JP2023529483A - Ｈｉｖワクチン組成物、方法、及びその使用 - Google Patents

Abstract

本開示は、一部の態様では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ウイルス抗原及び免疫原、例えばｇｐ１２０タンパク質ペプチドを含む組換えペプチド及びタンパク質を含む免疫原性組成物に関する。一部の態様では、免疫原性組成物は、自己三量体化してジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質を形成することが可能な、コラーゲンのＣ末端部分にインフレーム融合で接合されている可溶性ＨＩＶウイルス抗原を含む分泌融合タンパク質を含む。一部の態様では、本明細書で提供される免疫原性組成物は、免疫応答を生成するために、例えば、ＨＩＶ感染を治療または予防するために有用である。一部の態様では、本明細書で提供される免疫原性組成物は、ワクチン組成物に、例えば、予防用及び／または療法用ワクチンの一部として使用され得る。また、本明細書では、組換えペプチド及びタンパク質を産生するための方法、予防、療法、及び／または診断方法、ならびに関連キットが提供される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月１０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０９５３３５号、及び２０２１年４月１３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０８７０５４号に対する優先権及び利益を主張するものであり、これら出願の開示は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

ＡＳＣＩＩテキストファイルとしての配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルの以下の提出物の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピューター可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１６５７６２０００４４２ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年６月９日、サイズ：１８６ＫＢ）。

本開示は、一部の態様では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ウイルス抗原及び免疫原、例えば、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドを含む組換えペプチド及びタンパク質を含む、ＨＩＶ感染を治療及び／または予防するための免疫原性組成物に関する。

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）としては、ヒトに感染する２種のレンチウイルスが挙げられ、時間の経過と共に後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こす可能性がある。ＨＩＶ １に対するワクチン接種は現在利用可能ではない。臨床試験では、ＨＩＶのすべてのティア（ｔｉｅｒ）に対する広域中和抗体を生成することに成功していない。戦略の向上が必要とされている。

本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）としては、ヒトに感染する２種のレンチウイルスが挙げられ、それらのウイルスに対抗するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ウイルス抗原及び免疫原、ＨＩＶ感染を治療及び／または予防するための免疫原性組成物を提供する。

一部の実施形態では、本明細書には、ジスルフィド結合連結ホモ三量体を形成することが可能なコラーゲンのＣ－プロペプチドにインフレームで融合されている、ＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質などのＨＩＶタンパク質の外部ドメイン（例えば、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを有しない）またはその断片を含む組換えサブユニットワクチンが開示される。ｇｐ１２０三量体などの得られる組換えサブユニットワクチンは、トランスフェクトした細胞から発現及び精製することができ、三量体形態の天然様立体構造をとることが予想される。これにより、ウイルス抗原が、膜貫通ドメイン及び／または細胞質ドメインを有しない可溶性形態の組換えペプチドまたはタンパク質として発現される場合に遭遇することが多い、ウイルス抗原のミスフォールディングの問題が解決される。そのようなミスフォールディングしたウイルス抗原は、天然ウイルス抗原立体構造を忠実には保存せず、中和抗体を誘発することができないことが多い。

一態様では、本明細書では、複数の組換えポリペプチドを含むタンパク質であって、各組換えポリペプチドは、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに連結されたＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープを含み、組換えポリペプチドのＣ末端プロペプチドは、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する、タンパク質が提供される。

任意の実施形態の一部では、ＨＩＶは、ＨＩＶ－１であり、任意選択で、ティア１Ｂ（ｔｉｅｒ１Ｂ）、ティア１Ａ（ｔｉｅｒ１Ａ）、ティア２（ｔｉｅｒ２）、またはティア３（ｔｉｅｒ３）ウイルスである。任意の実施形態の一部では、エピトープは、線状エピトープまたは立体構造エピトープである。

任意の実施形態の一部では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、外側ドメインサブユニットペプチド、内側ドメインサブユニットペプチド、またはそれらの任意の組合せを含み、このタンパク質は、３つの組換えポリペプチドを含む。任意の実施形態の一部では、任意選択で架橋シートにより隔てられている、ｇｐ１２０タンパク質は、１、２、３、４、または５つのＣ領域及び１、２、３、４、または５つの可変領域を含む。一部の実施形態では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、ｇｐ１２０タンパク質の外側サブユニットまたは内側サブユニットを含む。任意の実施形態の一部では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、ｇｐ１２０タンパク質の内側サブユニット及び外側サブユニットを含み、任意選択で、外側サブユニット及び内側サブユニットは、ジスルフィド結合または人工的に導入されたリンカーにより連結されている。任意の実施形態の一部では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、膜貫通（ＴＭ）ドメインペプチド及び／または細胞質（ＣＰ）ドメインペプチドを含まない。

任意の実施形態の一部では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、プロテアーゼ切断部位を含み、プロテアーゼは、任意選択で、フリン、ＴＭＰＲＳＳ２などの膜貫通セリンプロテアーゼ、トリプシン、第Ｘａ因子、トロンビン、またはカテプシンＬである。任意の実施形態の一部では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、プロテアーゼ切断部位を含まず、プロテアーゼは、任意選択で、フリン、ＴＭＰＲＳＳ２などの膜貫通セリンプロテアーゼ、トリプシン、第Ｘａ因子、トロンビン、またはカテプシンＬである。

任意の実施形態の一部では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、可溶性であるか、または脂質二重層、例えば、膜もしくはウイルスエンベロープに直接的に結合しない。任意の実施形態の一部では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、タンパク質の組換えポリペプチド間で同じであるかまたは異なる。実施形態のいずれかの一部では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、Ｃ末端プロペプチドに直接的に融合されているか、またはグリシン－Ｘ－Ｙリピートを含むリンカーであって、Ｘ及びＹは独立して任意のアミノ酸であり、任意選択でプロリンもしくはヒドロキシプロリンである、リンカーなどのリンカーを介してＣ末端プロペプチドに連結されている。

任意の実施形態の一部では、本提供のタンパク質は可溶性である。任意の実施形態の一部では、このタンパク質は、脂質二重層、例えば、膜またはウイルスエンベロープに直接的に結合しない。任意の実施形態の一部では、このタンパク質は、対象の細胞表面付着因子または受容体に結合することが可能であり、任意選択で、対象は、霊長類、例えばヒトなどの哺乳動物である。

任意の実施形態の一部では、Ｃ末端プロペプチドは、ヒトコラーゲンのものである。任意の実施形態の一部では、Ｃ末端プロペプチドは、ｐｒｏα１（Ｉ）、ｐｒｏα１（ＩＩ）、ｐｒｏα１（ＩＩＩ）、ｐｒｏα１（Ｖ）、ｐｒｏα１（ＸＩ）、ｐｒｏα２（Ｉ）、ｐｒｏα２（Ｖ）、ｐｒｏα２（ＸＩ）、もしくはｐｒｏα３（ＸＩ）のＣ末端ポリペプチド、またはその断片を含む。任意の実施形態の一部では、Ｃ末端プロペプチドは、組換えポリペプチド間で同じであるかまたは異なる。

任意の実施形態の一部では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号３１～４６のいずれか１つ、またはポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することが可能な、それと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。

任意の実施形態の一部では、各組換えポリペプチド中のｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、融合前立体構造または融合後立体構造をとる。

任意の実施形態の一部では、各組換えポリペプチド中のｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、配列番号１９～３０のいずれか、またはそれと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。

任意の実施形態の一部では、組換えポリペプチドは、配列番号１～１８のいずれか、またはそれと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。

本明細書では、本提供のタンパク質のいずれかを含む免疫原などの免疫原が提供される。また、本明細書では、ナノ粒子に直接的または間接的に連結された本提供のタンパク質のいずれかを含むタンパク質ナノ粒子などの、タンパク質ナノ粒子が提供される。また、本明細書では、本提供のタンパク質のいずれかを含むＶＬＰなどのウイルス様粒子（ＶＬＰ）が提供される。

また、本明細書では、本提供のタンパク質のいずれかの組換えポリペプチドの１つ、２つ、３つ、またはそれよりも多くをコードする単離された核酸などの核酸が提供される。一部の実施形態では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドをコードするポリペプチドは、コラーゲンのＣ末端プロペプチドをコードするポリペプチドにインフレームで融合されている。

一部の実施形態では、単離された核酸は、プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、単離された核酸は、プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、単離された核酸はＤＮＡ分子である。

一部の実施形態では、単離された核酸はＲＮＡ分子、任意選択で、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ、非増幅ｍＲＮＡ、自己増幅ｍＲＮＡ、またはトランス増幅ｍＲＮＡなどのｍＲＮＡ分子である。

本明細書では、本提供の核酸のいずれかを含むベクターなどのベクターが提供される。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。

また、本明細書では、本明細書で提供されるベクターのいずれかを含むウイルス、偽ウイルス、または細胞が提供され、任意選択で、ウイルスまたは細胞は、組換えゲノムを有する。

本明細書では、本提供のタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、または細胞のいずれか、及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物が提供される。

本明細書では、本提供の免疫原性組成物のいずれかを、任意選択でアジュバント中に含むワクチン組成物であって、ワクチンは任意選択でサブユニットワクチンである、ワクチン組成物を含む。一部の実施形態では、ワクチンは、予防用及び／または療法用ワクチンである。

また、本明細書では、タンパク質を産生するための方法であって、本提供の単離された核酸またはベクターのいずれかを宿主細胞内で発現させて、本提供のタンパク質のいずれかを産生すること；及びタンパク質を精製することを含む方法が提供される。本明細書では、この方法により産生されるタンパク質が提供される。

本明細書では、対象においてＨＩＶウイルスのｇｐ１２０タンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープに対する免疫応答を生成するための方法であって、本提供のタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、細胞、免疫原性組成物、またはワクチンのいずれかの治療有効量を対象に投与して、免疫応答を生成することを含む方法が提供される。

一部の実施形態では、この方法は、ＨＩＶウイルスによる感染を治療または予防するためのものである。一部の実施形態では、免疫応答の生成は、対象におけるＨＩＶの複製を阻害または低減させる。一部の実施形態では、免疫応答は、任意選択で、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体などの１つまたは複数の中和抗体の産生を含む、細胞媒介姓応答及び／または体液性応答を含む。一部の実施形態では、免疫応答は、ＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープに対するものであるが、Ｃ末端プロペプチドに対するものではない。

任意の実施形態の一部では、投与は、１つまたは複数のＨＩＶウイルスに以前に曝露されたための抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を対象にもたらさない。一部の実施形態では、投与は、１つまたは複数のＨＩＶウイルスにその後曝露されたための抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を対象にもたらさない。

一部の実施形態では、この方法は、予備刺激ステップ及び／または追加免疫ステップをさらに含む。

任意の実施形態の一部では、投与ステップは、局部的、経皮、皮下、皮内、経口、鼻腔内（例えば、鼻腔内噴霧）、気管内、舌下、頬側、直腸、膣、吸入、静脈内（例えば、静脈内注射）、動脈内、筋肉内（例えば、筋肉内注射）、心臓内、骨内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局所、または皮膚上投与により実施される。任意の実施形態の一部では、有効量は、単一用量または１つもしくは複数の間隔で隔てられている一連の用量で投与される。任意の実施形態の一部では、有効量は、アジュバントを伴わずに投与される。任意の実施形態の一部では、有効量は、アジュバントと共に投与される。

本明細書では、有効量の本提供のタンパク質のいずれかを対象に投与して、対象においてＨＩＶウイルスに対する中和抗体または中和抗血清を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、任意選択で、ヒトまたは非ヒト以霊長類である。

任意の実施形態の一部では、この方法は、中和抗体または中和抗血清を対象から単離することをさらに含む。任意の実施形態の一部では、この方法は、ＨＩＶウイルスによる感染を予防または治療するために、単離された中和抗体または中和抗血清の有効量を受動免疫によりヒト対象に投与することをさらに含む。任意の実施形態の一部では、中和抗血清は、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープに対するポリクローナル抗体を含み、任意選択で、中和抗体は、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに対する抗体を含まないかまたは実質的に含まない。任意の実施形態の一部では、中和抗体は、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープに対するモノクローナル抗体を含み、任意選択で、中和抗体は、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに対する抗体を含まないかまたは実質的に含まない。

任意の実施形態の一部では、本提供のタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、細胞、免疫原性組成物、またはワクチンのいずれかは、対象におけるＨＩＶウイルスに対する免疫応答の誘導及び／またはＨＩＶウイルスによる感染の治療もしくは予防に使用するためのものである。

本明細書では、対象においてＨＩＶウイルスに対する免疫応答を誘導するための、及び／またはＨＩＶウイルスによる感染を治療もしくは予防するための、本提供のタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、細胞、免疫原性組成物、またはワクチンのいずれかの使用が提供される。

本明細書では、対象においてＨＩＶウイルスに対する免疫応答を誘導するための、及び／またはＨＩＶウイルスによる感染の治療もしくは予防するための薬剤または予防薬を製造するための、本提供のタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、細胞、免疫原性組成物、またはワクチンのいずれかの使用が提供される。

また、本明細書では、試料を分析するための方法であって、試料を、本提供のタンパク質のいずれかと接触させること、及び本タンパク質と、ＨＩＶウイルスのｇｐ１２０タンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープに特異的に結合することが可能な分析物との間の結合を検出することを含む方法が提供される

任意の実施形態の一部では、分析物は、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープを認識する抗体、受容体、または細胞である。任意の実施形態の一部では、結合は、試料中の分析物の存在、及び／または試料が由来する対象におけるＨＩＶによる感染を示す。

また、本明細書では、本提供のタンパク質のいずれか、及び本タンパク質を含むかまたは固定化する基材、パッド、またはバイアルを含むキットが提供され、任意選択でキットは、ＥＬＩＳＡまたはラテラルフローアッセイキットである。

図１は、ＨＩＶ ｇｐ１２０を含む例示的な融合タンパク質の発現レベルを示す図である。８５ＵＳ＿Ｂａ－Ｌ ｇｐ１２０ ｅｎｖ遺伝子は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）発現の最適化後に、ｇｐ１２０ ＮＣＢＩ受入番号ＤＱ３１８２１０．１を使用してＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（南京）が合成した。図１Ａは、ｇｐ１２０糖タンパク質をコードする遺伝子断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩ部位を介してｐＴｒｉｍｅｒタグベクターにクローニングしたことを示す。 図１Ｂは、構築物を、ＣＨＯ－Ｓ ｄｈｆｒ－／－細胞株に安定的にトランスフェクトし、上清を、まず５ｍＬのＢｌｕｅ－セファロース親和性精製カラムに流し、三量体画分を単離し、ＨＩＶ ｇｐ１２０を含む単離された例示的な融合タンパク質の純度を示している。 図１Ｃは、構築物を、ＣＨＯ－Ｓ ｄｈｆｒ－／－細胞株に安定的にトランスフェクトし、上清を、まず５ｍＬのＢｌｕｅ－セファロース親和性精製カラムに流し、三量体画分を単離し、ＨＩＶ ｇｐ１２０を含む単離された例示的な融合タンパク質の純度を示している。 図２Ａは、ＨＩＶ－１膜の表面上の成熟Ｅｎｖ三量体タンパク質の代表的な説明図を図示する図である。 図２Ｂは、ｇｐ１２０－三量体ネガティブ染色電子顕微鏡法（ＥＭ）画像に基づくｇｐ１２０－三量体融合タンパク質の代表的な説明図である。 図２Ｃは、例示的な融合タンパク質単独及びＢ１２またはＣＤ４との複合体を、ネガティブ染色電子顕微鏡法により分析した図である。結果は、ｇｐ１２０－三量体融合タンパク質の天然様構造を示す。 図３は、幾つかの広域中和抗体（ｂＮＡｂ）に対して評価した、ＨＩＶ ｇｐ１２０を含む例示的な融合タンパク質の結合動力学を図示する図である。結果は、ｇｐ１２０－三量体融合タンパク質が、高い特異性でｂＮＡｂに結合することを示す。 図４は、例示的な融合タンパク質を、２０ｍＭ ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でビオチン標識し、次いでストレプトアビジン（ＳＡ）センサーに付着させ、１０μｇ／ｍＬビオチン－ｇｐ１２０－三量体でコーティングしたプレート内に３００秒間負荷し、加えて、結合動力学を、ｆｏｒｔｅｂｉｏ ＯＣＴＥＴ ＱＫｅ Ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）システム（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ）により３０℃で測定した図を示す。結果は、ｇｐ１２０－三量体融合タンパク質が、ｂＮＡｂ及びＣＤ４に対する高い親和性及び強固な結合動力学を呈することを示す。 図５は、ＮＩＨ４５－４６、ＰＧ９、及び４４７－５２ＤなどのｂＮＡｂに対する結合動力学を示す図である。結果は、ｇｐ１２０－三量体が、高度に免疫原性であり、ウサギ免疫モデルにおいて抗体を誘導することを示す。 図６Ａは、例示的なＨＩＶ ｇｐ１２０融合タンパク質による免疫化のウサギ免疫化モデルにおいて、ティア１Ａ及びティア１Ｂ（図６Ａ）に対するものを含むＨＩＶ－１中和抗体を誘導することが観察されたことを示す。 図６Ｂは、例示的なＨＩＶ ｇｐ１２０融合タンパク質による免疫化のウサギ免疫化モデルにおいて、ティア２ウイルスに対するものを含むＨＩＶ－１中和抗体を誘導することが観察されたことを示す。 図６Ｃは、例示的なＨＩＶ ｇｐ１２０融合タンパク質による免疫化も、高いパーセントの広域中和抗体を誘導したことがわかったことを示す。結果は、ｇｐ１２０－三量体が、ウサギ免疫化モデルにおいてＨＩＶ－１中和抗体を誘導することを示す。

一部の実施形態では、共有結合で連結された三量体形態の、ＲＮＡウイルスに由来する組換え可溶性表面抗原の組成物及び使用方法が開示される。一部の実施形態では、得られる融合タンパク質は、構造がより安定であり、天然様三量体ウイルス抗原の立体構造を維持し、したがってこうした危険な病原体に対するより効果的なワクチンとして使用することができるジスルフィド結合連結ホモ三量体として分泌される。

一部の実施形態では、本明細書では、ウイルス抗原三量体を、ワクチンとしてまたは多価ワクチンの一部として、アジュバントを伴わずにもしくはアジュバントと共にまたは１つよりも多くのアジュバントと共に、任意選択で筋肉内注射または鼻腔内投与のいずれかにより使用して、ウイルス感染を予防するための方法が開示される。

