PT99063B - Processo para a producao de uma glicoproteina e de vacinas que a contem - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a um processo para a produção de formas novas, substancialmente não cliváveis de uma gicoproteína de peso molecular 160 KD (gp 160), e formulações de vacina contendo gp 160 ou um seu derivado, tendo como adjuvante monofosforil-lípido A 3-desacilado (3D MPL). As composições são úteis para o tratamento imunoterapêutico e imunoprofilático das infecções por HIV.

Mais concrectamente o presente invento diz essencialmente respeito a um processo para a produção de uma proteína de HIV gpl60 modificada em que amino-ãcidos diferentes da lisina ou arginina são proporcionados nas posições 502 e 510 independentemente, processo esse que consiste na expressão de uma sequência ADN que codifica a referida proteína num hospedeiro eucariótico recombinante.

Este invento relaciona-se com novas vacinas e novas formulações farmacêuticas e com a sua produção e utilização no tratamento da SIDA. Em particular o invento relaciona-se com a utilização de gpl6O ou de seus derivados, incluindo novas formas de gp 160 numa vacina, tendo como adjuvante monofosforil-lípido A 3-desacilado.

Os retrovírus, isto é, os vírus da famílida dos Retroviridae, constituem uma grande família de vírus revestidos, icosaédricos com cerca de 150 nm tendo um núcleocapsido enrolado no interior da estrutura do núcleo e tendo ARN como material genético. A família compreende os oncovírus tais como os vírus do sarcoma e da leucemia, certos vírus da imunodeficiância e os lentivírus.

O vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) é o agente etiológico do sindroma da imunodeficiência adquirida, também conhecido como SIDA. Esre retrovírus tem uma organização genética complexa, incluindo as repetições terminais longas (LTRs), os genes gag, pol e env, e outros genes. Este retrovírus transporta um certo número de antigénios que são potenciais candidatos quer isoladamente que em concertação como agentes de vacina capazes de induzirem uma resposta imunitária protectora.

A proteína de envõlucro do HIV-1 é sintetizada como um precursor da poliproteina que é subsequentemente glicosilado no interior das células infectadas para dar origem a uma glicoproteina com um peso molecular de 160 kDa (gp 160), que é processada por proteolise numa glicoproteína externa gp 120 e proteína transmembranar gp 41.

Uma região que codifica ADN para HIV proviral pode ser preparada a partir de qualquer um dos clones genómicos do vírus da imunodeficiência referidos na bibliografia. Ver, por exemplo, Shaw et al.,Science 226:1165 (1984); Kramer et al., Science 231:1580 (1986). Alternativamente, um clone genómico do vírus da imunodeficiência pode ser preparado a partir de vírus isolados a partir de espécimes clínicos por meio de técnicas de clonagem de ADN padronizadas. Ver, por exemplo, Gallo et al. , Patente dos E.U.A. No. 4.520-113; Montagnier et al., Patente dos E.U.A. No. 4.708.818.

A sequência de ADN próviral de HIV-BH10-2 é descrita por Ratner et al., Human Retroviruses and AIDS 1989, HIV Sequence Database ed. Gerald Meyers,Los Alamos National Laboratory. A sequência tem comprimento 8932 bp, estando o gene env localizado em 5580-8150 e os seus sítios de clivagem em 7088 e 7112 correspondendo aos amino ácidos 503 e 511 (clivagem após estes resíduos) (numeração de acordo com os dados de base de Los Alamos).

De acordo com o presente invento, proporciona-se HIV gp 160 que foi modificado a fim de proporcionar amino ácidos diferentes da lisina ou arginina nas posições 502 e 510 independentemente .

Substituições apropriadas para a lisina são as que se assemelham à lisina em hidrofilicidade e tamanho, tais como histidina, treonina, serina, asparagina, ácido aspártico, glutamina e ácido glutâmico. Destes, o amino ácido preferido é o ácido glutâmico. A proteína preferida é tanto não clivável devido às mutações introduzidas como também capaz de produzir anticorpo de neutralização cruzada, que depende da flexibilidade correcta da proteina.

Com maior preferência o invento proporciona a protéina do invento modificada, sob uma forma oligomérica. Em particular com um peso molecular relativo de 640 kDa. Tendo como base o peso molecular de monomero gp 160, pensa-se que esta forma seja tetramérica. Isto é vantajoso visto as proteínas da superfície virai existirem naturalmente como oligómeros os quais formam in-vivo espigões que fazem saliência na superfície virai. Na medida em que epitopos de neutralização são conformacionais, é claramente importante imitar tanto quanto possível a forma do antigénio que aparece naturalmente, visto isto ir proporcionar uma resposta imunitária mais relevante.

Numa apresentação pereferida o invento proporciona a protéina modificada do invento, sob uma forma oligomérica e substancialmente pura.

Substancialmente puro significa pelo menos 75% de pureza, com maior preferência 90% de pureza, com maior preferência 99% de pureza.

Num outro aspecto o invento proporciona um processo para a preparação de HIV gp 160 modificado de acordo com o invento, processo esse que consiste na expressão de ADN que codifica a referida protéina modificada numa célula de hospedeiro eucariótico recombinante e recuperação do produto proteico modificado.

polímero ADN compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica a protéina modificada também faz parte do invento.

A molécula de ADN recombinante do invento pode ser preparada de acordo com o invento pela condensação de unidades de nucleotido apropriadas mono-, di- ou oligoméricas.

A preparação pode ser realizada quimicamente, enzimáticamente, ou por combinação dos dois métodos, in vitro ou in vivo como seja apropriado. Assim, a molécula de ADN pode ser preparada pela ligação enzimática de fragmentos apropriados de ADN, por métodos convencionais tais como os descritos por D. M. Roberts et al em Biochemistry 1985, 24, 5090-5098.

Os fragmentos de ADN podem ser obtidos por digestão de ADN contendo as sequências requeridas de nucleótidos com enzimas de restrição apropriados, por síntese química, por polimerização enzimática, ou por uma combinação destes métodos.

A digestão com enzimas de restrição pode ser realizada num tampão apropriado a uma temperatura entre 20°-70°C, geralmente num volume de 50 μΐ ou menos com 0,1-10 pg de ADN.

A polimerização enzimática do ADN pode ser realizada in vitro usando uma polimerase do ADN tal como polimerase do ADN I (fragmento Klenow) num tampão apropriado contendo os nucleósido trifosfatos dATP, dGTP, dGTP e dTTP tal como seja requerido a uma temperatura de 10°-37°C, geralmente num volume de 50 μΐ ou menos. Os fragmentos podem ser polimerizados e amplificados por reacção de cadeia de polimerase usando polimerase Taq (ref. PCR Protocols 1989 - um guia para Methods and Applications, Ed. M.A. Innis et al., Academic Press).

A ligação enzimática dos fragmentos de ADN pode ser realizada usando ligase do ADN tal como ligase T4 ADN num tampão apropriado a uma temperatura de 4°C à ambiente, geralmente num volume de 50 μΐ ou menos.

noutras publicações Matthes, M. Singh,

A síntese química da molécula ou fragmentos do ADN pode ser realizada por processo químicos convencionais com fosfotriéster, fosfite ou fosforamidite, usando técnicas de fase sólida tais como as descritas em Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual (ed. H.G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), ou científicas, por exemplo M.J. Gait, H.W.D.

