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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der pharmazeutischen
Zusammensetzungen, die für
die Immunisierung gegen die mit HIV verbundenen Infektionen verwendbar
ist.
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Das
acquired immunodeficiency syndrome oder AIDS ist eine Krankheit,
gegen die über
einen Impfstoff verfügen
zu können
sehr wünschenswert
wäre und
insbesondere über
einen Impfstoff, der prophylaktisch verwendbar ist. Nun ist man
aber bis heute bei der Entwicklung eines solchen Impfstoffs auf
zahlreiche Probleme gestoßen,
darunter insbesondere die verschiedenen Formen, die das HIV-Virus
einnehmen kann, sowie die Schwierigkeiten, die Zusammenhänge der
Immunität
gegen HIV zu erkennen, das heißt
die Immunfaktoren, die gegen die Viren schützen können. Der Fall von Personen,
die [dem Virus] ausgesetzt waren und nicht infiziert wurden, sowie
die Untersuchungen an "Nonprogressoren" geben jedoch Hinweise
und richten die Forschungen auf die Induktion von 2 Immunreaktionstypen:
die Reaktion über
die Antikörper
(humoral) und die Zellreaktion.
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Die
humorale Reaktion, die man hervorrufen möchte, ist nicht nur eine systemische
humorale Reaktion, sondern auch eine Reaktion in den Schleimhäuten, weil
es wünschenswert
ist, eine Immunschranke gegen das Virus am Ort seines Eintretens
in den Organismus zu errichten.
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Die
Strategien bei der Erforschung eines Impfstoffs gegen AIDS gehen
folglich in Richtung der Erforschung von Impfzusammensetzungen,
die das Immunsystem dazu anregen können, insbesondere eine große Menge
an Ig G und Ig A, die für
das AIDS-Virus spezifisch sind, insbesondere in den Schleimhäuten zu
produzieren.
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Dieses
Ziel stößt jedoch
auf zahlreiche Schwierigkeiten, weil die HIV-Antigene, die in einer
Impfzusammensetzung verwendet werden können, nicht immer allein eine
ausreichende Reaktion induzieren können, und die Formulierungen,
die im Stand der Technik für
ihr Vermögen
bekannt sind, eine solche Reaktion zu induzieren, wie die Formulierungen,
die das Choleratoxin umfassen, weisen bisweilen nicht vernachlässigbare Toxizitätsrisiken
auf.
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Das
Ziel der vorliegenden Erfindung ist folglich, eine neue pharmazeutische
Zusammensetzung vorzuschlagen, die prophylaktisch oder therapeutisch
für die
Immunisierung gegen die mit HIV verbundenen Infektionen verwendet
werden kann.
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Überraschenderweise
wurde gezeigt, dass es die erfindungsgemäße Zusammensetzung ermöglicht, eine
bedeutende Produktion von Ig G und Ig A, die für ein HIV-Antigen spezifisch sind, zu induzieren.
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Um
dieses Ziel zu erreichen, schlägt
die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung,
die wenigstens ein HIV-Antigen und DCchol umfasst, zur Herstellung
eines Medikaments für
die Immunisierung gegen die mit HIV verbundenen Infektionen vor,
das dazu bestimmt ist, über
die Schleimhäute
verabreicht zu werden.
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Gemäß einem
Merkmal der Erfindung ist das Medikament zur Induktion von Ig G-
und Ig A-Antikörpern,
die für
ein HIV-Antigen spezifisch sind, in den Schleimhautgeweben eines
Säugers
bestimmt.
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Weitere
Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen
der folgenden Beschreibung unter Bezug auf die Zeichnungen, die
die erhaltenen Ergebnisse veranschaulichen, hervortreten.
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Die 1 bis 3 veranschaulichen
die in Beispiel 5 erhaltenen Ergebnisse.
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Die 4 veranschaulicht
die in Beispiel 6 erhaltenen Ergebnisse.
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Die 5 und 6 veranschaulichen
die in Beispiel 7 erhaltenen Ergebnisse.
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Die 7 bis 13 veranschaulichen
die in Beispiel 8 erhaltenen Ergebnisse.
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Unter
HIV-Antigen versteht man jedes Antigen, das von HIV 1 oder 2 stammt,
vorzugsweise von HIV 1 stammt, das neutralisierende Antikörper induzieren
kann, einschließlich
der Laborstämme
und der Primärisolate.
Dieser Begriff umfasst folglich insbesondere die Oberflächenantigene
des Virus, wie das Glykoprotein 160 oder gp160, oder die sich daraus
ableitenden Proteine, d.h. gp120 und gp41, die aus internen Proteinen bestehenden
Antigene, wie das Protein Gag, und die sich daraus ableitenden Proteine,
wie p24, p17, oder auch die Antigene, die aus Regulationsproteinen
stammen, wie das Protein Tat. Die oben angegebene Liste ist nicht
beschränkend.
Unter HIV-Antigen im Sinne der Erfindung versteht man auch die wie
oben definierten Antigene, die durch chemische oder genetische Behandlung
modifiziert wurden, sofern die angewandte Behandlung die immunologischen
Eigenschaften des Antigens nicht wesentlich verändert.