一部の実施形態では、本明細書では、中和抗体などのウイルス抗原を認識する抗体、例えばＩｇＭまたはＩｇＧを検出することによりウイルス感染を診断するための抗原として、ウイルス抗原三量体を使用するための方法が開示される。

一部の実施形態では、本明細書では、ウイルス抗原三量体を抗原として使用して、受動免疫のために使用することができるポリクローナルまたはモノクローナル抗体、例えばＨＩＶ感染を予防または治療するための中和ｍＡｂを生成するための方法が開示される。

一部の実施形態では、本明細書では、ワクチンとしてのまたは多価ワクチンの一部としてのウイルス抗原三量体であって、ワクチンは、ウイルスの同じタンパク質のウイルス抗原を含むか、あるいは１つもしくは複数のウイルスまたは同じウイルスの１つもしくは複数の株の２つまたはそれよりも多くの異なるタンパク質のウイルス抗原を含む複数の三量体サブユニットワクチンを含む、ウイルス抗原三量体が開示される。

一部の実施形態では、本明細書では、本明細書で開示のウイルス抗原三量体を含む一価ワクチンが開示される。一部の実施形態では、本明細書では、本明細書で開示のウイルス抗原三量体を含む二価ワクチンが開示される。一部の実施形態では、本明細書では、本明細書で開示のウイルス抗原三量体を含む三価ワクチンが開示される。一部の実施形態では、本明細書では、本明細書で開示のウイルス抗原三量体を含む四価ワクチンが開示される。

一部の実施形態では、本明細書では、エンベロープ糖タンパク質三量体（例えば、ｇｐ１６０－またはｇｐ１２０－またはｇｐ４１－三量体）を含む一価ワクチンが開示される。一部の実施形態では、本明細書では、エンベロープ糖タンパク質三量体（例えば、ｇｐ１６０－またはｇｐ１２０－またはｇｐ４１－三量体）を含む二価ワクチンが開示される。一部の実施形態では、本明細書では、第１のエンベロープ糖タンパク質抗原を含む少なくとも１つのエンベロープ糖タンパク質三量体（例えば、ｇｐ１６０－またはｇｐ１２０－またはｇｐ４１－三量体）及び第２のエンベロープ糖タンパク質抗原を含む少なくとも１つのエンベロープ糖タンパク質三量体（例えば、ｇｐ１６０－またはｇｐ１２０－またはｇｐ４１－三量体）を含む二価ワクチンが開示される。一部の実施形態では、第１及び第２のエンベロープ糖タンパク質抗原は、１つまたは複数のウイルス種または株／サブタイプの同じエンベロープ糖タンパク質に由来するか、あるいは１つもしくは複数のウイルス種または同じウイルス種の１つもしくは複数の株／サブタイプの２つまたはそれよりも多くの異なるエンベロープ糖タンパク質に由来する。一部の実施形態では、本明細書では、エンベロープ糖タンパク質三量体（例えば、ｇｐ１６０－またはｇｐ１２０－またはｇｐ４１－三量体）を含む三価ワクチンが開示される。一部の実施形態では、本明細書では、第１のエンベロープ糖タンパク質抗原を含む少なくとも１つのエンベロープ糖タンパク質三量体（例えば、ｇｐ１６０－またはｇｐ１２０－またはｇｐ４１－三量体）、第２のエンベロープ糖タンパク質抗原を含む少なくとも１つのエンベロープ糖タンパク質三量体（例えば、ｇｐ１６０－またはｇｐ１２０－またはｇｐ４１－三量体）、及び第３のエンベロープ糖タンパク質抗原を含む少なくとも１つのエンベロープ糖タンパク質－三量体（例えば、ｇｐ１６０－またはｇｐ１２０－またはｇｐ４１－三量体）を含む三価ワクチンが開示される。一部の実施形態では、第１、第２、及び第３のエンベロープ糖タンパク質抗原は、１つまたは複数のウイルス種または株／サブタイプの同じエンベロープ糖タンパク質に由来するか、あるいは１つもしくは複数のウイルスまたは同じウイルス種の１つもしくは株／サブタイプの２つ、３つ、またはそれよりも多くの異なるエンベロープ糖タンパク質に由来する。一部の実施形態では、本明細書では、エンベロープ糖タンパク質三量体（例えば、ｇｐ１６０－またはｇｐ１２０－またはｇｐ４１－三量体）を含む四価ワクチンが開示される。一部の実施形態では、本明細書では、第１のエンベロープ糖タンパク質抗原を含む少なくとも１つのエンベロープ糖タンパク質三量体（例えば、ｇｐ１６０－またはｇｐ１２０－またはｇｐ４１－三量体）、第２のエンベロープ糖タンパク質抗原を含む少なくとも１つのエンベロープ糖タンパク質三量体（例えば、ｇｐ１６０－またはｇｐ１２０－またはｇｐ４１－三量体）、第３のエンベロープ糖タンパク質抗原を含む少なくとも１つのエンベロープ糖タンパク質－三量体（例えば、ｇｐ１６０－またはｇｐ１２０－またはｇｐ４１－三量体）、及び第４のエンベロープ糖タンパク質抗原を含む少なくとも１つのエンベロープ糖タンパク質－三量体（例えば、ｇｐ１６０－またはｇｐ１２０－またはｇｐ４１－三量体）を含む四価ワクチンが開示される。一部の実施形態では、第１、第２、第３、及び第４のエンベロープ糖タンパク質抗原は、１つまたは複数のウイルス種または株／サブタイプの同じエンベロープ糖タンパク質に由来するか、あるいは１つもしくは複数のウイルスまたは同じウイルス種の１つもしくは複数の株／サブタイプの２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多くの異なるエンベロープ糖タンパク質に由来する。一部の実施形態では、本明細書では、ＢＧ５０５に由来する少なくとも１つのｇｐ１２０－三量体、Ｂ４１に由来する少なくとも１つのｇｐ１２０－三量体、及びＣＨ５０５に由来する少なくとも１つのｇｐ１２０－三量体を含むワクチンが開示される。

本明細書では、ＨＩＶ感染の治療、例えば予防、療法のためのＨＩＶウイルス抗原または免疫原を含む組換えポリペプチドペプチド及びタンパク質の免疫原性組成物、方法、及び使用が提供される。ＨＩＶとしては、ヒトに感染する２種のレンチウイルスが挙げられ、時間の経過と共に後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こす可能性がある。ＡＩＤＳは、免役系の進行性不全により、生命を脅かす感染症及びがんの増進が可能になる状態である。治療を行わない場合、ＨＩＶによる感染後の平均生存期間は９～１１年であると推定される。

ＨＩＶ感染は、血液、尿道球腺液、精液、及び膣液との接触及びそれらの移行により、性行為で伝染する可能性がある。ＨＩＶ感染は、非性行為によっても、例えば、妊娠、出産、及び／または授乳中に、感染母親からその乳児に伝染する可能性がある。

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染に起因する主な免疫学的異常は、ＣＤ４細胞表面糖タンパク質を発現するＴリンパ球の進行性枯渇及び機能障害である。ＡＩＤＳに特徴的な日和見感染及び悪性腫瘍に結び付く細胞性免疫及び体液性免疫の深刻な欠損の根底には、おそらくは、ＣＤ４ヘルパー／インデューサーＴ細胞機能の喪失がある（Ｌａｎｅら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３巻：４７７頁，１９８５年）。正常ドナー及びＡＩＤＳ患者から分画されたＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞のＨＩＶ－１感染に関する研究は、ＣＤ４ Ｔ細胞の枯渇が、選択的に感染し、その中で複製し、最終的にこのＴリンパ球サブセットを破壊するＨＩＶ－１の能力に起因することを明らかにした（Ｋｌａｔｚｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２５巻：５９頁、１９８４年）。ＡＩＤＳは、１９８０年代初頭に発見されて以来、パンデミックとなり、２，５００万人よりも多くの死亡を引き起こした。現在、世界中でおよそ３，５００万人がＨＩＶ／ＡＩＤＳと共に生きており、この疾患の効果的で手頃な価格の長期的な治療及び管理が緊急に必要とされている。

ＨＩＶは、様々な細胞タイプに感染することができるが、ｉｎ ｖｉｖｏでの主要な細胞標的は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びマクロファージである。宿主細胞への進入は、抗ＨＩＶ－１薬により標的とすることができる、ＨＩＶ－１ライフサイクルにおける必須ステップである。ＨＩＶ－１進入は、３つのｇｐ１２０サブユニット及び３つのｇｐ４１サブユニットを含むウイルススパイク（Ｅｎｖ）により媒介される（図２Ａ）。ＨＩＶが付着に使用するｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質は、まずＣＤ４受容体に係合し、次いでＣＣＲ５共受容体に結合した際に、受容体駆動性立体構造変化を起こして、ウイルス及び宿主細胞膜の融合を引き起こす。無細胞ウイルス粒子の宿主細胞への進入に重要であることは別にして、ｇｐ１２０とＣＤ４及びＣＣＲ５との相互作用は、ウイルス学的シナプスを介した細胞間伝達によるウイルスの拡散にも関与が示唆されている（Ａｃｈａｒｙａら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ（１９巻）６号：７６５～７８３頁、２０１５年）。

高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）の普及により、ＨＩＶに感染した多数の個体の臨床経過が劇的に改善された（Ｂｅｒｒｅｙら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１８３巻（１０号）：１４６６頁、２００１年）。しかしながら、長期ＨＡＡＲＴに伴う毒性により、毒性のより低い療法の設計及び開発に高い優先性が置かれてきた。

以前の成功しなかったＨＩＶワクチンの試みとしては、ｇｐ１２０単量体、非天然ｇｐ１４０タンパク質、ｇｐ１２０コア及び外側ドメイン（ＯＤ）タンパク質、エピトープ特異的スキャフォールド、ならびにエピトープベースペプチドの使用が挙げられる（Ｓｌｉｅｐｅｎ ２０１６年）。可溶性三量体を製作するための１つの十分に研究された手法は、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４であり、これは、分子間ジスルフィド結合を導入してｇｐ１２０－ｇｐ４１ＥＣＴＯ相互作用を強化することにより、天然ｇｐ１４０－三量体立体構造を模倣しようとする試みである（Ｂｉｎｌｅｙ ２０００年、Ｂｉｎｌｅｙ ２００２年、Ｓａｎｄｅｒｓ ２００２年、Ｋｌａｓｓｅ ２０１３年、Ｋｈａｙａｔ ２０１３年）。ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４は、電子顕微鏡法（ＥＭ）に基づくと、安定した三量体立体構造をとり（Ｓａｎｄｅｒｓ ２０１５年）、多数の既知ｂＮＡｂエピトープを提示するが、非ＮＡｂとの結合は弱い（Ｓａｎｄｅｒｓ ２０１３年）。しかしながら、ウサギ免疫化研究では、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４は、自家Ｔｉｅｒ－２ウイルスに対するＮＡｂを誘導するに過ぎず、異種Ｔｉｅｒ－２ウイルスに対するｂＮＡｂは観察されなかった（Ｓａｎｄｅｒｓ ２０１５年）。

１９８３年にＡＩＤＳの原因としてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が発見されて以来（Ｇａｌｌｏ，２００３年）、効果的なワクチンの開発は、進行中の世界的な健康上の優先事項となっている。ワクチンを成功させるためには、循環ＨＩＶ－１分離株の膨大な遺伝的多様性、特に中和抵抗性ティア－２ウイルスに対して防御免疫を付与する広域中和抗体（ｂＮＡｂ）を誘導することができなければならない（Ｍ．Ｓ．Ｓｅａｍａｎ、２０１０年）。残念なことに、何十年にもわたる集中的な取り組みの後でも、ｂＮＡｂを誘導可能なワクチン候補は、依然として達成困難であり、ヒトはおろか動物モデルにおいてでさえまだ成功は達成されていない。

本明細書で提供されるＨＩＶウイルス抗原及び免疫原を含むタンパク質及び組換えポリペプチドは、ＨＩＶ感染を効果的に及び安全に治療するために（例えば、療法的に、予防的に）有用である。一部の態様では、本提供の方法は、簡便でロバストな製造プロセスにおけるサブユニットワクチンの安全な産生を可能にする。一部の態様では、本提供の組成物及び方法は、ＨＩＶウイルス抗原または免疫原がそれらの天然の立体構造を維持することを可能にする。これは、天然抗原部位、例えば線状または立体構造エピトープに対する免疫応答を誘発するのに有利であり得る。

一部の実施形態では、ＨＩＶウイルス抗原または免疫原は、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープである。一部の実施形態では、ＨＩＶウイルス抗原または免疫原、例えば、本明細書に記載の通りのｇｐ１２０タンパク質ペプチドをコラーゲンのＣ末端プロペプチドに連結して組換えポリペプチドを形成し、組換えポリペプチドのＣ末端プロペプチドは、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態では、組換えポリペプチドのＣ末端プロペプチドは、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドの多量体化、例えば三量体化をもたらす。一部の態様では、多量体化、例えば三量体化は、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドが、例えば天然ウイルス表面上でのｇｐ１２０の組織化に類似する天然ｇｐ１２０三量体立体構造を獲得することを可能にする。一部の実施形態では、天然立体構造は、ｇｐ１２０の保護立体構造エピトープを標的とするロバストな免疫応答を誘発させる。

一部の実施形態では、本明細書に記載の通りのタンパク質は、本明細書に記載の複数の組換えタンパク質を含む。一部の実施形態では、タンパク質はマクロ構造を形成する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるタンパク質または組換えポリペプチドは、ナノ粒子またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）に含まれている。また、組換えポリペプチドをコードする核酸、例えば単離された核酸が提供される。一部の実施形態では、組換えポリペプチドをコードする核酸は、ウイルスベクターまたは偽ウイルスベクターなどのベクターに含まれている。一部の実施形態では、組換えポリペプチドをコードする核酸または核酸ベクターを含むベクターは、細胞に含まれている。一部の実施形態では、組換えポリペプチドを産生するために、核酸またはベクターを含む細胞が使用され得る。

一部の実施形態では、タンパク質、組換え受容体、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、または細胞は、免疫原性組成物であるか、または免疫原性組成物を含む。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、ワクチンとして使用される。一部の実施形態では、ワクチンは、１つもしくは複数のアジュバントを含むか、または１つもしくは複数のアジュバントと組み合わせて投与される。

また、本明細書では、本明細書で提供されるタンパク質を産生するための方法、本明細書で提供されるタンパク質及び組成物で対象を治療するための方法、ならびにキットが提供される。

特許文献、科学論文、及びデータベースを含む、本出願で参照されているすべての刊行物は、個々の刊行物が参照によりあたかも個々に組み込まれるのと同じ程度に、あらゆる目的のために参照により組み込まれる。本明細書に示されている定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、出願公開、及び他の刊行物に示されている定義に反するかまたはそうでなければ矛盾する場合、本明細書に示されている定義が、参照により本明細書に組み込まれる定義に優先する。

本明細書で使用されているセクション見出しは、構成目的のために過ぎず、記載されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。

Ｉ． ウイルス抗原及び免疫原
本明細書で提供されるタンパク質は、ＨＩＶウイルス抗原及び免疫原を含む。本明細書で企図されるＨＩＶウイルス抗原及び免疫原は、細胞媒介性応答及び／または体液性応答を促進または刺激することが可能である。一部の実施形態では、応答、例えば、細胞媒介性応答または体液性応答は、抗体、例えば中和抗体の産生を含む。

ゲノムウイルスＲＮＡは、ウイルスが伝染するようにウイルス粒子の内部にパッケージングされていなければならない。一部のウイルスＲＮＡカプシドは、感染した宿主細胞の脂質膜に封入されているかまたは取り囲まれており、他のものは、脂質二重層を有しないウイルスタンパク質の外殻を有する。ウイルスタンパク質は、一般に、構造タンパク質及び非構造タンパク質に分類される。一般に、非構造タンパク質は、ゲノム複製、転写調節、及びパッケージングに関与する。構造タンパク質は、一般に、（１）ゲノムＲＮＡ結合（つまり、ＨＩＶ Ａウイルスのヌクレオカプシドタンパク質）、（２）パッケージングされたＲＮＡと他のタンパク質（つまり、マトリックスタンパク質）との間の関係性の維持、及び（３）最も外側のウイルス層（つまり、ｇｐ１２０などの表面タンパク質）との結合を含む３つの主要な機能を実施する。ウイルス粒子へのアセンブリにより、同じ種内のまたは種を越えた別の宿主へのウイルスＲＮＡゲノムの効果的な伝染が確保される。

一部の実施形態では、ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。一部の実施形態では、ＨＩＶはＨＩＶ－１である。ＨＩＶ－１分離株は、中和「ティア（ｔｉｅｒ）」表現型に基づいて分類されることが多い。三量体ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質スパイクが自発的に移行することのできる少なくとも３つの立体構造との関係性で、４つのティア（ｔｉｅｒ）が規定される。中和ティア（ｔｉｅｒ）表現型は、三量体が、開（ティア１Ａ（ｔｉｅｒ１Ａ））、閉（ティア２（ｔｉｅｒ２）及び３（ｔｉｅｒ３））、または中間（ティア１Ｂ（ｔｉｅｒ１Ｂ））立体構造で存在する頻度に対応する。一部の観点では、開立体構造は、より多くの内部エピトープを露出させる。一部の場合では、閉立体構造が安定化され、多数の広域中和抗体が結合できる。

ティア１Ａ（ｔｉｅｒ１Ａ）は、感受性が最も高い中和表現型であり、循環株に占める割合は非常に小さい。ティア１Ｂ（ｔｉｅｒ１Ｂ）は、２番目に感受性が高く、循環株に占める割合はより大きいが、依然として比較的小さい。ほとんどの循環株は、ワクチンで標的とすることが最も重要であると考えられる、感受性が中程度のティア２（ｔｉｅｒ２）表現型を呈し；この表現型は、基準株の大部分を構成する。ティア３（ｔｉｅｒ３）は、感受性が最も低い表現型である（Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ ＨＩＶ ＡＩＤＳ（１３巻）２号：１２８～１３６頁、２０１８年）。

一部の実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、ＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープである。

