JP2009531444A - HIVTATタンパク質およびEnvタンパク質の共有結合的に連結された複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2006年3月28日に出願された米国仮出願第60/786,947号(この出願は、その全体が参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
HIVゲノム内でコードされる種々のタンパク質としては、エンベロープ糖タンパク質(Env)およびトランス活性化転写因子(Tat)が挙げられる。
EnvおよびTatタンパク質は、本発明の複合体中で一緒に共有結合する。タンパク質を共有結合するための種々の方法は、当該分野で公知であり、例えば、引用文献3および4を参照のこと。例えば、共有結合は、ホモ二官能性(homobifunctional)の架橋剤、ヘテロ二官能性の架橋剤または長さゼロの架橋剤の使用を包含し得る。これは、タンパク質中のスルフヒドリル基に対する試薬、タンパク質中のアミノ基に対する試薬、タンパク質中のカルボキシル基に対する試薬、チロシン選択性試薬、アルギニン特異的試薬、ヒスチジン特異的試薬、メチオニンアルキル化試薬、トリプトファン特異的試薬、セリン修飾試薬などを包含し得る。
本発明の複合体としては、共有結合するEnvおよびTatタンパク質が挙げられる。好ましい複合体は、本質的に1:1のモル比のEnvおよびTatを有する。従って、Envが三量体の形態である場合、好ましい複合体は3つのTat単量体を含む。
本発明の複合体は、HIVのEnvポリペプチドを含み、そして種々の形態のEnvポリペプチドがHIV−1またはHIV−2から用いられ得る。例えば、この複合体は、全長gp160Envポリペプチド、gp120Envポリペプチド、gp160またはgp120ポリペプチド(1つ以上の欠失を有する)、gp120またはgp160ポリペプチドを含む融合タンパク質などを含んでもよい。しかし、全長のEnv前駆体であるよりも、本発明は代表的には短くなったタンパク質を用いる。
(i)配列番号1、2、4、5、7、8および9から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(ii)配列番号1、2、4、5、7、8および9から選択されるアミノ酸配列に対して配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(iii)配列番号1、2、4、5、7、8および9から選択されるアミノ酸配列に対して比較して、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10など)の置換および/または欠失および/または挿入を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(iv)配列番号1、2、4、5、7、8および9から選択されるアミノ酸配列由来の少なくともn個の連続的なアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を含み、ここでnが7以上であるポリペプチド;あるいは
(v)ペアワイズアラインメントを用いて配列番号1、2、4、5、7、8および9から選択されるアミノ酸配列と配列された場合、N末端からC末端に動くxアミノ酸の各々のウインドウにおいて少なくともx・y同一の配列された単量体を有するpアミノ酸の配列を含むポリペプチドであって、ここで:p>x;p−x+1ウインドウがあり;xが20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800または850から選択され;yが0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98または0.99から選択され;そしてx・yが整数でない場合最も近い整数に切り上げられる、ポリペプチド。
本発明の複合体は、HIVのTatポリペプチドを包含し、そしてHIV−1またはHIV−2由来の種々の形態のTatポリペプチドが用いられ得る。Tatポリペプチドの長さは、ウイルス株に依存して変化する。REFSEQデータベース由来の全長HIV−1 Tatポリペプチドのアミノ酸配列(GI:9629358)は、下に示される86マーである(本明細書においては、配列番号10):
(i)配列番号10、11および12から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(ii)配列番号10、11および12から選択されるアミノ酸配列に対して配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(iii)配列番号10、11および12から選択されるアミノ酸配列に対して比較して、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10など)の置換および/または欠失および/または挿入を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(iv)配列番号10、11および12から選択されるアミノ酸配列由来の少なくともn個の連続的なアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を含み、ここでnが7以上であるポリペプチド;あるいは
