ES2240526T3

ES2240526T3 - Composicion farmaceutica para inmunizar contra el sida.

Info

Publication number: ES2240526T3
Application number: ES01976378T
Authority: ES
Inventors: Jean Haensler; Francois Dalencon
Original assignee: Sanofi Pasteur Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Inc
Priority date: 2000-10-06
Filing date: 2001-10-08
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2021-10-08
Also published as: AU2001295673A1; EP1326635A2; DE60125797D1; CA2424836A1; ES2275738T3; DE60110822T2; DE60125797T2; DE60110822D1; PT1326635E; FR2814958A1; EP1326636A2; US20040038922A1; WO2002028428A2; DK1326636T3; EP1326636B1; PT1326636E; EP1326635B1; CY1105943T1; FR2814958B1; ATE295180T1

Abstract

Utilización de una composición farmacéutica que comprende al menos un antígeno del VIH y del DCchol, para la preparación de un medicamento para la inmunización contra las infecciones unidas al VIH, destinado a ser administrado por vía mucosa.

Description

Composición farmacéutica para inmunizar contra el SIDA.

La presente invención se refiere al ámbito de las composiciones farmacéuticas utilizable para la inmunización contra las infecciones vinculadas al VIH.

El síndrome de la inmunodeficiencia adquirida o SIDA es una enfermedad contra la cual sería muy deseable poder disponer de una vacuna, y en particular de una vacuna utilizable en profilaxia. Ahora bien, hasta hoy, el desarrollo de tal vacuna ha chocado con numerosos problemas en que, en particular, las diversas formas que puede tomar el virus VIH, así como las dificultades para identificar las correlaciones de la inmunidad contra el VIH, es decir, los factores inmunitarios susceptibles de proteger contra los virus. Los casos de personas expuestas y no infectadas así como los estudios sobre los "no progresores" dan sin embargo indicaciones, y orientan las investigaciones hacia la inducción de 2 tipos de respuesta inmunitaria: la respuesta por los anticuerpos (humoral) y la respuesta celular.

La respuesta humoral que es deseable suscitar no sólo es una respuesta humoral sistémica, sino también una respuesta mucosa ya que es deseable poder elaborar una barrera inmunitaria contra el virus en el lugar de su entrada en el organismo.

Las estrategias de búsqueda de una vacuna contra el SIDA se orientan, por lo tanto, hacia la búsqueda de composiciones vaccíneas capaces de incitar el sistema inmunitario para producir, en particular, una gran cantidad de Ig G y de Ig A específicos del virus del SIDA, en particular en las mucosas.

Este objetivo choca sin embargo con numerosas dificultades, ya que los antígenos del VIH, susceptibles de ser utilizados en una composición vaccínea, no son siempre capaces de inducir, por sí solos, una respuesta suficiente, y las formulaciones conocidas en el estado de la técnica anterior por su capacidad para inducir dicha respuesta, tal como las formulaciones que comprenden la toxina colérica, presentan a veces riesgos de toxicidad no desdeñables.

El objetivo de la presente invención es, por lo tanto, proponer una nueva composición farmacéutica susceptible de ser utilizada para la inmunización, con carácter profiláctico o terapéutico, contra las infecciones vinculadas al VIH. De manera sorprendente, se puso en evidencia que la composición según la invención permite inducir una producción importante de Ig G y de Ig A específicos de un antígeno del VIH.

Para alcanzar este objetivo, la presente invención propone la utilización de una composición que comprende al menos un antígeno del VIH y del DCchol, para la fabricación de un medicamento para la inmunización contra las infecciones vinculadas al VIH, destinado a ser administrado por vía mucosa.

Según una característica de la presente invención, el medicamento se destina a la inducción en los tejidos mucosos de un mamífero de anticuerpos Ig G e Ig A específicos de un antígeno del VIH.

Otras características y ventajas de la presente invención aparecerán en la lectura de la descripción que sigue, en referencia a los dibujos que ilustran los resultados obtenidos.

Las figuras 1 a 3 ilustran los resultados obtenidos en el ejemplo 5.

La figura 4 ilustra los resultados obtenidos en el ejemplo 6.

Las figuras 5 y 6 ilustran los resultados obtenidos en el ejemplo 7.

Las figuras 7 a 13 ilustran los resultados obtenidos en el ejemplo 8.

Por antígeno de VIH, se entiende cualquier antígeno susceptible de inducir anticuerpos neutralizantes procedentes del VIH 1 ó 2, preferentemente procedente del VIH 1, y que incluye las cepas de laboratorio y los aisladores primarios. Este término engloba por lo tanto, en particular, los antígenos de superficie del virus tales como la glicoproteína 160 o gp160, o las proteínas que se derivan de ésta i.e. gp120 y gp41, los antígenos constituidos por proteínas internas tales como la proteína Gag y las proteínas que se derivan de ésta tales como p24, p17, o también los antígenos procedentes de las proteínas de regulación tales como la proteína Tat. La lista anteriormente mencionada no es limitativa. Por antígeno del VIH en el sentido de la invención, se entienden igualmente los antígenos tales como se definen anteriormente que han sido modificados por tratamiento químico o genético siempre que el tratamiento aplicado no altere sustancialmente las propiedades inmunológicas del antígeno.