B.S. Sproat, and R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat and W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24. 5771; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105. 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, and H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; and H.W.D. Matthes et al.. EMBO Journal, 1984, 3, 801. De preferência utiliza-se um sintetizador automático de ADN.

polímero de ADN que codifica a proteína modificada pode ser preparado por meio de mutagenese dirigida ao sítio do cADN que codifica a proteína não modificada, por métodos convencionais tais como os descritos por G. Winter et al em Nature 1982, 299, 756-758 ou por Zoller and Smith 1982; Nucl. Acids Res., 10, 6487-6500.

O invento também se estende a um vector compreendendo a molécula do ADN recombinante do invento e a um vírus vaccina recombinate contendo o referido vector.

vector pode ser preparado de acordo com o invento por clivagem de um vector a fim de proporcionar um segmento linear de ADN tendo uma replicação intacta, e ligando o referido segmento linear e uma ou mais moléculas de ADN, as quais juntamente com o referido segmento linear completam a molécula recombinate de ADN do invento.

A célula do hospedeiro recombinante do invento pode ser preparada por transformação de um vírus vaccina com um vector do invento.

produto proteico modificado é isolado a partir de meio condicionado por técnicas padronizadas de isolamento e purificação da proteína. Detergentes, por exemplo, Decyl PEG-300, DO Decyl PEG Triton X100. Thesit Deoxycholate, pode ser adicionado a fim de efectuar a lise da célula e libertar a proteína modificada do material da membrana da célula. Destes são preferidos Decyl PEG-300 e Thesit Deoxycholate, podendo então a proteína DO Decyl Triton X100 Modified ser purificada por uma série de passos de ultrafiltração, passos de ultracentrifugação, precipitações selectivas com por exemplo, sulfato de amónio ou PEG, centrifugação com gradiente de densidade em CsCl ou sucrose ou gradientes de metrizamide e/ou passos cromatogrãficos, tais como cromatografia de afinidade, sendo preferida cromatografia de imunoafinidade, HPLC, HPLC de fase reversa, permuta de catiões e aniões, cromatografia de exclusão de tamanhos, focagem isoelectrica preparativa. É preferida a purificação utilizando a cromatografia de imunoafinidade. Durante ou a seguir à purificação, a proteína modificada pode ser tratada com, por exemplo, formaldeído, glutaraldeido ou NAE para melhorar a estabilidade ou a imunogenicidade.

Para a preparação da forma oligomérica do invento é preferido usar condições suaves durante os passos de purificação. Em particular, o agente de redução deve ser evitado, e os detergentes não iónicos tais como Decyl PEG-300 (monodeciléter de polietileneglicol 300) são preferidos aos detergentes iónicos para a lise.e solubilização celular durante os passos cromatogrãficos. Um meio cromatografico de afinidade preferido é Lentil lectin Sepharose e um meio de cromatografia de imunoafinidade preferido é um anticorpo monoclonal anti-gp 160 tal como 178.1 (WO 90/06358) acoplado num veículo apropriado tal como Trisacryl | (IBF) activado com glutaraldeido.

A proteína modificada pode ser adsorvida a partir do anticorpo monoclonal na presença do detergente octil glucopiranoside o qual pode ser removido por diãlise. Os detergentes são de preferência usados em concentrações acima da sua concentração micelar crítica teórica.

A proteina modificada produzida de acordo com este invento é útil como um agente diagnóstico para a detecção da exposição ao HIV. A proteina modificada é também útil nas vacinas para a prevenção da infecção ou para a inibição ou prevenção da progressão da doença.

Este invento também se relaciona com uma vacina e com composições farmacêuticas contendo a proteina modificada deste invento. Essas composições irão conter uma quantidade imunoprotectora da proteina modificada deste invento e podem ser preparadas por técnicas convencionais.

Na vacina do invento, uma solução aquosa da proteina pode ser usada directamente. Alternativamente, a proteina, com ou sem liofilização prévia, pode ser misturada ou absorvida com qualquer um de vários adjuvantes conhecidos. Esses adjuvantes incluem, mas não se limitam a, hidróxido de alumínio, . dipeptídeo de muramilo e saponinas tais como Quil A, 3D-MPL (monofosforil-lípido A 3-desacilado), ou TDM. Como ainda outro exemplo alternativo, a proteína pode ser encapsulada em microparticulas tais como liposomas. Ainda num outro exemplo alternativo, a proteína pode ser conjugada com uma macromolécula imunoestimulante, tal como Bordetella morta ou toxoide do tétano.

A preparação de vacina é geralmente descrita em New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1078. A encapsulação no interior de liposomas é descrita, por exemplo, por Fullerton, Patente dos E.U.A. No. 4.235.877. A conjugação de proteínas em macromoléculas é apresentada, por exemplo, por Likhite, Patente dos E.U.A. No. 4.372.945 e por Armor et al., Patente dos E.U.A. No. 4.474.757.

A quantidade de proteína modificada do presente invento em cada dose de vacina é seleccionada como uma quantidade que induza uma resposta imunoprotectora sem efeitos secundários adversos, significativos, em vacinas típicas, Essa quantidade irá variar dependendo de qual o imunogénio específico gue é utilizado e do facto da vacina ter ou não adjuvantes. Geralmente, espera-se gue cada dose compreenda 1-1.000 Mg de proteína modificada, de preferência 10-200 Mg. Uma quantidade óptima para uma determinada vacina pode ser verificada por estudos padronizados envolvendo observação dos títulos de anticorpo e outras respostas nos indivíduos. A seguir à vacinação inicial, os indivíduos irão receber de preferência um reforço ao fim de cerca de 4 semanas, seguindo-se reforços repetidos de seis em seis meses anquanto existir um risco de infecção.

O invento proporciona ainda proteina modificada do invento para utilização na vacinação de um hospedeiro e utilização da proteina modificada na preparação de uma vacina.

Além da vacinação a indivíduos susceptiveis de infecções por HIV, as composições farmacêuticas do presente invento podem ser usadas para tratar, imunoterapêuticamente, doentes que sofram de infecções por HIV.

Consequentemente, num aspecto do presente invento é proporcionado um método para o tratamento de um ser humano susceptível a ou sofrendo de infecção por HIV por administração de uma quantidade eficaz de gp 160 modificado tal como é aqui descrito.

Coincidentemente com o conceito de utilização de componentes sub unitários produzidos, por exemplo, por meio, de tecnologia do ADN recombinante, vem a necessidade de adjuvantes e/ou veículos para apresentar eficazmente os imunogénios ao sistema imunitário do hospedeiro de modo a que os dois braços da resposta imunitária (neutralização do anticorpo e imunidade mediada pela célula (DTH)) sejam produzidos. No contexto do presente invento (isto é no tratamento profilático ou terapêutico das infecções por HIV) descobrimos que uma porção imunoestimulante, 3D MPL é capaz de estimular ambos os braços do sistema imunitário.

Consequentemente num aspecto preferido do presente invento é porporcionada uma formulação farmacêutica compreendendo gp 160 ou um seu derivado imunológico e monosfosforil-lípido A (3D-MPL) com um veículo apropriado.

Numa apresentação preferida do presente invento o gp 160 ou um seu derivado imunolôgico e 3D-MPL são apresentados numa emulsão óleo em água. Este sistema proporciona uma actividade neutralizadora melhorada.

Consequentemente num aspecto preferido do presente invento proporciona-se uma formulação farmacêutica ou de vacina compreendendo gp 160 ou um seu derivado imunolôgico, 3D-MPL num veículo óleo em ãgua, compreendendo o referido veículo uma emulsão de tetrapoliol e um óleo mineral não tóxico numa solução | salina tamponada.

