DE60023300T2 - Verwendung von cpg als adjuvans für hivimpstoff - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Impfstofformulierungen und ihre Verwendung in der Behandlung oder Prophylaxe von HIV-Infektionen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von HIV-Antigen in Verbindung mit einem CpG-Oligonukleotid.
  • HIV ist die primäre Ursache für AIDS (erworbenes Immundefizienzsyndrom) und wird als eines der dringendsten Gesundheitsprobleme in der Welt betrachtet. Obwohl es umfangreiche Anstrengungen gibt, einen erfolgreichen Impfstoff herzustellen, haben bis heute die Anstrengungen in der Herstellung eines solchen versagt. Entsprechend bleibt ein Bedarf an einer verbesserten HIV-immunogenen Zusammensetzung bestehen.
  • WO 92/06113 betrifft eine Impfstofformulierung, die das Hüllprotein gp160 und sein natürlich vorkommendes Derivat gp120 zusammen mit 3-desacyliertem Monophosphoryllipid A als Hilfsstoff und einem geeigneten Träger wie Aluminiumhydroxid umfasst.
  • WO 99/16884 beschreibt Impfstofformulierungen auf Basis von Nicht-Hüll-HIV-Proteinen, Nef und Tat, insbesondere Fusionen aus dem Nef-Protein mit Tat und Fusionen aus dem Nef-Protein mit Tat oder einem immunologischen Fusionspartner.
  • Immunmodulatorische Oligonukleotide enthalten unmethylierte CpG-Dinukleotide ("CpG") und sind bekannt (WO 96/02555, EP 468520 ). CpG ist eine Abkürzung für Cytosine-Guanosin-Dinukleotidmotive, die in DNA vorhanden sind. Historisch wurde beobachtet, dass die DNA-Fraktion von BCG einen Antitumoreffekt ausüben konnte. In weiteren Untersuchungen wurde gezeigt, dass aus BCG-Gensequenzen stammende synthetische Oligonukleotide immunstimulatorische Wirkungen (sowohl in vitro als auch in vivo) induzieren können. Die Autoren dieser Studien schlossen daraus, dass bestimmte Palindromsequenzen, einschließlich eines zentralen CG-Motivs, diese Aktivität trugen. Die zentrale Rolle des CG-Motivs in der Immunstimulation wurde später in einer Veröffentlichung von Krieg aufgeschlüsselt, Nature 374, S. 546 (1995). Eine ausführliche Analyse hat gezeigt, dass das CG-Motiv in einem gewissen Sequenzkontext sein muss und dass solche Sequenzen üblich in bakterieller DNA sind, aber selten in Wirbeltier-DNA.
  • Es wird derzeit angenommen, dass dieser Evolutionsunterschied dem Wirbeltier-Immunsystem erlaubt, die Gegenwart von bakterieller DNA (wie sie während einer Infektion auftritt) zu detektieren, was entsprechend zur Stimulation des Immunsystems führt. Die immunstimulatorische Sequenz, wie von Krieg definiert, lautet:
    Purin Purin CG Pyrimidin Pyrimidin, worin das CG-Motiv nicht methyliert ist. In bestimmten Kombinationen der sechs Nukleotide ist eine Palindromsequenz vorhanden. Mehrere dieser Motive, entweder als Repeats eines Motivs oder als eine Kombination aus unterschiedlichen Motiven, können im gleichen Oligonukleotid vorhanden sein. Die Gegenwart eines oder mehrerer dieser eine immunstimulatorische Sequenz enthaltenden Oligonukleotide kann verschiedene Immununtergruppen aktivieren, einschließlich natürlicher Killerzellen (die Interferon-γ erzeugen und cytolytische Aktivität besitzen) und Makrophagen (Wooldrige et al., Band 89 (Nr. 8), 1977). Dennoch wurde jetzt gezeigt, dass andere unmethylierte CpG-haltige Sequenzen, die nicht diese Consensus-Sequenz aufweisen, immunmodulatorisch sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine verbesserte Impfstofformulierung bereit, umfassend ein CpG-Oligonukleotid und ein HIV-Antigen, das aus der Gruppe HIV-gp160 und HIV-gp120 ausgewählt ist; ein HIV-Nef-Protein oder Derivat davon, gebunden an entweder (i) einen Fusionspartner oder (ii) ein HIV-Tat-Protein oder Derivat davon; oder ein HIV-Tat-Protein oder Derivat davon, gebunden an entweder (i) ein Fusionsprotein oder (ii) ein HIV-Nef-Protein oder Derivat davon; oder ein HIV-Nef-Protein oder Derivat davon, gebunden an ein HIV-Tat-Protein oder Derivat davon und einen Fusionspartner.