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Als
Beispiel kann man die HIV-Regulationsproteine anführen, die
wie in den folgenden Patenten oder Patentanmeldungen beschrieben
chemisch detoxifiziert wurden:
US6200575 ,
US6132721 , WO99/33346; das durch
Mutation detoxifizierte Protein Tat, wie von Golstein in der Anmeldung
WO95/31999 und Nature Medicine, 1, 960, (1996) und von Loret in
der Anmeldung WO00/61067 beschrieben. Vorzugsweise ist das im Rahmen
der vorliegenden Erfindung verwendete Protein Tat ein Protein, das
von seiner Transaktivierungsaktivität und seiner immunsuppressiven
Aktivität
befreit ist.
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Die
Suppression der Transaktivierungsaktivität kann leicht durch den CAT-Test
kontrolliert werden, wie von G. Tosi et al in Eur. J. Immuno. (2000)
30, S. 1120-1126 beschrieben. Die Suppression der immunsuppressiven
Aktivität
des Proteins Tat kann leicht durch den Immunosuppressionstest bestimmt
werden, wie von Zagury in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95: 3851-6
beschrieben.
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Unter
HIV-Antigen im Sinne der Erfindung versteht man folglich das Antigen
selbst, aber auch die DNA, die nach Verabreichung mittels eines
Vektors, wie ein Canarypox, vom Organismus exprimiert werden und
folglich zur in situ-Produktion des Antigens führen kann, gegen das man eine
Immunreaktion induzieren möchte.
Die vorliegende Erfindung umfasst folglich außer den oben definierten Proteinantigenen
die vorzugsweise viralen Vektoren, die diese Antigene exprimieren.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendeten viralen
Vektoren sind die Vektoren ALVAC und NYVAC, die im Einzelnen in
den Patenten
US5364773 ,
US5756103 ,
US5990091 beschrieben sind, auf die
man sich für
eine vollständige
Beschreibung dieser Vektoren und ihres Verfahrens zum Erhalt beziehen
kann. Das erfindungsgemäße Peptidantigen
kann durch chemische Synthese oder gentechnisch hergestellt werden.
Die DNA- und Proteinsequenzen einer großen Anzahl von HIV-Antigenen
sind auf der Seite: http://hiv-web.lanl.gov/ und in den entsprechenden
Kompendien von Los Adamos verfügbar.
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Wenn
das Antigen durch chemische Synthese hergestellt wird, kann das
erfindungsgemäße Antigen in
der Form einer einzigen Sequenz oder in der Form mehrerer Sequenzen,
die dann aneinander gebunden werden, synthetisiert werden. Die chemische
Synthese kann in fester Phase oder in Lösung durchgeführt werden, wobei
diese beiden Syntheseverfahren dem Fachmann gut bekannt sind. Diese
Verfahren sind insbesondere von Atherton und Shepard in "solid phase peptide
synthesis" (IRL
press Oxford, 1989) und von Houben-Weyl in "Methoden der organischen Chemie", herausgegeben von
E. Wunsch, Band 15-I und II, Thieme, Stuttgart, 1974, Dawson PE
et al (Science 1994; 266(5186): 776-9); Kochendoerfer GG et al (Curr
Opin Chem Biol 1999; 3(6): 665-71); und Dawson PE et al (Annu Rev
Biochem 2000; 69: 923-60) beschrieben, auf die man sich für eine vollständige Beschreibung
der Syntheseverfahren beziehen kann.
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Das
erfindungsgemäße Antigen
kann auch durch die dem Fachmann gut bekannten Gentechnikverfahren
hergestellt werden. Diese Verfahren sind im Einzelnen beschrieben
in Molecular Cloning: a molecular manual von Maniatis et al, Cold
Spring Habor, 1989. Herkömmlicherweise
kann die DNA-Sequenz, die für
das erfindungsgemäße Polypeptid
kodiert, durch die PCR-Technik hergestellt werden, bei der die N-
und C-Sequenzen zuerst unabhängig
voneinander vervielfältigt
werden, dann danach gepaart und erneut vervielfältigt werden. Die so erhaltene
DNA-Sequenz wird dann in einen Expressionsvektor inseriert. Der
Expressionsvektor, der die interessierende Sequenz einschließt, wird
dann verwendet, um eine Wirtszelle zu transformieren, was die Expression
der interessierenden Sequenz ermöglicht.
Das produzierte Polypeptid wird dann aus dem Kulturmedium durch
dem Fachmann gut bekannte Verfahren isoliert, wie Ausfällen mit
Ethanol oder Ammoniumsulfat, Extraktion mit Säure, Anion/Kation-Austauschchromatographie,
Chromatographie über
Phosphocellulose, Chromatographie mit hydrophober Wechselwirkung,
Affinitätschromatographie,
Chromatographie über Hydroxyapatit
und Chromatographie über
Lectin. Vorzugsweise wird die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
bei der Reinigung angewandt.
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Um
die Synthese des Antigens durchzuführen, kann jeder Expressionsvektor,
der herkömmlicherweise
für die
Expression eines rekombinanten Proteins verwendet wird, im Rahmen
der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Dieser Begriff umfasst
folglich sowohl die sogenannten "lebenden" Expressionsvektoren, wie
die Viren und Bakterien, als auch die Expressionsvektoren vom Plasmidtyp.