ＨＩＶのエンベロープタンパク質は、サイズが８４５～８７０個アミノ酸のより長い前駆体ｇｐ１６０タンパク質としてまず合成される。Ｇｐ１６０は、ホモ三量体を形成することができ、感染した宿主細胞のゴルジ装置内でグリコシル化を受ける。次いで、ｇｐ１６０は、Ｉｎ ｖｉｖｏでは、細胞性フリンプロテアーゼによりｇｐ１２０及びｇｐ４１へと切断される。Ｇｐ４１は、膜貫通ドメインを含み、三量体構成のままである。Ｇｐ１２０は、エンベロープ糖タンパク質複合体の細胞表面外部ドメインのほとんどを含む。Ｇｐ１２０は、細胞性ＣＤ４受容体及び細胞性ケモカイン受容体（ＣＣＲ５など）の両方に結合し、それにより宿主細胞内へのウイルス進入が促進される。Ｇｐ４１及びｇｐ１２０は、非共有結合を介して相互作用することができる。

成熟ｇｐ１２０ポリペプチドは、一次配列に約５００個のアミノ酸を有する。Ｇｐ１２０は、ｉｎ ｖｉｖｏでは、高度にＮ－グリコシル化されたタンパク質であり、ウェスタンブロットにより可視化すると、その名称の通り１２０ｋＤの分子量を生じさせる。ｇｐ１２０ポリペプチドは、５つの保存された領域（Ｃ１～Ｃ５）及び５つの高度に可変性の領域（Ｖ１～Ｖ５）で構成される。野生型ｇｐ１６０ポリペプチドの例示的な配列は、ＧＥＮＢＡＮＫにおいて、例えば、２００７年９月６日に入手可能になった受入番号ＡＡＢ０５６０４及びＡＡＤ１２１４２に示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

ｇｐ１２０コアは、２つのドメイン：「内側」ドメイン（ｇｐ４１に面する）及び「外側」ドメイン（主にオリゴマーエンベロープ糖タンパク質複合体の表面に露出している）を含む、独特の分子構造を有する。２つのｇｐ１２０ドメインは、いずれのドメインの一部でもない「架橋シート」により隔てられている。ｇｐ１２０コアは、２５個のベータ鎖、５個のａｌｐｇｐ１２０ヘリックス、及び１０個の画定されたループセグメントを含む。

また、Ｇｐ１２０ポリペプチドは、天然ｇｐ１２０構造のアナログ（非タンパク質有機分子）、誘導体（本開示のタンパク質配列から開始して得られる化学的機能性タンパク質分子）、または模倣物（三次元的に類似した化学物質）、ならびにタンパク質配列バリアント（突然変異体など）、遺伝的対立遺伝子、ｇｐ１２０の融合タンパク質、またはそれらの組合せを包含する「ｇｐ１２０由来分子」を含む。一部の実施形態では、ｇｐ１２０は、ペプチド断片、エピトープ、またはそれらの誘導体である。

本明細書においてＶ３ループと呼ばれる第３の可変領域は、共受容体の結合のために、及びどの共受容体が結合することになるかを決定するために重要な約３５個アミノ酸のループである。一部の実施形態では、Ｖ３ループは、残基２９６～３３１を含む。

Ｇｐ１２０は、三量体複合体上に露出しているという性質のため、ＨＩＶ－１に対する中和抗体の最も一般的な標的であるが、ｇｐ４１抗原エピトープは、典型的には露出しておらず、ウイルス膜付近に位置するか、またはＨＩＶ－１ウイルス及びＣＤ４＋ Ｔリンパ球膜の融合プロセス中に一時的に露出するに過ぎない（Ｂｕｒｔｏｎ ２００４年）。興味深いことに、ｇｐ１２０は、一般的に、自然感染の過程中に非中和抗体を誘発する。このような非中和抗体は、アセンブリされた三量体上では閉されているが、その後、ｇｐ１２０がｇｐ４１から脱落して可溶性ｇｐ１２０単量体になる際に露出されるｇｐ１２０領域に対して向けられ得る（Ｍｏｏｒｅ １９９６年、Ｗｙａｔｔ １９９７年）。対照的に、中和抗体は、典型的には、ｇｐ１２０単量体よりも高い親和性で成熟三量体複合体に結合し、そのような結合は、三量体特異的であり得る（Ｓａｔｔｅｎｔａｕ １９９５年、Ｂｕｒｔｏｎ ２００４年、ｄｅ Ｔａｅｙｅ ２０１６年）。

ｇｐ１２０のアミノ酸残基は、Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ＨＩＶ Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｏ ＨＸＢ２ＣＧ Ｂｅｔｔｅ Ｋｏｒｂｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＡＩＤＳ １９９８年：Ａ Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｋｏｒｂｅｒ Ｂ、Ｋｕｉｋｅｎ Ｃ Ｌ、Ｆｏｌｅｙ Ｂ、Ｈａｈｎ Ｂ、ＭｃＣｕｔｃｈａｎ Ｆ、Ｍｅｌｌｏｒｓ Ｊ Ｗ、及びＳｏｄｒｏｓｋｉ Ｊ編、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ロスアラモス、ニューメキシコ州に示されているＨＸＢ２付番スキームを使用して付番することができる。こうした文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、外側ドメインサブユニットペプチド、内側ドメインサブユニットペプチド、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、タンパク質は、３つの組換えポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ｇｐ１２０タンパク質は、任意選択で架橋シートにより隔てられている、１、２、３、４、または５つのＣ領域及び１、２、３、４、または５つの可変領域を含む。一部の実施形態では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、ｇｐ１２０タンパク質の外側サブユニットまたは内側サブユニットを含む。一部の実施形態では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、ｇｐ１２０タンパク質の内側サブユニット及び外側サブユニットを含み、任意選択で、外側サブユニット及び内側サブユニットは、ジスルフィド結合または人工的に導入されたリンカーにより連結されている。一部の実施形態では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、膜貫通（ＴＭ）ドメインペプチド及び／または細胞質（ＣＰ）ドメインペプチドを含まない。一部の実施形態では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、プロテアーゼ切断部位を含み、プロテアーゼは、任意選択で、フリン、ＴＭＰＲＳＳ２などの膜貫通セリンプロテアーゼ、トリプシン、第Ｘａ因子、またはカテプシンＬである。一部の実施形態では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、プロテアーゼ切断部位を含まず、プロテアーゼは、任意選択で、フリン、ＴＭＰＲＳＳ２などの膜貫通セリンプロテアーゼ、トリプシン、第Ｘａ因子、またはカテプシンＬである。一部の実施形態では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、可溶性であるか、または脂質二重層、例えば、膜もしくはウイルスエンベロープに直接的に結合しない。一部の実施形態では、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、タンパク質の組換えポリペプチド間で同じであるかまたは異なる。

一部の実施形態では、各組換えポリペプチド中のｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、融合前立体構造または融合後立体構造をとる。一部の実施形態では、各組換えポリペプチド中のｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、配列番号１９～３０のいずれかに示されている配列であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、各組換えポリペプチド中のｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、配列番号１９～３０のいずれかに示されている配列に対して、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９７％の配列同一性を呈するアミノ酸の配列であるか、またはそれを含む。

一部の実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１つまたは複数のアミノ酸位置に置換、欠失、及び／または挿入を含む配列を含む、配列番号１９～３０のいずれかに対して、少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

本明細書では、ＨＩＶ ｇｐ１２０などの組換えペプチドをコードするポリ核酸が提供される。一部の実施形態では、ポリ核酸は、組換えペプチドの１つ、２つ、３つ、またはそれよりも多くをコードする。

一部の実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、コドン最適化された核酸配列から産生される。一部の実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、コドン最適化されていない核酸配列から産生される。

ＩＩ． 組換えポリペプチド及びタンパク質
一部の実施形態では、共有結合連結三量体形態の、ＲＮＡウイルスに由来する組換え可溶性表面抗原の組成物及び使用方法が開示される。一部の実施形態では、得られる融合タンパク質は、構造がより安定であり、天然様三量体ウイルス抗原の立体構造を維持し、したがってこうした危険な病原体に対するより効果的なワクチンとして使用することができるジスルフィド結合連結ホモ三量体として分泌される。

本明細書で提供されるＨＩＶウイルス抗原及び免疫原、例えば、ｇｐ１２０タンパク質ペプチド（セクションＩ－１を参照）を、他のタンパク質またはペプチドと組み合わせて、例えば連結して、融合ペプチドを含む組換えポリペプチドを形成することができることが企図される。一部の実施形態では、本明細書で提供される個々の組換えポリペプチド（例えば、単量体）は、付随して、組換えポリペプチドの多量体、例えば三量体を形成する。一部の実施形態では、個々の組換えポリペプチド単量体の付随は、共有結合相互作用により生じる。一部の実施形態では、個々の組換えポリペプチド単量体の付随は、非共有結合相互作用により生じる。一部の実施形態では、相互作用、例えば共有結合または非共有結合は、ＨＩＶウイルス抗原または免疫原、例えばｇｐ１２０タンパク質ペプチドが連結されているタンパク質またはペプチドにより達成される。一部の実施形態では、例えば、ＨＩＶウイルス抗原または免疫原が、本明細書に記載の通りのｇｐ１２０タンパク質ペプチドである場合、それが連結されることになるタンパク質またはペプチドは、糖タンパク質の天然ホモ三量体構造が保存されるように選択することができる。これは、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドに対する強力で効果的な免疫原性応答を誘発させるために有利である。例えば、ＨＩＶウイルス抗原または免疫原（例えば、ｇｐ１２０タンパク質ペプチド）の天然立体構造の保存及び／または維持は、免疫応答を生じさせることが可能な抗原部位へのアクセスを向上または可能にし得る。一部の場合では、本明細書に記載のｇｐ１２０タンパク質ペプチドを含む組換えポリペプチドは、例えばセクションＩ－１を参照されたいが、本明細書では代替的に組換えＨＩＶ抗原、組換えＨＩＶ免疫原、または組換えＨＩＶタンパク質、組換えＨＩＶ ｇｐ１２０抗原と呼ばれる。

一部の場合では、組換えポリペプチドまたはそれらの多量体化組換えポリペプチドは凝集するか、または凝集して、複数のＨＩＶウイルス抗原及び／もしくは免疫原組換えポリペプチドを含むタンパク質を形成することができることがさらに企図される。そのようなタンパク質の形成は、ＨＩＶウイルス抗原及び／または免疫原に対する強力で効果的な免疫原性応答の生成に有利であり得る。例えば、複数の組換えポリペプチド、したがって複数のＨＩＶウイルス抗原、例えばｇｐ１２０タンパク質ペプチドを含むタンパク質の形成は、ウイルス抗原の三次及び／または四次構造を保存し、天然構造に対する免疫応答の開始を可能にし得る。一部の場合では、凝集は、ＨＩＶウイルス抗原または免疫原に構造安定性を付与し得、次いでそれにより、免疫応答を促進することが可能な潜在的に抗原性の部位へのアクセスを可能にすることができる。

１．融合ペプチド及び組換えポリペプチド
一部の実施形態では、ＨＩＶウイルス抗原または免疫原を、三量体化ドメインにそれらのＣ末端で連結して（Ｃ末端連結）、単量体の三量体化を促進することができる。一部の実施形態では、三量体化は、三量体構成のＨＩＶウイルス抗原または免疫原の膜近位面を安定化させる。

可溶性組換えタンパク質の安定三量体を促進する外因性多量体化ドメインの非限定的な例としては、ＧＣＮ４ロイシンジッパー（Ｈａｒｂｕｒｙら、１９９３年 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２巻：１４０１～１４０７頁）、肺サーファクタントタンパク質に由来する三量体化モチーフ（Ｈｏｐｐｅら、１９９４年 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３４４巻：１９１～１９５頁）、コラーゲン（ＭｃＡｌｉｎｄｅｎら、２００３年 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８巻：４２２００～４２２０７頁）、及びファージＴ４フィブリチンフォールドン（Ｍｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖら、１９９８年 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １１巻：３２９～４１４頁）が挙げられ、これらはいずれも、本明細書に記載の組換えＨＩＶウイルス抗原または免疫原に連結して（例えば、ｇｐ１２０ドメインのＣ末端との連結により）、組換えウイルス抗原または免疫原の三量体化を促進することができる。また、米国特許第７，２６８，１１６号明細書、第７，６６６，８３７号明細書、第７，６９１，８１５号明細書、第１０，６１８，９４９号明細書、第１０，９０６，９４４号明細書、及び第１０，９６０，０７０号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０２０／０００９２４４号明細書を参照されたい。こうした文献は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態では、１つまたは複数のペプチドリンカー（ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー、例えば、１０個アミノ酸のグリシン－セリンペプチドリンカーなど）を使用して、組換えウイルス抗原または免疫原を膜貫通ドメインに連結することができる。三量体は、組換えウイルス抗原または免疫原三量体が所望の特性（例えば、融合前立体構造）を保持する限り、本明細書で提供される安定化突然変異のいずれか（またはそれらの組合せ）を含むことができる。

療法的に実現可能であるために、生物学的薬物設計に望ましい三量体化タンパク質部分は、以下の基準を満たすべきである。理想的には、三量体化タンパク質部分は、循環中にも豊富に存在し（非毒性）、起源がヒトであり（免疫原性の欠如）、比較的安定しており（半減期が長い）、鎖間共有結合ジスルフィド結合により強化されているため、三量体化されたＨＩＶウイルス抗原または免疫原が構造的に安定するような効率的な自己三量体化が可能である、免疫グロブリンＦｃのような天然で分泌されるタンパク質の一部であるべきである。

コラーゲンは、細胞外マトリックスの主要成分である線維性タンパク質のファミリーである。コラーゲンは、哺乳動物において最も豊富なタンパク質であり、体内の総タンパク質のほぼ２５％を占める。コラーゲンは、骨、腱、皮膚、角膜、軟骨、血管、及び歯の形成に主要な構造的役割を果たす。線維型のコラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、及びＸＩはすべて、プロコラーゲンと呼ばれるより大きな三量体前駆体として合成され、プロコラーゲンでは、何百個もの「Ｇ－Ｘ－Ｙ」リピート（またはグリシンリピート）からなる中央非中断三重らせんドメインが、非コラーゲン性ドメイン（ＮＣ）、Ｎ－プロペプチド、及びＣ－プロペプチドによりフランキングされている。Ｃ末端及びＮ末端の延在部分は両方とも、プロコラーゲンの分泌時にタンパク質分解的にプロセシングされる。これは、不溶性細胞マトリックスを形成するコラーゲン線維への成熟タンパク質のアセンブリを引き起こす事象である。ＢＭＰ－１は、コラーゲンのグリシンリピートとＣ－プロドメインとの間の接合部付近のプロコラーゲンの特定のペプチド配列を認識するプロテアーゼであり、プロペプチドの除去に関与する。Ｉ型コラーゲンの脱落三量体Ｃ－プロペプチドは、正常成人のヒト血清中では５０～３００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で見出され、小児は、骨形成が活発であることを示すはるかにより高いレベルを有する。家族性高血清濃度のＩ型コラーゲンのＣ－プロペプチドを有する人々では、レベルは、明らかな異常を示さずに１～６μｇ／ｍＬにも達する可能性があり、Ｃ－プロペプチドが毒性ではないことが示唆される。コラーゲンの三量体Ｃ－プロペプチドの構造研究により、３つのサブユニットはすべて、それらのＮ末端付近の接合領域で一緒になって、プロコラーゲン分子の残りの部分に接続する三葉構造であることが示唆された。融合しようとするタンパク質を一方向に突出させるこのような幾何形状は、Ｆｃ二量体の形状と類似している。

Ｉ型、ＩＶ型、Ｖ型、及びＸＩ型コラーゲンは、主に、配列が高度に相同性である、２つのα－１鎖及び１つのα－２鎖（Ｉ型、ＩＶ型、Ｖ型の場合）、または３つの異なるａ鎖（ＸＩ型の場合）のいずれかからなるヘテロ三量体形態にアセンブリされる。ＩＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンは両方とも、α－１鎖のホモ三量体である。コラーゲンの最も豊富な形態であるＩ型コラーゲンの場合、安定α（Ｉ）ホモ三量体も形成され、異なる組織に様々なレベルで存在する。こうしたコラーゲンＣ－プロペプチド鎖のほとんどは、細胞にて単独で過剰発現されると、自己アセンブリしてホモ三量体になり得る。Ｎ－プロペプチドドメインが最初に合成されるが、三量体コラーゲンへの分子アセンブリは、Ｃ－プロペプチドの一致した付随から始まる。Ｃ－プロペプチド複合体は、鎖間ジスルフィド結合の形成により安定化されると考えられているが、鎖を正しく一致させるためのジスルフィド結合形成の必要性は明らかではない。次いで、グリシンリピートの三重らせんが、付随したＣ末端からＮ末端へとチャックのように伝播する。この知識は、組換えＤＮＡ技術を使用して異なるコラーゲン鎖のＣ－プロペプチドを取り替えることによる、非天然型のコラーゲンマトリックスの作出に結び付いた。また、サイトカイン及び成長因子などの非コラーゲン性タンパク質を、プロコラーゲンまたは成熟コラーゲンのいずれかのＮ末端に融合して、新しいコラーゲンマトリックスの形成が可能になった。これは、細胞マトリックスからの非コラーゲン性タンパク質の徐放を可能にすることが意図されている。しかしながら、いずれの状況下でも、Ｃ－プロペプチドは、組換えコラーゲン線維が不溶性細胞マトリックスへとアセンブリする前に切断される必要がある。

ＧＣＮ４に由来するもの、酵母フィブリチンに由来するもの、細菌ファージＴ４に由来するもの、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のアスパラギン酸トランスカルバモイラーゼに由来するものなどの他のタンパク質三量体化ドメインは、異種性タンパク質の三量体化を可能にすることが以前に記載されているが、こうした三量体化タンパク質はいずれも、本質的にヒトのものではなく、天然に分泌されるタンパク質でもない。そのため、任意の三量体融合タンパク質は細胞内で製作される必要があるだろう。その場合、可溶性受容体などの天然で分泌されるタンパク質が誤ってフォールディングし得るだけでなく、そのような融合タンパク質を何千個もの他の細胞内タンパク質から精製することも困難になり得る。さらに、三量体生物学的薬物設計にそのような非ヒトタンパク質三量体化ドメイン（例えば、酵母、バクテリアファージ、及び細菌に由来する）を使用することの致命的な欠点は、ヒト体内での免疫原性が推定されることであり、それによりそのような融合タンパク質はヒト体内に注射した後すぐに無効にされる。