  • Mit "Fusionspartner" ist jede Proteinsequenz gemeint, die nicht Tat oder Nef ist. Bevorzugt ist der Fusionspartner Protein D oder dessen lipidiertes Derivat Lipoprotein D aus Hämophilus influenzae B. Insbesondere ist es bevorzugt, dass das N-terminale Drittel, d.h. etwa die ersten 100–130 Aminosäuren, verwendet wird. Dies wird hier als Lipo D 1/3 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das Nef-Protein oder Derivat davon an das Tat-Protein oder Derivat davon gebunden sein. Solche Nef-Tat-Fusionen können gegebenenfalls auch an einen Fusionspartner wie Protein D gebunden sein.
  • Falls vorhanden, ist der Fusionspartner normalerweise an den N-Terminus des Nef- oder Tat-Proteins gebunden.
  • Derivate, die von der vorliegenden Erfindung umfasst werden, schließen Moleküle mit einem C-terminalen Histidin-Schwanz ein, der bevorzugt zwischen 5 und 10 Histidinreste umfasst. Allgemein wird ein Histidin-Schwanz, der n Reste enthält, hier als His (n) dargestellt. Die Gegenwart eines Histidin- (oder "His")-Schwanzes hilft in der Reinigung. Insbesondere stellt die Erfindung Impfstoffe bereit, die Proteine mit der folgenden Struktur umfassen:
  • Figure 00030001
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Proteine mit einem Histidin-Schwanz exprimiert, der zwischen 5 und 10 und vorzugsweise sechs Histidinreste umfasst. Diese sind vorteilhaft in der Unterstützung der Reinigung. Von einer separaten Expression von Nef (Macreadie IG et al., 1993, Yeast 9 (6) 565–573) und Tat (Braddock M et al., 1989, Cell 58 (2) 269–79) in Hefe (Saccharomyces cerevisiae) wurde bereits berichtet. Nef-Protein wird nur myristiliert. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Impfstoffe bereit, die Nef und/oder Tat getrennt umfassen. Die DNA- und Aminosäuresequenzen von repräsentativen Nef-His-, Tat-His- und Nef-Tat-His-Fusionsproteinen sind in WO 99/16884 dargestellt.
  • Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Impfstoffe umfassen ein HIV-Fusionsprotein wie Nef-Tat und gegebenenfalls ein zusätzliches HIV-Protein. Besonders bevorzugt in einer erfindungsgemäßen Impfstofformulierung ist eine Kombination aus einem HIV-Fusionsprotein plus gp120, insbesondere Nef-Tat mit gp120.
  • Von der vorliegenden Erfindung umfasste Derivate schließen auch mutierte Proteine ein. Der Begriff "mutiert" wird hier verwendet, um ein Molekül zu bezeichnen, das eine Deletion, Addition oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren unter Verwendung allgemein bekannter Techniken zur ortsgerichteten Mutagenese oder jedes anderen herkömmlichen Verfahrens erfahren hat.
  • Die Impfstoffherstellung wird allgemein beschrieben in "Vaccine Design – The subunit and adjuvant approach" (Herausgeber Powell und Newman) Pharmaceutical Biotechnology Band 6, Plenum Press 1995. Die Verkapselung innerhalb von Liposomen wird beschrieben von Fullerton, US-PS 4,235,877 .
  • Die bevorzugten Oligonukleotide enthalten bevorzugt zwei oder mehr CpG-Motive, die durch sechs oder mehr Nukleotide getrennt sind. Die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung sind typischerweise Desoxynukleotide. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Internukleotid im Oligonukleotid Dithiophosphat oder besonders bevorzugt eine Dithiophosphatbindung, obwohl Phosphodiester und andere Internukleotidbindungen im Umfang der Erfindung sind, einschließlich von Oligonukleotiden mit gemischten Internukleotidbindungen.