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Man
verwendet vorzugsweise Vektoren, worin die DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen Antigens unter
der Abhängigkeit
eines induzierbaren oder nicht induzierbaren starken Promoters steht.
Man kann als Beispiel für
einen verwendbaren Promoter den Promoter der T7-RNA-Polymerase anführen.
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Die
Expressionsvektoren schließen
vorzugsweise wenigstens einen Selektionsmarker ein. Solche Marker
schließen
beispielsweise das Dihydrofolatreduktasegen oder das Neomycinresistenzgen
für die
Kultur der Eukaryotenzellen und die Kanamycin-, Tetracyclin- oder
Ampicillinresistenzgene für
die Kultur in E. coli und anderen Bakterien ein.
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Als
im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren Expressionsvektor
kann man die Plasmide anführen,
wie beispielsweise pET28 (Novagen) oder pBAD (Invitrogen).
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Um
die Expression und die Reinigung des Antigens zu fördern, kann
dieses Letztere in einer modifizierten Form, wie ein Fusionsprotein,
exprimiert werden und kann nicht nur Sekretionssignale, sondern
auch zusätzliche
heterologe funktionelle Regionen einschließen. Beispielsweise kann eine
Region zusätzlicher
Aminosäuren,
insbesondere geladene Aminosäuren,
N-terminal an das Antigen angefügt
werden, um die Stabilität und
den Fortbestand in der Wirtszelle zu verbessern.
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Für die Expression
des Antigens kann jede herkömmlicherweise
in Kombination mit den oben beschriebenen Expressionsvektoren verwendete
Wirtszelle verwendet werden.
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Man
kann als nicht beschränkendes
Beispiel die Zellen von E. coli, BL21 (λDE3), HB101, Top 10, CAG 1139,
Bacillus, die Eukaryotenzellen, wie CHO oder Vero, anführen.
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Vorzugsweise
verwendet man im Rahmen der vorliegenden Erfindung das folgende
System Expressionsvektor/Zelle: pET(Cer)/BL21LamdaDE3 oder BL21lamdaDE3(RIL).
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Es
wurden pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt, die für eine Immunisierung
gegen das menschliche Immunschwächevirus
vom Typ 1 (HIV-1) geeignet sind, worin das Antigen das Hüllglykoprotein gp160
MN/LAI-2 ist. Dieses Antigen enthält den Teil gp120 des Isolats
HIV-1 MN und den Teil gp41 des Isolats HIV-1 LAI. Bei gp41 wurden
seine Spaltungsstelle mit gp120 und sein Transmembranteil deletiert,
um ein nicht gespaltenes und im Wesentlichen sekretiertes Glykoprotein
zu erhalten. Das Antigen wird aus der Hamsterzelllinie BHK-21 hergestellt,
die infiziert ist mit dem rekombinanten Virus des Impfstoffs VVTG.9150,
abgeleitet aus der vorhergehenden Konstruktion VVTG.1163 (Kieny,
M.-P. et al., 1988, Protein Eng, 2(3): 219-255), wird dann mit Ionenaustauschchromatographie
und anschließend
einer Immunoaffinitätschromatographie
gereinigt.
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Es
wurden auch pharmazeutische Zusammensetzungen mit dem Antigen p24
hergestellt.
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Dieses
Antigen p24 wurde in der folgenden Veröffentlichung beschrieben: Diagnostic
value of HIV-Ag testing and anti-p24 titers in HIV carriers and
AIDS patients. Roumeliotou A, Nestoridou E, Economidou I, Psarra
E, Sidiri E, Choremi E, Kallinikos G, Papaevangelou G, AIDS 1988
Feb; 2(1): 64.
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Außerdem wurden
pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt, die als Antigen ein
detoxifiziertes Protein Tat IIIB enthalten. Das Protein Tat wurde
durch eine Alkylierungsreaktion in alkalischem Medium durch Verwendung
von Iodacetamid unter den folgenden Bedingungen detoxifiziert: Anzahl
an Mikromolen Iodacetamid = 200 × Anzahl an Mikromolen Tat
+ Anzahl an Mikromolen DTT. Dieses detoxifizierte Protein und sein
Herstellungsverfahren sind im Einzelnen in der Anmeldung WO99133346
beschrieben, wo es mit dem Begriff carboxymethyliertes Tat gekennzeichnet
ist.
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Unter
DCchol versteht man das Produkt, das gemäß dem in dem Patent
US 5283185 beschriebenen Verfahren
oder bevorzugt gemäß dem in
Beispiel 8 der Patentanmeldung WO 96/40067 beschriebenen Verfahren
aus Cholesterylchlorformiat und N,N-Dimethylethylendiamin erhalten
werden kann. Es ist auch möglich, ein
Produkt zu verwenden, das durch Reaktion von Cholesterylchlorformiat
und N,N,N-Trimethylethylendiamin erhalten wird.
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Die
erfindungsgemäßen Impfzusammensetzungen
können
in verschiedenen Formen formuliert werden und insbesondere in Form
von Emulsionen, Liposomen, Liposomen in Emulsionen, Micellen....
usw. Besonders gute Ergebnisse wurden mit Emulsionen erhalten, insbesondere
mikroemulgierte Emulsionen, die Squalen und ein Tensid wie Tween® 80
umfassen.