Se pueden citar a título de ejemplo las proteínas de regulación del VIH desintoxicadas por vía química tales como se describen en las patentes o en las solicitudes de las siguientes patentes: de EE.UU. nº 6.200.575, 6.132.721 e internacional nº WO99/33346; la proteína Tat desintoxicada por mutación tal como se describe por Golstein en la solicitud de patente internacional nº WO95/31999 y en Nature Medicine, 1, 960, (1996) y por Loret en la solicitud de patente internacional nº WO00/61067. Preferentemente la proteína Tat utilizada en el marco de la presente invención es una proteína desprovista de su actividad de transactivación y de su actividad inmunosupresiva.

La supresión de la actividad de transactivación puede ser controlada fácilmente por el ensayo CAT tal como se describe por G. Tosi et al en Eur. J. Inmuno. (2000) 30, pp1120-1126. La supresión de la actividad inmunosupresión de la proteína Tat se puede determinar fácilmente por el ensayo de inmunosupresión tal como se describe por Zagury en Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1998, 95: 3851- 6.

Por antígeno del VIH en el sentido de la invención, se entienden por lo tanto el propio antígeno, pero igualmente el ADN que, después de la administración por medio de un vector tal como un canaripox, es susceptible de ser expresado por el organismo y en consecuencia de conducir a la producción in situ del antígeno contra el cual se desea inducir una respuesta inmunitaria. La presente invención engloba por lo tanto además de los antígenos proteicos anteriormente definidos los vectores, preferentemente virales que expresan estos antígenos. Los vectores virales utilizados preferentemente en el marco de la presente invención son los vectores ALVAC y NYVAC que se describen en detalles en las patentes de EE.UU. nº 5.364.773, 5.756.103 y 5.990.091 a las cuales se podrá hacer referencia para una descripción completa de estos vectores y su procedimiento de obtención. El antígeno peptídico según la invención puede ser producido por síntesis química o por ingeniería genética. Las secuencias ADN y proteicas de un gran número de antígeno del VIH están disponibles en la página web: http://hiv-web.lanl.gov/ y en el compendio de Los Adamos correspondientes.

Cuando el antígeno se produce por síntesis química, el antígeno según la invención se puede sintetizar en forma de una secuencia única, o en forma de varias secuencias que están a continuación unidas unas con otras. La síntesis química se puede realizar en fase sólida o en solución, siendo estas dos técnicas de síntesis bien conocidas por el experto en la técnica. Estas técnicas están descritas, en particular, por Atherton y Shepard en "solid fase peptido synthesis (IRL press Oxford, 1989)" y por Houbenweyl en "method der organischen chemie" publicado por E. Wunsch vol, 15-I y II, Stuttgart, 1974, Dawson PE et al (Ciencia 1994; 266 (5186): 776-9); Kochendoerfer GG et al (Curr Opin Chem Biol 1999; 3 (6): 665-71); y Dawson PE et al (Annu Rev Biochem 2000; 69: 923-60) al cual se podrá referir para una descripción completa de las técnicas de síntesis.

El antígeno según la invención se puede producir también por las técnicas de ingeniería genética bien conocidas por el experto en la técnica. Estas técnicas se describen en detalle en Molecular Cloning: a molecular manual de Maniatis et al, Cold Spring Harbor, 1989).

Clásicamente, la secuencia de ADN codificador para el polipéptido según la invención se puede producir por la técnica de PCR en la cual las secuencias N y C se amplifican en primer lugar independientemente una de otra luego en segundo lugar se aparean y se amplifican de nuevo. La secuencia de ADN así obtenida se inserta a continuación en un vector de expresión. El vector de expresión que contiene la secuencia de interés se utiliza entonces para transformar una célula huésped que permite la expresión de la secuencia de interés. El polipéptido producido se aísla a continuación del medio de cultivo por técnicas clásicas bien conocidas por el experto en la técnica, tales como precipitación con etanol o con sulfato de amonio, extracción por ácido, cromatografía de intercambio de anión/catión, cromatografía sobre fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía sobre hidroxiapatita y cromatografía sobre lecitina. Preferentemente, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se utiliza en la purificación.

Para emplear la síntesis del antígeno, cualquier vector de expresión clásicamente utilizado para la expresión de una proteína recombinante puede ser utilizada en el marco de la presente invención. Este término engloba, por lo tanto, tanto los vectores de expresión denominados "vivos" tales como los virus y las bacterias como los vectores de expresión de tipo plásmidos.

Se utilizan preferentemente vectores en los cuales la secuencia de ADN del antígeno según la invención está bajo la dependencia de un fuerte promotor, inductible o no inductible. Se puede citar a título de ejemplo de promotor utilizable, el promotor del ARN polimerasa T7.