したがって、本明細書に記載の通りの組換えポリペプチドにおけるコラーゲンの使用は、以下を含む多数の利点を有する：（１）コラーゲンは、哺乳動物の体内で分泌される最も豊富なタンパク質であり、体内の総タンパク質のほぼ２５％を占めること；（２）コラーゲンの主要形態は、三量体ヘリックスとして天然で生じ、それらの球状Ｃ－プロペプチドが三量体化の開始に関与すること；（３）成熟コラーゲンからタンパク質分解的に放出されるコラーゲンの三量体Ｃ－プロペプチドは、サブマイクログラム／ｍＬレベルで哺乳動物の血液中に天然で見出され、身体に毒性があることは知られていないこと；（４）コラーゲンの線状三重らせん領域は、予測間隔が１残基当たり２．９Åのリンカーとして含まれていてもよく、または融合タンパク質の一部として除外されていてもよいため、三量体化させようとするタンパク質とコラーゲンのＣ－プロペプチドとの間の距離を、最適な生物学的活性を達成するために正確に調整することができること；（５）Ｃ－プロペプチドをプロコラーゲンから切断するＢＭＰ１の認識部位を突然変異または欠失させて、三量体融合タンパク質の破壊を防止することができること；（６）Ｃ－プロペプチドドメインは、ジスルフィド結合を介して自己三量体化し、作出されるあらゆる分泌型融合タンパク質の精製に使用することができるユニバーサル親和性タグを提供すること。一部の実施形態では、ＨＩＶウイルス抗原及び免疫原、例えば、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドが結合するコラーゲンのＣプロペプチドは、可溶性共有結合連結ホモ三量体融合タンパク質の組換え産生を可能にする。

一部の実施形態では、ＨＩＶウイルス抗原または免疫原を、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに連結して、組換えポリペプチドを形成する。一部の実施形態では、組換えポリペプチドのＣ末端プロペプチドは、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態では、組換えタンパク質は三量体を形成する。一部の実施形態では、ＨＩＶウイルス抗原または免疫原は、セクションＩ－１に記載の通りのｇｐ１２０タンパク質ペプチドである。

一部の実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、ヒトコラーゲンのものである。一部の実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、ｐｒｏα１（Ｉ）、ｐｒｏα１（ＩＩ）、ｐｒｏα１（ＩＩＩ）、ｐｒｏα１（Ｖ）、ｐｒｏα１（ＸＩ）、ｐｒｏα２（Ｉ）、ｐｒｏα２（Ｖ）、ｐｒｏα２（ＸＩ）、もしくはｐｒｏα３（ＸＩ）のＣ末端ポリペプチド、またはその断片を含む。一部の実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、ｐｒｏα１（Ｉ）のＣ末端ポリペプチドであるか、またはそれを含む。

一部の実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号３１～４６のいずれかにより示されているアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号３１～４６のいずれかの配列に対して、少なくともまたは約８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。

一部の実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、ＢＭＰ－１部位において、アスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）への置換を有する、例えば、ＲＡＤがＲＡＮに突然変異されているコラーゲン三量体化ドメイン（例えば、ヒトα１（Ｉ）コラーゲンのＣ－プロペプチド）のアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、ＢＭＰ－１部位において、アラニン（Ａ）からアスパラギン（Ｎ）への置換を有する、例えば、ＲＡＤがＲＮＤに突然変異されているコラーゲン三量体化ドメイン（例えば、ヒトα１（Ｉ）コラーゲンのＣ－プロペプチド）のアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、本明細書のＣ末端プロペプチドは、突然変異ＢＭＰ－１部位、例えば、ＤＤＡＮの代わりにＲＳＡＮを含み得る。一部の実施形態では、本明細書のＣ末端プロペプチドは、ＢＭＰ－１部位を含み得、例えば、ＲＡＮ（例えば、ＲＡＮＤＡＮ）またはＲＮＤ（例えば、ＲＮＤＤＡＮ）の代わりにＲＡＤ（例えば、ＲＡＤＤＡＮ）配列を含む配列が、本明細書に開示の融合ポリペプチドに使用され得る。

一部の実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号３１～４６のいずれかのＮ末端に連結されたグリシン－Ｘ－Ｙリピートであって、Ｘ及びＹは、独立して任意のアミノ酸である、グリシン－Ｘ－Ｙリピートを含む配列、またはポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することが可能な、それと少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、Ｘ及びＹは、独立してプロリンまたはヒドロキシプロリンである。

ｇｐ１２０ペプチドタンパク質（例えば、ＨＩＶウイルス抗原または免疫原、例えばセクションＩ－１を参照）をＣ末端プロペプチドに連結して、組換えポリペプチドを形成する一部の場合では、組換えポリペプチドは、三量体を形成し、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドのホモ三量体をもたらす。一部の実施形態では、三量体化組換えポリペプチドのｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、融合前立体構造をとる。一部の実施形態では、三量体化組換えポリペプチドのｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、融合後立体構造をとる。一部の実施形態では、立体構造状態は、ｇｐ１２０タンパク質ペプチド上の異なる抗原部位へのアクセスを可能にする。一部の実施形態では、抗原部位は、線状エピトープまたは立体構造エピトープなどのエピトープである。記載の通りの三量体化組換えポリペプチドを有することの利点は、様々な潜在的で多様な抗原部位に対して免疫応答を起こすことができることである。

一部の実施形態では、三量体化組換えポリペプチドは、同じウイルス抗原または免疫原を含む個々の組換えポリペプチドを含む。一部の実施形態では、三量体化組換えポリペプチドは、各々が、他の組換えポリペプチドとは異なるウイルス抗原または免疫原を含む個々の組換えポリペプチドを含む。一部の実施形態では、三量体化組換えポリペプチドは、個々の組換えポリペプチドの１つが、他の組換えポリペプチドとは異なるウイルス抗原または免疫原を含む、個々の組換えポリペプチドを含む。一部の実施形態では、三量体化組換えポリペプチドは、個々の組換えポリペプチドの２つが、同じウイルス抗原または免疫原を含み、ウイルス抗原または免疫原が、残りの組換えポリペプチドに含まれるウイルス抗原または免疫原とは異なる、個々の組換えポリペプチドを含む。

一部の実施形態では、組換えポリペプチドは、セクションＩ－１に記載の任意のＨＩＶウイルス抗原または免疫原を含む。一部の実施形態では、組換えポリペプチドは、本明細書に記載の通りのコラーゲンのＣ末端プロペプチドに本明細書に記載の通りに連結された、セクションＩ－１に記載の任意のＨＩＶウイルス抗原または免疫原を含む。

一部の実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１～１８のいずれかにより示されているアミノ酸配列であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１～１８のいずれかの配列に対して、少なくともまたは約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。

上記に示されているように、一部の実施形態では、本明細書で提供される組換えポリペプチドは、付随して三量体を形成するだけでなく、凝集してまたは凝集されて、複数の組換えポリペプチドを含むタンパク質を生成することもできる。一部の実施形態では、形成されるタンパク質はマクロ構造を形成する。一部の場合では、マクロ構造は、ＨＩＶウイルス抗原または免疫原組換えポリペプチドに構造安定性を付与し得、それにより次いで、免疫応答を促進することが可能な潜在的抗原部位へのアクセスをもたらすことができる。

一部の実施形態では、複数の組換えポリペプチドを含む本明細書に記載のタンパク質は、免疫原である。一部の実施形態では、複数の組換えポリペプチドを含む本明細書に記載のタンパク質は、ナノ粒子に含まれている。例えば、一部の実施形態では、タンパク質は、ナノ粒子、例えばタンパク質ナノ粒子に直接的に連結されている。一部の実施形態では、タンパク質は、ナノ粒子に間接的に連結されている。一部の実施形態では、複数の組換えポリペプチドを含む本明細書に記載のタンパク質は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に含まれている。

２． ポリヌクレオチド及びベクター
また、本明細書で提供されるＨＩＶ抗原または免疫原及び組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（核酸分子）、ならびにそのようなＨＩＶ抗原または免疫原及び組換えポリペプチドを発現するように細胞を遺伝的に操作するためのベクターが提供される。

一部の実施形態では、本明細書で提供される組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、組換えポリペプチドをコードする核酸配列などの、単一の核酸配列を含む。他の場合では、ポリヌクレオチドは、特定のＨＩＶウイルス抗原または免疫原を含む組換えポリペプチドをコードする第１の核酸配列、及び異なるＨＩＶウイルス抗原または免疫原を含む組換えポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む。

一部の実施形態では、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、組換えポリペプチドの発現を制御するために作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えポリペプチドの発現を制御するために作動可能に連結された２つ、３つ、またはそれよりも多くのプロモーターを含む。

一部の実施形態では、例えば、ポリヌクレオチドが、異なるＨＩＶウイルス抗原または免疫原を含む組換えポリペプチドをコードする配列など、２つまたはそれよりも多くの核酸コード配列を含む場合、少なくとも１つのプロモーターが、２つまたはそれよりも多くの核酸配列の発現を制御するために作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えポリペプチドの発現を制御するために作動可能に連結された２つ、３つ、またはそれよりも多くのプロモーターを含む。

一部の実施形態では、組換えポリペプチドの発現は、誘導性または条件的である。したがって、一部の態様では、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、条件付きプロモーター、エンハンサー、またはトランス活性化因子を含む。一部のそのような態様では、条件付きプロモーター、エンハンサー、またはトランス活性化因子は、誘導性プロモーター、エンハンサー、もしくはトランス活性化因子、または抑制性プロモーター、エンハンサー、もしくはトランス活性化因子である。例えば、一部の実施形態では、誘導性プロモーターまたは条件付きプロモーターを使用して、組換えポリペプチドの発現を特定の微小環境に制限することができる。一部の実施形態では、誘導性プロモーターまたは条件付きプロモーターにより駆動される発現は、熱、放射線、または薬物などの外因性因子への曝露により調節される。

ポリヌクレオチドが、組換えポリペプチドをコードする１つよりも多くの核酸配列を含む場合、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の核酸配列間に、ペプチドをコードする核酸配列をさらに含み得る。一部の場合では、核酸配列間に配置された核酸は、翻訳中または翻訳後に核酸配列の翻訳産物を隔てるペプチドをコードする。一部の実施形態では、ペプチドは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、自己切断ペプチド、またはＴ２Ａペプチドなどの、リボソームスキッピングを引き起こすペプチドを含む。

一部の実施形態では、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、レトロウイルス形質導入、トランスフェクション、または形質転換などにより、培養細胞（例えば、宿主細胞）を含む組成物に導入される。一部の実施形態では、これにより、組換えポリペプチドの発現（例えば、産生）が可能になり得る。一部の実施形態では、発現された組換えポリペプチドは、精製される。

一部の実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチド（核酸分子）は、本明細書に記載の通りのＨＩＶウイルス抗原または免疫原をコードする。一部の実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチド（核酸分子）は、本明細書に記載の通りのＨＩＶウイルス抗原または免疫原、例えば、ＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質ペプチドを含む組換えポリペプチドをコードする。

また、本明細書に記載の通りの核酸分子を含むベクターまたは構築物が提供される。一部の実施形態では、ベクターまたは構築物は、組換えポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された、その発現を駆動するための１つまたは複数のプロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、１つまたは１つよりも多くの核酸分子、例えば、異なるＨＩＶウイルス抗原または免疫原を含む組換えポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結されている。

一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。一部の実施形態では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、レトロウイルスベクターはガンマレトロウイルスベクターである。

一部の実施形態では、ベクターまたは構築物は、ポリヌクレオチドの１つまたは複数の核酸分子の発現を駆動する単一のプロモーターを含む。一部の実施形態では、そのようなプロモーターは、多シストロン性であってもよい（バイシストロン性またはトリシストロン性、例えば、米国特許第６，０６０，２７３号明細書を参照）。例えば、一部の実施形態では、転写ユニットは、単一のプロモーターからのメッセージにより、遺伝子産物（例えば、異なる組換えポリペプチドをコードする）の共発現を可能にする、ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）を含むバイシストロン性ユニットとして遺伝子操作することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるベクターはバイシストロン性であり、ベクターが２つの核酸配列を含み、それらを発現することを可能にする。一部の実施形態では、本明細書で提供されるベクターはトリシストロン性であり、ベクターが３つの核酸配列を含み、それらを発現することを可能にする。

一部の実施形態では、単一のプロモーターは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に、自己切断ペプチド（例えば、２Ａ配列）またはプロテアーゼ認識部位（例えば、フリン）をコードする配列により互いに隔てられている２つまたは３つの遺伝子（例えば、キメラシグナル伝達受容体をコードする、及び組換え受容体をコードする）を含むＲＮＡの発現を指図する。したがって、ＯＲＦは、翻訳中（２Ａの場合）または翻訳後のいずれかにて、個々のタンパク質へとプロセシングされる単一のポリペプチドをコードする。一部の場合では、Ｔ２Ａなどのペプチドは、リボソームに、２ＡエレメントのＣ末端でのペプチド結合の合成をスキップさせ（リボソームスキッピング）、２Ａ配列の末端と次のペプチド下流との間に分断をもたらすことができる（例えば、ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒ．２巻：１３頁（２００４年）及びｄｅＦｅｌｉｐｅら、Ｔｒａｆｆｉｃ ５巻：６１６～６２６頁（２００４年）を参照）。多数の２Ａエレメントが当技術分野で公知である。本明細書で開示の方法及び核酸に使用することができる２Ａ配列の例としては、限定ではないが、米国特許出願公開第２００７０１１６６９０号明細書に記載のような、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、馬鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、トセアアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）、及び豚テッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）に由来する２Ａ配列が挙げられる。

一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスに含まれている。一部の実施形態では、ウイルスは偽ウイルスである。一部の実施形態では、ウイルスはウイルス様粒子である。一部の実施形態では、ベクターは、細胞に含まれている。一部の実施形態では、ベクターが含まれているウイルスまたは細胞は、組換えゲノムを含む。

ＩＩＩ． 免疫原性組成物及び製剤
一部の実施形態では、本明細書では、配列番号１～１８からなる群から選択される配列またはその断片、バリアント、もしくは突然変異体を含む組換えポリペプチドの三量体、あるいは三量体の任意の２つまたはそれよりも多くの組合せを含む免疫原性組成物である。一部の実施形態では、免疫原性組成物の単位用量は、約１０μｇ～約１００μｇのＨＩＶ抗原、好ましくは約２５μｇ～約７５μｇのＨＩＶ抗原、好ましくは約４０μｇ～約６０μｇのＨＩＶ抗原、または約５０μｇのＨＩＶ抗原を含み得る。一部の実施形態では、用量は、３μｇのＨＩＶ抗原を含む。他の実施形態では、用量は、９μｇのＨＩＶ抗原を含む。さらなる実施形態では、用量は、３０μｇのＨＩＶ抗原を含む。

また、本開示の免疫原（例えば、本開示の組換えＨＩＶ ｇｐ１２０三量体または本開示の組換えＨＩＶ ｇｐ１２０三量体のプロトマーをコードする核酸分子）及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物が提供される。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供される三量体化組換えポリペプチド及び任意選択で薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供される複数の三量体化組換えポリペプチドを含むタンパク質、及び任意選択で薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供されるタンパク質ナノ粒子、及び任意選択で薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供される通りのＶＬＰ、及び任意選択で薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供される単離された核酸、及び任意選択で薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供される通りのベクター、及び任意選択で薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供される通りのウイルス、及び任意選択で薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供される偽ウイルス、及び任意選択で薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供される通りの細胞、及び任意選択で薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のものなどの免疫原性組成物は、ワクチンである。一部の実施形態では、ワクチンは、予防用ワクチンである。一部の実施形態では、ワクチンは、療法用ワクチンである。一部の実施形態では、ワクチンは、予防用ワクチン及び治療用ワクチンである。そのような医薬組成物は、当業者に公知の様々な投与様式、例えば、筋肉内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、関節内、腹腔内、鼻腔内、舌下、扁桃腺、口腔咽頭、または他の非経口及び粘膜経路により、対象に投与することができる。一部の実施形態では、本開示の免疫原の１つまたは複数を含む医薬組成物は、免疫原性組成物である。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者にとって公知であるかまたは自明であろう。そうした方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、イーストン、ペンシルベニア州、１９９５年などの刊行物により詳細に記載されている。

したがって、本明細書に記載の免疫原、例えば、組換えＨＩＶ ｇｐ１２０抗原、例えば、三量体タンパク質は、生物学的活性の保持を支援しつつ、許容温度範囲内での保管中の安定性増加も促進されるように、薬学的に許容される担体と共に製剤化することができる。潜在的な担体としては、これらに限定されないが、生理学的にバランスのとれた培養培地、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水型または水／油型エマルジョン）、種々のタイプの湿潤剤、凍結保護添加剤、またはタンパク質、ペプチド、もしくは加水分解物（例えば、アルブミン、ゼラチン）、糖（例えば、スクロース、ラクトース、ソルビトール）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸ナトリウム）などの安定剤、または他の保護剤が挙げられる。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装され得るか、または凍結乾燥される。凍結乾燥調製物は、単回投薬または複数回投薬のいずれかのため、投与前に無菌溶液と一緒にされる。

製剤化された組成物、特に液体製剤は、保管中の分解を防止または最小限に抑えるために静菌剤を含み得、静菌剤として、これらに限定されないが、有効濃度（通常は１％重量／容積）のベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベン、及び／またはプロピルパラベンが挙げられる。一部の患者には静菌薬が禁忌であり得る；したがって凍結乾燥製剤は、そのような成分を含むかまたは含まないかのいずれかである溶液で再構成され得る。

本開示の免疫原性組成物は、薬学的に許容されるビヒクルとして、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張度調整剤、および湿潤剤など、生理学的条件に近似させるために必要な物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、及びオレイン酸トリエタノールアミンを含んでいてもよい。免疫原性組成物は、任意選択で、宿主の免疫応答を増強するためのアジュバントを含み得る。好適なアジュバントは、例えば、トール様受容体アゴニスト、ミョウバン、ＡｌＰＯ４、アルハイドロゲル、リピド－Ａ及びその誘導体またはバリアント、油型エマルジョン、サポニン、中性リポソーム、ワクチン及びサイトカインを含むリポソーム、非イオン性ブロックコポリマー、ならびにケモカインである。当技術分野で周知の多数の他の好適なアジュバントの中でも、ＰＯＥ－ＰＯＰ－ＰＯＥブロックコポリマー、ＭＰＬ（登録商標）（３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；Ｃｏｒｉｘａ、ハリルトン、インディアナ州）、及びＩＬ－１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）などのポリオキシエチレン（ＰＯＥ）及びポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）を含む非イオン性ブロックポリマーをアジュバントとして使用し得る（Ｎｅｗｍａｎら、１９９８年、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５巻：８９～１４２頁）。こうしたアジュバントは、免疫系の非特異的な刺激を支援し、したがって、医薬品に対する免疫応答を増強するという利点を有する。一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、１つよりも多くのアジュバントを含み得るか、または１つよりも多くのアジュバントと共に投与され得る。一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、２つのアジュバントを含み得るか、または２つのアジュバントと共に投与され得る。一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、複数のアジュバントを含み得るか、または複数のアジュバントと共に投与され得る。例えば、一部の場合では、例えば本明細書で提供される免疫原性組成物を含むワクチンは、複数のアジュバントを含み得るか、または複数のアジュバントと組み合わせて投与され得る。