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Gemäß einem
Merkmal der Erfindung kann DCchol auch mit einem immunstimulierenden
Oligonukleotid kombiniert werden; es wurde nämlich festgestellt, dass man
in diesem Fall eine Synergie zwischen den 2 Zusätzen erhielt. Man kann insbesondere
Oligonukleotide verwenden wie diejenigen, die in der Anmeldung WO
96/02555 beschrieben sind, diejenigen, die in der Anmeldung
EP0468520 beschrieben sind,
diejenigen, die in der Anmeldung WO0075304 beschrieben sind, oder
jedes andere, für
seine Aktivität
als Immunoadjuvans bekannte Qligonukleotid.
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Speziell
kann man das Oligonukleotid 3Db(S) verwenden, dessen Sequenz unter
SEQ ID NO 15 in der Anmeldung WO96102555 beschrieben ist.
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Die
erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzungen sind dazu bestimmt, auf allen herkömmlicherweise
bei der Impfung verwendeten Wegen verabreicht zu werden und insbesondere
parenteral, aber auch über
die Schleimhäute,
insbesondere oral, nasal, rektal, vaginal. Sie können gemäß unterschiedlichen Protokollen,
die einen einzigen oder mehrere Verabreichungsschritte umfassen,
verabreicht werden.
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Im
Fall eines Protokolls in mehreren Schritten ist es möglich, dass
die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
bei jedem Schritt verabreicht werden oder einfach nur bei einigen
von ihnen. Es ist nämlich möglich, dass
ein Verabreichungsprotokoll, das einen Schritt zur Erstimmunisierung,
gefolgt von einem Schritt zur Auffrischung vorsieht, den Schritt
zur Erstimmunisierung mit einer Zusammensetzung vorsieht, die sich
von derjenigen der Erfindung unterscheidet, während die erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung nur für
den Schritt zur Auffrischung verwendet wird.
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Jedoch
ist es wegen der Eigenschaften der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen
auch möglich,
sie bei jedem der vorgeschlagenen Schritte zu verwenden.
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Die
Menge an Antigen in der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung
hängt,
wie der Fachmann versteht, von zahlreichen Parametern ab, wie die
Art des Antigens, der verwendete Vektor oder der Verabreichungsweg.
Eine geeignete Menge ist eine solche Menge, dass nach Verabreichung
dieser Letzteren eine humorale Immunreaktion, die die Primärisolate
von HIV neutralisieren kann, induziert wird. Die zu verabreichende
Menge an Proteinantigen liegt in der Größenordnung von 10 bis 100 Mikrogramm.
Im Fall, wo das verwendete Antigen ein viraler Vektor ist, liegt
die zu verabreichende Menge an Vektor in der Größenordnung von 104 bis
108 TCID50.
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Die
Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden
Erfindung können
durch jedes dem Fachmann bekannte herkömmliche Verfahren hergestellt
werden. Herkömmlicherweise
werden die erfindungsgemäßen Antigene
mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Verdünnungsmittel,
wie Wasser oder phosphatgepufferte Salzlösung, gemischt. Der Träger oder
das Verdünnungsmittel
wird in Abhängigkeit
von der gewählten
galenischen Form, der Art und dem Weg der Verabreichung sowie der
pharmazeutischen Praxis ausgewählt.
Die geeigneten Träger
oder Verdünnungsmittel
sowie die Erfordernisse hinsichtlich der pharmazeutischen Formulierung
sind im Einzelnen in Remington's
Pharmaceutical Sciences, das auf diesem Gebiet ein Referenzwerk
darstellt, beschrieben.
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen spezielle Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung.
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Beispiel 1
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Es
wurde DC-Chol Hydrochlorid (erhalten gemäß der in Beispiel 8 der Patentanmeldung
WO 96/40067 beschriebenen Herstellungsweise) verwendet, das zu 20
mg/ml in TRIS-NaCl-Puffer (20 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 6,8) suspendiert
wurde. Nach 8 Stunden unter Rühren
bei 35 – 40 °C unter Argon
wurde die Suspension mit einem Mikrofluidizer M-110S von Microfluidics
(10 Durchgänge
bei 500 kPa) mikroemulgiert, um eine homogene DC-Chol-Suspension
zu erzeugen, die über
einen Filter Millex 0,45 μm
filtriert wurde.
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Beispiel 2
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Mit
einem von Applied Biosystems gelieferten Syntheseautomat, der das
chemische Standardverfahren mit Phosphoramidit einsetzt und der
bei jedem Durchgang einen Oxidationsschritt umfasst, wurden Oligonukleotide
hergestellt.
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Dieser
Oxidationsschritt wurde mit einer Lösung Iod/Wasser/Tetrahydrofuran/Acetonitril,
um eine Phosphodiesterbindung zu erhalten, und mit einer Lösung Tetraethylthiuram/Acetonitril,
um eine Phosphorothioatbindung zu erhalten, durchgeführt.
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So
wurde ein Oligonukleotid 3 Db(S) hergestellt, dessen Sequenz in
der Patentanmeldung WO96/02555 unter SEQ ID NO 15 wiedergegeben
ist und das Phosphorothioatbindungen auf seiner gesamten Länge umfasst.