Los vectores de expresión incluyen preferentemente al menos un marcador de selección. Tales marcadores incluyen, por ejemplo, el gen de la dihidrofolato reductasa o el gene de resistencia a la neomicina para el cultivo de las células de eucariota y los genes de resistencia a la kanamicina, tetraciclina o ampicilina para el cultivo en E. coli y de las otras bacterias.

Se pueden citar a título de vector de expresión utilizable en el marco de la presente invención los plásmidos tales como pET28 (Novagen) o pBAD (Invitrogen) por ejemplo.

Para favorecer la expresión y la purificación del antígeno, este último se puede expresar en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no sólo señales de secreción, sino también regiones funcionales hetérologas suplementarias. Por ejemplo, una región de aminoácidos suplementarios, especialmente de los aminoácidos cargados, se puede añadir al N-terminal del antígeno para mejorar la estabilidad y el mantenimiento en la célula huésped.

Para la expresión del antígeno, se puede utilizar cualquier célula huésped clásicamente utilizada en asociación con los vectores de expresión anteriormente descritos.

\newpage

Se puede citar a título de ejemplo no restrictivo las células de E. coli, BL21 (\lambdaDE3), HB101, Top 10, CAG 1139, Bacillus, las células eucariotas tales como CHO o Vero.

Preferentemente se utilizará en el marco de la presente invención el siguiente sistema vector de expresión/célula: pET(Cer)/BL21LamdaDE3, o BL21lamdaDE3 (RIL).

Se prepararon composiciones farmacéuticas apropiadas para una inmunización contra el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) en las cuales el antígeno es la glicoproteína de envolvente gp160 MN/LAI-2. Este antígeno contiene la porción gp120 del aislador VIH-1 MN y la porción gp41 del aislador VIH-1 LAI. La gp41 ha sido deleccionada de su punto de escisión con la gp120 y de su parte transmembranal de tal modo que obtenga una glicoproteína no escindida y esencialmente secretada. El antígeno se produce a partir de la raza celular de hámster BHK-21 infectada por el virus recombinante de la vacuna VVTG.9150 derivado de la anterior construcción VVG.1163 (Kieny, M-P. et al, 1988, Protein Eng, 2(3): 219-255), luego se purifica por cromatografía de intercambio de iones seguida de una cromatografía de inmunoafinidad.

Igualmente, se prepararon composiciones farmacéuticas que comprenden el antígeno p24.

Este antígeno p24 se describió en la siguiente publicación: Diagnostic value of HIV-Ag testing and anti-p24 titers in HIV carriers and AIDS patients. Roumeliotou A, Nestoridou E, Economidou I, Psarra E, Sidiri E, Choremi E, Kallinikos G, Papaevangelou G, AIDS 1988 Feb; 2(1): 64.

Además, se prepararon las composiciones farmacéuticas que comprenden como antígeno una proteína Tat III B desintoxicada. La proteína Tat fue desintoxicada por una reacción de alquilación en medio alcalino por utilización de yodoacetamida en las siguientes condiciones: número de micromoles de yodoacetamida = 200 X número de micromoles de Tat + número de micromoles de DTT. Esta proteína desintoxicada y su procedimiento de preparación se describen en detalle en la solicitud de patente internacional nº WO99/33346 donde se identifica bajo el término de Tat carboximetilada.

Por DCchol, se entiende el producto que se puede obtener a partir de colesteril cloroformato y de N,N-dimetiletilenodiamina, según el método descrito en la patente de EE.UU. nº 5.283.185 o de manera preferida, según el método descrito en el ejemplo 8 de la solicitud de patente internacional nº WO 96/40067. Igualmente, es posible utilizar un producto obtenido por reacción de colesteril cloroformato y N,N,N-trimetiletilenodiamina.

Las composiciones vaccíneas según la invención son susceptibles de ser formuladas bajo distintas formas y, en particular, bajo forma de emulsiones, de liposomas, de liposomas en emulsiones, de micelas... etc. Particularmente se obtuvieron buenos resultados con emulsiones, en particular emulsiones microfluidizadas que comprenden esqualeno, y un detergente tal como el Tween® 80.

Según una característica de la invención, el DCchol se puede igualmente asociar a un oligonucleótido inmunoestimulante; en efecto, se observó que se obtenía en este caso, una sinergia entre los 2 adyuvantes. Se pueden, en particular, utilizar oligonucleótidos, tales como los que se describen en la solicitud de patente internacional nº WO 96/02555, los descritos en la solicitud de patente europea nº 0468520, los descritos en la solicitud de patente internacional nº WO0075304 o cualquier otro oligonucleótido conocido por su actividad inmunoadyuvante.

De manera particular, se puede utilizar el oligonucleótido 3Db(S), cuya secuencia se describe bajo SEQ ID NO 15 en la solicitud de patente internacional nº WO96/02555.

Las composiciones farmacéuticas según la invención están destinadas a ser administradas por cualquiera de las vías clásicas utilizadas en vacunación, y en particular por vía parenteral, pero también por vía mucosa, en particular, la vía oral, nasal, rectal y vaginal. Se pueden administrar según distintos protocolos, que incluyen una sola o varias etapas de administración.