(v)ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号10、11および12から選択されるアミノ酸配列と配列された場合、N末端からC末端に動くxアミノ酸の各々のウインドウにおいて少なくともx・y同一の配列された単量体を有するpアミノ酸の配列を含むポリペプチドであって、ここで:p>xである場合;p−x+1ウインドウがあり;xが20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、または85から選択され;yが0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98または0.99から選択され;そしてx・yが整数でない場合、最も近い整数に切り上げられる、ポリペプチド。
本発明の複合体は、免疫原性成分において活性成分として用いられ得る。これらの組成物は、免疫応答を惹起するために動物に投与され得る。この免疫応答としては好ましくは、体液性の応答(例えば、抗体応答、例えば、中和性の抗体応答)、ならびに/または、Envおよび/もしくはTatに対する細胞性応答が挙げられる。HIVに既に感染している患者では、免疫応答は、感染の重篤度を軽減(例えば、ウイルス負荷を軽減)し得、そしてHIV感染のクリアランスさえ生じ得る。HIVに感染していない患者では、免疫応答は、将来のHIV感染のリスクを軽減し得、そして将来のHIV感染に対して防御さえし得る。免疫原性組成物の投与から生じるこれらの効果は、他の抗HIVストラテジーの使用、例えば、限定はしないが、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、プロテアーゼインヒビター、進入インヒビター、融合インヒビターなどを含む抗ウイルス剤の投与によって増強され得るか、またはそれらを要するかもしれない。
本発明の組成物は有利には、組成物を投与される患者で惹起された免疫応答(体液性および/または細胞性)を増強するように機能し得るアジュバントを含んでもよい。本発明で用いられ得るアジュバントとしては、限定はしないが以下が挙げられる:
・ミネラル含有組成物であって、カルシウム塩およびアルミニウム塩(またはその混合物)を含む組成物。カルシウム塩は、リン酸カルシウム(例えば、引用文献40に開示される「CAP」粒子)を含む。アルミニウム塩としては、任意の適切な形態(例えば、ゲル、結晶、非結晶)をとる塩との、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられる。これらの塩に対する吸着が好ましい。ミネラル含有組成物はまた、金属塩の粒子として処方されてもよい[41]。アルミニウム塩アジュバントは下にさらに詳細に記載される。
ここで:
R1およびR2が各々独立して、H、ハロ、−NRaRb、−OH、C1−6アルコキシ、置換C1−6アルコキシ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、C6−10アリール、置換C6−10アリール、C1−6アルキル、または置換C1−6アルキルであり;
R3が、存在しないか、H、C1−6アルキル、置換C1−6アルキル、C6−10アリール、置換C6−10アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R4およびR5が各々独立して、H、ハロ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、−C(O)−Rd、C1−6アルキル、置換C1−6アルキルであるか、または一緒に結合して5員の環をR4−5:
X1およびX2は各々独立して、N、C、OまたはSである;
R8は、H、ハロ、−OH、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C2−6アルキニル、−OH、−NRaRb、−(CH2)n−O−Rc、−O−(C1−6アルキル)、−S(O)pRe、または−C(O)−Rdであり;
R9は、H、C1−6アルキル、置換C1−6アルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリルまたはR9aであり、
ここでR9aが:
R10およびR11は各々独立して、H、ハロ、C1−6アルコキシ、置換C1−6アルコキシ、−NRaRb、または−OHであり;
各々のRaおよびRbが独立して、H、C1−6アルキル、置換C1−6アルキル、−C(O)Rd、C6−10アリールであり;
各々のRcは独立して、H、リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、C1−6アルキル、または置換C1−6アルキルであり;
各々のRdは各々独立して、H、ハロ、C1−6アルキル、置換C1−6アルキル、C1−6アルコキシ、置換C1−6アルコキシ、−NH2、−NH(C1−6アルキル)、−NH(置換C1−6アルキル)、−N(C1−6アルキル)2、−N(置換C1−6アルキル)2、C6−10アリールまたはヘテロシクリルであり;
各々のReは独立して、H、C1−6アルキル、置換C1−6アルキル、C1−6アリール、置換C6−10アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
各々のRfは独立して、H、C1−6アルキル、置換C1−6アルキル、−C(O)Rd、リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩であり;
各々のnは独立して、0、1、2または3であり;
各々のpは独立して、0、1、2または3であるか;あるいは
(g)(a)〜(f)のいずれかの薬学的に受容可能な塩、(a)〜(f)のいずれかの互変異性体、またはその互変異性体の薬学的に受容可能な塩。
N2−メチル−1−(2−メチルプロピル)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2,4−ジアミン