De preferência o veículo compreende um poliol Pluronic tal como Pluronic L121, e esqualeno ou esqualeno ou outros óleos metabolizãveis. Um emulsificador tal como Tween 80 ou Tween 28 é de preferência fornecido a fim de estabilizar a emulsão.

O veículo de preferência contem apenas partículas submicron entre 100 e 400 nm.

A concentração de antigénio na formulação final varia de preferência entre 10 /zg e 150 /zg/ml, com maior preferência entre 20 pg e 100 ^g/ml.

>

A gama de concentração do adjuvante, 30-MPL. na vacina, varia de preferência entre 10 pg e 100 μgml com maior preferência entre 25 e 50 gg/ml.

presente invento proporciona ainda as formulações da vacina tal como são aqui descritas para utilização em medicina, em particular para utilização no tratamento por imunoterapia e tratamento profilático de infecções por HIV tais como SIDA ou complexo relacionado com SIDA (ARC).

Num outro aspecto do presente invento, é proporcionado um método para produzir a vacina compreendendo gp 160 ou um seu derivado imunológico, monofosforil-lípido A 3D com um veículo apropriado, compreendendo o método a mistura de gp 160 ou de um seu derivado imunológico com o referido veículo e com monofosforil-lípido A 3D.

Numa apresentação, proporciona-se um método para produzir uma vacina tal como é aqui descrita num veículo óleo em água em que uma emulsão óleo em água é microfluidizada para proporcionar partículas micron na referida emulsão e misturada com gp 160 ou um seu derivado imunológico e 3D MPL.

Tipicamente o 3D-MPL é prémisturado com a emulsão, e em seguida o antigênio é misturado na composição resultante.

3D-MPL pode ser obtido pelos métodos indicados na Patente Britânica 2.211.502.

Veículos apropriados neste contexto, compreendem emulsões óleo em água. As formulações do presente invento proporcionam títulos de neutralização melhorados quando comparados com formulações de vacina convencionais compreendendo apenas alúmen como o adjuvante (o único adjuvante autorizado para utilização humana).

A expressão derivados imunológicos é aqui utilizada para incluir fragmentos imunogénicos de gp 160 que quando adjuvados com Monofosforil-lípido A 3D são capazes de fazer aumentar os anticorpos neutralizantes contra HIV-1. Como tal serão incluídos, por exemplo a glicoproteina da membrana exterior de HIV-1 gp 120, gp 160 modificado tal como foi aqui descrito assim como gp 160 isolado ocorrendo naturalmente. Particularmente preferidos são os

derivados que são também capazes de fazer aumentar a resposta DTH.

Assim, com a maior preferência o invento proporciona a forma modificada da protéina sob forma oligomêrica a qual guando purificada em condições suaves, não redutoras, revela ter um peso molecular aparente variando entre 600-700 KDa 640 Kd pensando-se que seja um tetramero. Este tetramero pode ser desestabilizado quando se utiliza a protéina em gel SDS em condições não redutoras, obtendo-se então um dimero de 330 kd e um monómero. 0 dímero . pode ainda ser reduzido em condições de redução padronizadas para ^F proporcionar o monómero.

Todas estas formas de gp 160 podem ser usadas nas formulações do presente invento.

A produção de gp 160 ou de seus derivados pode ser realizada por métodos conhecidos nesta técnica. Tipicamente esta envolverá a clonagem e expressão do gene que codifica gp 160 num hospedeiro apropriado. A produção de gp 160 recombinate (Rgp 160) desse modo pode ser realizada usando as técnicas descritas em Maniatis et al; Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbour 1982.

)

Uma série de células eucarióticas e sistemas de expressão encontra-se disponível para expressão das moléculas de ADN recombinantes. De entre estas as mais habitualmente usadas são a levedura, sistemas de insectos ou de mamíferos, embora o invento não se limite à utilização destes. Esses sistemas utilizam uma molécula de ADN recombinante do invento, facultativamente um marcador de seleccção, nalguns casos, funções de manutenção tais como um ponto de partida de replicação.

As células de insectos que podem ser usadas no invento incluem células de Drosophila e células de Lepidoptera. Células de Drosophila úteis incluem células Sl, S2, S3, KC-0 e D. Hydei. Ver, por exemplo, Schneider et al., J. Embryol. Exp. Morph. 27.:353 (1972); Schultz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:9428 (1986); Sinclair et al., Mol. Cell. Biol. 5:3208 (1985). As células de Drosophila são transinfectadas por técnicas padronizadas, incluindo precipitação com fosfato de cálcio, fusão celular, electroporação e transinfecção virai. As células são cultivadas de acordo com processos de cultura celular padronizados numa série de meios nutritivos, incluindo, por exemplo, meios M3 que consistem em sais equilibrados e amino ácidos essenciais. Ver, Lindquist, DIS 58:163 (1982).

Promotores considerados úteis na Drosophila incluem promotores de células de mamíferos tais como SV40 assim como promotores da Drosophila, sendo estes últimos preferidos. Exemplos de promotores úteis da Drosophila incluem o promotor metalotioneina da Drosophilla, o promotor da protéina de choque de calor de 70 kilodalton (HSP70) e o COPIA LTR. Ver, por exemplo, DiNocera et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80; 7095 (1983); McGarry et al., Cell 42:903 (1985).

Células de Lepidoptera úteis incluem células a partir de Trichoplusia ni, Spodoptera f rucriperda. Heliothis zea, Autographica californica. Rachiplusis ou. Galleria melonella. Manduca sexta ou outras células que podem ser infectadas com Baculovírus, incluindo vírus de poli-hedrose nuclear (NPV), vírus nucleocapsidos simples (SNPV9 e vírus nucleocapsidos múltiplos (MNPV). Os Baculovirus preferidos são Baculovírus NPV ou MNPV porque estes contêm o promotor do gene polihedrina o qual é altamente expresso em células infectadas. Particularmente exemplificado aqui a seguir é o vírus MNPV a partir de Autographica californica (AcMNPV). Contudo, outros vírusMNPV e NPV podem também ser utilizados o vírus do bicho da seda, Bombyx mori. As células da Lepidoptera são co-transinfectadas com ADN compreendendo a molécula de ADN recombinante do invento e com o ADN de um Baculovírus infeccioso por meio de técnicas de transinfecção padronizadas, tal como foi discutido anteriormente. As células são cultivadas de acordo com técnicas de cultura de células padronizadas numa série de meios nutritivos, incluindo, por exemplo, TC100 (Gibco Europe; Gardiner et al., J. Inverteb. Pathol. 25.:363 (1975) suplementado com 10% de soro de Vitelo fetal (FCS). Ver, Miller et al., em Setlow et al., eds., Genetic Encrineer ince Principies and Methods. . Volume 8, New York, Plenum, 1986, pages 277-298.

Os promotores para utilização em células de Lepidoptera incluem promotores a partir de um genoma de baculovírus. O promotor do gene polihedrina é preferido porque a proteína da polihedrina é naturalmente super expressa em relação a outras proteínas do Baculovírus. O promotor do gene polihedrina a partir do vírus AcMNPV é preferido. Ver, Summers et al., TAES Buli. NR 1555, May 1987; Smith et al., EP-A-127.839; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:8404 (1985); e Cochran, EP-A-228.036.