  • Bevorzugte Oligonukleotide haben die folgenden Sequenzen:
  • Figure 00040001
    • * Alternativ als WD001–WD007 bezeichnet
  • In der obigen Tabelle zeigt ein "+" in der Thio-Spalte die Gegenwart einer Thioatmodifikation an. "Mischung" zeigt eine Mischung aus der Thioatmodifikation und einer Sequenz ohne Thioatmodifikation an (der Stern zeigt die Bindungen mit einer Thioatmodifikation an). Ein "–" in der Thio-Spalte zeigt die Abwesenheit einer Thioatmodifikation an. Ein "+" in der CpG-Spalte zeigt die Gegenwart eines CpG-Motivs an, und ein "–" in der CpG-Spalte zeigt die Abwesenheit eines CpG-Motivs an. Zum Beispiel enthält WD1005 ein GpC- anstelle eines CpG-Motivs, so dass es mit einem "–" in der CpG-Spalte der Tabelle markiert ist. WD1007 enthält ein Palindrommotiv (GACGTC) sowie andere Nicht-Palindrom-CpG-Sequenzen. Dies ist auch im Umfang eines CpG-Oligonukleotids, wie der Begriff in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten CpG-Oligonukleotide können durch jedes fachbekannte Verfahren synthetisiert werden (z.B. EP 0 468 520 ). Zweckmäßig können solche Oligonukleotide unter Verwendung eines Syntheseautomaten synthetisiert werden. Verfahren zur Herstellung von Thiophosphat-Oligonukleotiden oder Dithiophosphat werden in US 5,666,153 , US 5,278,302 und WO 95/26204 beschrieben.
  • Die Proteinmenge in jeder Impfstoffdosis wird als eine Menge ausgewählt, die eine Immunschutzreaktion ohne signifikante nachteilige Nebenwirkungen in typischen Impflingen induziert. Eine solche Menge wird abhängig davon variieren, welches spezifische Immunogen eingesetzt wird und wie es angeboten wird. Allgemein wird erwartet, dass jede Dosis 1–1000 μg Protein umfassen wird, vorzugsweise 2–500 μg, am meisten bevorzugt 5–250 μg. Eine optimale Menge für einen besonderen Impfstoff kann durch Standarduntersuchungen festgestellt werden, die die Beobachtung geeigneter Immunreaktionen in Testpersonen beinhalten. Im Anschluss an eine Erstimpfung können Patienten eine oder mehrere Auffrischungsimmunisierungen in angemessenem Abstand erhalten.
  • Es ist ebenfalls möglich, ein CpG-Oligonukleotid kurz vor der Impfung mit dem HIV-Antigen zu verabreichen, z.B. 1 Tag vorher.
  • Entsprechend wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Menschen, der dies benötigt, mit einer Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt, die ein HIV-Antigen und ein CpG-Oligonukleotid (wir hier oben definiert) umfasst, oder mit dem CpG-Oligonukleotid, gefolgt nach einer geeigneten Zeit von dem HIV-Antigen.
  • Es wird auch ein Kit bereitgestellt, das wirksame Mengen einer CpG-Oligonukleotid-haltigen Formulierung zur Verwendung als Vorimpfungsformulierung zur Vorverabreichung an menschliche Patienten und ein HIV-Antigen zur Injektion zu einem geeigneten Zeitpunkt später, wie hier oben beschrieben, umfasst.
  • Bevorzugte CpG-Oligonukleotide sind die in der oben angegebenen Tabelle.
  • In geeigneter Weise wird das CpG im Bereich von 10 μg pro Dosis bis 2000 μg sein, bevorzugt 50–1000 μg, z.B. ca. 50 oder ca. 500 oder ca. 1000 μg pro Dosis.
  • In geeigneter Weise kann der in der vorliegenden Erfindung verwendete Impfstoff einen Träger wie ein Aluminiumsalz, z.B. Aluminiumhydroxid (Al(OH)3), Aluminiumphosphat oder Aluminiumphosphatsulfat (Alaun), oder eine nicht-toxische Öl-in-Wasser-Emulsion oder eine Mischung daraus umfassen.
  • Falls ein Aluminiumsalz (bevorzugt Aluminiumhydroxid) als Träger verwendet wird, ist es allgemein im Bereich von 50 bis 100 μg vorhanden, bevorzugt 100 bis 500 μg pro Dosis.
