또는 F4co 클레이드 C 항원에 의해 유도된 특이 CD4+ T 세포 반응의 교차-반응성 능력을 평가하였다. 전반적으로, F4co-특이 CD4+ T 세포 반응은 F4co 클레이드 B 및 클레이드 C 항원 둘 모두에 의해 유도되었고, 이는 다양한 강도로 모든 클레이드 펩티드에 대해 관찰되었다. 클레이드 B 및 클레이드 C F4co 항원 둘 모두를 이용한 3차 투여 후 HIV-특이 CD4+ T 세포 빈도는 증가하였다.

F4co 클레이드 B 항원은 클레이드 B 펩티드에 대해 최고 수준의 CD4+ T 세포 반응을 유도하였는데, 이는 아마도 펩티드가 면역화에 사용된 F4co 클레이드 B 항원과 정확하게 동일한 서열을 가진다는 사실에 기인하는 것으로 보인다. F4co 클레이드 B에 의해 유도된 CD4+ T 세포 반응의 교차-반응성이 클레이드 A 및 클레이드 C 펩티드에 대해 관찰되었다. 클레이드 A 및 C 펩티드에 대한 특이 CD4⁺ T 세포 반응의 강도는 클레이드 B 펩티드에 대해 관찰된 강도의 약 절반 정도였다 (도 30-32 및 36).

F4co 클레이드 C 및 F4co 클레이드 B 항원 둘 모두에 의해 유도된 클레이드 C-특이 CD4+ T 세포 반응의 크기는 유사하였다 (도 32). 흥미롭게도, F4co 클레이드 C 항원에 의해 교차 반응성인 HIV-특이 CD4+ T 세포 반응이 유도되었으며, 클레이드 A 및 B 펩티드에 대한 CD4⁺ T 세포 반응의 강도는 클레이드 C 펩티드를 사용한 경우에 얻은 강도의 절반을 초과하였다 (도 30-32 및 36).

기대한 바와 같이, 면역화에 사용된 항원과는 상관없이, 반응 CD4+ T 세포의 백분율은 클레이드 A 펩티드에 대해 가장 낮았는데 (도 30 및 36), 이는 상기 펩티드가 F4co 단백질에 사용된 클레이드 B 및 클레이드 C 서열에 대해 가장 낮은 동일성(%)을 가지고 있기 때문이다 (도 8).

추가로, 2차 및 3차 면역화 후에 단리된 F4co-특이 CD4+ T 세포는 다관능성이며, 각 집단의 절반 초과가 IL2 뿐만 아니라, IFNγ 및/또는 TNFα를 발현하는 것으로 밝혀졌다(데이터 미제시).

4.3 CD8 + T 세포 반응

클레이드 B 및 클레이드 C 항원 둘 모두에 의해 유도된 F4co-특이 CD8+ T 세포 수준은 전반적으로 CD4+ T 세포 반응에 대해 관찰된 것보다 더 낮았지만, 동물 중 일부 풀에서는 여전히 검출가능하였다. CD4+ T 세포 데이터와 마찬가지로, 최고의 CD8+ T 세포 반응은 F4co 클레이드 B 항원에 의해 유도되었고, 이는 클레이드 B 펩티드에 대해 특이적이었다. 클레이드 C 및 클레이드 A 펩티드에 대한 교차-반응성은 매우 낮았다 (도 33-35 및 36). F4co 클레이드 C 항원은 클레이드 C에 대해 특이적인 매우 낮은 CD8+ T 세포 반응을 유도하였지만, 클레이드 B 및 클레이드 A 펩티드에 대한 교차-반응성은 비록 낮은 강도이기는 하였지만, 검출될 수 있었다.

반응자 CD8+ T 세포의 비율이 낮았기 때문에, 다관능성은 쉽게 분석할 수는 없었다.

4.4 결론

이러한 임상 전 연구로부터 얻은 클레이드 간 결과는 도 36에 요약되어 있다. 클레이드 A, B 및 C에 대한 강력한 교차-반응성 F4co-특이 CD4+ T 세포 반응이 F4co 클레이드 B 및 F4co 클레이드 C 항원 둘 모두에 의해 유도되었고, 그 반응은 다관능성이었다. F4co-특이 CD8+ T 세포의 빈도는 그만큼 강력하지는 않았지만, 클레이드 간 반응은 시험된 3개의 클레이드 모두에서 검출가능하였다.