Para a expressão em células de mamíferos, a molécula de ADN recombinante é também clonada com um vector de clonagem e é então usada para a transinfecção para células de mamíferos. 0 vector compreende de preferência funções do ADN adicionais para a amplificação do gene, por exemplo, uma cassette para expressão DHFR, e pode também compreender funções adicionais para selecção e/ou amplificação, por exemplo, uma cassette de resistência à neomicina para selecção de G418. Podem também ser utilizadas outras funções, tais como melhoria da transcrição. Podem ainda ser incluídas no vector outras funções para manutenção episomal

estável, se desejado, tais como funções de manutenção do Vírus Papilloma Bovino. Alternativamente e de preferência o vector de clonagem é um vírus de mamífero recombinante tal como vírus vaccinia.

O vírus vaccinia é um vector particularmente útil pelo facto de poderem ser rápidamente construídos recombinantes por integração do gene estranho numa região não essencial do ADN de vaccinia retendo desse modo a infectividade. Quando submetidas a engenharia apropriada as proteinas são sintetizadas, processadas e transportadas para a membrana das células infectadas. Embora a infecção por vírus vaccinia leve à morte celular, existe pouca lise e a maior parte das células permanece intacta, permitindo uma fácil extracção da proteína requerida a partir das células infectadas. Um sistema de expressão do vírus vaccinia foi desenvolvido por Barrett et al., Aids Research and Human Retroviruses 1989; 5: 159-171.

Células de mamíferos úteis incluem células a partir de ovário de criceto Chinês (CHO), NIH3T3, COS-7, CV-I. BHK-21, mieloma de ratinho ou rato, HAK, Vero, HeLa, células diploides humanas tais como MRC-5 e W138, ou linhagens de células de linfoma de frangos, sendo preferidos CV-I e BHK -21.

A transinfecção e a cultura das células são realizadas por técnicas padronizadas. A produção em células de mamíferos pode também ser realizada por expressão em animais transgénicos.

As sequências reguladoras úteis para conduzir a expresão genética em linhagens de células de mamíferos ou células primárias de mamíferos incluem os promotores de gene precoces e tardios SV 40, o promotor metalotioneina, LTRs virais tais como LTR de Sarcoma Rous, o vírus de sarcoma Moloney (MSV) ou o LTR de vírus do tumor de mamífero de ratinhos (MMTV), ou o promotor tardio do principal adenovirus e promotores híbridos tais como vírus BK híbrido e promotor tardio principal de adenovirus. A região de elementos de controlo pode também compreender funções a jusante, tais como regiões para poliadenilação, ou outras funções, tais como sequências que melhoram a transcrição.

As leveduras que podem ser usadas na prática do invento incluem as dos gêneros Hanensula. Pichia, Kluveromyces. Schizosaccharomyces, Candida e Saccharomyces. Promotores úteis incluem o promotor induzível de cobre (CUP1), promotores de genes glicolíticos, por exemplo, TDH3, PGK e ADH, e os promotores PHO5 e ARG3. Ver, por exemplo, Miyanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:1 (1983); mellor et al., Gene 24:1 (1983); Hitzeman et al., Science 219:620 (1983); Cabezon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6594 (1984).

I

Exemplo 1 (i) Expressão de gp 160 modificado em células CV-I

O gene env HIV do clone molecular BH10 foi mutagenizado a fim de abolir a clivagem do precursor.

Para isto, as sequências de clivagem lis ala lis arg e arg glu lis arg presentes nestas sequências foram modificadas por mutagenese dirigida ao sitio para lis/arg x glu arg.

sítio 1 de clivagem ( posição 502) sítio 2 de clivagem (posição 510)

Clone

BH10

AAG GCA AAG AGA AGA GTG GTG LIS ALA LIS ARG ARG VAL VAL

CAG AGA GAA AAA AGA GLN ARG GLU LIS ARG foi submetido a V V mutação para: AAG GCA GAG AGA AGA GTG GTG CAG AGA GAA GAA AGA

LIS ALA GLU ARG ARG VAL VAL GLN ARG GLU GLU ARG >

O gene env mutagenizado completo (nucleótidos 5802-8478) foi clonado para o vector transfer do plasmídeo da vaccinia pGS20 [Mackett M.G., Smith L. and Moss B. (1984) J. Virology 49: 857-864] e transferido para vírus vaccinia infeccioso por recombinação. As placas de vaccinia recombinantes foram analisadas para expressão de env por captura EIA e placas positi vas reclonadas duas vezes em células CV-1. A produção de gp 160 não clivado nestas linhagens celulares foi ainda verificada por RIPA após marcação metabólica de células infectadas com vaccinia recombinante. A expressão da superfície celular foi confirmada

por marcação fluorescente da superfície celular intacta usando anticorpos anti-gp 120.

(ii) Purificação de gp 160 Modificado a partir de células dependentes de Ancoradouro

A proteina de envólucro gp 160 HIV de (i) foi purificada num protocolo em três passos: lise das células hospedeiras e extracção do antigénio com o auxílio de um detergente seguindo-se dois passos cromatográficos de afinidade. Todos os passos de purificação foram realizados a 4°C.

Passo 1: Lise das células CV-1 e extracção do antigénio qp 160

Após descongelação, a suspensão celular e as pérolas de microveículo correspondendo a 20 1 de cultura foram centrifugadas a 2.200 xg durante 15 min e o produto flutuante foi eliminado. 0 precipitado foi ressuspenso em 1 1 de tampão tris/HCl 30 mM pH 8 suplementado com NaCl 150 mM, 1% de polietileneglicol 300 monodeciléter (Decyl PEG) e 20 mcg/ml de aprotinina. As células foram lisadas durante 1 hora sobre gelo com agitação ocasional manual e centrifugadas a 11.300 xg durante 20 minutos. Após a separação do produto flutuante, a pílula foi lavada com 400 ml de tampão de lise e centrifugada a 11.300 xg durante 20 minutos. Os detritos celulares e as pérolas de microveículo foram eliminados e os produtos flutuantes combinados foram usados para posterior purificação.

Passo 2: Cromatocrraf ia de afinidade em Sepharose lectina Lentil 4B lisado foi cromatografado numa coluna de Sepharose lectina Lentil 4B (Pharmacia-LKB) (2,5 cm x 20 cm) equilibrada

com tampão Tris/HCl 30 mM pH 8 suplementado com NaCl 150 mM e PEG Decyl a 0,1%. Após fornecimento do lisado a uma taxa de fluxo de 1 ml/min, a coluna foi lavada com tampão Tris/HCl 30 mM pH 8 suplementado com NaCl IM de PEG Decyl a 0,1%. Subsequentemente, o antigênio foi eluido a partir da coluna com α-D-manopiranosida de metilo 0,5 M em tampão de equilíbrio e foram reunidas fracções positivas de gp 160. Os passos de lavagem e de eluição foram realizados a uma taxa de fluxo de 5,5 ml/min.

Passo 3: Cromatografia de imunoafinidade sobre 178.1-Trisacryl

O anticorpo 178.1 monoclonal anti-pg 160 (publicação de Patente No. WO 90/06358) foi purificado a partir de líquido ascítico numa coluna de Proteina G-Sepharose (Pharmacia-LKB) e subsequentemente acoplado em Trisacryl activado com glutaraldeído (IBF) de acordo com as directivas do fabricante. 0 anticorpo, que é dirigido contra um epítopo na porção gp 120 do antigênio (ansa V ), foi acoplado a uma densidade de gel 1,5 mg/ml.

A resina foi embalada numa coluna (2,5 cm x 10 cm) e equilibrada em tampão Tris/HCl 30 mM pH 8 suplementado com NaCl 150 mM e PEG Decyl a 0,1%.