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Es
wurde auch ein Oligonukleotid MGC (S) hergestellt, dessen Sequenz
in der Patentanmeldung WO00/15256 mit SEQ ID NO 2 wiedergegeben
ist, das zugleich Phophodiesterbindungen und Phosphorothioatbindungen
umfasst. Die Phosphorothioatbindungen liegen an jedem Ende; es gibt
2 Phosphorothioatbindungen in 3' und
5 Phosphorothioatbindungen in 5'.
Dieses Oligonukleotid besitzt keine CG-Sequenz und wird als negative
Kontrolle verwendet.
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Beispiel 3: ap160 + immunstimulierendes
Oligonukleotid bei der Maus
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Es
wurden pharmazeutische Zusammensetzungen für die Immunisierung gegen das
menschliche Immunschwächevirus
vom Typ 1 (HIV-1) hergestellt, worin das Antigen das Hüllglykoprotein
gp160 MN/LAI-2 ist. Dieses Antigen enthält den Teil gp120 des Isolats
HIV-1 MN und den Teil gp41 des Isolats HIV-1 LAI. Bei gp41 wurden
seine Spaltungsstelle mit gp120 und sein Transmembranteil deletiert,
um ein nicht gespaltenes und im Wesentlichen sekretiertes Glykoprotein
zu erhalten. Das Antigen wird aus der Hamsterzelllinie BHK-21 hergestellt,
die infiziert ist mit dem rekombinanten Virus des Impfstoffs VVTG.9150,
abgeleitet aus der vorhergehenden Konstruktion VVTG.1163 (Kieny,
M.-P. et al., 1988, Protein Eng, 2(3): 219-255), wird dann mit Ionenaustauschchromatographie
und anschließend
einer Immunoaffinitätschromatographie
gereinigt.
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Die
Immunisierungsdosen von 20 μl
entsprachen einer der folgenden Formulierungen:
- – 25 μg nur gp160,
- – 25 μg gp160 +
50 μg Oligonukleotid
3Db(S), hergestellt in Beispiel 2,
- – 25 μg gp160 +
50 μg Oligonukleotid
MGC, hergestellt in Beispiel 2, + 200 μg DCchol, hergestellt in Beispiel 1,
- – 25 μg gp160 +
50 μg Oligonukleotid
3Db(S), hergestellt in Beispiel 2, + 200 μg DCchol, hergestellt in Beispiel
1.
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Die
hergestellten Dosen wurden 4 Gruppen zu 6 Mäusen (1 Formulierung pro Gruppe)
rektal unter Betäubung
in einer Menge von 4 Injektionen, jede im Abstand von 2 Wochen {also
J1, J15, J29 und J44) injiziert.
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Am
J57 wurde Serum entnommen, wurde der Kot gewonnen und wurden rektale
Spülungen
durchgeführt,
um die folgenden Bestimmungen auszuführen:
- – Bestimmung
durch ELISA der Anti-gp 160-IgG im Serum,
- – Bestimmung
durch ELISA der Gesamt-IgA und -IgG sowie der spezifischen Antigp160-IgA
und -IgG in den rektalen Spülungen,
- – Bestimmung
durch ELISA der Gesamt-IgA und -IgG sowie der spezifischen Antigp160-IgA
und -IgG im Kot.
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Die
das Oligonukleotid MGC enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung
wurde als eine negative Kontrolle im Vergleich mit dem Oligonukleotid
3Db(S) betrachtet. Das Oligonukleotid MGC hatte sich bei vorhergehenden
Experimenten nämlich
als nicht immunstimulierend erwiesen. Die erhaltenen Ergebnisse
werden folglich als äquivalent
mit denjenigen betrachtet, die erhalten werden, wenn man DCchol
als einzigen Zusatz verwendet.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen zusammengefasst;
es sind lediglich die Mittelwerte pro Mäusegruppe, die die gleiche
Zusammensetzung erhalten haben, angegeben.
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Tabelle
1: Bestimmung der spezifischen IgG im Serum:
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Diese
Ergebnisse zeigen die von den 2 Zusätzen ausgeübte Synergie für die Produktion
von IgG gegen das Antigen gp160 bei einer Verabreichung über die
Schleimhäute.
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Tabelle
2: Bestimmung der IgA und der IgG in den rektalen Spülungen:
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Tabelle
3: Bestimmung der IgA und der IgG im Kot:
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Diese
Ergebnisse zeigen den Synergieeffekt, den man, wenn zugleich DCchol
und immunstimulierende Oligonukleotide verwendet werden, bezüglich der
lokalen Produktion von spezifischen Immunoglobulinen G und Immunoglobulinen
A erzielt.
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Dieses
Vermögen,
die Produktion von spezifischen IgA lokal zu stimulieren, ist bei
der Immunisierung gegen die mit HIV verbundenen Infektionen besonders
gefragt und bestätigt
die Bedeutung des Gegenstands der vorliegenden Erfindung.
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Beispiel 4: ap160 bei
Mäusen
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Man
verfügt über gp160,
wie in Beispiel 3 beschrieben, DCchol, wie in Beispiel 1 beschrieben,
und Choleratoxin CT, geliefert von der Firma Sigma unter der Artikelnummer
#C-8052.