  • Nicht-toxische Öl-in-Wasser-Emulsionen enthalten bevorzugt ein nicht-toxisches Öl, z.B. Squalen, und einen Emulgator wie (Polysorbitanmonoleat) Tween 80, in einem wässrigen Träger wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
  • Nach Wunsch kann der in der vorliegenden Erfindung verwendete Impfstoff einen zusätzlichen Hilfsstoff umfassen, bevorzugt einen Saponin-Hilfsstoff wie QS21, wie z.B. in WO 95/17210 beschrieben, gegebenenfalls in Gegenwart eines Sterols, z.B. Cholesterol, wie z.B. in PCT/EP96/01464 beschrieben. Der Impfstoff der Erfindung kann auch Monophosphoryllipid A und fachbekannte Derivate davon umfassen. Ein bevorzugtes Derivat ist 3-des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A, beschrieben in GB 2 220 211 .
  • Entsprechend können Impfstofformulierungen der vorliegenden Erfindung zusätzlich andere pharmazeutische Exzipienten oder Immunstimulantien umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Impfstofformulierung zusätzlich ein Aluminiumsalz, bevorzugt Aluminiumhydroxid. In einer weiteren Ausführungsform kann ein Saponin-Hilfsstoff ebenfalls eingeschlossen werden, z.B. QS21 (Aquila).
  • Die vorliegende Erfindung wird jetzt unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben:
  • Beispiele
  • Beispiel 1 – Immunogenitätsuntersuchungen unter Verwendung von HIV-1 gp120, formuliert mit CpG oder CpG/Alaun
  • Auswertung von CpG und CpG/Alaun in Rhesussffen
  • Erläuterung des Experiments
  • Eine Immunogenitätsuntersuchung wurde durchgeführt, um die Hilfsstoffwirkung von CpG in nicht-humanen Primaten auszuwerten. Gruppen von fünf Affen wurden zweimal mit HIV-1W6.1Dgp120 in Kombination mit CpG oder CpG/Alaun immunisiert. Nach der zweiten Immunisierung wurde die Immunreaktion der Tiere bewertet. Antikörper gegen gp120 und lymphproliferative sowie Cytokin-Reaktionen wurden ausgewertet.
  • Gruppen von Affen
    Figure 00060001
  • Formulierung Verwendete Kamponentenchargen:
    Figure 00070001
    • * gp120 aus HIV-1-Klon W6.1D (Groenink et al., 1991)
  • Formulierungsprozess:
  • Formulierungen wurden einen Tag vor der Injektion hergestellt. Alle Inkubationen wurden bei Raumtemperatur unter Rühren durchgeführt.
  • CpG/Alaun Gruppe 1 (500 μl/Dosis)
  • Gp120 (50 μg) wurde an 500 μg Al(OH)3 für 1 Stunde adsorbiert. Die Formulierung wurde mit einer 10-fach konzentrierten PO4/NaCl-Lösung (pH 6,8) vor der Zugabe von 500 μg WD001 gepuffert. Nach 15 min wurden 50 μg/ml Thiomersal als Konservierungsmittel hinzugegeben.
  • CpG Gruppe 2 (500 μl/Dosis)
  • Gp120 (50 μg) wurde in PO4/NaCl-Puffer, pH 6,8, vor der Zugabe von 500 μg CpG WD001 verdünnt. Nach 15 min wurden 50 μg/ml Thiomersal als Konservierungsmittel hinzugegeben.
  • Immunologische Verfahren
  • Fünf Rhesusaffen (Macaca mulatta) pro Gruppe wurden zweimal intramuskulär mit 500 μl Impfstoff in einem vierwöchigen Intervall immunisiert. Seren und einkernige Zellen aus peripherem Blut (PBMC) wurden zu mehreren Gelegenheiten entnommen.
  • Gp120-spezifische Antikörper in Seren von immunisierten Affen wurden in einem ELISA wie in Mooij et al., 1998, beschrieben bestimmt. Kurz gesagt wurden ELISA-Platten mit 1 μg/ml gp120 beschichtet, mit BSA gesättigt und der Inkubation mit Rhesusaffen-Seren, gefolgt von einem α-humanen biotinylierten Antikörper unterworfen. Schließlich wurde HRP-Streptavidin hinzugegeben und in einer Farbreaktion unter Verwendung von OPD als Substrat quantifiziert.