>

O produto eluido em Sepharose lectina Lentil 4B foi fornecido a uma coluna por reciclação durante a noite a 1 ml/min. Subsequentemente a coluna foi lavada a uma taxa de fluxo de 3,3 ml/min com 20 volumes de coluna de tampão Tris/HCl 3 0 mM pH 8 suplementado com NaCl 1 M e 1% de β-D-glucopiranosido de n.octilo (OGP). Finalmente, o antigênio foi eluido com a mesma taxa de fluxo com tampão ãcido cítrico 0,1 M pH 3,3 suplementado com OGP a 1%. As fracções da eluição foram neutralizadas imediatamente com Tris/HCl 1 M pH 8,8 e as fracções positivas de antigênio foram reunidas.

(iii) Determinação da proteína

As concentrações da proteína foram determinadas pelo método de Bradford (Bradford, 1976) usando albumina do soro bovino como o padrão.

(iv) Determinação do antigênio

A quantidade do antigênio gp 160 foi medida por um ELISA sandwich desenvolvido in-house usando anti-gp 41 de carneiro como anticorpo monoclonal de captura e anti-gp 120 murino como anticorpo monoclonal indicador. Detecção posterior foi feita com um anticorpo anti-ratinho biotinilado clássico, sistema streptavidin e peroxidase.

(v) Electroforese em gel poliacrilamida e mancha Ocidental

Electroforese em gel SDS-slab foi realizada em geles de poliacrilamida a 10% de acordo com o método de Laemmli (Laemmli, 1970). Após migração, as proteínas foram visualizadas por mancha de prata após oxidação com ãcido periódico (corante Pas) (Dubray et al, 1982).

>

As acções electroforéticas foram realizadas na presença e na ausência de um agente redutor. As faixas de proteína foram ainda identificadas por mancha Ocidental sobre nitrocelulose de acordo com Towbin (towbin et al, 1979) e a avaliação foi feita com anticorpos quer dirigidos contra o antigênio gp 160 quer contra células do hospedeiro (CV-1) ou proteínas do vírus vaccinia.

(vi) Libertação do anticorpo monoclonal 178.1

A presença de anticorpo monoclonal 178.1 no antigénio gp 160 purificado foi medida por ELISA. Os anticorpos foram capturados por um anticorpo cabra-anti-ratinho e detectados com um anticorpo anti-ratinho niotinilado. Posterior detecção foi feita com o sistem streptavidin-peroxidase.

(vii) Cromatografia por exclusão de tamanhos do gp 160 env ouro gp 160 purificado foi cromatografado numa coluna TSK 4000 SW HPLC (7,5 mm x 300 mm) equilibrada em tampão fosfato 0,2 M pH 7 suplementado com OGP a 1%. A taxa de fluxo foi de 0,75 ml/min e as fracções da coluna foram analisadas quanto ao antigénio por ELISA.

(viii) Determinação da pureza

A pureza foi determinada após cada passo de purificação por electroforose em gel SDS-poliacrilamida sob condições de redução. As faixas de proteina foram visualizadas por coloração com PAS e identificadas posteriormente por mancha Ocidental.

»

Os resultados indicaram claramente que o antigénio se encontrava livre de proteínas de contaminação detectáveis após cromatografia na coluna de imunoafinidade. Contudo o produto final pode ser contaminado com quantidades vestigiais de anticorpo monoclonal libertando-se da coluna de imunoafinidade. Assim, a quantidade de anticorpo 178.1 no gp 160 puro foi medida por ELISA . e variava entre 0,004% e 0,02% da quantidade total de proteina presente nas amostras.

ι|.

Ο antigénio purificado foi analisado quanto à presença de formas oligoméricas de gp 160. A formação de oligómeros pode reflectir a estrutura de gp 160 no vírus onde as proteínas de envólucro são organizadas como espigões na superfície do virion. A presença de cisteinas na sequência primária do antigénio permite a formação de (homo-)-oligómeros ligados por pontes de dissulfureto. Isto foi demonstrado por electroforese em gel poliacrilamida na presença e na ausência de β-mercaptoetanol. Sem um agente redutor, o antigénio revelou faixas de proteina de massa molecular superior a 160.000 Da, mesmo na presença de detergente (SDS). Em contraste, guando o antigénio foi submetido a ebulição na presença de um agente redutor, foi observada uma única faixa de proteina a 160 kDa. A fim de determinar o tamanho das estruturas oligoméricas, o antigénio foi analisado por cromatografia HPLC de exclusão de tamanho. Verificou-se a partir de calibração da coluna com padrões de massa molecular conhecida que a maior parte das moléculas de gp 160 eram eluidas num tempo de retenção correspondendo a uma massa molecular de 640.000 Da. Assim, conclui-se que na presença de um detergente mas sem um agente de redução, a maior parte da proteina HIV gp 160 env se reunia em estruturas tetraméricas.

(ix) Análise

O produto final apresenta uma relação antigénio/proteina de cerca de 2 que corresponde ao conteúdo ELISA do lisado (0,8-1,4 mg de antigénio por ELISA por litro de cultura).

Exemplo 2

Expressão de qp 160 modificado em BHK-21 e purificação de env, gp

160 a partir de células cultivadas em suspensão

A proteina de envólucro de HIV gp 16.0 expressa em células BHK-21 por um método análogo ao descrito no Exemplo l(i) com um vírus vaccinia recombinante foi purificada de acordo com o esquema indicado no Exemplo 1 (ii) exceptuando quanto a algumas modificações menos importantes no passo de lise.

Passo 1: Lise das células BHK-21 e extracção do antigénio qp 160 „ _ 9

Apos descongelação, a suspensão celular (10 células) foi centrifugada durante 15 minutos a 2.200 xg e o produto flutuante foi eliminado. A pílula celular foi suspensa de novo em 50 ml de tampão Tris/HCl 30 mM pH 8 suplementado com NaCl 150 mM, 1% de polietilenoglicol 300 monodeciléter (Decyl PEG) e 20 mcg/ml de aprotinina. As células foram lisadas durante 1 hora sobre gelo com agitação ocasional manual e centrifugadas a 11.300 xg durante 15 minutos. Após separação do produto flutuante, a pílula foi lavada com 20 ml de tampão de lise e centrifugada a 11.300 xg durante 15 minutos. A pílula foi eliminada e os produtos flutuantes combinados foram usados para posterior purificação.

Passos 2 e 3 e subsequente análise foram realizados tal como foi descrito no Exemplo 1 (ii)-(ix).

Exemplo 3

Preparação de formulações de Vacinas gp 160 - 3D-MPL (a) rgp 160-Hidróxido de Alumínio mais 3D-MPL rgp 160 purificado (100 Mg ou 20 μ$ cada por dose) de vacina (exemplo 1) foi adsorvida durante a noite a 4°C em hidróxido de alumínio (alúmen) correspondendo a equivalentes de 0,5 μg

3+ de Al em 1 ml de NaCl 150 mM, tampão fosfato 10 mM pH 6,8. Depois da incubação durante a noite, a preparação de adjuvante foi centrifugada e o produto flutuante foi removido. Um volume igual de tampão de adsorção contendo 100 μg de 3D-MPL foi então adicionado a rgp 160 ligado a alúmen. Verificou-se que mais de 95% do rgp 160 era adsorvido no hidróxido de alumínio.