SEQUENCE LISTING <110> GlaxoSmithKline Biologicals, s.a. Bourguignon, Patricia B. 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Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile Arg 1010 1015 1020 Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His Ile Val Trp 1025 1030 1035 1040 Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu 1045 1050 1055 Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu Gln Pro Ser Leu 1060 1065 1070 Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr 1075 1080 1085 Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp Thr Lys Glu Ala 1090 1095 1100 Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln 1105 1110 1115 1120 Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gln Val Ser Gln Asn Tyr 1125 1130 1135 <210> 9 <211> 3411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clade B F4co <400> 9 atggtcattg ttcagaacat acagggccaa atggtccacc aggcaattag tccgcgaact 60 cttaatgcat gggtgaaggt cgtggaggaa aaggcattct ccccggaggt cattccgatg 120 ttttctgcgc tatctgaggg cgcaacgccg caagacctta ataccatgct taacacggta 180 ggcgggcacc aagccgctat gcaaatgcta aaagagacta taaacgaaga ggccgccgaa 240 tgggatcgag tgcacccggt gcacgccggc ccaattgcac caggccagat gcgcgagccg 300 cgcgggtctg atattgcagg aactacgtct acccttcagg agcagattgg gtggatgact 360 aacaatccac caatcccggt cggagagatc tataagaggt ggatcatact gggactaaac 420 aagatagtcc gcatgtattc tccgacttct atactggata tacgccaagg cccaaaggag 480 ccgttcaggg actatgtcga ccgattctat aagacccttc gcgcagagca ggcatcccag 540 gaggtcaaaa attggatgac agaaactctt ttggtgcaga atgcgaatcc ggattgtaaa 600 acaattttaa aggctctagg accggccgca acgctagaag agatgatgac ggcttgtcag 660 ggagtcggtg gaccggggca taaagcccgc gtcttacaca tgggcccgat atctccgata 720 gaaacagttt cggtcaagct taaaccaggg atggatggtc caaaggtcaa gcagtggccg 780 ctaacggaag agaagattaa ggcgctcgta gagatttgta ctgaaatgga gaaggaaggc 840 aagataagca agatcgggcc agagaacccg tacaatacac cggtatttgc aataaagaaa 900 aaggattcaa caaaatggcg aaagcttgta gattttaggg aactaaacaa gcgaacccaa 960 gacttttggg aagtccaact agggatccca catccagccg gtctaaagaa gaagaaatcg 1020 gtcacagtcc tggatgtagg agacgcatat tttagtgtac cgcttgatga ggacttccga 1080 aagtatactg cgtttactat accgagcata aacaatgaaa cgccaggcat tcgctatcag 1140 tacaacgtgc tcccgcaggg ctggaagggg tctccggcga tatttcagag ctgtatgaca 1200 aaaatacttg aaccattccg aaagcagaat ccggatattg taatttacca atacatggac 1260 gatctctatg tgggctcgga tctagaaatt gggcagcatc gcactaagat tgaggaactg 1320 aggcaacatc tgcttcgatg gggcctcact actcccgaca agaagcacca gaaggagccg 1380 ccgttcctaa agatgggcta cgagcttcat ccggacaagt ggacagtaca gccgatagtg 1440 ctgcccgaaa aggattcttg gaccgtaaat gatattcaga aactagtcgg caagcttaac 1500 tgggcctctc agatttaccc aggcattaag gtccgacagc tttgcaagct actgagggga 1560 actaaggctc taacagaggt catcccatta acggaggaag cagagcttga gctggcagag 1620 aatcgcgaaa ttcttaagga gccggtgcac ggggtatact acgacccctc caaggacctt 1680 atagccgaga tccagaagca ggggcagggc caatggacgt accagatata tcaagaaccg 1740 tttaagaatc tgaagactgg gaagtacgcg cgcatgcgag gggctcatac taatgatgta 1800 aagcaactta cggaagcagt acaaaagatt actactgagt ctattgtgat atggggcaag 1860 accccaaagt tcaagctgcc catacagaag gaaacatggg aaacatggtg gactgaatat 1920 tggcaagcta cctggattcc agaatgggaa tttgtcaaca cgccgccact tgttaagctt 1980 tggtaccagc ttgaaaagga gccgatagta ggggcagaga ccttctatgt cgatggcgcc 2040 gcgaatcgcg aaacgaagct aggcaaggcg ggatacgtga ctaatagggg ccgccaaaag 2100 gtcgtaaccc ttacggatac caccaatcag aagactgaac tacaagcgat ttaccttgca 2160 cttcaggata gtggcctaga ggtcaacata gtcacggact ctcaatatgc gcttggcatt 2220 attcaagcgc agccagatca aagcgaaagc gagcttgtaa accaaataat agaacagctt 2280 ataaagaaag agaaggtata tctggcctgg gtccccgctc acaagggaat tggcggcaat 2340 gagcaagtgg acaagctagt cagcgctggg attcgcaagg ttcttgcgat ggggggtaag 2400 tggtctaagt ctagcgtagt cggctggccg acagtccgcg agcgcatgcg acgcgccgaa 2460 ccagccgcag atggcgtggg ggcagcgtct agggatctgg agaagcacgg ggctataact 2520 tccagtaaca cggcggcgac gaacgccgca tgcgcatggt tagaagccca agaagaggaa 2580 gaagtagggt ttccggtaac tccccaggtg ccgttaaggc cgatgaccta