ワクチン組成物の場合、好適なアジュバントの例としては、例えば、水酸化アルミニウム、レシチン、フロインドアジュバント、ＭＰＬ（登録商標）、及びＩＬ－１２が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書で開示のワクチン組成物またはナノ粒子免疫原（例えば、ＨＩＶワクチン組成物）は、制御放出製剤または持続放出製剤として製剤化することができる。これは、徐放性ポリマーを含む組成物中で、またはマイクロカプセル化送達系または生体接着性ゲルにより達成することができる。種々の医薬組成物は、当技術分野で周知の標準的手順に従って調製することができる。

一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、水中油型エマルジョンの形態代謝可能な油（例えば、スクアレン）及びアルファトコフェロールならびにモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－８０）を含むアジュバント製剤を含んでいてもよい。一部の実施形態では、アジュバント製剤は、約２％～約１０％のスクアレン、約２％～約１０％のアルファトコフェロール（例えば、Ｄ－アルファ－トコフェロール）、及び約０．３％～約３％のモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンを含んでいてもよい。一部の実施形態では、アジュバント製剤は、約５％のスクアレン、約５％のトコフェロール、及び約０．４％のモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンを含んでいてもよい。一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、３脱Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ－ＭＰＬ）、及び水中油型エマルションの形態のアジュバントを含んでいてもよく、アジュバントは、代謝可能な油、アルファトコフェロール、及びモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンを含む。一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、ＱＳ２１（キラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の抽出物：画分２１）、３Ｄ－ＭＰＬ、及び水中油型エマルジョンを含んでいてもよく、水中油型エマルジョンは、代謝可能な油、アルファトコフェロール、及びモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンを含む。一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、ＱＳ２１、３Ｄ－ＭＰＬ、および水中油型エマルジョンを含んでいてもよく、水中油型エマルジョンは、以下の組成物：スクアレン、アルファトコフェロール、及びＴｗｅｅｎ－８０などの代謝可能な油を有する。一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、リポソーム組成物の形態のアジュバントを含んでいてもよい。

一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、代謝可能な油（例えば、スクアレン）、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ－８０）、及びＳｐａｎ８５を含むアジュバント製剤を含んでいてもよい。一部の実施形態では、アジュバント製剤は、約５％（重量／容積）スクアレン、約０．５％（重量／容積）モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、及び約０．５％（重量／容積）Ｓｐａｎ８５を含んでいてもよい。

一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、例えばナノ粒子組成物の形態のキラヤサポニン、コレステロール、及びリン脂質を含むアジュバント製剤を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、その後コレステロール及びリン脂質と共に製剤化される、キラヤ・サポナリア・モリナの別々に精製された画分の混合物を含んでいてもよい。

一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、ＭＦ５９（登録商標）、Ｍａｔｒｉｘ－Ａ（登録商標）、Ｍａｔｒｉｘ－Ｃ（登録商標）、Ｍａｔｒｉｘ－Ｍ（登録商標）、ＡＳ０１、ＡＳ０２、ＡＳ０３、及びＡＳ０４からなる群から選択されるアジュバントを含んでいてもよい。

一部の実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、トール様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニストを含んでいてもよく、ＴＬＲ９アゴニストは、非メチル化シチジン－ホスホ－グアノシン（ＣｐＧまたはシトシン－ホスフェート－グアノシンとも呼ばれる）モチーフを含む８～３５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ＨＩＶ抗原（例えば、ｇｐ１２０タンパク質）及びこのオリゴヌクレオチドは、それを必要とするヒト対象などの哺乳動物対象においてＨＩＶ抗原に対する免疫応答を刺激するのに有効な量で免疫原性組成物中に存在する。ＴＬＲ９（ＣＤ２８９）は、微生物ＤＮＡに見出される非メチル化シチジン－ホスホ－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフを認識し、このモチーフは、合成ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）を使用して模倣することができる。ＣｐＧ－ＯＤＮは、抗体産生を増強し、ヘルパーＴ１（Ｔｈ１）細胞応答を刺激することが知られている（Ｃｏｆｆｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３３巻：４９２～５０３頁、２０１０年）。最適なオリゴヌクレオチドＴＬＲ９アゴニストは、一般式：５’－プリン－プリン－ＣＧ－ピリミジン－ピリミジン－３’または５’－プリン－プリン－ＣＧ－ピリミジン－ピリミジン－ＣＧ－３’に従う回文配列を含むことが多い。米国特許第６，５８９，９４０号明細書、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは線状である。他の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、環状であるか、またはヘアピンループを含む。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。一部の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、修飾を含み得る。修飾としては、これらに限定されないが、３’ＯＨ基または５’ＯＨ基の修飾、ヌクレオチド塩基の修飾、糖成分の修飾、及びリン酸基の修飾が挙げられる。修飾塩基がワトソン－クリック塩基対合によるその天然相補体に対する特異性を維持する（例えば、回文部分が依然として自己相補性である）限り、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの回文配列には修飾塩基が含まれ得る。一部の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、非標準塩基を含む。一部の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、２’－デオキシ－７－デアザグアノシン、２’－デオキシ－６－チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’－デオキシ－２’置換－アラビノグアノシン、及び２’－Ｏ－置換－アラビノグアノシンからなる群から選択される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、リン酸基の修飾を含み得る。例えば、ホスホジエステル連結に加えて、ホスフェート修飾としては、これらに限定されないが、ホスホン酸メチル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート（架橋または非架橋）、ホスホトリエステル、及びホスホロジチオエートが挙げられ、任意の組合せで使用され得る。他の非ホスフェート連結も使用され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格のみを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格のみを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル連結及びホスホロチオエート連結の組合せなど、ホスフェート骨格にホスフェート連結の組合せを含む。ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫原性が高く、宿主に注射した後の分解に対してより耐性であると考えることができる（Ｂｒａｕｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４１巻：２０８４～２０８９頁、１９８８年；及びＬａｔｉｍｅｒら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、３２巻：１０５７～１０６４頁、１９９５年）。本開示のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ、２つ、または３つのヌクレオチド間ホスホロチオエートエステル連結を含む。一部の実施形態では、複数のＣｐＧオリゴヌクレオチド分子が、少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物中に存在する場合、ホスホロチオエートエステル連結の両立体異性体が、複数のＣｐＧオリゴヌクレオチド分子中に存在する。一部の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間連結のすべてが、ホスホロチオエート連結であるか、または別の言い方をすれば、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有する。

任意の好適なＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）またはそれらの組合せを、本開示におけるアジュバントとして使用することができる。例えば、Ｋ型ＯＤＮ（Ｂ型とも呼ばれる）は、ホスホロチオエート骨格に複数のＣｐＧモチーフをコードする。Ｋ型ＯＤＮは、以下の配列ＴＣＣＡＴＧＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＴＴに基づき得る。ホスホロチオエートヌクレオチドの使用は、天然ホスホジエステルヌクレオチドと比較して、ヌクレアーゼ消化に対する耐性を増強し、大幅により長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期をもたらす。Ｋ型ＯＤＮは、ｐＤＣが分化しＴＮＦ－αを産生すること、及びＢ細胞が増殖しＩｇＭを分泌することを引き起こす。Ｄ型ＯＤＮ（Ａ型とも呼ばれる）は、混合ホスホジエステル／ホスホロチオエート骨格で構築されており、回文配列にフランキングされた単一のＣｐＧモチーフを含み、３’末端及び５’末端にポリＧ尾部（コンカテマーの形成を促進する構造モチーフ）を有する。Ｄ型ＯＤＮは、以下の配列ＧＧＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧに基づき得る。Ｄ型ＯＤＮは、ｐＤＣが成熟しＩＦＮ－αを分泌することを引き起こすが、Ｂ細胞には効果を及ぼさない。Ｃ型ＯＤＮは、全体がホスホロチオエートヌクレオチドで構成されているという点ではＫ型に似ているが、回文ＣｐＧモチーフを含むという点ではＤ型と似ている。Ｃ型ＯＤＮは、以下の配列ＴＣＧＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＡＣＧＴＴＧＡＴに基づき得る。このクラスのＯＤＮは、Ｂ細胞を刺激してＩＬ－６を分泌させ、ｐＤＣを刺激してＩＦＮ－αを産生させる。Ｐ型ＯＤＮは、２つの回文配列を含み、より高次の構造の形成を可能にする。Ｐ型ＯＤＮは、以下の配列ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧに基づき得る。Ｐ型ＯＤＮは、Ｂ細胞及びｐＤＣを活性化し、Ｃ型ＯＤＮと比較して大幅により多くのＩＦＮ－α産生を誘導する。この段落では、ＯＤＮ配列の太字は自己相補的な回文を示し、ＣｐＧモチーフには下線が引かれている。

例示的なＣｐＧ ＯＤＮは、例えば、ＣｐＧ７９０９（５’－ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ－３’）及びＣｐＧ１０１８（５’－ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ－３’）が公知であり、米国特許第７，２５５，８６８号明細書、第７，４９１，７０６号明細書、第７，４７９，２８５号明細書、第７，７４５，５９８号明細書、第７，７８５，６１０号明細書、第８，００３，１１５号明細書、第８，１３３，８７４号明細書、第８，１１４，４１８号明細書、第８，２２２，３９８号明細書、第８，３３３，９８０号明細書、第８，５９７，６６５号明細書、第８，６６９，２３７号明細書、第９，０２８，８４５号明細書、及び第１０，０５２，３７８号明細書；米国特許出願公開第２０２０／０００２７０４号明細書；ならびにＢｏｄｅら、「ＣｐＧ ＤＮＡ ａｓ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ」、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１１年）、１０巻（４号）：４９９～５１１頁に開示されており、これらの文献はすべて、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

１つまたは複数のアジュバントを組み合わせて使用し得る。１つまたは複数のアジュバントとしては、これらに限定されないが、ミョウバン（アルミニウム塩）、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、リポソーム、及びポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）マイクロ粒子（Ｓｈａｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１４９４巻：１～１４頁、２０１７年）などのマイクロ粒子が挙げられ得る。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、ＨＩＶ抗原が吸着するアルミニウム塩アジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、アルミニウム塩アジュバントは、非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェートスルフェート、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸カリウムアルミニウムからなる群の１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、アルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムの一方または両方を含む。一部の実施形態では、アルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウムを含む。一部の実施形態では、免疫原性組成物の単位用量は、約０．２５～約０．５０ｍｇのＡｌ^３＋、または約０．３５ｍｇのＡｌ^３＋を含む。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、追加のアジュバントをさらに含む。他の好適なアジュバントとしては、これらに限定されないが、水中スクアレン型エマルジョン（例えば、ＭＦ５９またはＡＳ０３）、ＴＬＲ３アゴニスト（例えば、ポリ－ＩＣまたはポリ－ＩＣＬＣ）、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）などの細菌リポポリサッカリド誘導体、及び／またはＡＳ０１もしくはＡＳ０２中にあるようなＱｕｉｌ ＡもしくはＱＳ－２１などのサポニン）、ＴＬＲ５アゴニスト（細菌フラゲリン）、ならびにＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及び／またはＴＬＲ９アゴニスト（イミキモドなどのイミダゾキノリン誘導体、及びレシキモド）が挙げられる（Ｃｏｆｆｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３３巻：４９２～５０３頁、２０１０年）。一部の実施形態では、追加のアジュバントは、ＭＰＬ及びミョウバンを含む（例えば、ＡＳ０４）。獣医学的使用の場合及び非ヒト動物における抗体産生の場合、フロイントアジュバント（完全及び不完全の両方）の有糸分裂促進成分を使用することができる。

一部の実施形態では、免疫原性組成物は、例えば、溶媒、増量剤、緩衝剤、張度調整剤、及び保存剤を含む薬学的に許容される賦形剤を含む（Ｐｒａｍａｎｉｃｋら、Ｐｈａｒｍａ Ｔｉｍｅｓ、４５巻：６５～７７頁、２０１３年）。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、溶媒、増量剤、緩衝剤、及び張度調整剤（例えば、生理食塩水中の塩化ナトリウムは、水性ビヒクル及び張度調整剤の両方としての役目を果たし得る）の１つまたは複数として機能する賦形剤を含み得る。

一部の実施形態では、免疫原性組成物は、溶媒として水性ビヒクルを含む。好適なビヒクルとしては、例えば、無菌水、生理食塩溶液、リン酸緩衝生理食塩水、及びリンゲル溶液が挙げられる。一部の実施形態では、組成物は等張性である。

免疫原性組成物は、緩衝剤を含み得る。緩衝剤は、ｐＨを制御して、処理、保管、及び任意選択で再構成中の活性作用剤の分解を阻害する。好適な緩衝剤としては、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、または硫酸塩を含む塩が挙げられる。他の好適な緩衝剤としては、例えば、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、及びリジンなどのアミノ酸が挙げられる。緩衝剤は、塩酸または水酸化ナトリウムをさらに含み得る。一部の実施形態では、緩衝剤は、組成物のｐＨを６～９の範囲内に維持する。一部の実施形態では、ｐＨは、（下限）６、７、または８よりも大きい。一部の実施形態では、ｐＨは、（上限）９、８、または７未満である。つまり、ｐＨは、下限が上限未満である約６～９の範囲にある。

免疫原性組成物は、張度調整剤を含み得る。好適な張度調整剤としては、例えば、デキストロース、グリセロール、塩化ナトリウム、グリセリン、及びマンニトールが挙げられる。

免疫原性組成物は、増量剤を含み得る。増量剤は、医薬組成物が投与前に凍結乾燥される場合に特に有用である。一部の実施形態では、増量剤は、凍結乾燥または噴霧乾燥中及び／または保管中の活性作用剤の安定化及び分解防止を援助する保護剤である。好適な増量剤は、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、グルコース、及びラフィノースなどの糖（単糖、二糖、及び多糖）である。

免疫原性組成物は、保存剤を含み得る。好適な保存剤としては、例えば、抗酸化剤及び抗菌剤が挙げられる。しかしながら、好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、無菌条件下で調製され、単回使用容器に入っているため、保存剤を含める必要はない。

一部の場合では、本開示の免疫原を、他の作用剤に対する防御応答を誘導する他の医薬品（例えば、ワクチン）と組み合わせることが望ましい場合があり得る。例えば、本明細書に記載の通りの組換えパラミクソウイルスを含む組成物は、予防接種の実施に関する諮問委員会（ＡＣＩＰ；ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ａｃｉｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）により推奨される、ＨＩＶワクチンまたは水痘帯状疱疹ワクチンなど、標的年齢群（例えば、およそ１～６か月齢の乳児）向けの他のワクチンと同時に（典型的には別々に）または順次に投与することができる。そのため、本明細書に記載の組換えＨＩＶ ｇｐ１２０三量体を含む本開示の免疫原は、例えば、Ｂ型肝炎（ＨｅｐＢ）、ジフテリア、破傷風、及び百日咳（ＤＴａＰ）、肺炎球菌細菌（ＰＣＶ）、ｂ型ヘモフィルスＨＩＶｅ（Ｈｉｂ）、ポリオ、ＨＩＶ、ならびにロタウイルスに対するワクチンと同時にまたは順次に投与され得る。

多価ワクチンまたは混合ワクチンは、複数の病原体からの防御を提供する。一部の態様では、多価ワクチンは、同じ病原体の複数の株から防御することができる。一部の態様では、多価ワクチンは、破傷風、百日咳、及びジフテリアの株から防御する混合ワクチンＴｄａｐなど、複数の病原体から防御する。多価ワクチンは、複数の病原体または病原体株からの防御を付与するために必要な免疫化の回数を最小限に抑えるために、投与コストを低減させるために、及び接種率を増加させるために非常に望ましい。これは、例えば、幼児または小児にワクチン接種する場合に特に有用である。

一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載の免疫原性組成物を含むワクチンは、多価ワクチンである。一部の実施形態では、本発明の多価ワクチン組成物に組み込むための抗原性物質は、ＨＩＶ株またはそれらの組合せに由来する。本発明の多価ワクチン組成物に組み込むための抗原は、より広域の防御を提供するために、ＨＩＶの１つの株または複数の株、例えば２～５つの株に由来し得る。一実施形態では、本発明の多価ワクチン組成物に組み込むための抗原は、ＨＩＶの複数の株に由来する。他の有用な抗原としては、不活化ポリオウイルス（Ｊｉａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．（１９８６年）１４巻：１０３～９頁）、Ａ型肝炎の弱毒化株（Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８４年）１４巻：３７３～８６頁）、弱毒化麻疹ウイルス（Ｊａｍｅｓら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９９５年）３３２巻：１２６２～６頁）、及び百日咳ウイルスのエピトープ（例えば、ＡＣＥＬ－ＩＭＵＮＥｒＭ無細胞ＤＴＰ、Ｗｙｅｔｈ－Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）など、生弱毒化及び不活化ウイルスが挙げられる。

一部の態様では、ユニバーサルワクチンは、ＨＩＶの複数の株など、同じウイルスの複数の株から防御するワクチンである。有効なユニバーサルＨＩＶワクチンの開発は、ワクチン製剤化のコスト及び労力を低減し、よりロバストなパンデミックへの備えを可能にするだろう。

一部の態様では、ユニバーサルワクチンは、異なるウイルス株に由来する複数のエピトープで構成されるワクチンである。一部の態様では、ユニバーサルワクチンは、異なるウイルス株にわたって保存されている単一エピトープで構成されている。例えば、ユニバーサルワクチンは、ｇｐ１２０タンパク質の保存された領域など、ＨＩＶ表面タンパク質の比較的保存されたドメインに基づいていてもよい。