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Aus
diesen Produkten stellt man immunisierende Zusammensetzungen her,
die entweder gp160 allein oder gp160 und DCchol oder gp160 und CT
umfassen.
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Die
immunisierenden Zusammensetzungen werden weiblichen Mäusen BALB/c
By J Ico nasal verabreicht. Die intranasalen Immunisierungen werden
4 Mal in einer Menge von 2 × 5 μl in jedes
Nasenloch (d.h. 2 × 5 μl morgens
und 2 × 5 μl nachmittags)
ausgeführt.
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Die
verabreichten Mengen pro Dosis sind die folgenden: 25 μg gp160,
200 μg DCchol
und 5 μg
CT.
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Die
Immunisierungen finden an den Tagen 1, 13, 30 und 59 statt.
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Die
Blutentnahmen wurden am retroorbitären Sinus an den Tagen 42 und
75, also jeweils nach 3 und 4 Immunisierungen ausgeführt.
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Die
Vaginalsekrete wurden nach der 3. und nach der 4. Immunisierung
entnommen.
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Die
Rektalsekrete wurden nach Tötung
der Mäuse
entnommen.
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Die
Nasensekrete wurden am Ende des Tests durch eine Nasen-Rachen-Spülung entnommen.
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Die
Bestimmungen der gesamten und der für gp160 spezifischen IgA und
IgG wurden durch ELISA in den Seren, den Nasen-, Vaginal- und Rektalsekreten
ausgeführt.
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Zusammengefasst
wurden NUNC Maxisorp F96-Platten mit Anti-IgA- oder Anti-IgG Antikörpern von Mäusen oder
mit gp160 MN/LAI-2 sensibilisiert und mit Serienverdünnungen
von Serum oder Sekret inkubiert. Die gesamten und spezifischen IgA
oder IgG wurden durch ein Anti-IgA- oder Anti-IgG-Peroxidasekonjugat von
der Maus nach Zugabe von OPD (O-Phenylendiamin Dihydrochlorid) aufgezeigt.
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Für jedes
Sekret wurden die Anti-gp160-IgA- oder -IgG-Titer durch die Titer
an Gesamt-IgA oder -IgG dividiert (normierte spezifische Aktivitäten, ASN,
genannte Verhältnisse),
um die Entnahmen untereinander vergleichen zu können.
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Die
erhaltenen Ergebnisse bezüglich
der Serumantikörper
sind in der folgenden Tabelle 4 wiedergegeben, worin man sieht,
dass DCchol ein guter Zusatz ist, ohne jedoch die Aktivität von CT
zu erreichen, aber dieses führte
zur Beobachtung von Vergiftungsanzeichen.
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Die
Ergebnisse bezüglich
der bei den Nasen-Rachen-Entnahmen bestimmten Antikörper sind
in der folgenden Tabelle 5 wiedergegeben. Es sind nur die Mittelwerte
der erhaltenen Ergebnisse nach 4 Immunisierungen angegeben. Die
Analyse der normierten spezifischen Aktivitäten (ASN) zeigt trotz der großen individuellen
Schwankung der Verhältnisse
eine ausgeprägte
Wirkung von DCchol als Zusatz auf die IgA-Reaktionen. Bezogen auf
gp160 allein waren die ASN im Mittel um einen Faktor 12 erhöht. So erwies
sich bei einer bestimmten Anzahl von Mäusen eine Mehrheit der geernteten
IgA in den Nasen-Rachen-Spülungen
als spezifisch für
das verabreichte Antigen.
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Dagegen
ermöglichte
es der Zusatz des Stands der Technik, CT, trotz seiner starken positiven
Wirkung beim Serum nicht, die lokalen IgA-Reaktionen zu erhöhen.
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Die
Ergebnisse bezüglich
der bei den Vaginalentnahmen gemessenen Reaktionen sind in der folgenden
Tabelle 6A (für
die IgG) und 6B (für
die IgA) wiedergegeben, worin nur die Mittelwerte der Ergebnisse
angegeben sind. Wie für
die Nasen-Rachen-Entnahmen stellt man auch hier eine gute Reaktion
bei den IgG und den IgA, die mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
erzielt wird, fest, wenn auch die ASN der IgA geringer als zuvor
sind, wobei die ASN der IgG in der gleichen Größenordnung liegen.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass man durch eine Verabreichung über die
Schleimhäute
unter Verwendung der erfindungsgemäßen Impfzusammensetzungen eine
Reaktion in einem anderen, von der Immunisierungsstelle sehr entfernten
Schleimhautgebiet induzieren kann.
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Die
Ergebnisse bezüglich
der Rektalentnahmen sind in der folgenden Tabelle 7 wiedergegeben,
worin man sieht, dass die IgA-Reaktionen relativ gering sind, worin
man aber dagegen die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Impfzusammensetzungen
bezüglich
der produzierten IgG feststellt.
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Beispiel 5: gp160 beim
Makaken
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Man
verfügt
auf die gleiche Weise wie im vorhergehenden Beispiel über gp160,
DCchol und Choleratoxin CT und man stellt aus diesen Produkten immunisierende
Zusammensetzungen her, die entweder gp160 allein oder gp160 und
DCchol oder gp160 und CT umfassen.