taaggcagcg 2640 gtggatcttt ctcacttcct taaggagaaa ggggggctgg agggcttaat tcacagccag 2700 aggcgacagg atattcttga tctgtggatt taccataccc aggggtactt tccggactgg 2760 cagaattaca ccccggggcc aggcgtgcgc tatcccctga ctttcgggtg gtgctacaaa 2820 ctagtcccag tggaacccga caaggtcgaa gaggctaata agggcgagaa cacttctctt 2880 cttcacccgg taagcctgca cgggatggat gacccagaac gagaggttct agaatggagg 2940 ttcgactctc gacttgcgtt ccatcacgta gcacgcgagc tgcatccaga atatttcaag 3000 aactgccgcc caatgggcgc cagggccagt gtacttagtg gcggagaact agatcgatgg 3060 gaaaagatac gcctacgccc ggggggcaag aagaagtaca agcttaagca cattgtgtgg 3120 gcctctcgcg aacttgagcg attcgcagtg aatccaggcc tgcttgagac gagtgaaggc 3180 tgtaggcaaa ttctggggca gctacagccg agcctacaga ctggcagcga ggagcttcgt 3240 agtctttata ataccgtcgc gactctctac tgcgttcatc aacgaattga aataaaggat 3300 actaaagagg cccttgataa aattgaggag gaacagaata agtcgaaaaa gaaggcccag 3360 caggccgccg ccgacaccgg gcacagcaac caggtgtccc aaaactacta a 3411 <210> 10 <211> 1140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10 clade C F4 <400> 10 Met Val Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile 1 5 10 15 Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys Ala 20 25 30 Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Thr Ala Leu Ser Glu Gly Ala 35 40 45 Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln 50 55 60 Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu 65 70 75 80 Trp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu 100 105 110 Gln Glu Gln Ile Ala Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly 115 120 125 Asp Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg 130 135 140 Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Lys Gln Gly Pro Lys Glu 145 150 155 160 Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Phe Lys Thr Leu Arg Ala Glu 165 170 175 Gln Ala Thr Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Asp Thr Leu Leu Val 180 185 190 Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Arg Ala Leu Gly Pro 195 200 205 Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly 210 215 220 Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu His Met Gly Pro Ile Ser Pro Ile 225 230 235 240 Glu Thr Val Pro Val Lys Leu Lys Pro Gly Met Asp Gly Pro Lys Val 245 250 255 Lys Gln Trp Pro Leu Thr Glu Glu Lys Ile Lys Ala Leu Thr Ala Ile 260 265 270 Cys Glu Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile Thr Lys Ile Gly Pro Glu 275 280 285 Asn Pro Tyr Asn Thr Pro Val Phe Ala Ile Lys Lys Lys Asp Ser Thr 290 295 300 Lys Trp Arg Lys Leu Val Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln 305 310 315 320 Asp Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly Ile Pro His Pro Ala Gly Leu Lys 325 330 335 Lys Lys Lys Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser 340 345 350 Val Pro Leu Asp Glu Gly Phe Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro 355 360 365 Ser Ile Asn Asn Glu Thr Pro Gly Ile Arg Tyr Gln Tyr Asn Val Leu 370 375 380 Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr 385 390 395 400 Lys Ile Leu Glu Pro Phe Arg Ala Gln Asn Pro Glu Ile Val Ile Tyr 405 410 415 Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val Gly Ser Asp Leu Glu Ile Gly Gln 420 425 430 His Arg Ala Lys Ile Glu Glu Leu Arg Glu His Leu Leu Lys Trp Gly 435 440 445 Phe Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro Pro Phe Leu Lys 450 455 460 Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys Trp Thr Val Gln Pro Ile Gln 465 470 475 480 Leu Pro Glu Lys Asp Ser Trp Thr Val Asn Asp Ile Gln Lys Leu Val 485 490 495 Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln Ile Tyr Pro Gly Ile Lys Val Arg 500 505 510 Gln Leu Cys Lys Leu Leu Arg Gly Ala Lys Ala Leu Thr Asp Ile Val 515 520 525 Pro Leu Thr Glu Glu Ala Glu Leu Glu Leu Ala Glu Asn Arg Glu Ile 530 535 540 Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys Asp Leu 545 550 555 560 Ile Ala Glu Ile Gln Lys Gln Gly His Asp Gln Trp Thr Tyr Gln Ile 565 570 575 Tyr Gln Glu Pro Phe Lys Asn Leu