一部の実施形態では、組成物は、無菌組成物として提供することができる。医薬組成物は、典型的には、有効量の本開示の免疫原を含み、従来技法により調製することができる。典型的には、免疫原性組成物の各用量における免疫原の量は、重大な有害副作用を起こさずに免疫応答を誘導する量として選択される。一部の実施形態では、組成物は、対象における免疫応答の誘導に使用するための単位剤形で提供することができる。単位剤形は、対象に投与するための好適な単一の予め選択された投薬量、または２つもしくはそれよりも多くの予め選択された単位投薬量の好適な印付きかまたは測定された倍数、ならびに／または単位用量もしくはその倍数を投与するための計量機構を含む。他の実施形態では、組成物は、アジュバントをさらに含む。

ＩＶ． 免疫応答を誘導するための方法
一部の実施形態では、本明細書では、ウイルス抗原三量体を、ワクチンとしてまたは多価ワクチンの一部として、アジュバントを伴わずにもしくはアジュバントと共にまたは１つよりも多くのアジュバントと共に、任意選択で筋肉内注射または鼻腔内投与のいずれかにより使用して、ウイルス感染を予防するための方法が開示される。

一部の実施形態では、本明細書では、ウイルス抗原三量体を、ワクチンとしてまたは多価ワクチンの一部として、アジュバントを伴わずにもしくはアジュバントと共にまたは１つよりも多くのアジュバントと共に、任意選択で筋肉内注射または鼻腔内投与のいずれかにより使用して、感染を予防するため方法が開示される。

一部の実施形態では、本明細書では、中和抗体などの、ウイルス抗原を認識する抗体、例えばＩｇＭまたはＩｇＧを検出することによりウイルス感染を診断するために、ウイルス抗原三量体を抗原として使用するための方法が開示される。

一部の実施形態では、本明細書では、ウイルス抗原三量体を抗原として使用して、受動免疫のために使用することができるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、例えばＨＩＶ感染を治療するための中和ｍＡｂを生成するための方法が開示される。

一部の実施形態では、本明細書では、ワクチンとしてまたは多価ワクチンの一部としてのウイルス抗原三量体であって、ワクチンは、ウイルスの同じタンパク質のウイルス抗原を含むか、または１つもしくは複数のウイルスまたは同じウイルスの１つもしくは複数の株の２つもしくはそれよりも多くの異なるタンパク質のウイルス抗原を含む複数の三量体サブユニットワクチンを含む、ウイルス抗原三量体が開示される。

本開示の免疫原（例えば、組換えＨＩＶ ｇｐ１２０三量体、本開示の組換えＨＩＶ ｇｐ１２０三量体のプロトマーをコードする核酸分子（ＲＮＡ分子など）もしくはベクター、または本開示の組換えＨＩＶ ｇｐ１２０三量体を含むタンパク質ナノ粒子もしくはウイルス様粒子）を対象に投与して、対応するＨＩＶ ｇｐ１２０に対する免疫応答を対象において誘導することができる。特定の例では、対象はヒトである。免疫応答は、防御免疫応答、例えば、対応するＨＩＶ ｇｐ１２０により、その後の感染を阻害する応答であってもよい。免疫応答の誘発は、対応するＨＩＶ ｇｐ１２０に関連する感染症及び疾患を治療または阻害するためにも使用することができる。

例えば、ＨＩＶに曝露されたかまたは曝露の可能性があるため、免疫原中のｇｐ１２０タンパク質に対応するＨＩＶに感染しているかまたは感染を生じさせるリスクがある対象を、治療のために選択することができる。本開示の免疫原の投与後、ＨＩＶに関連する感染症もしくは症状またはその両方について対象をモニターすることができる。

本開示の療法薬及び方法による治療が意図される典型的な対象としては、ヒト、ならびに非ヒト霊長類及び他の動物が挙げられる。本開示の方法による予防または治療のための対象を特定するために、受け入れられているスクリーニング法を使用して、標的とされるかまたは疑われる疾患または状態に関連するリスク因子を決定するか、または対象における既存の疾患もしくは状態の状態を決定する。こうしたスクリーニング法としては、例えば、環境的、家族的、職業的、及び標的とされるかまたは疑われる疾患または状態に関連し得る他のそのようなリスク因子を決定するための従来の検査、ならびに種々のＥＬＩＳＡ及びＨＩＶ感染を検出及び／または特徴付けるための他のイムノアッセイ法などの診断方法が挙げられる。こうした方法及び他の日常的な方法により、臨床医は、本開示の方法及び医薬組成物を使用した療法を必要とする患者を選択することができる。こうした方法及び原理によると、組成物は、本明細書の教示または他の従来方法に従って、独立した予防もしくは治療プログラムとして、または他の治療に対する経過観察レジメン、補助レジメン、または連係治療レジメンとして投与することができる。

本開示の免疫原の投与は、予防目的であってもよくまたは療法目的であってもよい。予防的に提供される場合、本開示の療法剤は、任意の症状の前に、例えば感染前に提供される。本開示の療法剤の予防的投与は、あらゆるその後の感染を予防または改善する役目を果たす。療法的に提供される場合、本開示の療法剤は、疾患または感染症の症状の発症時にまたは発症後に、例えば、免疫原中のｇｐ１２０タンパク質に対応するＨＩＶによる感染症の症状の発生後にまたはＨＩＶ感染と診断された後に提供される。したがって、療法剤は、感染症及び／または関連する疾患症状の予想される重症度、期間、もしくは程度を減弱させるためにＨＩＶへの予想される曝露の前に、ウイルスに曝露された後にもしくは曝露が疑われた後に、または感染症が実際に発症した後に提供することができる。

本明細書に記載の免疫原及びそれらの免疫原性組成物は、対象、好ましくはヒトにおいて、免疫原中のＨＩＶウイルスｇｐ１２０タンパク質に対する免疫応答を誘導または増強するのに有効な量で対象に提供される。本開示の免疫原の実際の投薬量は、疾患徴候及び対象の特定の状態（例えば、対象の年齢、サイズ、健康状態、症状の程度、及び感受性因子など）、投与の時間及び経路、同時に投与されている他の薬物または治療、ならびに対象において所望の活性または生物学的応答を誘発するための組成物の特定の薬理学的特徴などの要因に応じて様々であろう。投薬レジメンは、最適な予防応答または療法応答を提供するように調整することができる。

本開示の免疫原の１つまたは複数を含む免疫原性組成物は、連係（または予備刺激－追加免疫）ワクチン接種プロトコールまたは組合せ製剤で使用することができる。ある特定の実施形態では、新規の組合せ免疫原性組成物及び連係免疫化プロトコールでは、各々が、ＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質に対する免疫応答などの抗ウイルス免疫応答を誘発することを目的とする別々の免疫原または製剤が使用される。抗ウイルス免疫応答を誘発する別々の免疫原性組成物は、単一の免疫化ステップで対象に投与される多価免疫原性組成物に組み合わせてもよく、または連係（または予備刺激－追加免疫）免疫化プロトコールにて別々に（一価免疫原性組成物で）投与するしてもよい。

幾つかの追加免疫が存在してもよく、各追加免疫は、異なる本開示の免疫原であってもよい。一部の例では、追加免疫は、別の追加免疫または予備刺激と同じ免疫原であり得る。予備刺激及び追加免疫は、単一用量または複数用量として投与することができ、例えば、２用量、３用量、４用量、５用量、６用量、またはそれよりも多くを、数日間、数週間、または数か月にわたって対象に投与することができる。１回～５回（例えば、１回、２回、３回、４回、または５回の追加免疫）またはそれよりも多くなど、複数の追加免疫を投与することもできる。一連の順次免疫化では、異なる投薬量を使用することができる。例えば、予備刺激免疫では比較的大きな用量であり、次いで追加免疫では比較的より少量の用量である。

一部の実施形態では、追加免疫は、予備刺激の約２週間後、約３週間～８週間後、もしくは約４週間後、または予備刺激の約数か月後であってもよい。一部の実施形態では、追加免疫は、予備刺激の約５、約６、約７、約８、約１０、約１２、約１８、約２４か月後、または予備刺激の多少の時間後に投与することができる。対象の「免疫記憶」を増強するために、適切な時点で定期的なさらなる追加免疫を使用することもできる。選択されたワクチン接種パラメーター、例えば製剤、用量、及びレジメンなどの妥当性は、対象から血清のアリコートを採取し、免疫化プログラムの過程中に抗体力価をアッセイすることにより決定することができる。加えて、対象の臨床状態は、所望の効果、例えば、感染の予防または病状の改善（例えば、ウイルス量の低減）についてモニターすることができる。そのようなモニタリングによりワクチン接種が最適ではないことが示された場合、対象を、追加用量の免疫原性組成物で追加免疫し、免疫応答を強化することが期待されるようにワクチン接種パラメーターを変更することができる。

一部の実施形態では、予備刺激－追加免疫法は、対象へのＤＮＡ－予備刺激及びタンパク質－追加免疫ワクチン接種プロトコールを含んでいてもよい。この方法は、核酸分子またはタンパク質の２回またはそれよりも多くの投与を含んでいてもよい。

タンパク質療法薬の場合、典型的には、各ヒト用量は、約１μｇ～約１００μｇなどの１～１０００μｇの、例えば、約１μｇ、約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、または約５０μｇなどの約１μｇ～約５０μｇのタンパク質を含むことになる。

免疫原性組成物に使用される量は、対象集団（例えば、乳児または高齢者）に基づいて選択される。特定の組成物の最適な量は、対象における抗体力価及び他の応答の観察を含む標準的な研究により確かめることができる。免疫原性組成物中の、本開示の組換えＨＩＶ ｇｐ１２０三量体、ウイルスベクター、または核酸分子などの本開示の免疫原の治療有効量は、単一用量の投与では免疫応答の誘発に有効ではないが、複数投薬量の投与時には、例えば予備刺激－追加免疫投与プロトコールでは有効である量を含むことができることが理解される。

本開示の免疫原を投与すると、対象の免疫系は、典型的には、免疫原に含まれるＨＩＶ ｇｐ１２０三量体に特異的な抗体を産生することにより、免疫原性組成物に応答する。そのような応答は、免疫学的に有効な用量が対象に送達されたことを意味する。

一部の実施形態では、対象の抗体応答を、有効な投薬量／免疫化プロトコールを評価する状況にて決定することになる。ほとんどの場合、対象から得られる血清または血漿中の抗体価を評価するだけで十分であろう。追加免疫接種を施すか否か、及び／または個体に投与される療法剤の量を変更するか否かに関する決定は、少なくとも部分的には抗体力価レベルに基づいてもよい。例えば、抗体力価レベルは、例えば、免疫原に含まれる組換えＨＩＶ ｇｐ１２０三量体を含む抗原に結合する抗体の血清中濃度が測定される免疫結合アッセイに基づいてもよい。

こうした方法が有効であるためには、ＨＩＶ感染を完全に排除することも、低減することも、予防することも必要ではない。例えば、本開示の免疫原の１つまたは複数による、ＨＩＶに対する免疫応答の誘発は、ＨＩＶによる感染を、所望の量だけ、例えば、免疫原の非存在下でのＨＩＶによる感染と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも１００％さえ（検出可能な感染細胞の排除または予防）低減または阻害することができる。追加の例では、ＨＩＶ複製を、本開示の方法により低減または阻害することができる。この方法が有効であるためには、ＨＩＶ複製を完全に排除する必要はない。例えば、本開示の免疫原の１つまたは複数を使用して誘発される免疫応答は、対応するＨＩＶの複製を、所望の量だけ、例えば、免疫応答の非存在下でのＨＩＶ複製と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも１００％さえ（検出可能なＨＩＶ複製の排除または予防）低減することができる。

一部の実施形態では、本開示の免疫原は、アジュバントの投与と同時に対象に投与される。他の実施形態では、本開示の免疫原は、アジュバントの投与後であり、免疫応答を誘導するのに十分な時間内に対象に投与される。

核酸を投与するための１つの手法は、哺乳動物発現プラスミドによるなど、プラスミドＤＮＡによる直接免疫化である。核酸構築物による免疫化は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，６４３，５７８号明細書（所望の抗原をコードするＤＮＡを導入して細胞媒介姓応答または体液性応答を誘発することにより脊椎動物を免疫する方法が記載されている）、ならびに米国特許第５，５９３，９７２号明細書及び第５，８１７，６３７号明細書（発現を可能にする調節配列に、抗原をコードする核酸配列を作動可能に連結することが記載されている）に教示されている。米国特許第５，８８０，１０３号明細書には、免疫原性ペプチドまたは他の抗原をコードする核酸を生物に送達するための幾つかの方法が記載されている。こうした方法としては、核酸（または合成ペプチド自体）のリポソーム送達、及び免疫刺激構築物、またはコレステロール及びＱｕｉｌ Ａ（登録商標）（サポニン）の混合時に自発的に形成される、サイズが３０～４０ｎｍの負荷電ケージ様構造であるＩＳＣＯＭＳ（登録商標）が挙げられる。トキソプラズマ症及びエプスタイン－バーウイルス誘導性腫瘍を含む感染症の様々な実験モデルにおいて、ＩＳＣＯＭＳ（登録商標）を抗原の送達ビヒクルとして使用して防御免疫が生成されている（Ｍｏｗａｔ及びＤｏｎａｃｈｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １２巻：３８３頁、１９９１年）ＩＳＣＯＭＳ（登録商標）に封入された１μｇと低い用量の抗原が、クラスＩ媒介性ＣＴＬ応答をもたらすことが見出された（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３４４巻：８７３頁、１９９０年）。

一部の実施形態では、プラスミドＤＮＡワクチンを使用して、対象において本開示の免疫原を発現させる。例えば、本開示の免疫原をコードする核酸分子を対象に投与して、免疫原に含まれるＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質に対する免疫応答を誘導することができる。一部の実施形態では、核酸分子は、ｐＶＲＣ８４００ベクター（Ｂａｒｏｕｃｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７９巻、８８２８～８８３４頁、２００５年に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる）などの、ＤＮＡ免疫化のためのプラスミドベクターに含まれていてもよい。

免疫化に核酸を使用する別の手法では、本開示の組換えＨＩＶ ｇｐ１２０または組換えＨＩＶ ｇｐ１２０三量体を、弱毒化ウイルス宿主もしくはベクターまたは細菌ベクターにより発現させることができる。別の実施形態では、ウイルスベクターに基づく免疫化プロトコールを使用して、本開示の組換えＨＩＶ ｇｐ１２０またはＨＩＶ ｇｐ１２０三量体をコードする核酸を細胞内に直接的に送達することができる。レトロウイルス系及びアデノウイルス系など、遺伝子導入を目的とした少なからぬウイルスベース系が記載されている。組換えワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、サイトグメガロウイルス、または他のウイルスベクターを使用して、ペプチドまたはタンパク質を発現させ、それによりＣＴＬ応答を誘発させることができる。例えば、免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクター及び方法は、米国特許第４，７２２，８４８号明細書に記載されている。ＢＣＧ（カルメット・ゲラン菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ））は、ペプチド発現のための別のベクターを提供する（Ｓｔｏｖｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３５１巻：４５６～４６０頁、１９９１年を参照）。

一実施形態では、本開示の組換えＨＩＶ ｇｐ１２０またはＨＩＶ ｇｐ１２０三量体をコードする核酸は、細胞内に直接的に導入される。例えば、核酸は、標準的な方法により金マイクロスフェアに負荷され、Ｂｉｏ－ＲａｄのＨＥＬＩＯＳ（登録商標）遺伝子銃などのデバイスにより皮膚内に導入することができる。核酸は、強力なプロモーターの制御下のプラスミドからなる「ネイキッド」であってもよい。典型的には、ＤＮＡは筋肉内に注射されるが、他の部位内に直接注射することもできる。注射の投薬量は、通常は、約０．５μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇである（例えば、米国特許第５，５８９，４６６号明細書を参照）。

例えば、核酸は、標準的な方法により金マイクロスフェアに負荷され、Ｂｉｏ－ＲａｄのＨＥＬＩＯＳ（登録商標）遺伝子銃などのデバイスにより皮膚内に導入することができる。核酸は、強力なプロモーターの制御下のプラスミドからなる「ネイキッド」であってもよい。典型的には、ＤＮＡは筋肉内に注射されるが、他の部位内に直接注射することもできる。注射の投薬量は、通常は、約０．５μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇである（例えば、米国特許第５，５８９，４６６号明細書を参照）。

別の実施形態では、ｍＲＮＡに基づく免疫化プロトコールを使用して、本開示の組換えＨＩＶ ｇｐ１２０またはＨＩＶ ｇｐ１２０三量体をコードする核酸を細胞内に直接的に送達することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡに基づく核酸ベースワクチンは、前述の手法に対する強力な代替手段を提供し得る。ｍＲＮＡワクチンは、宿主ゲノム内へのＤＮＡ組込みに関する安全性の懸念を排除し、宿主細胞細胞質において直接的に翻訳され得る。さらに、ＲＮＡの単純な無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成により、ウイルスベクターに関連する製造上の複雑さが回避される。本開示の組換えＨＩＶ ｇｐ１２０またはＨＩＶ ｇｐ１２０三量体をコードする核酸を送達するために使用することができるＲＮＡベースワクチン接種の２つの例示的な形態としては、従来の非増幅ｍＲＮＡ免疫化が挙げられる。そのような方法は、ＨＩＶのようなウイルスと共に使用されており、当業者にはなじみのあるものである（例えば、Ｐｅｔｓｃｈら、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３０巻（１２号）：１２１０～６頁、２０１２年、及び自己増殖ｍＲＮＡ免疫化（例えば、Ｇｅａｌｌら、「Ｎｏｎｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｅｌｆ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、ＰＮＡＳ、１０９巻（３６号）：１４６０４～１４６０９頁、２０１２年；Ｍａｇｉｎｉら、「Ｓｅｌｆ－Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｍＲＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａｎｔｉｇｅｎｓ Ｃｏｎｆｅｒ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ Ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ」、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、１１巻（８号）：ｅ０１６１１９３、２０１６年；及びＢｒｉｔｏら、「Ｓｅｌｆ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｍＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ．、８９巻：１７９～２３３頁、２０１５年を参照）を参照されたい）。一部の実施形態では、単離された核酸は、ＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、核酸は、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ、非増幅ｍＲＮＡ、自己増幅ｍＲＮＡ、またはトランス増幅ｍＲＮＡなどのｍＲＮＡ分子である。