N2,N2−ジメチル−1−(2−メチルプロピル)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2,4−ジアミン
N2−エチル−N2−メチル−1−(2−メチルプロピル)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2,4−ジアミン
N2−メチル−1−(2−メチルプロピル)−N2−プロピル−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2,4−ジアミン
1−(2−メチルプロピル)−N2−プロピル−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2,4−ジアミン
N2−ブチル−1−(2−メチルプロピル)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2,4−ジアミン
N2−ブチル−N2−メチル−1−(2−メチルプロピル)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2,4−ジアミン
N2−メチル−1−(2−メチルプロピル)−N2−ペンチル−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2,4−ジアミン
N2−メチル−1−(2−メチルプロピル)−N2−プロプ−2−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2,4−ジアミン
1−(2−メチルプロピル)−2−[(フェニルメチル)チオ]−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−4−アミン
1−(2−メチルプロピル)−2−(プロピルチオ)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−4−アミン
2−[[4−アミノ−1−(2−メチルプロピル)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2−イル](メチル)アミノ]エタノール
2−[[4−アミノ−1−(2−メチルプロピル)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2−イル](メチル)アミノ]エチルアセテート
4−アミノ−1−(2−メチルプロピル)−1,3−ジヒドロ−2H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2−オン
N2−ブチル−1−(2−メチルプロピル)−N4,N4−ビス(フェニルメチル)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2,4−ジアミン
N2−ブチル−N2−メチル−1−(2−メチルプロピル)−N4,N4−ビス(フェニルメチル)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2,4−ジアミン
N2−メチル−1−(2−メチルプロピル)−N4,N4−ビス(フェニルメチル)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2,4−ジアミン
N2,N2−ジメチル−1−(2−メチルプロピル)−N4,N4−ビス(フェニルメチル)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2,4−ジアミン
1−{4−アミノ−2−[メチル(プロピル)アミノ]−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−1−イル}−2−メチルプロパン−2−オール
1−{4−アミノ−2−(プロピルアミノ)−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−1−イル}−2−メチルプロパン−2−オール
N4,N4−ジベンジル−1−(2−メトキシ−2−メチルプロピル)−N2−プロピル−1H−イミダゾ[4,5−c]キノリン−2,4−ジアミン。
Rが、水素、直鎖または分枝した、非置換または置換の、飽和したまたは不飽和のアシル、アルキル(例えば、シクロアルキル)、アルケニル、アルキニルおよびアリール基、またはその薬学的に受容可能な塩もしくは誘導体を含む群より選択される。例としては限定はしないが以下が挙げられる:カスアリン(casuarine)、カスアリン−6−α−D−グルコピラノース、3−エピ−カスアリン、7−エピ−カスアリン、3,7−ジエピ−カスアリンなど。
水中油型エマルジョンはアジュバントとして特に有用である。種々のこのようなエマルジョンが公知であり、そしてそれらは代表的には少なくとも1つのオイルおよび少なくとも1つのサーファクタントを含み、そしてこのオイルおよびサーファクタントは、生分解性(代謝可能)で、かつ生体適合性である。エマルジョン中の油滴は一般には直径5μm未満であり、サブミクロンの直径を有してさえよく、これらの小さいサイズは、安定なエマルジョンを得るためにマイクロフルイダイザーで達成される。濾過滅菌に供することができるので、サイズが220nm未満の小滴が好ましい。