Lys Thr Gly Lys Tyr Ala Lys Met 580 585 590 Arg Thr Ala His Thr Asn Asp Val Lys Gln Leu Thr Glu Ala Val Gln 595 600 605 Lys Ile Ala Met Glu Ser Ile Val Ile Trp Gly Lys Thr Pro Lys Phe 610 615 620 Arg Leu Pro Ile Gln Lys Glu Thr Trp Glu Thr Trp Trp Thr Asp Tyr 625 630 635 640 Trp Gln Ala Thr Trp Ile Pro Glu Trp Glu Phe Val Asn Thr Pro Pro 645 650 655 Leu Val Lys Leu Trp Tyr Gln Leu Glu Lys Glu Pro Ile Ala Gly Ala 660 665 670 Glu Thr Phe Tyr Val Asp Gly Ala Ala Asn Arg Glu Thr Lys Ile Gly 675 680 685 Lys Ala Gly Tyr Val Thr Asp Arg Gly Arg Gln Lys Val Val Ser Leu 690 695 700 Thr Glu Thr Thr Asn Gln Lys Thr Glu Leu Gln Ala Ile Gln Leu Ala 705 710 715 720 Leu Gln Asp Ser Gly Ser Glu Val Asn Ile Val Thr Asp Ser Gln Tyr 725 730 735 Ala Leu Gly Ile Ile Gln Ala Gln Pro Asp Lys Ser Glu Ser Glu Leu 740 745 750 Val Asn Gln Ile Ile Glu Gln Leu Ile Lys Lys Glu Arg Val Tyr Leu 755 760 765 Ser Trp Val Pro Ala His Lys Gly Ile Gly Gly Asn Glu Gln Val Asp 770 775 780 Lys Leu Val Ser Ser Gly Ile Arg Lys Val Leu Ala Met Gly Gly Lys 785 790 795 800 Trp Ser Lys Ser Ser Ile Val Gly Trp Pro Ala Ile Arg Glu Arg Met 805 810 815 Arg Arg Thr Glu Pro Ala Ala Glu Gly Val Gly Ala Ala Ser Gln Asp 820 825 830 Leu Asp Lys His Gly Ala Leu Thr Ser Ser Asn Thr Ala Thr Asn Asn 835 840 845 Ala Asp Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Glu Val Gly 850 855 860 Phe Pro Val Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Ala 865 870 875 880 Ala Phe Asp Leu Ser Phe Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly 885 890 895 Leu Ile Tyr Ser Lys Lys Arg Gln Asp Ile Leu Asp Leu Trp Val Tyr 900 905 910 His Thr Gln Gly Phe Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro 915 920 925 Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys Leu Val Pro 930 935 940 Val Asp Pro Arg Glu Val Glu Glu Ala Asn Glu Gly Glu Asn Asn Cys 945 950 955 960 Leu Leu His Pro Met Ser Gln His Gly Met Glu Asp Glu Asp Arg Glu 965 970 975 Val Leu Lys Trp Lys Phe Asp Ser His Leu Ala Arg Arg His Met Ala 980 985 990 Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Tyr Lys Asp Cys Arg Pro Met Gly Ala 995 1000 1005 Arg Ala Ser Ile Leu Arg Gly Gly Lys Leu Asp Lys Trp Glu Lys Ile 1010 1015 1020 Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys His Tyr Met Leu Lys His Leu Val 1025 1030 1035 1040 Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro Gly Leu Leu 1045 1050 1055 Glu Thr Ser Glu Gly Cys Lys Gln Ile Ile Lys Gln Leu Gln Pro Ala 1060 1065 1070 Leu Gln Thr Gly Thr Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala 1075 1080 1085 Thr Leu Tyr Cys Val His Ala Lys Ile Glu Val Arg Asp Thr Lys Glu 1090 1095 1100 Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Gln Gln Lys Thr 1105 1110 1115 1120 Gln Gln Ala Lys Ala Ala Asp Gly Lys Val Ser Gln Asn Tyr His His 1125 1130 1135 His His His His 1140 <210> 11 <211> 3423 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11 clade C F4 <400> 11 atggttattg ttcagaatct gcagggtcag atggttcatc aggcaatttc tccgcgtacc 60 ctgaatgcat gggtgaaagt gattgaagaa aaagcctttt ctccggaagt tattccgatg 120 tttaccgcac tgagcgaagg tgcaacaccg caggatctga ataccatgct gaataccgtt 180 ggtggtcatc aggcagcaat gcagatgctg aaagatacca ttaatgaaga ggcagcagaa 240 tgggatcgtc tgcatccggt tcatgcaggt ccgattgcac cgggtcagat gcgtgaaccg 300 cgtggtagcg atattgcagg tacaaccagc accctgcaag agcagattgc atggatgacc 360 agcaatcctc cgattccggt tggtgatatt tataaacgct ggattattct gggcctgaat 420 aaaattgtgc gtatgtattc tccggttagc attctggata ttaaacaggg tccgaaagaa 480 ccgtttcgtg attatgtgga tcgctttttt aaaaccctgc gtgcagaaca ggcaacccaa 540 gaggttaaaa attggatgac cgataccctg ctggttcaga atgcaaatcc ggattgcaaa 600 accattctgc gtgcactggg tccgggtgca acactggaag aaatgatgac cgcatgtcag 660 ggtgttggtg gtccgggtca taaagcacgt gttctgcaca tgggtccgat tagcccgatt 720 gaaaccgttc cggtgaaact gaaaccgggt atggatggtc cgaaagttaa acagtggcct 780 ctgaccgaag aaaaaatcaa agccctgacc gcaatttgtg aagaaatgga aaaagaaggc 840 aaaattacca aaattggtcc ggaaaatccg tataacacac cggtgtttgc cattaaaaaa 