En el caso de un protocolo en varias etapas, es posible que las composiciones según la invención sean administradas en cada etapa, o simplemente en algunas de entre ellas. Es en efecto posible que un protocolo de administración que prevé una etapa de primoinmunización seguida de una etapa de recuerdo, prevé la etapa de primoinmunización por medio de una composición diferente que la de la invención, mientras que la composición farmacéutica según la invención se utilizaría solamente para la etapa de recuerdo.

Sin embargo, dadas las calidades de las composiciones farmacéuticas según la invención, es también posible utilizarlas en cada una de las etapas propuestas.

La cantidad de antígeno en la composición según la presente invención depende de numerosos parámetros tal como lo comprenderá el experto en la técnica, tales como la naturaleza del antígeno, el vector utilizado o, la vía de administración. Una cantidad apropiada es una cantidad tal que una respuesta inmunitaria humoral capaz de neutralizar aisladores primarios del VIH es inducida después de la administración de esta última. La cantidad de antígeno proteico que se debe administrar es del orden de 10 a 100 microgramos. En el caso en que antígeno utilizado es un vector viral, la cantidad de vector que se debe administrar es del orden de 10^{4} a 10^{8} TCID_{50}.

Las composiciones según la presente invención se pueden preparar por cualquier procedimiento clásico conocido por el experto en la técnica. Clásicamente los antígenos según la invención se mezclan con un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como agua o solución salina tamponada con fosfato. El soporte o diluyente se va a seleccionar en función de la forma galénica elegida, del modo y de la vía de administración así como de la práctica farmacéutica. Los soportes o diluyentes apropiados así como las exigencias en materia de formulación farmacéutica se describen en detalle en Remington's Pharmaceutical Sciences, que representa una obra de referencia en este ámbito.

Los ejemplos que siguen ilustran los modos de realización particulares de la presente invención.

Ejemplo 1

Se utilizó el hidrocloruro de DC-Chol (obtenido según el modo de preparación descrito en el ejemplo 8 de la solicitud de patente internacional nº WO96/40067) que se puso en suspensión a 20 mg/ml en el tampón TRIS-NaCl (20 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 6,8). Después de 8 horas bajo agitación a 35- 40ºC bajo argón, la suspensión se microfluidiza con la ayuda de un microfluidificador M-110S en Microfluidics (10 ciclos a 500 kPa), con el fin de generar una suspensión homogénea de DC-Chol, que se filtró sobre un filtro Millex 0,45 \mum.

Ejemplo 2

Se prepararon oligonucleótidos gracias a un autómata sintetizador proporcionado por Applied Biosystems que emplea el método químico estándar con fosforamidita y que incluye en cada ciclo una etapa de oxidación.

Esta etapa de oxidación se realizó por medio de una solución de yodo/agua/tetrahidrofurano/acetonitrilo para obtener un enlace fosfodiéster y por medio de una solución tetraetiltiuram/acetonitrilo para obtener un enlace fosforotioato.

Así, se preparó un oligonucleótido 3 Db(S) cuya secuencia se reproduce en la solicitud de patente internacional nº WO96/02555 bajo SEQ ID NO 15 y que incluye enlaces fosforotioato sobre toda su longitud.

Se preparó también un oligonucleótido MGC(S) cuya secuencia se reproduce en la solicitud de patente internacional nº WO00/15256 de SEQ ID NO 2, que incluye a la vez enlaces fosfodiéster y enlaces fosforotioato. Los enlaces fosforotioato se sitúan en cada extremo; hay 2 enlaces fosforotioato en 3' y 5 enlaces fosforotioato en 5'. Este oligonucleótido no posee secuencia CG y se utiliza como control negativo.

Ejemplo 3 gp160 + oligonucleótido inmunoestimulante en el ratón

Se prepararon composiciones farmacéuticas para la inmunización contra el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) en las cuales el antígeno es la glicoproteína de envolvente gp160 MN/LAI-2. Este antígeno contiene la porción gp120 del aislador VIH-1 MN y la porción gp41 del aislador VIH-1 LAI. La gp41 ha sido quitada de su punto de escisión con la gp120 y de su parte transmembranal de tal modo que obtenga una glicoproteína no escindida y esencialmente secretada. El antígeno se produce a partir de la raza celular de hámster BHK-21 infectada por el virus recombinante de la vacuna VVTG.9150 derivado de la anterior construcción VVTG.1163 (Kieny, M-P. et al, 1988, Protein Eng, 2 (3): 219-255), luego se purifica por cromatografía de intercambio de iones seguida de una cromatografía de inmunoafinidad.