(b) Óleo rgp 160-3D-MPL em emulsão em ácrua veículo foi preparado como se segue. Pluronic L121 5% (BASF Wyandotte, New Jersey) (v/v) e 10% de squaleno (Aldrich) foram adicionados a solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,4% (v/v). de Tween 80. Esta mistura foi então microfluidizada. Para a microfluidização, a emulsão foi deslocada ciclicamente dez vezes através de um microfluidizador (Model M110 Microfluidics Corp., Newton, Mass.). A emulsão resultante compreendia apenas partículas submicron. Um volume desta emulsão foi misturado com um volume igual de rgp 160 concentrado duas vezes (ou 20 μg ou 100 μg) e submetido a vórtice num período curto a fim de assegurar a mistura completa dos componentes. 100 ^g/ml de 3D-MPL foram então adicionados a esta emulsão de rgp 160 o/w. A preparação final consistia em 0,2% de Tween 80, 2,5% de Pluronic L121, 5% de esqualeno, 100 μg de 3D-MPL e rgp 160 (100 μg ou 20 Mg) numa dose para injecção de 1 ml.

Exemplo 4

Imunogenicidade em cobaias

ELISA e títulos de neutralização

Cinco cobaias foram imunizadas com 3 injecções de 50 p,g de gp 160 modificado (Exemplo 1) em SAF-1 (formulação-1 de adjuvante Syntex) Byars NE and Allison A,C, (1987) Vaccine 5: 223-227 com um intervalo de um mês. Os soros foram testados 2 semanas e 1 mês após imunização secundária, assim como 2 semanas após imunização terciária das cobaias. Os resultados são descritos no Quadro 2.

Um imunoensaio com enzima de captura (EIA) tendo como base um lisado de células infectadas com HIV-1 (IIIB) foi usado para determinar o título de ELISA dos anti-soros depois do primeiro e segundo reforços. O teste usado é muito semelhante ao publicado por Moore et al., [Moore J.P. et al., 1989, AIDS 3.:155 (63)].

O ensaio de neutralização em microplaca baseia-se na detecção de antigênio HIV gag em células indicadoras. Resumidamente, células SupTl (Hecht et al., 1984, Science 226:1145) são usadas como células indicadoras. O inóculo virai consiste em produto flutuante livre de uma linhagem celular linfoide produzindo HIV-1 (IIIB). O produto flutuante é centrifugado a uma velocidade elevada para eliminar células e detritos celulares, dividido em porções alíquotas em frascos de 1 ml e armazenado a -80°C até à utilização. Os soros a serem testados são inactivados a 56°C durante 30 minutos antes do teste. O nosso controlo negativo consiste numa reunião de soros de animais préimunização ou inoculados apenas com adjuvante (as mesmas espécies que os

soros a serem testados). Para neutralização, 750 TCID_5Q são incubados com séries de diluições duplas dos soros durante 1 hora a 37°C. Células SupTl são então adicionadas (4.10⁴ células/recipiente) e incubadas 4 dias a 37°C. 0 efeito citopático é monitorizado microscopicamente, Triton X-100 (1% de concentração final) é adicionada a cada recipiente e a placa é congelada. Um ELISA em sandwich é usado para monitorizar a quantidade relativa de antigénio virai produzido nas culturas. As placas são revestidas com um anticorpo monoclonal anti p55. As amostras anteriores tratadas com Triton X-100 são incubadas na placa e a presença de antigénio gag é visualizada por HIV-1 biotinilado + IgGs humanos seguindo-se um passo com streptavidin peroxidase. As percentagens de redução da produção de antigénio HIV-1 em relação ao controlo são então avaliadas para todas as diluições do soro testadas. Usando um curva adaptada aos pontos dos dados por análise não linear de quadrados mínimos a diluição do soro (se existente) dando origem a uma redução de 50% na produção do antigénio em comparação com o controlo, é extrapolada.

O Quadro 2 indica o título de anticorpo neutralizador após imunização terciária.

Os títulos de neutralização observados após o segundo reforço excedem os encontrados nos soros de seres humanos infectados. Mais precisamente, o título de neutralização dos nossos anti-soros em relação ao isolado de HIV IIIB é em média 4 vezes mais elevado do que o observado para um grupo de 5 soros de referência WHO seropositivos (McKeating et al. , 1989, J. Gen. Virol. 70.:3326-3333) . A neutralização de uma série de isolados HIV-1 (neutralização cruzada) foi testada pelo laboratório do Dr. Weiss (Chester Beatty Laboratories, U.K.) usando um teste de neutralização mais rigoroso que proporciona uma sensibilidade e título mais baixo. Os resultados, descritos no Quadro 3 foram

reproduzidos em 3 ocasiões com 2 colheitas sanguíneas diferentes e apresentam uma boa neutralização cruzada de uma série de estirpes de HIV-1 incluindo uma estirpe Africana (CBL-4) (ver Quadro 3).

Os soros de cobaias imunizadas com vaccinia gp 160 (Exemplo 1) (01-05) revelam bons títulos de neutralização cruzada após imunização terciária.

Devido à forte resposta de neutralização cruzada observada após 3 doses, vaccinia gp 160 do invento é considerado de potencial utilização para vacinação HIV-1.

Exemplo 5

Estudo do efeito de diferentes formulações de vacina sobre a imunogenicidade de gp 160 recombinante de vaccinia HIV purificado (isolado IIIB) em macacos Rhesus

Neste estudo, a capacidade de diferentes formulações de vacina para melhorar a imunogenicidade de gp 160 recombinante de vaccinia purificado (rgp 160) foi avaliada em macacos Rhesus (Macaca mulatta). Os adjuvantes testados foram hidróxido de alumínio (Alhidrogel, Superfos -Dennmark) em combinação com 3D-MPL (Exemplo 2b) (Monofosforil-lípido A 3D, Ribi); 3D-MPL em emulsão em água (Exemplo 2a).

Macacos Rhesus (Macaca mulatta) pesando 3,5a 5 kg foram distribuídos ao acaso por sete grupos contendo 3 ou 4 animais por grupo.

Os grupos foram imunizados com diferentes doses de rgp 160 fomuladas em 3 formulações de adjuvante, como se segue:

Grupo 1 (4 macacos) : 100 pg rgp 160 ádsorvido em hidróxido de alumínio mais 3D-MPL.

Grupo 2 (4 macacos) : 20 pg rgp 160 adsorvido em hidróxido de alumínio mais 3D-MPL

Grupo 3 (4 macacos): 100 pg rgp 160 mais 3D-MPL em emulsão o/w Grupo 4 (4 macacos): 20pg rgp 160 mais 3D-MPL em emulsão o/w

5.1. Preparações Anticrénio-Adjuvante

Todas as formulações rgp 160 foram preparadas imediatamente antes da utilização. Cada dose de injecção foi administrada num volume de 1 ml.

Grupos de macacos Rhesus foram injectados intramuscularmente no tricipite braquial com uma dose de 1 ml de várias formulações de gp 160 no dia 0 e no dia 35. Duas semanas após a segunda imunização, os animais foram sangrados para determinações do anticorpo.

5.2 Leitura

OS soros colhidos destes animais 2 semanas após a segunda injecção foram testados em ELISA e ensaios de neutralização.

5.3 ELISA

Foi usada uma modificação do imunoensaio de captura cujo protocolo geral descrito em Thiriart et al (Thiriart et al, 1989, J. Immunol 148 6.:832-1836). Este ensaio usa um reagente anti gp 41 monoespecífico comercial Biochrom. Um lisado crú de células BHK 21 infectadas com vaccinia gp 160 é usado como antigénio.