900 aaagatagca ccaaatggcg taaactggtg gattttcgcg aactgaataa acgtacccag 960 gatttttggg aagttcagct gggtattccg catccggcag gtctgaaaaa aaaaaaatcc 1020 gtgaccgttc tggatgttgg tgatgcctat ttttctgttc cgctggatga aggttttcgt 1080 aaatataccg cctttaccat tccgagcatt aataatgaaa caccgggtat tcgctatcag 1140 tataatgttc tgccgcaggg ttggaaaggt tctccggcaa tttttcagag cagcatgacc 1200 aaaattctgg aaccgtttcg cgcacagaat ccggaaattg tgatttatca gtatatggat 1260 gatctgtatg ttggtagcga tctggaaatt ggtcagcatc gtgccaaaat tgaagaactg 1320 cgtgaacatc tgctgaaatg gggttttacc acaccggata aaaaacatca gaaagaaccg 1380 ccgtttctga aaatgggtta tgaactgcat ccggataaat ggaccgttca gccgattcag 1440 ctgccggaaa aagatagctg gaccgtgaat gatattcaga aactggtggg caaactgaat 1500 tgggcaagcc agatttatcc gggtattaaa gttcgtcagc tgtgtaaact gctgcgtggt 1560 gcaaaagcac tgaccgatat tgttccgctg acagaagaag cagaactgga actggccgaa 1620 aatcgtgaaa ttctgaaaga accggtgcat ggtgtttatt atgatccgag caaagatctg 1680 attgccgaaa ttcagaaaca gggtcatgat cagtggacct atcagattta tcaggaaccg 1740 tttaaaaatc tgaaaaccgg caaatatgca aaaatgcgta ccgcacatac caatgatgtt 1800 aaacagctga ccgaagccgt tcagaaaatt gccatggaaa gcattgtgat ttggggtaaa 1860 acaccgaaat ttcgtctgcc gattcagaaa gaaacctggg aaacatggtg gaccgattat 1920 tggcaggcaa cctggattcc ggaatgggaa tttgttaata caccgccgct ggttaaactg 1980 tggtatcagc tggaaaaaga accgattgca ggtgcagaaa ccttttatgt tgatggtgca 2040 gcaaatcgcg aaaccaaaat tggcaaagcc ggttatgtta ccgatcgtgg tcgtcagaaa 2100 gttgttagcc tgaccgaaac caccaatcag aaaaccgaac tgcaggcaat tcagctggcc 2160 ctgcaggata gcggtagcga agttaatatt gtgaccgata gccagtatgc actgggtatt 2220 attcaggcac agccggataa aagcgaaagc gaactggtga atcagattat tgaacagctg 2280 attaaaaaag aacgcgtgta tctgagctgg gttccggcac ataaaggtat tggtggcaat 2340 gaacaggttg ataaactggt tagcagcggt attcgtaaag ttctggccat gggtggtaaa 2400 tggtctaaaa gcagcattgt tggttggccg gcaattcgtg aacgtatgcg tcgtaccgaa 2460 ccggcagcag aaggtgttgg cgcagcaagc caggatctgg ataaacatgg tgcactgacc 2520 agcagcaata ccgcaaccaa taatgcagat tgtgcatggc tggaagcaca ggaagaagaa 2580 gaagaagttg gttttccggt tcgtccgcag gttccgctgc gtccgatgac ctataaagca 2640 gcatttgatc tgagcttttt tctgaaagaa aaaggtggtc tggaaggtct gatttatagc 2700 aaaaaacgcc aggatattct ggatctgtgg gtttatcata cccagggttt ttttccggat 2760 tggcagaatt acacaccggg tccgggtgtg cgttatccgc tgacctttgg ttggtgttat 2820 aaactggttc cggttgatcc gcgtgaagtt gaagaagcaa acgaaggcga aaataattgt 2880 ctgctgcatc cgatgagcca gcatggtatg gaagatgaag atcgcgaagt gctgaaatgg 2940 aaatttgata gccatctggc tcgtcgtcac atggcacgcg aactgcatcc ggaatattat 3000 aaagattgcc gtccgatggg tgcacgtgca agcattctgc gtggtggtaa actggataaa 3060 tgggaaaaaa ttcgtctgcg tccgggtggt aaaaaacatt atatgctgaa acatctggtt 3120 tgggcaagcc gtgaactgga acgttttgca ctgaatccgg gtctgctgga aaccagcgaa 3180 ggttgcaaac aaattattaa acagctgcag ccggcactgc agaccggcac cgaagaactg 3240 cgcagcctgt ataataccgt tgcaaccctg tattgtgtgc atgcgaaaat tgaagtgcgc 3300 gataccaaag aagcactgga taaaattgaa gaagaacaga ataaaagcca gcagaaaacc 3360 cagcaggcaa aagcagcaga tggtaaagtg agccagaatt atcaccacca ccaccaccac 3420 taa 3423

Claims (127)

1. a. Nef, Pol 및/또는 Gag로부터 선택된 하나 이상의 항원을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드이며;
   여기서, 상기 하나 이상의 항원이 하나 이상의 클레이드(clade)로부터의 하나 이상의 HIV-1 균주로부터 선택된 것인 하나 이상의 폴리펩티드; 및
   b. Th1 면역 반응의 차별적 유도제인 아주반트
   를 포함하는 면역원성 조성물이며, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 의한 질환 또는 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
2. 제1항에 있어서, Nef를 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
3. 제2항에 있어서, Nef가 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, 또는 HIV-1의 순환 재조합 형태 (CRF)의 HIV-1 균주로부터의 것인 면역원성 조성물.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, Nef가 클레이드 B의 HIV-1 균주로부터의 것인 면역원성 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Pol을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
6. 제5항에 있어서, Pol이 RT 단편인 면역원성 조성물.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, Pol이 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, 또는 HIV-1의 순환 재조합 형태 (CRF)의 HIV-1 균주로부터의 것인 면역원성 조성물.