  • Die Lymphproliferation wurde unter Verwendung von Dichtegradientengereinigtem PBMC aus immunisierten Rhesusaffen bewertet. Zellen wurden in vierfacher Ausführung mit 1×105 in 100 μl RPMI/5 % FCS pro Vertiefung in Platten mit 96 rundbödigen Vertiefungen übergeimpft. Dann wurden weitere 100 μl Medium allein oder lösliches gp120 enthaltend (10 μg/ml) hinzugege ben, und parallele Kulturen wurden für 48 h inkubiert. Danach wurden 100 μl Kulturüberstand durch frisches Medium ersetzt, das 1 μCi [3H]-Thymidin enthielt. Nach 15 h wurden die Zellen auf Filterplatten geerntet, und die aufgenommene Radioaktivität wurde in einem β-Zähler bestimmt. Die Ergebnisse werden in cpm und in Stimulationsindizes ausgedrückt (SI = cpm antigenhaltige Kulturen/cpm von Kulturen mit Medium allein), wobei ein SI-Wert von mehr als 3 als positive Reaktion betrachtet wird.
  • Flachbödige Platten mit 96 Vertiefungen wurden durch Beschichten eines IFN-γ-spezifischen Einfang-Antikörpers in 50 μl PBS für 4 h bei 37°C hergestellt. Die Platten wurden dreimal gewaschen, und PBMCs wurden ähnlich den Lymphproliferationstests übergeimpft. Nach 48 h Kultur wurden die Platten dreimal mit PBS/0,05 % Tween 20 gewaschen, und 50 μl biotinylierter sekundärer IFN-γ-spezifischer Antikörper, verdünnt in PBS/Tween/1 % FCS, wurden für 2 h hinzugegeben. Die Platten wurden erneut gewaschen, und ein Gold-konjugierter α-Biotin-Antikörper wurde für 1 h inkubiert. Nach weiteren Waschungen wurden die ELI-Spots unter Verwendung eines Silber-Verstärkungskits (50 μl/Vertiefung) visualisiert. Die Reaktion wurde nach ca. 30 min durch Zugabe von entionisiertem Wasser beendet. Cytokin-sekretierende Zellen wurden durch mikroskopische Untersuchung gezählt.
  • Ergebnisse
  • Die Analyse von gp120-spezifischen Antikörpern in Seren der Affen zeigte, dass alle Tiere in den zwei Gruppen spezifische Immunreaktionen erworben hatten (Tabelle 1 und 1). Einige geringe Reaktionen waren in zwei Tieren bereits nach einer Immunisierung nachweisbar. Nach der zweiten Immunisierung wiesen alle Tiere hohe Titer von gp120-spezifischen Antikörpern auf.
  • Tabelle 1
    Figure 00090001
  • Die Induktion spezifischer Lymphproliferation durch Immunisierung mit gp120 in Kombination mit CpG oder CpG/Alaun wurde vor der Immunisierung und 6 Tage nach der zweiten Immunisierung ausgewertet. Alle 10 Tiere wiesen keinerlei spezifische Lymphproliferation (SI > 3) zum Studienbeginn auf (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz besaßen alle Tiere in Gruppe 1 starke lymphproliferative Reaktionen 6 Tage nach der Auffrischungsimpfung (2). In ähnlicher Weise zeigten alle außer einem Tier in Gruppe 2 eine spezifische Lymphproliferation.
  • Die Gegenwart von gp120-spezifischen IFN-γ-sekretierenden Zellen wurde in allen Affen vor der Immunisierung und 6 Tage nach der zweiten Dosis untersucht. IFN-γ-sekretierende Zellen konnten nicht aus Vorimmunisierungsproben aufgrund technischer Schwierigkeiten ausgewertet werden. Jedoch waren solche Zellen nach der zweiten Immunisierung detektierbar (3). Alle Tiere in beiden Gruppen wiesen eine Antigen-spezifische Reaktion auf.
  • Schlussfolgerungen
  • Immunisierung mit HIV-1 gp120 in Kombination mit CpG oder CpG/Alaun induziert Immunreaktionen in nicht-humanen Primaten. Diese Reaktionen schließen gp120-spezifische Antikörper, Lymphproliferation und IFN-γ-sekretierende Zellen ein.