Las dosis para inmunización de 20 \mul respondían a una de las siguientes formulaciones:

-: 25 \mug de gp160 únicamente,

-: 25 \mug de gp160 + 50 \mug de oligonucleótido 3Db(S) preparado en el ejemplo 2,

-: 25 \mug de gp160 + 50 \mug oligonucleótido de MGC preparado en el ejemplo 2 + 200 \mug de DCchol preparado en el ejemplo 1,

-: 25 \mug de gp160 + 50 \mug oligonucleótido 3Db(S) preparado en el ejemplo 2 + 200 \mug de DCchol preparado en el ejemplo 1.

Se inyectaron las dosis preparadas a 4 grupos de 6 ratones (1 formulación por grupo) por vía rectal, bajo anestesia, a razón de 4 inyecciones separadas cada una de 2 semanas (sean J1, J15, J29 y J44).

A J57, se tomó muestra del suero, se recogieron las heces y se procedió a lavados rectales con el fin de efectuar las siguientes valoraciones:

-: valoración por ELISA de los IgG anti-gp160 en el suero,

-: valoración por ELISA de los IgA y los IgG totales así como de los IgA y los IgG específicos anti-gp160 en los lavados rectales,

-: valoración por ELISA de los IgA y los IgG totales así como de los IgA y los IgG específicos anti-gp160 en las heces.

La composición farmacéutica que contiene el oligonucleótido MGC se consideró como un control negativo con respecto al oligonucleótido 3Db(S). En efecto, el oligonucleótido MGC se había revelado no ser inmunoestimulante en experiencias anteriores. Los resultados obtenidos se consideran por lo tanto equivalentes a los obtenidos utilizando DCchol como solo coadyuvante.

Los resultados obtenidos se recapitulan en las tablas siguientes; sólo se indican las medias por grupo de ratones que hayan recibido la misma composición.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Valoración de los IgG específicos en el suero

	IgG anti-gp160 en \mug/ml
25 \mug gp160	60,55
25 \mug gp160 + 50 \mug 3Db(S)	46,97
25 \mug gp160 + DCchol 200 \mug + 50 \mug MGC	47,85
25 \mug gp160 + DCchol 200 \mug + 50 \mug 3Db (S)	645,26
\begin{minipage}[t]{150mm} Estos resultados muestran la sinergia ejercida por los 2 coadyuvantes para la producción de IgG frente al antígeno gp160, durante una administración por vía mucosa. \end{minipage}

TABLA 2 Valoración de los IgA y de los IgG en los lavados rectales

	IgA espec/IgA tot en %	IgG espec/IgG tot en %
25 \mug gp160	0,15	3,68
25 \mug gp160 + 50 \mug 3Db(S)	0,91	2,46
25 \mug gp160 + DCchol 200 \mug + 50 \mug MGC	0,68	1,07
25 \mug gp160 + DCchol 200 \mug + 50 \mug 3Db (S)	1,53	12,43

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Valoración de los IgA y de los IgG en las heces

	IgA espec/IgA tot x 10^{4}	IgG espec/IgG tot x 10^{4}
25 \mug gp160	2,44	0,00
25 \mug gp160 + 50 \mug 3Db (S)	18,05	1,33
25 \mug gp160 + DCchol 200 \mug + 50 \mug MGC	43,38	0,00
25 \mug gp160 + DCchol 200 \mug + 50 \mug 3Db(S)	104,79	3,03
\begin{minipage}[t]{150mm} Estos resultados muestran el efecto sinérgico obtenido utilizando a la vez el DCchol y los oligonucleótidos inmunoestimulantes, frente a la producción local de inmunoglobulinas G y de inmunoglobulinas A específicas. \end{minipage}

\newpage

Esta capacidad para estimular localmente la producción de IgA específicos se busca particularmente en la inmunización contra las infecciones vinculadas al VIH, y confirma el interés del objeto de la presente invención.

Ejemplo 4 gp160 en los ratones

Se dispone de gp160 tal como se describe en el ejemplo 3, de DCchol tal como se describe en el ejemplo 1, y de toxina colérica CT proporcionada por la Sociedad Sigma bajo la referencia #C-8052.

A partir de estos productos, se preparan composiciones inmunizantes, que comprenden bien sea gp160 sola, o bien gp160 y DCchol, o bien gp160 y la CT.

Las composiciones inmunizantes se administran por vía nasal a ratones hembras tipo BALB/c By J Ico. Las inmunizaciones intranasales se efectúan en 4 veces, a razón de 2x5 \mul en cada ventana nasal (i.e. 2x5 \mul por la mañana, y 2x5 \mul por la tarde).

Las cantidades administradas por dosis son las siguientes: 25 \mug de gp160, 200 \mug de DCchol y 5 \mug de CT.

Las inmunizaciones tuvieron lugar a los días 1, 13, 30 y 59.

Las tomas de muestras de sangre se efectuaron a nivel del seno retro-orbital en los días 42 y 75, esto es respectivamente después de 3 y 4 inmunizaciones.

Se tomaron muestras de las secreciones vaginales después de la 3ª y después de la 4ª inmunización.

Se tomaron muestras de las secreciones rectales después del sacrificio de los ratones.

Se tomaron muestras de las secreciones nasales al final del ensayo por un lavado naso-faríngeo.