8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Pol이 클레이드 B의 HIV-1 균주로부터의 것인 면역원성 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Gag를 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
10. 제9항에 있어서, Gag가 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, 또는 HIV-1의 순환 재조합 형태 (CRF)의 HIV-1 균주로부터의 것인 면역원성 조성물.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, Gag가 클레이드 B의 HIV-1 균주로부터의 것인 면역원성 조성물.
12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, Gag가 p17인 면역원성 조성물.
13. 제12항에 있어서, p17이 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, 또는 HIV-1의 순환 재조합 형태 (CRF)의 HIV-1 균주로부터의 것인 면역원성 조성물.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, p17이 클레이드 B의 HIV-1 균주로부터의 것인 면역원성 조성물.
15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, Gag가 p24인 면역원성 조성물.
16. 제15항에 있어서, p24가 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, 또는 HIV-1의 순환 재조합 형태 (CRF)의 HIV-1 균주로부터의 것인 면역원성 조성물.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, p24가 클레이드 B의 HIV-1 균주로부터의 것인 면역원성 조성물.
18. 제9항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, Gag가 p17 및 p24 둘 모두를 별개의 단백질 항원 성분으로서 또는 함께 융합된 형태로서 포함하는 것인 면역원성 조성물.
19. 제18항에 있어서, p17 및 p24가 함께 융합되어 있고, 이종 아미노산 서열에 의해 분리되어 있는 것인 면역원성 조성물.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 부분의 2가지 이상의 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 면역학적으로 활성인 사포닌 분획 및/또는 리포폴리사카라이드 및/또는 면역자극성 올리고뉴클레오티드로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 면역학적으로 활성인 사포닌 분획 및 리포폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
23. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 면역학적으로 활성인 사포닌 분획이 QS21인 면역원성 조성물.
24. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포폴리사카라이드가 지질 A 유도체인 면역원성 조성물.
25. 제23항에 있어서, 상기 지질 A 유도체가 3D-MPL인 면역원성 조성물.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 스테롤을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
27. 제25항에 있어서, 상기 스테롤이 콜레스테롤인 면역원성 조성물.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 리포솜 담체를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 1:1 내지 1:100 (w/w)의 사포닌:스테롤의 비로 사포닌 및 스테롤을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
30. 제28항에 있어서, 사포닌:스테롤의 비가 1:1 내지 1:10 (w/w)인 면역원성 조성물.
31. 제28항 또는 제29항에 있어서, 사포닌:스테롤의 비가 1:1 내지 1:5 (w/w)인 면역원성 조성물.
32. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 1:1의 사포닌:리포폴리사카라이드의 비로 사포닌 및 리포폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 리포폴리사카라이드를 포함하고, 상기 리포폴리사카라이드는 용량당 1-60 ㎍의 양으로 존재하는 것인 면역원성 조성물.
34. 제33항에 있어서, 상기 리포폴리사카라이드가 용량당 50 ㎍의 양으로 존재하는 것인 면역원성 조성물.
35. 제33항에 있어서, 상기 리포폴리사카라이드가 용량당 25 ㎍의 양으로 존재하는 것인 면역원성 조성물.
36. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 사포닌을 포함하고, 상기 사포닌이 용량당 1-60 ㎍의 양으로 존재하는 것인 면역원성 조성물.
37. 제36항에 있어서, 상기 사포닌이 용량당 50 ㎍의 양으로 존재하는 것인 면역원성 조성물.
38. 제36항에 있어서, 상기 사포닌이 용량당 25 ㎍의 양으로 존재하는 것인 면역원성 조성물.
39. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 (0.5 mL의 용량당) 0.025-2.5, 0.05-1.5, 0.075-0.75, 0.1-0.3, 또는 0.125-0.25 mg (예를 들어, 0.2-0.3, 0.1-0.15, 0.25 또는 0.125 mg)의 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤)을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
40. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 (0.5 mL의 용량당) 5-60, 10-50, 또는 20-30 ㎍ (예를 들어, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎍)의 지질 A 유도체 (예를 들어, 3D-MPL)를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
41. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 (0.5 mL의 용량당) 5-60, 10-50, 또는 20-30 ㎍ (예를 들어, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎍)의 사포닌 (예를 들어, QS21)을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
42. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 수중유 에멀젼을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
43. 제42항에 있어서, 수중유 에멀젼이 스쿠알렌 및/또는 알파 토코페롤을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
44. 제41항 또는 제42항에 있어서, 수중유 에멀젼이 대사가능한 수중유 에멀젼인 면역원성 조성물.