  • Beispiel 2 – Nef-Tat- und mutierte Nef-Tat-Formulierung
  • Die gemäß WO 99/16884 hergestellten Antigene wurden gegen NaCl 150 mM dialysiert, um die PO4-Ionen zu eliminieren, die die Adsorption von gp120 an Al(OH)3 inhibieren.
  • Die Formulierungsreihenfolge ist wie nachfolgend beschrieben:
  • Figure 00100001
  • Die Antigene wurden mit dem CpG vor der Adsorption an Al(OH)3 inkubiert, um eine potenzielle Wechselwirkung zwischen dem His-Schwanz der Nef-Tat- und Nef-Antigene und dem Oligonukleotid zu begünstigen.
  • Formulierungscharakterisierung
  • Die Formulierung wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde durch SDS-PAGE (Novex 4–20 %, reduzierende Bedingungen) analysiert, um die Adsorption von HIV Nef-Tat zu überprüfen. Das Gel wurde mit Silber angefärbt. Die Gel-Analyse der Formulierung zeigte, dass der Großteil des Nef- oder Nef-Tat-Proteins an das Alaun adsorbiert wurde.
  • Beispiel 3 – Immunisierungs- und SHIV-Expositionsexperiment in Rhesusaffen Impfstoffzubereituag
  • Eine Impfstofformulierung wurde erfindungsgemäß hergestellt, die ein Nef-Tat-Fusionsprotein und gp120 zusammen mit einem Oligonukleotid, das unmethylierte CpG-Dinukleotidmotive enthielt, und Aluminiumhydroxid als Träger umfasste.
  • Herstellung der CpG-Oligonukleotidlösung: Trockenes CpG-Pulver wird in H2O gelöst, um eine Lösung mit 5 mg/ml CpG zu ergeben.
  • Herstellung der CpG-Formulierung
  • Die 3 Antigene wurden gegen NaCl 150 mM dialysiert, um die Phosphationen zu eliminieren, die die Adsorption von gp120 an Aluminiumhydroxid inhibieren.
  • Die in H2O verdünnten Antigene (100 μg gp120, 20 μg NefTat und 20 μg SIV-Nef) wurden mit der CpG-Lösung (500 μg CpG) für 30 min vor der Adsorption an Al(OH)3 inkubiert, um eine potenzielle Wechselwirkung zwischen dem His-Schwanz von NefTat- und Nef-Antigenen und dem Oligonukleotid zu begünstigen (eine stärkere immunstimulatorische Wirkung von CpG wird beschrieben, wenn es an das Antigen gebunden ist, verglichen mit freiem CpG). Dann wurden Al(OH)3 (500 μg), 10-fach konzentriertes NaCl und 1 μg/ml Thiomersal als Konservierungsmittel nacheinander in 5-minütigen Intervallen hinzugegeben.
  • Alle Inkubationen wurden bei Raumtemperatur unter Rühren durchgeführt.
  • Untersuchung
  • Vier Rhesusaffen wurden intramuskulär im Monat 0, 1 und 3 mit der Impfstoffzusammensetzung immunisiert.
  • Einen Monat nach der letzten Immunisierung wurden alle Tiere mit einem pathogenen SHIV (Stamm 89.6p) in Kontakt gebracht. Ab der Expositionswoche (Woche 16) wurden Blutproben periodisch an den angegebenen Zeitpunkten entnommen, um den Prozentwert von CD4-positiven Zellen unter einkernigen Zellen aus peripherem Blut durch FACS-Analyse (4) und die Konzentration von viralen RNA-Genomen im Plasma durch cDNA-Assay (5) zu bestimmen.
  • Ergebnisse
  • Alle Tiere wurden nach Kontakt mit SHIV89.6p infiziert.
  • CD4-positive Zellen nahmen nach Kontakt ab. Alle vier Tiere wiesen eine schwache Abnahme von CD4-positiven Zellen auf und erholten sich im Zeitverlauf auf das Basislinienniveau (4). Im Gegensatz wiesen drei von vier Tieren in der Kontrollgruppe mit nur Hilfsstoff einen Abfall an CD4-positiven Zellen auf unter 5 % auf und erholten sich nie mehr.