Las valoraciones de los IgA e IgG totales y específicas de la gp160 se efectuaron por ELISA en los sueros, las secreciones nasales, vaginales y rectales.

En resumen, placas NUNC Maxisorp F96 se han sensibilizado con anticuerpos anti-IgA o anti-IgG de ratón o con la gp160 MN/LAI-2 y se han incubado con diluciones seriadas de suero o de secreción. Los IgA o IgG, totales y específicas, fueron reveladas por un conjugado peroxidasa anti-IgA o anti-IgG de ratón después de la adición de OPD (O-dihidrocloururo de fenilenodiamina).

Para cada secreción, los títulos en IgA o IgG anti-gp160 fueron divididos por los títulos en IgA o IgG totales (ratios denominados actividades específicas normalizadas, ASN) de tal manera que se pueda comparar las tomas de muestras entre sí.

Los resultados relativos a los anticuerpos séricos obtenidos se recogen en la Tabla 4 siguiente donde se ve que el DCchol es un buen adyuvante, sin que por ello alcance la actividad de la CT, pero ésta condujo a la observación de señales de toxicidad.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4

Composición vaccínea recibida	IgG anti-gp160 (\mug/ml) a	IgG anti-gp160 (\mug/ml)
	J41 después de la 3ª	a J79 después de la 4ª
	inmunización	inmunización
gp 160 (25 \mug)	4,694	20,545
gp160 (25 \mug) + Dcchol (200 \mug)	128,698	172,022
gp 160 (25 \mug) + CT (5 \mug)	325,091	430,806

Los resultados relativos a los anticuerpos valorados en las tomas de muestras naso-faríngeas se recogen en la Tabla 5 siguiente. Sólo se indican las medias de los resultados obtenidos después de 4 inmunizaciones.

El análisis de las actividades específicas normalizadas (ASN) muestra un efecto adyuvante marcado del DCchol sobre las respuestas IgA, a pesar de la gran variabilidad individual de las ratios. Con respecto a la gp160 sola, los ASN se multiplicaron por un factor 12 por término medio. Así por lo tanto, en un cierto número de ratones, una mayoría de las IgA recogidas en lavados naso-faríngeos resultaron específicas del antígeno administrado.

Al contrario, el adyuvante según el estado de la técnica anterior, la CT, no permitió aumentar las respuestas IgA locales, a pesar de su fuerte efecto positivo a nivel sérico.

TABLA 5

Composición vaccínea recibida	Ratio IgA anti-gp/IgA tot en %	Ratio IgG anti-gp/IgG en (%)
gp160 MN/LAI-2 (25 \mug)	4,76	0,62
gp160 + DCchol (200 \mug)	55,05	8,23
gp160 + CT (5 \mug)	7,28	7,81

Los resultados relativos a las respuestas medidas en las tomas de muestras vaginales se recogen en el Tabla 6A (para las IgG) y 6B (para la IgA) siguientes, donde no se toman más que los medias de los resultados. Así como para las tomas de muestras naso-faríngeas, se tiene en cuenta aquí una buena respuesta a nivel de las IgG y de las IgA obtenida con las composiciones según la invención, aunque los ASN de los IgA son más bajos que anteriormente, siendo los ASN de las IgG del mismo orden.

Estos resultados ponen de manifiesto que, gracias a una administración por vía mucosa, se puede inducir, utilizando las composiciones vaccíneas según la invención, una respuesta en otro compartimento mucoso muy distante del punto de inmunización.

TABLA 6A

Composición vaccínea recibida	Ratio IgG anti-gp/IgG tot	Ratio IgG anti-gp/IgG tot
	en (%) después de la 3ª	en (%) después de la 4ª
	inmunización	inmunización
gp 160 (25 \mug)	0	0,62
gp160 (25 \mug) + Dcchol (200 \mug)	2,31	6,93
gp 160 (25 \mug) + CT (5 \mug)	4,53	8,26

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6B

Composición vaccínea recibida	Ratio IgA anti-gp/IgA tot	Ratio IgA anti-gp/IgA tot
	en (%) después de la 3ª	en (%) después de la 4ª
	inmunización	inmunización
gp 160 (25 \mug)	0	0,95
gp160 (25 \mug) + Dcchol (200 \mug)	7,00	22,32
gp 160 (25 \mug) + CT (5 \mug)	1,82	6,75

Los resultados relativos a las tomas de muestras rectales se recogen en la Tabla 7 siguiente, donde se ve que las respuestas en IgA son relativamente bajas, pero donde, por el contrario, se observa la eficacia de las composiciones vaccíneas según la invención porque en lo que se refiere a las IgG producidas.

TABLA 7

Composición vaccínea recibida	Ratio IgA anti-gp/IgA tot en %	Ratio IgG anti-gp/IgG tot en (%)
gp 160 (25 \mug)	0	0,89
gp160 (25 \mug) + Dcchol (200 \mug)	0,87	9,02
gp 160 (25 \mug) + CT (5 \mug)	0,39	8,91

Ejemplo 5 gp160 en el macaco

Se dispone, de la misma forma que en el ejemplo anterior, de gp160, DCchol, y de toxina colérica CT y se prepara, a partir de estos productos, composiciones inmunizantes, que comprenden bien sea solo la gp160, o bien la gp160 y el DCchol, o bien la gp160 y la CT.