一部の実施形態では、本開示の組換えＨＩＶ ｇｐ１２０またはＨＩＶ ｇｐ１２０三量体をコードする核酸は、細胞内に直接的に導入される。例えば、核酸またはタンパク質は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）内に含まれていてもよい。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、標準的な天然ウイルスの組織及び構造を模倣するが、ウイルスゲノムを欠如する多タンパク質構造である。

一部の実施形態では、治療有効量の本開示の免疫原の１つまたは複数を対象に投与することにより、対象において中和免疫応答が誘導される。中和活性を評価するために、対象の免疫化後に、適切な時点で対象から血清を収集し、凍結させ、中和試験のために保管することができる。中和活性をアッセイするための方法は、当業者に公知であり、本明細書にさらに記載されており、これらに限定されないが、プラーク低減中和（ＰＲＮＴ）アッセイ、マイクロ中和アッセイ、フローサイトメトリーベースアッセイ、単一サイクル感染アッセイが挙げられる。

一部の実施形態では、治療有効量の本開示の免疫原の１つまたは複数を対象に投与することにより、対象において中和免疫応答が誘導される。中和活性を評価するために、対象の免疫化後に、適切な時点で対象から血清を収集し、凍結させ、中和試験のために保管することができる。中和活性をアッセイするための方法は、当業者に公知であり、本明細書にさらに記載されており、これらに限定されないが、プラーク低減中和（ＰＲＮＴ）アッセイ、マイクロ中和アッセイ、フローサイトメトリーベースアッセイ、単一サイクル感染アッセイが挙げられる。一部の実施形態では、血清中和活性は、一群のＨＩＶ偽ウイルスを使用してアッセイすることができる。

一部の実施形態では、本明細書で開示される免疫原により誘導される中和免疫応答は、ＨＩＶなどのＲＮＡウイルスに対する中和抗体を生成する。一部の実施形態では、本明細書の中和抗体は、ＨＩＶなどのＲＮＡウイルスの細胞受容体またはその成分に結合する。一部の実施形態では、ウイルス受容体は、レトロウイルス受容体または共受容体、好ましくはＨＩＶ－１またはＨＩＶ－２受容体または共受容体である。一部の実施形態では、本明細書の中和抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＨＩＶ放出、ＨＩＶ受容体シグナル伝達、膜ＨＩＶ切断、ＨＩＶ活性、ＨＩＶ産生、及び／または合成など、少なくとも１つのＲＮＡウイルスを、例えばＨＩＶ活性もしくは結合を、またはＲＮＡウイルス受容体を、例えばＨＩＶ受容体活性もしくは結合をモジュレート、減少、アンタゴナイズ、軽減、遮断、阻害、無効化、及び／または妨害する。一部の実施形態では、本明細書で開示される免疫原は、ＣＤ４及び共受容体（例えば、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４）などの受容体または共受容体に対するＨＩＶウイルス結合をモジュレート、減少、アンタゴナイズ、軽減、遮断、阻害、無効化、及び／または妨害する、ＨＩＶなどのＲＮＡウイルスに対する中和抗体を誘導する。

Ｖ． 製造品またはキット
また、本明細書で提供される本提供の組換えポリペプチド、タンパク質、及び免疫原性組成物を含む製造品またはキットが提供される。製造品は、容器、及び容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書を含み得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、試験管、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料で形成され得る。一部の実施形態では、容器は、無菌アクセスポートを有する。例示的な容器としては、注射用の針で突き刺すことができるストッパーを有するものを含む、静脈内溶液バッグ、バイアルが挙げられる。製造品またはキットは、組成物を使用して、本明細書に記載の状態（例えば、ＨＩＶ感染）などの特定の状態を治療することができることを示す添付文書をさらに含み得る。その代わりにまたはそれに加えて、製造品またはキットは、薬学的に許容される緩衝液を含む別のまたは同じ容器をさらに含み得る。製造品またはキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及び／またはシリンジなどの他の材料をさらに含み得る。

ラベルまたは添付文書は、個体のＨＩＶ感染を治療するために組成物が使用されることを示し得る。容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書は、製剤の再構成及び／または使用に関する指示を示し得る。ラベルまたは添付文書は、製剤が、個体のＨＩＶ感染を治療または予防するための皮下、静脈内、または他の投与様式に有用であるかまたは意図されていることをさらに示し得る。

一部の実施形態における容器は、組成物それ自体を、または状態を治療、予防、及び／もしくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わされている組成物を保持する。製造品またはキットは、（ａ）免疫原性組成物またはタンパク質もしくはその組換えポリペプチドを含む組成物（つまり、第１の薬剤）その中に含む第１の容器；及び（ｂ）アジュバントまたは別様の療法剤などのさらなる作用剤を含む組成物（つまり、第２の薬剤）をその中に含む第２の容器を含み得、物品またはキットは、有効量の第２の薬剤で対象を治療するための、ラベル上の指示書または添付文書をさらに含む。

用語法
別様の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記法、ならびに他の技術的及び科学的用語または用語法は、特許請求されている主題が関する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有することが意図されている。一部の場合では、一般的に理解されている意味を有する用語は、本明細書では、明瞭性のために及び／または参照し易さのために定義されており、本明細書におけるそのような定義の包含は、当技術分野で一般に理解されているものと実質的に異なることを表すとは必ずしも解釈されるべきではない。

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために同義的に使用され、最小長に限定されない。本提供の受容体及び他のポリペプチド、例えばリンカーまたはペプチドを含むポリペプチドは、天然及び／または非天然アミノ酸残基を含むアミノ酸残基を含み得る。この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、及びリン酸化も含む。一部の態様では、ポリペプチドは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然または自然の配列に対する修飾を含み得る。こうした修飾は、部位特異的突然変異誘発などによる意図的なものであり得るか、またはタンパク質を産生する宿主の突然変異もしくはＰＣＲ増幅によるエラーなどによる偶発的なものであり得る。

本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒトまたは他の動物などの哺乳動物であり、典型的にはヒトである。一部の実施形態では、１つまたは複数の作用剤、細胞、細胞集団、または組成物が投与される対象、例えば患者は、哺乳動物、典型的にはヒトなどの霊長類である。一部の実施形態では、霊長類は、サルまたは類人猿である。対象は、男性であってもよくまたは女性であってもよく、乳児、未成年、若者、成人、及び老人対象を含む、任意の好適な年齢であってもよい。一部の実施形態では、対象は、げっ歯類などの非霊長類哺乳動物である。

本明細書で使用される場合、「治療」（及び「治療する」または「治療すること」などのその文法的変化形）は、疾患もしくは状態もしくは障害、またはそれらに関連する症状、副作用、もしくは転帰、もしくは表現型の完全なまたは部分的な改善または低減を指す。治療の望ましい効果としては、これらに限定されないが、疾患の発生または再発の防止、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移の防止、疾患進行速度の減少、病状の改善または緩和、及び寛解または予後向上が挙げられる。こうした用語は、疾患の完全な治癒も、任意の症状の完全な排除も、すべての症状または転帰に対して効果があることも意味しない。

本明細書で使用される場合、「疾患の発症を遅延させる」は、疾患（がんなど）の発症を遅らせる、妨げる、緩徐させる、遅滞させる、安定させる、抑制する、及び／または先に延ばすことを意味する。この遅延は、疾患の履歴及び／または治療されている個体に応じて、様々な期間であり得る。一部の実施形態では、十分なまたは著しい遅延は、個体が疾患を発症しないという点で、事実上、予防を包含することができる。例えば、転移の発生などの末期がんを遅延させ得る。

「予防すること」は、本明細書で使用する場合、疾患の素因を有し得るが、疾患を有するとまだ診断されていない対象における疾患の発症または再発に対して予防を提供することを含む。一部の実施形態では、本提供の細胞及び組成物は、疾患の発症を遅延させるために、または疾患の進行を緩徐させるために使用される。

本明細書で使用される場合、機能または活性を「抑制する」は、目的の状態またはパラメーターを除いて他の点では同じ状態と比較して、またはその代わりに別の状態と比較して、機能または活性を低減させることである。例えば、腫瘍増殖を抑制する細胞は、細胞の非存在下での腫瘍の増殖速度と比較して、腫瘍の増殖速度を低減させる。

作用剤、例えば、医薬製剤、細胞、または組成物の「有効量」は、投与の状況では、必要な投薬量／量及び期間において、療法結果または予防結果など、所望の結果を達成するために有効な量を指す。

作用剤、例えば医薬製剤または細胞の「治療有効量」は、必要な投薬量及び期間において、疾患、状態、もしくは障害の治療などの所望の療法結果を、及び／または治療の薬物動態学的または薬力学的効果を達成するのに有効な量を指す。治療有効量は、対象の病状、年齢、性別、及び体重、ならびに投与される細胞集団などの要因に応じて様々であり得る。一部の実施形態では、本提供の方法は、細胞及び／または組成物を、有効量で、例えば治療有効量で投与することを含む。

「予防有効量」は、必要な投与量及び期間において、所望の予防結果を達成するために有効な量を指す。必ずというわけではないが、典型的には、予防用量は、疾患の前または初期段階で対象に使用されるため、予防有効量は、治療有効量よりも少ないだろう。腫瘍負荷がより低い状況では、予防有効量は、一部の態様では、治療有効量よりも高くなるだろう。

「約」という用語は、本明細書で使用される場合、当技術分野の当業者に直ちに公知であるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における値またはパラメーターの「約」への言及は、その値またはパラメーター自体に向けられた実施形態を含む（及び記述する）。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、状況が明確に別様の指示をしない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」を意味する。

本開示を通して、特許請求されている主題の種々の態様が範囲形式で提示されている。範囲形式での記載は、便宜上及び簡潔性のために過ぎず、特許請求されている主題の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての考え得る部分範囲を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、値の範囲が提供されている場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の表記されている値または介在値は、特許請求されている主題内に包含されることが理解される。こうしたより小さな範囲の上限及び下限は、独立してより小さな範囲に含まれ得、表記されている範囲における任意の特に除外される端値に応じて、特許請求されている主題内にも包含される。表記されている範囲が端値の一方または両方を含む場合、こうした含まれる端値のいずれかまたは両方を除外する範囲も、特許請求されている主題に含まれる。これは、範囲の幅広さに関わりなく適用される。

本明細書で使用される場合、組成物は、細胞を含む、２つまたはそれよりも多くの産物、物質、または化合物の任意の混合物を指す。組成物は、溶液、懸濁物、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらの任意の組合せであり得る。

「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それに連結されている別の核酸を増殖させることが可能な核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、ベクターに作動可能に連結した核酸の発現を指図することが可能である。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。

「多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｃｙ）」及び「多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｙ）」は、本明細書では同義的に使用され、複数の異なるタンパク質をコードするかまたは含む核酸またはタンパク質組成物、例えばタンパク質またはその断片の特徴を指す。各核酸、例えばプラスミドは、異なるＨＩＶエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ ｇｐ）、または欠損ＨＩＶウイルス粒子の形態のＥｎｖ ｇｐ、または異なるクレードのＨＩＶエンベロープ糖タンパク質、またはこうした可能性の組合せのいずれかをコードし、この多価核酸、例えばＤＮＡプラスミド、ワクチンの柔軟性を可能にする。本明細書で使用される場合、「エンベロープ糖タンパク質」（Ｅｎｖ ｇｐ）は、単離されたＥｎｖ ｇｐだけでなく、欠損ウイルス粒子の形態のＥｎｖ ｇｐも指す。「三価」は、３つの異なる抗原（例えば、クレードＡ分離株のｅｎｖ遺伝子、クレードβ分離株のｅｎｖ遺伝子、及びクレードＣ分離株のｅｎｖ遺伝子）の組成物を指す。同様に、「四価」及び「八価」は、それぞれ４つ及び８つの固有の抗原を有する組成物を指す。

例示的な実施形態
１． 複数の組換えポリペプチドを含むタンパク質であって、各組換えポリペプチドは、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに連結されたヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０タンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープを含み、組換えポリペプチドのＣ末端プロペプチドは、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する、タンパク質。

２． ＨＩＶは、ＨＩＶ－１であり、任意選択で、ティア１Ｂ（ｔｉｅｒ１Ｂ）、ティア１Ａ（ｔｉｅｒ１Ａ）、ティア２（ｔｉｅｒ２）、またはティア３（ｔｉｅｒ３）ウイルスである、実施形態１に記載のタンパク質。

３． エピトープは、線状エピトープまたは立体構造エピトープである、実施形態１または２に記載のタンパク質。

４． ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、外側ドメインサブユニットペプチド、内側ドメインサブユニットペプチド、またはそれらの任意の組合せを含み、このタンパク質は、３つの組換えポリペプチドを含む、実施形態１～３のいずれかに記載のタンパク質。

５． ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、任意選択で架橋シートにより隔てられている、１、２、３、４、または５つのＣ領域及び１、２、３、４、または５つの可変領域を含む、実施形態１～４のいずれかに記載のタンパク質。

６． ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、ｇｐ１２０タンパク質の外側サブユニットまたは内側サブユニットを含む、実施形態１～５のいずれかに記載のタンパク質。

７． ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、ｇｐ１２０タンパク質の内側サブユニット及び外側サブユニットを含み、任意選択で、外側サブユニット及び内側サブユニットは、ジスルフィド結合または人工的に導入されたリンカーにより連結されている、実施形態１～６のいずれかに記載のタンパク質。

８． ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、膜貫通（ＴＭ）ドメインペプチド及び／または細胞質（ＣＰ）ドメインペプチドを含まない、実施形態１～７のいずれかに記載のタンパク質。

９． ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、プロテアーゼ切断部位を含み、プロテアーゼは、任意選択で、フリン、ＴＭＰＲＳＳ２などの膜貫通セリンプロテアーゼ、トリプシン、第Ｘａ因子、またはカテプシンＬである、実施形態１～８のいずれかに記載のタンパク質。

１０． ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、プロテアーゼ切断部位を含まず、プロテアーゼは、任意選択で、フリン、ＴＭＰＲＳＳ２などの膜貫通セリンプロテアーゼ、トリプシン、第Ｘａ因子、またはカテプシンＬである、実施形態１～８のいずれかに記載のタンパク質。

１１． ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、可溶性であるか、または脂質二重層、例えば、膜もしくはウイルスエンベロープに直接的に結合しない、実施形態１～１０のいずれかに記載のタンパク質。

１２． ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、タンパク質の組換えポリペプチド間で同じであるかまたは異なる、実施形態１～１１のいずれかに記載のタンパク質。

１３． ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、Ｃ末端プロペプチドに直接的に融合されているか、またはグリシン－Ｘ－Ｙリピートを含むリンカーであって、Ｘ及びＹは独立して任意のアミノ酸であり、任意選択でプロリンもしくはヒドロキシプロリンであるリンカーなどのリンカーを介してＣ末端プロペプチドに連結されている、実施形態１～１２のいずれかに記載のタンパク質。

１４． 可溶性である、実施形態１～１３のいずれかに記載のタンパク質。

１５． タンパク質は、脂質二重層、例えば、膜またはウイルスエンベロープに直接的に結合しない、実施形態１～１４のいずれかに記載のタンパク質。

１６． タンパク質は、対象の細胞表面付着因子または受容体に結合することが可能であり、任意選択で、対象は、霊長類、例えばヒトなどの哺乳動物である、実施形態１～１５のいずれかに記載のタンパク質。

１７． Ｃ末端プロペプチドは、ヒトコラーゲンのものである、実施形態１～１６のいずれかに記載のタンパク質。

１８． Ｃ末端プロペプチドは、ｐｒｏα１（Ｉ）、ｐｒｏα１（ＩＩ）、ｐｒｏα１（ＩＩＩ）、ｐｒｏα１（Ｖ）、ｐｒｏα１（ＸＩ）、ｐｒｏα２（Ｉ）、ｐｒｏα２（Ｖ）、ｐｒｏα２（ＸＩ）、またはｐｒｏα３（ＸＩ）、またはそれらの断片を含む、実施形態１～１７のいずれかに記載のタンパク質。

１９． Ｃ末端プロペプチドは、組換えポリペプチド間で同じであるかまたは異なる、実施形態１～１８のいずれかに記載のタンパク質。

２０． Ｃ末端プロペプチドは、配列番号３１～４６のいずれか、またはポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することが可能な、それらと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～１９のいずれかに記載のタンパク質。

２１． Ｃ末端プロペプチドは、配列番号３１、またはポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することが可能な、それと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。

２２． Ｃ末端プロペプチドは、配列番号３２、またはポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することが可能な、それと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。

２３． Ｃ末端プロペプチドは、配列番号３３、またはポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することが可能な、それと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。

２４． Ｃ末端プロペプチドは、配列番号３４、またはポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することが可能な、それと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。

２５． Ｃ末端プロペプチドは、配列番号３５、またはポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することが可能な、それと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。

２６． Ｃ末端プロペプチドは、配列番号３６、またはポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することが可能な、それと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。

２７． Ｃ末端プロペプチドは、配列番号３７、またはポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することが可能な、それと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。

２８． Ｃ末端プロペプチドは、配列番号３８、またはポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することが可能な、それと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。

２９． Ｃ末端プロペプチドは、配列番号３９、またはポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することが可能な、それと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。

３０． Ｃ末端プロペプチドは、配列番号３１～４６のいずれかのＮ末端に連結されたグリシン－Ｘ－Ｙリピートであって、Ｘ及びＹは、独立して任意のアミノ酸であり、任意選択でプロリンもしくはヒドロキシプロリンである、グリシン－Ｘ－Ｙリピートを含む配列、またはポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することが可能な、それらと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～２９のいずれかに記載のタンパク質。

３１． 各組換えポリペプチド中のｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、融合前立体構造または融合後立体構造をとる、実施形態１～３０のいずれかに記載のタンパク質。

３２． 各組換えポリペプチド中のｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、配列番号１９～３０、またはそれらと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態１～３１のいずれかに記載のタンパク質。

３３． 組換えポリペプチドは、配列番号１～１８、またそれらと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１～３２のいずれかに記載のタンパク質。

３４． 実施形態１～３３のいずれかに記載のタンパク質を含む免疫原。

３５． ナノ粒子に直接的または間接的に連結された実施形態１～３３のいずれかに記載のタンパク質を含むタンパク質ナノ粒子。

３６． 実施形態１～３３のいずれかに記載のタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。

３７． 実施形態１～３３のいずれかに記載のタンパク質の組換えポリペプチドの１つ、２つ、３つ、またはそれよりも多くをコードする単離された核酸。

３８． ｇｐ１２０タンパク質ペプチドをコードするポリペプチドは、コラーゲンのＣ末端プロペプチドをコードするポリペプチドにインフレームで融合されている、実施形態３７に記載の単離された核酸。