5.4 Ensaio de Neutralização

O ensaio de neutralização em microplaca é baseado na detecção de antigénio gag HIV em células indicadoras. Resumidamente, células SupTl (Hecht et al, 1984, Science 226:1445) são usadas como células indicadoras. 0 inoculo virai consiste em produto flutuante livre de células de linhagem celular linfoide produzindo HIV-1 (IIIB). 0 produto flutuante é centrifugado a uma alta velocidade a fim de eliminar células e detritos celulares, dividido em porções alíquotas em frascos de 1 ml e armazenado a -80°C até utilização. Os soros a serem testados são inactivados a 56°C durante 30 minutos antes do teste. O controlo negativo consiste numa reunião de soros a partir de animais préimunizados. Para a neutralização, 750 TCID₅₀ são incubados com sérias de duplas diluições dos soros durante 1 hora a 37°C. Células Stup TI são então adicionadas (2.10⁴ células/recipiente) e incubadas 4 dias a 37°C. O efeito citopãtico é monitorizado microscopicamente, adiciona-se Triton X-100 (1% de concentração final) a cada recipiente e a placa é congelada. Um ELISA sandwich é usado para monitorizar a quantidade relativa de antigénio virai produzida nas culturas. As placas são revestidas com um anticorpo monoclonal anti p55. As amostras anteriores tratadas com Triton X-100 são incubadas na placa e a presença de antigénio gag é visualizada por HIV-1 biotinilado + IgGs humanas seguindo-se o passo de streptavidin peroxidase. As percentagens de redução da produção de antigénio HIV-1 em relação aos controlos são então avaliadas para todas as diluições de soro testadas. Usando uma curva adaptada aos pontos dos dados por análise de regressão linear, a diluição do soro (se existente) dando origem a uma redução de 50% na produção de antigénio em comparação com os controlos, é extrapolada.

5.5 Resultados

Quadro 4 indica o ELISA e o título de anticorpo neutralizante após uma segunda imunização. A imunogenicidade geral de HIV rgp 160 em 3D-MPL o/w é muito boa. Quando doses de 20 /xg de gp 160 são administradas aos animais, o título de neutralização (NT) e os títulos de ELISA observados foram extremamente bons no grupo de animais que recebia rgp 160 em 3G-MPL o/w (grupo 4). Estes dados sugerem um efeito adjuvante superior da emulsão 3D-MPL o/w. A resposta imune dos animais imunizados com gp 160 adsorvido em Alúmen na presença de 3D-MPL é fraca, embora seja produzido algum anticorpo neutralizante. O HIV gp 160 contem uma porção hidrofóbica e esta provavelmente confere à molécula uma elevada afinidade para os lípidos. 0 HIV gp 160 é melhor apresentado ao sistema imunitário utilizando um óleo em água tendo como base a formulação contendo 3D-MPL.

Exemplo 6

6.1 Esquema experimental

Dois chimpanzés (No. 1, No. 2) 160 recombinante de vaccinia purificada do exemplo 1.

foram imunizados com gp (100 /xg/dose) (rgp 160)

Dois chimpanzés (No. 3, No. 4) foram imunizados com gp 120 recombinante purificado (100 /xg/dose) expresso ém células de Drosophila Schneider (rgp 120) (Culp et al., Biotechnology, 9:173-177, 1991).

As proteínas recombinantes foram formuladas com 3D MPL (100 /xg/dose) numa emulsão o/w. A formulação consistia em 0,2% de Tween 80, 2,5% de Pluronic L121, 5% de esqualeno, 100 /xg de 3D

MPL e dose de antigénio recombinante (100 μg para rgp 160 ou rgp 120; num volume de injecção de 1 ml.

Os animais foram imunizados intramuseularmente numa perna no mês ο, l e 2.

Os animais foram sangrados de duas em duas semanas para determinação do anticorpo por ELISA e ensaios de neutralização (ver Exemplo 4.3 para metodologia de ELISA); o ensaio de neutralização de HIV foi ligeiramente modificado, tal como é descrito mais abaixo). A indução de resposta de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) foi também avaliada, tal como é descrito mais abaixo.

6.2

Indução de imunidade humoral

Tal como é indicado no Quadro 5, chimpanzés vacinados quer com rgp 160 quer com rgp 120 administrados numa emulsão de 3D MPL o/w produziram ELISA e títulos de neutralização elevados após 3 imunizações. A actividade de neutralização pôde ser detectada em 3 soros de entre 4 após 2 injecções e em 4 de entre 4 após um outro reforço. Foi observado um aumento dos títulos de neutralização após uma terceira imunização. O ELISA e os títulos de neutralização medidos após este reforço são muito semelhantes aos obtidos em macacos rhesus imunizados três vezes com a mesma formulação de rgp 160.

6.3 Indução de DTH

Os testes DTH foram realizados duas semanas após a terceira imunização. Todas as injecções foram administradas no abdómen, num volume de 100 μΐ por injecção.

Os dois chimpanzés imunizados com rgp 160 e os dois animais tratados com rgp 120 fizeram testes à pele com 3 antigénios diferentes (rgp 160, rgD 26, toxoide do tétano) e 2 tampões de controlo (tampão de controlo rgDt (PBS) e tampão de controlo rgp 160). Foram testadas doses diferentes de antigénio recombinante: 40, 20 ou 10p,g para rgp 160 e 20, 10 ou 5 μ$ para rgDt.

As respostas DTH foram monitorizadas 24 horas mais tarde por medição da espessura da pele. Os resultados são ilustrados nas Figuras 1-3.

Uma resposta DTH específica contra o toxoide do tétano e rgp 160 foi observada em animais vacinados quer com rgp 160 (Fig. 1) quer com rgp 120 (Fig. 2).

Estes resultados indicam que formulações contendo 3D MPL numa emulsão o/w são capazes de induzir uma resposta específica das células T (ver Quadro 6).

Em conclusão, os resultados obtidos em chimpanzés indicam claramente que formulações adjuvantes contendo 3D MPL numa emulsão óleo em água melhoram significativamente as respostas imunitárias humoral (anticorpos neutralizantes) e mediadas pela célula efectora (DTH) em primatas.

Ensaio de neutralização

O ensaio de neutralização da microplaca é baseado na avaliação visual de CPE induzido por infecção com HIV1 em células indicadoras. Resumidamente, células SupTl (Hecht et al, 1984, Science 226:1445) são usadas como células indicadoras. O inõculo virai consiste num produto flutuante livre de células de uma linhagem de células linfoídes produzindo HIV-1 (IIIB). O produto

flutuante é centrifugado a alta velocidade a fim de eliminar células e detritos celulares, é dividido em porções alíquotas em frascos de 1 ml e armazenado a -80°C até à utilização. Os soros a ser testados são inactivados a 56 °C durante 30 minutos antes do teste. Os nosos controlos negativos consistem numa reunião de soros a partir de animais da préimunização. Para neutralização, 750 TCID_5q são incubados com sérias de duplas diluições dos soros durante 1 hora a 37°C. Células SupTl são então adicionadas (2.10^ células/recipiente) e incubadas 4 dias a 37°C. 0 efeito citopático é monitorizado microscopicamente no dia 4 e os títulos de neutralização são determinados visualmente. Os títulos de neutralização obtidos correspondem ao recíproco da diluição de soro dando origem a 80% de redução da formação de sincícios em comparação com Controlos da préimunização. Os títulos determinados visualmente são ainda objectivados no dia 7 por medição da viabilidade celular em cada recipiente usando o ensaio MTT Virol. Methods 20.:309-321, 1988).

ensaio representam o recíproco da diluição do soro dando origem a 80% de protecção contra CPE em comparção cçm células não infectadas. Os títulos determinados visualmente e MTT são muito reproductíveis de um ensaio para outro e os títulos determinados MTT (não indicados) são 2a 4 vezes mais baixos que os determinados visualmente.