  • Die Viruslastdaten sind fast invers zu den CD4-Daten (5). Die Viruslast nahm in den Tieren ab, die NefTat + gp120, formuliert mit CpG-haltigem Oligonukleotid, erhalten hatten, aber blieb hoch bei drei von vier Kontrolltieren, die nur einen Hilfsstoff erhalten hatten.
  • In der Woche 44 mussten zwei von vier Tieren in einer Kontrollgruppe, die nur mit einem Hilfsstoff behandelt wurde, aufgrund von AIDS-artigen Symptomen eingeschläfert werden.
  • Schlussfolgerungen
  • Die Kombination von gp120 und NefTat (in Gegenwart von SIV Nef) mit CpG-Hilfsstoff verhindert den Verlust an CD4-positiven Zellen und reduziert die Viruslast in mit pathogenem SHIV89.6p infizierten Tieren.
  • Figurenlegende
  • 1: HIV-1 gp120-spezifische Antikörperreaktionen im immunisierten Rhesusaffen. Spezifische Antikörper wurden in einem ELISA ausgewertet. Individuelle Werte aus multiplen Zeitpunkten für jedes Tier sind in Tabelle 1 gezeigt, und Gruppen-Mittelwerte sind in Tabelle 1 und als Diagramm in 1 gezeigt.
  • 2: Gp120-spezifische Lymphproliferation in immunisierten Rhesusaffen 6 Tage nach der zweiten Immunisierung. PBMCs wurden mit gp120-Antigen stimuliert und die lymphproliferativen Reaktionen durch 3H-Thymidin-Aufnahme gemessen. Die Ergebnisse sind in cpm und als SI ausgedrückt.
  • 3: Gp120-spezifische IFN-γ-sekretierende Zellen aus immunisierten Rhesusaffen. IFN-γ-sekretierende Zellen wurden durch das ELIspot-Verfahren visualisiert. Cytokin-sekretierende Zellen, die zu einem gefärbten Fleck führen, wurden durch mikroskopische Untersuchung gezählt, und die Ergebnisse sind halbquantitativ ausgedrückt (– = 0–5, + = 5–15, ++ = 15–35, +++ = 35–50, ++++ = > 50).
  • 4 und 5: Daten der CD4-Zellzahl und Viruslast aus Beispiel 3, in dem Rhesusaffen mit Nef-Tat + gp120, formuliert mit CpG, immunisiert und mit pathogenem SHIV in Kontakt gebracht wurden.
  • Literaturstellen
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Claims (12)

  1. Impfstofformulierung, die eine Kombination aus einem HIV-Fusionsprotein plus gp120 und ein immunstimulatorisches CpG-Oligonukleotid umfaßt.
  2. Impfstoff gemäß Anspruch 1, worin das HIV-Fusionsprotein ein Nef-Tat-Fusionsprotein ist.
  3. Impfstoff gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das Nef-Tat an Protein D oder Lipoprotein D oder ein Fragment davon aus Hämophilus influenzae fusioniert ist.
  4. Impfstofformulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, die zusätzlich ein Aluminiumsalz oder ein Saponin-Adjuvans umfaßt.
  5. Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Oligonukleotid zwei CpG-Dinukleotide umfaßt.
  6. Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das CpG-Oligonukleotid zwischen 15 und 45 Nukleotiden lang ist.
  7. Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Oligonukleotid aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
    Figure 00130001
  8. Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das CpG-Oligonukleotid wenigstens eine Thiophosphat-Internukleotidbindung umfaßt.
  9. Verwendung eines HIV-Fusionsproteins plus gp120 und eines immunstimulatorischen CpG-Oligonukleotids in der Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Linderung einer HIV-Infektion in einem Patienten.
  10. Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Verwendung als Medikament.
  11. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend das Vermischen eines HIV-Fusionsproteins plus gp120 und eines immunstimulatorischen CpG-Oligonukleotids.
  12. Kit, das wirksame Mengen einer CpG-Oligonukleotid-haltigen Formulierung zur Verwendung als Vorimpfungsformulierung zur Vorverabreichung an menschliche Patienten und eines HIV-Fusionsproteins plus gp120 zur Injektion zu einem geeigneten späteren Zeitpunkt umfaßt.
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