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Man
möchte
die Wirksamkeit dieser Zusammensetzungen bei den Primaten in einem
vollständig über die
Schleimhäute
gehenden Verabreichungsprotokoll insbe sondere auf die in den Schleimhäuten, aber
auch im Serum ausgelöste
Reaktion untersuchen.
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Dazu
teilt man 12 weibliche Rhesusaffen in 3 Gruppen auf, die man gleichzeitig
nasal, vaginal und rektal 5 Mal hintereinander (nämlich an
den Tagen 1, 29, 57, 85 und 190) mit den folgenden Impfzusammensetzungen
immunisiert:
- – nur gp160 in einer Menge
von 50 μg
pro Verabreichungsweg und Tier,
- – gp160
und DCchol in einer Menge von 50 μg
gp160 und 400 μg
DCchol pro Weg und Tier,
- – gp160
und CT in einer Menge von 50 μg
gp160 und 50 μg
CT pro Weg und Tier.
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Die
verabreichten Volumina sind die folgenden:
- – nasal:
100 μl in
jedes Nasenloch,
- – vaginal:
200 μl,
- – rektal:
1000 μl.
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Die
Entnahmen wurden zu den folgenden Zeiten ausgeführt:
- – Seren:
J-11/-4, 1, 29, 57, 71, 99, 184 und 203
- – Vaginalsekrete:
J-11, 71/78, 99/106, 184 und 203/212
- – Nasensekrete:
J-11, 71, 99, 184 und 203
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Die
Vaginalentnahmen wurden zweifach mit 7 oder 9 Tagen Abstand ausgeführt, um
eine etwaige Verunreinigung durch die Menstruationen zu vermeiden.
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Die
Bestimmungen der IgG und IgA wurden durch ELISA ausgeführt.
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Um
sich von dem Verdünnungsfaktor,
der in die Schleimhautsekrete bei den Entnahmen durch Spülung eingeführt wird,
freizumachen, wurden die Anti-gp160-IgA- und -IgG Titer jeweils durch die
Titer an Gesamt-IgA und -IgG normiert (normierte spezifische Aktivitäten genannte
Verhältnisse).
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Die
in den Seren gemessenen Ergebnisse bezüglich der Anti-gp160-IgG-Reaktionen sind in
der 1 angegeben, worin man klar die Wirksamkeit der
erfindungsgemäßen Impfzusammensetzungen
insbesondere nach den 4. und 5. Immunisierungen sieht.
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Die
Ergebnisse bezüglich
der in den Vaginalsekreten erzielten Reaktionen sind in der 2 dargestellt,
worin man die Verbesserung der mit den erfindungs gemäßen Impfzusammensetzungen
induzierten Immunreaktion im Vergleich zu den bei der Verabreichung
von gp160 allein erzielten Reaktionen feststellen kann.
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Die
Ergebnisse bezüglich
der in den Nasensekreten erhaltenen Reaktionen sind in der 3 dargestellt,
worin man ebenfalls eine Verbesserung der mit den erfindungsgemäßen Impfzusammensetzungen
erzielten Reaktionen im Vergleich zu den mit dem Antigen allein
erzielten Reaktionen feststellt.
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Beispiel 6: Protein Tat
bei Meerschweinchen
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Man
verfügt über carboxymethyliertes
Tat-Protein, erhalten durch Expression bei E. choli und Reinigung
durch verschiedene Chromatographieschritte, dann chemische Deaktivierung,
so wie dies in der Anmeldung WO99/33346 beschrieben ist.
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Man
stellt immunisierende Zusammensetzungen her, die entweder das Protein
Tat allein in PBS-Puffer oder das Protein Tat in Gegenwart von DCchol
in einer Menge von 500 μg
DCchol pro Dosis umfassen. Die Impfdosen von 1 ml umfassen 50 μg Protein
Tat.
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Man
verfügt
dann über
Dunkin-Hartley-Albinomeerschweinchen, die man in 2 Gruppen mit 5
Meerschweinchen aufteilt, die man intramuskulär in den Oberschenkel mit 0,5
ml pro Injektion in jeden Oberschenkel immunisiert.
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Die
Injektionen werden an den Tagen 1, 14, 29 und 43 ausgeführt.
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Die
Serumentnahmen werden an den Tagen 11, 27, 39 und 56 ausgeführt.
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Die
produzierten Antikörper
werden durch das ELISA-Verfahren bestimmt.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der 4 dargestellt,
worin man klar sieht, dass die Menge an produzierten Anti-Tat-Antikörpern mit
einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung eindeutig höher
ist als mit einer Zusammensetzung, die nur das Antigen allein umfasst.
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Beispiel 7: Protein Tat
bei Mäusen
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Man
verfügt über carboxymethyliertes
Tat-Protein, erhalten durch Expression bei E. choli und Reinigung
durch verschiedene Chromatographieschritte, dann chemische Deaktivierung,
so wie dies in der Anmeldung WO99/33346 beschrieben ist.