descrito por Pauwels et al (J. Os títulos determinados neste

Quadro 1

Purificação de HIV gp 160 expresso em células CV-1 e BHK-21

Passo Purificação	Volume (ml)	:Proteina Total (mg)	: Recuperaçãc Proteina (%)	Recuperação Antigênio (%)
CV-1 (1)
Lise	1400	2000	100	100
lentil lectin	350	100	5	80
Imunoafinidade	60	8	0.4	65
BHK-21 (2)
Lise	1480	2688	100	100
lentil lectin	495	113	4	79
Imunoafinidad<	. 60	7	0.3	58

(1) ; 20 1 de cultura como material de partida (2) : 14 1 de cultura (2,1 x 10 células) como material de partida

Quadro 2

IMUNOGENICIDADE DE gp 160 EM COBAIAS

	Titulo Anti-HIV	(D	Titule	NeutraliZaç^IIB)
Antigé... ni-o-*	Dose	Adjuvante	Guinea	Post II	Post III	Post II	Post III
		pig n°	15 d	1 mês	15 d	15 d	1 mês
Vacina gP l60	50 ug	SAF-1	01 02	21653 22348	20327 16694	158589 179971	183 165	< 100 117	2207 1930
(Exemple 1)			03	25360	20327	151254	445	394	6630
D			04	35905	26175	161124	353	195	2034
			05	ND	8658	77884	133	< 100	677
			GMT	25764	17330	140203	229	117	2079

(1) Representa o inverso da diluição do soro que dá um O.D. de 0,5

Quadro 3

	Heterologous	challenge
SAMPLE I.D.	Illb Homolo- gous challenge	SF2	MN	RF	CBL-4
01 02/05/90	80	10/<10	—
02 02/05/90	<40	80	10	-	10
03 02/05/90	80	20	-	-	10
04 02/05/90	40	10	-	-	10
05 02/05/90	80	40	10	-	10
01 14/05/90	40	20	—		10
02 14/05/90	80	20	-	-	10
03 14/05/90	160	20	10	-	10/<10
04 14/05/90	20	10	-	-	40
05 14/05/90	40	40	0/<10	-	10
1 Positivo Humano	160	320	80	160	80
Negativo Humano	-	-	-	-	-

° Actividade neutralizadora dos Soros da Cobaia para gp 160' em relação a isolados homólogos (Illb) e heterõlogos.

Efeito neutralizador positivo é representado por 90% de inibição da formação de sincícios tal como é avaliado visualmente.

Quadro 4

IMUNOGENICIDADE DE GP 160 DE VACCINIA RECOMBINANTE EM MACACOS RHESUS

		Γ	- . __	______
		tELISA e Neutralização de Titulos 1
		“· -15-Dias .......	___..... _____	E.os.1—U—
Ί Grupo	ADJ/DOSE	Identificação	50% NT*	ELISA**._____
				titulo de ponto
				central
1	ALUM 3D	IP 111	< 100	576
	MPL/100gg	IP 123	< 100	301
		IP 151	< 100	411
		IP 167	< 100	630
		GMT		460
2	ALUM 3D	IP 101	< 100	1871
	MPL/20gg	IP 103	< 100	1641
		IP 105	< 100	1437
		IP 196	< 100	94
		GMT		802
3	3D MPLOW	IP 120	486	9043
	lOOgg	IP 125	282	5537
		IP 150	285	3981
		IP 152	918	10629
		GMT	435	6789
4 ·	3D MPLOW	IP 114	462	5413
	20gg	IP 117	576	5220
		IP 118	< 100	2529
		IP 197	804	5268 ‘
		GMT	322	4404

* Correspondendo ao recíproco da diluição do soro dando origem a

50% de redução da produção de antigénio em comparação com os controlos.

** Corresponde ao recíproco da diluição dó soro dando origem a uma absorção igual a 50% do valor de absorção máximo (título de ponto central)

GMT = Título Médio Geométrico

Quadro 5

RESPOSTA DE ANTICORPO ANTI-HIV EM CHIMPANZÉS VACINADOS COM RPG 160 E RPG 120

	Post I	Post II	Post III
20	dias	14	dias	20 dias	14 dias	2 0 d i a s
Vacina Chimp	Tit.	Neu t.	Tit. ELISA	Tit. Neut.	Tit.Neut.'	Elisa Tit.	nt. Neut.	Tit. Neut.
rgpl60(lOOgg)	1	<50	2592	<50/	50/	16509	200	400
3D MPL o/w	2	<50	9004	100	100	15665	200/	400
rgpl20 (100|lg)	3	<50	3059	100	100	22679	000	000
3D MPL o/w	4	<50	506	<50/	50	3917	200	200/

TITULO ELISA: corresponde ao recíproco da diluição do soro dando origem a uma absorção igual a 50% do valor de absorção máximo (título de ponto central).

TÍTULO NEUT.: corresponde ao recíproci da diluição do soro dando origem a 80% de protecção do efeito citopático do isolado IIIB

HIV1.

/: barra indica gue o título de neutralização se situa entre 2 diluições sucessivas do soro; por exemplo,. 200/ indica que o título se situa entre 200 e 400.

Quadro 6

RESPOSTA ANTICORPO ANTI-HSV EM CHIMPANZÉS VACINADOS

			Post	II		Post	III
		14	dias	20	dias	14 dias	dias
Vacina	Chimp.	Titulo Elisa	Titulo Neut.	Titulo Elisa	Titulo Neut.	Titulo Titulo Elisa Neut.		Titulo Titulo Elisa Neut.
	Nome
rgplGO(lOOgg) 3D MPL o/w	1	<100	<50

>

TÍTULO ELISA: corresponde ao recíproco da diluição do soro dando origem a uma absorção igual a 50% do valor de absorção máximo (título de ponto central).

TÍTULO NEUT.: corresponde ao recíproco da diluição do soro dando origem a 100% de protecção contra o efeito citopático de HSV2

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES:

   ia. - processo para a produção de uma proteína de HIV gplôO modificada em que amino-ácidos diferentes da Iisina ou arginina são proporcionados nas posições 502 e 510 independentemente, caracterizado por compreender a expressão de uma sequência ADN que codifica a referida proteína num hospedeiro eucariõtico recombinante.
2. 2§. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os amino-ácidos na posição 502 e 510 serem seleccionados de entre o grupo: histidina, treonina, serina, asparagina, ãcido aspártico, glutamina e ácido glutâmico.

   32. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por os amino-ácidos nas posições 502 e 510 serem ãcido glutâmico.

   42. - Processo para a produção de um oligómero ou dímero de uma gpl60 modificada em que amino-ácidos diferentes de Iisina ou arginina serem proporcionados nas posições 502 e 510 independentemente, caracterizado por compreender o isolamento da proteína modificada a partir de um hospedeiro recombinante e sua purificação em condições não redutoras.

   52. - Método para a produção de uma vacina ou composição farmacêutica, caracterizado por compreender a mistura de uma gpl60 modificada em que amino-ácidos diferentes de Iisina ou arginina são proporcionados na posição 502 e 510 independentemente, ou uma sua forma oligomérica, com um veículo farmaceuticamente aceitável.
3. 6§. - Método para produzir uma vacina ou composição farmacêutica, caracterizado por compreender a mistura de gpl60 ou de um seu derivado imunológico, e de monofosforil-lípido A 3D, com um veículo farmaceuticamente aceitável.