45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 수중유 에멀젼이 유화제, 예를 들어, 트윈 80을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 사포닌 및 리포폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
47. 제46항에 있어서, 아주반트가 1:10 내지 10:1 (w/w) 범위의 사포닌:리포폴리사카라이드의 비로 사포닌 및 리포폴리사카라이드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
48. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 사포닌 및 스테롤을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
49. 제48항에 있어서, 아주반트가 1:1 내지 1:20 (w/w) 범위의 사포닌:스테롤의 비로 사포닌 및 스테롤을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
50. 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 사포닌 및 대사가능한 오일을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
51. 제50항에 있어서, 아주반트가 1:1 내지 250:1 (w/w) 범위의 대사가능한 오일:사포닌의 비로 사포닌 및 대사가능한 오일을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
52. 제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 알파 토코페롤을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
53. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 (0.5 mL의 용량당) 0.5-15, 1-13, 2-11, 4-8, 또는 5-6 mg (예를 들어, 2-3, 5-6, 또는 10-11 mg)의 대사가능한 오일 (예를 들어, 스쿠알렌)을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
54. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 (0.5 mL의 용량당) 0.1-10, 0.3-8, 0.6-6, 0.9-5, 1-4, 또는 2-3 mg (예를 들어, 0.9-1.1, 2-3 또는 4-5 mg)의 유화제 (예를 들어, 트윈 80)를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
55. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 (0.5 mL의 용량당) 0.5-20, 1-15, 2-12, 4-10, 5-7 mg (예를 들어, 11-13, 5-6, 또는 2-3 mg)의 토콜 (예를 들어, 알파 토코페롤)을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
56. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 (0.5 mL의 용량당) 5-60, 10-50, 또는 20-30 ㎍ (예를 들어, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎍)의 지질 A 유도체 (예를 들어, 3D-MPL)를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
57. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 (0.5 mL의 용량당) 0.025-2.5, 0.05-1.5, 0.075-0.75, 0.1-0.3, 또는 0.125-0.25 mg (예를 들어, 0.2-0.3, 0.1-0.15, 0.25 또는 0.125 mg)의 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤)을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
58. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 (0.5 mL의 용량당) 5-60, 10-50, 또는 20-30 ㎍ (예를 들어, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎍)의 사포닌 (예를 들어, QS21)을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
59. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 금속 염 및 지질 A 유도체를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
60. 제59항에 있어서, 아주반트가 (0.5 mL의 용량당) 100-750, 200-500, 또는 300-400 ㎍의 Al, 예를 들어, 인산알루미늄을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 아주반트가 (0.5 mL의 용량당) 5-60, 10-50, 또는 20-30 ㎍ (예를 들어, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎍)의 지질 A 유도체 (예를 들어, 3D-MPL)를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트가 CpG 모티프를 포함하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중에 존재하는 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 의한 질환 또는 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
64. 제63항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드가 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, 또는 HIV-1의 순환 재조합 형태 (CRF)로부터 선택된 것인 면역원성 조성물.
65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 HIV-1 클레이드가 클레이드 B인 면역원성 조성물.
66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드가 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, 또는 HIV-1의 순환 재조합 형태 (CRF)로부터 선택된 것인 면역원성 조성물.
67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드가 클레이드 A 또는 C로부터 선택된 것인 면역원성 조성물.
68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 하나 이상의 클레이드가 클레이드 A 및 C로부터 선택된 것인 면역원성 조성물.
69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대한 체액성 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
70. 제69항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대한 체액성 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에게 장기간 무진행자 지위를 부여하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
72. 제71항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에게 장기간 무진행자 지위를 부여하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대한 다중-시토카인-생산 항바이러스 CD4+ T 세포를 유도하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
74. 제73항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대한 다중-시토카인-생산 항바이러스 CD4+ T 세포를 유도하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
75. 제73항 또는 제74항에 있어서, CD4+ T 세포가 IL2, IFNγ 및 TNFα 중 2개 이상을 생산하는 것인 면역원성 조성물.
76. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+ T 세포가 IL2 및 IFNγ을 생산하는 것인 면역원성 조성물.
77. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+ T 세포가 IL2 및 TNFα를 생산하는 것인 면역원성 조성물.
78. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+ T 세포가 IFNγ 및 TNFα를 생산하는 것인 면역원성 조성물.
79. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+ T 세포가 IL2, IFNγ 및 TNFα를 생산하는 것인 면역원성 조성물.
80. 제73항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+ T 세포가 CD40L을 발현하는 것인 면역원성 조성물.
81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에서의 진행성 CD4+ T 세포 감소를 방지하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
82. 제81항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에서의 진행성 CD4+ T 세포 감소를 방지하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에서 바이러스 저장소를 감소 또는 제거하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
84. 제83항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에서 바이러스 저장소를 감소 또는 제거하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
85. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에서 장기 지속되는 높은 수치의 HIV-1-특이 다관능성 CD4+ T 세포를 유도하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
86. 제85항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에서 장기 지속되는 높은 수치의 HIV-1-특이 다관능성 CD4+ T 세포를 유도하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에서 바이러스혈증을 통제하거나 감소시키는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
88. 제87항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주로 감염된 개체에서 바이러스혈증을 통제하거나 감소시키는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 2, 3, 4개, 또는 그 이상의 항원이 융합되어 융합 단백질을 형성하는 것인 면역원성 조성물.
90. 제89항에 있어서, 융합 단백질이 Pol에 융합된 Gag, 또는 Gag에 융합된 Pol을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
91. 제89항 또는 제90항에 있어서, 융합 단백질이 Nef에 융합된 Pol, 또는 Pol에 융합된 Nef를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
92. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 Gag에 융합된 Nef, 또는 Nef에 융합된 Gag를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
93. 제90항 또는 제92항에 있어서, Gag가 p17 및/또는 p24인 면역원성 조성물.
94. 제90항 또는 제91항에 있어서, Pol이 RT인 면역원성 조성물.