Se quiere evaluar la eficacia en los primates de estas composiciones en un protocolo de administración enteramente mucoso, en particular, sobre la respuesta inducida a nivel mucoso, pero también a nivel sérico.

Para eso, se divide en 3 grupos, 12 monos tipo Rhésus hembras, que se inmunizan simultáneamente por vías nasales, vaginales y rectales, en 5 ocasiones (o sea en los días 1, 29, 57, 85 y 190) gracias a las siguientes composiciones vaccíneas:

-: solo gp160 a razón de 50 \mug por vía y por animal,

-: gp160 y DCchol a razón de 50 \mug de gp160 y 400 \mug de DCchol por vía y por animal,

-: gp160 y CT a razón de 50 \mug de gp160 y 50 \mug de CT por vía y por animal,

Los volúmenes administrados son los siguientes:

-: para la vía nasal: 100 \mul en cada ventana nasal,

-: para la vía vaginal: 200 \mul

-: para la vía rectal: 1000 \mul

Las tomas de muestras se efectuaron en las siguientes fechas:

-: sueros: J-11/-4, 1, 29, 57, 71, 99, 184 y 203

-: secreciones vaginales: J-11, 71/78, 99/106, 184 y 203/212

-: secreciones nasales: J-11, 71, 99,184 y 203

Las tomas de muestras vaginales se efectuaron en doble, con 7 ó 9 días de intervalo, con el fin de evitar una eventual contaminación por las menstruaciones.

Las valoraciones de los IgG e IgA han sido efectuadas por ELISA.

De tal modo que se libere del factor de dilución introducido en las secreciones mucosas en las tomas de muestras por lavado, los títulos IgA e IgG anti-gp160 fueron normalizados respectivamente por los títulos en IgA e IgG totales (ratios llamados actividades específicas normalizadas).

Los resultados relativos a las respuestas en IgG anti-gp160 medidos en los sueros se indican a la Figura 1 donde se ve claramente la eficacia de las composiciones vaccíneas según la invención, en particular, después de las 4ª y 5ª inmunizaciones.

Los resultados relativos a las respuestas obtenidas en las secreciones vaginales están representados en la Figura 2 donde se puede observar la mejora de la respuesta inmune inducida gracias a las composiciones vaccíneas según la invención con respecto a las respuestas obtenidas durante la administración de gp160 sola.

Los resultados relativos a las respuestas obtenidas en las secreciones nasales están representados en la Figura 3 donde se tiene en cuenta también una mejora de las respuestas obtenidas con las composiciones vaccíneas según la invención con respecto a las respuestas obtenidas con el antígeno solo.

Ejemplo 6 proteína Tat en cobayas

Se dispone de proteína carboximetilada Tat, obtenida por expresión en E. coli y purificación por distintas etapas de cromatografía, luego inactivación química, así como se describe eso en la solicitud de patente internacional nº WO99/33346.

Se preparan composiciones inmunizantes que comprenden bien sea la proteína Tat sola en tampón PBS, o la proteína Tat en presencia de DCchol, a razón de 500 \mug de DCchol por dosis. Las dosis que vacunan 1 ml comprenden 50 \mug de proteína Tat.

Se dispone a continuación de Cobayas albinos tipo Dunkin-Hartley que se reparten en 2 grupos de 5 cobayas, que se inmunizan por vía intramuscular en el muslo, a razón de una inyección de 0,5 ml en cada muslo.

Las inyecciones se efectúan en los días 1, 14, 29 y 43.

Las tomas de muestras séricas se efectúan en los días 11, 27, 39 y 56.

Los anticuerpos producidos se valoran por el método ELISA.

Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 4 donde se ve claramente que la cantidad de anticuerpos anti-Tat producidos es claramente más elevada con una composición farmacéutica según la invención, que con una composición que no comprenden más que el antígeno solo.

Ejemplo 7 Proteína Tat en ratones

Se dispone de proteína carboximetilada Tat, obtenida por expresión en E. coli y purificación por diferentes etapas de cromatografía, luego inactivación química, como así se describe eso en la solicitud de patente internacional nº WO99/33346.

Se preparan composiciones inmunizantes que comprenden:

-: proteína Tat a razón de 200 \mug/ml en tampón TRIS/NaCl

-: proteína Tat a razón de 200 \mug/ml e hidróxido de aluminio en tampón TRIS/NaCl,

-: proteína Tat a razón de 200 \mug/ml y DCchol obtenido en el ejemplo 1 en tampón TRIS/NaCl,

Se dispone de ratas tipo Sprague Dawley, a las que se inyectan las preparaciones inmunizantes en intramuscular, en los días 1, 8, 15, 29 y 43.