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Man
stellt immunisierende Zusammensetzungen her, die umfassen:
- – Protein
Tat in einer Menge von 200 μg/ml
in TRIS/NaCl-Puffer,
- – Protein
Tat in einer Menge von 200 μg/ml
und Aluminiumhydroxid in TRIS/NaCl-Puffer,
- – Protein
Tat in einer Menge von 200 μg/ml
und DCchol, erhalten in Beispiel 1, in TRIS/NaCl-Puffer.
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Man
verfügt über Sprague-Dawley-Ratten,
denen man die immunisierenden Zubereitungen intramuskulär an den
Tagen 1, 8, 15, 29 und 43 injiziert.
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Bei
jeder Verabreichung führt
man 2 Injektionen von 0,25 ml pro Tier aus.
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An
den Tagen 45 und 58 wird Blut entnommen, um durch ELISA die IgG-Antikörper gegen
detoxifiziertes rekombinantes Tat zu bestimmen.
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Die
erhaltenen Ergebnisse, ausgedrückt
als log IgG, sind in der 5 für die Ergebnisse am J45 und in
der 6 für
die Ergebnisse am J58 dargestellt.
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Diese
Ergebnisse veranschaulichen die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzungen im Vergleich zu Impfzusammensetzungen, die nur
das Tat-Antigen umfassen.
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Beispiel 8: p24 bei der
Maus
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Man
verfügt über das
Protein p24, das ein Antigen ist, das in der folgenden Veröffentlichung
beschrieben wurde: Diagnostic value of HIV-Ag testing and anti-p24
titers in HIV carriers and AIDS patients. Roumeliotou A, Nestoridou
E, Economidou I, Psarra E, Sidiri E, Choremi E, Kallinikos G, Papaevangelou
G, AIDS 1988 Feb; 2(1): 64.
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Dieses
Antigen liegt mit einer Konzentration von 1 mg/ml in einer Lösung von
20 mM Natriumphosphat, 50 mM NaCl mit pH 7,5 vor.
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Man
verfügt
auch über
eine Lösung
von TRIS/NaCl mit 20 mM TRIS und 150 mM NaCl mit pH 8 sowie über DCchol,
erhalten gemäß Beispiel
1.
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Man
stellt so immunisierende Zusammensetzungen mit den folgenden Zusammensetzungen
her:
- – Gruppe
1: p24 (20 μg/Dosis)
- – Gruppe
2: p24 (1 μg/Dosis)
- – Gruppe
3: p24 (0,1 μg/Dosis)
- – Gruppe
4: p24 (0,01 μg/Dosis)
- - Gruppe 5: Kontrolle, bestehend nur aus einer Salzlösung
- – Gruppe
6: p24 (1 μg/Dosis)
+ DCchol (25 μg/Dosis)
in Form einer Liposomensuspension
- – Gruppe
7: p24 (1 μg/Dosis)
+ DCchol (25 μg/Dosis)
in Squalen/Tween®80-Emulsion, worin die Menge an Squalen
5 mg/Dosis beträgt
und die Menge an Tween®80 600 μg/Dosis beträgt. Die
Emulsion wird durch Mischen von 1 g Squalen in 20 ml TRIS/NaCl,
das Tween®80
und DCchol enthält,
erhalten, mit dem Ultraturrax 1 min lang bei 13500 Umdr./min. homogenisiert,
dann vor dem Filtrieren mikroemulgiert. Die Tropfen der so erhaltenen
Emulsion haben eine mittlere Größe um 150
nm.
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Die
verschiedenen immunisierenden Zusammensetzungen werden BALB/c-Mäusen, die in 6er-Gruppen aufgeteilt
sind, verabreicht, wobei jede Gruppe eine andere Zusammensetzung
erhält.
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Jede
der Mäuse
erhält
subkutan eine Dosis von 200 μl
am J1 und am J21.
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Am
J14 und 35 werden Entnahmen ausgeführt, um die Bestimmungen von
Serumantikörpern
auszuführen.
Am J37 werden die Tiere getötet.
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5-tägige Tests
zur Proliferation als Reaktion auf rekombinantes Protein p24 (5 μg/ml) werden
ausgeführt.
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Man
führt auch
Bestimmungen bezüglich
der Produktion von IL5 und IFNγ im Überstand
von Milzzellen aus, die 5 Tage lang in vitro mit 10 mg/ml rekombinantem
p24 stimuliert werden oder nicht.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in den 7 bis 13 illustriert.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Titer an IgG1-Antikörpern am J14 und am J35 (7 und 9) mit
den erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammen setzungen besser sind als mit Impfzusammensetzungen, die
bei gleicher Antigenkonzentration nur das Antigen umfassen, und
dass am J35 eine der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auch
die Produktion von IgG2a-Antikörpern
induzieren kann (10), was für die Induktion einer Reaktion
vom TH1-Typ charakteristisch ist.
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Außerdem führen die
erfindungsgemäßen Impfzusammensetzungen
zu einem größeren Proliferationsindex
als die Zusammensetzungen, die nur das Antigen enthalten (11).
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Die
Ergebnisse der Bestimmungen der Cytokine IFNγ und IL5 (12 und 13)
zeigen, dass, wenn man eine erfindungsgemäße Impfzusammensetzung verwendet,
die Mengen an produzierten Cytokinen ebenfalls erhöht sind.