３９． プロモーターに作動可能に連結している、実施形態３７または３８に記載の単離された核酸。

４０． ＤＮＡ分子である、実施形態３７～３９のいずれかに記載の単離された核酸。

４１． ＲＮＡ、任意選択で、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ、非増幅ｍＲＮＡ、自己増幅ｍＲＮＡ、またはトランス増幅ｍＲＮＡなどのｍＲＮＡ分子である、実施形態３７～３９のいずれかに記載の単離された核酸。

４２． 実施形態３７～４１のいずれかに記載の単離された核酸を含むベクター。

４３． ウイルスベクターである、実施形態４２に記載のベクター。

４４． 実施形態４２または４３に記載のベクターを含むウイルス、偽ウイルス、または細胞であって、任意選択でウイルスまたは細胞は、組換えゲノムを有する、ウイルス、偽ウイルス、または細胞。

４５． 実施形態１～４４のいずれか１つに記載のタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、または細胞、及び薬学的に許容される担体を含む、免疫原性組成物。

４６． 実施形態４５に記載の免疫原性組成物及び任意選択でアジュバントを含むワクチンであって、任意選択でサブユニットワクチンであり、ならびに／または任意選択で予防用及び／もしくは療法用ワクチンであるワクチン。

４７． 複数の異なるアジュバントを含む、実施形態４６に記載のワクチン。

４８． タンパク質を産生するための方法であって、宿主細胞において実施形態３７～４３のいずれか１つに記載の単離された核酸またはベクターを発現させて、実施形態１～３３のいずれかに記載のタンパク質を産生させること；及びタンパク質を精製することを含む方法。

４９． 実施形態４８に記載の方法により産生されるタンパク質。

５０． 対象においてＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープに対する免疫応答を生成するための方法であって、実施形態１～４７及び４９のいずれか１つに記載のタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、細胞、免疫原性組成物、またはワクチンの治療有効量を対象に投与して、免疫応答を生成することを含む方法。

５１． ＨＩＶによる感染を治療または予防するための、実施形態５０に記載の方法。

５２． 免疫応答の生成は、対象におけるＨＩＶの複製を阻害または低減させる、実施形態５０または５１に記載の方法。

５３． 免疫応答は、任意選択で、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体などの１つまたは複数の中和抗体の産生を含む、細胞媒介姓応答及び／または体液性応答を含む、実施形態５０～５２のいずれかに記載の方法。

５４． 免疫応答は、ＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープに対するものであるが、Ｃ末端プロペプチドに対するものではない、実施形態５０～５３のいずれかに記載の方法。

５５． 投与は、１つまたは複数のＨＩＶウイルスに以前に曝露されたための抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を対象にもたらさない、実施形態５０～５４のいずれかに記載の方法。

５６． 投与は、１つまたは複数のＨＩＶウイルスにその後曝露されたための抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を対象にもたらさない、実施形態５０～５５のいずれかに記載の方法。

５７． 予備刺激ステップ及び／または追加免疫ステップをさらに含む、実施形態５０～５６のいずれかに記載の方法。

５８． 投与ステップは、局部的、経皮、皮下、皮内、経口、鼻腔内（例えば、鼻腔内噴霧）、気管内、舌下、頬側、直腸、膣内、吸入、静脈内（例えば、静脈内注射）、動脈内、筋肉内（例えば、筋肉内注射）、心臓内、骨内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局所、または皮膚上投与により実施される、実施形態５０～５７のいずれかに記載の方法。

５９． 有効量は、単一用量または１つもしくは複数の間隔で隔てられている一連の用量で投与される、実施形態５０～５８のいずれかに記載の方法。

６０． 有効量は、アジュバントを伴わずに投与される、実施形態５０～５９のいずれかに記載の方法。

６１． 有効量は、アジュバントと共に投与される、実施形態５０～５９のいずれかに記載の方法。

６２． 対象においてＨＩＶに対する中和抗体または中和抗血清を生成するために、実施形態１～３３に記載のいずれか１つのタンパク質の有効量を対象に投与することを含む方法。

６３． 対象は、哺乳動物、任意選択でヒトまたは非ヒト霊長類である、実施形態６２に記載の方法。

６４． 中和抗体または中和抗血清を対象から単離することをさらに含む、実施形態６２または６３に記載の方法。

６５． ＨＩＶによる感染を予防または治療するために、単離された中和抗体または中和抗血清の有効量を受動免疫によりヒト対象に投与することをさらに含む、実施形態６４に記載の方法。

６６． 中和抗血清は、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープに対するポリクローナル抗体を含み、任意選択で、中和抗体は、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに対する抗体を含まないかまたは実質的に含まない、実施形態６２～６５のいずれかに記載の方法。

６７． 中和抗抗体は、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープに対するモノクローナル抗体を含み、任意選択で、中和抗体は、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに対する抗体を含まないかまたは実質的に含まない、実施形態６２～６５のいずれかに記載の方法。

６８． 対象においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導するために使用するための、及び／またはＨＩＶによる感染を治療もしくは予防するために使用するための、実施形態１～４７及び４９のいずれか１つに記載のタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、細胞、免疫原性組成物、またはワクチン。

６９． 対象においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導するための、及び／またはＨＩＶによる感染を治療もしくは予防するための、実施形態１～４７及び４９のいずれか１つに記載のタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、細胞、免疫原性組成物、またはワクチンの使用。

７０． 対象においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導するための、及び／またはＨＩＶによる感染を治療もしくは予防するための薬剤または予防薬を製造するための、実施形態１～４７及び４９のいずれか１つに記載のタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、細胞、免疫原性組成物、またはワクチンの使用。

７１． 試料を分析するための方法であって、試料を、実施形態１～３３のいずれかに記載のタンパク質と接触させること、及びタンパク質と、ＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープに特異的に結合することが可能な分析物との間の結合を検出することを含む方法。

７２． 分析物は、ｇｐ１２０タンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープを認識する抗体、受容体、または細胞である、実施形態７１に記載の方法。

７３． 結合は、試料中の分析物の存在、及び／または試料が由来する対象におけるＨＩＶによる感染を示す、実施形態７１または７２に記載の方法。

７４． 実施形態１～３３のいずれかに記載のタンパク質、及びタンパク質を含むかまたは固定化する基材、パッド、またはバイアルを含むキットであって、ＥＬＩＳＡまたはラテラルフローアッセイキットであるキット。

以下の実施例は、説明目的で含まれており、本発明の範囲を限定することは意図されていない。

実施例１：例示的なｇｐ１２０融合タンパク質ワクチン接種効力の特徴付け
例示的なｇｐ１２０融合タンパク質を生成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで特徴付けし、ｉｎ ｖｉｖｏ効力を評価した。この例示的なｇｐ１２０融合タンパク質は、ネガティブ染色電子顕微鏡法に基づくと、高度に天然様であることが観察された。例示的なｇｐ１２０融合タンパク質は、ＣＤ４及び種々の広域中和抗体（ｂＮＡｂ）に、高い親和性及び強固な結合動力学で結合することが観察された。例示的なｇｐ１２０融合タンパク質は、ウサギ免疫化研究において、多様な一群のティア２（ｔｉｅｒ２）ウイルスに対してｂＮＡｂを誘導することができたことも実証された。

Ａ． ｇｐ１２０－三量体融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
８５ＵＳ＿Ｂａ－Ｌ ｇｐ１２０ ｅｎｖ遺伝子は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）発現の最適化後に、ｇｐ１２０ ＮＣＢＩ受入番号ＤＱ３１８２１０．１を使用してＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（南京）が合成した。図１Ａに示されているように、ｇｐ１２０糖タンパク質をコードする遺伝子断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩ部位を介してｐＴｒｉｍｅｒタグベクターにクローニングした。構築物を、ＤＮＡ配列分析及びコロニーＰＣＲにより検証した。

構築物を、ＦｕＧＥＮＥ６により１μｇのｇｐ１２０－三量体プラスミドを使用して、ＣＨＯ－Ｓ ｄｈｆｒ－／－細胞系に安定的にトランスフェクトした。クローン選択後、高発現クローンを使用して、ＨＩＶ ｇｐ１２０を含む例示的な融合タンパク質を、無血清培地（ＳＦＭ）中で産生させた。バイオリアクターの上清を、４０００ｇで２０分間４℃にて遠心分離することにより、９日後に回収した。細胞残渣を、精製前に０．２μｍフィルターで除去した。まず、上清を、５ｍＬ Ｂｌｕｅ－セファロース親和性精製カラムに流した。溶出液を、５０ｍＬ限外フィルターで濃縮し、直ちに緩衝液をＰＢＳに交換し、ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用したＳＥＣによりさらに精製し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で溶出した。流速を、５ｍＬ／分かそれを上まわる速さに維持した。三量体画分を単離し、濃縮し、－８０℃で保管した。タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して検出しした。ＨＩＶ ｇｐ１２０を含む単離された例示的な融合タンパク質の純度は、図１Ｂ及び１Ｃに示されている。

例示的な融合タンパク質単独及びＢ１２またはＣＤ４との複合体を、図２Ｃに示されているように、ネガティブ染色電子顕微鏡により分析した。複合体を、Ｂ１２とは１：１比で、またはＣＤ４とは１：２比で調製した。試料を、１０ｕｇ／ｍＬに希釈し、１２ｍＡで２０秒間グロー放電した炭素被覆４００ＣＵメッシュグリッド上に５秒間アプライした。グリッドを、１％（重量／容積）ギ酸ウラニルで２０秒間ネガティブ染色した。１２０ＫｅＶで動作するＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ ｓｐｉｒｉｔ電子顕微鏡により試料を収集し、ＦＥＩ Ｅａｇｌｅ ＣＣＤカメラ及び９００～１５００ｎｍの公称脱焦範囲を使用して画像を取得した。

幾つかの広域中和抗体（ｂＮＡｂ）に対して評価した、ＨＩＶ ｇｐ１２０を含む例示的な融合タンパク質の結合動力学が図３に示されている。９６ウェルプレートを、５μｇ／ｍＬの例示的な融合タンパク質で一晩４℃にてコーティングした。コーティングしたプレートを、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用してブロッキングし、系列希釈したｂＮＡｂ Ｂ１２、ＮＩＨ４５－４６、ＰＧ９、４４７－５２Ｄ、３５Ｏ２２と共にインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に連結されたマウス抗ヒトＩｇＧでコーティングした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、各ステップ間に室温で１時間インキュベートした。最後に、プレートに、３，３’、５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、４５０ｎＭでの吸光度を測定した。

結合動力学を、図４に示されているように、ｆｏｒｔｅｂｉｏ ＯＣＴＥＴ ＱＫｅ Ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）システム（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ）により３０℃でさらに測定した。例示的な融合タンパク質を、２０ｍＭ ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でビオチン標識し、次いで１０００ｒｐｍで振盪しながらストレプトアビジン（ＳＡ）センサーに付着させ、１０μｇ／ｍＬビオチン－ｇｐ１２０－三量体でコーティングされたプレートに３００秒間負荷した。付随ステップでは、ＳＡセンサーを、ＰＢＳ中４、２、１μｇ／ｍＬのＣＤ４希釈物で３００秒間負荷した。ＰＢＳに６００秒間浸すことにより解離を実施した。

Ｂ． ｇｐ１２０－三量体融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ評価
０、２１、４２、及び１４０日目に、５０μｇの例示的な融合タンパク質（ｎ＝２）または５０μｇの例示的な融合タンパク質＋ミョウバンアジュバント（ｎ＝２）のいずれかを用いて、雌ニュージーランドホワイトラビットを筋肉内免疫した。図５に示されているように、例示的な融合タンパク質は高度に免疫原性であり、ウサギ免疫化モデルにおいて抗体を誘導することが観察された。図５に図示されている通りのｂＮＡｂに対する結合動力学を、以前に記載されている通りに実施した。プロテインＡセンサーを、２．５μｇ／ｍＬのＢ１２、ＮＩＨ４５－４６、ＰＧ９、及び４４７－５２Ｄなどの他の５μｇ／ｍＬのｂＮＡｂでコーティングしたプレートに３００秒間負荷した。付随は、ｂＮＡｂを負荷したプロテインＡセンサーを、ＰＢＳ中１０、５、２．５、１、０μｇ／ｍＬの異なる濃度の例示的な融合タンパク質に浸漬することを使用して確立させた。ＰＢＳに浸すことにより解離を実施した。上記のすべてのウェルに２００μＬの試料を添加した。

例示的なＨＩＶ ｇｐ１２０融合タンパク質による免疫化は、ウサギ免疫化モデルにおいて、ティア１Ａ（ｔｉｅｒ１Ａ）及び１Ｂ（ｔｉｅｒ１Ｂ）（図６Ａ）ならびにティア２（ｔｉｅｒ２）ウイルス（図６Ｂ）に対するものを含むＨＩＶ－１中和抗体を誘導することが観察された。例示的なＨＩＶ ｇｐ１２０融合タンパク質による免疫化も、高いパーセントの広域中和抗体を誘導したことがわかった（図６Ｃ）。ウサギにおいて誘導された抗体は、例示的なＨＩＶ ｇｐ１２０融合タンパク質への結合を種々のｂＮＡｂと競合した。

本発明は、例えば本発明の種々の態様を説明するために提供されている特定の開示された実施形態に範囲が限定されることが意図されていない。記載された組成物及び方法に対する種々の改変は、本明細書の記載及び教示から自明になるだろう。そのような変化型は、本開示の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく実施され得、本開示の範囲内に入ることが意図されている。

Claims (37)

1. 哺乳動物においてＨＩＶによる感染を予防するための方法であって、ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質を形成するように、コラーゲンのＣ末端部分にインフレーム融合で接合されている可溶性ＨＩＶウイルス表面抗原を含む有効量の組換えサブユニットワクチンで哺乳動物を免疫することを含む方法。
2. 前記ＨＩＶは、ＨＩＶ－１であり、任意選択で、ティア１Ｂ（ｔｉｅｒ１Ｂ）、ティア１Ａ（ｔｉｅｒ１Ａ）、ティア２（ｔｉｅｒ２）、またはティア３（ｔｉｅｒ３）ウイルスである、請求項１に記載の方法。
3. 前記可溶性ＨＩＶウイルス表面抗原は、ｇｐ１２０タンパク質またはその断片もしくはエピトープを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、外側ドメインサブユニットペプチド、内側ドメインサブユニットペプチド、またはそれらの任意の組合せを含み、前記ｇｐ１２０タンパク質は、３つの組換えポリペプチドを含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記ｇｐ１２０タンパク質ペプチドは、任意選択で架橋シートにより隔てられている１、２、３、４、または５つのＣ領域及び１、２、３、４、または５つの可変領域を含む、請求項３または４に記載の方法。
6. 前記可溶性ＨＩＶウイルス表面抗原は、突然変異ｇｐ１２０タンパク質を含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
7. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号１に示されている配列を含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
8. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号２に示されている配列を含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
9. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号３に示されている配列を含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
10. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号４に示されている配列を含む、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
11. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号５に示されている配列を含む、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号６に示されている配列を含む、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
13. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号７に示されている配列を含む、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
14. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号８に示されている配列を含む、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
15. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号９に示されている配列を含む、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。
16. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号１０に示されている配列を含む、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。
17. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号１１に示されている配列を含む、請求項１～１６のいずれかに記載の方法。
18. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号１２に示されている配列を含む、請求項１～１７のいずれかに記載の方法。
19. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号１３に示されている配列を含む、請求項１～１８のいずれかに記載の方法。
20. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号１４に示されている配列を含む、請求項１～１９のいずれかに記載の方法。
21. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号１５に示されている配列を含む、請求項１～２０のいずれかに記載の方法。
22. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号１６に示されている配列を含む、請求項１～２１のいずれかに記載の方法。
23. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号１７に示されている配列を含む、請求項１～２２のいずれかに記載の方法。
24. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号１８に示されている配列を含む、請求項１～２３のいずれかに記載の方法。
25. 前記ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質は、配列番号３１～４６のいずれかに示されている第２の配列に連結された配列番号１９～３０のいずれかに示されている第１の配列を含み、前記第１の配列のＣ末端は、前記第２の配列のＮ末端に直接的または間接的に連結されている、請求項１～２４のいずれかに記載の方法。
26. 前記組換えサブユニットワクチンは、筋肉内注射により投与される、請求項１～２５のいずれかに記載の方法。
27. 前記組換えサブユニットワクチンは、鼻腔内噴霧により投与される、請求項１～２６のいずれかに記載の方法。
28. 前記組換えサブユニットワクチンは、単一用量で、または数週間もしくは数か月間の間隔で隔てられた一連の用量で投与される、請求項１～２７のいずれかに記載の方法。
29. 前記組換えサブユニットワクチンは、アジュバントを伴わずに投与される、請求項１～２８のいずれかに記載の方法。
30. 前記組換えサブユニットワクチンは、アジュバントと共に投与される、請求項１～２９のいずれかに記載の方法。
31. 前記組換えサブユニットワクチンは、１つよりも多くのアジュバントと共に投与される、請求項１～３０のいずれかに記載の方法。
32. 哺乳動物の血清からＨＩＶに対する抗体を検出するための方法であって、前記血清を、ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質を形成するように、コラーゲンのＣ末端部分にインフレーム融合で接合されている可溶性ＨＩＶウイルス表面抗原と接触させるステップを含む方法。
33. 前記可溶性ＨＩＶウイルス表面抗原は、ｇｐ１２０タンパク質またはペプチドである、請求項３２に記載の方法。
34. ジスルフィド結合連結三量体融合タンパク質を形成するように、コラーゲンのＣ末端部分にインフレーム融合で接合されている、ＨＩＶに由来する可溶性ウイルス表面抗原を含む組換えサブユニットワクチンを使用するための方法であって、哺乳動物を免疫すること、生成された中和抗体を精製すること、及び前記中和抗体を使用した受動免疫により前記ＨＩＶに感染した患者を治療することを含む方法。
35. 前記中和抗体は、ポリクローナル抗体を含む、請求項３４に記載の方法。
36. 前記中和抗体は、モノクローナル抗体である、請求項３４に記載の方法。
37. 前記中和抗体は、ｇｐ１２０タンパク質またはペプチドに対するモノクローナル抗体である、請求項３４に記載の方法。

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