En cada administración, se efectúan 2 inyecciones de 0,25 ml por animal.

Se efectúan algunas tomas de muestras sanguíneas en los días 45 y 58, con el fin de dosificar por ELISA los anticuerpos IgG anti-Tat recombinante desintoxicado.

Los resultados obtenidos, expresados en log IgG están representados en la Figura 5 para los resultados a J45 y en la Figura 6 para los resultados a J58.

Estos resultados ilustran la eficacia de las composiciones farmacéuticas según la invención con respecto a las composiciones vaccíneas que no comprenden más que el antígeno Tat.

Ejemplo 8 p24 en el ratón

Se dispone de la proteína p24 que es un antígeno que se describió en la siguiente publicación: Diagnostic value of HIV-Ag testing and antip24 titers in HIV carriers and AIDS patients. Roumeliotou A, Nestoridou E, Economidou I, Psarra E, Sidiri E, Choremi E, Kallinikos G, Papaevangelou G, AIDS 1988 Feb; 2(1): 64.

Este antígeno está presente en una concentración de 1 mg/ml en una solución Fosfato de Sodio 20 mM, NaCl 50 mM, a pH 7,5.

Se dispone también de una solución de TRIS/NaCl a 20 mM de TRIS y 150 mM de NaCI, a pH 8, así como de DCchol obtenido según el ejemplo 1.

Se preparan así composiciones inmunizantes que tienen la composición siguiente:

-: Grupo 1: p24 (20 \mug/dosis)

-: Grupo 2: p24 (1 \mug/dosis)

-: Grupo 3: p24 (0,1 \mug/dosis)

-: Grupo 4: p24 (0,01 \mug/dosis)

-: Grupo 5: control constituido únicamente de una solución salina

-: Grupo 6: p24 (1 \mug/dosis) + DCchol (25 \mug/dosis) en forma de suspensión liposomal

-: Grupo 7: p24 (1 \mug/dosis) + DCchol (25 \mug/dosis) en emulsión de Escualeno/Tween® 80 en la cual la cantidad de Escualeno es de 5 mg/dosis y la cantidad de Tween® 80 es de 600 \mug/dosis. La emulsión se obtiene por mezcla de 1 g de Escualeno en 20 ml de TRIS/NaCl que contiene el Tween® 80 y el DCchol, homogeneizado con ultra-turrax durante 1 min a 13.500 rpm, luego microfluidización antes de ser filtrada. Las gotas de la emulsión así obtenida tienen un tamaño medio en torno a 150 nm.

Las distintas composiciones inmunizantes se administran a ratones tipo BALB/c repartidas por grupo de 6, recibiendo cada grupo una composición diferente.

Cada uno de los ratones recibe una dosis de 200 \mul a J1 y a J21, en subcutáneo.

Se efectúan algunas tomas de muestras a J14 y a 35 con el fin de efectuar las valoraciones en anticuerpos séricos.

A J37, se sacrifican los ratones.

Se efectúan algunos ensayos de proliferación en respuesta a la proteína recombinante p24 (5 \mug/ml) en 5 días.

Se realizan igualmente valoraciones relativas a la producción de IL5 y de IFN\gamma en los sobrenadantes de células esplénicas que se estimulan o no se estimulan durante 5 días "in vitro" por 10 mg/ml de p24 recombinante.

Los resultados obtenidos se ilustran en las figuras 7 a 13.

Estos resultados ponen de manifiesto que los títulos en Anticuerpo IgG1 a J14 y a J35 (Figuras 7 y 9) son mejores con las composiciones farmacéuticas según la invención que con composiciones vaccíneas que comprenden únicamente el antígeno, a la misma concentración de antígeno, y que a J35, una de las composiciones según la invención es igualmente capaz de inducir la producción de anticuerpo IgG2a (Figura 10), lo que es representativo de la inducción de una respuesta de tipo TH1.

Además las composiciones vaccíneas según la invención conducen a un mayor índice de proliferación que las composiciones que comprenden únicamente el antígeno (Figura 11).

Los resultados de las valoraciones de las citoquinas IFN\gamma e IL5 (Figuras 12 y 13) ponen de manifiesto que, cuando se utiliza una composición vaccínea según la invención, se aumentan igualmente las cantidades de citoquinas producidas.

Claims

1. Utilización de una composición farmacéutica que comprende al menos un antígeno del VIH y del DCchol, para la preparación de un medicamento para la inmunización contra las infecciones unidas al VIH, destinado a ser administrado por vía mucosa.

2. Utilización según la reivindicación anterior, caracterizada porque el medicamento se destina a la inducción en los tejidos mucosos de un mamífero, de anticuerpos IgG o IgA específicos de un antígeno del VIH.

3. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el antígeno del VIH es la gp160.

4. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el antígeno del VIH es el p24.

5. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el antígeno del VIH es la proteína Tat.

6. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la composición farmacéutica comprende por otro lado un oligonucleótido inmunoestimulante.

7. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la composición farmacéutica se presenta en forma de emulsión.