95. 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 융합되어 임의 순서로 Nef, RT, p17 및 p24를 포함하는 융합 단백질을 형성한 것인 면역원성 조성물.
96. 제1항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 융합되어 p24-RT-Nef-p17을 포함하는 융합 단백질을 형성한 것인 면역원성 조성물.
97. 제89항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질 중의 항원이 2, 3, 또는 4개의 상이한 HIV-1 클레이드로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 것인 면역원성 조성물.
98. 제89항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질 중의 모든 항원이 한 HIV-1 균주로부터, 또는 동일 HIV-1 클레이드로부터의 균주들부터 유래된 것인 면역원성 조성물.
99. 제89항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 항원을 포함하는 하나 이상의 비융합 폴리펩티드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
100. 제99항에 있어서, 비융합 폴리펩티드 중의 항원이 융합 단백질 중의 항원 중 적어도 하나와 동일한 클레이드로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 것인 면역원성 조성물.
101. 제99항에 있어서, 비융합 폴리펩티드 중의 항원이 융합 단백질 중의 하나 이상의 클레이드와 상이한 HIV-1 균주로부터 유래된 것인 면역원성 조성물.
102. 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 비융합 폴리펩티드가 Env를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
103. 제99항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 비융합 폴리펩티드가 gp120, gp140 또는 gp160 중 하나 이상을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
104. 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 항원 중 하나가 클레이드 B로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 것인 면역원성 조성물.
105. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중에 2개의 항원이 존재할 경우, 2개 항원 모두 클레이드 B로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 것인 면역원성 조성물.
106. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중에 3개의 항원이 존재할 경우, 3개 항원 모두 클레이드 B로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 것인 면역원성 조성물.
107. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중에 4개의 항원이 존재할 경우, 4개 항원 모두 클레이드 B로부터의 HIV-1 균주로부터 유래된 것인 면역원성 조성물.
108. 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 용량의 면역원성 조성물 중 각 항원의 총량이 0.5-25 ㎍, 2-20 ㎍, 5-15 ㎍, 또는 약 10 ㎍인 면역원성 조성물.
109. 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 용량의 면역원성 조성물 중 융합 단백질의 총량이 10 ㎍인 면역원성 조성물.
110. 제99항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 용량의 면역원성 조성물 중 비융합 폴리펩티드의 총량이 20 ㎍인 면역원성 조성물.
111. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 용량의 면역원성 조성물 중 모든 항원의 총량이 0.5-50 ㎍, 2-40 ㎍, 5-30 ㎍, 7-20 ㎍ 또는 약 30 ㎍, 약 20 ㎍ 또는 약 10 ㎍인 면역원성 조성물.
112. 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대한 항바이러스 면역 반응의 장기간 기억을 유도시키는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
113. 제112항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 대한 항바이러스 면역 반응의 장기간 기억을 유도시키는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
114. 제1항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 지속성 항바이러스 CD4+ T 세포를 유도하는 데 사용하기 위한 면역원성 조성물.
115. 제114항에 있어서, CD4+ T 세포가 적어도 6개월 동안 지속되는 것인 면역원성 조성물.
116. 제114항 또는 제115항에 있어서, CD4+ T 세포가 6 내지 24개월, 또는 9-18개월, 예를 들어, 12개월 동안 지속되는 것인 면역원성 조성물.
117. 제1항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 의한 질환 또는 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이며, 여기서, 조성물이 초기에는 2회 또는 3회 투여로서 대상체에게 투여되고, 여기서, 투여는 2주 내지 3개월, 바람직하게는 1개월의 기간을 두고 분리되어 있는 것인 면역원성 조성물.
118. 제1항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 의한 질환 또는 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이며, 여기서, 조성물이 대상체에게 (예를 들어, 부스터로서) 매 6-24개월, 또는 9-18개월마다, 예를 들어, 1년 단위로 투여되는 것인 면역원성 조성물.
119. 제1항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 의한 질환 또는 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이며, 대상체에게 (예를 들어, 부스터로서) 6개월 또는 1년의 간격을 두고 투여되는 면역원성 조성물.
120. 제118항 또는 제119항에 있어서, 상기 대상체에 대한 조성물의 후속적 투여가 동일 대상체에 대한 이전의 조성물 투여의 면역 반응을 부스팅시키는 것인 면역원성 조성물.
121. 제1항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 중의 하나 이상의 HIV-1 클레이드와는 상이한 상기 하나 이상의 클레이드로부터의 HIV-1 균주에 의한 질환 또는 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 것이며, 프라임-부스트(prime-boost) 요법의 일부로서 사용되는 면역원성 조성물.
122. 제121항에 있어서, 프라이밍 용량인 면역원성 조성물.
123. 제121항에 있어서, 부스팅 용량인 면역원성 조성물.
124. 제121항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 2회 이상의 프라이밍 및/또는 부스팅 용량이 투여되는 것인 면역원성 조성물.
125. 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 조성물인 면역원성 조성물.
126. 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항에 따른 HIV-1 균주에 의한 질환 또는 감염의 치료 또는 예방용 의약의 제조에서 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 제125항의 백신의 용도.
127. 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 제125항의 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항에 따른 HIV-1 질환 또는 감염을 치료 또는 예방하는 방법.

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