・スクアレン、Tween80およびSpan85のサブミクロンのエマルジョン。容積あたりのエマルジョンの組成物は、約5%のスクアレン、約0.5%のポリソルベート80および約0.5%のSpan85であってもよい。重量に関しては、これらの比は、4.3%のスクアレン、約0.5%のポリソルベート80および約0.48%のSpan85になる。このアジュバントは、引用文献118の第10章、および引用文献119の第12章にさらに詳細に記載されるように、「MF59」として公知である[115〜117]。このMF59エマルジョンは有利には、クエン酸イオン、例えば、10mMのクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントが用いられてもよい。これらの名称は慣習的であるが、存在する実際の化合物の正確な説明ではなく、簡便のために用いられているに過ぎない(例えば、引用文献118の第9章を参照のこと)。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される任意の「水酸化物(hydroxide)」または「リン酸塩(phosphate)」アジュバントを用いてもよい。
ある組成物が、患者に対する送達のための2つの成分、例えば、Env/Tat複合体およびアジュバントを含む場合、これらは、製造の間に混合されてもよいし、またはそれらは、送達の時点で即席に混合されてもよい。従って、本発明は、混合の準備が整った種々の成分を含むキットを提供する。このキットによって、アジュバントおよび複合体は、使用時点まで別々に保持することが可能になる。この構成は水中油型エマルジョンアジュバントを用いる場合、特に有用である。
本発明は、患者において免疫応答を惹起する方法を提供し、この方法は、この患者に対して本発明の組成物を投与する工程を包含する。本発明の組成物はヒト患者に投与するために特に適切であるが、また研究目的のため、抗血清を惹起するためなどのために他の哺乳動物に投与されてもよい。
「含む、包含する(comprising)」という用語は、「含む、包含する(including)」および「含む、からなる(consisting)」を包含する。例えば、ある組成物が、Xを「含む(cmprising)」とは、排他的にXからなってもよいし、または何か追加のものを含んでもよい、例えばX+Y。
(EnvおよびTatの非共有結合)
4つの形態のEnvタンパク質を、HIV−1のSF162株から調製した:gp120;gp120ΔV2;gp140;およびgp140ΔV2。gp120分子は、単量体であるが、gp140分子は三量体である。これらの4つのタンパク質は、前に記載されている(例えば、引用文献12、138および139)。要するに、HIV−1 SF162およびHIV−1 SF162ΔV2単離体由来のEnvエクトドメインをコードする配列を、前に記載されたように[138]コドン改変して、2.1kbのEcoRI−XbaIDNAフラグメントとして合成的に構築した。この遺伝子カセットは、効率的な分泌のためにヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ(TPA)シグナル配列にインフレームで融合されたEnvタンパク質のタンパク質コード領域を含んだ。コードされたオリゴマータンパク質のオリゴマー構造を安定化するために、Envポリペプチドにおける一次(REKR)および二次(KAKRR)プロテアーゼ切断部位を改変した[138]。得られたEnv発現カセット(gp120SF162、gp120SF162ΔV2、gp140SF162およびgp140SF162ΔV2)を、293細胞の一過性トランスフェクションのため、そしてまた安定なCHO細胞株の発達のためにpCMV3発現ベクターのEcoRI−XbaI部位にクローニングした。このベクターは、サイトメガロウイルスのエンハンサー/プロモーターエレメント、アンピシリン耐性遺伝子、ならびにジヒドロ葉酸還元酵素および減弱ネオマイシン耐性タンパク質から構成される融合タンパク質をコードする配列を含む。
Env/Tat複合体を安定化するために、ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドを、図14に図示される反応スキームに従い架橋試薬として用いた。それらは、18の異なる条件下で試験した:
Claims (9)
- HIVのEnvポリペプチドおよびHIVのTatポリペプチドを含む複合体であって、(i)該EnvおよびTatポリペプチドが共有結合され、かつ(ii)該複合体がCD4に特異的に結合し得る、複合体。
- HIVのEnvポリペプチドおよびHIVのTatポリペプチドを含む複合体を調製するためのプロセスであって、CD4に対してEnvタンパク質が特異的に結合する能力を除去することなくEnvおよびTatポリペプチドが互いに共有結合するようになる反応条件下で、EnvおよびTatポリペプチドを相互作用させる工程を包含する、プロセス。
- 前記EnvおよびTatがHIV−1由来である、請求項1〜2のいずれか一項に記載の複合体またはプロセス。
- 前記EnvおよびTatがHIV−1のM群由来である、請求項3に記載の複合体またはプロセス。
- 前記EnvおよびTatがサブタイプB株由来である、請求項4に記載の複合体またはプロセス。
- 前記EnvおよびTatがサブタイプC株由来である、請求項4に記載の複合体またはプロセス。
- 前記EnvおよびTatがホモ二官能性架橋剤を介して連結される、請求項1〜6のいずれか一項に記載される複合体またはプロセス。
- 前記EnvおよびTatがホルムアルデヒドまたはジアルデヒドとの反応を介して連結される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の複合体またはプロセス。
- 前記EnvおよびTatが本質的に1:1のモル比で存在する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の複合体またはプロセス。
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